KR20030059852A - 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단킷트 - Google Patents
암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단킷트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질을 이용하여 암을 진단하는 방법 및 상기 방법을 이용한 진단킷트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암의 발생과 전이에 관여하여 N-연결형 당쇄의 변화를 나타내는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 상기 단백질의 당쇄변화를 측정하는 방법을 이용한 진단킷트에 관한 것이다. 본 발명의 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단킷트는 대장암, 위암, 폐암 및 간암을 포함한 여러 가지 암을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질을 이용하여 암을 진단하는 방법 및 상기 방법을 이용한 진단킷트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암의 발생과 전이에 관여하여 N-연결형 당쇄의 변화를 나타내는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 상기 단백질의 당쇄변화를 측정하는 방법을 이용한 진단킷트에 관한 것이다.
단백질의 기능을 분석하기 위한 방법으로는 오래 전부터 전기영동 방법의 일환으로 2차원 전기영동 방법이 많이 사용되어 왔으나 최근 들어 MALDI-TOF와 같은 질량분석기기의 발달과 N-말단 아미노산 서열 결정이 쉬워지면서 포스트 게놈(Post-Genome) 시대의 기능 분석 방법으로서 프로테오믹스(proteomics)가 등장하였다. 그러나 프로테오믹스는 다이내믹하게 움직이는 생체에 대하여 정지된 한 시점이 선택적으로 분석되므로 복잡한 신호 전달의 결과로 발생하는 것으로 알려진 암에 대한 연구에는 어느 정도 한계를 지니고 있으며, 실제 단순 염색에 의해 새로운 스팟(spot)의 출현보다는 신호전달의 결과물로서 발현양의 증가나 번역후 변형(post-translational modification)이라는 양상으로 나타나는 것이 일반적이다. 특히 2차원 전기영동 상에서 펼쳐지는 단백질들은 대단히 소량이어서 단순 염색에 의해서는 고도화된 분석이 어려운 실정이다. 이러한 어려움을 극복하고 분석상의 차이점을 번역후 변형의 관점에서 광범위하게 확인할 수 있는 분야가 단백질의 당질화(glycosylation)이다. 대조군과 비교할 때 일반적인 전기영동으로는 스팟의 차이를 발견할 수 없는 경우에도 당쇄의 변화를 렉틴(lectin)으로 분석하면 대단히 다른 양상이 나타난다. 최근 들어 프로테오믹스에 비추어 이런 당쇄의 변화를 이용하는 분석을 글리코믹스(glycomics)라 하며, 이는 이미 진행되고 있는 프로테오믹스의 분석상의 어려움을 극복한 한 단계 진전된 분석방법으로 번역후 변형 중 단백질의 당질화 변화를 추적하는 것이다.
발암 및 전이의 과정에서 일어나는 세포 생물학적 변화를 보면, 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질이나 당지질이 암유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령을 받아 "잘못된 당질화(aberrant glycosylation)"로 인한 당쇄(sugar chain)의 변화가 세포간의 접착(adhesion), 인식(recognition)에 변화를 일으켜 세포의 암화 및 암전이를 일으킨다(Hakomori and Kannagi, 1983,J. Natl. Cancer Inst.,71:231-251; Feizi, 1985,Nature, 314:53-571). 세포 외부에서 자극이 오면 암유전자 ras, 전사인자 ets-1의 신호전달을 거쳐 당전이효소 GnT-V(N-acetylglucosaminyltransferase)의 발현을 강화시킨다. 상기 GnT-V는 당단백질의 기본적인 당쇄에 N-아세틸글루코사민을 β1,6의 위치로 부가하는 반응을 촉매하는 효소로 암의 공격(invasion)과 전이(metastasis)에 직접 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(Denniset al.,1987,Science, 236:582-5853). 일반적으로 당단백질은 단백질이 합성된 후 ER(endoplasmic reticulum)에서 아주 기본적인 당쇄가 만들어진 후 골지체로 이동하여 세포의 다양한 생명현상의 결과로 여러 당전이효소에 의해 당의 부가가 이루어지는데 1차적으로 만들어지는 N-아세틸글루코사민 당전이효소 여섯가지(I-Ⅵ)가 촉매하여 얻어지는 당쇄들을 보여주고 있으며, 이중 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄를 만드는 GnT-V가 암의 발생과 전이에 가장 많이 관여한다고 알려져 있다. GnT-V 효소는 골지체에 위치하며, 목표 단백질들은 당쇄에 변화를 받아 세포 표면이나 밖으로 분비된다. 이때 당단백질은 대상세포의 표면 단백질과 인식(recognition), 접착(adhesion)하여 암을 유발하게 된다.
