KR19980063781A

KR19980063781A - 1,5-언히드로글루시톨의 정량법 및 정량용 시약

Info

Publication number: KR19980063781A
Application number: KR1019970065879A
Authority: KR
Inventors: 에지누마히로유키; 우시자와유지
Original assignee: 구니요시이에지; 다이이치가가쿠야쿠힝가부시키가이샤
Priority date: 1996-12-04
Filing date: 1997-12-04
Publication date: 1998-10-07
Also published as: EP0846773A1; CN1138001C; CN1190188A; DE69704328T2; EP0846773B1; DE69704328D1; US5871949A; KR100478514B1

Abstract

체액을 검체로 하고 1,5-AG에 작용하며, 전자수용체 비존재하에 있어서 환원성 발색제를 직접 환원시키는 반응을 촉매하는 1,5-AG 탈수소효소를 사용하여, 바람직하게는 글루코스 소거제에 의해 검체중의 글루코스를 1,5-AG 탈수소효소와 반응하지 않는 구조로 변화시킨 후, 또는 변화시키면서, 검체중의 1,5-AG의 환원성 발색제의 존재하에서 상기 1,5-AG 탈수소효소를 작용시켜 생성하는 환원된 발색물질을 측정한다. 1,5-AG 탈수소효소로는 아그로박테리움 속에 속하며, 1,5-AG 탈수소효소 생산능을 가지는 미생물에 의해 생산된 것이 바람직하게 사용된다.

Description

1,5-언히드로글루시톨의 정량법 및 정량용 시약

본 발명은 당뇨병 등의 진단에 유용한 1,5-언히드로글루시톨의 정량법 및 정량용 시약에 관한 것이다.

1,5-언히드로글루시톨(이하 「1,5-AG」라 함)은, 사람의 혈청, 혈장, 요 등의 체액 중에 존재하며, 어떤 종류의 질환, 특히 당뇨병에 있어서, 체액중의 양이 크게 변동하는 것으로부터, 유용한 진단지표로서 근래 임상에 있어서 중요한 검사항목이 되고 있다.

이 1,5-AG의 정량법으로는 피라노스옥시다제 또는 소르보스옥시다제를 작용시켜 생성되는 과산화수소를 퍼옥시다제 발색계로 비색정량하는 방법(특공평 5-41238호 공보참조)이 주류가 되며, 근래에 범용의 자동분석장치에 응용되고 있다. 그러나 이들의 효소는 기질특이성이 약하며, 글루코스 등의 당류에도 약한 반응을 하므로 검체중의 당류를 미리 완전히 제거 또는 소거해 둘 필요가 있었다.

또한 특공평 3-24200호 공보에는, 슈도모나스 속 sp. NK-85001로부터 생산되는 1,5-AG에 특이성이 높은 1,5-AG 산화효소를 사용하여, 1,5-AG와 반응한 후의 산소의 소비량이나, 전자수용체의 환원체 등의 반응생성물을 정량하는 방법이 제안되어 있다. 그러한 산소의 소비량을 정량하는 방법등은 다검체 처리에 부적합하며, 전자수용체의 환원체를 정량하는 방법에 있어서도, 동 공보의 실시예에서 사용되고 있는 바와 같은, 페리시안화합물이나 디클로로페놀인도페놀 등을 전자수용체로 사용한 경우, 환원체 자신이 가역적이고 불안정하다든지, 감도의 면에 있어서 충분한 것이라 할 수 없어 실용적인 응용에 부적합한 방법이다.

또한 NAD를 보효소로 하는 1,5-AG 디히드로게나제(특개평 2-268679호 공보 참조)와 같은 효소를 사용하여 정량을 실시하는 경우는 NAD를 보효소로 하는 생체시료중에 함유되는 산소, 예를 들면 락트산디히드로게나제 등의 영향을 받는 경우가 있으므로, 정확성에 문제가 있다.

또한 아그로박테리움 속의 가용성부분(The Journal of Biological Chemistry vol. 242, No16, pp.3665-3672, 1967)이나, 플라보박테리움 속의 막부분에 존재가 확인되고 있는 글루코시드 3-디히드로게나제[EC 1.1.99.13]도 1,5-AG를 기질로 하는 것이 알려져 있다(Journal of Biochemistry vol. 100, No4, pp.1049-1055, 1986). 그러나 이들 효소도 기질특이성이 약하므로, 검체중의 당류를 미리 완전히 제거 또는 소거해 두는 것과 함께, 전자수용체로 페리시안화합물이나 디클로로페놀인도페놀을 사용하는 것으로부터 안정성 및 감도면에서 문제가 있다.

한편 1,5-AG의 임상적 의의로서 당뇨병환자에서는 특이적으로 혈청 또는 혈장 중의 1,5-AG 농도가 수 μg/ml 정도까지도 저하한다. 반대로 글루코스 농도는 건강인에서 100 mg/dl 정도인 것에 대하여 당뇨병환자에서는 1000 mg/dl에 달하는 경우도 있고, 1,5-AG와 글루코스와의 농도차는 수천배나 된다. 이와 같이 고농도 글루코스가 공존하는 검체중에서의 1,5-AG를 직접 정량가능한 완전하게 특이적인 효소는 아직 발견되지 않았다.

