KR102070878B1

KR102070878B1 - 가교제 없이 전자선을 이용하여 히알루론산을 가교시키는 필러 시술용 머크겔의 제조 방법

Info

Publication number: KR102070878B1
Application number: KR1020190156327A
Authority: KR
Inventors: 장진희
Original assignee: 장진희
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-01-29

Abstract

필러 시술용 머크겔의 제조 방법이 제공된다. 상기 머크겔의 제조 방법은 10~20 w/v% 히알루론산(hyaluronic acid) 수용액에 전자선(electron-beam)을 30초 내지 5분간 0.5~5 kGy 선량이 되도록 조사하여 히알루론산을 가교시킴으로써 벌크(bulk) 하이드로겔(hydrogel)을 제조하는 단계; 및 상기 벌크 하이드로겔 내부의 기포를 제거하는 단계를 포함한다.

Description

가교제 없이 전자선을 이용하여 히알루론산을 가교시키는 필러 시술용 머크겔의 제조 방법{METHOD OF PREPARING MUK-GEL FOR FILLER PROCEDURE BY CROSS-LINKING HYALURONIC ACID USING ELECTRON-BEAM WITHOUT CROSS-LINKING AGENT}

본 발명은 히알루론산을 가교시켜 머크겔을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 가교제 없이도 전자선을 조사하는 것만으로 히알루론산을 가교시킬 수 있는 필러 시술용 머크겔의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 필러 시술용 머크겔, 이를 이용한 주사용 필러 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 복잡한 음전하성 다당류의 하나로 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어진 고분자 화합물로서, 생체내의 연결조직, 피하조직, 신경조직 또는 관절 활액에 존재한다. 히알루론산은 매우 뛰어난 생체 적합성 때문에 스트렙토코커스속 등의 미생물 발효 또는 닭 벼슬 등에서 추출되어 화장품 첨가제뿐만 아니라 관절강 주사제, 유착 방지제, 안과용 의약품 등으로 이용되고 있다. 또한, 히알루론산 겔은 조직수복생체재료 의료기기인 성형필러로도 많이 사용되고 있다.

한편 히알루론산 그 자체로는 효소와 활성산소에 의한 분해에 의해 체내에서 빠르게 배출될 수 있다는 난제가 보고됨에 따라, 체내에서의 분해 기간을 연장시키기 위해 화학적으로 가교시키려는 다양한 시도가 있었다.

즉, 히알루론산의 화학 구조적 안정성을 높여 생체 내에서의 분해 작용을 늦춰 물성 유지 기간을 길게 유지시키고자, 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether; BDDE) 등의 가교제를 첨가하여 히알루론산을 안정화시키는 기술이 개발되어 왔으며, 그 가운데 현존하는 히알루론산 가교체 및 히알루론산 유도체 가교물의 생체 내 최대 유지 기간은 약 6개월 내지 24개월인 것으로 알려져 있다.

다만 히알루론산의 생체내 체류기간을 증진시키고자 단순히 가교제량만을 증량하여 수득한 고점탄성의 히알루론산 가교체는 생체내에서 분해되거나 미반응된 잔류 가교제 성분이 독성을 유발하여 염증 반응을 야기할 수 있다는 문제점이 있다.

또한 이러한 잔류 가교제를 제거하기 위해서는 추가적인 제거 공정을 거쳐야 하는데, 이는 히알루론산 필러를 제작하는 공정에 대해 비경제성을 유발한다는 문제가 있다.

한국 공개특허공보 제10-2019-0067653호 (특허문헌 2) 한국 공개특허공보 제10-2018-0096562호

이와 같은 문제를 해결하기 위한 본 발명의 과제는 히알루론산에 전자선(electron-beam)을 조사하여 별도의 가교제 없이도 가교 반응을 일으킴으로써 독성을 갖는 가교제가 첨가되어 발생하는 문제를 미연에 방지하는 것이다.

또한 특정 조건 하에서 히알루론산을 가교시켜 고점도 및 큰 입자를 갖는 벌크(bulk) 하이드로겔(hydrogel)을 제조함으로써 주사용 필러 조성물로 사용할 수 있는 수준의 점도와 생체 내 안정성을 갖는 하이드로겔을 제공하는 것이다.

아울러 전자선의 조사와 함께 가교제를 사용하되 생체 친화적인 가교제를 사용함으로써 미반응된 잔류 가교제를 제거하기 위한 추가적인 공정이 생략할 수 있는 머크겔의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 필러 시술용 머크겔의 제조 방법은, 10~20 w/v% 히알루론산(hyaluronic acid) 수용액에 전자선(electron-beam)을 30초 내지 5분간 0.5~5 kGy 선량이 되도록 조사하여 히알루론산을 가교시킴으로써 벌크(bulk) 하이드로겔(hydrogel)을 제조하는 단계; 및 상기 벌크 하이드로겔 내부의 기포를 제거하는 단계를 포함한다.

상기 전자선의 조사는, 제1 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제1 조사 단계, 상기 제1 조사 단계에 이어서, 상기 제1 시간 보다 긴 제2 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제2 조사 단계, 및 상기 제2 조사 단계에 이어서, 상기 제2 시간 보다 짧은 제3 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제3 조사 단계를 포함할 수 있다.

