KR101831949B1 - 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가교된 히알루론산 하이드로젤(Cross-linked hyaluronic acid hydrogel)을 포함하는 마이크로구조체(microstructure) 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 마이크로구조체는 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용함으로서 균일하며 뒤틀림이 최소화된 마이크로구조체의 제조가 가능한 효과가 있다. 또한, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체는 주름 등 노화된 피부 조직을 개선시키고 보습 효과를 줄 수 있으며, 팽윤성이 우수하여 생체내에서 체액을 쉽게 흡수하고, 히알루론산 분해효소에 대해 안정하여 마이크로구조체의 생체내 지속기간이 길어 유용성분을 생체내에 안정적으로 전달할 수 있는 이점이 있다.

Description

가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체 및 이의 제조방법{Microstructure Using Cross-linked Hyaluronic Acid Hydrogel and Process for Preparing the Same}
본 발명은 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 생분해성 마이크로구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 히알루론산 유도체인 가교된 히알루론산에 의하여 형성된 하이드로젤을 이용한 생분해성 마이크로구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
약물 전달 시스템(Drug Delivery System, DDS)은 약물의 흡수 및 방출을 제어함으로써 약물의 부작용을 줄이고 효능을 극대화 시킬 수 있도록 세포, 조직 등의 표적 부위로 약물을 전달하는 일련의 기술을 의미한다.
약물 전달 시스템은 일반적인 경구 섭취 이외에 약물을 국부적으로 적용할 수 있는 경피투과형 전달 시스템 등이 있으며, 약물과 같은 약제학적 물질을 효율적이면서도 안전하게 투여하기 위한 연구가 지속적으로 이루어져 왔다. 이 중 주사요법의 경우 투여 방법이 번거로우며 환자에 따라 통증을 동반할 수 있고 약물을 일시적으로 주입하는 방법 외에 제어에 한계가 있는 문제점이 있다.
이러한 주사요법의 단점을 개선하기 위해 주사기의 바늘보다 훨씬 작고 통증이 적은 마이크로구조체(마이크로 니들)에 관한 연구가 진행되었고 약물전달, 혈액 채취, 바이오센서 및 피부미용 등 여러 분야에서 연구가 진행되고 있다.
종래의 마이크로 니들의 제조방법으로는 미국 특허 제6334856호인“MICRONEEDLE DEVICES AND METHODS OF MANUFACTURE AND USE THEREOF"와 대한민국 특허 제10-0793615호인 "생분해성 솔리드 마이크로니들 및 이의 제조방법"이 있다.
상기 특허는 경화성 폴리머를 이용하여 제작된 마이크로 몰드에 생분해성 점성물질을 주입하고 건조한 다음 몰드로부터 분리하여 마이크로 니들을 제조하거나(몰딩 기법), 생분해성 솔리드 마이크로니들을 형성하기 위한 생분해성 점성 물질을 코팅하고 기둥(필라)으로 패터닝된 프레임으로 코팅된 생분해성 점성 물질을 드로잉하면서 건조시킨 다음 드로잉된 생분해성 점성 물질을 절단하는 단계를 통해 마이크로 니들을 제조한다(드로잉 기법).
그러나 이러한 종래의 제조방법에 의해 제조된 생분해성 폴리머 마이크로구조체는 상대적으로 낮은 기계적 강도로 인해 피부 투과 시 휘어지거나 뭉개지는 문제점을 가지고 있다.
특히, 높은 탄성을 갖는 고분자 유도체를 원료로 이용하는 경우 몰딩기법 또는 드로잉 기법을 이용하여 마이크로구조체를 제조 시 원하는 구조체의 모양이 균질하게 생성되지 않는 한계가 있으며, 피부투과에 필요한 마이크로구조체의 기계적 강도를 만족시키기 어려운 단점이 있다.
본 발명에서 사용되는 히알루론산은 N-아세틸 글루코사민과 글루쿠론산의 이당 단위가 반복된 연결 구조를 갖는 생분해성 고분자이다.
히알루론산으로 제조된 구조체의 경우 히알루론산의 평균 분자량이 작을수록 구조체 형성이 용이하고 점성이 낮으며, 분자량이 커질수록 기계적 강도는 높아지지만 점성이 강해진다. 이러한 특성 때문에 일반적으로 마이크로구조체의 원료로는 저분자의 히알루론산을 이용하는데, 저분자의 히알루론산을 이용한 마이크로구조체의 경우 피부 투과 시 부러지거나 휘어지는 문제가 발생하기 쉽다.
본 발명에서는 저분자의 히알루론산을 사용하면서도 피부 투과에 적합한 기계적 강도를 가지며 피부 내에서 쉽게 용해 또는 팽윤되어 약물전달이나 피부 미용에 적합한 마이크로구조체를 제조하기 위해 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 이를 주재로 한 마이크로구조체 제조방법을 개발하였다.
본 발명자들은 상술한 종래기술들의 문제점을 해결하고자 예의 연구노력 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 피부의 구성성분인 히알루론산의 유도체인 가교된 히알루론산으로 형성된 하이드로젤을 마이크로구조체에 주재로 이용함으로써, 균일하며 뒤틀림이 최소화된 마이크로구조체의 제조를 가능하게 하고, 높은 경도를 가져 유용성분 전달의 효율성을 높일 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 마이크로구조체는 가교된 히알루론산의 특성인 높은 점탄성에 의하여 주름 등 노화된 피부 조직을 개선시키고 보습 효과를 줄 수 있음을 확인하였다. 더불어, 본 발명의 마이크로구조체는 팽윤성이 우수하여 생체내에서 체액을 쉽게 흡수하고, 히알루론산 분해효소에 대해 안정하여 마이크로구조체의 생체내 지속기간을 증가시킴으로써 궁극적으로 생체내로 마이크로구조체에 탑재된 유용성분을 안정적으로 전달할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 가교된 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 마이크로구조체(microstructure)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유용성분 전달체(effective component delivery system)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 가교된 히알루론산 하이드로젤(Cross-linked hyaluronic acid hydrogel)을 포함하는 마이크로구조체(microstructure)를 제공한다.
본 발명자들은 상술한 종래기술들의 문제점을 해결하고자 예의 연구노력 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 피부의 구성성분인 히알루론산의 유도체인 가교된 히알루론산으로 형성된 하이드로젤을 마이크로구조체에 주재로 이용함으로써, 히알루론산을 마이크로구조체에 이용하는 경우에 비해 입자 크기를 선택적으로 조절할 수 있으며, 균일하며 뒤틀림이 최소화된 마이크로구조체의 제조를 가능하게 하고, 높은 경도를 가져 유용성분 전달의 효율성을 높일 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 마이크로구조체는 가교된 히알루론산의 특성인 높은 점탄성에 의하여 주름 등 노화된 피부 조직을 개선시키고 보습 효과를 줄 수 있음을 확인하였다. 더불어, 본 발명의 마이크로구조체는 팽윤성이 우수하여 생체내에서 체액을 쉽게 흡수하고, 히알루론산 분해효소에 대해 안정하여 마이크로구조체의 생체내 지속기간을 증가시킴으로써 궁극적으로 생체내로 마이크로구조체에 탑재된 유용성분을 안정적으로 전달할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서의 용어 “히알루론산”은 히알루론산 뿐만 아니라 히알루론산 염(예컨대, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 마그네슘 및 히알루론산 칼슘) 및 이들의 혼합물을 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서의 용어 “하이드로젤”은 충분한 양의 수분을 보유하고 있는 친수성 고분자의 3차원적 구조를 의미한다. 본 발명의 목적상, 하이드로젤은 가교된 히알루론산 간에 형성된 하이드로젤이다.