GnT-V는 1987년 데니스 등에 의해 이런 β1,6의 가지가 암 조직이나 암이 전이가 일어날 때 높은 정도로 나타남이 보고되면서 생물학적 의미가 부각되었다(Dennis,et al.,1987,Science, 236:582-5853). 세포표면 단백질인 gp130이 GnT-V의 주목표 단백질 중의 하나인데 β1,6 N-아세틸글루코사민 부가가 높은 전이 활성이 있음이 밝혀졌으며, 또한 GnT-V가 적중(결손, knock-out)된 ES(embryonic stem) 세포주를 생쥐에서 구축하고, 상기 생쥐에 폴리오마바이러스(polyomavirus)의 중간(middle) T 항원(이하 "PyMT"라 약칭한다) 바이러스성 암유전자를 도입하여 암을 유발시키면 정상 생쥐에 PyMT만을 과발현시킨 생쥐에 비하여 PyMT에 의해 유도되는 암의 성장과 전이가 크게 억제됨을 확인하였고(Granovskyet al.,2000,Nature Med., 6:306-312), 동물내에서 β1,6의 가지화가 쥐 유방암에서 높은 전이성을 보여주었다. 최근의 연구에서 33가지 유형의 검증된 간암(hepatocellular carcinoma, HCC) 조직에 대해 GnT-V의 활성을 분석한 결과 정상조직에 비하여 50배, 암 주변조직에 비하여는 4배의 높은 효소 활성이 관찰되었다(Yaoet al., 1998,J Cancer Res. Clin. Oncol.,124:27-307). 또한, 대장암 세포주 WiDr에 이 GnT-V의 과발현 세포주를 구축한 다음 면역결핍 생쥐에 주입하여 대장암을 유도하거나 CAM 분석방법으로 수정란을 이용하여 혈관 신생을 조사한 결과, 높은 전이활성이 확인되었다(Miyoshi et al., 2001, unpublished results). 이렇듯 GnT-V는 조직에 관계없이 암의 전이 과정에 관여하여 높은 전이 활성을 보이는 것으로 예측되고 있다. 이 GnT-V 효소는 사람의 폐암세포 및 쥐의 신장에서 정제된 이래, cDNA 클로닝, 게놈상의 구조 및 프로모터 영역의 해석이 이루어졌다(Guet al.,1993,J Biochem, 113:614-619; Soreibahet al.,1993,J Biol. Chem.,268:15381-15385; Kanget al.,1996,J. Biol. Chem.,271:26706-26712). 최근에 본 발명자들도 전사인자인 ets-1이 GnT-V의 발현에 크게 관여함을 보고하였다(Ko,et al.,1999,J. Biol. Chem.,274(33):22941-22948). 한편 최근 들어 식생활의 변화로 지속적인 증가 추세를 보여주는 선진국형 암인 대장암은 남녀 모두에게 4번째로 높은 발병율과 증가추세를 보여주고 있으나 대장 내시경 이외에는 구체적인 진단이 어려운 실정이다.
이에, 본 발명자들은 암이 유발된 세포에서 당전이효소 GnT-V에 의해 부가된 β1,6-N-아세틸글루코사민을 검출하고 이를 질량분석기로 아미노산 서열을 분석하여 당쇄 변화를 나타내는 새로운 당단백질을 발견하고, 검체로부터 상기 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법과 상기 방법을 이용한 암의 진단 킷트를 발명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 상기 방법을 이용한 진단킷트를 제공하는 것이다.
도 1은 N-연결형 당쇄와 관여하는 6개의 당전이효소가 촉매하여 얻어지는 당쇄들을 나타낸 모식도이고,
도 2는 당전이효소 GnT-V에 의해 β1,6 N-아세틸글루코사민(GlcNAcβ1)이 부가되는 반응을 나타낸 것이고,
도 3은 세가지 세포주(Mock/WiDr, ets-1/WiDr, GnT-V/WiDr)의 2차원 전기영동을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색한 것이고,
도 4는 세가지 세포주에 대한 2차원 전기영동 후 렉틴 L4-PHA에 의한 렉틴 블럿팅을 한 것이고,
도 5는 세가지 세포주에서 유래한 무혈청 배지의 2차원 전기영동을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색한 것이고,
도 6은 세가지 세포주 무혈청 배지에 대한 2차원 전기영동 후 렉틴 L4-PHA에 의한 렉틴 블럿팅을 한 것이고,
도 7은 ESI/Q-TOF에 의해 timp-1 아미노산 서열을 분석한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질의 당쇄변화를 측정하는 것을 이용한 진단킷트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.