또는, 상기 전자선의 조사는, 제1 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제1 조사 단계, 상기 제1 조사 단계에 이어서, 상기 제1 시간 보다 짧은 제2 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제2 조사 단계, 및 상기 제2 조사 단계에 이어서, 상기 제2 시간 보다 긴 제3 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제3 조사 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시예에서, 상기 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계와 상기 기포를 제거하는 단계 사이에, 상기 벌크 하이드로겔에 상기 하이드로겔 대비 1~20 wt%의 1~80 kDa 저분자 히알루론산 수용액을 첨가한 후 전자선을 3초 내지 20초간 1~5 kGy 선량이 되도록 조사하여 추가 가교된 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계는, 10~20 w/v% 히알루론산 및 히알루론산 대비 0.1~1 wt%의 추가 물질을 포함하는 수용액에 전자선을 30초 내지 5분간 0.5~5 kGy 선량이 되도록 조사한 후 30℃ 내지 42℃ 온도를 유지하며 8시간 내지 16시간 동안 교반하여 히알루론산을 가교시켜 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계일 수 있다.

또, 상기 추가 물질은 게니핀(Genipin) 및/또는 하기 화학식 1로 표현되는 게니핀의 유도체를 포함할 수 있다.

[화학식 1]

상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법은, 전술한 방법을 통해 제조된 머크겔을 준비하는 단계, 및 상기 벌크 하이드로겔을 1,000 rpm 내지 5,000 rpm의 속도로 1분 내지 5분간 분쇄하여 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

여기서, 상기 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계에서 제조되는 하이드로겔의 점도는 250~1,000 Pa·s일 수 있다.

또, 상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 제조하는 단계에서 제조되는 하이드로겔은 입자의 평균직경이 50㎛ 내지 700㎛이고, 점도는 15~100 Pa·s일 수 있다.

몇몇 실시예에서, 상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 제조하는 단계에서, 하이드로겔 입자의 평균 직경이 50㎛ 이하일 경우, 1~5 w/v%의 5~30 kDa 저분자 히알루론산 수용액에 50~200 kGy 선량의 전자선을 조사하여 생성한 나노 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 수득하여 상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔에 1~50 wt%로 첨가한 후 전자선을 30초 내지 5분간 10~30 kGy 선량이 되도록 조사하는 단계, 또는 상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔에 0.1~1 wt%의 생체 친화성 가교제를 첨가하고 30℃ 내지 42℃ 온도를 유지하며 1시간 내지 8시간 동안 교반하는 단계를 더 포함할 수 있다.

기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명의 실시예들에 따르면, 히알루론산에 전자선을 조사하여 별도의 가교제 없이도 가교 반응을 일으킴으로써, 독성을 갖는 가교제가 첨가되어 발생하는 문제를 미연에 방지할 수 있다.

또한, 특정 조건 하에서 히알루론산을 가교시켜 고점도를 갖는 벌크 하이드로겔을 제조한 뒤 이를 분쇄함으로써 주사용 필러 조성물로 사용할 수 있는 수준의 점도를 갖는 하이드로겔을 제공할 수 있다.

또한 후속 공정을 통한 입자 크기의 제어가 용이하여, 예를 들어 필러 시술에 사용될 수 있는 수준의 마이크로 사이즈의 입자 크기를 갖는 하이드로겔을 제공할 수 있다.

아울러, 전자선의 조사와 함께 생체 친화적인 가교제를 사용함으로써, 미반응된 잔류 가교제를 제거하기 위한 추가적인 공정이 불필요하다는 장점이 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 실시예들에 따라 제조된 히알루론산 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예들에 따라 제조된 히알루론산 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

즉, 본 발명이 제시하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 나타낸다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '머크겔(muk-gel)'은 그물 조직이 형성되어 점탄성을 갖는 상태를 의미하되, 입자화가 이루어지지 않고 겔이 놓여진 용기 또는 반응기의 형상을 갖는 벌크(bulk) 상태의 겔을 의미한다. 본 명세서에서 용어 '머크겔'은 '벌크겔'과 혼용될 수 있다.

본 명세서에서 전자선의 선량 단위는 그레이(Gy)를 사용하며, 중량 당 에너지로 표현될 수 있다. 또, 전자선의 선량률 단위는 Gy/s를 사용하며, 단위 시간 당 중량 당 에너지로 표현될 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 필러 시술용 머크겔의 제조 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다. 하기 단계들은 영문자 및 숫자의 순서대로 수행될 수 있다.

(a-1) 10~20 w/v% 히알루론산(hyaluronic acid) 수용액에 전자선(electron-beam)을 30초 내지 5분간 0.5~5 kGy 선량이 되도록 조사하여 히알루론산을 가교시킴으로써 벌크(bulk) 하이드로겔(hydrogel)을 제조하는 단계

(b) 상기 벌크 하이드로겔 내부의 기포를 제거하는 단계

몇몇 실시예에서, 본 발명에 따른 필러 시술용 머크겔의 제조 방법은 하기 단계들을 더 포함할 수 있다. 하기 단계들은 전술한 단계들과 함께 영문자 및 숫자의 순서대로 이루어질 수 있다.

(a-2) 상기 벌크 하이드로겔에 상기 하이드로겔 대비 1~20 wt%의 1~80 kDa 저분자 히알루론산 수용액을 첨가한 후 전자선을 3초 내지 20초간 1~5 kGy 선량이 되도록 조사하여 추가 가교된 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계

또한 몇몇 실시예에서, 본 발명에 따른 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법은 하기 단계들을 더 포함할 수 있다. 하기 단계들은 전술한 단계들과 함께 영문자 및 숫자의 순서대로 이루어질 수 있다.