본 발명은 다양한 마이크로구조체를 제공할 수 있으며, 예를 들어 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(microbarb), 마이크로어레이 또는 마이크로전극을 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로구조체는 마이크로니들이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 1-50%의 가교도를 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 1-40%, 2-40%, 5-40%, 7-40%, 10-40%, 15-40%, 18-40%, 20-40%, 22-40%, 25-40%, 28-40%, 30-40%, 1-35%, 2-35%, 5-35%, 7-35%, 10-35%, 15-35%, 18-35%, 20-35%, 22-35%, 25-35%, 28-35%, 1-30%, 2-30%, 5-30%, 7-30%, 10-30%, 15-30%, 18-30%, 20-30%, 22-30%, 25-30%, 28-30%, 1-25%, 2-25%, 5-25%, 7-25%, 10-25%, 15-25%, 18-25%, 20-25%, 22-25%, 1-20%, 2-20%, 5-20%, 7-20%, 10-20%, 15-20%, 18-20%, 1-15%, 2-15%, 5-15%, 7-15%, 10-15%, 1-10%, 2-10%, 5-10%, 7-10%, 1-5%, 2-5%, 1-3% 또는 2-3%의 가교도를 갖는다. 하기 실시예 6에서 입증한 바와 같이, 가교된 히알루론산 하이드로젤은 생체내 존재하는 히알루론산 분해효소로 인한 생분해 억제 효과를 나타내므로 비가교 히알루론산에 비해 긴 피부 내 지속 시간을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로구조체는 반감기가 20시간 내지 850시간이다. 본 명세서의 용어 “반감기”는 히알루론산 분해효소(hyaluronidase)에 대한 비가교 히알루론산의 분해율을 100%로 할 때, 상기 히알루론산 분해효소에 대한 분해율이 50%가 되는 시점의 시간을 의미한다. 하기 실시예 7에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 마이크로구조체는 반감기가 길어 유용성분을 생체내에 안정적으로 전달할 수 있으며 상기 유용성분이 미용성분인 경우 높은 피부 미용 개선 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 본 발명의 마이크로구조체에 15 %(w/v) 이하로 포함된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 본 발명의 마이크로구조체에 0.1-15 %(w/v)로 포함된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 본 발명의 마이크로구조체에 0.1-12, 0.1-10, 0.1-7.5, 0.5-12, 0.5-10, 0.5-7.5, 1-12, 1-10 또는 1-7.5%(w/v)로 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 1Hz에서의 탄성계수가 0.5 내지 5 Pa 미만인 경우 15 %(w/v) 이하, 5 내지 50 Pa미만인 경우 12 %(w/v) 이하, 50 내지 200 Pa 미만인 경우 10% 이하, 200 내지 1000 Pa 미만인 경우 7.5% 이하로 본 발명의 마이크로구조체에 포함된다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 1Hz에서의 탄성계수가 0.5 내지 3 Pa 미만, 0.5 내지 2 Pa 미만, 1 내지 5 Pa 미만, 1 내지 3 Pa 미만, 1 내지 2 Pa 미만인 경우 15 %(w/v) 이하로 본 발명의 마이크로구조체에 포함된다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 1Hz에서의 탄성계수가 5 내지 30 Pa 미만, 8 내지 30 Pa 미만, 10 내지 30 Pa 미만, 5 내지 25 Pa 미만, 8 내지 25 Pa 미만, 10 내지 25 Pa 미만, 5 내지 20 Pa 미만, 8 내지 15 Pa 미만, 20 내지 30 Pa 미만 또는 22 내지 26 Pa 미만인 경우 12 %(w/v) 이하로 본 발명의 마이크로구조체에 포함된다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 1Hz에서의 탄성계수가 50 내지 150 Pa 미만, 50 내지 130 Pa 미만, 50 내지 70 Pa 미만, 100 내지 150 Pa 미만, 100 내지 140 Pa 미만 또는 100 내지 130 Pa 미만인 경우 10 %(w/v) 이하로 본 발명의 마이크로구조체에 포함된다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 1Hz에서의 탄성계수가 200 내지 900 Pa 미만, 200 내지 500 Pa 미만, 200 내지 300 Pa 미만, 300 내지 900 Pa 미만, 400 내지 900 Pa 미만, 400 내지 500 Pa 미만 또는 800 내지 900 Pa 미만인 경우 7.5 %(w/v) 이하로 본 발명의 마이크로구조체에 포함된다.
본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 당업계의 어떠한 히알루론산 가교 방법에 의하여도 가교가 가능하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 가교제에 의하여 가교된 히알루론산 하이드로젤이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 가교제는 에테르 가교제이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 에테르 가교제는 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(EGDGE: ethylene glycol diglycidyl ether), 부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE: 1,4-butandiol diglycidyl ether), 헥산디올 디글리시딜 에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 디글리세롤 폴리글리시딜 에테르(diglycerol polyglycidyl ether) 및 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 가교제이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 에테르 가교제는 부탄디올 디글리시딜 에테르이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 주파수 0.02 Hz에서 3-5000 Pa.s의 복합점도를 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 복합점도는 3-4500, 3-4300, 3-4200, 3-2000, 3-1500, 3-1000, 3-700, 3-650, 3-600, 3-400, 3-200, 3-150, 3-100, 3-70, 3-50, 3-20, 3-10, 3-8, 5-4500, 5-4300, 5-4200, 5-2000, 5-1500, 5-1000, 5-700, 5-650, 5-600, 5-400, 5-200, 5-150, 5-100, 5-70, 5-50, 5-20, 5-10, 50-4500, 50-4300, 50-4200, 50-2000, 50-1500, 50-1000, 50-700, 50-650, 50-600, 50-400, 50-200, 50-150, 50-100, 50-70, 100-4500, 100-4300, 100-4200, 100-2000, 100-1500, 100-1000, 100-700, 100-650, 100-600, 100-400, 100-200, 100-150, 300-4500, 300-4300, 300-4200, 300-2000, 300-1500, 300-1000, 300-700, 300-650, 300-600, 300-400, 500-4500, 500-4300, 500-4200, 500-2000, 500-1500, 500-1000, 500-700, 500-650, 500-600, 600-4500, 600-4300, 600-4200, 600-2000, 600-1500, 600-1000, 600-700, 600-650, 650-4500, 650-4300, 650-4200, 650-2000, 650-1500, 650-1000, 650-700, 650-650, 650-600, 650-400, 650-200, 650-150, 650-100, 650-70, 650-50, 650-20, 650-10, 1000-2000, 1000-1500, 1000-4500, 1000-4300, 1000-4200, 1000-2000, 1000-1500, 1300-4500, 1300-4300, 1300-4200, 1300-2000, 1300-1500, 1500-4500, 1500-4300, 1500-4200, 1500-2000, 4000-4500 또는 4000-4300 Pa.s이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 주파수 1 Hz에서 1-1000 Pa의 탄성계수를 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 탄성계수는 1-900 Pa, 1-870 Pa 또는 1.5-870 Pa이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 탄성계수는 1-500, 1-450, 1-300, 1-250, 1-150, 1-130, 1-100, 1-70, 1-10, 1-5, 1-3, 8-900, 8-500, 8-450, 8-300, 8-250, 8-150, 8-130, 8-100, 8-70, 8-10, 10-900, 10-500, 10-450, 10-300, 10-250, 10-150, 10-130, 10-100, 10-70, 20-900, 20-500, 20-450, 20-300, 20-250, 20-150, 20-130, 20-100, 20-70, 50-900, 50-500, 50-450, 50-300, 50-250, 50-150, 50-130, 50-100, 50-70, 100-900, 100-500, 100-450, 100-300, 100-250, 100-150, 100-130, 110-900, 110-500, 110-450, 110-300, 110-250, 110-150, 110-130, 120-900, 120-500, 120-450, 120-300, 120-250, 120-150, 120-130, 400-900, 400-500, 400-450 또는 800-900 Pa이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 주파수 1 Hz에서 0.5-500 Pa의 점성계수를 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 점성계수는 0.5-400 Pa, 0.5-300 Pa, 0.5-250 Pa 또는 0.7-250 Pa이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 점성계수는 0.5-300, 0.5-150, 0.5-120, 0.5-70, 0.5-50, 0.5-10, 0.5-5, 0.5-3, 0.5-2, 0.5-1, 1-300, 1-150, 1-120, 1-70, 1-50, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2, 1-1, 3-300, 3-150, 3-120, 3-70, 3-50, 3-10, 3-5, 5-300, 5-150, 5-120, 5-70, 5-50, 5-10, 6-300, 6-150, 6-120, 6-70, 6-50, 6-10, 7-500, 7-300, 7-150, 7-120, 7-70, 7-50, 7-10, 10-500, 10-300, 10-150, 10-120, 10-70, 10-50, 15-500, 15-300, 15-150, 15-120, 15-70, 15-50, 30-500, 30-300, 30-150, 30-120, 30-70, 30-50, 40-500, 40-300, 40-150, 40-120, 40-70, 40-50, 80-500, 80-300, 80-150, 80-120, 90-500, 90-300, 90-150, 90-120, 100-500, 100-300, 100-150, 100-120, 200-500, 200-300, 230-500, 230-300 또는 230-250 Pa이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 100-1000000 cp의 점도를 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 점도는 100-500000, 100-200000, 100-160000, 100-130000, 100-120000, 100-110000, 100-100000, 100-90000, 100-85000, 100-80000, 100-75000, 100-70000, 100-60000, 100-55000, 100-50000, 100-40000, 100-35000, 100-30000, 100-25000, 100-20000, 100-15000, 100-5000, 100-2000, 100-1200, 100-500, 100-400, 150-1000000, 150-500000, 150-200000, 150-160000, 150-130000, 150-120000, 150-110000, 150-100000, 150-90000, 150-85000, 150-80000, 150-75000, 150-70000, 150-60000, 150-55000, 150-50000, 150-40000, 150-35000, 150-30000, 150-25000, 150-20000, 150-15000, 150-5000, 150-2000, 150-1200, 150-500, 150-400, 500-1000000, 500-500000, 500-200000, 500-160000, 500-130000, 500-120000, 500-110000, 500-100000, 500-90000, 500-85000, 500-80000, 500-75000, 500-70000, 500-60000, 500-55000, 500-50000, 500-40000, 500-35000, 500-30000, 500-25000, 500-20000, 500-15000, 500-5000, 500-2000, 500-1200, 600-1000000, 600-500000, 600-200000, 600-160000, 600-130000, 600-120000, 600-110000, 600-100000, 600-90000, 600-85000, 600-80000, 600-75000, 600-70000, 600-60000, 600-55000, 600-50000, 600-40000, 600-35000, 600-30000, 600-25000, 600-20000, 600-15000, 600-5000, 600-2000, 600-1200, 800-1000000, 800-500000, 800-200000, 800-160000, 800-130000, 800-120000, 800-110000, 800-100000, 800-90000, 800-85000, 800-80000, 800-75000, 800-70000, 800-60000, 800-55000, 800-50000, 800-40000, 800-35000, 800-30000, 800-25000, 800-20000, 800-15000, 800-5000, 800-2000, 800-1200, 10000-1000000, 10000-500000, 10000-200000, 10000-160000, 10000-130000, 10000-120000, 10000-110000, 10000-100000, 10000-90000, 10000-85000, 