KR100894186B1 - 내포 복합체를 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본원 발명은 중합체, 치료약물, 착화제를 함유하는 조성물을 제시한다. 중합체는 호스트-게스트(host-guest) 또는 게스트-호스트(guest-host) 상호작용으로 착화제와 상호작용하여 내포 복합체를 형성한다. 본원 발명의 조성물은 다양한 질환의 치료에서 치료 약물을 전달하는데 사용될 수 있다. 미립자 혼합물의 중합체 및 착화제는 치료 조성물에 기능기를 도입하는데 사용될 수 있다. 본원 발명은 또한, 조성물을 제조하는 방법에 관한다. 상기 방법은 치료약물, 호스트 또는 게스트 기능분자를 보유하는 중합체, 게스트 또는 호스트 기능분자를 보유하는 착화제를 결합시켜 치료 조성물을 형성하는 단계로 구성된다. 착화제와 중합체는 내포 복합체를 형성한다. 본원 발명은 또한, 치료약물을 전달하는 방법에 관한다. 상기 방법에 따라, 본원 발명에 다른 치료 조성물의 치료요법적 효과량은 치료약물을 필요로 하는 포유동물(예, 사람이나 동물)에 투여된다.

Description

내포 복합체를 함유하는 조성물{COMPOSITIONS CONTAINING INCLUSION COMPLEXES}
본원 발명은 치료약물을 전달하는데 사용되는 조성물 및 방법에 관한다. 더욱 구체적으로, 본원 발명은 중합체, 치료약물, 착화제를 함유하는 조성물에 관하는데, 여기서 상기 중합체는 호스트-게스트(host-guest) 또는 게스트-호스트(guest-host) 상호작용으로 착화제와 상호작용하여 내포 복합체를 형성한다. 본원 발명의 조성물은 다양한 질환의 치료에서 치료 약물을 전달하는데 사용될 수 있다.
사이클로덱스트린은 α-(1,4) 결합으로 자연 발생 D(+)-글루코피라노즈 단위를 보유하는 환형 폴리사카라이드이다. 가장 일반적인 사이클로덱스트린은 알파(α)-사이클로덱스트린, 베타(β)-사이클로덱스트린, 감마(γ)-사이클로덱스트린인데, 이들은 각각 6개, 7개 또는 8개의 글루코피라노즈 단위를 보유한다. 구조적으로, 사이클로덱스트린의 환형 성질은 원환체 또는 도넛-유사 형태를 취하고, 내부의 무극성이나 소수성 공동(cavity), 사이클로덱스트린 원환체의 일면에 위치하는 2차 하이드록실기, 다른 면에 위치하는 1차 하이드록실기를 보유한다. 따라서, 사이클로덱스트린은 (β)-사이클로덱스트린을 예로 하여, 다음과 같이 개략적으로 나 타낸다:
Figure 112003021806745-pct00001
2차 하이드록실기가 위치하는 부분은 1차 하이드록실기가 위치하는 부분보다 더욱 넓은 직경을 갖는다. 사이클로덱스트린 내부 공동의 소수성은 다양한 화합물의 내포를 가능하게 한다(Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J.L. Atwood et al., eds., Pergamon Press(1996); T. Cserhati, Analytical Biochemistry, 225:328-332(1995); Husain et al., Applied Spectroscopy, 46:652-658(1992); FR 665 169).
사이클로덱스트린은 사이클로덱스트린의 소수성 공동에 적합될 수 있는 다양한 약물과 내포 복합체를 형성하거나, 또는 올리고뉴클레오티드와 이들의 유도체와 같은 다른 생물학적 활성 분자와 비-공유 결합 복합체를 형성함으로써 다양한 치료 약물의 전달 수단으로 사용되고 있다. 가령, 미국 특허 4,727,064에서는 실질적으로 낮은 수용성을 갖는 약물 및 비결정질 수용성 사이클로덱스트린-기초한 혼합물로 구성되는 제약학적 제제를 기술한다. 약물은 혼합물의 사이클로덱스트린과 내포 복합체를 형성한다. 미국 특허 5,691,316에서는 올리고뉴클레오티드에 대한 사이클로덱스트린 세포 전달 시스템을 기술한다. 이런 시스템에서, 올리고뉴클레오티드는 사이클로덱스트린과 비-공유 복합체를 형성하거나, 또는 대안으로 올리고뉴클레오티드는 사이클로덱스트린과 비-공유 결합하는 아다만테인(adamantane)에 공유 결합할 수 있다.
다양한 사이클로덱스트린-보유 중합체 및 이들의 제조 방법 역시 당분야에 공지되어 있다((Comprehensive Supramolecular Chemistry, Volume 3, J.L. Atwood et al., eds., Pergamon Press(1996)). 고정된 사이클로덱스트린을 보유하는 중합체를 생산하는 공정은 미국 특허 5,608,015에서 기술한다. 이런 공정에 따라, 사이클로덱스트린 유도체는 α,β-불포화된 산이나 이의 유도체의 산 할로겐화물 단량체, 또는 말단 이소시아네이트 작용기나 이의 유도체를 포함하는 α,β-불포화된 산이나 이의 유도체와 반응시킨다. 사이클로덱스트린 유도체는 카르보닐 활로겐화물과 산 무수물과 같은 화합물과 사이클로덱스트린을 반응시켜 얻는다. 생성된 중합체는 산형 중합체 주사슬로부터 분리된 측쇄로 사이클로덱스트린 단위를 보유한다.