(c-1) 상기 벌크 하이드로겔을 1,000 rpm 내지 5,000 rpm의 속도로 1분 내지 5 분간 분쇄시켜 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 제조하는 단계

(c-2) 상기 단계 (c-1)에서 하이드로겔 입자의 평균 직경이 50㎛ 이하일 경우, 1~5 w/v%의 5~30 kDa 저분자 히알루론산 수용액에 50~200 kGy 선량의 전자선을 조사하여 생성한 나노 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 수득하여 상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔에 1~50 wt%로 첨가한 후 전자선을 30초 내지 5분간 10~30 kGy 선량이 되도록 조사하는 단계, 또는 상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔에 0.1~1 wt%의 생체 친화성 가교제를 첨가하고 30℃ 내지 42℃ 온도를 유지하며 1시간 내지 8시간 동안 교반하는 단계

단계 (a-1) 및 단계 (a-2)

종래에는 히알루론산을 가교시키기 위해 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE) 등의 화합물을 가교제로서 첨가하였는데, 이러한 가교제들은 독성이 있기 때문에 미반응된 가교제가 잔류하여 피부내에 축적될 경우 염증을 일으키는 문제가 있었고, 이에 따라 미반응된 가교제를 제거하기 위해서는 별도의 제거 공정이 뒤따른다는 단점이 있었다. 그러나 본 발명의 실시예들에 따른 히알루론산의 가교 방법은 별도의 가교제 없이 전자선의 조사만으로 히알루론산을 가교시킬 수 있어, 미반응된 가교제가 잔류하여 인체에 독성을 유발하는 문제를 해결할 수 있고 이를 제거하는 별도의 공정이 필요하지 않다는 장점이 있다. 즉 본 발명에 따른 머크겔은 종래 사용되는 가교제, 또는 글리콜류의 가교 보조제 등을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.

다른 실시예에서, 머크겔은 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol), PEG) 및/또는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, PEGDE) 등의 가교제 내지는 가교 보조제를 더 포함하는 수용액이 가교되어 형성될 수도 있다.

상기 (a-1) 단계 및/또는 상기 (a-2) 단계를 통해 가교되어 제조되는 벌크 하이드로겔은 Rheometer로 측정시 1Hz에서 점도(viscosity)가 250~1,000 Pa·s인 고점도의 겔로서, 상기 (c-1) 단계에서 분쇄되어 균일한 마이크로 입자로 구성된 하이드로겔로 제조되기에 적절한 점도 및 입자 크기를 가질 수 있다.

히알루론산의 가교가 적절히 일어나지 않아 나노 사이즈의 입자가 형성될 경우 점도가 너무 낮아 필러 시술용 머크겔에 사용하기 어렵기 때문에 본 발명의 실시예들과 같이 철저하게 설계된 조건으로 가교를 진행시키는 것이 중요하다.

히알루론산의 농도가 10 w/v% 보다 낮을 경우 벌크화가 충분히 일어나지 않을 수 있고, 20 w/v% 보다 높을 경우 농도 증가에 따른 벌크 정도가 미미하여 비경제적일 수 있다. 또는 겔화가 너무 진행되어 압출 기구 등을 이용한 주입이 곤란하고 필러 시술용으로 이용할 수 없게 된다.

또, 전자선의 선량이 0.5kGy 내지 5kGy를 벗어나거나 총 조사 시간이 30초 내지 5분을 벗어날 경우 가교가 충분히 일어나지 않거나 히알루론산의 분해로 인해 입자 크기가 작아져 점도가 낮아질 수 있다. 예를 들어 전자선의 선량이 5kGy를 초과할 경우, 구체적으로 약 10kGy 이상, 또는 15kGy 이상, 또는 약 20kGy 이상일 경우 머크겔이 분해되는 현상이 발생할 수 있다. 나아가 머크겔이 국부적으로 점도가 달라지고 머크겔의 형상을 유지하지 못할 수 있다. 다른 예를 들어 조사 시간이 5분을 초과할 경우 머크겔이 분해되는 현상이 발생할 수 있다. 또 머크겔이 국부적으로 점도가 달라지고 머크겔의 형상을 유지하지 못할 수 있다. 조사 시간 동안의 선량률(Gy/s)는 일정하거나, 또는 변화될 수 있다.

상기 전자선의 선량은 히알루론산 수용액의 중량을 고려하여 선택될 수 있음을 통상의 기술자는 이해할 수 있을 것이다.

예를 들어 본 발명의 실시예들에서 사용되는 전자선의 에너지는 1 MeV 내지 100 MeV일 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 또, 상기 10~20 w/v% 히알루론산 수용액을 제조하기 위한 히알루론산은 100 kDa 이상, 바람직하게는 200 kDa 이상일 수 있다.

예시적인 실시예에서, 단계 (a-1)에서 전자선의 조사에 있어서 선량률의 변화가 수반될 수 있다.

즉, 상기 단계 (a-1)은 제1 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제1 조사 단계, 상기 제1 조사 단계에 곧바로 이어서, 상기 제1 시간 보다 긴 제2 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제2 조사 단계, 및 상기 제2 조사 단계에 곧바로 이어서, 상기 제2 시간 보다 짧은 제3 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제3 조사 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

또는 상기 단계 (a-1)는 제1 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제1 조사 단계, 상기 제1 조사 단계에 곧바로 이어서, 상기 제1 시간 보다 짧은 제2 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제2 조사 단계, 및 상기 제2 조사 단계에 곧바로 이어서, 상기 제2 시간 보다 긴 제3 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제3 조사 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

여기서 전체 조사 시간 동안 전자선의 최소 선량 및 최대 선량은 0.5kGy 내지 5kGy의 범위 내에 있을 수 있다.