10000-80000, 10000-75000, 10000-70000, 10000-60000, 10000-55000, 10000-50000, 10000-40000, 10000-35000, 10000-30000, 10000-25000, 10000-20000, 10000-15000, 25000-1000000, 25000-500000, 25000-200000, 25000-160000, 25000-130000, 25000-120000, 25000-110000, 25000-100000, 25000-90000, 25000-85000, 25000-80000, 25000-75000, 25000-70000, 25000-60000, 25000-55000, 25000-50000, 25000-40000, 25000-35000, 25000-30000, 40000-1000000, 40000-500000, 40000-200000, 40000-160000, 40000-130000, 40000-120000, 40000-110000, 40000-100000, 40000-90000, 40000-85000, 40000-80000, 40000-75000, 40000-70000, 40000-60000, 40000-55000, 40000-50000, 45000-1000000, 45000-500000, 45000-200000, 45000-160000, 45000-130000, 45000-120000, 45000-110000, 45000-100000, 45000-90000, 45000-85000, 45000-80000, 45000-75000, 45000-70000, 45000-60000, 45000-55000, 45000-50000, 50000-1000000, 50000-500000, 50000-200000, 50000-160000, 50000-130000, 50000-120000, 50000-110000, 50000-100000, 50000-90000, 50000-85000, 50000-80000, 50000-75000, 50000-70000, 50000-60000, 60000-1000000, 60000-500000, 60000-200000, 60000-160000, 60000-130000, 60000-120000, 60000-110000, 60000-100000, 60000-90000, 60000-85000, 60000-80000, 60000-75000, 60000-70000, 70000-1000000, 70000-500000, 70000-200000, 70000-160000, 70000-130000, 70000-120000, 70000-110000, 70000-100000, 70000-90000, 70000-85000, 70000-80000, 70000-75000, 100000-1000000, 100000-500000, 100000-200000, 100000-160000, 100000-130000, 100000-120000, 100000-110000, 110000-1000000, 110000-500000, 110000-200000, 110000-160000, 110000-130000, 110000-120000, 130000-1000000, 130000-500000, 130000-200000, 130000-160000, 140000-1000000, 140000-500000, 140000-200000, 140000-160000, 350000-1000000, 350000-500000, 370000-1000000, 370000-500000 또는 370000-450000 cp이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로구조체는 2000-80000%의 팽윤도를 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로구조체는 2000-75000, 2000-70000, 2000-60000, 2000-45000, 2000-40000, 2000-35000, 2000-30000, 2000-25000, 2000-15000, 2000-12000, 2000-5000, 2000-3000, 2000-2500, 2500-75000, 2500-70000, 2500-60000, 2500-45000, 2500-40000, 2500-35000, 2500-30000, 2500-25000, 2500-15000, 2500-12000, 2500-5000, 2500-3000, 3000-75000, 3000-70000, 3000-60000, 3000-45000, 3000-40000, 3000-35000, 3000-30000, 3000-25000, 3000-15000, 3000-12000, 3000-5000, 4000-75000, 4000-70000, 4000-60000, 4000-45000, 4000-40000, 4000-35000, 4000-30000, 4000-25000, 4000-15000, 4000-12000, 4000-5000, 10000-75000, 10000-70000, 10000-60000, 10000-45000, 10000-40000, 10000-35000, 10000-30000, 10000-25000, 10000-15000, 10000-12000, 20000-75000, 20000-70000, 20000-60000, 20000-45000, 20000-40000, 20000-35000, 20000-30000, 20000-25000, 25000-75000, 25000-70000, 25000-60000, 25000-45000, 25000-40000, 25000-35000, 25000-30000, 30000-75000, 30000-70000, 30000-60000, 30000-45000, 30000-40000, 30000-35000, 35000-75000, 35000-70000, 35000-60000, 35000-45000, 35000-40000, 40000-75000, 40000-70000, 40000-60000, 40000-45000, 55000-75000, 55000-70000, 55000-60000, 65000-75000, 65000-70000, 70000-75000 또는 70000-72000%의 팽윤도를 갖는다. 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 건조 후 다시 물을 가하면 높은 팽윤도를 나타내며 마이크로구조체 제조 시 이와 같은 팽윤성의 범위를 제한함으로써 마이크로구조체의 생체내 흡수 시간과 약물전달 속도를 조절할 수 있다. 특히, 피부 삽입용 마이크로구조체에 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용하는 경우 팽윤도 및 생체내 흡수성이 우수하여 높은 미용 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로구조체는 비가교 히알루론산을 추가적으로 포함한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 추가적으로 포함되는 비가교 히알루론산은 가교된 히알루론산 하이드로젤 중량 100을 기준으로 5-2000 중량부이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 추가적으로 포함되는 비가교 히알루론산은 가교된 히알루론산 하이드로젤 중량 100을 기준으로 7-1500, 9-1100, 10-1000, 20-500, 50-200, 5-20, 5-15 또는 8-12 중량부이다. 하기 실시예 6에서 입증한 바와 같이 마이크로구조체 제조 시 비가교 히알루론산과 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 일정 비율로 혼합함으로써 팽윤도를 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로구조체는 유용성분을 추가적으로 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유용성분은 약물, 미용성분 또는 이의 조합이다. 본 발명의 마이크로구조체는 유용성분을 포함하므로써 피부 내에 유용성분을 유효하게 전달할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 가교된 히알루론산 하이드로젤을 마이크로 몰드에 공급하는 단계; (b) 상기 가교된 히알루론산 하이드로젤을 마이크로 몰드의 구멍에 주입하는 단계; 및 (c) 상기 마이크로 몰드와 가교된 히알루론산 하이드로젤을 분리하여 마이크로구조체를 형성시키는 단계를 포함하는 마이크로구조체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 가교된 히알루론산 하이드로젤을 마이크로 몰드에 공급하는 단계
본 발명에 따르면, 우선 가교된 히알루론산 하이드로젤을 마이크로 몰드에 공급한다.
본 발명의 마이크로 몰드는 당업계의 어떠한 마이크로 몰드 제작 기법을 이용하여서도 제작이 가능하다. 예컨대, MEMS(Micro-Electro Mechanical System) 제작기법, 포토리소그래피(photolithography, Biodegradable polymer microneedles: Fabrication, mechanics and transdermal drug delivery, Journal of Controlled Release 104, 51-66, 2005) 제작기법 및 소프트 리소그래피(soft lithography) 제작기법 등이 본 발명의 마이크로 몰드 제작에 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이중 소프트 리소그래피(soft lithography) 제작 기법을 이용하는 경우 PDMS(polydimethylsiloxane) 또는 PMMA(Poly(methyl methacrylate))와 같은 탄성체 몰드를 제조하여 이를 마이크로구조체의 제조에 이용할 수 있다. PDMS 몰드를 제조하는 기술은 일종의 플라스틱 가공기술로서 캐스팅(casting), 인젝션(injection), 핫-엠보싱(hot-embossing) 등의 다양한 방법으로 원하는 몰딩구조를 얻을 수 있다. 예를 들면, 실리콘웨이퍼, 글래스등의 기판 상에 감광물질을 코팅하고 포토마스크를 이용하여 패터닝하면 결과적으로 마스터(master)가 만들어진다. 이를 주형으로 PDMS를 캐스팅하고 소결시키면, 스탬프 기능을 하는 PDMS몰드를 완성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 가교도가 1-50%이다. 본 발명의 마이크로구조체 제조방법은 본 발명의 마이크로구조체와 가교된 히알루론산 하이드로젤을 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
단계 (b): 가교된 히알루론산 하이드로젤을 마이크로 몰드의 구멍에 주입
이어, 상기 가교된 히알루론산 하이드로젤을 마이크로 몰드의 구멍에 주입시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 주입은 상기 가교된 히알루론산 이드로젤에 외향력을 가하여 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 외향력은 원심력이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 주입은 대기압 이하의 압력에서 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 주입은 100-750 mmHg의 압력에서 실시한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 주입은 100-750, 200-750, 300-750, 400-750, 500-750, 600-750, 100-700, 200-700, 300-700, 400-700, 500-700 또는 600-700 mmHg에서 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 주입은 대기압 이하의 압력에서 5분 이상, 5-180분, 5-120분, 5-60분, 5-30분, 5-20분, 10-180분, 10-120분, 10-60분, 10-30분, 10-20분, 13-180분, 13-120분, 13-60분, 13-30분, 13-20분 또는 13-17분 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b) 이후 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 마이크로 몰드에 공급하여 일정한 두께의 1차 기저부(base)를 구성하는 단계를 추가적으로 포함한다(도 1). 이 경우 마이크로구조체 구성 물질과 동일한 기저부를 구성할 수 있으며 기저부의 뒤틀림을 최소화하기 위한 상기 1차 기저부의 두께는 10 μm-200 μm 또는 30 μm-100 μm이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 1차 기저부를 구성하는 단계 이후 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤과 상이한 고분자 물질을 마이크로 몰드에 공급하여 일정한 두께의 2차 기저부를 구성하는 단계를 추가적으로 포함한다(도 1). 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 2차 기저부는 생체 적합성 고분자 또는 점착제를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 생체 적합성 고분자는 비가교 히알루론산(도 1b), 알지닉 산(alginic acid), 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 키토산, 폴리라이신(polylysine), 콜라겐, 젤라틴, 카르복시메틸 키틴(carboxymethyl chitin), 피브린, 아가로스, 풀루란 폴리락타이드, 폴리글리코라이드(PGA), 폴리락타이드-글리코라이드 공중합체(PLGA), 히아루로닉 산(hyaluronicacid), 알지닉 산(alginic acid), 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 키토산, 폴리라이신(polylysine), 콜라겐, 젤라틴, 카르복시메틸 키틴(carboxymethyl chitin), 피브린, 아가로스, 풀루란 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리에테르에스테르(polyetherester), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리에스테르아마이드(polyesteramide), 폴리(뷰티릭 산), 폴리(발레릭 산), 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 에틸렌-비닐아세테이트 중합체, 아크릴 치환 셀룰로오스 아세테이트, 비-분해성 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 풀루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설포네이트 폴리올레핀(chlorosulphonate polyolefins), 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리메타크릴레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 에틸셀룰로오스(EC), 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC), 카복시메틸셀루로스, 싸이클로덱스트린 및 이러한 고분자를 형성하는 단량체들의 공중합체 및 셀룰로오스으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 고분자이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 점착제는 실리콘, 폴리우레탄, 히알루론산, 물리적 접착제(게코), 폴리 아크릴, 에틸 셀룰로오스, 하이드록시 메틸 셀룰로오스, 에틸렌 비닐 아세테이트 및 폴리 이소 부틸렌으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 점착제이다.