따라서 1,5-AG에 대한 특이성이 나쁘고, 오히려 글루코스와 강하게 반응하는 피라노스옥시다제 또는 소르보스옥시다제를 사용하여 정량할 때는 글루코스의 완전한 제거 및 소거가 필요하게 된다. 따라서 다양한 방법이 제안되어 있다. 예를 들면 특공평 5-41238호 공보에서는 글루코스 등의 당류를 제거하기 위해 이온교환수지를 사용한 전처리 조작을 조합시키는 방법이 제안되어 있다. 또한 글루코스 소거법으로서는 특개평 1-320998호 공보, 특공평 7-71514호 공보, 특개평 6-237795호 공보, 특개평 1-27299호 공보, 특개평 6-245796호 공보등에는 글루코스6위인산화효소(글루코키나제 또는 헥소키나제)를 사용하고, 또한 이 반응을 완결시키기 위해, 글루코스의 인산화반응의 평형을 완전히 글루코스-6-인산에 향하게 하는 고안(몇몇 종류의 효소 및 기질을 조합시킨 공역계)를 하는 방법이 개시되어 있다. 이것은 피라노스옥시다제에 대한 ATP의 저해작용을 경감하는 고안도 겸하고 있느나, 특공평 7-102154호 공보, 특공평 7-108236호 공보와 같이, 피라노스옥시다제를 작용시키는 pH 조건을 규정하는 것이나, 기원이 다른 피라노스옥시다제를 사용하는 고안에 의해, ATP의 저해작용을 없애는 방법도 제안되어 있다.

그러나 상기 방법중, 이온교환수지를 사용하는 방법은 조작이 번잡하고 다검체 처리에는 부적합하다. 또한 글루코스6위인산산화효소와 또한 몇몇 종류의 효소를 조합시키는 공역계에 의한 방법에서는 반응계가 복잡하고, 사용되는 효소 및 기질 등의 안정성에도 고려해야한다. 또한 글루코스6위인산산화효소 단독으로 처리하는 방법에 있어서도, 글루코스를 완전히 변화소거하기 위해 과잉의 ATP를 필요로 하는 것이나, 피라노스옥시다제의 기원이나 반응조건 등이 제한되는 것등 제약이 많고, 1,5-AG 측정시약으로서 조합시키기에는 범용성이 부족하다.

따라서 본 발명의 목적은 검체중의 1,5-AG를 단손한 조작으로 좋은 정밀도에서 고감도로 측정할 수 있으며, 자동분석장치에도 응용할 수 있는 1,5-AG의 정량법 및 정량용 시약을 제공하는 것에 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 1,5-AG의 분석에 이용할 수 있는 반응계에 대해서 검토하는 것과 함께, 그것들의 이용할 수 있는 효소에 대해서 검색을 실시하였다. 그 결과, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속에 속하는 미생물의 막부분중에 1,5-AG를 특이적으로 산화시키는 신규 효소(이하 「1,5-AG 탈수소효소」라 함)가 존재하는 것, 이 1,5-AG 탈수소효소를 1,5-AG에 작용시키면, 1,5-AG의 2번위치의 수산기를 산화시키는 것과 함께 2,6-디클로로페놀인도페놀 등의 전자수용체를 환원시키는 반응을 촉매하는 것, 및 당해 반응을 환원성 발색제를 사용하여 실시하면, 전자수용체의 비존재하에서도 1,5-AG의 2번위치의 수산기를 산화하는 것과 함께 환원성 발색제를 직접 환원하여 발색 물질을 생성시키는 것을 발견하고 이들의 사실에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명의 1,5-AG의 정량법은 1,5-AG에 작용하며, 전자수용체 비존재하에 있어서 환원성 발색제를 직접 환원하는 반응을 촉매하는 1,5-AG 탈수소효소를 사용하며, 검체중의 1,5-AG에 환원성 발색제의 존재하에서 상기 1,5-AG 탈수소효소를 작용시켜 생성되는 환원된 발색물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 것이다.

또한 본 발명의 1,5-AG 정량용시약은 1,5-AG에 작용하는 동시에 전자수용체 비존재하에 있어서 환원성 발색제를 직접 환원시키는 반응을 촉매하는 1,5-AG 탈수소효소와 환원성 발색제를 함유하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명에 의하면, 1,5-AG를 함유하는 검체에 환원성 발색제를 첨가하고 이것에 1,5-AG 탈수소효소를 작용시키는 것에 의해, 1,5-AG 탈수소효소가 1,5-AG에 특이적으로 작용하여 1,5-AG를 산화하는 것과 함께, 환원성 발색제를 직접 환원시켜 발색시킨다. 이 반응은 비가역적 반응이며 생체 시료등에 함유되어 있는 효소의 영향을 받는 것도 아니므로, 고감도이며 정확한 정량이 가능하게 된다. 또한 반응계가 간단하여 구성시약의 수도 적으므로 작업성이 향상되며, 자동분석장치에의 적용도 용이하다.

도 1은 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주를 배양하여 얻어진 1,5-AG 탈수소효소의 최적 pH를 보이는 도면이며,

도 2는 상기 1,5-AG 탈수소효소의 pH 안정성을 보이는 도표이며,

도 3은 상기 1,5-AG 탈수소효소의 최적온도를 보이는 도표이며,

도 4는 상기 1,5-AG 탈수소효소의 온도안정성을 보이는 도표이며,

도 5는 상기 1,5-AG 탈수소효소, 아그로박테리움·투메파시엔스 IF013532 유래의 1,5-AG 탈수소효소, 및 아그로박테리움·투메파시엔스 IF013533 유래의 1,5-AG 탈수소효소의 보존안정성을 비교하여 보이는 도표이며,

도 6은 환원성 발색제를 함유하는 제 1 시약과, 1,5-AG 탈수소효소를 함유하는 제 2 시약을 사용하고, 각종 농도의 1,5-AG 용액을 측정한 결과를 보이는 도표이며,

도 7은 환원성 발색제를 함유하는 제 1 시약과, 1,5-AG 탈수소효소를 함유하는 제 2 시약을 사용하고, 일정 농도의 1,5-AG를 함유하는 용액에 글루코스 농도를 변화시켜 첨가한 용액을 측정한 결과를 보이는 도표이며,

도 8은 환원성 발색제 및 글루코스 소거제를 함유하는 제 1 시약과, 1,5-AG 탈수소효소를 함유하는 제 2 시약을 사용하고, 일정 농도의 1,5-AG를 함유하는 용액에 글루코스 농도를 변화시켜 첨가한 용액을 측정한 결과를 보이는 도표이며,

도 9는 환원성 발색제, 글루코스 소거제, 1,5-AG 탈수소효소를 함유하는 시약을 사용하고, 일정 농도의 1,5-AG를 함유하는 용액에 글루코스 농도를 변화시켜 첨가한 용액을 측정한 결과를 보이는 도표이다.