다시 말해서, 전자선의 선량률은 증가와 감소를 한번 이상, 바람직하게는 두번 이상, 더 바람직하게는 세번 이상, 더욱 바람직하게는 다섯번 이상 반복하여 수행될 수 있다. 또, 전자선의 선량률이 증가하는 구간의 시간은 전자선의 선량률이 감소하는 구간의 시간 보다 더 짧거나, 적어도 같을 수 있다. 예컨대 전자선의 선량률이 증가하는 구간의 시간은 약 5초이고, 전자선의 선량률이 감소하는 구간의 시간은 약 7초일 수 있으나 본 발명이 이에 제한되지 않음은 물론이다. 비제한적인 예시로서, 선량률이 증가하는 구간에서의 총 선량과 선량률이 감소하는 구간에서의 총 선량의 차이는 실질적으로 동일하거나, 20% 내외, 또는 30% 내외, 또는 40% 내외의 차이를 가질 수 있다. 선량률이 증가하는 구간에서의 총 선량과 선량률이 감소하는 구간에서의 총 선량의 차이는 50% 이하인 것이 바람직하다. 선량의 차이가 지나치게 클 경우 가교된 하이드로겔의 물성이 불안정할 수 있다.

히알루론산 수용액의 농도 등에 영향을 받을 수 있으나, 몇몇 실험에서 일정한 선량률로 전자선을 조사할 경우 머크겔이 대략 균질한 점도를 가지고 그 형상을 유지하지 못하고, 부분적으로 또는 국부적으로 점도가 상이하며 머크겔이 온전한 형상을 유지하지 못하며 부분적으로 흘러내리는 것을 확인할 수 있었다.

반면 전자선의 선량률을 증가와 감소를 반복할 경우 이러한 문제를 현저히 개선할 수 있으며 필러 시술용 하이드로겔로 사용하기에 적합한 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

한편, 몇몇 실시예에서 상기 단계 (a-1)의 수용액은 게니핀(Genipin) 및/또는 게니핀의 유도체를 더 포함하여 수행될 수 있다.

게니핀 및 게니핀의 유도체는 히알루론산과의 반응이 용이하며 히알루론산과 가교가 가능할 수 있다. 즉, 게니핀 및 게니핀의 유도체는 가교제(생체 친화성 가교제)로 기능할 수 있으나, 게니핀 및 게니핀 유도체의 기능이 용어 '가교제'에 국한되는 것은 아니다. 게니핀은 생체 독성이 매우 낮아(LD50 i.v. 382 mg/kg in mice) 잔류 성분의 제거가 실질적으로 불필요한 반면에 제조되는 머크겔의 물성을 개선할 수 있다. 즉, 하이드로겔의 가교율을 높일 수 있다. 상기 게니핀의 유도체는 하기 화학식 1로 표현되며 에폭시기를 가질 수 있다.

[화학식 1]

게니핀 또는 게니핀 유도체는 히알루론산과의 분자 간 가교 결합을 형성할 수 있다. 반면, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니나 게니핀/게니핀 유도체 간의 가교 결합은 실질적으로 이루어지지 않을 수 있다.

게니핀 단독, 게니핀 유도체 단독, 또는 게니핀과 게니핀 유도체의 혼합의 함량 범위는 히알루론산 대비 약 0.1 wt% 내지 1.0 wt%일 수 있다. 만일 게니핀 및/또는 게니핀 유도체의 함량이 상기 범위를 초과할 경우 제조된 머크겔이 투명하지 못하고 불투명해지고, 및/또는 점도가 너무 높아져 필러 시술에 적합하지 못할 수 있다.

또, 히알루론산의 가교에 있어서 전자선의 조사 후 약 30℃ 내지 42℃ 온도를 유지하며 8시간 내지 16시간 동안 교반하며 가교가 수행될 수 있다.

한편 몇몇 실시예에서, 상기 단계 (a-1) 다음에 상기 단계 (a-2)가 수행될 수 있다. 즉, 히알루론산 수용액을 전자선을 이용해 가교하여 준비된 벌크 하이드로겔에 추가적인 히알루론산 수용액을 첨가하여 추가 가교를 수행할 수 있다.

추가적인 히알루론산 수용액은 상기 단계 (a-1)에서 사용된 히알루론산에 비해 저분자 히알루론산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 약 1kDa 내지 80kDa의 히알루론산이 이용될 수 있다.

또, 단계 (a-2)는 단계 (a-1)와 동일하거나 더 큰 선량으로 전자선이 조사될 수 있다. 예를 들어, 약 1kGy 내지 5kGy, 또는 약 2kGy 내지 5kGy, 또는 약 3kGy 내지 5kGy의 선량으로 조사될 수 있다. 비제한적인 예시로, 전자선의 선량률은 변화되지 않고 대략 일정하게 조사될 수 있다.

반면 단계 (a-2)는 단계 (a-1) 보다 더 짧은 시간 동안 수행될 수 있다. 조사 시간은 약 3초 내지 20초일 수 있으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 제조하고자 하는 하이드로겔의 물성을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다.