단계 (c): 마이크로 몰드와 가교된 히알루론산 하이드로젤을 분리
단계 (b) 실시 이후, 본 발명의 마이크로 몰드와 가교된 히알루론산 하이드로젤을 분리하여 마이크로구조체를 형성시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이후 상기 가교된 히알루론산 하이드로젤을 건조하는 단계를 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이후 실시하는 건조는 15-90℃에서 10분-60시간, 20-80℃에서 1-60시간 또는 20-80℃에서 1-50시간 동안 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이후 실시하는 건조는 10℃ 내지 30℃ 미만에서 12-60, 18-52, 24-48, 18-30, 42-54시간; 40-60℃에서 1-8시간, 2-8, 2-6, 2.5-6, 2-3, 4-8, 4-6, 5-7 또는 3-5시간; 또는 60-90℃ 또는 60-80℃에서 1-5, 1-3, 1.5-5, 1.5-3, 1.5-2.5, 2-4, 2-3 또는 1-2시간 동안 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b) 이후 상기 가교된 히알루론산 하이드로젤을 건조하는 단계를 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b) 이후 실시하는 건조는 15-90℃에서 10분-60시간, 20-90℃에서 10분-10시간, 30-80℃에서 10분-5시간, 40-80℃에서 10분-3시간 또는 40-80℃에서 20분-2시간동안 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b) 이후 실시하는 건조는 10-30℃에서 36-60 또는 42-54시간; 40-60℃에서 0.5-7시간, 5-7, 0.5-2 또는 0.5-1.5시간; 또는 60-90℃ 또는 60-80℃에서 0.2-4, 2-4, 0.2-1, 0.2-0.6시간 동안 실시한다. 상기 단계 (b) 이후 건조 과정은 마이크로구조체의 기계적 강도를 높여주며 기저부의 편평도를 높이는데 도움을 준다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이전 상기 가교된 히알루론산 하이드로젤을 건조하는 단계를 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이전 실시하는 건조는 15-90℃에서 10분-60시간, 20-90℃에서 1-30시간, 20-80℃에서 1-25시간 또는 20-80℃에서 1.5-22시간동안 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이전 실시하는 건조는 15-90℃에서 10분-60시간, 15-30℃에서 10-30시간, 40-60℃에서 2-6시간 또는 60-80℃에서 1-3시간 동안 실시한다. 상기 단계 (a) 이전 실시하는 가교된 히알루론산 하이드로젤 건조에 의하여 가교된 히알루론산 하이드로젤의 부피가 3/100-1/10으로 감소하게 된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이후 가교된 히알루론산 하이드로젤의 건조는 대기압 이하의 압력에서 실시한다. 본 발명의 단계 (a) 이후의 가교된 히알루론산 하이드로젤의 건조를 1기압(760 mmHg) 이하에서 실시하는 경우 건조시간을 평균 40% 단축시킬 수 있어 본 발명의 마이크로구조체에 유용성분(예컨대, 약물 또는 미용성분)을 탑재시키는 경우 상기 유용성분의 안정성을 높일 수 있다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이후 가교된 히알루론산 하이드로젤의 건조는 100-750 mmHg의 압력에서 실시한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이후 가교된 히알루론산 하이드로젤의 건조는 100-750, 200-750, 300-750, 400-750, 500-750, 600-750, 100-700, 200-700, 300-700, 400-700, 500-700 또는 600-700 mmHg에서 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이후 가교된 히알루론산 하이드로젤의 건조는 대기압 이하의 압력에서 5분 이상, 5-180분, 5-120분, 5-60분, 5-30분, 5-20분, 10-180분, 10-120분, 10-60분, 10-30분, 10-20분, 13-180분, 13-120분, 13-60분, 13-30분, 13-20분 또는 13-17분 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a) 이전 상기 가교된 히알루론산 하이드로젤을 균질화하는 단계를 실시한다. 본 명세서의 용어 “균질화”는 가교된 히알루론산 하이드로젤을 균일한 입자형태로 만드는 것을 의미한다. 본 발명에서 균질화를 실시하는 경우 좁은 입자분포와 낮은 돌출압력을 갖는 하이드로젤을 얻을 수 있으며, 가교된 히알루론산 하이드로젤이 마이크로구조체 몰드의 구멍 크기를 넘지 않도록 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (a) 이전 히알루론산에 염기를 첨가하는 단계 (i) 및 상기 단계 (i)의 결과물에 가교제를 첨가하여 가교반응을 일으키는 단계 (ii)를 포함하는 가교된 히알루론산 하이드로젤을 제조하는 단계 (pre-a)를 추가적으로 실시한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 히알루론산은 평균 분자량이 100-5000 kDa이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 히알루론산은 평균 분자량이 100-4500, 150-4500, 200-4200 kDa, 220-4200, 220-1500, 300-1500, 350-1500, 220-550, 240-490, 3000-3500, 1000-1800, 1200-1500, 300-400 kDa이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (i)의 결과물은 농도가 5-50 %(w/v)이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (i)의 결과물은 농도가 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-13, 8-40, 8-35, 8-30, 8-25, 8-20, 8-15, 8-13, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20, 13-40, 13-35, 13-30, 13-25, 13-20, 13-15, 15-40, 15-35, 15-30, 15-25, 15-20, 18-40, 18-35, 18-30, 18-25, 18-20, 28-40, 28-35, 28-32, 28-30 %(w/v)이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (i)의 결과물은 pH가 11-13 또는 12-13이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 가교제는 에테르 가교제이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 가교제는 히알루론산의 반복단위 0.5-50 몰% 농도로 첨가한다. 상기 가교제의 농도를 조절함으로서 상기 히알루론산의 가교율을 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 가교반응은 20-50℃에서 10-36시간 동안 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 가교반응은 20-30℃에서 12-36시간, 20-30℃에서 18-30시간 또는 20-30℃에서 21-27시간 동안 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 가교반응은 25-35℃에서 10-30시간, 25-35℃에서 15-25시간 또는 25-35℃에서 18-22시간 동안 실시한다.
가교반응을 실시한 후 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 정제수, 생리식염수 또는 염화나트륨용액(NaCl)으로 세척하여 잔류 BDDE 및 NaOH를 제거할 수 있으며 팽윤과정을 동시에 진행할 수 있다. 에탄올 수용액(예컨대, 80% 에탄올 수용액)을 첨가하는 경우, 하이드로젤 입자가 침전으로 생성되며 이 과정에서 미반응 물질들이 용이하게 제거될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로구조체는 비가교 히알루론산을 추가적으로 포함한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 추가적으로 포함되는 비가교 히알루론산은 가교된 히알루론산 하이드로젤 중량 100을 기준으로 5-2000 중량부이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 추가적으로 포함되는 비가교 히알루론산은 가교된 히알루론산 하이드로젤 중량 100을 기준으로 10-1000, 7-1500, 9-1100, 20-500, 50-200, 5-20, 5-15 또는 8-12 중량부이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 염기는 당업계에서 사용하는 통상의 염기(예컨대, NaOH)를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 염기는 NaOH 수용액이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 염기는 0.25N-5N NaOH 수용액이다.
본 발명의 마이크로구조체 제조방법은 상술한 마이크로구조체를 공통으로 하기 때문에, 상기 마이크로구조체와의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체 및 이의 제조방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 마이크로구조체는 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용함으로서 균일하며 뒤틀림이 최소화된 마이크로구조체의 제조가 가능한 효과가 있다.
(c) 또한, 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체는 주름 등 노화된 피부 조직을 개선시키고 보습 효과를 줄 수 있으며, 팽윤성이 우수하여 생체내에서 체액을 쉽게 흡수하고, 히알루론산 분해효소에 대해 안정하여 마이크로구조체의 생체내 지속기간이 길어 유용성분을 생체내에 안정적으로 전달할 수 있는 이점이 있다.
도 1a는 본 발명의 가교된 히알루론산(HA) 하이드로젤 및 마이크로구조체 제조방법에 의하여 제조된 마이크로구조체의 모식도를 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 실시예 3-1에 의하여 제조된 마이크로구조체의 현미경(Nikon Eclipse 80i, 70배) 사진을 나타낸다. 상기 마이크로구조체의 2차 기저부는 비가교 HA를 추가하여 기저부의 두께를 조절하였다.
도 2는 본 발명의 마이크로구조체의 제조과정에 대한 모식도이다. 도 2a는 본 발명의 마이크로구조체의 제조과정에 대한 대표 모식도이고, 도 2b는 본 발명의 실시예 3-2에 대한 구체적인 모식도이다.
도 3a는 본 발명의 실시예 2-3에 의하여 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체의 현미경(Nikon Eclipse 80i, 100배) 사진을 나타낸다.
도 3b 및 3c는 본 발명의 실시예 3-2에 의하여 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체의 전자현미경(SEM, JEOL JSM-7500F, 70배) 사진을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤이 마이크로구조체에 최대 함량범위 이상으로 포함된 경우 제조되는 마이크로구조체의 현미경(Nikon Eclipse 80i, 40배) 사진을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤의 최대 점도범위 이상으로 제조된 마이크로구조체를 현미경(Nikon Eclipse 80i, 80배)로 관찰한 사진을 나타낸다.
