JP2018510041A - 架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを含むマイクロ構造体及びその製造方法を提供する。【解決手段】本発明によれば、本発明のマイクロ構造体は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いることによって、均一であり、ねじれが最小化されたマイクロ構造体の製造が可能な効果がある。また、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体は、しわなど老化した皮膚組織を改善させ、保湿効果を与え、膨潤性に優れて、生体内で体液を容易に吸収し、ヒアルロン酸分解酵素に対して安定してマイクロ構造体の生体内持続期間が長くて、有用成分を生体内に安定して伝達できるという利点がある。【選択図】なし

Description

本願は、２０１５年２月１３日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１５−００２２３００号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参考として組み込まれる。

本発明は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いた生分解性マイクロ構造体及びその製造方法に係り、より詳細には、本発明は、ヒアルロン酸誘導体である架橋されたヒアルロン酸によって形成されたハイドロゲルを用いた生分解性マイクロ構造体及びその製造方法に関する。

薬物伝達システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＤＳ）は、薬物の吸収及び放出を制御することによって、薬物の副作用を減らし、効能を極大化させるように、細胞、組織などの標的部位に薬物を伝達する一連の技術を意味する。

薬物伝達システムは、一般的な経口摂取以外に、薬物を局部的に適用することができる経皮透過型伝達システムなどがあり、薬物のような薬剤学的物質を効率的でありながらも、安全に投与するための研究が持続的になされた。そのうち、注射療法の場合、投与方法が煩わしく、患者によって疼痛を伴い、薬物を一時的に注入する方法の以外に、制御に限界があるという問題点がある。

このような注射療法の短所を改善するために、注射器の針よりも遥かに小さく、疼痛が少ないマイクロ構造体（マイクロニードル）に関する研究が進められ、薬物伝達、血液採取、バイオセンサー及び皮膚美容など多様な分野で研究が進められている。

従来のマイクロニードルの製造方法としては、米国特許第６３３４８５６号である“ＭＩＣＲＯＮＥＥＤＬＥ ＤＥＶＩＣＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ”と大韓民国特許第１０−０７９３６１５号である“生分解性ソリッドマイクロニードル及びその製造方法”とがある。

前記特許は、硬化性ポリマーを用いて製作されたマイクロモールドに生分解性粘性物質を注入し、乾燥した後、モールドから分離してマイクロニードルを製造するか（モールディング技法）、生分解性ソリッドマイクロニードルを形成するための生分解性粘性物質をコーティングし、柱（ピラー）でパターニングされたフレームにコーティングされた生分解性粘性物質をドローイングしながら、乾燥させた後、ドローイングされた生分解性粘性物質を切断する段階を通じてマイクロニードルを製造する（ドローイング技法）。

しかし、このような従来の製造方法によって製造された生分解性ポリマーマイクロ構造体は、相対的に低い機械的強度によって、皮膚透過時に、曲がるか、つぶれる問題点を有している。

特に、高い弾性を有する高分子誘導体を原料として用いる場合、モールディング技法またはドローイング技法を用いてマイクロ構造体を製造時に、所望の構造体の形状が均質に生成されない限界があり、皮膚透過に必要なマイクロ構造体の機械的強度を満足させにくい短所がある。

本発明で使われるヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸との二糖単位が反復された連結構造を有する生分解性高分子である。

ヒアルロン酸で製造された構造体の場合、ヒアルロン酸の平均分子量が小さいほど構造体形成が容易であり、粘性が低く、分子量が大きくなるほど機械的強度は高くなるが、粘性が強くなる。このような特性のために、一般的に、マイクロ構造体の原料としては、低分子のヒアルロン酸を用いるが、低分子のヒアルロン酸を用いたマイクロ構造体の場合、皮膚透過時に、折れるか、曲がる問題が発生しやすい。

本発明では、低分子のヒアルロン酸を使用しながらも、皮膚透過に適した機械的強度を有し、皮膚内で容易に溶解または膨潤されて薬物伝達や皮膚美容に適したマイクロ構造体を製造するために、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及びそれを主材としたマイクロ構造体の製造方法を開発した。

本発明者らは、前述した従来技術の問題点を解決するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、皮膚の構成成分であるヒアルロン酸の誘導体である架橋されたヒアルロン酸で形成されたハイドロゲルをマイクロ構造体に主材として用いることによって、均一であり、ねじれが最小化されたマイクロ構造体の製造を可能にし、高い硬度を有して、有用成分伝達の効率性を高めるということを確認した。また、前記マイクロ構造体は、架橋されたヒアルロン酸の特性である高い粘弾性によって、しわなど老化した皮膚組織を改善させ、保湿効果を与えるということを確認した。また、本発明のマイクロ構造体は、膨潤性に優れて、生体内で体液を容易に吸収し、ヒアルロン酸分解酵素に対して安定してマイクロ構造体の生体内持続期間を増加させることによって、究極的に生体内にマイクロ構造体に搭載された有用成分を安定して伝達することができるということを確認することによって、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを含むマイクロ構造体（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を提供することである。

本発明の他の目的は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体の製造方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、有用成分伝達体（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

本発明の一態様によれば、本発明は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を含むマイクロ構造体を提供する。

本発明者らは、前述した従来技術の問題点を解決するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、皮膚の構成成分であるヒアルロン酸の誘導体である架橋されたヒアルロン酸で形成されたハイドロゲルをマイクロ構造体に主材として用いることによって、ヒアルロン酸をマイクロ構造体に用いる場合に比べて、粒子サイズを選択的に調節し、均一であり、ねじれが最小化されたマイクロ構造体の製造を可能にし、高い硬度を有して、有用成分伝達の効率性を高めるということを確認した。また、前記マイクロ構造体は、架橋されたヒアルロン酸の特性である高い粘弾性によって、しわなど老化した皮膚組織を改善させ、保湿効果を与えるということを確認した。また、本発明のマイクロ構造体は、膨潤性に優れて、生体内で体液を容易に吸収し、ヒアルロン酸分解酵素に対して安定してマイクロ構造体の生体内持続期間を増加させることによって、究極的に生体内にマイクロ構造体に搭載された有用成分を安定して伝達することができるということを確認した。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体及びその製造方法を提供する。
（ｂ）本発明のマイクロ構造体は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いることによって、均一であり、ねじれが最小化されたマイクロ構造体の製造が可能である。
（ｃ）また、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体は、しわなど老化した皮膚組織を改善させ、保湿効果を与え、膨潤性に優れて、生体内で体液を容易に吸収し、ヒアルロン酸分解酵素に対して安定してマイクロ構造体の生体内持続期間が長くて、有用成分を生体内に安定して伝達できるという利点がある。

本発明の架橋されたヒアルロン酸（ＨＡ）ハイドロゲル及びマイクロ構造体の製造方法によって製造されたマイクロ構造体の模式図を示す。 本発明の実施例３−１によって製造されたマイクロ構造体の顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、７０倍）写真を示す。前記マイクロ構造体の２次基底部は、非架橋ＨＡを追加して基底部の厚さを調節した。 本発明のマイクロ構造体の製造過程に対する模式図である。図２ａは、本発明のマイクロ構造体の製造過程に対する代表模式図である。 本発明のマイクロ構造体の製造過程に対する模式図である。図２ｂは、本発明の実施例３−２に対する具体的な模式図である。 本発明の実施例２−３によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体の顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、１００倍）写真を示す。 本発明の実施例３−２によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体の電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＥＯＬ ＪＳＭ−７５００Ｆ、７０倍）写真を示す。 本発明の実施例３−２によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体の電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＥＯＬ ＪＳＭ−７５００Ｆ、７０倍）写真を示す。 本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルがマイクロ構造体に最大含量範囲以上に含まれた場合、製造されるマイクロ構造体の顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、４０倍）写真を示す。 本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの最大粘度範囲以上に製造されたマイクロ構造体を顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、８０倍）で観察した写真を示す。 本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの最大粘度範囲以上に製造されたマイクロ構造体を顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、８０倍）で観察した写真を示す。 未変形ヒアルロン酸（非架橋ＨＡ）を用いて製造したマイクロ構造体と本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び未変形ヒアルロン酸（非架橋ＨＡ）とを混合して製造したマイクロ構造体の膨潤されたゲル状を示す。 本発明の方法によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体の機械的強度の実験結果を示す。 本発明の方法によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体の機械的強度の実験結果を示す。 本発明によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いてマイクロ構造体の製造時に、十分な遠心力を加えて注入していない場合のマイクロ構造体の顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、４０倍）写真を示す。 本発明によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いてマイクロ構造体の製造時に、減圧状態で注入が十分ではない場合のマイクロ構造体の顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、４０倍）写真を示す。 本発明によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いてマイクロ構造体の製造時に、追加乾燥過程が十分ではない場合のマイクロ構造体の顕微鏡［Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、４０倍］写真を示す。 本発明によって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを用いてマイクロ構造体の製造時に、追加乾燥過程が十分ではない場合のマイクロ構造体の顕微鏡［Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ、８０倍］写真を示す。

本明細書の用語“ヒアルロン酸”は、ヒアルロン酸だけではなく、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム及びヒアルロン酸カルシウム）及びこれらの混合物をいずれも含む意味として使われる。