상기에서 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며 반드시 여기에 포함되는 것은 아니며, 모든 종류의 암이 본 발명의 대상이 될 수 있다.
본 발명은 정상세포와 비교하여 암세포 및 전이된 세포에서 N-연결형 당쇄변화인 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지변화를 나타내는 단백질의 당쇄가지변화를 측정하는 방법을 제공한다. β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄를 만드는 GnT-V는 조직에 관계없이 암의 발생과 전이에 관여하고, 상기 GnT-V에 의해 부가되는 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄는 렉틴 피토해마글루티닌(Phytohaemagglutinin)-L4(이하 "L4-PHA"라 약칭한다)에 의해 검출된다.
암의 전이는 세포간의 인식(recognition), 접착(adhesion)에 의한 것이며, 인식과 접착에 관여하는 당단백질은 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오는 형태이므로, 암을 진단할 수 있는 초기 표식인자들은 혈액이나 소변 등의 체액의 진단을 통해서 암 진단이 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 대장암 특이적인 종양표식인자를 찾아내기 위하여 GnT-V 발현이 상대적으로 낮은 대장암 세포주 WiDr을 사용하였으며, GnT-V를 과발현하는 세포주인 GnT-V/WiDr을 대장암의 모델 시스템으로 보고 세포주 수준에서 글리코믹스를 수행하였다. 본 발명에서는 전이된 암세포 배양액에 대하여 2차원 전기영동을 통한 분석을 시도하고, 각각 2장의 겔을 확보한 후 한 장은 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 다른 한 장은 렉틴 블럿팅을 수행하여, 정상세포에 비하여 암 세포 및 전이된 세포에서 당쇄변화를 일으키는 단백질을 선별하였다(도 5및도 6참조). β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 렉틴 블럿의 경우 대조군에 비하여 암세포의 경우가 몇 군데에서 진한 강도의 스팟이 나타났는데, 상기 스팟에 해당하는 단백질이 암 발생 및 전이에 관여하여당쇄변화를 나타내는 단백질이다.
겔상에서 해당하는 스팟을 잘라내고, 단백질을 절단한 후 절단된 펩타이드를 ESI(Electrospray Ionization)/Q-TOF(Quadruple Time of Flight) 질량 분석기로 아미노산 서열을 결정하여,서열번호 1내지서열번호 15로 기재되는 펩타이드 서열을 밝혀내었다. 상기 분석된 펩타이드 서열은 기존의 단백질 데이터베이스와 비교하여 정확한 단백질의 이름을 동정하였고, 각각의 서열과 분자량, 등전점 등을 분석하였다(표 1참조).
상기 단백질에 대해 지금까지 알려진 특성은 N-연결형 당쇄는 Asn-Xaa-Thr/Ser 이라는 배열상에서 Asn에 생긴다는 공지의 사실에 근거하여 확인하였다(Varki et al, 1999,Essentials of glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA, pp85-100).
상기에서 분석된서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 펩타이드 서열은 PDF(prostate-derived factor)의 일부분이고, PDG는 TGF-β(transforming growth factor beta) 패밀리의 구성원인 BMPs(Bone morphogenetic proteins) 단백질 중의 하나로 연골형성을 유도하여 골격의 발생과 재생에 관여하는 것으로 알려져 있으며(Paralkar,V.M. et al., 1998,J Biol. Chem, 273:13760-13767), 2군데의 보존된 N-연결형 당쇄의 위치를 지니고 있다. 상기 단백질은 PDF 뿐만 아니라, MIC-1(macrophage inhibitory cytokine-1), PLAB(placental bone morphogenic protein), GDF-15(growth/ differentiation factor 15) 등의 이름으로 여러 그룹에의해 발견되었다.
상기에서 분석된서열번호 3,서열번호 4및서열번호 5로 기재되는 펩타이드 서열은 T 세포 사이클로필린(T cell cyclophilin)으로 알려진 것으로 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)라고도 하는데, 3군데의 보존된 N-연결형 당쇄의 위치를 지니고 있으며 항산화 시스템의 구성성분으로 잘 알려져 있다.