도 6은 미변형 히알루론산(비가교 HA)을 이용하여 제조한 마이크로구조체와 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 미변형 히알루론산(비가교 HA)을 혼합하여 제조한 마이크로구조체의 팽윤된 젤 상태를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 방법에 의하여 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체의 기계적 강도 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 의하여 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용하여 마이크로구조체 제조 시 충분한 원심력을 가하여 주입하지 않은 경우의 마이크로구조체 현미경(Nikon Eclipse 80i, 40배) 사진을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 의하여 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용하여 마이크로구조체 제조 시 감압상태에서 주입이 충분하지 않는 경우의 마이크로구조체 현미경(Nikon Eclipse 80i, 40배) 사진을 나타낸다.
도 10은 본 발명에 의하여 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용하여 마이크로구조체 제조 시 추가 건조 과정이 충분하지 않은 경우의 마이크로구조체 현미경[Nikon Eclipse 80i, 40배(도 10a) 및 80배(도 10b)] 사진을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 가교된 히알루론산 하이드로젤의 제조
실시예 1-1: 10% 히알루론산(평균분자량 360 kDa) 이용
실시예 1-1-1
평균분자량 360 kDa(분자량 범위 240-490 kDa)의 히알루론산(Bloomage Freda Biotech, 중국)을 10 %(w/v) 농도로 알칼리수(0.25 N NaOH)에 완전히 녹인 후 하이드록시기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether)를 첨가하였다. BDDE는 HA의 반복단위의 10 몰%로 첨가하였다. 가교반응이 완전히 진행되기 위해 25℃에서 24시간 또는 30℃ 에서 20시간 동안 반응시켰다. 히알루론산 용액의 pH는 약 12였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 정제수 또는 생리식염수로 세척하여 잔류 BDDE 및 NaOH를 제거하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 H1-NMR 분석법(핵자기공명분광기)으로 측정하였으며, 가교도는 19.75%였다.
실시예 1-1-2
BDDE를 HA 반복단위의 12 몰%로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1-1-1과 동일한 방법으로 가교된 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 25.5%였다.
실시예 1-1-3
BDDE를 HA 반복단위의 15 몰%로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1-1-1과 동일한 방법으로 가교된 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 20.5%였다.
실시예 1-1-4
BDDE를 HA 반복단위의 30 몰%로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1-1-1과 동일한 방법으로 가교된 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 30.5%였다.
실시예 1-1-5
BDDE를 HA 반복단위의 40 몰%로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1-1-1과 동일한 방법으로 가교된 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 31.75%였다.
실시예 1-2: 15% 히알루론산(평균분자량 360 kDa) 이용
실시예 1-2-1
평균분자량 360 kDa(분자량 범위 240-490 kDa)의 히알루론산을 15 %(w/v) 농도로 알칼리수(0.25 N NaOH)에 완전히 녹인 후 하이드록시기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 BDDE를 첨가하였다. BDDE는 HA의 반복단위의 5 몰%로 첨가하였다. 가교반응이 완전히 진행되기 위해 25℃에서 24시간 또는 30℃ 에서 20시간 동안 반응시켰다. 히알루론산 용액의 pH는 약 12였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 정제수 또는 생리식염수로 세척하여 잔류 BDDE 및 NaOH를 제거하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 9.25%였다.
실시예 1-2-2
BDDE를 HA 반복단위의 7.5 몰%로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1-2-1과 동일한 방법으로 가교된 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 19.75%였다.
실시예 1-3: 20% 히알루론산(평균분자량 360 kDa) 이용
평균분자량 360 kDa(분자량 범위 240-490 kDa)의 히알루론산을 20 %(w/v) 농도로 알칼리수(0.25 N NaOH)에 완전히 녹인 후 하이드록시기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 BDDE를 첨가하였다. BDDE는 HA의 반복단위의 3 몰%로 첨가하였다. 가교반응이 완전히 진행되기 위해 25℃에서 24시간 또는 30℃ 에서 20시간 동안 반응시켰다. 히알루론산 용액의 pH는 약 12였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 정제수 또는 생리식염수로 세척하여 잔류 BDDE 및 NaOH를 제거하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 6.25%였다.
실시예 1-4: 30% 히알루론산(평균분자량 360 kDa) 이용
평균분자량 360 kDa(분자량 범위 240-490 kDa)의 히알루론산을 30 %(w/v) 농도가 되도록 알칼리수(0.25 N NaOH)에 첨가한 후 하이드록시기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 BDDE를 추가로 첨가하고 잘 혼합하였다. BDDE는 HA의 반복단위의 1 몰%로 첨가하였다. 가교반응이 완전히 진행되기 위해 25℃에서 24시간 또는 30℃ 에서 20시간 동안 반응시켰다. 히알루론산 용액의 pH는 약 12였다. 제조된 히가교된 히알루론산 하이드로젤을 정제수 또는 생리식염수로 세척하여 잔류 BDDE 및 NaOH를 제거하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 2.25%였다.
실시예 1-5: 10% 히알루론산(평균분자량 1,400kDa) 이용
실시예 1-5-1
평균분자량 1,400 kDa(분자량 범위 1000-1800 kDa, Bloomage Freda Biotech, 중국)의 히알루론산을 10 %(w/v) 농도로 알칼리수(0.25 N NaOH)에 완전히 녹인 후 하이드록시기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 BDDE를 첨가하였다. BDDE는 HA의 반복단위의 12 몰%로 첨가하였다. 가교반응이 완전히 진행되기 위해 25℃에서 24시간 또는 30℃ 에서 20시간 동안 반응시켰다. 히알루론산 용액의 pH는 약 12였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 정제수 또는 생리식염수로 세척하여 잔류 BDDE 및 NaOH를 제거하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 21.25%였다.
실시예 1-5-2
BDDE를 HA 반복단위의 20 몰%로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1-5-1과 동일한 방법으로 가교된 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 26.75%이었다.
실시예 1-6: 20% 히알루론산(평균분자량 3,200 kDa) 이용
평균분자량 3,200 kDa(분자량 범위 2400-4000 kDa, CPN, 체코)의 히알루론산을 20% 농도로 알칼리수(0.25N NaOH)에 완전히 녹인 후 하이드록시기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 BDDE를 첨가하였다. BDDE는 HA의 반복단위의 5 몰%로 첨가하였다. 가교반응이 완전히 진행되기 위해 25℃에서 24시간 또는 30℃ 에서 20시간 동안 반응시켰다. 히알루론산 용액의 pH는 약 12였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 정제수 또는 생리식염수로 세척하여 잔류 BDDE 및 NaOH를 제거하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 7.75%였다.
실시예 1-7 : 30% 히알루론산(평균분자량 3,200 kDa) 이용
평균분자량 3,200 kDa(분자량 범위 2400-4000 kDa)의 히알루론산을 30% 농도로 알칼리수(0.25N NaOH)에 완전히 녹인 후 하이드록시기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 BDDE를 첨가하였다. BDDE는 HA의 반복단위의 1 몰%로 첨가하였다. 가교반응이 완전히 진행되기 위해 25℃에서 24시간 또는 30℃ 에서 20시간 동안 반응시켰다. 히알루론산 용액의 pH는 약 12였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 정제수 또는 생리식염수로 세척하여 잔류 BDDE 및 NaOH를 제거하였다. 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 가교도는 2.25%였다.
실시예 2: 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체 제조
PDMS 마이크로 몰드 제조
실리콘 웨이퍼에 MEMS(Micro-Electro Mechanical System) 제작기법을 이용하여 양 마스터 몰드(positive master mold)를 제조한 다음 상기 양 마스터 몰드로부터 경화성 실리콘(PDMS, polydimethylsilozane)을 이용하여 음 몰드(negative mold)를 제조하였다.
실시예 2-1
PDMS 마이크로 몰드에 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 공급한 후 상온(25℃)에서 48시간, 50℃에서 6시간 또는 70℃에서 3시간 동안 건조하고, 상기 몰드에 형성된 구멍에 주입시킨 후 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 마이크로구조체를 제조하였다.
실시예 2-2
PDMS 마이크로 몰드에 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 공급한 후 감압조건(650 mmHg, 15분)에서 상기 몰드에 형성된 구멍에 주입하였다. 상온(25℃)에서 48시간, 50℃에서 6시간 또는 70℃에서 3시간 동안 건조하고 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 마이크로구조체를 제조하였다.
실시예 2-3
PDMS 마이크로 몰드에 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 공급한 후 900 g에서 15분간 원심분리(centrifuge)를 이용하여 상기 몰드에 형성된 구멍에 주입하였다. 상온에서 48시간, 50℃에서 6시간 또는 70℃에서 3시간 동안 건조시킨 후 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 마이크로구조체를 제조하였다.
실시예 2-4
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤 100 ml을 3 ml 또는 10 ml이 되도록 상온에서 20시간, 50℃에서 4시간 또는 70℃에서 2시간 동안 건조시키고 PDMS 마이크로 몰드에 공급한 후, 900 g에서 60분간 원심분리를 이용하여 상기 몰드에 형성된 구멍에 주입한 다음 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 마이크로구조체를 제조하였다.
실시예 2-5
PDMS 마이크로 몰드에 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 호모게나이저(homogenizer, Primix Corporation 일본)를 이용하여 8,000 rpm에서 10분간 균질화 하여 공급한 후, 상온에서 24시간, 50℃에서 5시간 또는 70℃에서 2.5시간 동안 중간 건조시키고 원심분리 900 g에서 20분간 원심분리를 이용하여 상기 몰드에 형성된 구멍에 고르게 주입한 다음, 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 마이크로구조체를 제조하였다. 상기 중간 건조 과정은 마이크로구조체의 기계적 강도를 높여주며 기저부의 편평도를 높이는데 도움을 준다.