本明細書の用語“ハイドロゲル”は、十分な量の水分を保有している親水性高分子の３次元的構造を意味する。本発明の目的上、ハイドロゲルは、架橋されたヒアルロン酸間に形成されたハイドロゲルである。

本発明は、多様なマイクロ構造体を提供し、例えば、マイクロニードル、マイクロブレード、マイクロナイフ、マイクロファイバー、マイクロスパイク、マイクロプローブ、マイクロバーブ（ｍｉｃｒｏｂａｒｂ）、マイクロアレイまたはマイクロ電極を提供することができる。本発明の一具現例によれば、本発明のマイクロ構造体は、マイクロニードルである。

本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１〜５０％の架橋度を有する。本発明の他の具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１〜４０％、２〜４０％、５〜４０％、７〜４０％、１０〜４０％、１５〜４０％、１８〜４０％、２０〜４０％、２２〜４０％、２５〜４０％、２８〜４０％、３０〜４０％、１〜３５％、２〜３５％、５〜３５％、７〜３５％、１０〜３５％、１５〜３５％、１８〜３５％、２０〜３５％、２２〜３５％、２５〜３５％、２８〜３５％、１〜３０％、２〜３０％、５〜３０％、７〜３０％、１０〜３０％、１５〜３０％、１８〜３０％、２０〜３０％、２２〜３０％、２５〜３０％、２８〜３０％、１〜２５％、２〜２５％、５〜２５％、７〜２５％、１０〜２５％、１５〜２５％、１８〜２５％、２０〜２５％、２２〜２５％、１〜２０％、２〜２０％、５〜２０％、７〜２０％、１０〜２０％、１５〜２０％、１８〜２０％、１〜１５％、２〜１５％、５〜１５％、７〜１５％、１０〜１５％、１〜１０％、２〜１０％、５〜１０％、７〜１０％、１〜５％、２〜５％、１〜３％または２〜３％の架橋度を有する。下記の実施例６で立証したように、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、生体内に存在するヒアルロン酸分解酵素による生分解抑制効果を示すので、非架橋ヒアルロン酸に比べて、長い皮膚内持続時間を示す。

本発明の一具現例によれば、本発明のマイクロ構造体は、半減期が２０時間〜８５０時間である。本明細書の用語“半減期”は、ヒアルロン酸分解酵素（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）に対する非架橋ヒアルロン酸の分解率を１００％とする時、前記ヒアルロン酸分解酵素に対する分解率が５０％になる時点の時間を意味する。下記の実施例７で立証したように、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを含むマイクロ構造体は、半減期が長くて、有用成分を生体内に安定して伝達し、前記有用成分が美容成分である場合、高い皮膚美容改善効果を示すことができる。

本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、本発明のマイクロ構造体に１５％（ｗ／ｖ）以下に含まれる。本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、本発明のマイクロ構造体に０．１〜１５％（ｗ／ｖ）に含まれる。本発明の他の具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、本発明のマイクロ構造体に０．１〜１２、０．１〜１０、０．１〜７．５、０．５〜１２、０．５〜１０、０．５〜７．５、１〜１２、１〜１０または１〜７．５％（ｗ／ｖ）に含まれる。

本発明の他の具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１Ｈｚでの弾性係数が０．５〜５Ｐａ未満である場合、１５％（ｗ／ｖ）以下、５〜５０Ｐａ未満である場合、１２％（ｗ／ｖ）以下、５０〜２００Ｐａ未満である場合、１０％以下、２００〜１０００Ｐａ未満である場合、７．５％以下に本発明のマイクロ構造体に含まれる。本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１Ｈｚでの弾性係数が０．５〜３Ｐａ未満、０．５〜２Ｐａ未満、１〜５Ｐａ未満、１〜３Ｐａ未満、１〜２Ｐａ未満である場合、１５％（ｗ／ｖ）以下に本発明のマイクロ構造体に含まれる。本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１Ｈｚでの弾性係数が５〜３０Ｐａ未満、８〜３０Ｐａ未満、１０〜３０Ｐａ未満、５〜２５Ｐａ未満、８〜２５Ｐａ未満、１０〜２５Ｐａ未満、５〜２０Ｐａ未満、８〜１５Ｐａ未満、２０〜３０Ｐａ未満または２２〜２６Ｐａ未満である場合、１２％（ｗ／ｖ）以下に本発明のマイクロ構造体に含まれる。本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１Ｈｚでの弾性係数が５０〜１５０Ｐａ未満、５０〜１３０Ｐａ未満、５０〜７０Ｐａ未満、１００〜１５０Ｐａ未満、１００〜１４０Ｐａ未満または１００〜１３０Ｐａ未満である場合、１０％（ｗ／ｖ）以下に本発明のマイクロ構造体に含まれる。本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１Ｈｚでの弾性係数が２００〜９００Ｐａ未満、２００〜５００Ｐａ未満、２００〜３００Ｐａ未満、３００〜９００Ｐａ未満、４００〜９００Ｐａ未満、４００〜５００Ｐａ未満または８００〜９００Ｐａ未満である場合、７．５％（ｗ／ｖ）以下に本発明のマイクロ構造体に含まれる。

本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、当業者の如何なるヒアルロン酸架橋方法によっても架橋が可能である。本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、架橋剤によって架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルである。本発明の他の具現例によれば、本発明の前記架橋剤は、エーテル架橋剤である。本発明の一具現例によれば、前記エーテル架橋剤は、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ、１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ｄｉｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、及びＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）で構成された群から選択された１以上の架橋剤である。本発明の特定の具現例によれば、前記エーテル架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテルである。

本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、周波数０．０２Ｈｚで３〜５０００Ｐａ．ｓの複合粘度を有する。本発明の他の具現例によれば、前記複合粘度は、３〜４５００、３〜４３００、３〜４２００、３〜２０００、３〜１５００、３〜１０００、３〜７００、３〜６５０、３〜６００、３〜４００、３〜２００、３〜１５０、３〜１００、３〜７０、３〜５０、３〜２０、３〜１０、３〜８、５〜４５００、５〜４３００、５〜４２００、５〜２０００、５〜１５００、５〜１０００、５〜７００、５〜６５０、５〜６００、５〜４００、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、５〜７０、５〜５０、５〜２０、５〜１０、５０〜４５００、５０〜４３００、５０〜４２００、５０〜２０００、５０〜１５００、５０〜１０００、５０〜７００、５０〜６５０、５０〜６００、５０〜４００、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１００、５０〜７０、１００〜４５００、１００〜４３００、１００〜４２００、１００〜２０００、１００〜１５００、１００〜１０００、１００〜７００、１００〜６５０、１００〜６００、１００〜４００、１００〜２００、１００〜１５０、３００〜４５００、３００〜４３００、３００〜４２００、３００〜２０００、３００〜１５００、３００〜１０００、３００〜７００、３００〜６５０、３００〜６００、３００〜４００、５００〜４５００、５００〜４３００、５００〜４２００、５００〜２０００、５００〜１５００、５００〜１０００、５００〜７００、５００〜６５０、５００〜６００、６００〜４５００、６００〜４３００、６００〜４２００、６００〜２０００、６００〜１５００、６００〜１０００、６００〜７００、６００〜６５０、６５０〜４５００、６５０〜４３００、６５０〜４２００、６５０〜２０００、６５０〜１５００、６５０〜１０００、６５０〜７００、６５０〜６５０、６５０〜６００、６５０〜４００、６５０〜２００、６５０〜１５０、６５０〜１００、６５０〜７０、６５０〜５０、６５０〜２０、６５０〜１０、１０００〜２０００、１０００〜１５００、１０００〜４５００、１０００〜４３００、１０００〜４２００、１０００〜２０００、１０００〜１５００、１３００〜４５００、１３００〜４３００、１３００〜４２００、１３００〜２０００、１３００〜１５００、１５００〜４５００、１５００〜４３００、１５００〜４２００、１５００〜２０００、４０００〜４５００または４０００〜４３００Ｐａ．ｓである。

本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、周波数１Ｈｚで１〜１０００Ｐａの弾性係数を有する。本発明の他の具現例によれば、前記弾性係数は、１〜９００Ｐａ、１〜８７０Ｐａまたは１．５〜８７０Ｐａである。本発明の一具現例によれば、前記弾性係数は、１〜５００、１〜４５０、１〜３００、１〜２５０、１〜１５０、１〜１３０、１〜１００、１〜７０、１〜１０、１〜５、１〜３、８〜９００、８〜５００、８〜４５０、８〜３００、８〜２５０、８〜１５０、８〜１３０、８〜１００、８〜７０、８〜１０、１０〜９００、１０〜５００、１０〜４５０、１０〜３００、１０〜２５０、１０〜１５０、１０〜１３０、１０〜１００、１０〜７０、２０〜９００、２０〜５００、２０〜４５０、２０〜３００、２０〜２５０、２０〜１５０、２０〜１３０、２０〜１００、２０〜７０、５０〜９００、５０〜５００、５０〜４５０、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜１５０、５０〜１３０、５０〜１００、５０〜７０、１００〜９００、１００〜５００、１００〜４５０、１００〜３００、１００〜２５０、１００〜１５０、１００〜１３０、１１０〜９００、１１０〜５００、１１０〜４５０、１１０〜３００、１１０〜２５０、１１０〜１５０、１１０〜１３０、１２０〜９００、１２０〜５００、１２０〜４５０、１２０〜３００、１２０〜２５０、１２０〜１５０、１２０〜１３０、４００〜９００、４００〜５００、４００〜４５０または８００〜９００Ｐａである。