상기에서 분석된서열번호 6내지서열번호 11로 기재되는 펩타이드 서열은 기존의 알려진 여러 데이터베이스에 비교한 결과 아직까지 알려지지 않은 새로운 단백질로 판명되었다. 네 번째의 펩타이드에서 Asn-Xaa-Ser의 서열을 지니고 있어 N-연결형 당쇄를 보유하고 있을 것으로 추정된다.
상기에서 분석된서열번호 12및서열번호 13으로 기재되는 펩타이드 서열은 갈렉틴 결합 단백질(galectin binding protein), L3 항원(L3 antigen), Mac-2 결합 단백질(Mac-2-binding protein), 혈청 단백질 90K(serum protein 90K), 종양 관련 항원 90K(tumor associated antigen 90K) 등의 여러 이름으로 알려져 있으며, 암이나 AIDS 환자의 혈액에서 다량 검출되며, 노던 블럿의 결과를 보면 정상조직, 1차 암, 종양유래 세포주에서 높게 발현되는 것으로 알려져 있어 질병과 관련하여 다양한 발현 양상을 보여주고 있고, 7군데의 보존된 N-연결형 당쇄의 위치를 지니고 있다(Ullich,A. et al., 1994,J Biol. Chem., 269:18401-18407).
상기에서 분석된서열번호 14및서열번호 15로 기재되는 펩타이드 서열은 TIMP-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1)으로 TIMP는 지금까지4(1-4)개가 알려져 있으며 22K에서 30K의 저분자량 단백질로 40-50%의 상동성을 지니고 있다. TIMP-1은 당질화에 의해 트레인(train) 형태로 높은 분자량의 상태를 보여주고 있는데(도 7참조), N-말단 영역이 우세하게 MMPs에 붙어 매트릭스 메탈로프로티나제(matrix metalloproteinase)의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 두 군데의 N-연결형당쇄를 포함하고 있다(Gomls-Reuth F. et al., 1997,Nature, 389:77-81).
상기에서 밝혀낸 다섯가지 단백질에서 갈렉틴 결합 단백질(종양 관련 항원 90K) 및 TIMP-1은 암의 발생과 전이에 직접적으로 관여한다고 알려져 있으나, 상기 두 단백질 또한 암과 연관되어 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지 변화를 알려주는 직접적인 보고는 현재까지 발표되지 않았다.
상기에서 밝혀낸 암 발생 및 전이에 관여하여 당쇄변화를 나타내는 단백질들은 당단백질로 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오기 때문에, 혈액이나 소변 등의 체액에 존재하는 상기 단백질의 발현 및 N-연결형 당쇄변화를 측정하여 암을 진단할 수 있다.
상기 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질을 이용하여 암을 진단하는 방법은 환자로부터 시료를 채취하는 단계(단계 1) 및 상기 시료를 대상으로 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 발현 및 N-연결형 당쇄변화를 측정하는 단계(단계 2)로 이루어진다.
단계 1의 시료는 혈액 또는 소변으로부터 채취하고, 바람직하게는 일반적인혈청 분리방법을 통해 시료를 채취한다.
상기 진단 방법의 단계 2에서 이용되는 구체적인 측정방법으로는 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 분석방법이 사용될 수 있다. 그 중에서도, 항원-항체 결합의 분석에 흔히 사용되는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법과 면역 블롯(Immunoblot) 방법이 바람직하다.
본 발명자들은 바람직한 실시예로서 암을 진단하기 위하여 상기에서 밝혀낸 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질에 대한 항체를 생산하고, 상기 항체를 이용하여 ELISA 방법을 수행하여 단백질의 발현 정도 및 N-연결형 당쇄변화를 측정하는 방법을 제공한다.
ELISA 방법을 이용하여 단백질의 발현 정도 및 N-연결형 당쇄변화를 측정하는 방법은
1) 기질에 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질에 대한 항체를 흡착시키는 단계;
2) 상기 기질에 검체의 혈청을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계;
3) 표지된 동일 항체 또는 표지된 L4-PHA를 첨가하여 반응시키는 단계;
4) 상기 기질을 세척한 후 발색효소 또는 형광물질이 결합된 2차 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
5) 발색기질액을 첨가하여 발색시킨 후 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하는 단계로 구성된다.
단계 1의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 96 웰 플레이트를 사용하였다.
단계 3에서 표지는 바이오틴(biotin) 등과 같은 화합물을 사용할 수 있고, 바이오틴-표지된 동일 항체에 의해서는 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 발현을 정량분석 또는 정성분석할 수 있고, 바이오틴-표지된 L4-PHA에 의해서는 N-연결형 당쇄변화인 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지 변화를 측정할 수 있다.