실시예 2-6
PDMS 마이크로 몰드에 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 호모게나이저를 이용하여 8,000 rpm에서 10분간 균질화 하여 공급한 후, 37℃에서 12시간, 50℃에서 4시간 또는 70℃에서 2.5시간 동안 중간 건조시키고 900 g에서 20분간 원심분리를 이용하여 상기 몰드에 형성된 구멍에 고르게 주입한 후 50℃에서 1시간 또는 70℃에서 30분 동안 추가 건조를 진행한 다음, 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 마이크로구조체를 제조하였다. 상기 추가 건조 과정은 남아있는 수분을 추가로 제거함으로써 마이크로구조체의 기계적 강도를 높여주는 효과가 있다.
실시예 2-7
마이크로 몰드에 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 호모게나이저를 이용하여 8,000 rpm에서 10분간 균질화 하여 공급한 후, 37℃에서 7시간, 50℃에서 2.5시간 또는 70℃에서 1.5시간 동안 감압(684 mmHg) 조건에서 중간 건조시키고 900 g에서 20분간 원심분리를 이용하여 상기 몰드에 형성된 구멍에 고르게 주입한 후 50℃에서 1시간 또는 70℃에서 30분 동안 추가 건조를 진행한 다음, 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 마이크로구조체를 제조하였다. 상기 감압 건조 과정은 유도체 원료의 몰드 내 주입을 원활하게 하고 중간 건조 시간을 단축하여(평균 40%) 마이크로구조체에 약물 탑재 시 안정성을 높일 수 있는 장점이 있다.
비교예 1: 미변형(비가교) 히알루론산만을 이용한 마이크로구조체 제조
PDMS 마이크로 몰드에 비가교 히알루론산 30 %(w/v)를 공급하고 900 g에서 15분간 원심분리(centrifuge)를 이용하여 상기 몰드에 형성된 구멍에 주입하였다. 이후, 상온(25℃)에서 30분간 건조하고 몰드를 제거하여 마이크로구조체를 제조하였다.
실시예 3: 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 미변형(비가교) 히알루론산을 이용한 마이크로구조체 제조
실시예 3-1
실시예 1의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 호모게나이저를 이용하여 8,000 rpm에서 10분간 균질화 한 다음, 비가교 히알루론산을 가교된 히알루론산 하이드로젤:비가교 히알루론산 중량비가 1:1, 1:5, 1:10 또는 5:1이 되도록 혼합하고, 진공펌프(750 mmHg)를 이용한 탈포 과정을 통해 기포를 완전히 제거한 다음 마이크로 몰드에 공급하였다. 감압조건(650 mmHg, 15분)에서 상기 몰드에 형성된 구멍에 주입한 후, 상온(25℃)에서 48시간, 50℃에서 6시간 또는 70℃에서 3시간 동안 건조하고 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 비가교 히알루론산을 이용한 마이크로구조체를 제조하였다.
실시예 3-2
실시예 1의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 호모게나이저를 이용하여 8,000 rpm에서 10분간 균질화 한 다음, 비가교 히알루론산을 가교된 히알루론산 하이드로젤:비가교 히알루론산 중량비가 1:1, 1:5, 1:10 또는 5:1이 되도록 혼합하고, 감압조건(250 mmHg, 이에 의하여 기포 제거됨)에서 마이크로 몰드에 공급한 후 진공펌프(750 mmHg, 15분)를 이용한 추가 탈포 과정을 통해 기포를 완전히 제거하였다. 37℃에서 12시간, 50℃에서 4시간 또는 70℃에서 2.5시간 동안 중간 건조시키고, 900 g에서 20분간 원심분리를 이용하여 몰드에 형성된 구멍에 고르게 주입한 후 50℃에서 1시간 내지 70℃에서 30분 동안 추가 건조를 진행한 다음, 몰드를 제거하여 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 비가교 히알루론산을 이용한 마이크로구조체를 제조하였다.
실시예 4: 가교된 히알루론산 하이드로젤의 점탄성 확인 시험
가교된 히알루론산 하이드로젤의 경우 가교방법 및 가교제 첨가량에 따라 다양한 점탄성을 나타내며 지나치게 높은 점도(2,500,000 cp 이상)나 탄성계수(1 Hz에서 측정된 탄성계수 값이 100 kPa 이상)를 갖는 경우 원하는 모양과 경도의 마이크로구조체 제조가 불가능하다.
본 실시예는 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤 점탄성 별 마이크로구조체 제조 조건을 확인하기 위하여 수행되었다. 특히, 가교된 히알루론산 하이드로젤의 점탄성에 따라 마이크로구조체 제조 시 건조 시간과 원심분리 조건을 달리할 수 있으며, 1 Hz에서 측정된 탄성계수 값이 100 Pa 보다 높거나 젤의 평균입자 크기가 200 μm 이상이며 불균질한 경우 몰드에 공급하기 전 하이드로젤 입자의 균질화 과정이 필요하다.
본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤의 제조방법에 따른 점탄성을 확인하기 위하여 실시예 1-1 내지 1-5의 제조물에 대해 복합점도(|n*|, Pa.s), 탄성계수(G', Pa) 및 점성계수(G″, Pa)를 측정하였다.
AR 2000EX rheometer(T.A Instruments Ltd., 미국) 장비와 4-cm, 2°-콘 앤드 플레이트(cone and plate) 기하학을 이용하여 1% 스트레인(strain) 및 진동모드(oscillation mode)로 0.02-1 Hz까지 측정 했으며, 0.02 Hz에서 측정된 복합점도 값, 1 Hz에서 측정된 탄성계수 및 점성계수 값을 하기 표 1에 나타내었다. 장비의 편차는 ±10% 이며, 실험은 25℃에서 진행하였다.
HA
분자량
(kDa)		 가교제 첨가량
(HA 반복
단위 당 몰%)		 복합점도
(|n*|)
(Pa.s at 0.02 Hz)		 탄성계수
(G′)
(Pa at 1 Hz)		 점성계수
(G″)
(Pa at 1 Hz)		 마이크로구조체에 포함될 수 있는 가교된 HA 하이드로젤의 최대 함량(%, w/v)
실시예
1-1-1		 360 10 6.91 1.58 0.85 15%
실시예
1-1-2		 360 12 67.00 10.54 5.18 12%
실시예
1-1-3		 360 15 64.39 12.02 1.52 12%
실시예
1-1-4		 360 30 1754.33 435.50 100.16 7.5%
실시예
1-1-5		 360 40 4154.67 860.47 246.53 7.5%
실시예
1-2-1		 360 5 570.01 119.50 4.72 10%
실시예
1-2-2		 360 7.5 389.26 61.50 6.09 10%
실시예
1-3		 360 3 678.80 119.76 17.66 10%
실시예
1-4		 360 1 600.05 129.56 112 10%
실시예
1-5-1		 1,400 12 138.47 24.16 7.52 12%
실시예
1-5-2		 1,400 20 1469.67 227.35 45.95 7.5%
상기 표 1에서 보는 바와 같이 히알루론산 분자량과 가교제 조성 비율에 따라 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 복합점도와 탄성계수가 영향을 받음을 알 수 있다.
초기 히알루론산 반응 농도가 10 %(w/v)인 경우 가교제 첨가량이 증가함에 따라 제조된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 복합점도와 탄성계수가 증가하는 것이 확인되었다. 한편, 초기 히알루론산 반응 농도가 높아지면 가교제 첨가량이 낮은 경우에도 상대적으로 높은 복합점도와 탄성계수를 나타내는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 2-4의 방법으로 실시예 1-1 내지 1-5의 제조물을 몰드에 공급 전 건조한 후 농도를 변경해가면서 마이크로구조체 제조가 가능한 범위 내에서 최대로 포함될 수 있는 가교된 히알루론산 하이드로젤의 함량을 측정하였으며, 이를 표 1에 나타내었다. 가교된 히알루론산 하이드로젤만으로 마이크로구조체 제조 시 상기 최대 함량 범위를 넘어서는 경우, 탄성(또는, 복원력) 강하여 몰드에 주입이 어려움을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 1-1-2의 가교된 히알루론산 하이드로젤의 고형분 함량을 15%로 하여 실시예 2-4로 제조한 경우의 마이크로구조체는 균질하지 않은 상태로 건조되고 몰드로 주입되는 양이 구조체 별로 달라져 길이가 균질하지 않은 마이크로구조체가 제조됨을 확인하였다(도 4).
실시예 5: 균질화된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 점도 범위 측정
실시예 1에서 제조한 가교된 히알루론산 하이드로젤의 점도범위를 확인하기 위하여 실시예 1-1 내지 1-5의 제조물을 분쇄기(호모게나이저 또는 플런저밀)를 이용하여 균질화 한 다음, 점도계(Brookfield DV-I prime)를 이용하여 점도를 측정하였다.
기포가 발생하지 않도록 주의하면서 균질화된 가교된 히알루론산 하이드로젤을 비이커에 넣고 전체 시료의 온도가 균일해지도록 상온에서 2-3시간 동안 방치하였다. 이후, 평평한 바닥에 비이커를 고정시키고 LV62 내지 64 스핀들(spindle)을 이용하여 토크(torque) 값이 10-100% 범위 안에 들도록 rpm을 조절한 다음, 측정 시작 3분 후 안정화된 점도 값을 읽어 균질화된 가교된 히알루론산 하이드로젤의 점도를 측정하였다. 점도범위는 하기 표 2에 나타내었다.