본 발명에 있어서의 검체로는 1,5-AG의 농도를 측정하고 싶은 것이면 특히 제한이 없으며, 예를 들면 혈청, 혈장 또는 요 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 1,5-AG 탈수소효소는 1,5-AG에 특이적으로 작용함과 함께 전자수용체 비존재하에 있어서 환원성 발색제를 직접 환원시키는 반응을 촉매하는 것이면 특히 제한되지 않는다. 단 바람직하게는, 아그로박테리움 속에 속하며, 1,5-AG 탈수소효소 생산성을 가지는 미생물, 특히 아그로박테리움·투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) IFO13532, 아그로박테리움·투메파시엔스 IFO13533, 및 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주로부터 생산되는 것이 사용된다.

여기서 아그로박테리움·투메파시엔스 IFO13532, 및 아그로박테리움·투메파시엔스 IFO13533는 재단법인 발효연구소(INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA(IFO), 주소: 일본 532 오오사카후 오오사카시 요도가와쿠 쥬산혼마치 2쵸메 17반 85고(17-85, Jusanhonmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan)으로부터 입수할 수 있는 시판의 균주이다.

또한 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주는 특허수속상의 미생물의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL, RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE)에 기초하여 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of International an Technology, 주소: 일본 305 이바라키켄 츠쿠바시 히가시1쵸메 1반 3고(1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan))에, 기탁번호 FERMBP-5997호로서 기탁되어 있다. 기탁자는 다이이치가가쿠야쿠힝 가부시키가이샤(DAIICHI PURE CHEMICALS CO., LTD., 주소: 일본 103 도쿄도 쥬오쿠 니혼바시 3-쵸메 13반 5고(13-5, Nihonbashi 3-chome, Chuo-ku, Tokyo 103, Japan))이다.

이중에서도 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주는 본 발명자들이 토양으로부터 분리한 주이며, 기존균주인 아그로박테리움·투메파시엔스 IFO13532, 및 아그로박테리움·투메파시엔스 IFO13533 유래의 1,5-AG 탈수소효소와 비교하여 보존안정성이 우수하여 특히 바람직하다. 물론 보존균주의 중에서 선택하는 것 뿐만이아니라, 토양 등의 자연계로부터도 분리하여도 좋고, 변이균주를 사용하여도 좋으며, 이들의 균주로부터 효소생산에 관여하는 유전자를 숙주에 재조합하여 효소생산을 시켜도 좋다.

참고로 상기 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주의 균학적 성질을 기재하면, 다음과 같다.

A. 형태학적 특징

1) 세포의 형태 및 크기: 간균이며 크기는 (0.3 내지 0.5)×(1.0 내지 3.0) μm이다.

2) 포자의 유무: 무

3) 운동성: 운동성이 있고, 주(周)편모를 가진다.

4) 그람염색성: 음성

B. 생리학적 성질

1) 카탈라제: 양성

2) 옥시다제: 양성

3) 우레아제: 양성

4) 젤라틴액화: 음성

5) 인돌 생성: 음성

6) 황화수소 생성: 음성

7) 시트르산 이용: 음성

8) 에스쿨린 분해성: 양성

9) β-갈락토시다제: 양성

10) 질산염의 환원: 양성(±)

11) 산소에 대한 태도: 호기성

12) 생육온도: 25 내지 35℃

13) 당류에 대한 태도: 글루코스, 크실로스, 만노스, 아라비노스, 프럭토스, 말토스, 람노스, 만니톨, 사카로스로부터 산을 생성하고 가스는 발생하지 않는다.

C. 퀴논조성분석

유비퀴논-10(98%)

이상의 결과로부터 이 균주는 아그로박테리움 속으로 분류된다고 사료된다. 통상 미생물의 동정시에는 각 미생물의 분류학적 성질이 종합되어 있는 「바디즈 매뉴얼 오브 디터미네이티브 박테올로지」와 대비시켜 미생물의 동정이 실시되지만, 본 균이 속하는 것으로 생각되는 아그로박테리움 속에 관해서는, 최근 16SrRNA의 유전자배열에 의한 계통적 분류가 시험되며(International Journal of Bacteriology vol. 43, 1993, p. 694-702, 및 vol. 44, No. 2, 1994, p. 373-374 참조), 그 결과에 기초하여 분류기준이 변경되고 재편성되었다. 그 결과 종의 통합이나 균주의 분류변경이 가해져 「바디즈 매뉴얼 오브 디터미네이티브 박테올로지」와의 정합성이 유지되지 않게 되었다.

따라서 본 균에 대해서도 16SrRNA의 유전자배열에 의한 계통적 분류를 시험하였다. 방법으로는 본 균의 16SrRNA의 전체유전자배열을 구하고, 유전자의 데이터베이스(Genbank, EMBL 및 DDBJ)에 등록공개되어 있는 미생물의 유전자배열과의 상동성을 검색한 결과, 아그로박테리움·투메파시엔스와의 상동성이 99.4%로 유의하게 일치하였다. 이 결과로부터 본 균주는 아그로박테리움 속 투메파시엔스 종에 속하는 세균인 것으로 동정되며, 본 균주를 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주로 명명하였다. 본 균은 상기한 바와 같이, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 97년 6월 27일 기탁되었고, 그 기탁번호는 FERM BP-5997이다.