미국 특허 5,276,088에서는 폴리비닐 알코올이나 이의 유도체를 사이클로덱스트린 유도체와 반응시키거나, 또는 사이클로덱스트린 유도체를 비닐 아세테이트나 메틸 메타크릴레이트와 공중합(copolymerization)함으로써 사이클로덱스트린 중합체를 합성하는 방법을 기술한다. 생성된 사이클로덱스트린 중합체는 중합체의 주사슬로부터 분리된 펜던트(pendant) 성분으로 사이클로덱스트린 성분을 보유한다.
초분자 구조를 갖는 생분해성 약물 중합체 어셈블리는 WO 96/09073 A1과 미국 특허 5,855,900에서 기술한다. 상기 어셈블리는 약물을 α, β또는 γ-사이클 로덱스트린에 결합시키고, 이후 중합체의 양 말단에 결합된 생분해성 성분으로 약물/사이클로덱스트린 화합물을 선형 중합체에 따라 배열시켜 만들어진 다수의 약물-함유 환형 화합물을 함유한다. 이런 어셈블리는 질환으로 발생하는 특이적인 생분해에 반응하여 약물을 방출할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 일반적으로, 이들 어셈블리는 "목걸이형" 사이클로덱스트린 중합체라고 한다.
하지만, 당분야에서 예로써 증가된 안정성(예, 생리학적 조건하에) 및 효과적인 표적화 능력과 같은 특성을 보이는 더욱 효과적인 비-바이러스 전달 시스템의 필요성은 여전하다. 본원 발명은 이런 요구를 충족시킨다.
본원 발명의 요약
본원 발명은 중합체, 치료약물, 착화제를 함유하는 조성물을 제시한다. 중합체는 호스트-게스트(host-guest) 또는 게스트-호스트(guest-host) 상호작용으로 착화제와 상호작용하여 내포 복합체를 형성한다. 본원 발명의 조성물은 다양한 질환의 치료에서 치료 약물을 전달하는데 사용될 수 있다. 중합체와 착화제는 조성물에 기능분자(functionality)를 도입하는데 사용될 수 있다.
본원 발명은 중합체와 치료약물의 미립자 혼합물 및 중합체와 착화제의 내포 복합체를 포함하는 조성물을 제시한다. 미립자 혼합물의 중합체는 호스트 기능분자를 보유하고 게스트 착화제와 내포 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 미립자 혼합물의 적어도 한가지 중합체는 게스트 기능분자를 보유하고 호스트 착화제와 내포 복합체를 형성한다. 다른 구체예에서, 중합체 또는 착화제는 내포 복합체를 형성하는 호스트와 게스트 기능분자를 모두 보유할 수 있다. 이는 다중 착화제가 내포 복합체를 형성하여 치료 조성물과 결합할 수 있도록 한다. 이는 또한, 다중 기능분자가 본원 발명의 치료 조성물에 도입될 수 있도록 한다.
또한, 본원 발명은 치료 조성물을 제조하는 방법에 관한다. 상기 방법은 치료약물, 호스트 또는 게스트 기능분자를 보유하는 중합체, 게스트 또는 호스트 기능분자를 보유하는 착화제를 결합시켜 치료 조성물을 생성하는 단계로 구성된다. 착화제는 중합체와 내포 복합체를 형성한다.
또한, 본원 발명은 치료약물을 전달하는 방법에 관한다. 상기 방법에 따라, 본원 발명에 따른 조성물의 치료요법적 효과량은 치료약물을 필요로 하는 포유동물(예, 사람이나 동물)에 투여된다. 따라서, 본원 발명은 적절한 치료약물을 전달하는 본원 발명의 조성물을 사용한 질환의 치료법을 제시한다.
본원 발명의 다양한 구체예를 설명하는 도면에서, 화합물(12)은 βCDP6이다. 미립자 혼합물에 핵산과 양이온성 중합체를 함유하는 혼합물은 폴리플렉스(polyplex)라고 한다. 도면의 간단한 설명은 다음과 같다.
도 1 은 다양한 아다만테인-PEG 분자의 구조를 도시한다.
도 2 는 GALA와 GALA-Ad 변형된 조성물의 유체역학적 직경(실시예 30)을 도시한다.
도 3 은 GALA와 GALA-Ad 변형된 조성물의 제타 전위(실시예 32)를 도시한다.
도 4 는 BHK-21 세포에 의한 GALA와 GALA-Ad 변형된 조성물의 흡수(실시예 31)를 도시한다.
도 5 는 HUH-7 세포에 의한 GALA와 GALA-Ad 변형된 조성물의 흡수(실시예 33)를 도시한다.
도 6 은 GALA와 GALA-Ad로 변형된 β-사이클로덱스트린-DMS 공중합체 12-기초한 조성물로 BHK-21 세포의 루시페라제 트랜스펙션(실시예 34)을 도시한다.
도 7 은 BHK-21 세포에 대한 GALA와 GALA-Ad 변형된 폴리플렉스의 독성(실시예 35)을 도시한다.
도 8 은 결합(grafting)에 의한 DNA-복합화이후 페길화(pegylation) 계획(실시예 39)을 도시한다.