가교제 첨가량
(HA 반복단위 당 몰%)		 spindle No. rpm toque(%) 점도(cp)
실시예 1-1-1 10 63 1.0 90-100 112000-120000
64 5.0 30-40 380000-445000
실시예 1-1-2 12 63 60.0 10-20 300-450
63 100.0 15-25 180-300
실시예 1-1-3 15 63 60.0 30-40 300-450
63 100.0 15-25 700-1150
실시예 1-1-4 30 63 2.0 80-90 50000-53000
63 2.5 90-100 45000-51000
실시예 1-1-5 40 63 1.0 90-100 110000-120000
64 5.0 50-60 63000-72000
실시예 1-2-1 5 63 1.0 60-70 101000-107000
64 5.0 60-70 72000-82000
실시예 1-2-2 7.5 63 2.5 70-80 37000-38000
63 5.0 90-100 27000-33000
실시예 1-3 3 63 1.5 65-75 48000-66000
63 6.0 71-93 14000-19000
실시예 1-4 1 62 1.5 60-70 12000-18000
63 5.0 60-70 14000-21000
실시예 1-5-1 12 63 5.0 60-65 140000-155000
63 10 80-90 9100-11000
실시예 1-5-2 20 63 0.5 50-60 112000-152000
64 5.0 35-45 43000-53000
실시예 1-1-1의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 점도범위 2,500,000 cp 상태에서 실시예 2-4로 제조한 경우 가교된 히알루론산 하이드로젤이 몰드에 전체적으로 균질하게 주입되지 않아 내부가 비어있거나 중간 부분이 잘린 마이크로구조체가 제조됨을 확인하였다(도 5).
실시예 6: 가교된 히알루론산 하이드로젤의 생체외 분해 확인(hyaluronidase assay)
본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤의 제조방법에 따른 생체외 분해 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 1-1 내지 1-7의 제조물에 대해 히알루론산 분해효소에 의한 분해실험을 실시하였다.
Reissig 등(A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugar, J. Biol. Chem. 1955, 217:959-966)의 방법을 변형하여 히알루론산 분해효소에 의한 생체외 분해실험을 실시하였다. 실시예 1-1 내지 1-7까지의 가교된 히알루론산 하이드로젤들을 각 시험관에 동일한 질량으로 담았다. 히알루론산 분해효소(hyaluronidase, Bovine Testes, Sigma-Aldrich, 미국) 500 U/mL을 포함한 0.2 M PBS(=pH 7.4)를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 6시간 및 48시간 동안 반응시켰다. 효소 반응을 멈추고 효소반응으로 인해 분해된 N-아세틸글루코사민(NAG)을 중간체인 글루콕사졸린(glucoxazoline)으로 전환하기 위하여, 0.8 M 포타슘 보레이트(potassium borate, pH 9.1)를 첨가한 후 100℃에서 5분간 가열하였다. 분해되어 나온 N-아세틸글루코사민의 양을 측정하기 위하여 p-디메틸아미노벤즈알데하이드(DMAB, p-Dimethylaminobenzaldehyde) 발색시약을 상기 시험관에 첨가 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 상등액을 취하여 분해되어 나온 가교물들 중 NAG의 양을 UV로 흡광도 585 nm에서 측정하였다. 비가교 히알루론산의 분해율을 100%로 정하고 실시예 1-1 내지 1-7의 제조물의 히알루론산 분해효소에 의한 상대적 분해 억제 효과를 하기 표 3에 나타내었다.
HA 분자량
(kDa)		 가교제 첨가량
(HA 반복단위 당 몰%)		 가교율
(%)		 생분해성 억제 효과(%)
6시간 48시간
비교예
(비가교 HA)		 360 - - 0 0
실시예 1-1-1 360 10 19.75 8.97 12.92
실시예 1-1-2 360 12 25.5 23.21 30.18
실시예 1-1-3 360 15 20.5 32.48 33.42
실시예 1-1-4 360 30 30.5 32.08 32.80
실시예 1-1-5 360 40 31.75 33.52 34.97
실시예 1-2-1 360 5 9.25 24.19 36.90
실시예 1-2-2 360 7.5 19.75 35.80 46.17
실시예 1-3 360 3 6.25 29.70 29.95
실시예 1-4 360 1 2.25 32.48 43.14
실시예 1-5-1 1,400 12 21.25 10.52 11.44
실시예 1-5-2 1,400 20 26.75 32.26 33.60
실시예 1-6 3,200 5 7.75 71.34 73.44
실시예 1-7 3,200 1 2.25 45.42 48.55
상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이 실시예 1-1 내지 1-7의 가교된 히알루론산 하이드로젤은 생체내 존재하는 히알루론산 분해효소에 대한 억제 효과를 나타내므로 비가교 히알루론산에 비해 긴 피부 내 지속 시간을 나타내므로, 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용한 마이크로구조체는 생체내 지속기간이 길어 높은 피부 미용 개선 효과를 나타낼 수 있으며 유용성분을 생체내에 안정적으로 전달할 수 있는 이점이 있다.
실시예 7: 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용하여 제조한 마이크로구조체의 생체외 효소 분해 속도(반감기, half-life) 확인
본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤 이용하여 제조한 마이크로구조체의 제조방법에 따른 생체외 효소 분해 속도의 차이를 확인하기 위해 실시예 1-1 내지 1-7의 제조물을 이용하여 실시예 2-2의 방법으로 마이크로구조체를 만든 다음, 일정한 크기로 잘라 히알루론산 분해효소에 의한 분해실험을 실시하고 각각의 마이크로구조체가 50%가 분해되는 시간을 비교하였다.
상기 일정한 크기로 자른 마이크로구조체를 각 시험관에 넣고 히알루론산 분해효소(hyaluronidase, Bovine Testes, Sigma-Aldrich, 미국)[16 units/mL을 포함한 0.2 M PBS(=pH 7.4)]를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 각각 24시간, 40시간, 48시간, 72시간, 120시간, 216시간 및 360시간 동안 반응시켰다. 각 반응시간에 맞추어 효소 반응을 멈추고 효소반응으로 인해 분해된 N-아세틸글루코사민(NAG)을 중간체인 글루콕사졸린(glucoxazoline)으로 전환하기 위하여, 0.8 M 포타슘 보레이트(potassium borate, pH 9.1)를 첨가한 후 100℃에서 5분간 가열하였다. 분해되어 나온 N-아세틸글루코사민의 양을 측정하기 위하여 p-디메틸아미노벤즈알데하이드(DMAB, p-Dimethylaminobenzaldehyde) 발색시약을 상기 시험관에 첨가 후 37℃에서 30분간 반응시킨 후 NAG의 양을 UV로 흡광도 585 nm에서 측정하였다. 비가교 히알루론산의 분해율을 100%로 정하고 유도체 별로 각 시간의 분해율을 구하여 분해율이 50%가 되는 시점의 시간(반감기, half-life)을 구하였다. 비가교 히알루론산의 분해율을 100%로 정하고 실시예 1-1 내지 1-7의 제조물을 이용하여 제조한 마이크로구조체의 히알루론산 분해효소에 의한 상대적 50% 분해 속도를 하기 표 4에 나타내었다.
마이크로구조체
제조방법		 가교된 히알루론산 하이드로젤 가교제 첨가량
(HA 반복단위 당 몰%)		 가교율
(%)		 마이크로구조체
효소 분해 속도
반감기
(half-life, 시간)
실시예 2-2 비교예
(비가교 HA)		 - - -
실시예 1-1-1 10 19.75 124±13.0
실시예 1-1-2 12 25.5 56±9.0
실시예 1-1-3 15 20.5 90±10.0
실시예 1-1-4 30 30.5 291±65.6
실시예 1-1-5 40 31.75 358±14.3
실시예 1-2-1 5 9.25 78±16.9
실시예 1-2-2 7.5 19.75 119±14.6
실시예 1-3 3 6.25 97±18
실시예 1-4 1 2.25 40±10.0
실시예 1-5-1 12 21.25 90±7.5
실시예 1-5-2 20 26.75 99±4.7
실시예 1-6 5 7.75 760±33.2
실시예 1-7 1 2.25 363±15.5
실시예 8: 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용하여 제조한 마이크로구조체의 팽윤도 실험
가교된 히알루론산 하이드로젤은 건조 후 다시 물을 가하면 높은 팽윤도를 나타내며 마이크로구조체 제조 시 이와 같은 팽윤성의 범위를 제한함으로써 마이크로구조체의 생체내 흡수 시간과 약물전달 속도를 조절할 수 있다.
특히, 생체내 흡수성과 팽윤도가 우수한 원료를 이용한 피부 삽입용 마이크로구조체를 사용하는 경우 높은 미용 효과를 나타낼 수 있다.
실시예 1의 70℃ 건조기에서 6시간 이상 완전히 건조된 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 실시예 2-1, 2-4 내지 2-7 및 3-2의 방법으로 건조된 마이크로구조체를 일정한 크기로 잘라 물속에 침전시킨 후 평형에 완전히 이를 수 있도록 24시간 동안 상온에서 보관하였다. 팽윤된 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 구조체를 꺼내 표면의 물을 제거한 후 중량을 측정한 다음 건조기에 넣어 수분을 완전히 제거한 후 건조된 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 마이크로구조체의 중량을 측정하여 다음 식으로 구조체의 팽윤도를 계산하였다.