단계 (a-2)를 통해 더욱 고점도화 되고 탄성이 우수한 머크겔, 즉 벌크겔을 수득할 수 있다. 이를 통해 후술할 단계 (c-1)과 같이 머크겔을 분쇄할 경우 입도 크기 제어가 용이하고 시술 용이성이 향상될 수 있는 장점이 있다.

전술한 단계 (a-1) 및/또는 단계 (a-2)를 통해 제조되는 머크겔의 점도는 약 15Pa·s 내지 1,000Pa·s, 또는 약 700Pa·s 이상(Rheometer 1Hz 기준)의 고점도 겔일 수 있다.

단계 (b)

제조된 머크겔은 탈포 공정이 수행될 수 있다. 상기 탈포 공정은 하이드로겔에 대해 이루어지는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어 탈포제를 첨가하거나, 또는 물리적/기계적 방법을 통해 수행될 수 있다.

단계 (c-1) 및 단계 (c-2)

상기 (c-1) 단계는 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 수행될 수 있다. 이 경우 분쇄 속도는 1,000rpm 내지 5,000rpm일 수 있다. 만일 상기 범위를 벗어날 경우 균일한 입자상 하이드로겔을 얻을 수 없다. 이는 머크겔의 점도가 매우 높기 때문일 수 있으나 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다. 또, 분쇄 시간은 약 1분 내지 5분일 수 있다. 마찬가지로 분쇄 시간은 마이크로 사이즈의 입자의 입도 균일성에 영향을 미칠 수 있다.

전술한 것과 같이 머크겔 및 이를 분쇄하여 수득한 마이크로 사이즈의 하이드로겔을 필러 시술용으로 이용할 경우 입자의 입도 균일성이 매우 중요한 요소이다. 만일 입도가 균일하지 못할 경우 시술 후 부작용이 발생하거나, 점도 제어가 곤란하여 시술이 곤란할 수 있다.

머크겔이 분쇄되어 제조되는 하이드로겔을 구성하는 마이크로 사이즈의 입자는 평균직경이 약 50㎛ 내지 700㎛, 또는 약 100㎛ 내지 600㎛, 또는 약 150㎛ 내지 500㎛일 수 있고, 이에 따른 점도는 Rheometer로 측정시 1Hz에서 15~100 Pa·s일 수 있다. 본 발명은 입자상 하이드로겔을 상기 입도와 상기 점도 범위로 제어함으로써 필러 시술용으로 적용하기에 용이한 장점이 있다.

몇몇 실시예에서, (c-1) 상기 단계에서 제조된 하이드로겔 입자의 평균직경이 50㎛ 이하일 경우, 단계 (c-2)가 추가로 수행될 수 있다.

즉, 별도로 준비된 1~5 w/v%의 5~30 kDa 저분자 히알루론산 수용액에 50~200 kGy 선량의 전자선을 조사하여 생성한 나노 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 수득하고, 이를 (c-1) 단계에서 제조된 하이드로겔에 1~50 wt%로 첨가한 후 전자선을 30초~5분간 10~30 kGy 선량이 되도록 조사할 수 있다.

또는 상기 (c-1) 단계에서 제조된 하이드로겔에 0.1~1 wt%의 생체 친화성 가교제를 첨가하고 30℃ 내지 42℃ 온도를 유지하며 1~8 시간 동안 교반하는 단계를 수행할 수 있다. 상기 생체 친화성 가교제는 전술한 게니핀 및/또는 게니핀 유도체를 포함할 수 있다.

상기 (c-1) 단계를 통해 제조한 하이드로겔의 입자 사이즈가 작아 적절한 점도를 나타내지 못하여 필러 시술용 머크겔로서 사용하기 부적절한 경우, 상기 (c-2) 단계와 같은 공정을 추가로 진행함으로써 원하는 사이즈의 입자 및 점도를 갖는 하이드로겔을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 발명자는 머크겔의 가교도, 점도, 탄성 등과 함께, 후처리 공정 제어를 통해 필러 시술용으로 사용하기에 가장 적합한 점도와 입도를 갖는 하이드로겔을 제조할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

상술한 본 발명의 실시예들에 따라 제조된 하이드로겔은 필러 시술용 머크겔로서 사용되기 위해 공지의 첨가 공정이나 멸균 공정 등을 추가적으로 거칠 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 필러 시술용 머크겔 및/또는 하이드로겔은 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체 유체, 예컨대 등장 완충액, 특히 바람직하게는 완충된 생리학적 식염수 용액을 포함할 수 있다.

예시적인 실시예에서, 본 발명의 필러 시술용 머크겔 및/또는 하이드로겔은 상기 조성물 100 중량부 대비 히알루론산의 체내 지속성 향상용 조성물을 1중량부 내지 20중량부로 포함할 수 있다.

본 발명의 필러 시술용 머크겔 및 하이드로겔은 바람직하게는 미용적 질환을 치료하기 위해, 예컨대 피부의 주름살 또는 주름(예를 들어, 안면 주름 및 안면 주름살), 미간 주름, 비구순 주름, 턱 주름, 마리오네트 주름, 구강 교련, 입주위 주름살, 눈가 잔주름, 피부 함몰부, 흉터, 관자, 눈썹의 진피하 지지부, 광대 및 볼 지방 패드, 눈물 도랑, 코, 입술, 뺨, 입주위 영역, 안와하 영역, 안면 비대칭, 아래턱선 및 턱의 치료를 위해 투여될 수 있다. 또는, 치료적 적응증, 예컨대 복압성 요실금, 방광-요관 역류, 성대 주름 부전, 성대 주름 내측화를 치료하기 위해 투여될 수도 있다.