단계 4에서 항체에 결합된 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 퍼옥시데이즈가 결합된 항체를 사용하였다.
단계 5에서 발색기질액은 ABTS[2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 상기 퍼옥시데이즈에 의해 발색되는 OPD를 사용하였다.
본 발명의 암 진단 방법에서는, 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하여 대량으로 시료를 분석할 수 있다.
또한, 본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 발현 또는 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 킷트를 제공한다.
상기에서 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며 반드시 여기에 포함되는 것은 아니며, 모든 종류의 암이 본 발명의 대상이 될 수 있다.
상기 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질은 정상세포에 비하여 암 세포 및 전이된 세포에서 당쇄변화를 일으키는 단백질 즉, PDF, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제, 갈렉틴 결합 단백질, L3 항원, Mac-2 결합 단백질, 혈청 단백질 90K, 종양 관련 항원 90K, TIMP-1 및서열번호 6내지서열번호 11로 기재되는 펩타이드를 포함하는 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질이다.
본 발명의 진단킷트는 상기 단백질의 발현을 정량분석 또는 정성분석하거나, N-연결형 당쇄변화인 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄가지변화를 측정하며, 상기 분석을 위하여 ELISA 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질에 대한 항체를 제조하여 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 진단킷트는 상기 단백질에 대한 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄가지변화를 측정하기 위하여 L4-PHA를 포함한다.
상기에서 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 진단킷트는 암을 진단하기 위해 생물학적 마이크로 칩을 이용한 자동화된 분석 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 암 발생 및 전이에 관여하여 당쇄변화를 나타내는 단백질들을 글래스 슬라이드 등의 표면에 고정화시켜 단백질 칩을 제작하고, 이들 단백질의 당쇄변화를 동시에 측정하도록 진단킷트를 구성할 수 있다. 이와 같은 진단킷트는 상기 단백질, 적당한 완충용액 및 L4-PHA등을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포주의 2차원 전기영동과 렉틴 블럿팅
본 발명자들은 GnT-V/WiDr 세포주를 대장암의 모델 시스템으로 보고 세포주수준에서의 프로테오믹스를 시도하였다. 세포를 배양한 후 세포내(intracellular)와 세포외로 분비(media)되는 단백질에서 본 효소가 관여하여 암의 악성화를 도모하는 구체적 목표 단백질군에 대하여 조사하였다. 대조군 세포주인 Mock/WiDr, ets-1을 과발현하는 세포주인 ets-1/WiDr 및 GnT-V를 과발현하는 세포주인 GnT-V/WiDr을 10% 송아지 혈청(FCS)을 포함하는 RPMI(Gibco BRL사) 배지에서 성장시켰다. 과발현 세포주는 미국의 ATCC(American Type Tissue Culture)사에서 사들인 대장암 세포주 WiDr에 진핵세포 과발현 플라스미드(Ko,et al.,1999,J. Biol. Chem.,274(33):22941-22948)와 여기에 전사인자 ets-1 그리고 당전이효소 GnT-V를 도입한 후 세포에 감염(transfection)시키고 네오마이신 내성 유전자에 대응하여 350μg/ml의 농도로 G418을 처리한 후 콜로니가 형성되었을 때 ets-1은 항체를 이용한 웨스턴 블럿으로, GnT-V는 cDNA를 이용한 노던 블럿으로 탐색하여 과발현 세포주를 확립하였다. 배양 2-3일 후 CO2배양기에서 90% 정도로 바닥을 세포가 덮었을 때(confluent) PBS(phosphate buffered saline)로 2회 이상 씻어 잔존 혈청을 제거하였다. 스크래퍼(scrapper)로 세포를 긁어모은 다음 PBS를 가하여 세척하였고 1 ㎖의 PBS에 현탁시킨 다음 초음파 파쇄기로 1분씩 3회 세포를 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄액에 TCA(trichloroacetic acid)를 포함하는 아세톤을 최종 10%가 되게 가하여 단백질만을 침전시켰다. 아세톤으로 3회 이상 씻어 잔류 TCA를 제거하고 말린 다음 겔 로딩 완충용액(8M Urea, 2% Triton X-100, 20mM DTT, 0.5% carrier ampholyte, Bromophenol Blue dye)을 가하여 녹였고, 1차원 전기영동장치(Multiphor-II, Pharmarcia 사)를 이용하여 1차원 전기영동을 실시하였다(18 cm drystrip pH 3-10). 상기 전개된 1차원 전기영동 겔을 SDS와 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol)을 포함하는 평형 완충용액으로 평형화시킨 후 2차원 전기영동 장치(Protean Ⅱ, Bio-Rad사)를 이용하여 12% 폴리아크릴아미드에서 2차원 전기영동을 실시하였다. 각각 2장의 겔을 확보한 후 한 장은 바이오세이프(Biosafe, Bio-Rad사) 염색액을 이용하여 쿠마지 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색하였다. 또 다른 한 장은 반-건조 이동장치(Semi-Dry transfer, Bio-Rad사)를 이용하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 바이오틴(Biotin) 표지된 L-PHA 렉틴을 가하여, 상기 가지를 지닌 당단백질에 붙도록 한 후 HRP-표지된 스트렙토아비딘(Streptoavidin)을 붙이고 ECL 형광반응을 이용하여 필름에 감광시켰다.