본 발명에서 사용되는 1,5-AG 탈수소효소는, 예를 들면 상기 균주를 영양배지에서 배양하고, 막부분중에 1,5-AG 탈수소효소를 생성축적시키고, 이것을 채취하는 것에 의해 제조할 수 있다. 상기 영양배지로는 탄소원, 무기질소원 및 무기염을 함유하는 배지가 사용된다. 탄소원으로는 기본적 당류를 사용하며, L-소르보스, 글루코스 등을 효소유도하는 것이면 사용할 수 있다. 무기질소원으로는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등을, 무기염으로는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 철, 망간 등의 염류를 사용할 수 있다.

배양은 진탕, 통기교반 등의 방법에 의한 호기적 조건하에서 실시하는 것이 좋고, pH 6 내지 8, 25 내지 35℃에서 실시하는 것이 바람직하다. 배양기간은 1 내기 7일간, 통상은 2 내지 4일간으로 완료한다. 상기 방법으로 배양하는 것에 의해 주로 균체의 막부분중에 1,5-AG 탈수소효소가 생성축적된다.

배양후, 미생물중에서 본 발명 효소를 취득하기 위해서는 적당한 완충액중에서 균체를 다이노실, 초음파처리 등에 의해 파괴하고, 그 처리액으로부터 막부분을 초원심 등에 의해 분리한다. 이어서 트리톤X-100 등의 비이온계 계면활성제에 의해 막부분으로부터 효소를 분리시키고, 불용성 부분을 원심분리에 의해 제거하면, 1,5-AG 탈수소효소 함유 추출액을 얻을 수 있다. 정제효소는 이 추출액을 소수성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 히드록시아파타이트, 겔여과 등의 효소의 정제에 일반적으로 이용되고 있는 기술을 적절히 조합시켜 정제하는 것에 의해 얻을 수 있다.

상기한 바와 같은 방법으로, 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주로부터 채취된 1,5-AG 탈수소효소는 이하와 같은 이화학적 성질을 보인다.

또한 1,5-AG 탈수소효소의 역가는 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 즉, 0.2 M 인산칼륨완충액(pH 8.0) 1.5 ml, 0.25 중량% 니트로테트라졸륨 블루 0.3 ml, 2 중량% 비이온성 계면활성제 0.3 ml, 50 mM 1,5-언히드로글루시톨 수용액 0.3 ml, 물 0.45 ml, 및 효소용액 0.15 ml로 이루어지는 총량 3.0 ml의 효소함유액을 37℃에서 반응시키고, 540 nm에서 흡광도 변화(Δ mOD/분)를 측정한다. 이 조건하에서 생성되는 포르마잔 색소의 분자흡광계수를 16.7×10³으로 하고, 1분간 1 μmol의 포르마잔을 생성하는 효소량을 1 단위(unit)로 하고, 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소의 활성을 하기 수학식 1에 따라 구한다.

(1) 작용:

1 mM 2,6-디클로로페놀인도페놀 및 2.5 mM 1,5-AG를 함유하는 100 mM 트리스·염산 완충액(pH 9.0)에 본 발명 효소를 첨가하고, 37℃에서 반응시키고, 경시적으로 반응액중의 생성물과 반응의 몰균형을 표 1에 보이는 조건으로 고속액체크로마토그래피(HPLC)하여 분석하였다.

	HPLC 분석조건
칼럼	Shodex SUGAR SH1011
용리액	물
칼럼 온도	30℃
유속	0.75 ml/분
검출기	시차굴절율계(RI)

그 결과, 반응의 진행과 함께 리텐션타임 10.0분의 1,5-AG의 피크가 감소하고, 새로운 리텐션타임 9.6분의 위치에 반응물의 피크가 나타났다. 이 반응의 몰밸런스는 일치하고 있었다. 또한 1,5-AG의 3번째 위치의 수산기를 산화시키는 작용이 있는 글루코시드-3-디히드로게나제(EC 1.1.99.13)을 동일한 조건에서 반응시키고, HPLC로 분석한 결과, 1,5-AG의 피크 감소와 함께 새로운 리텐션타임 10.8분의 위치에 반응물의 피크가 나타났다. 한편 1,5-AG의 2번째 위치의 수산기를 산화하는 작용을 가지는 피라노스옥시다제(EC 1.1.3.10)을 2.5 mM 1,5-AG를 함유하는 40 mM 붕산완충액(pH 7.5)에 첨가하고, 37℃에서 반응시킨 결과, 1,5-AG의 피크 감소와 함께, 새로운 리텐션타임 9.6분의 위치에 반응물의 피크가 나타났다. 이들의 결과에 있어서, 1,5-AG에 본 효소를 작용시킨 경우의 반응생성물과 피라노스옥시다제를 작용시킨 경우의 반응생성물의 리텐션타임이 일치하고 있는 것으로부터, 본 효소에 의한 1,5-AG의 산화부위는 2번째 위치의 수산기임을 알 수 있다.

(2) 기질특이성:

상기한 효소활성 측정법에 있어서, 1,5-AG의 대신에 각종 당용액(모두 농도 5 mM)을 사용한 경우의 상대반응성(기질특이성)을 표 2에 보인다. 본 효소는 1,5-AG에 대하여 강하고, L-소르보스에 대해서는 약하게 작용하고, D-글루코스에 약간 작용하였다.

기질	상대활성 (%)
1,5-AG	100
L-소르보스	25
D-글루코스	11
D-갈락토스	0
D-프럭토스	2
글루시톨	0
미오이노시톨글리세롤	0
말토스	0

(3) 최적 pH:

본 효소를 사용하여 상기의 효소활성측정중에서 완충액의 대신에 여러 pH의 시트르산완충액, 인산칼륨완충액, 트리스염산완충액 및 글리실완충액을 사용한 경우의 효소활성을 측정하였다. 이 결과를 도 1에 보인다. 도 1에서 본 효소의 최적 pH는 8.0 내지 9.0 부근임을 알 수 있다.