도 9 는 DNA-복합체형성이후 PEI 및 12(βCDP6) 폴리플렉스의 입자 크기(실시예 39)를 도시한다.
도 10 은 페길화에 의한 폴리플렉스 조성물의 안정화(실시예 40)를 도시한다.
도 11 은 PEG3400-FITC로 12 폴리플렉스의 동시-전달(실시예 42)을 도시한다.
도 12 는 락토오스-12의 구조(실시예 37)를 도시한다.
도 13 은 12와 LAC-CDP6 폴리플렉스의 HUH-7 세포로의 트랜스펙션(실시예 43)을 도시한다.
도 14 는 실험 프로토콜의 개요(실시예 47)를 도시한다.
도 15 는 입자 직경(실시예 47)을 도시한다.
도 16 은 복합체 침전에 의한 DNA 손실(실시예 47)을 도시한다.
도 17 은 12/DNA 혼합물을 변화시키는 내포 복합체(실시예 48)를 도시한다.
도 18 은 변형된 폴리플렉스의 HepG2 세포로의 트랜스펙션(실시예 49)을 도시한다.
도 19 는 경쟁적 치환 실험(실시예 52)을 도시한다.
도 20 은 아다만테인-PEG-트랜스페린(Ad-PEG-Tf)의 합성(실시예 55)을 도시한다.
도 21 은 트랜스페린에 대한 이온 적하(loading)(실시예 55)를 도시한다.
도 22 는 결합 친화성 트랜스페린-PEG-Ad(실시예 55)를 도시한다.
도 23 은 리신 작용기를 통한 트랜스페린 결합(실시예 56)을 도시한다.
도 24 는 PC3 세포에서 트랜스페린 수용체에 대한 트랜스페린-PEG-AD의 결합 친화성(실시예 57)을 도시한다.
도 25 는 트랜스페린과 PEG-변형된 폴리플렉스에서 입자 변형의 함수로 제타 전위 변화 및 입자 크기(실시예 58)를 도시한다.
도 26 은 제타 전위 측정, Ad-음이온성-PEG(실시예 62)를 도시한다.
도 27 은 안정성 측정(실시예 62)을 도시한다.
도 28 은 증가하는 트랜스페린 착화제의 첨가(실시예 62)를 도시한다.
도 29 는 히스트딜화된 12의 합성을 도시한다.
도 30 은 엔도솜 이탈을 위한 pH-감수성 중합체(2차 아민-포함 중합체의 합성)를 도시한다.
본원 발명은 치료약물을 전달하기 위하여 내포 복합체를 사용하는 조성물에 관한다. 내포 복합체는 부가물의 특징적인 구조를 갖는 분자 화합물인데, 여기서 화합물중 한가지(호스트 분자)는 다른 화합물의 적어도 일부를 공간적으로 둘러싼다. 둘러싸인 화합물(게스트 분자)은 호스트의 골격 구조에 영향을 주지 않으면서 호스트 분자의 공동에 위치한다. 이용가능한 공동의 크기와 형태가 약간의 변형과 상관없이 실질적으로 변화지 않는 점은 내포 복합체의 특징이다. "호스트"는 당분야에 공지된 임의의 호스트 화합물 또는 분자일 수 있다. 적합한 호스트의 예에는 사이클로덱스트린, 카르세란드(carcerand), 카비탄드(cavitand), 크라운 에테르(crown ethers), 크립탄드(cryptand), 쿠쿠르비투릴(cucurbituril), 칼릭사렌(calixarenes), 스페란드(spherands) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 착화제에 적합한 내포 게스트는 당분야에 공지된 것으로, 예로써 아다만테인, 디아다만테인(diadamantane), 나프탈렌, 콜레스테롤 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
사이클로덱스트린은 다양한 이온과 분자 종류와 상호작용할 수 있는 적합한 호스트이고, 생성된 내포 화합물은 "호스트-게스트" 복합체 군에 속한다. 호스트-게스트 상관관계의 실현을 위해서는 여러 필요조건이 충족되어야 한다; 이들중 한가지는 호스트와 게스트 분자의 결합 부위가 입체전자적 측면에서 상보적이어야 한다는 점이다. 사이클로덱스트린은 공동의 치수에 적합한 크기를 갖는 화합물과 내포 복합체를 형성할 수 있다. 하지만, 복합체 형성의 정도는 게스트 분자의 극성에 좌우된다. 이에 덧붙여, 공동보다 현저하게 큰 분자와의 복합체 형성은 특정 작용기 또는 측쇄가 탄수화물 채널에 침투하는 방식으로 가능하다(J. Szejtli, Akademial Kiado, Cyclodextrins and their inclusion complexes, Budaoest, 1982).
본원 발명의 조성물은 중합체와 치료약물의 미립자 혼합물의 형태로, 적어도 한가지 중합체 및 적어도 한가지 치료약물을 함유한다. 또한, 치료 조성물은 한가지이상 착화제를 함유한다. 미립자 혼합물의 적어도 한가지 중합체는 호스트-게스트 또는 게스트-호스트 상호작용으로 착화제와 상호작용하여 중합체와 착화제간 내포 복합체를 형성한다. 중합체와 착화제는 본원 발명의 조성물에 기능분자를 도입하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 미립자 혼합물의 적어도 한가지 중합체는 호스트 기능분자를 보유하고 게스트 기능분자를 보유하는 착화제와 내포 복합체를 형성한다. 다른 구체예에서, 미립자 혼합물의 적어도 한가지 중합체는 게스트 기능분자를 보유하고 호스트 기능분자를 보유하는 착화제와 내포 복합체를 형성한다. 또 다른 구체예에서, 미립자 혼합물의 중합체는 호스트와 게스트 기능분자를 모두 보유하고 게스트 착화제 및 호스트 착화제와 내포 복합체를 형성한다.