本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、周波数１Ｈｚで０．５〜５００Ｐａの粘性係数を有する。本発明の他の具現例によれば、前記粘性係数は、０．５〜４００Ｐａ、０．５〜３００Ｐａ、０．５〜２５０Ｐａまたは０．７〜２５０Ｐａである。本発明の一具現例によれば、前記粘性係数は、０．５〜３００、０．５〜１５０、０．５〜１２０、０．５〜７０、０．５〜５０、０．５〜１０、０．５〜５、０．５〜３、０．５〜２、０．５〜１、１〜３００、１〜１５０、１〜１２０、１〜７０、１〜５０、１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２、１〜１、３〜３００、３〜１５０、３〜１２０、３〜７０、３〜５０、３〜１０、３〜５、５〜３００、５〜１５０、５〜１２０、５〜７０、５〜５０、５〜１０、６〜３００、６〜１５０、６〜１２０、６〜７０、６〜５０、６〜１０、７〜５００、７〜３００、７〜１５０、７〜１２０、７〜７０、７〜５０、７〜１０、１０〜５００、１０〜３００、１０〜１５０、１０〜１２０、１０〜７０、１０〜５０、１５〜５００、１５〜３００、１５〜１５０、１５〜１２０、１５〜７０、１５〜５０、３０〜５００、３０〜３００、３０〜１５０、３０〜１２０、３０〜７０、３０〜５０、４０〜５００、４０〜３００、４０〜１５０、４０〜１２０、４０〜７０、４０〜５０、８０〜５００、８０〜３００、８０〜１５０、８０〜１２０、９０〜５００、９０〜３００、９０〜１５０、９０〜１２０、１００〜５００、１００〜３００、１００〜１５０、１００〜１２０、２００〜５００、２００〜３００、２３０〜５００、２３０〜３００または２３０〜２５０Ｐａである。

本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１００〜１００００００ｃｐの粘度を有する。本発明の他の具現例によれば、前記粘度は、１００〜５０００００、１００〜２０００００、１００〜１６００００、１００〜１３００００、１００〜１２００００、１００〜１１００００、１００〜１０００００、１００〜９００００、１００〜８５０００、１００〜８００００、１００〜７５０００、１００〜７００００、１００〜６００００、１００〜５５０００、１００〜５００００、１００〜４００００、１００〜３５０００、１００〜３００００、１００〜２５０００、１００〜２００００、１００〜１５０００、１００〜５０００、１００〜２０００、１００〜１２００、１００〜５００、１００〜４００、１５０〜１００００００、１５０〜５０００００、１５０〜２０００００、１５０〜１６００００、１５０〜１３００００、１５０〜１２００００、１５０〜１１００００、１５０〜１０００００、１５０〜９００００、１５０〜８５０００、１５０〜８００００、１５０〜７５０００、１５０〜７００００、１５０〜６００００、１５０〜５５０００、１５０〜５００００、１５０〜４００００、１５０〜３５０００、１５０〜３００００、１５０〜２５０００、１５０〜２００００、１５０〜１５０００、１５０〜５０００、１５０〜２０００、１５０〜１２００、１５０〜５００、１５０〜４００、５００〜１００００００、５００〜５０００００、５００〜２０００００、５００〜１６００００、５００〜１３００００、５００〜１２００００、５００〜１１００００、５００〜１０００００、５００〜９００００、５００〜８５０００、５００〜８００００、５００〜７５０００、５００〜７００００、５００〜６００００、５００〜５５０００、５００〜５００００、５００〜４００００、５００〜３５０００、５００〜３００００、５００〜２５０００、５００〜２００００、５００〜１５０００、５００〜５０００、５００〜２０００、５００〜１２００、６００〜１００００００、６００〜５０００００、６００〜２０００００、６００〜１６００００、６００〜１３００００、６００〜１２００００、６００〜１１００００、６００〜１０００００、６００〜９００００、６００〜８５０００、６００〜８００００、６００〜７５０００、６００〜７００００、６００〜６００００、６００〜５５０００、６００〜５００００、６００〜４００００、６００〜３５０００、６００〜３００００、６００〜２５０００、６００〜２００００、６００〜１５０００、６００〜５０００、６００〜２０００、６００〜１２００、８００〜１００００００、８００〜５０００００、８００〜２０００００、８００〜１６００００、８００〜１３００００、８００〜１２００００、８００〜１１００００、８００〜１０００００、８００〜９００００、８００〜８５０００、８００〜８００００、８００〜７５０００、８００〜７００００、８００〜６００００、８００〜５５０００、８００〜５００００、８００〜４００００、８００〜３５０００、８００〜３００００、８００〜２５０００、８００〜２００００、８００〜１５０００、８００〜５０００、８００〜２０００、８００〜１２００、１００００〜１００００００、１００００〜５０００００、１００００〜２０００００、１００００〜１６００００、１００００〜１３００００、１００００〜１２００００、１００００〜１１００００、１００００〜１０００００、１００００〜９００００、１００００〜８５０００、１００００〜８００００、１００００〜７５０００、１００００〜７００００、１００００〜６００００、１００００〜５５０００、１００００〜５００００、１００００〜４００００、１００００〜３５０００、１００００〜３００００、１００００〜２５０００、１００００〜２００００、１００００〜１５０００、２５０００〜１００００００、２５０００〜５０００００、２５０００〜２０００００、２５０００〜１６００００、２５０００〜１３００００、２５０００〜１２００００、２５０００〜１１００００、２５０００〜１０００００、２５０００〜９００００、２５０００〜８５０００、２５０００〜８００００、２５０００〜７５０００、２５０００〜７００００、２５０００〜６００００、２５０００〜５５０００、２５０００〜５００００、２５０００〜４００００、２５０００〜３５０００、２５０００〜３００００、４００００〜１００００００、４００００〜５０００００、４００００〜２０００００、４００００〜１６００００、４００００〜１３００００、４００００〜１２００００、４００００〜１１００００、４００００〜１０００００、４００００〜９００００、４００００〜８５０００、４００００〜８００００、４００００〜７５０００、４００００〜７００００、４００００〜６００００、４００００〜５５０００、４００００〜５００００、４５０００〜１００００００、４５０００〜５０００００、４５０００〜２０００００、４５０００〜１６００００、４５０００〜１３００００、４５０００〜１２００００、４５０００〜１１００００、４５０００〜１０００００、４５０００〜９００００、４５０００〜８５０００、４５０００〜８００００、４５０００〜７５０００、４５０００〜７００００、４５０００〜６００００、４５０００〜５５０００、４５０００〜５００００、５００００〜１００００００、５００００〜５０００００、５００００〜２０００００、５００００〜１６００００、５００００〜１３００００、５００００〜１２００００、５００００〜１１００００、５００００〜１０００００、５００００〜９００００、５００００〜８５０００、５００００〜８００００、５００００〜７５０００、５００００〜７００００、５００００〜６００００、６００００〜１００００００、６００００〜５０００００、６００００〜２０００００、６００００〜１６００００、６００００〜１３００００、６００００〜１２００００、６００００〜１１００００、６００００〜１０００００、６００００〜９００００、６００００〜８５０００、６００００〜８００００、６００００〜７５０００、６００００〜７００００、７００００〜１００００００、７００００〜５０００００、７００００〜２０００００、７００００〜１６００００、７００００〜１３００００、７００００〜１２００００、７００００〜１１００００、７００００〜１０００００、７００００〜９００００、７００００〜８５０００、７００００〜８００００、７００００〜７５０００、１０００００〜１００００００、１０００００〜５０００００、１０００００〜２０００００、１０００００〜１６００００、１０００００〜１３００００、１０００００〜１２００００、１０００００〜１１００００、１１００００〜１００００００、１１００００〜５０００００、１１００００〜２０００００、１１００００〜１６００００、１１００００〜１３００００、１１００００〜１２００００、１３００００〜１００００００、１３００００〜５０００００、１３００００〜２０００００、１３００００〜１６００００、１４００００〜１００００００、１４００００〜５０００００、１４００００〜２０００００、１４００００〜１６００００、３５００００〜１００００００、３５００００〜５０００００、３７００００〜１００００００、３７００００〜５０００００または３７００００〜４５００００ｃｐである。