이하에서는 본 발명의 실시예들을 구체적인 제조예 및 실험예 등을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1-1: 머크 하이드로겔(hydrogel)의 제조 (1)

약 200 kDa의 히알루론산(hyaluronic acid)을 물에 녹여 5, 15 및 30 w/v% 수용액을 제조하고, 제조된 히알루론산 수용액에 직류형 전자선 가속기(electron-beam accelerator)를 사용하여 전자선을 1분간 하기 표 1과 같은 선량이 되도록 조사하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 벌크 하이드로겔(머크겔)을 제조하였다.

선량 / 농도	5 w/v%	15 w/v%	30 w/v%
0.1 kGy	실시예 1-1	실시예 2-1	실시예 3-1
3 kGy	실시예 1-2	실시예 2-2	실시예 3-2
10 kGy	실시예 1-3	실시예 2-3	실시예 3-3

실험예 1-1: 머크 하이드로겔의 점도(viscosity) 측정 (1)

Anton-Paar MCR 302 rheometer로 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 1 Hz에서의 점도를 측정하였으며, 결과는 하기 표 2와 같았다.

점도 (Pa·s)
실시예 1-1	0.038	실시예 2-1	0.051	실시예 3-1	0.17
실시예 1-2	196	실시예 2-2	882	실시예 3-2	1050
실시예 1-3	2	실시예 2-3	101	실시예 3-3	244

상기 표 2와 같은 점도는 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 벌크화 또는 겔화된 정도를 나타낼 수 있는데, 전자선의 선량이 3 kGy에 가까울 수록, 히알루론산의 농도가 높을수록 가교가 잘되어 점도가 높음을 알 수 있다. 이는 전자선의 선량이 3 kGy 보다 너무 낮으면 자유 라디칼의 생성이 어려워 가교가 충분히 일어나지 않고, 3 kGy 보다 너무 높으면 히알루론산 사슬이 절단되어 분해가 일어나기 때문인 것으로 추측된다. 다만 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아님은 물론이다.

한편, 실시예 2-3 및 실시예 3-3의 경우 벌크화가 상당한 정도로 이루어진 것과 별개로, 머크겔이 균일한 점도를 갖지 못하고 부분적으로 상이한 점도를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 3-3의 경우 부분적으로 불투명한 정도가 심하였다.

제조예 1-2: 벌크 하이드로겔의 제조 (2)

상기 제조예 1-1과 같은 방법으로 벌크 하이드로겔을 제조하되, 하기 표 3과 같이 전자선의 조사 시간을 달리하여 제조하였다.

조사 시간	10 w/v%	15 w/v%
3 kGy, 10 초	실시예 4-1	실시예 5-1
3 kGy, 1 분	실시예 4-2	실시예 5-2(= 실시예 2-2)
3 kGy, 10 분	실시예 4-3	실시예 5-3

실험예 1-2: 벌크 하이드로겔의 점도 측정 (2)

상기 실험예 1-1과 같은 방법으로 실시예 4-1 내지 실시예 5-3의 점도를 측정하였으며, 결과는 하기 표 4와 같았다.

점도 (Pa·s)
실시예 4-1	33	실시예 5-1	205
실시예 4-2	679	실시예 5-2(= 실시예 2-2)	882
실시예 4-3	48	실시예 5-3	186

전자선의 조사 시간이 1 분에 가까울수록 가교가 잘되어 점도가 높음을 알 수 있는데, 이는 조사 시간이 너무 짧거나 길면 가교가 충분히 일어나지 않거나 히알루론산의 분해가 일어나기 때문인 것으로 추측된다. 다만 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아님은 물론이다.

제조예 2: 마이크로 입자를 포함하는 하이드로겔의 제조

상기 실시예 중 마이크로 입자로 분쇄하기 위한 머크겔로서 가장 이상적인 점도(250~2,500 Pa·s)를 나타낸 실시예 2-2의 머크겔을 압축하여 기포를 제거하고 호모게나이저(homogenizer, Ika)를 사용하여 하기 표 5와 같은 속도 및 시간으로 분쇄시켜 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 제조하였다.

시간 / 속도	1,000 rpm	5,000 rpm
15초	실시예 7-1	실시예 8-1
2분	실시예 7-2	실시예 8-2
10분	실시예 7-3	실시예 8-3

실험예 2: 마이크로 입자화된 하이드로겔의 직경 및 점도 측정

실시예 7-1 내지 실시예 8-3의 하이드로겔의 입자 크기와 점도를 측정하였으며, 입자 크기는 DLS(Dynamic light scattering)로 확인하였다.

도 1은 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과로서, (A) 내지 (D)는 각각 실시예 7-2, 8-2, 7-1 및 8-3을 나타낸다. 실시예 8-1과 7-3은 뚜렷한 피크를 얻기 어려웠다. 하기 표 6은 점도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

점도 (Pa·s)
실시예 7-1	144	실시예 8-1	95
실시예 7-2	61	실시예 8-2	23
실시예 7-3	14	실시예 8-3	3

도 1 및 표 6에 나타난 바와 같이, 분쇄 시간이 너무 짧거나 길면 입자의 평균직경이 50㎛ 내지 700㎛를 벗어나거나 균일하지 않아 적절한 점도(15~100 Pa·s)를 갖지 않음을 알 수 있고, 호모게나이저의 속도 또한 1,000~5,000 rpm 범위를 벗어날 경우 바람직한 입자 또는 점도 특성을 갖지 못할 것으로 예상할 수 있다.