1. 미립자 혼합물
치료약물와 중합체의 미립자 혼합물은 치료약물과 중합체의 조합 또는 통합이다. 미립자 혼합물은 다중-차원적 중합체 네트워크내에 한가지이상의 치료약물을 함유하는 연결 구조이다. 단일 중합체 또는 중합체 혼합물이 사용될 수 있다. 혼합물중 적어도 한가지 중합체는 미립자 혼합물의 다중-차원적 중합체 네트워크를 형성할 수 있을 뿐만 아니라 후술한 바와 같이 한가지이상 착화제와 내포 복합체를 형성할 수 있는 호스트 및/또는 게스트 기능분자를 보유한다.
A. 중합체
치료약물과 미립자 혼합물을 형성할 수 있고 호스트 및/또는 게스트 기능분자를 보유하는 임의 유형의 중합체가 본원 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 중합체는 선형 또는 분지된 중합체이다. 중합체는 동종중합체 또는 공중합체일 수 있다. 사용되는 공중합체는 임의의 공중합체 또는 분지된 공중합체일 수 있다. 중합체는 바람직하게는 물에 분산가능하고, 더욱 바람직하게는 수용성이다. 가령, 적합한 중합체에는 폴리사카라이드, 폴리에스테르, 폴리아마이드, 폴리에테르, 폴리카르보네이트, 폴리아크릴레이트 등이 포함된다. 치료용도의 중합체는 낮은 독성 프로필을 보이고, 바람직하게는 독성 또는 세포독성을 보이지 않는다. 후술한 바와 같이, 본원 발명에 사용하기 적합한 중합체는 사이클로덱스트린-기초한 중합체이다. 후술된 수용성 선형 사이클로덱스트린 공중합체는 바람직하게는 3,000 내지 100,000, 더욱 바람직하게는 3,000 내지 50,000의 분자량을 갖는다.
본원 발명에 따라, 미립자 혼합물에서 중합체는 단일 중합체, 또는 동일하거나 상이한 2가지이상 중합체의 혼합물일 수 있다. 미립자 혼합물의 각 중합체는 가교결합기를 추가로 보유하거나 또는 이를 보유하도록 추가로 변형되는데, 이런 가교결합기를 통하여 미립자 혼합물 형성하는 중합체의 결합이 달성될 수 있다.
미립자 혼합물의 적어도 한가지 중합체는 내포 복합체를 형성할 수 있는 중합체이다. "내포 복합체를 형성할 수 있는 중합체"는 비-공유결합(예, 반 데르 발스 힘(van der Waals forces), 수소 결합, 쌍극자간(dipole-dipole) 상호작용, 이온-결합, 소수성 상호작용 등)을 통하여 다른 화합물(착화제) 또는 화합물상의 치환체와 하나이상의 호스트-게스트 결합을 달성할 수 있는 임의의 중합체일 수 있다. 다시 말하면, 적어도 한가지 중합체는 호스트 또는 게스트 기능분자를 보유하고 착화제 또는 착화제상의 치환체와 내포 복합체를 형성한다. 호스트 또는 게스트 기능분자는 중합체 골격의 일부이거나, 또는 치환체로 혹은 매달리거나 분지된 사슬에 존재할 수 있다. 중합체 골격에 호스트 기능분자를 보유하는 중합체의 예는 후술된 선형 사이클로덱스트린 중합체이다. 중합체 골격의 일부가 아닌 게스트 기능분자를 보유하는 중합체의 예는 펜던트 아다만테인 작용기를 보유하는 중합체이다. 중합체로 사용하는데 적합한 "호스트"의 다른 예는 카르세론드(carcerond), 카비탄드(cavitand), 크라운 에테르, 크립탄드(cryptand), 쿠쿠르비투릴(cucurbituril), 칼릭사렌(calixarene), 스페란드(spherand) 등이다. 이런 호스트에 적합한 내포 게스트는 당업자에게 공지된 것으로, 예로써 아다만테인, 디아다만테인(diadamantane), 나프탈렌(naphthalene), 콜레스테롤 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
적절한 구체예에서, 중합체는 상이한 유형의 호스트 또는 게스트 기능분자를 보유하거나, 또는 중합체는 호스트와 게스트 기능분자를 모두 보유할 수 있다. 이는 일정한 중합체에서 형성되는 별개의 내포 복합체에 대한 더욱 많은 융통성을 가능하게 한다. 다중 호스트, 다중 게스트, 또는 동일한 중합체에서 호스트와 게스트 기능분자 모두를 보유하는 것은 내포 복합체를 통하여 본원 발명의 치료 조성물에 도입되는 기능분자의 다양성을 증가시킨다.