本発明の一具現例によれば、本発明のマイクロ構造体は、２０００〜８００００％の膨潤度を有する。本発明の他の具現例によれば、本発明のマイクロ構造体は、２０００〜７５０００、２０００〜７００００、２０００〜６００００、２０００〜４５０００、２０００〜４００００、２０００〜３５０００、２０００〜３００００、２０００〜２５０００、２０００〜１５０００、２０００〜１２０００、２０００〜５０００、２０００〜３０００、２０００〜２５００、２５００〜７５０００、２５００〜７００００、２５００〜６００００、２５００〜４５０００、２５００〜４００００、２５００〜３５０００、２５００〜３００００、２５００〜２５０００、２５００〜１５０００、２５００〜１２０００、２５００〜５０００、２５００〜３０００、３０００〜７５０００、３０００〜７００００、３０００〜６００００、３０００〜４５０００、３０００〜４００００、３０００〜３５０００、３０００〜３００００、３０００〜２５０００、３０００〜１５０００、３０００〜１２０００、３０００〜５０００、４０００〜７５０００、４０００〜７００００、４０００〜６００００、４０００〜４５０００、４０００〜４００００、４０００〜３５０００、４０００〜３００００、４０００〜２５０００、４０００〜１５０００、４０００〜１２０００、４０００〜５０００、１００００〜７５０００、１００００〜７００００、１００００〜６００００、１００００〜４５０００、１００００〜４００００、１００００〜３５０００、１００００〜３００００、１００００〜２５０００、１００００〜１５０００、１００００〜１２０００、２００００〜７５０００、２００００〜７００００、２００００〜６００００、２００００〜４５０００、２００００〜４００００、２００００〜３５０００、２００００〜３００００、２００００〜２５０００、２５０００〜７５０００、２５０００〜７００００、２５０００〜６００００、２５０００〜４５０００、２５０００〜４００００、２５０００〜３５０００、２５０００〜３００００、３００００〜７５０００、３００００〜７００００、３００００〜６００００、３００００〜４５０００、３００００〜４００００、３００００〜３５０００、３５０００〜７５０００、３５０００〜７００００、３５０００〜６００００、３５０００〜４５０００、３５０００〜４００００、４００００〜７５０００、４００００〜７００００、４００００〜６００００、４００００〜４５０００、５５０００〜７５０００、５５０００〜７００００、５５０００〜６００００、６５０００〜７５０００、６５０００〜７００００、７００００〜７５０００または７００００〜７２０００％の膨潤度を有する。本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、乾燥後、再び水を加えれば、高い膨潤度を示し、マイクロ構造体の製造時に、このような膨潤性の範囲を制限することによって、マイクロ構造体の生体内吸収時間と薬物伝達速度とを調節することができる。特に、皮膚挿入用マイクロ構造体に本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いる場合、膨潤度及び生体内吸水性に優れて、高い美容効果を示すことができる。

本発明の一具現例によれば、本発明のマイクロ構造体は、非架橋ヒアルロン酸をさらに含む。本発明の一具現例によれば、前記さらに含まれる非架橋ヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの重量１００を基準に５〜２０００重量部である。本発明の一具現例によれば、前記さらに含まれる非架橋ヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの重量１００を基準に７〜１５００、９〜１１００、１０〜１０００、２０〜５００、５０〜２００、５〜２０、５〜１５または８〜１２重量部である。下記の実施例６で立証したように、マイクロ構造体の製造時に、非架橋ヒアルロン酸と本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルとを一定比率で混合することによって、膨潤度を調節することができる。

本発明の一具現例によれば、本発明のマイクロ構造体は、有用成分をさらに含む。本発明の他の具現例によれば、前記有用成分は、薬物、美容成分またはその組合せである。本発明のマイクロ構造体は、有用成分を含むことによって、皮膚内に有用成分を有効に伝達することができる。

本発明の他の態様によれば、本発明は、（ａ）架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドに供給する段階と、（ｂ）前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドの穴に注入する段階と、（ｃ）前記マイクロモールドと架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルとを分離してマイクロ構造体を形成させる段階と、を含むマイクロ構造体の製造方法を提供する。

本発明の方法をそれぞれの段階別に詳細に説明すれば、次の通りである：

段階（ａ）：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドに供給する段階

本発明によれば、まず、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドに供給する。

本発明のマイクロモールドは、当業者の如何なるマイクロモールド製作技法を用いても製作が可能である。例えば、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）製作技法、フォトリソグラフィー（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅｓ：Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０４，５１−６６，２００５）製作技法及びソフトリソグラフィー（ｓｏｆｔ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）製作技法などが、本発明のマイクロモールド製作に利用できるが、これらに制限されるものではない。二重ソフトリソグラフィー製作技法を用いる場合、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）またはＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））のような弾性体モールドを製造して、それをマイクロ構造体の製造に利用できる。ＰＤＭＳモールドを製造する技術は、一種のプラスチック加工技術であって、キャスティング（ｃａｓｔｉｎｇ）、インジェクション（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ホットエンボッシング（ｈｏｔ−ｅｍｂｏｓｓｉｎｇ）などの多様な方法で所望のモールディング構造が得られる。例を挙げれば、シリコンウェーハ、ガラスなどの基板上に感光物質をコーティングし、フォトマスクを用いてパターニングすれば、結果としてマスタ（ｍａｓｔｅｒ）が作られる。それを鋳型としてＰＤＭＳをキャスティングし、焼結させれば、スタンプ機能を果たすＰＤＭＳモールドを完成することができる。

本発明の一具現例によれば、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、架橋度が１〜５０％である。本発明のマイクロ構造体の製造方法は、本発明のマイクロ構造体と架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルとを共通にするために、両者間の共通内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

段階（ｂ）：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドの穴に注入

引き続き、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドの穴に注入させる。

本発明の一具現例によれば、本発明の注入は、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルに外向力を加えて実施する。本発明の他の具現例によれば、前記外向力は、遠心力である。

本発明の他の具現例によれば、本発明の注入は、大気圧以下の圧力で実施する。本発明の一具現例によれば、本発明の注入は、１００〜７５０ｍｍＨｇの圧力で実施する。本発明のさらに他の具現例によれば、本発明の注入は、１００〜７５０、２００〜７５０、３００〜７５０、４００〜７５０、５００〜７５０、６００〜７５０、１００〜７００、２００〜７００、３００〜７００、４００〜７００、５００〜７００または６００〜７００ｍｍＨｇで実施する。本発明の一具現例によれば、前記注入は、大気圧以下の圧力で５分以上、５〜１８０分、５〜１２０分、５〜６０分、５〜３０分、５〜２０分、１０〜１８０分、１０〜１２０分、１０〜６０分、１０〜３０分、１０〜２０分、１３〜１８０分、１３〜１２０分、１３〜６０分、１３〜３０分、１３〜２０分または１３〜１７分実施する。

本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ｂ）以後、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドに供給して、一定の厚さの１次基底部（ｂａｓｅ）を構成する段階をさらに含む（図１ａ）。この場合、マイクロ構造体の構成物質と同じ基底部を構成し、基底部のねじれを最小化するための前記１次基底部の厚さは、１０μｍ〜２００μｍまたは３０μｍ〜１００μｍである。

本発明の他の具現例によれば、本発明の１次基底部を構成する段階以後、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルと異なる高分子物質をマイクロモールドに供給して、一定の厚さの２次基底部を構成する段階をさらに含む（図１ａ）。本発明の一具現例によれば、本発明の２次基底部は、生体適合性高分子または粘着剤を含む。本発明の特定の具現例によれば、前記生体適合性高分子は、非架橋ヒアルロン酸（図１ｂ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ペクチン、カラギーナン、コンドロイチン（サルフェート）、デキストラン（サルフェート）、キトサン、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、コラーゲン、ゼラチン、カルボキシメチルキチン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｉｎ）、フィブリン、アガーロス、プルロニックポリ乳酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−グリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、コンドロイチン（サルフェート）、デキストラン（サルフェート）、キトサン、ポリリジン、コラーゲン、ゼラチン、カルボキシメチルキチン、フィブリン、アガーロス、プルロニックポリアンヒドリド（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ）、ポリエーテルエステル（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｅｓｔｅｒ）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリエステルアミド（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒａｍｉｄｅ）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリウレタン、ポリアクリル酸、エチレン−酢酸ビニル重合体、アクリル置換セルロースアセテート、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルフッ素化合物、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン酸ポリオレフィン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ ｐｏｌｙｏｌｅｆｉｎｓ）、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリメタクリレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシプロフィールセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、及びこのような高分子を形成する単量体の共重合体及びセルロースで構成された群から選択された１以上の高分子である。本発明の特定の具現例によれば、前記粘着剤は、シリコン、ポリウレタン、ヒアルロン酸、物理的接着剤（ゲッコー）、ポリアクリル、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、エチレン酢酸ビニル、及びポリイソブチレンで構成された群から選択された１以上の粘着剤である。

段階（ｃ）：マイクロモールドと架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルとを分離

段階（ｂ）実施以後、本発明のマイクロモールドと架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルとを分離してマイクロ構造体を形成させる。

本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ａ）以後、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを乾燥する段階を実施する。本発明の他の具現例によれば、本発明の段階（ａ）以後、実施する乾燥は、１５〜９０℃で１０分〜６０時間、２０〜８０℃で１〜６０時間または２０〜８０℃で１〜５０時間実施する。本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ａ）以後、実施する乾燥は、１０℃〜３０℃未満で１２〜６０、１８〜５２、２４〜４８、１８〜３０、４２〜５４時間；４０〜６０℃で１〜８時間、２〜８、２〜６、２．５〜６、２〜３、４〜８、４〜６、５〜７または３〜５時間；または６０〜９０℃または６０〜８０℃で１〜５、１〜３、１．５〜５、１．５〜３、１．５〜２．５、２〜４、２〜３または１〜２時間実施する。