제조예 3: 선량률을 점진적으로 변화하며 하이드로겔을 제조(실시예 9-1, 9-2, 9-3, 9-4)

약 200 kDa의 히알루론산(hyaluronic acid)을 물에 녹여 15 w/v% 수용액을 제조하고, 전자선 가속기를 사용하여 전자선을 제조된 히알루론산 수용액에 하기 표 7 및 표 8과 같은 방법으로 총 1분간 조사하여 히알루론산의 가교를 유도하고 머크겔을 제조하였다.

구간	~5초	~12초	~17초	~24초	~29초	~36초	~41초	~48초	~53초	~60초
실시예 9-1(선량률, Gy/s)	30 ↓ 50	50 ↓ 30	30 ↓ 50	50 ↓ 30	30 ↓ 50	50 ↓ 30	30 ↓ 50	50 ↓ 30	30 ↓ 50	50 ↓ 30
실시예 9-2(선량률, Gy/s)	40 ↓ 30	30 ↓ 40	40 ↓ 30	30 ↓ 40	40 ↓ 30	30 ↓ 40	40 ↓ 30	30 ↓ 40	40 ↓ 30	30 ↓ 40

구간	~7초	~12초	~19초	~24초	~31초	~36초	~43초	~48초	~55초	~60초
실시예 9-3(선량률, Gy/s)	30 ↓ 50	50 ↓ 30	30 ↓ 50	50 ↓ 30	30 ↓ 50	50 ↓ 30	30 ↓ 50	50 ↓ 30	30 ↓ 50	50 ↓ 30
실시예 9-4(선량률, Gy/s)	40 ↓ 30	30 ↓ 40	40 ↓ 30	30 ↓ 40	40 ↓ 30	30 ↓ 40	40 ↓ 30	30 ↓ 40	40 ↓ 30	30 ↓ 40

실험예 3: 벌크 하이드로겔의 점도 측정 (3)

Anton-Paar MCR 302 rheometer로 실시예 9-1 내지 실시예 9-4의 1 Hz에서의 점도를 측정하였으며, 결과는 하기 표 9와 같았다.

점도 (Pa·s)
실시예 9-1	947
실시예 9-2	799
실시예 9-3	840
실시예 9-4	901

실시예 9-2 및 9-3의 경우 선량을 점진적으로 제어하지 않은 실시예 2-2와 대략 동등하거나, 미소하게 낮은 점도를 나타내어 선량 제어를 통한 점도 개선 효과가 미미한 것을 확인할 수 있다.

반면 실시예 9-1 및 9-4의 경우 선량을 점진적으로 제어, 구체적으로 선량을 증가시키는 구간을 5초, 선량을 감소시키는 구간을 7초 수행함에 따라 점도의 향상 효과가 있는 것을 확인할 수 있다.

제조예 4: 저분자 히알루론산을 첨가하여 하이드로겔을 제조(실시예 10-1, 10-2)

상기 제조예 1-1과 같은 방법으로 제조한 실시예 2-2의 하이드로겔에 약 50 kDa의 저분자 히알루론산 수용액을 상기 저분자 히알루론산이 상기 하이드로겔 대비 10 wt%가 되도록 첨가한 후, 다시 3 kGy 선량의 전자선을 10 초간 조사하여 벌크 하이드로겔을 제조하고(실시예 10-1), 상기 제조예 2와 같은 방법으로 분쇄하여(2분, 1000 rpm) 마이크로 입자화된 하이드로겔을 제조하였다(실시예 10-2).

제조예 5: 생체 친화성 가교제를 첨가하여 하이드로겔을 제조(실시예 11-1, 11-2, 11-3, 11-4)

상기 실시예 2-2와 같은 벌크 하이드로겔을 제조할 때, 히알루론산 수용액에 생체 친화성 가교제인 게니핀(Genipin; Sigma-Aldrich)과 하기 화학식 1로 표현되는 그 유도체를 각각 히알루론산 대비 0.5 wt%로 첨가하여 전자선을 조사한 후, 36℃ 온도를 유지하며 12시간 동안 교반하여 벌크 하이드로겔을 제조하고(실시예 11-1 및 실시예 11-2), 상기 제조예 2와 같은 방법으로 분쇄하여(2분, 1000 rpm) 마이크로 입자화된 하이드로겔을 제조하였다(실시예 11-3 및 실시예 11-4). 하기 화학식 1의 게니핀 유도체는 공지된 합성 방법을 이용하여 제조한 것을 이용하였다. (J. Luo, et al., ChemMedChem (2012) 1661-8)

[화학식 1]

제조예 6: 입자의 직경이 작은 하이드로겔의 재가교(실시예 12)

5 w/v%의 10 kDa 저분자 히알루론산 수용액에 100 kGy 전자선을 조사하여 나노 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 수득하고, 이를 상기 제조예 2에서 제조된 실시예 8-3(입자크기 24㎛)의 하이드로겔에 10 wt%로 첨가한 후 다시 15 kGy 선량의 전자선을 2분간 조사하여 마이크로 입자화된 하이드로겔을 제조하였다. (실시예 12)

실험예 4: 하이드로겔의 직경 및 점도 측정

실시예 10-1 내지 실시예 12의 하이드로겔의 입자 크기와 점도를 측정하였으며, 그 결과는 도 2 및 하기 표 10과 같았다.