(4) pH 안정성:

여러가지의 pH를 가지는 시트르산완충액, 인산칼륨완충액, 트리스염산완충액 및 글리신완충액(각 완충액 모두 200 mM)에 본 효소를 첨가하고, 37℃에서 60분간 처리후, 잔존 효소활성을 측정하였다. 이 결과를 도 2에 보인다. 도 2로부터 본 효소의 안정 pH범위는 6.0 내지 9.0임을 알 수 있다.

(5) 최적 온도:

본 효소를 사용하여 상기의 효소활성측정법에 있어서의 조성으로 여러 온도에서 10분간 반응시켰다. 이 결과를 도 3에 보인다. 도 3에서 본 효소의 최적온도는 35 내지 45℃ 부근임을 알 수 있다.

(6) 온도 안정성:

본 효소를 20 mM 인산칼륨완충액에 첨가하고, 여러 온도에서 10분간 처리후, 잔존효소활성을 측정하였다. 이 결과를 도 4에 보인다. 도 4에서 본 효소는 40℃ 부근까지 90% 이상 안정함을 알 수 있다.

(7) 전자수용체:

100 mM 인산칼륨완충액(pH 8.0)중에 본 효소와 함께 여러 전자수용체를 공존시킨 경우의 각 전자수용체으로의 활성을 상대활성으로 나타내고, 표 3에 보였다. 표 3에서 전자수용체로서는 환원성 발색제인 니트로테트라졸륨 블루 외에, 2,6-디클로로페놀인도페놀 및 페리시아니드 화합물이 이용 가능함을 알 수 있다.

전자수용체	최종순도(mM)	상대활성(%)
2,6-디클로로페놀인도페놀	0.1	100
페리시안화 칼륨	10.0	67
티트크롬C	0.1	0
NAD	1.0	0
NADP	1.0	0
산소	용존산소	0
니트로테트라졸륨 블루	1.0	53

(8) 분자량:

도데실황산-폴리아크릴아미드 전기영동법에 의해 구한 본 효소의 분자량은 약 55,000이었다.

(9) Km치:

라인위버벌크(Lineweaver-Burk) 플롯에 의해 본 효소의 1,5-AG에 대한 Km치를 구한 결과, 약 0.5 mM이었다.

(9) 보존안정성:

100 mM 트리스-염산완충액(pH 7.0)중에 0.1 u/ml의 농도에서 용해시키고, 4℃의 조건에서 14일간 보존하고 7일간 및 14일간 보존후 잔존활성을 측정한 결과를 도 5에 보인다.

한편 비교를 위해 재단법인 발효연구소에 기탁되어 분양가능한 공지 균주인 아그로박테리움·투메파시엔스 IF013532, 아그로박테리움·투메파시엔스 IF103533을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 제조한 1,5-AG 탈수소효소에 대하여 상기와 동일한 보존안정성을 측정한 결과를 도 5에 함께 보인다.

도 5 중, ■-■는 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주 유래의 본 발명의 효소의 결과를 보이며, ◆-◆는 아그로박테리움·투메파시엔스 IF013532 유래의 효소의 결과를 보이며, ▲-▲는 아그로박테리움·투메파시엔스 IF103533 유래의 효소의 결과를 보인다.

도 5에 보인 바와 같이, 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주 유래의 1,5-AG 탈수소효소는 14일간 보존한 후의 잔존활성이 90% 이상으로 우수한 보존안정성을 보인다. 이것에 대하여 아그로박테리움·투메파시엔스 IF013532 유래의 1,5-AG 탈수소효소 및 아그로박테리움·투메파시엔스 IF103533 유래의 1,5-AG 탈수소효소는 14일간 보존한 후의 잔존활성이 모두 40%이하로서 보존안정성이 떨어진다.

또한 본 발명자들이 발견한 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주 유래의 1,5-AG 탈수소효소는 아그로박테리움·투메파시엔스 IF013532 유래의 1,5-AG 탈수소효소 및, 아그로박테리움·투메파시엔스 IF103533 유래의 1,5-AG 탈수소효소와 비교하여 상기 보존안정성에 있어서 현저히 다르지만, 그 외의 이화학적 성질에 있어서는 유의차가 없었다.

본 발명의 1,5-AG의 정량법은, 예를 들면 다음과 같은 방법으로 실시할 수 있다. 즉, 피검체를 환원성 발색제의 존재하에 1,5-AG 탈수소효소 또는 이것을 함유하는 효소제제와 함께 가온처리하고, 2-케토-1,5-AG 및 환원된 발색물질을 생성시키고, 생성된 발색물질량을 측정하는 것에 의해 피검체 중의 1,5-AG 양을 정량할 수 있다.

상기 측정법에 사용할 수 있는 완충액으로는 pH 6-10의 인산완충액, 트리스 염산완충액, 굿완충액, 붕산완충액 등 통상 사용되는 것이면 모두 사용할 수 있다.

환원성 발색제로는 테트라졸륨 또는 그 염 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 니트로테트라졸륨 블루(이하 NTB라 약칭함), 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)5-페닐-2H 테트라졸륨클로라이드, 3-4(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H 테트라졸륨브로마이드, 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술로페닐)-2H 테트라졸륨염(이하 WST-1이라 약칭함) 등을 이용할 수 있으며, 그 사용 농도는 50 내지 2000 μmol/l 특히 100 내지 1000 μmol/l의 범위가 바람직하다.

본 발명의 정량법에 있어서, 1,5-AG 탈수소효소 20 내지 10,000 단위/리터, 특히 200 내지 2,000 단위/리터의 범위에서 사용하는 것이 바람직하다.