本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ｂ）以後、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを乾燥する段階を実施する。本発明の他の具現例によれば、本発明の段階（ｂ）以後、実施する乾燥は、１５〜９０℃で１０分〜６０時間、２０〜９０℃で１０分〜１０時間、３０〜８０℃で１０分〜５時間、４０〜８０℃で１０分〜３時間または４０〜８０℃で２０分〜２時間実施する。本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ｂ）以後、実施する乾燥は、１０〜３０℃で３６〜６０または４２〜５４時間；４０〜６０℃で０．５〜７時間、５〜７、０．５〜２または０．５〜１．５時間；または６０〜９０℃または６０〜８０℃で０．２〜４、２〜４、０．２〜１、０．２〜０．６時間実施する。前記段階（ｂ）以後、乾燥過程は、マイクロ構造体の機械的強度を高め、基底部の扁平度を高めるのに役に立つ。

本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ａ）以前、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを乾燥する段階を実施する。本発明の他の具現例によれば、本発明の段階（ａ）以前、実施する乾燥は、１５〜９０℃で１０分〜６０時間、２０〜９０℃で１〜３０時間、２０〜８０℃で１〜２５時間または２０〜８０℃で１．５〜２２時間実施する。本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ａ）以前、実施する乾燥は、１５〜９０℃で１０分〜６０時間、１５〜３０℃で１０〜３０時間、４０〜６０℃で２〜６時間または６０〜８０℃で１〜３時間実施する。前記段階（ａ）以前、実施する架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの乾燥によって架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの体積が３／１００〜１／１０に減少する。

本発明の他の具現例によれば、本発明の段階（ａ）以後、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの乾燥は、大気圧以下の圧力で実施する。本発明の段階（ａ）以後の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの乾燥を１気圧（７６０ｍｍＨｇ）以下で実施する場合、乾燥時間を平均４０％短縮させて、本発明のマイクロ構造体に有用成分（例えば、薬物または美容成分）を搭載させる場合、前記有用成分の安定性を高めうる。本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ａ）以後、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの乾燥は、１００〜７５０ｍｍＨｇの圧力で実施する。本発明のさらに他の具現例によれば、本発明の段階（ａ）以後、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの乾燥は、１００〜７５０、２００〜７５０、３００〜７５０、４００〜７５０、５００〜７５０、６００〜７５０、１００〜７００、２００〜７００、３００〜７００、４００〜７００、５００〜７００または６００〜７００ｍｍＨｇで実施する。本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ａ）以後、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの乾燥は、大気圧以下の圧力で５分以上、５〜１８０分、５〜１２０分、５〜６０分、５〜３０分、５〜２０分、１０〜１８０分、１０〜１２０分、１０〜６０分、１０〜３０分、１０〜２０分、１３〜１８０分、１３〜１２０分、１３〜６０分、１３〜３０分、１３〜２０分または１３〜１７分実施する。

本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ａ）以前、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを均質化する段階を実施する。本明細書の用語“均質化”は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを均一な粒子状に作ることを意味する。本発明で均質化を実施する場合、狭い粒子分布と低い突出圧力とを有するハイドロゲルが得られ、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルがマイクロ構造体モールドの穴サイズを超えないように調節することができる。

本発明の一具現例によれば、本発明の方法は、段階（ａ）以前、ヒアルロン酸に塩基を添加する段階（ｉ）及び前記段階（ｉ）の結果物に架橋剤を添加して架橋反応を起こす段階（ｉｉ）を含む架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを製造する段階（ｐｒｅ−ａ）を追加的に実施する。

本発明の他の具現例によれば、本発明のヒアルロン酸は、平均分子量が１００〜５０００ｋＤａである。本発明の一具現例によれば、本発明のヒアルロン酸は、平均分子量が１００〜４５００、１５０〜４５００、２００〜４２００ｋＤａ、２２０〜４２００、２２０〜１５００、３００〜１５００、３５０〜１５００、２２０〜５５０、２４０〜４９０、３０００〜３５００、１０００〜１８００、１２００〜１５００、３００〜４００ｋＤａである。

本発明の他の具現例によれば、本発明の段階（ｉ）の結果物は、濃度が５〜５０％（ｗ／ｖ）である。本発明の一具現例によれば、本発明の段階（ｉ）の結果物は、濃度が５〜４０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１３、８〜４０、８〜３５、８〜３０、８〜２５、８〜２０、８〜１５、８〜１３、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１３〜４０、１３〜３５、１３〜３０、１３〜２５、１３〜２０、１３〜１５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、１８〜４０、１８〜３５、１８〜３０、１８〜２５、１８〜２０、２８〜４０、２８〜３５、２８〜３２、２８〜３０％（ｗ／ｖ）である。

本発明の他の具現例によれば、本発明の段階（ｉ）の結果物は、ｐＨが１１〜１３または１２〜１３である。

本発明の他の具現例によれば、本発明の架橋剤は、エーテル架橋剤である。本発明の一具現例によれば、前記架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルである。本発明の特定の具現例によれば、前記架橋剤は、ヒアルロン酸の繰り返し単位０．５〜５０ｍｏｌ％の濃度で添加する。前記架橋剤の濃度を調節することによって、前記ヒアルロン酸の架橋率を調節することができる。

本発明の他の具現例によれば、本発明の架橋反応は、２０〜５０℃で１０〜３６時間実施する。本発明の一具現例によれば、本発明の架橋反応は、２０〜３０℃で１２〜３６時間、２０〜３０℃で１８〜３０時間または２０〜３０℃で２１〜２７時間実施する。本発明の一具現例によれば、本発明の架橋反応は、２５〜３５℃で１０〜３０時間、２５〜３５℃で１５〜２５時間または２５〜３５℃で１８〜２２時間実施する。

架橋反応を実施した後、製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを精製水、生理食塩水または塩化ナトリウム溶液（ＮａＣｌ）で洗浄して、残留ＢＤＤＥ及びＮａＯＨを除去し、膨潤過程を同時に進行できる。エタノール水溶液（例えば、８０％エタノール水溶液）を添加する場合、ハイドロゲル粒子が沈殿で生成され、この過程で未反応物質が容易に除去される。

本発明の他の具現例によれば、本発明のマイクロ構造体は、非架橋ヒアルロン酸をさらに含む。本発明の一具現例によれば、前記さらに含まれる非架橋ヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの重量１００を基準に５〜２０００重量部である。本発明の一具現例によれば、前記さらに含まれる非架橋ヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの重量１００を基準に１０〜１０００、７〜１５００、９〜１１００、２０〜５００、５０〜２００、５〜２０、５〜１５または８〜１２重量部である。

本発明の他の具現例によれば、本発明の塩基は、当業者で使用する通常の塩基（例えば、ＮａＯＨ）を含み、これに制限されるものではない。本発明の一具現例によれば、前記塩基は、ＮａＯＨ水溶液である。本発明の特定の具現例によれば、前記塩基は、０．２５Ｎ〜５Ｎ ＮａＯＨ水溶液である。

本発明のマイクロ構造体の製造方法は、前述したマイクロ構造体を共通にするために、前記マイクロ構造体との関係で共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されるものではないということは、当業者にとって自明である。

実施例１：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの製造
実施例１−１：１０％ヒアルロン酸（平均分子量３６０ｋＤａ）利用
実施例１−１−１
平均分子量３６０ｋＤａ（分子量範囲２４０〜４９０ｋＤａ）のヒアルロン酸（Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｆｒｅｄａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，中国）を１０％（ｗ／ｖ）の濃度でアルカリ水（０．２５Ｎ ＮａＯＨ）に完全に溶かした後、ヒドロキシ基との反応で架橋を果たすために、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を添加した。ＢＤＤＥは、ＨＡの繰り返し単位の１０ｍｏｌ％で添加した。架橋反応が完全に進行するために、２５℃で２４時間または３０℃で２０時間反応させた。ヒアルロン酸溶液のｐＨは、約１２であった。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを精製水または生理食塩水で洗浄して、残留ＢＤＤＥ及びＮａＯＨを除去した。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、Ｈ^１−ＮＭＲ分析法（核磁気共鳴分光器）で測定し、架橋度は、１９．７５％であった。

実施例１−１−２
ＢＤＤＥをＨＡ繰り返し単位の１２ｍｏｌ％で添加したことを除いては、実施例１−１−１と同じ方法で架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを製造した。該製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、２５．５％であった。

実施例１−１−３
ＢＤＤＥをＨＡ繰り返し単位の１５ｍｏｌ％で添加したことを除いては、実施例１−１−１と同じ方法で架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを製造した。該製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、２０．５％であった。

実施例１−１−４
ＢＤＤＥをＨＡ繰り返し単位の３０ｍｏｌ％で添加したことを除いては、実施例１−１−１と同じ方法で架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを製造した。該製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、３０．５％であった。

実施例１−１−５
ＢＤＤＥをＨＡ繰り返し単位の４０ｍｏｌ％で添加したことを除いては、実施例１−１−１と同じ方法で架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを製造した。該製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、３１．７５％であった。