도 2는 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과로서, (E) 내지 (G)는 각각 실시예 10-2, 11-3 및 11-4를 나타낸다.

점도 (Pa·s)
실시예 10-1	1290
실시예 11-1	1378
실시예 11-2	2213
실시예 12	476

상기 표 10에 나타난 바와 같이, 실시예 10-1, 실시예 11-1 및 실시예 11-2의 벌크 하이드로겔은 높은 점도를 나타내어 보다 벌크화되었음을 알 수 있고, 실시예 12의 하이드로겔은 마이크로화 겔 수준으로 점도가 높아졌음을 알 수 있다.

또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 10-1, 실시예 11-1 및 실시예 11-2의 고점도 겔을 분쇄하여 제조된 마이크로 겔은 입자 크기가 보다 균일함을 알 수 있다.

그 외에 히알루론산 대신에 카르복시메틸덱스트란, 사이클로덱스트린 및 글리코겐을 이용하여 실시예 2-2와 동일한 방법으로 전자선 가교를 시도하였으나, 온전히 겔화가 이루어지지 않았다.

앞서 설명한 것과 같이, 히알루론산 등의 생체 적합성 고분자에 전자선을 조사하여 나노 사이즈의 입자를 형성하는 것이 보고된 바 있다. 그러나 나노 사이즈의 입자는 필러 시술용 하이드로겔로 적용이 불가능한 한계가 있으며, 본 발명의 발명자는 머크겔 및 이를 이용하여 마이크로 사이즈의 겔을 형성하기 위한 시도를 하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 따르면 단순히 입자의 크기를 나노 사이즈에서 마이크로 사이즈로 증가시키는 것을 넘어 전자선 가교 만으로 머크겔을 형성할 수 있다. 또 머크겔이 우수한 점도 및 탄성을 가짐으로써 분쇄 등을 통해 입도 제어가 용이하며 다양한 분야에 활용이 가능한 효과가 있다.

이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다.

따라서 본 발명의 범위는 이상에서 예시된 기술 사상의 변경물, 균등물 내지는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

10~20 w/v% 히알루론산(hyaluronic acid) 수용액에 전자선(electron-beam)을 30초 내지 5분간 0.5~5 kGy 선량이 되도록 조사하여 히알루론산을 가교시킴으로써 벌크(bulk) 하이드로겔(hydrogel)을 제조하는 단계; 및
상기 벌크 하이드로겔 내부의 기포를 제거하는 단계를 포함하는 필러 시술용 머크겔의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 전자선의 조사는,
제1 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제1 조사 단계,
상기 제1 조사 단계에 이어서, 상기 제1 시간 보다 긴 제2 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제2 조사 단계, 및
상기 제2 조사 단계에 이어서, 상기 제2 시간 보다 짧은 제3 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제3 조사 단계를 포함하거나, 또는
제1 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제1 조사 단계,
상기 제1 조사 단계에 이어서, 상기 제1 시간 보다 짧은 제2 시간 동안 선량률이 점차 증가하며 조사되는 제2 조사 단계, 및
상기 제2 조사 단계에 이어서, 상기 제2 시간 보다 긴 제3 시간 동안 선량률이 점차 감소하며 조사되는 제3 조사 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 필러 시술용 머크겔의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계와 상기 기포를 제거하는 단계 사이에,
상기 벌크 하이드로겔에 상기 하이드로겔 대비 1~20 wt%의 1~80 kDa 저분자 히알루론산 수용액을 첨가한 후 전자선을 3초 내지 20초간 1~5 kGy 선량이 되도록 조사하여 추가 가교된 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 필러 시술용 머크겔의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계는,
10~20 w/v% 히알루론산 및 히알루론산 대비 0.1~1 wt%의 게니핀(Genipin) 또는 하기 화학식 1로 표현되는 게니핀의 유도체를 포함하는 수용액에 전자선을 30초 내지 5분간 0.5~5 kGy 선량이 되도록 조사한 후 30℃ 내지 42℃ 온도를 유지하며 8시간 내지 16시간 동안 교반하여 히알루론산을 가교시켜 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계인 것을 특징으로 하는 필러 시술용 머크겔의 제조 방법.
[화학식 1]

제1항의 제조방법에 따른 머크겔을 준비하는 단계; 및
상기 벌크 하이드로겔을 1,000 rpm 내지 5,000 rpm의 속도로 1분 내지 5분간 분쇄하여 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 제조하는 단계를 포함하되,
상기 벌크 하이드로겔을 제조하는 단계에서 제조되는 하이드로겔의 점도는 250~1,000 Pa·s이고, 또는
상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 제조하는 단계에서 제조되는 하이드로겔은 입자의 평균직경이 50㎛ 내지 700㎛이고, 점도는 15~100 Pa·s이고,
상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 제조하는 단계에서, 하이드로겔 입자의 평균 직경이 50㎛ 이하일 경우,
1~5 w/v%의 5~30 kDa 저분자 히알루론산 수용액에 50~200 kGy 선량의 전자선을 조사하여 생성한 나노 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔을 수득하여 상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔에 1~50 wt%로 첨가한 후 전자선을 30초 내지 5분간 10~30 kGy 선량이 되도록 조사하는 단계, 또는
상기 마이크로 사이즈의 입자를 갖는 하이드로겔에 0.1~1 wt%의 생체 친화성 가교제를 첨가하고 30℃ 내지 42℃ 온도를 유지하며 1시간 내지 8시간 동안 교반하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법.