대조군(Mock/WiDr)과의 직접적인 비교를 위하여 동일조건에서 1차원(등전점 분리) 전기영동을 시도하고 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하였고(도 3), 겔의 단백질을 PVDF 막으로 이동시켜 GnT-V의 산물 특이적인 렉틴 L4-PHA로 블럿하였다(도 4). 3회 이상의 2차원 전기영동을 시도하고 세포내의 단백질 발현의 변화를 소프트웨어(PDQUEST, Bio-Rad 사)를 이용하여 분석한 결과, 단백질의 발현 양상에서 4배 이상의 차이를 보여주는 단백질은 나타나지 않았으며,도 4의 렉틴 블럿에서도 커다란 변화를 보여주지 않았다.
<실시예 2> 무혈청 배지의 2차원 전기영동과 렉틴 블럿팅
본 발명자들은 무혈청배지에서 세포주를 배양하고 이를 통해 당쇄의 변화를 알아보았다. 구체적으로, Mock/WiDr 세포주, ets-1/WiDr 세포주 및 GnT-V/WiDr 세포주를 10% 송아지 혈청(FCS)을 포함하는 RPMI(Gibco BRL사) 배지에서 성장시켰다. 2, 3일 후 CO2배양기에서 80% 정도로 바닥을 세포가 덮을 때 PBS로 2회 이상 씻어 잔존 혈청을 제거하였다. 이어 혈청을 포함하지 않는 RPMI 배지를 넣고 48시간 배양한 후 배양액을 수거하였다. 배지를 농축한 후 최종 10%가 되게 TCA(trichloro acetic acid)를 포함하는 아세톤을 가하여 단백질만을 침전시켰다. 아세톤으로 3회 이상 씻어 잔류 TCA를 제거하고 말린 다음 겔 로딩 완충용액(8M Urea, 2% Triton X-100, 20mM DTT, 0.5% carrier ampholyte, Bromophenol Blue dye)을 가하여 녹인 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 1차원 전기영동과 2차원 전기영동을 수행하였다.
2차원 전기영동의 결과, FCS가 미량 남아있고 PTM(post translational modification)의 현격한 변화가 예상되므로 발현양의 비교는 소프트웨어의 한계상 어려움이 있었다. 반면 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 L-PHA 렉틴 블럿의 경우 대조군에 비하여 ets-1 과발현 세포주에서 진한 스팟(spot)이 생겼고, ets-1 과발현 세포주에 비하여 GnT-V 과발현 세포주에서 더욱 진한 스팟이 나타났다(도 5및도 6). 이중 12개의 스팟을 잘라내었고 5개의 스팟을 동정하였다.
<실시예 3> ESI/Q-TOF 질량 분석기를 이용한 단백질의 서열분석
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 선별한 5개의 스팟에 있는 단백질을 동정하기 위하여, 상기 실시예 2의 렉틴 블럿, 즉 X-선 필름에 감광되고 난 PVDF 막을 다시 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하여 감광된 필름에 붙여 스팟의 정확한 위치를 확인하고 처음부터 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색된 겔 상에서 해당하는 스팟을 잘라내었다. 30%의 메탄올과 100% 아세토나이트릴을 이용하여 탈색 후 10 U의 트립신(trypsin, Promega 사)을 가하여 37℃에서 하룻밤 동안 절단하였다. 절단된 펩타이드를 아세토나이트릴로 추출한 후 원심 동결 건조기로 건조하고 ESI/Q-TOF(Electrospray Ionization/Quadruple Time of Flight) 질량 분석기로 아미노산 서열을 결정하였다. ESI는 각 펩타이드를 분리해 주는 효과가 있으며, 연속질량 분석(tandom mass)은 서열분석이 가능하도록 구성된 장치이다.