実施例１−２：１５％ヒアルロン酸（平均分子量３６０ｋＤａ）利用
実施例１−２−１
平均分子量３６０ｋＤａ（分子量範囲２４０〜４９０ｋＤａ）のヒアルロン酸を１５％（ｗ／ｖ）の濃度でアルカリ水（０．２５Ｎ ＮａＯＨ）に完全に溶かした後、ヒドロキシ基との反応で架橋を果たすために、ＢＤＤＥを添加した。ＢＤＤＥは、ＨＡの繰り返し単位の５ｍｏｌ％で添加した。架橋反応が完全に進行するために、２５℃で２４時間または３０℃で２０時間反応させた。ヒアルロン酸溶液のｐＨは、約１２であった。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを精製水または生理食塩水で洗浄して、残留ＢＤＤＥ及びＮａＯＨを除去した。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、９．２５％であった。

実施例１−２−２
ＢＤＤＥをＨＡ繰り返し単位の７．５ｍｏｌ％で添加したことを除いては、実施例１−２−１と同じ方法で架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを製造した。該製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、１９．７５％であった。

実施例１−３：２０％ヒアルロン酸（平均分子量３６０ｋＤａ）利用
平均分子量３６０ｋＤａ（分子量範囲２４０〜４９０ｋＤａ）のヒアルロン酸を２０％（ｗ／ｖ）の濃度でアルカリ水（０．２５Ｎ ＮａＯＨ）に完全に溶かした後、ヒドロキシ基との反応で架橋を果たすために、ＢＤＤＥを添加した。ＢＤＤＥは、ＨＡの繰り返し単位の３ｍｏｌ％で添加した。架橋反応が完全に進行するために、２５℃で２４時間または３０℃で２０時間反応させた。ヒアルロン酸溶液のｐＨは、約１２であった。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを精製水または生理食塩水で洗浄して、残留ＢＤＤＥ及びＮａＯＨを除去した。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、６．２５％であった。

実施例１−４：３０％ヒアルロン酸（平均分子量３６０ｋＤａ）利用
平均分子量３６０ｋＤａ（分子量範囲２４０〜４９０ｋＤａ）のヒアルロン酸を３０％（ｗ／ｖ）の濃度になるように、アルカリ水（０．２５Ｎ ＮａＯＨ）に添加した後、ヒドロキシ基との反応で架橋を果たすために、ＢＤＤＥをさらに添加し、よく混合した。ＢＤＤＥは、ＨＡの繰り返し単位の１ｍｏｌ％で添加した。架橋反応が完全に進行するために、２５℃で２４時間または３０℃で２０時間反応させた。ヒアルロン酸溶液のｐＨは、約１２であった。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを精製水または生理食塩水で洗浄して、残留ＢＤＤＥ及びＮａＯＨを除去した。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、２．２５％であった。

実施例１−５：１０％ヒアルロン酸（平均分子量１，４００ｋＤａ）利用
実施例１−５−１
平均分子量１，４００ｋＤａ（分子量範囲１０００〜１８００ｋＤａ、Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｆｒｅｄａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，中国）のヒアルロン酸を１０％（ｗ／ｖ）の濃度でアルカリ水（０．２５Ｎ ＮａＯＨ）に完全に溶かした後、ヒドロキシ基との反応で架橋を果たすために、ＢＤＤＥを添加した。ＢＤＤＥは、ＨＡの繰り返し単位の１２ｍｏｌ％で添加した。架橋反応が完全に進行するために、２５℃で２４時間または３０℃で２０時間反応させた。ヒアルロン酸溶液のｐＨは、約１２であった。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを精製水または生理食塩水で洗浄して、残留ＢＤＤＥ及びＮａＯＨを除去した。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、２１．２５％であった。

実施例１−５−２
ＢＤＤＥをＨＡ繰り返し単位の２０ｍｏｌ％で添加したことを除いては、実施例１−５−１と同じ方法で架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを製造した。該製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、２６．７５％であった。

実施例１−６：２０％ヒアルロン酸（平均分子量３，２００ｋＤａ）利用
平均分子量３，２００ｋＤａ（分子量範囲２４００〜４０００ｋＤａ、ＣＰＮ，チェコ）のヒアルロン酸を２０％の濃度でアルカリ水（０．２５Ｎ ＮａＯＨ）に完全に溶かした後、ヒドロキシ基との反応で架橋を果たすために、ＢＤＤＥを添加した。ＢＤＤＥは、ＨＡの繰り返し単位の５ｍｏｌ％で添加した。架橋反応が完全に進行するために、２５℃で２４時間または３０℃で２０時間反応させた。ヒアルロン酸溶液のｐＨは、約１２であった。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを精製水または生理食塩水で洗浄して、残留ＢＤＤＥ及びＮａＯＨを除去した。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、７．７５％であった。

実施例１−７：３０％ヒアルロン酸（平均分子量３，２００ｋＤａ）利用
平均分子量３，２００ｋＤａ（分子量範囲２４００〜４０００ｋＤａ）のヒアルロン酸を３０％の濃度でアルカリ水（０．２５Ｎ ＮａＯＨ）に完全に溶かした後、ヒドロキシ基との反応で架橋を果たすために、ＢＤＤＥを添加した。ＢＤＤＥは、ＨＡの繰り返し単位の１ｍｏｌ％で添加した。架橋反応が完全に進行するために、２５℃で２４時間または３０℃で２０時間反応させた。ヒアルロン酸溶液のｐＨは、約１２であった。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを精製水または生理食塩水で洗浄して、残留ＢＤＤＥ及びＮａＯＨを除去した。製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋度は、２．２５％であった。

実施例２：本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体の製造
ＰＤＭＳマイクロモールドの製造
シリコンウェーハにＭＥＭＳ製作技法を用いて正マスタモールド（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｓｔｅｒ ｍｏｌｄ）を製造した後、前記正マスタモールドから硬化性シリコン（ＰＤＭＳ、ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｚａｎｅ）を用いて負モールド（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｌｄ）を製造した。

実施例２−１
ＰＤＭＳマイクロモールドに、前記実施例１の方法で製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを供給した後、常温（２５℃）で４８時間、５０℃で６時間または７０℃で３時間乾燥し、前記モールドに形成された穴に注入させた後、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルマイクロ構造体を製造した。

実施例２−２
ＰＤＭＳマイクロモールドに、前記実施例１の方法で製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを供給した後、減圧条件（６５０ｍｍＨｇ、１５分）で前記モールドに形成された穴に注入した。常温（２５℃）で４８時間、５０℃で６時間または７０℃で３時間乾燥し、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルマイクロ構造体を製造した。

実施例２−３
ＰＤＭＳマイクロモールドに、前記実施例１の方法で製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルを供給した後、９００ｇで１５分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて前記モールドに形成された穴に注入した。常温で４８時間、５０℃で６時間または７０℃で３時間乾燥させた後、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルマイクロ構造体を製造した。

実施例２−４
前記実施例１の方法で製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲル１００ｍｌを３ｍｌまたは１０ｍｌになるように、常温で２０時間、５０℃で４時間または７０℃で２時間乾燥させ、ＰＤＭＳマイクロモールドに供給した後、９００ｇで６０分間遠心分離を用いて前記モールドに形成された穴に注入した後、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルマイクロ構造体を製造した。

実施例２−５
ＰＤＭＳマイクロモールドに、前記実施例１の方法で製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルをホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｐｒｉｍｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，日本）を用いて８，０００ｒｐｍで１０分間均質化して供給した後、常温で２４時間、５０℃で５時間または７０℃で２．５時間中間乾燥させ、９００ｇで２０分間遠心分離を用いて前記モールドに形成された穴に均一に注入した後、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルマイクロ構造体を製造した。前記中間乾燥過程は、マイクロ構造体の機械的強度を高め、基底部の扁平度を高めるのに役に立つ。

実施例２−６
ＰＤＭＳマイクロモールドに、前記実施例１の方法で製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルをホモジナイザーを用いて８，０００ｒｐｍで１０分間均質化して供給した後、３７℃で１２時間、５０℃で４時間または７０℃で２．５時間中間乾燥させ、９００ｇで２０分間遠心分離を用いて前記モールドに形成された穴に均一に注入した後５０℃で１時間または７０℃で３０分間追加乾燥を進行した後、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルマイクロ構造体を製造した。前記追加乾燥過程は、残っている水分をさらに除去することによって、マイクロ構造体の機械的強度を高める効果がある。

実施例２−７
マイクロモールドに、前記実施例１の方法で製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルをホモジナイザーを用いて８，０００ｒｐｍで１０分間均質化して供給した後、３７℃で７時間、５０℃で２．５時間または７０℃で１．５時間減圧（６８４ｍｍＨｇ）条件で中間乾燥させ、９００ｇで２０分間遠心分離を用いて前記モールドに形成された穴に均一に注入した後、５０℃で１時間または７０℃で３０分間追加乾燥を進行した後、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルマイクロ構造体を製造した。前記減圧乾燥過程は、誘導体原料のモールド内注入を円滑にし、中間乾燥時間を短縮して（平均４０％）、マイクロ構造体に薬物搭載時に、安定性を高めうるという長所がある。

比較例１：未変形（非架橋）ヒアルロン酸のみを用いたマイクロ構造体の製造
ＰＤＭＳマイクロモールドに非架橋ヒアルロン酸３０％（ｗ／ｖ）を供給し、９００ｇで１５分間遠心分離を用いて前記モールドに形成された穴に注入した。以後、常温（２５℃）で３０分間乾燥し、モールドを除去して、マイクロ構造体を製造した。