반응액 중의 환원된 발색성물질의 측정은 상기와 같이 하여 반응시킨 후, 발색물질 특유의 흡수파장에 있어서, 일정시간후의 흡광도 또는 일정시간내의 흡광도변화를 측정하는 것에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 정량법에 있어서는 검체중의 글루코스를 1,5-AG 탈수소효소가 작용하지 않는 형태로 변화시킨 후, 또는 변화시키면서 검체중의 1,5-AG의 환원성 발색제의 존재하에 상기 1,5-AG 탈수소효소를 작용시키는 것이 바람직하다. 따라서 시약중에는 글루코스 소거제를 함유하는 것이 바람직하며, 이 글루코스 소거제로는 글루코스6위인산화효소와 아데노신삼인산을 함유하는 것이 바람직하게 사용된다.

본 발명에 사용되는 1,5-AG 탈수소효소는 1,5-AG에 대한 특이성이 높지만, 완전히 특이적이지는 않고, 글루코스에 대하여 약간의 작용이 확인된다. 따라서 1,5-AG과 글루코스와의 농도차가 수천배나 되는 당뇨병 환자의 혈청 또는 혈장중의 1,5-AG을 측정하는 경우는, 글루코스의 영향을 적지않게 받게 된다. 따라서 글루코스 소거제를 병용하는 것에 의해, 당뇨병 환자의 혈청, 혈장 등을 검체로 한 경우의 측정 정밀도를 더욱 높일 수 있다.

이 경우, 본 발명에서는 검체중에 공존하는 글루코스를 어느 정도까지 감소시키면, 1,5-AG에 대한 높은 특이성에 의해 글루코스의 영향은 거의 무시할 수 있는 수준이 되며, 글루코스를 완전히 소거할 필요는 없다. 따라서 글루코스 소거제로는 1,5-AG 탈수소효소에 반응하지 않게 되는 농도 수준까지 글루코스를 감소시킬 수 있는 정도의 간편한 것으로 충분하다.

글루코스 소거제로서 사용되는 글루코스6위인산화효소로서는 글루코키나제, 헥소키나제 등을 들 수 있으며, EC2.7.1.2, EC2.7.1.1로 분류되는 것이면 특히 제한은 없고, 시판의 것을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 글루코스에 특이성이 높은 글루코키나제가 사용된다. 그들의 사용량은 검체중의 글루코스양에 따라 다르지만, 대략 0.1 내지 50 u/ml이다. 또한 글루코스의 인산화에 필요한 아데노신삼인산(ATP)양은 검체중의 글루코스양에 따라 다르지만, 대략 1 내지 20 mM이다. 또한 글루코스 인산화반응을 촉진하는 것으로 통상, 무기, 유기염류로서 마그네슘이온을 5 내지 50 mM 정도 함유시킨다. 글루코스 소거를 위하여 글루코스 인산화반응은 pH 6 내지 10의 완충액중에서 20 내지 50℃, 바람직하게는 25 내지 37℃에서 첨가직후부터 10분 정도 실시된다. 사용할 수 있는 완충액으로는 글리신완충액, 트리스염산완충액, 굿완충액 등, 통상 사용되는 것이면 모두 사용할 수 있다.

상기 각 시약을 사용한 검체중의 글루코스 소거처리는 1,5-AG 탈수소효소의 반응의 전처리의 형태로 실시하는 것이 바람직하지만, 본 발명에서 사용하는 1,5-AG 탈수소효소는 기질특이성이 높으므로, 글루코스를 1,5-AG 탈수소효소에 반응하지 않게되는 농도수준까지 감소시킬 수 있으면 좋고, 글루코스 소거제, 1,5-AG 탈수소효소의 농도 및 반응시간을 적당한 조건으로 조합시키는 것에 의해 상기 각 시약중에서 글루코스 처리와 1,5-AG 정량을 1액 내에서 실시할 수도 있다.

따라서 본 발명의 1,5-AG 정량용 시약은 글루코스 소거제와 정량용효소를 각각 조합시켜도 좋고, 글루코스 소거제와 정량용 효소를 혼합시켜 1시약으로 하여도 정량가능하다. 더욱 구체적으로는 환원성 발색제와 글루코스 소거제를 함유하는 제 1시약과 1,5-AG 탈수소효소를 함유하는 제 2시약과의 제 2시약으로 구성하거나, 또는 환원성 발색제, 글루코스 소거제, 및 1,5-AG 탈수소효소를 모두 함유하는 하나의 시약으로 하는 것이 바람직하다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1 [아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주 유래 1,5-AG 탈수소효소의 취득]

인산이칼륨 2%, 인산일칼륨 0.5%, 염화칼륨 0.75%, 염화나트륨 2.5%, 염화암모늄 1.25%, 황산마그네슘 0.005% 및 L-소르보스 0.1%로 이루어지는 배지(pH 7.0)를 200 ml 부피의 배양플라스크에 첨가하고, 120℃에서 15분간 살균후 냉각하고, 아그로박테리움·투메파시엔스 NT1130주(FERM BP-5997)을 1백금이 접종하고, 30℃에서 3일간 진탕배양하여 종배양액으로 하였다. 얻어진 종배양액 10 ml를 2리터 배양플라스크중에, 상기와 같은 조성의 액체배지 1000 ml에 접종하고, 30℃에서 3일간 진탕배양하였다.

배양종료후, 원심분리하여 균체를 회수하였다. 얻어진 균체량은 배양액 1리터 당 약 2g이었다. 얻어진 균체를 1 g당 2.5 ml의 20 mM 인산칼륨완충액(pH 7.2)에 현탁시키고, 초음파호모게나이저에 의해 균체를 파쇄하였다. 얻어진 파쇄액을 10,000 g에서 원심분리하고, 그 상징액을 다시 100,000 g에서 원심분리하여 막부분을 얻었다. 막부분 1 g당 10 ml의 1% 트리톤 X-100 함유 20 mM 인산칼륨완충액(pH 7.2)으로 현탁시키고, 교반하면서 하루밤 막부분으로부터 효소의 가용화를 실시하였다. 얻어진 가용화용액을 다시 100,000 g에서 원심분리하여 막잔사를 제거하고, 조효소액을 얻었다. 이 조효소액의 효소활성을 상기 측정법에 기초하여 측정한 바, 균체 1 g당 2단위의 활성이 얻어졌다.