호스트-게스트 결합의 결과로, 중합체는 착화제와 상호작용하여 내포 복합체를 형성한다. 적절하게는, 비-공유 상호작용이나 결합의 결과로 생성된 내포 복합체는 대략 >102, 바람직하게는 >103, 더욱 바람직하게는 >104의 결합 상수를 보인다. 전형적으로, 결합 상수는 102-106이다.
미립자 혼합물의 중합체는 한가지이상의 리간드로 변형시킬 수 있다. 리간드는 치료약물 및/또는 미립자 혼합물의 중합체의 리간드 변형을 통하여 미립자 혼합물의 형성이후에 도입될 수 있다. 리간드는 원하는 세포에 표적화 및/또는 결합을 가능하게 하는 임의의 리간드일 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 세포에 표적화와 결합은 세포 수용체 부착을 포함하는데, 이런 현상은 수용체 매개된 세포내이입을 유도할 수 있다. 2가지이상의 리간드가 부착되면, 이들 리간드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 적합한 리간드의 예에는 비타민(예, 엽산), 단백질(예, 트랜스페린과 단클론 항체), 모노사카라이드(예, 갈락토오스), 펩티드, 폴리사카라이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 리간드의 선택은 원하는 전달 유형에 좌우된다. 달리, 리간드는 막 침투가능 작용제, 예를 들면, HIV-1의 TAT 단백질일 수 있다. TAT 단백질은 세포핵으로 활발하게 유입되는 바이러스 전사 활성물질이다(Torchilin, V.P. et al, PNAS. 98, 8786-8791, (2001)).
본원 발명의 적절한 구체예에서, 미립자 혼합물의 중합체중 적어도 한가지는 내포 복합체를 형성할 수 있는 호스트 및/또는 게스트 기능분자를 보유하는 실질적으로 선형의 중합체이다. 실질적으로 선형의 중합체는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 만들 수 있다. 중합체는 내포 복합체를 형성할 수 있는 적합한 단량체, 또는 단량체중 적어도 한가지가 호스트 또는 게스트 기능분자를 보유하는 단량체 혼합물로부터 만들 수 있다. 호스트 또는 게스트 기능분자는 중합체 사슬내에, 중합체 사슬에 매달린(또는 분지된) 형태로, 또는 말단기로 존재할 수 있다. 대안으로, 중합체가 형성된 이후에, 전술한 바와 같이 호스트 및/또는 게스트 기능분자를 보유하도록 변형함으로써 내포 복합체를 형성할 수 있는 실질적으로 선형의 중합체를 만들 수 있다. 실질적으로 선형의 중합체는 블록 공중합체일 수 있는데, 여기서 상기 블록은 호스트 기능분자, 물-분산성 및/또는 수용성과 같은 특성을 도입한다. 이런 블록의 예에는 선형 폴리에틸렌이민(PEI), 선형 사이클로덱스트린-보유 중합체, 비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민(AEPD), N2,N2,N3,N3-(3'-PEG5000아미노프로판)-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디암모늄-디-트리플루오르아세테이트(AEPD-PEG)가 포함된다.
다른 적절한 구체예에서, 미립자 혼합물을 형성하는데 사용되는 중합체는 사이클로덱스트린-보유 중합체, 더욱 바람직하게는 후술된 실질적으로 선형의 사이클로덱스트린 중합체이다. 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 펜던트 사이클로덱스트린을 보유하는 중합체일 수도 있다. 선형 사이클로덱스트린 공중합체는 중합체 골격의 절대 필요 부분으로 사이클로덱스트린 성분을 보유하는 중합체이다. 주요 중합체 사슬의 일부가 아니고 중합체 골격으로부터 분리된 형태로 부착되는 사이클로덱스트린 성분을 보유하는 중합체 역시 본원 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 선형 사이클로덱스트린-보유 중합체는 중합체 골격의 일부로서 적어도 한가지 사이클로덱스트린 성분을 보유하는 임의의 선형 중합체일 수 있다. 적절하게는, 사이클로덱스트린-보유 중합체는 수용성이다. 더욱 적절하게는, 선형 사이클로덱스트린-보유 중합체는 후술된 선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체이다. 중합체내에서 사이클로덱스트린 작용기는 중합체가 내포 복합체를 형성할 수 있도록 하는 호스트 기능분자를 제공한다. 내포 복합체를 형성할 수 있는 실질적으로 선형의 중합체는 다른 기능기(예, 티올기)를 추가로 보유하거나, 또는 이를 보유하도록 추가로 변형될 수 있다.
선형 사이클로덱스트린-보유 중합체
미립자 혼합물을 형성하는데 사용될 수 있는 선형 사이클로덱스트린 공중합체는 선형 공중합체 골격에서 사이클로덱스트린의 하나이상 글루코피라노즈 고리의 2, 3 또는 6번 위치를 통하여, 선형 사이클로덱스트린 중합체의 사이클로덱스트린을 연결하는 이가(divalent) 성분에 이중기능기로 결합하는 치환되거나 또는 치환되지 않은 사이클로덱스트린 성분을 보유한다. WO 00/01734에서 밝힌 바와 같이, 이런 선형 사이클로덱스트린 공중합체는 화학식 Ia, Ib 또는 이들 조합의 반복 단위를 보유한다. 선형 사이클로덱스트린 공중합체, 이들의 제조 및 특성 역시 Gonzalez, H., hwang, S. and Davis, M.(1999) New class of polymers for the delivery of macromolecular therapeutics. Bioconjugate Chem, 10, 1068-1074 and Hwang, S., Bellocq, N. and Davis, M.(2001) Effects of structure of Beta-Cyclodextrin-Containing Polymers on Gene Delivery. Bioconjugate Chem, 12(2), 280-290에서 기술한다.