実施例３：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び未変形（非架橋）ヒアルロン酸を用いたマイクロ構造体の製造
実施例３−１
実施例１の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをホモジナイザーを用いて８，０００ｒｐｍで１０分間均質化した後、非架橋ヒアルロン酸を架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル：非架橋ヒアルロン酸重量比が１：１、１：５、１：１０または５：１になるように混合し、真空ポンプ（７５０ｍｍＨｇ）を用いた脱泡過程を通じて気泡を完全に除去した後、マイクロモールドに供給した。減圧条件（６５０ｍｍＨｇ、１５分）で前記モールドに形成された穴に注入した後、常温（２５℃）で４８時間、５０℃で６時間または７０℃で３時間乾燥し、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び非架橋ヒアルロン酸を用いたマイクロ構造体を製造した。

実施例３−２
実施例１の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをホモジナイザーを用いて８，０００ｒｐｍで１０分間均質化した後、非架橋ヒアルロン酸を架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル：非架橋ヒアルロン酸重量比が１：１、１：５、１：１０または５：１になるように混合し、減圧条件（２５０ｍｍＨｇ、これによって気泡除去される）でマイクロモールドに供給した後、真空ポンプ（７５０ｍｍＨｇ、１５分）を用いた追加脱泡過程を通じて気泡を完全に除去した。３７℃で１２時間、５０℃で４時間または７０℃で２．５時間中間乾燥させ、９００ｇで２０分間遠心分離を用いてモールドに形成された穴に均一に注入した後、５０℃で１時間ないし７０℃で３０分間追加乾燥を進行した後、モールドを除去して、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び非架橋ヒアルロン酸を用いたマイクロ構造体を製造した。

実施例４：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの粘弾性の確認試験
架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの場合、架橋方法及び架橋剤添加量によって多様な粘弾性を示し、過度に高い粘度（２，５００，０００ｃｐ以上）や弾性係数（１Ｈｚで測定された弾性係数値が１００ｋＰａ以上）を有する場合、所望の形状と硬度とのマイクロ構造体の製造が不可能である。

本実施例は、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの粘弾性別のマイクロ構造体の製造条件を確認するために行われた。特に、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの粘弾性によってマイクロ構造体の製造時に、乾燥時間と遠心分離条件とを異ならせ、１Ｈｚで測定された弾性係数値が１００Ｐａよりも高いか、ゲルの平均粒子サイズが２００μｍ以上であり、不均質な場合、モールドに供給する前、ハイドロゲル粒子の均質化過程が必要である。

本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの製造方法による粘弾性を確認するために、実施例１−１ないし１−５の製造物に対して複合粘度（｜ｎ＊｜，Ｐａ．ｓ）、弾性係数（Ｇ’，Ｐａ）及び粘性係数（Ｇ”，Ｐａ）を測定した。

ＡＲ２０００ＥＸ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（Ｔ．Ａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，米国）装備と４〜ｃｍ、２°−コーンアンドプレート（ｃｏｎｅ ａｎｄ ｐｌａｔｅ）幾何学とを用いて１％ストレイン（ｓｔｒａｉｎ）及び振動モード（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で０．０２〜１Ｈｚまで測定し、０．０２Ｈｚで測定された複合粘度値、１Ｈｚで測定された弾性係数及び粘性係数値を下記表１に示した。装備の偏差は、±１０％であり、実験は、２５℃で進行した。

前記表１から見るように、ヒアルロン酸分子量と架橋剤組成比率とによって製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの複合粘度と弾性係数とが影響を受けるということが分かる。

初期ヒアルロン酸反応濃度が１０％（ｗ／ｖ）である場合、架橋剤添加量が増加するにつれて製造された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの複合粘度と弾性係数とが増加することが確認された。一方、初期ヒアルロン酸反応濃度が高くなれば、架橋剤添加量が低い場合にも、相対的に高い複合粘度と弾性係数とを示すことが分かる。

また、実施例２−４の方法で実施例１−１ないし１−５の製造物をモールドに供給前、乾燥した後、濃度を変更しながら、マイクロ構造体の製造が可能な範囲内で最大に含まれる架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの含量を測定し、それを表１に示した。架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルのみでマイクロ構造体の製造時に、前記最大含量範囲を超える場合、弾性（または、復元力）が強くて、モールドに注入が難しいことを確認した。具体的に、実施例１−１−２の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの固形分含量を１５％にして、実施例２−４で製造した場合のマイクロ構造体は、均質ではない状態で乾燥され、モールドに注入される量が構造体別に変わって、長さが均質ではないマイクロ構造体が製造されることを確認した（図４）。

実施例５：均質化された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの粘度範囲の測定
実施例１で製造した架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの粘度範囲を確認するために、実施例１−１ないし１−５の製造物を粉砕機（ホモジナイザーまたはプランジャーミル）を用いて均質化した後、粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＤＶ−Ｉ ｐｒｉｍｅ）を用いて粘度を測定した。

気泡が発生しないように注意しながら、均質化された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルをビーカーに入れ、全体試料の温度が均一になるように、常温で２〜３時間放置した。以後、平らな床にビーカーを固定させ、ＬＶ６２〜６４スピンドル（ｓｐｉｎｄｌｅ）を用いてトルク（ｔｏｒｑｕｅ）値が１０〜１００％の範囲内に入るように、ｒｐｍを調節した後、測定開始３分後、安定化された粘度値を読み出して、均質化された架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの粘度を測定した。粘度範囲は、下記表２に示した。

実施例１−１−１の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを粘度範囲２，５００，０００ｃｐ状態で実施例２−４で製造した場合、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルがモールドに全体として均質に注入されず、内部が空いているか、中間部分が切られたマイクロ構造体が製造されることを確認した（図５）。

実施例６：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの生体外分解確認（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ａｓｓａｙ）
本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの製造方法による生体外分解抑制効果を確認するために、実施例１−１ないし１−７の製造物に対してヒアルロン酸分解酵素による分解実験を実施した。

Ｒｅｉｓｓｉｇら（Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ ｓｕｇａｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５５，２１７：９５９−９６６）の方法を変形して、ヒアルロン酸分解酵素による生体外分解実験を実施した。実施例１−１ないし１−７までの架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを各試験管に同じ質量で入れた。ヒアルロン酸分解酵素（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｔｅｓｔｅｓ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）５００Ｕ／ｍＬを含んだ０．２Ｍ ＰＢＳ（＝ｐＨ７．４）を添加した。この混合物を３７℃で６時間及び４８時間反応させた。酵素反応を止め、酵素反応によって分解されたＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）を中間体であるグリコオキサゾリン（ｇｌｕｃｏｘａｚｏｌｉｎｅ）に切り替えるために、０．８Ｍホウ酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｂｏｒａｔｅ、ｐＨ９．１）を添加した後、１００℃で５分間加熱した。分解されて出たＮ−アセチルグルコサミンの量を測定するために、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ、ｐ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）発色試薬を前記試験管に添加後、３７℃で３０分間反応させた。次いで、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分）して上澄み液を取って、分解されて出た架橋物のうち、ＮＡＧの量をＵＶで吸光度５８５ｎｍで測定した。非架橋ヒアルロン酸の分解率を１００％と定め、実施例１−１ないし１−７の製造物のヒアルロン酸分解酵素による相対的分解抑制効果を下記表３に示した。

前記表３から分かるように、実施例１−１ないし１−７の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、生体内に存在するヒアルロン酸分解酵素に対する抑制効果を示すので、非架橋ヒアルロン酸に比べて、長い皮膚内持続時間を示すので、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いたマイクロ構造体は、生体内持続期間が長くて、高い皮膚美容改善効果を示し、有用成分を生体内に安定して伝達できるという利点がある。

実施例７：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いて製造したマイクロ構造体の生体外酵素分解速度（半減期、ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の確認
本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いて製造したマイクロ構造体の製造方法による生体外酵素分解速度の差を確認するために、実施例１−１ないし１−７の製造物を用いて実施例２−２の方法でマイクロ構造体を作った後、一定のサイズに切ってヒアルロン酸分解酵素による分解実験を実施し、それぞれのマイクロ構造体が５０％が分解される時間を比較した。

前記一定のサイズに切ったマイクロ構造体を各試験管に入れ、ヒアルロン酸分解酵素（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｔｅｓｔｅｓ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）［１６ｕｎｉｔｓ／ｍＬを含んだ０．２Ｍ ＰＢＳ（＝ｐＨ７．４）］を添加した。この混合物を３７℃でそれぞれ２４時間、４０時間、４８時間、７２時間、１２０時間、２１６時間及び３６０時間反応させた。各反応時間に合わせて酵素反応を止め、酵素反応によって分解されたＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）を中間体であるグリコオキサゾリンに切り替えるために、０．８Ｍホウ酸カリウム（ｐＨ９．１）を添加した後、１００℃で５分間加熱した。分解されて出たＮ−アセチルグルコサミンの量を測定するために、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ）発色試薬を前記試験管に添加後、３７℃で３０分間反応させた後、ＮＡＧの量をＵＶで吸光度５８５ｎｍで測定した。非架橋ヒアルロン酸の分解率を１００％と定め、誘導体別に各時間の分解率を求めて、分解率が５０％になる時点の時間（半減期）を求めた。非架橋ヒアルロン酸の分解率を１００％と定め、実施例１−１ないし１−７の製造物を用いて製造したマイクロ構造体のヒアルロン酸分解酵素による相対的５０％の分解速度を下記表４に示した。