그 결과, ESI/Q-TOF에 의해서열번호 1내지서열번호 15로 기재되는 펩타이드 서열이 결정되었고, 상기 서열은 단백질의 데이타베이스와 비교하여 정확한 단백질의 이름을 동정하였으며 각각의 서열과 분자량(MW), 등전점(pI) 등을 나타내었다(표 1).
| No | 서열 | 이름 | 주요 기능 | M.W | pI | N-연결 당질화 |
| a | 서열번호 1 서열번호 2 | GDF-15 | PLAB/TFG-β패밀리 | 34168.6 | 9.79 | 유 |
| b | 서열번호 3 서열번호 4 서열번호 5 | 사이클로필린 | 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이소머라제 A | 18012.7 | 7.86 | 유 |
| c | 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8 서열번호 9 서열번호 10 서열번호 11 | 미확인 | 미확인 | 약 20K | 약 5.5 | 유 |
| d | 서열번호 12 서열번호 13 | 갈렉틴3 결합 단백질 | 갈렉틴 결합 혈청 단백질 | 65331.6 | 5.13 | 유 |
| e | 서열번호 14 서열번호 15 | TIMP-1 | 메탈로프로티나제의 조직 저해제 | 23171.1 | 8.46 | 유 |
이들에 대한 지금까지 알려진 특성은 하기와 같으며 N-연결형 당쇄는 Asn-Xaa-Thr/Ser 이라는 배열상에서 Asn에 생긴다는 공지의 사실에 근거하여 확인하였다.(Varki et al, 1999,Essentials of glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA, pp85-100).
상기표 1의서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 펩타이드 서열을 포함하는 a 즉 PDF(prostate-derived factor)는 TGF(transforming growth factor)-β 패밀리의 구성원인 BMPs(Bone morphogenetic proteins) 단백질 중의 하나로 2군데의 보존된 N-연결형 당쇄의 위치를 지니고 있다. 이 단백질은 PDF 뿐만 아니라, MIC-1(macrophage inhibitory cytokine-1), PLAB(placental bone morphogenic protein), GDF-15, PTGFP등의 이름으로 여러 그룹에 의해 발견되었다.
서열번호 3,서열번호 4및서열번호 5로 기재되는 펩타이드 서열을 포함하는 b는 T 세포 사이크로필린(cyclophilin)으로 알려진 것으로 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이소머라제(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)라고도 하는데 3군데의 보존된 N-연결형 당쇄의 위치를 지니고 있다.
서열번호 6내지서열번호 11로 기재되는 펩타이드 서열을 포함하는 c는 기존의 알려진 여러 데이터베이스에 비교한 결과 아직까지 알려지지 않은 새로운 단백질로 판명되었다. 네 번째의 펩타이드에서 Asn-Xaa-Ser의 서열을 지니고 있어 N-연결형 당쇄를 보유하고 있을 것으로 추정된다.
서열번호 12및서열번호 13로 기재되는 펩타이드 서열을 포함하는 d는 갈렉틴 결합 단백질(galectin binding protein), L3 항원, Mac-2-결합 단백질(Mac-2-binding protein), 혈청 단백질 90K(serum protein 90K), 암 관련 항원 90K(tumor associated antigen 90K) 등의 여러 이름으로 알려져 있으며, 7군데의 보존된 N-연결형 당쇄의 위치를 지니고 있다.
서열번호 14및서열번호 15으로 기재되는 펩타이드 서열을 포함하는 e는 TIMP-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1)으로 상기에서 ESI/Q-TOF에 동정된 timp-1의 예로서 정확하게 펩타이드 서열이 어떻게 분석되는 지를 나타내었다(도 7). TIMP-1은 도 7에서 보는 바와 같이 당질화에 의해 트레인(train) 형태로 높은 분자량의 상태를 보여주고 있으며, 두 군데의 N-연결형 당쇄를 포함하고 있다.
<실시예 4> 단백질의 발현 또는 당쇄가지변화 측정
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 밝혀낸 단백질의 발현 또는 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하고자, ELISA 방법을 이용하여 상기 단백질의 발현 및 N-연결형 당쇄변화를 측정하였다.