Figure 112003021806745-pct00002
Figure 112003021806745-pct00003
화학식 Ia와 Ib에서, C는 치환되거나 또는 치환되지 않은 사이클로덱스트린 단량체이고, A는 사이클로덱스트린 C에 공유 결합된 공단량체(comonomer)이다. 사이클로덱스트린 단량체 C 전구물질과 공단량체 A 전구물질의 중합화는 선형 사이클로덱스트린 공중합체를 결과한다. 단일 선형 사이클로덱스트린 공중합체내에서, 사이클로덱스트린 단량체 C 단위는 동일하거나 또는 상이하고 공단량체 A 역시 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 당분야에 공지된 임의의 사이클로덱스트린 또는 이의 유도체일 수 있다. 전술한 바와 같이, 사이클로덱스트린은 α-(1,4) 결합으로 6 내지 8개의 자연 발생 D(+)-글루코피라노즈 단위를 보유하는 환 형 폴리사카라이드이다. 적절하게는, 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 각각 6개, 7개 또는 8개의 글루코오스 단위를 보유하는 사이클로덱스트린, 다시 말하면 알파(α)-사이클로덱스트린, 베타(β)-사이클로덱스트린, 감마(γ)-사이클로덱스트린이다. 사이클로덱스트린 유도체는 당분야에 공지된 임의의 치환된 사이클로덱스트린일 수 있는데, 여기서 치환체는 후술한 바와 같이 공단량체 A 전구물질과의 공중합화를 간섭하지 않는다. 사이클로덱스트린 유도체는 중성, 양이온성 또는 음이온성일 수 있다. 적합한 치환체의 예에는 하이드록시프로필, 하이드록시에틸과 같은 하이드록시알킬기; 디하이드록시프로필 에테르, 메틸-하이드록시에틸 에테르, 에틸-하이드록시에틸 에테르, 에틸-하이드록시프로필 에테르와 같은 에테르기; 메틸과 같은 알킬기; 글루코실과 말토실과 같은 사카라이드; 카르복실산, 아인산, 포스핀산(phosphinous acid), 포스폰산(phosphonic acid), 인산, 티오포스폰산, 술폰산과 같은 산 작용기; 이미다졸기; 황산염기; 보호된 티올기가 포함된다.
사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 화학적으로 추가로 변형하여 후술한 바와 같이 사이클로덱스트린 단량체 전구물질과 공단량체 A 전구물질의 공중합화를 촉진할 수 있다. 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 화학적 변형은 각 사이클로덱스트린 성분의 2개 위치에서만 중합화, 즉 이중기능성 사이클로덱스트린 성분의 형성을 가능하게 한다. 각 글루코피라노즈의 C1-C6 위치에 대한 번호지정은 다음과 같다:
Figure 112003021806745-pct00004
적절한 구체예에서, 중합화는 사이클로덱스트린 성분의 C2, C3, C6 또는 이들의 조합에서 진행된다. 가령, 한 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 2개의 C6 위치에서 중합화되고, 다른 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 사이클로덱스트린 성분의 C2와 C6 위치에서 중합화될 수 있다. 사이클로덱스트린에서 각 글루코피라노즈 고리의 상대적 위치에 대한 문자지정은 다음과 같다(β-사이클로덱스트린의 경우):
Figure 112003021806745-pct00005
선형 사이클로덱스트린 공중합체의 적절한 구체예에서, 사이클로덱스트린 단량체 C는 화학식 Ⅱ를 갖는다:
Figure 112008501690159-pct00104
화학식 Ⅱ에서, n과 m은 정수로, 다른 2개의 글루코피라노즈 고리와 함께 사이클로덱스트린 단량체에서 글루코피라노즈 단위의 전체 수량을 정의한다. 화학식 Ⅱ는 사이클로덱스트린 단위의 2개의 C6 위치에서 중합화될 수 있는 사이클로덱스트린 단량체를 나타낸다. 화학식 Ⅱ의 사이클로덱스트린 단량체의 예에는 6A,6B-디데옥시-α-사이클로덱스트린(n=0,m=4), 6A,6c-디데옥시-α-사이클로덱스트린(n=1,m=3), 6A,6D-디데옥시-α-사이클로덱스트린(n=2,m=2), 6A,6B-디데옥시-β-사이클로덱스트린(n=0,m=5), 6A,6c-디데옥시-β-사이클로덱스트린(n=1,m=4), 6A,6D-디데옥시-β-사이클로덱스트린(n=2,m=3), 6A,6B-디데옥시-γ-사이클로덱스트린(n=0,m=6), 6A,6c-디데옥시-γ-사이클로덱스트린(n=1,m=5), 6A,6D-디데옥시-γ-사이클로덱스트린(n=2,m=4), 6A,6E-디데옥시-γ-사이클로덱스트린(n=3,m=3)이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다.