実施例８：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いて製造したマイクロ構造体の膨潤度の実験
架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、乾燥後、再び水を加えれば、高い膨潤度を示し、マイクロ構造体の製造時に、このような膨潤性の範囲を制限することによって、マイクロ構造体の生体内吸収時間と薬物伝達速度とを調節することができる。

特に、生体内吸水性と膨潤度とに優れた原料を用いた皮膚挿入用マイクロ構造体を使用する場合、高い美容効果を示すことができる。

実施例１の７０℃乾燥機で６時間以上完全に乾燥された架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び実施例２−１、２−４ないし２−７及び３−２の方法で乾燥されたマイクロ構造体を一定のサイズに切って水中に沈殿させた後、平衡に完全に至るように、２４時間常温で保管した。膨潤された架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び構造体を取り出して、表面の水を除去した後、重量を測定した後、乾燥機に入れて水分を完全に除去した後、乾燥された架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及びマイクロ構造体の重量を測定して、次の式で構造体の膨潤度を計算した。
Ｗｓ：膨潤されたマイクロ構造体の重量、Ｗｄ：乾燥されたマイクロ構造体の重量

前記表５から見るように、本発明の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及びマイクロ構造体は、約２０倍〜４００倍の膨潤度を示し、均質化過程を経た場合、約７００倍までも膨潤度が増加することが分かる。また、マイクロ構造体の製造時に、非架橋ヒアルロン酸を一定比率で混合することによって、膨潤度範囲に対する調節が可能であることが分かる。

実施例９：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び未変形（非架橋）ヒアルロン酸を用いて製造したマイクロ構造体の長期（７日間）膨潤度の保持実験
実施例１の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを均質化した後、非架橋ヒアルロン酸を架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル：非架橋ヒアルロン酸重量比が１：１０になるように混合し、実施例３−１の方法でマイクロ構造体を製造して、１〜７日間膨潤度の保持程度を比較した。

膨潤度の実験のために、前記実施例の方法で製作されたマイクロ構造体を１０〜２０ｍｇ／ｃｍ^２のサイズに準備した。フラスコに綿ガーゼまたは不織布ワイパーを平らに置き、生理食塩水（ＰＢＳ）または０．００３％メチレンブルー（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ）が含まれた生理食塩水を加えて十分に濡らした。マイクロ構造体サンプルを０．０１ｇの同一重量になるように切った後、濡らした状態の綿ガーゼまたは不織布ワイパーに載せ、綿ガーゼまたは不織布ワイパーが渇かないようにフラスコに蓋を覆った後、３７℃インキュベーターに保管した。１日、２日、３日、６日、そして、７日目になる時間に膨潤されたマイクロ構造体の重量を測定して、膨潤度の変化を観察した。

実施例８の計算式を用いて膨潤度を計算し、それを下記表６に示した。

前記表６から分かるように、非架橋ヒアルロン酸のみで製造されたマイクロ構造体は、生理食塩水による膨潤度が全く表われないが、一方、実施例１の方法で製造されたヒアルロン酸ハイドロゲルと非架橋ヒアルロン酸とを混合した後、実施例３−１の方法で製造されたマイクロ構造体の場合、高い膨潤度を示し、その膨潤度が７日間大きな変化なしに保持されることが分かる。

前記マイクロ構造体の形態を観察した結果、非架橋ヒアルロン酸のみで製造されたマイクロ構造体は、生理食塩水による膨潤度が全く表われず、いずれも溶解されて特定の形態を表わさないが、一方、実施例１の方法で製造されたヒアルロン酸ハイドロゲルと非架橋ヒアルロン酸とを混合した後、実施例３−１の方法で製造されたマイクロ構造体の場合、ハイドロゲルの形態で高い膨潤度を示し、その膨潤度が７日間大きな変化なしに保持されることが分かる（図６）。

実施例１０：架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルで製造されたマイクロ構造体の皮膚透過（マイクロ構造体の機械的強度）の確認実験
前記実施例１−１−３及び１−４の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを用いて、それぞれ実施例２−４及び２−５で製造されたマイクロニードルの機械的強度の変化を見るために、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルが添加されたマイクロ構造体を豚皮膚に刺した後、トリパンブルーで染色して、皮膚に成功的に穴を形成したか否かを確認した。その結果、マイクロニードルは、成功的に豚皮膚に穴を形成した（図７ａ及び図７ｂ）。したがって、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルが添加されたマイクロ構造体は、皮膚を透過することができる十分な機械的強度を示すので、皮膚で活性成分を効率的に伝達することができるということが分かる。

比較例２：実施例２−３の方法を用いてマイクロ構造体の製造時に、遠心力を十分に加えない場合
実施例１−１−４の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを遠心力が十分でない状態（５００ｇで５分間遠心分離）で実施例２−３の方法で製造した場合、遠心力が十分に加えられず、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルがモールド端部まで伝達されず、端部が鋭くなく、全体として不均質なマイクロ構造体が製造されることを確認した（図８）。

比較例３：実施例３−１の方法を用いてマイクロ構造体の製造時に、減圧注入が十分ではない場合
実施例１−１−５の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び非架橋ヒアルロン酸混合物（１：１０）を用いて実施例３−１の方法でマイクロ構造体の製造時に、減圧状態を十分に持続せずに注入した場合（６５０ｍｍＨｇ、３分間減圧注入）、前記混合物がモールド端部まで伝達されず、端部が鋭くなく、全体として長さが一定ではないマイクロ構造体が製造されることを確認した（図９）。

比較例４：実施例３−２の方法を用いてマイクロ構造体の製造時に、追加乾燥過程が十分ではない場合
実施例１−１−２の架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲル及び非架橋ヒアルロン酸混合物（１：１０）を用いて実施例３−２の方法でマイクロ構造体の製造時に、追加乾燥過程を十分に進行していない場合（５０℃で５分間追加乾燥）、前記混合物が完全に乾燥されず、端部が曲がったマイクロ構造体が製造されることを確認した（図１０）。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物とによって定義される。

Claims (35)

1. 架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを含むマイクロ構造体。
2. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１〜５０％の架橋度を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
3. 前記マイクロ構造体は、半減期が２０時間〜８５０時間であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
4. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１５％（ｗ／ｖ）以下で含まれることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
5. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、エーテル架橋剤によって架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
6. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルによって架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
7. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、周波数０．０２Ｈｚで３〜５０００Ｐａ．ｓの複合粘度を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
8. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、周波数１Ｈｚで１〜１０００Ｐａの弾性係数を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
9. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、周波数１Ｈｚで０．５〜５００Ｐａの粘性係数を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
10. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、１００〜１００００００ｃｐの粘度を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
11. 前記マイクロ構造体は、２０００〜８００００％の膨潤度を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
12. 前記マイクロ構造体は、非架橋ヒアルロン酸をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
13. 前記非架橋ヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの１００重量部を基準に５〜２０００重量部であることを特徴とする請求項１２に記載のマイクロ構造体。
14. 前記マイクロ構造体は、有用成分をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ構造体。
15. 次の段階を含むマイクロ構造体の製造方法：
    （ａ）架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドに供給する段階と、
    （ｂ）前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルをマイクロモールドの穴に注入する段階と、
    （ｃ）前記マイクロモールドと架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルとを分離してマイクロ構造体を形成させる段階。
16. 前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルは、架橋度が１〜５０％であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. 前記注入は、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルに外向力を加えて実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
18. 前記外向力は、遠心力であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 前記注入は、大気圧以下の圧力で実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
20. 前記大気圧以下の圧力は、１００〜７５０ｍｍＨｇであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 前記段階（ａ）以後、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを乾燥する段階を実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
22. 前記段階（ｂ）以後、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを乾燥する段階を実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
23. 前記段階（ａ）以前、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを乾燥する段階を実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
24. 前記乾燥は、１５〜９０℃で１０分〜６０時間実施することを特徴とする請求項２１ないし請求項２３のうち何れか一項に記載の方法。
25. 前記乾燥は、大気圧以下の圧力で実施することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
26. 前記段階（ａ）以前、前記架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを均質化する段階を実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
27. 前記方法は、段階（ａ）以前、ヒアルロン酸に塩基を添加する段階（ｉ）及び前記段階（ｉ）の結果物に架橋剤を添加して架橋反応を起こす段階（ｉｉ）を含む架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルを製造する段階（ｐｒｅ−ａ）を追加的に実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
28. 前記ヒアルロン酸は、平均分子量が１００〜５０００ｋＤａであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
29. 前記段階（ｉ）の結果物は、濃度が５〜５０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
30. 前記架橋剤は、エーテル架橋剤であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
31. 前記架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
32. 前記架橋剤は、ヒアルロン酸の繰り返し単位０．５〜５０ｍｏｌ％の濃度で添加することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
33. 前記架橋反応は、２０〜５０℃で１０〜３６時間実施することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
34. 前記マイクロ構造体は、非架橋ヒアルロン酸をさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
35. 前記非架橋ヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸ハイドロゲルの１００重量部を基準に５〜２０００重量部であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。