제조예 2 [1,5-AG 탈수소효소의 정제]

제조예 1에서 얻어진 가용화액을 미리 1% 트리톤 X-100 함유 20 mM 인산칼륨완충액(pH 7.2)으로 평형화한 히드록시아파타이트 칼럼을 통해 효소를 흡착시키고, 동조성의 완충액으로 세정후, 1% 트리톤 X-100 함유 20 mM 인산칼륨완충액(pH 7.2)의 직선구배로 용출하고, 효소의 활성부분을 수집하였다. 더욱 비활성을 높이기 위해, 다시 히드록시아파타이트 칼럼을 통하여 상기 동일 조작을 실시하고, 활성부분을 수집하고 한외여과에 의해 농축하여 비활성이 14 단위/mg 단백질인 정제효소를 얻었다. 이 정제표품은 폴리아크릴아미드 전기영동에 있어서 단일밴드를 보였다.

실시예 1 [글루코스 소거제를 사용하지 않는 시약계에서 1,5-AG의 정량]

환원성 발색제로서 WST-1과 제조예 2에서 얻어진 1,5-AG 탈수소효소를 사용하여 하기 표 4에 보이는 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 정량용 시약을 제조하였다. 이 시약을 사용하여 각종 농도의 1,5-AG 용액 및 각종 농도의 글루코스 용액을 측정하였다.

즉 각 농도의 1,5-AG를 함유하는 용액, 또는 일정 농도의 1,5-AG를 함유하는 용액에 글루코스 농도를 변화시켜 첨가한 용액 각 10 μl에 대하여 표 4의 제 1 시약 320 μl를 첨가하여 37℃에서 5분 반응시키고, 이어서 제 2 시약 70 μl를 첨가하여 동일하게 37℃에서 5분 반응시킨 후, 히다치 7070형 자동분석장치에 의해 주파장 450 nm, 부파장 700 nm로 하여 2 포인트어세이에 의해 흡광도를 측정하였다.

이 결과를 도 6, 7에 보였다. 도 6은 각 농도의 1,5-AG를 함유하는 용액에 대하여 측정한 결과, 도 7은 일정 농도의 1,5-AG를 함유하며 각 농도의 글루코스를 함유하는 용액에 대하여 측정한 결과를 보인다.

도 6에서 1,5-AG의 농도 0 내지 50 μg/ml까지, 직선적인 발색흡광도가 얻어지며, 1,5-AG의 정량이 가능함을 알 수 있다. 또한 도 7에서 글루코스가 공존하면, 글루코스 농도의 상승에 비교하여 흡광도 상승도 보이지만, 100 μg/ml 정도의 공존하에서는 흡광도의 변화가 적고, 1,5-AG 환산치로 2 μg/ml 미만이다. 이 결과로부터 제조예 2에서 얻어진 기질특이성이 높은 1,5-AG 탈수소효소를 사용한 경우, 1,5-AG 농도수준의 글루코스가 잔존하여도 1,5-AG를 거의 정확히 측정할 수 있음을 알 수 있다. 이것은 글루코스를 굳이 완전히 소거할 필요가 없다고도 할 수 있다.

제 1 시약	제 2 시약
글리신완충액	100 mM	인산완충액	50 mM
WST-1	1.25 mM	1,5-AG 탈수소효소	5 U/ml
트리톤 X-100	0.1%	트리톤 X-100	0.1%
	(pH 9.0)		(pH 7.0)

실시예 2 [글루코스 소거제를 조합시킨 시약계에서의 1,5-AG의 정량]

표 5에 보이는 조성의, 글루코스 소거제를 함유하는 제 1 시약과, 제조예 2에서 얻어진 1,5-AG 탈수소효소를 함유하는 제 2 시약을 사용하여 일정농도의 1,5-AG를 함유하는 용액에 글루코스 농도를 변화시켜 첨가한 용액을 시료로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 1,5-AG를 측정하였다. 이 결과를 도 8에 보인다.

도 8에 보인 바와 같이, 글루코스가 1500 mg/dl를 함유하는 시료에 있어서도, 글루코스를 함유하지 않는 시료와 동일한 흡광도가 얻어지는 것으로부터, 고농도 글루코스를 간편한 소거법으로 대략적으로 소거하는 것만으로 1,5-AG를 정확히 정량할 수 있음을 알 수 있다.

제 1 시약	제 2 시약
글리신완충액	100 mM	인산완충액	50 mM
WST-1	1.25 mM	1,5-AG 탈수소효소	5 U/ml
트리톤 X-100	0.1%	트리톤 X-100	0.1%
글루코키나제	3 U/ml		(pH 7.0)
ATP	10 mM
아세트산마그네슘	5 mM
	(pH 9.0)

실시예 3 [글루코스 소거제를 함유시킨 시약계에서의 1,5-AG의 정량]

표 6에 보이는 조성의, 글루코스 소거제, 환원성 발색제, 및 제조예 2에서 얻어진 1,5-AG 탈수소효소를 함유하는 1액으로 이루어지는 시약을 사용하고, 일정 농도의 1,5-AG를 함유하는 용액에 글루코스 농도를 변화시켜 첨가한 용액을 시료로서 1,5-AG를 측정하였다.

즉, 시료 8 μl에 대하여 상기 표 6의 시약 312 μl를 첨가하여 15분 반응시키고, 히다치 7070형 자동분석장치에 의해 주파장 450 nm, 부파장 700 nm로 하여 1 포인트어세이에 의해 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도 9에 보인다.

도 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 글루코스가 1500 mg/dl를 함유하는 시료에 있어서도, 글루코스를 함유하지 않는 시료와 거의 같은 흡광도가 얻어지는 것으로부터 고농도 글루코스를 함유하는 시료에 있어서도, 1액에 의한 간편한 측정시약으로 1,5-AG를 정확히 정량할 수 있음을 알 수 있다.