다른 적절한 구체예에서, 선형 사이클로덱스트린 공중합체는 글루코오스-고리-개방된 사이클로덱스트린 단량체 C 단위를 보유할 수 있는데, 여기서 사이클로덱스트린의 하나이상 글루코피라노즈 고리는 사이클로덱스트린 고리 시스템을 유지하면서 개방된다. 하기 화학식 Ⅲ은 C2, C3 위치에서 고리 개방을 갖는 글루코피라노즈-고리-개방된 사이클로덱스트린을 나타낸다:
Figure 112003021806745-pct00007
화학식 Ⅲ에서 p는 5 내지 7이다. 화학식 Ⅲ에서, 사이클로덱스트린 단량체의 적어도 하나의 D(+)-글루코피라노즈 단위는 사이클로덱스트린 단위의 C2와 C3 위치에서 중합화가 이루어질 수 있도록 고리 개방이 진행된다. 화학식 Ⅲ의 사이클로덱스트린 단량체, 예를 들면, 2A,3A-디아미노-2A,3A-디데옥시-β-사이클로덱스트린과 2A,3A-디알데하이드-2A,3A-디데옥시-β-사이클로덱스트린은 Carbomer (Westborough, MA)로부터 상업적으로 입수가능하다. 화학식 Ⅲ의 사이클로덱스트린 단량체의 예에는 2A,3A-디데옥시-2A,3A-디하이드로-α-사이클로덱스트린, 2A,3A-디데옥시-2A,3A-디하이드로-β-사이클로덱스트린, 2A,3A-디데옥시-2A,3A-디하이드로-γ-사이클로덱스트린(각각, 2,3-디데옥시-α-사이클로덱스트린, 2,3-디데옥시-β-사이클로덱스트린, 2,3-디데옥시-γ-사이클로덱스트린)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
공단량체 A 전구물질은 임의의 직쇄 또는 분지된 대칭이나 비대칭 화합물로, 전술한 바와 같이 사이클로덱스트린 단량체 전구물질과의 반응직후 2개의 사이클로덱스트린 단량체를 서로 연결시킨다. 적절하게는, 공단량체 A 전구물질은 반응 및 이에 따른 사이클로덱스트린 단량체의 결합을 달성하는 적어도 2개의 가교결합기를 보유하는 화합물이다. 각 공단량체 A 전구물질의 동일하거나 상이하고 말단이나 내부에 위치하는 가능한 가교결합기의 예에는 아미노, 산, 에스테르, 이미다졸 및 아실 할로겐화물 작용기와 이의 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적절한 구체예에서, 2개의 가교결합기는 동일하고 말단에 위치한다. 공단량체 A 전구물질과 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 공중합화 직후에, 2개의 사이클로덱스트린 단량체는 한 사이클로덱스트린 단량체의 일차 하이드록실 부분과 다른 사이 클로덱스트린 단량체의 일차 하이드록실 부분을 결합시키거나, 한 사이클로덱스트린 단량체의 이차 하이드록실 부분과 다른 사이클로덱스트린 단량체의 이차 하이드록실 부분을 결합시키거나, 또는 한 사이클로덱스트린 단량체의 일차 하이드록실 부분과 다른 사이클로덱스트린 단량체의 이차 하이드록실 부분을 결합시킴으로써 서로 연결할 수 있다. 따라서, 이런 결합의 조합이 최종 공중합체에 존재할 수 있다.
공단량체 A 전구물질과 최종 공중합체의 공단량체 A 모두 중성, 양이온성(예, 4차 암모늄기와 같은 양성자를 받은 작용기를 보유) 또는 음이온성(예, 황산염, 인산염 또는 탄수화물 음이온성 작용기와 같은 양성자를 잃은 작용기를 보유)일 수 있다. 하전된 공단량체 A 전구물질 또는 공단량체 A의 상대이온은 임의의 적합한 상대이온 또는 상대양이온일 수 있다(예를 들면, 양이온성 공단량체 A 전구물질 또는 공단량체 A의 상대이온은 할로겐화물(예, 염화물) 음이온일 수 있다). 공중합체에서 공단량체 A의 전하는 pH 조건을 조절하여 조정할 수 있다.
적합한 공단량체 A 전구물질의 예에는 시스타민, 1,6-디아미노헥산, 디이미다졸, 디티오이미다졸, 스페르민, 디티오스페르민, 디히스티딘, 디티오히스티딘, 숙시니미드(예, 디티오비스(숙시니미딜 프로피오네이트)(DSP)와 디숙시니미딜 수베레이트(DSS)), 이미데이트(예, 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온-이미데이트(DTBP))가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
공단량체 A 전구물질과 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 공중합화는 다음과 같은 화학식의 공단량체 A 결합(linkage)을 보유하는 선형 사이클로덱스트린 공중합체의 형성을 유도한다:
Figure 112003021806745-pct00008
Figure 112003021806745-pct00009
Figure 112003021806745-pct00010
Figure 112003021806745-pct00011
상기 화학식에서, x=1-50, y+z=x이다. 바람직하게는, x=1-30이다. 더욱 바람직하게는 x=1-20이다. 적절한 구체예에서, 공단량체 A는 이황화결합과 같은 생분해성 결합을 보유한다. 또한, 공단량체 A는 산-불안정성 기능기(예, 에스테르) 및 당업자에게 공지된 다른 산-불안정성 작용기를 포함한다.