우선 목표 단백질 cDNA를 확보한 다음 진핵세포 유전자 발현 벡터에 클로닝하였고, 이를 WiDr 세포주에 클로닝하였고 배양액으로부터 각각을 1 ㎎ 정도 정제한 다음 보조제(adjubant)와 섞어 토끼의 피하에 주사하여 폴리클로날(polyclonal) 항체를 제조하였다. 상기에서 제조한 항체를 일정 양씩 두장의 96 웰 플레이트에 붙였다. 즉, 96 웰 플레이트(Maxisorb, Nunc사)에 박테리아 유래의 단백질 A를 웰 당 1 ㎍씩 0.1 M 소듐 카보네이트(sodium carbornate, pH 9.6) 100 ㎕하에서 붙였다. 이어 TBS-T(Tris-buffered saline-Tween, 0.2M Tris-Cl, 0.4M NaCl, 0.05% Tween-20)로 씻어내고 앞서 제조한 항체를 붙이고, 다시 TBS-T로 씻어내고 3% BSA (Bovine serum albumin)를 이용하여 붙지 않은 부분을 블록킹하여 고정화된 항체 체계를 확보하였다. 이어 확인하고자 하는 혈액이나 여타의 시료를 재현성과 통계처리를 위하여 연속 희석하고 가한 다음 TBS-T로 세 번 씻어주었다. 이때 목표단백질은 각각의 특이 항체에 잘 붙어 있을 것이며, 이를 바이오틴-표지된 동일 항체와 바이오틴-표지된 L-PHA를 이용하여 항체로는 발현 정도를, 렉틴으로는 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지 변화를 확인하였다. 상기에서 바이오틴 표지된 항체를 제조하기 위하여, 항체 (5-10 ㎎/㎖)를 250 ㎖의 SBRB(succinimidyl-biotin reaction buffer)에 23℃에서 6시간동안 투석하였다. NHS-biotin(N-hydroxysuccinimidyl-biotin) 또는 NHS-LC-biotin(long chain sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido)hexanoate derivative biotin)을 DMSO (dimethylsulfoxide)하에서2-4 ㎎/㎖가 되도록 만들고, 이어 항체와 바이오틴 용액을 1:30 (Ab:biotin)의 비율로 섞은 다음 교반하여 37℃에서 한시간 방치하여 바이오틴을 붙이고 BBS(Borate buffered saline)에 투석하여 바이오틴화된 항체를 제조하였고, 렉틴의 경우에는 상용화된 바이오틴 표지 L-PHA를 이용하였다. 이어 바이오틴 표지된 각각 두장의 항체와 렉틴은 상용화된 아비딘 퍼옥시다제(Avidine-peroxidase) 킷트를 이용하여 검출하는데, 퍼옥시다제(peroxidase)의 기질인 O-페닐아민(O-phenylamine)과 H2O2를 가하고 490 nm에서의 흡광도를 조사하여 정상 혈액에 대비하여 암화나 암전이성 환자 혈액의 단백질의 발현 정도와 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지화 정도를 측정하였다.
그 결과, 암화나 암전이성 환자 혈액에서 정상 혈액에 비해서 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지화 정도가 10 내지 20배 증가한 것으로 나타났다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단 킷트는 대장암을 포함한 암을 효과적으로 진단할 수 있다.
Claims (12)
- 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 당쇄변화는 N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지변화인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질은 PDF, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제, 갈렉틴 결합 단백질, L3 항원, Mac-2 결합 단백질, 혈청 단백질 90K, 종양 관련 항원 90K, TIMP-1 및서열번호 6내지서열번호 11로 기재되는 펩타이드를 포함하는 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질에 대한 항체, 기질, 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 및 표지된 항체 또는 표지된 L4-PHA로 구성되어 있고 상기 단백질의 발현 및 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 킷트.
- 제 5항에 있어서, 상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 킷트.
- 제 6항에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 킷트.
- 제 5항에 있어서, 상기 당쇄변화는 N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄가지변화인 것을 특징으로 하는 킷트.
- 제 5항에 있어서, 상기 단백질은 PDF, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제, 갈렉틴 결합 단백질, L3 항원, Mac-2 결합 단백질, 혈청 단백질 90K, 종양 관련 항원 90K, TIMP-1 및서열번호 6내지서열번호 11로 기재되는 펩타이드를 포함하는 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는 킷트.
- 제 5항에 있어서, 상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 킷트.
- 제 5항에 있어서, 상기 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)로 구성된 군으로부터 선택되고, 발색기질액은 ABTS[2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 킷트.
- 제 5항에 있어서, 상기 표지된 항체 또는 L4-PHA는 바이오틴(biotin) 등과 같은 화합물에 의해 표지된 바이오틴-표지-항체 또는 바이오틴-표지-L4-PHA인 것을 특징으로 하는 킷트.
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