팽윤도(%)＝
Figure 112017101670704-pat00001
× 100(%)
Ws：팽윤된 마이크로구조체의 중량, Wd :건조된 마이크로구조체의 중량
마이크로구조체
제조방법		 가교된 히알루론산 하이드로젤 가교율
(%)		 균질화 유무 혼합 비율
(가교된 히알루론산 하이드로젤:
비가교 히알루론산) 		팽윤도
(%)
실시예 1-1-1 19.75 - - 23250
실시예 1-1-2 25.5 - - 66670
실시예 1-1-3 20.5 - - 33210
실시예 1-1-4 30.5 - - 58820
실시예 1-1-5 31.75 - - 35710
실시예 1-2-1 9.25 - - 13510
실시예 1-2-2 19.75 - - 41660
실시예 1-3 6.25 - - 39720
실시예 1-4 2.25 - - 43210
실시예 1-5-1 21.25 - - 29410
실시예 1-5-2 26.75 - - 34480
실시예 2-1 실시예 1-3 6.25 - - 37560
실시예 2-4 실시예 1-3 6.25 - - 40200
실시예 2-5 실시예 1-3 6.25 + - 69540
실시예 2-6 실시예 1-3 6.25 + - 70110
실시예 2-7 실시예 1-1-1 19.75 + - 3300
실시예 1-1-2 25.5 + - 3050
실시예 1-1-3 20.5 + - 2900
실시예 1-1-4 30.5 + - 2370
실시예 1-1-5 31.75 + - 2200
실시예 1-2-1 9.25 + - 2330
실시예 1-2-2 19.75 + - 2910
실시예 1-3 6.25 + - 3730
실시예 1-4 2.25 + - 4800
실시예 1-5-1 21.25 + - 3710
실시예 1-5-2 26.75 + - 3280
실시예 3-2 실시예 1-3 6.25 + 5 : 1 57840
1 : 1 38230
1 : 5 26220
1 : 10 11040
상기 표 5에서 보는 바와 같이 본 발명의 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 마이크로구조체는 약 20배 내지 400배의 팽윤도를 나타내며, 균질화 과정을 거친 경우 약 700배까지도 팽윤도가 증가하는 것을 알 수 있다. 또한, 마이크로구조체 제조 시 비가교 히알루론산을 일정 비율로 혼합함으로써 팽윤도 범위에 대한 조절이 가능함을 알 수 있다.
실시예 9: 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 미변형( 비가교 ) 히알루론산을 이용하여 제조한 마이크로구조체의 장기(7일간) 팽윤도 유지 실험
실시예 1의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 균질화 한 다음 비가교 히알루론산을 가교된 히알루론산 하이드로젤:비가교 히알루론산 중량비가 1:10이 되도록 혼합하고 실시예 3-1의 방법으로 마이크로구조체를 제조하여 1 내지 7일간 팽윤도 유지 정도를 비교하였다.
팽윤도 실험을 위하여 상기 실시예의 방법으로 제작된 마이크로구조체를 10 -20 mg/cm2 의 크기로 준비하였다. 플라스크에 면거즈 또는 부직포 와이퍼를 평평하게 놓고, 생리식염수(PBS) 또는 0.003% 메틸렌블루(methylene blue)가 포함된 생리식염수를 가하여 충분히 적시어 주었다. 마이크로구조체 샘플을 0.01 g의 동일 무게가 되도록 자른 후, 적신 상태의 면거즈 또는 부직포 와이퍼에 올리고 면거즈 또는 부직포 와이퍼가 마르지 않도록 플라스크에 뚜껑을 덮은 후, 37℃ 인큐베이터에 보관하였다. 1일, 2일, 3일, 6일, 그리고 7일 째 되는 시간에 팽윤된 마이크로구조체의 무게를 측정하여 팽윤도의 변화를 관찰하였다.
실시예 8의 계산식을 이용하여 팽윤도를 계산하였고, 이를 하기 표 6에 나타내었다.
가교된 히알루론산 하이드로젤 혼합 비율
(가교된 히알루론산 하이드로젤:
비가교 히알루론산) 		마이크로구조체 제조방법 팽윤도 (%)
1일 2일 3일 6일 7일
비교예
(비가교 히알루론산 하이드로젤)		 - 실시예
2-2		 - - - - -
실시예 1-1-1 1:10 실시예
3-1		 9515 10592 8735 9518 9038
실시예 1-2-1 1:10 4936 5821 5403 4433 5062
실시예 1-3 1:10 6738 8192 6128 5638 6085
상기 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 비가교 히알루론산만으로 제조된 마이크로구조체는 생리식염수에 의한 팽윤도가 전혀 나타나지 않는 반면에, 실시예 1의 방법으로 제조된 히알루론산 하이드로젤과 비가교 히알루론산을 혼합한 다음 실시에 3-1의 방법으로 제조된 마이크로구조체의 경우 높은 팽윤도를 나타내며 그 팽윤도가 7일간 큰 변화 없이 유지되는 것을 알 수 있다.
상기 마이크로구조체의 형태를 관찰한 결과, 비가교 히알루론산만으로 제조된 마이크로구조체는 생리식염수에 의한 팽윤도가 전혀 나타나지 않아 모두 용해되어 특정한 형태를 나타내지 않는 반면에, 실시예 1의 방법으로 제조된 히알루론산 하이드로젤과 비가교 히알루론산을 혼합한 다음 실시에 3-1의 방법으로 제조된 마이크로구조체의 경우 하이드로젤 형태로 높은 팽윤도를 나타내며 그 팽윤도가 7일간 큰 변화 없이 유지되는 것을 알 수 있다(도 6).
실시예 10: 가교된 히알루론산 하이드로젤로 제조된 마이크로구조체의 피부투과(마이크로구조체의 기계적 강도) 확인 실험
상기 실시예 1-1-3 및 1-4의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 이용하여 각각 실시예 2-4 및 2-5로 제조된 마이크로니들의 기계적 강도의 변화를 보기 위하여 가교된 히알루론산 하이드로젤이 첨가된 마이크로구조체를 돼지피부에 찌른 후 트리판 블루로 염색하여 피부에 성공적으로 구멍을 형성했는지 확인하였다. 그 결과, 마이크로니들은 성공적으로 돼지피부에 구멍을 형성하였다(도 7a 및 7b). 따라서 가교된 히알루론산 하이드로젤이 첨가된 마이크로구조체는 피부를 투과할 수 있는 충분한 기계적 강도를 나타내므로 피부에서 활성 성분을 효율적으로 전달할 수 있음을 알 수 있다.
비교예 2:　실시예 2-3의 방법을 이용하여 마이크로구조체 제조 시 원심력을 충분히 가하지 않은 경우
실시예 1-1-4의 가교된 히알루론산 하이드로젤을 원심력이 충분하지 않은 상태(500 g에서 5분간 원심분리)에서 실시예 2-3의 방법으로 제조한 경우 원심력이 충분히 가해지지 않아서 가교된 히알루론산 하이드로젤이 몰드 끝까지 전달되지 않으며 끝이 날카롭지 않고 전체적으로 불균질한 마이크로구조체가 제조됨을 확인하였다(도 8).
비교예 3: 실시예 3-1의 방법을 이용하여 마이크로구조체 제조 시 감압주입이 충분하지 않은 경우
실시예 1-1-5의 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 비가교 히알루론산 혼합물(1:10)을 이용하여 실시예 3-1의 방법으로 마이크로구조체 제조 시 감압상태를 충분히 지속하지 않고 주입한 경우(650 mmHg, 3분간 감압주입), 상기 혼합물이 몰드 끝까지 전달되지 않아 끝이 날카롭지 않고 전체적으로 길이가 일정하지 않은 마이크로구조체가 제조됨을 확인하였다(도 9).
비교예 4: 실시예 3-2의 방법을 이용하여 마이크로구조체 제조 시 추가건조 과정이 충분하지 않은 경우
실시예 1-1-2의 가교된 히알루론산 하이드로젤 및 비가교 히알루론산 혼합물(1:10)을 이용하여 실시예 3-2의 방법으로 마이크로구조체 제조 시 추가건조 과정을 충분히 진행하지 않은 경우(50℃에서 5분간 추가건조), 상기 혼합물이 완전히 건조되지 않아 끝이 휘어진 마이크로구조체가 제조됨을 확인하였다(도 10).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 다음 단계를 포함하는 마이크로니들(microneedle)의 제조방법:
    (a) 균질화된 가교 히알루론산 하이드로젤(homogenized cross-linked hyaluronic acid hydrogel) 및 비가교 히알루론산의 혼합물을 마이크로 몰드에 공급하는 단계;
    (b) 상기 혼합물을 마이크로 몰드의 구멍에 주입하는 단계; 및
    (c) 상기 마이크로 몰드와 상기 혼합물을 분리하여 마이크로니들을 형성시키는 단계:
    여기서 상기 (a) 단계의 가교 히알루론산 하이드로젤과 비가교 히알루론산의 혼합물은 가교 히알루론산 하이드로젤의 중량 100 중량부를 기준으로 비가교 히알루론산 150-1000 중량부를 포함한다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 히알루론산의 평균 분자량은 100-5000 kDa인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 혼합물은 상기 (a) 단계의 마이크로 몰드에 공급 전 또는 공급 후, 대기압 이하의 압력 조건에서 기포를 제거(탈포)시킨 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 하이드로젤은 가교도가 1-50%인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 주입은 상기 혼합물에 외향력을 가하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 외향력은 원심력인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 주입은 대기압 이하의 압력에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 3 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 대기압 이하의 압력은 100-750 mmHg인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 이후 상기 혼합물을 건조하는 단계를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이후 상기 혼합물을 건조하는 단계를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 이전 상기 혼합물을 건조하는 단계를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조는 15-90℃에서 10분-60시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항에 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조는 대기압 이하의 압력에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 균질화된 가교 히알루론산 하이드로젤은
    (i) 비가교 히알루론산에 염기성 용액을 첨가하는 단계;
    (ii) 상기 단계 (i)의 결과물에 가교제를 첨가하여 가교반응을 일으키는 단계; 및
    (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 균질화하는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 단계 (ii)의 가교반응 결과물을 정제수, 생리식염수 또는 염화나트륨 용액으로 세척하여 잔류 가교제 및 잔류 염기성 용액을 제거하는 단계를 추가적으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 단계 (i)의 결과물은 히알루론산의 농도가 5-50 %(w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 가교제는 에테르 가교제인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 14 항에 있어서, 상기 가교제는 히알루론산의 반복단위의 0.5-50 몰% 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 14 항에 있어서, 상기 가교반응은 20-50℃에서 10-36시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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