시약
글리신완충액	100 mM
WST-1	1 mM
트리톤 X-100	0.1%
글루코키나제	12 U/ml
ATP	10 mM
아세트산마그네슘	5 mM
1,5-AG 탈수소효소	0.4 U/ml
	(pH 9.0)

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 1,5-AG을 함유하는 환원성 발색제를 첨가하고, 이것에 1,5-AG 탈수소효소를 작용시키는 것에 의해, 1,5-AG 탈수소효소가 1,5-AG에 특이적으로 작용하여 1,5-AG를 산화하는 것과 함께 환원성 발색제를 직접 환원하여 발색시키므로, 그 흡광도가 검체중의 1,5-AG를 정량할 수 있다. 상기 반응은 비가역적 반응이며 생체시료 등에 함유되는 효소의 영향을 받지도 않으므로 고감도이며 정확한 정량이 가능해진다. 또한 반응계가 간단하고 구성시약의 수도 적으므로 작업성이 향상하고 자동분석장치로의 적용도 용이하다.

또한 글루코스 소거제를 병용하여 검체중에 공존하는 글루코스를 어느 정도까지 감소시키면, 본 발명에서 사용하는 1,5-AG 탈수소효소의 1,5-AG에 대한 높은 특이성에 의해 글루코스의 영향은 거의 무시할 수 있는 수준이 되므로 1,5-AG와 글루코스와의 농도차가 수천배나 되는 당뇨병 환자의 혈청 또는 혈장 등을 검체로 한 경우에 있어서도, 높은 측정 정밀도를 얻을 수 있다.

Claims

1,5-언히드로글루시톨에 작용하며, 전자수용체 비존재하에 있어서 환원성 발색제를 직접 환원시키는 반응을 촉매하는 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소를 사용하며, 검체중의 1,5-언히드로글루시톨에 환원성 발색제의 존재하에서 상기 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소를 작용시켜 생성되는 환원된 발색물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량법.

제 1 항에 있어서, 글루코스 소거제에 의해 검체중의 글루코스를 상기 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소와 반응하지 않는 구조로 변화시킨 후, 또는 변화시키면서 검체중의 1,5-언히드로글루시톨에 환원성 발색제의 존재하에서 상기 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량법.

제 2 항에 있어서, 상기 글루코스 소거제가 글루코스6위인산화효소와 아데노신삼인산을 함유하는 것인 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량법.

제 1 항에 있어서, 상기 환원성 발색제가 테트라졸륨 또는 그 염류인 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량법.

제 1 항에 있어서, 상기 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소가 아그로박테리움 속에 속하며, 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소 생산능을 가지는 미생물에 의해 생산된 것인 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량법.

제 1 항에 있어서, 상기 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소가 다음의 이화학적 성질을 가지는 효소인 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량법.

(1) 작용:

전자수용체 비존재하에 있어서, 1,5-언히드로글루시톨에 특이적으로 작용하여 2번째 위치의 수산기를 산화시키는 것과 함께, 직접 환원성 발색제를 환원시키는 반응을 촉매한다.

(2) 기질특이성:

1,5-언히드로글루시톨에 강하게 작용하며, L-소르보스에 약하게 작용한다. 또한 D-글루코스에 약간 작용한다.

(3) 최적pH:

최적 pH는 8.0 내지 pH 9.0 부근이다.

(4) pH 안정성:

pH 6.0 내지 pH 9.0에서 안정하다.

(5) 최적온도:

최적온도는 35℃ 내지 45℃ 부근이다.

(6) 온도안정성:

40℃ 부근까지 90% 이상 안정하다.

(7) 역가의 측정법

0.2 M 인산칼륨완충액(pH 8.0) 1.5 ml, 0.25 중량% 니트로테트라졸륨 블루 0.3 ml, 2 중량% 비이온성 계면활성제 0.3 ml, 50 mM 1,5-언히드로글루시톨 수용액 0.3 ml, 물 0.45 ml, 및 효소용액 0.15 ml로 이루어지는 총량 3.0 ml의 효소함유액을 37℃에서 반응시키고, 540 nm에서 흡광도 변화(Δ mOD/분)를 측정한다. 이 조건하에서 생성되는 포르마잔 색소의 분자흡광계수를 16.7×10³으로 하고, 1분간 1 μmol의 포르마잔을 생성하는 효소량을 1 단위로 하고, 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소의 활성을 하기 수학식 1에 따라 구한다.

(수학식 1)

(8) 전자수용체:

2,6-디클로로페놀인도페놀, 페리시안화합물 등 외에, 환원성 발색제도 이용할 수 있다. 또한 NAD, NADP 등의 보효소나 용존산소는 이용할 수 없다.

(9) 분자량:

도데실황산-폴리아크릴아미드 전기영동에 의한 분자량은 약 55,000이다.

1,5-언히드로글루시톨에 작용하며, 전자수용체 비존재하에 있어서 환원성 발색제를 직접 환원시키는 반응을 촉매하는 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소와 환원성 발색제를 함유하는 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량용 시약.

제 7 항에 있어서, 상기에 추가하여 글루코스 소거제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량용 시약.

제 8 항에 있어서, 상기 글루코스 소거제가 글루코스6위인산화효소와 아데노신삼인산을 함유하는 것인 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량용 시약.

제 7 항에 있어서, 상기 환원성 발색제가 테트라졸륨 또는 그 염류인 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량용 시약.

제 7 항에 있어서, 상기 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소가 아그로박테리움 속에 속하며 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소 생산능이 있는 미생물에 의해 생산되는 것인 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량용 시약.

제 7 항에 있어서, 상기 1,5-언히드로글루시톨 탈수소효소가 제 6 항에 기재된 이화학적 성질을 가지는 효소인 것을 특징으로 하는 1,5-언히드로글루시톨의 정량용 시약.