다른 적절한 구체예에서, 공단량체 A 전구물질과 공단량체 A는 원하는 목적을 달성하기 위하여 선별적으로 선택할 수 있다. 가령, 소형 분자 치료약물을 전달하기 위하여 하전된 중합체가 반드시 필요한 것은 아니며, 공단량체 A가 수용성 을 더욱 강화시키는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 친수성 작용기이거나 또는 이를 보유할 수 있다. DNA 또는 단백질과 같은 폴리펩티드 치료약물의 경우에, 공단량체 A는 폴리펩티드 치료약물과 미립자 혼합물을 형성하는 선형 사이클로덱스트린 공중합체의 능력을 향상시키는 양이온성 전하를 보유한다. 이에 덧붙여, 선형 사이클로덱스트린 공중합체는 공단량체 A 작용기의 혼합물을 보유할 수도 있다.
선형 사이클로덱스트린 공중합체는 적합한 이탈기(leaving group)가 분포된 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 상기 이탈기를 치환할 수 있는 공단량체 A 전구물질로 공중합시켜 만들 수 있다. 동일하거나 또는 상이한 이탈기는 당분야에 공지된 임의의 이탈기일 수 있는데, 이는 공단량체 A 전구물질과의 공중합화 직후에 치환될 수 있다.
선형 사이클로덱스트린 공중합체는 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 요오드화시켜 이중요오드화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 형성하고 공단량체 A전구물질로 이중요오드화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 공중합시켜 전술한 화학식 Ia, Ib, 또는 이들 조합의 반복 단위를 갖는 선형 사이클로덱스트린 공중합체를 형성한다.
선형 사이클로덱스트린을 제조하는 다른 방법은 전술한 바와 같이 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 요오드화시켜 화학식 IVa, IVb, IVc 또는 이들의 혼합물의 이중요오드화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 형성하는 것이다:
Figure 112003021806745-pct00012
Figure 112003021806745-pct00013
Figure 112003021806745-pct00014
이중요오드화된 사이클로덱스트린은 당분야에 공지된 방법으로 만들 수 있다(Tabusfi et al. J. Am. Chem. 106, 5267-5270(1984); Tabushi et al. J. Am. Chem. 106, 4580-4584(1984)). 가령, β-사이클로덱스트린은 무수성 피리미딘의 존재하에 비페닐-4,4'-디설포닐 클로라이드와 반응시켜 비페닐-4,4'-디설포닐 클로라이드 덧붙여진 β-사이클로덱스트린을 형성하고, 이는 요오드화칼륨과 반응시켜 이중요오드-β-사이클로덱스트린을 생산할 수 있다. 사이클로덱스트린 단량체 전 구물질은 2개의 위치에서만 요오드화된다. 전술한 바와 같이 이중요오드화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 공단량체 A 전구물질로 공중합함으로써, 전술한 화학식 Ia, Ib 또는 이들 조합의 반복 단위를 갖는 선형 사이클로덱스트린 중합체를 생산할 수 있다. 적절한 경우에, 요오드 또는 요오드기는 다른 공지된 이탈기로 치환할 수 있다.
요오드기 또는 다른 적합한 이탈기는 전술한 바와 같이 공단량체 A 전구물질과의 반응을 허용하는 작용기로 치환될 수 있다. 가령, 화학식 Ⅳa, Ⅳb, Ⅳc 또는 이들의 혼합물의 이중요오드화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 아미노화시켜 Ⅴa, Ⅴb, Ⅴc 또는 이들의 혼합물의 이중아미노화 사이클로덱스트린을 형성할 수 있다:
Figure 112003021806745-pct00015
Figure 112003021806745-pct00016
Figure 112003021806745-pct00017
이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 당분야에 공지된 임의의 수단으로 만들 수 있다(Tabusfi et al. J. Am. Chem. 106, 5267-5270(1984); Tabushi et al. J. Am. Chem. 106, 4580-4584(1984)). 가령, 이중요오드-β-사이클로덱스트린은 소디움 아자이드와 반응시키고, 이후 환원시켜 이중아미노-β-사이클로덱스트린을 형성할 수 있다. 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 2개의 위치에서만 아미노화된다. 전술한 바와 같이 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 공단량체 A 전구물질로 공중합함으로써, 전술한 화학식 Ia, Ib 또는 이들 조합의 반복 단위를 갖는 선형 사이클로덱스트린 중합체를 생산할 수 있다. 하지만, 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 아미노 기능기가 사이클로덱스트린 성분에 직접 부착될 필요는 없다.
대안으로, -SCH2CH2NH2와 같은 성분을 보유하는 아미노기로 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 요오드 또는 다른 적합한 이탈기를 치환하여 아미노 기능기를 도입함으로써 화학식 Ⅴd, Ⅴe, Ⅴf, Ⅴg, Ⅴh, Ⅴi 또는 이들의 혼합물의 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 형성할 수 있다:
Figure 112008501690159-pct00105
Figure 112003021806745-pct00019
Figure 112003021806745-pct00020
Figure 112003021806745-pct00021
Figure 112003021806745-pct00022
Figure 112003021806745-pct00023
선형 사이클로덱스트린 공중합체는 후술한 바와 같이 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체를 환원시켜 만들 수도 있다. 이 방법은 공단량체 A가 환원성 성분이나 작용기, 예를 들면, 이황화결합을 보유하지 않는 경우에 실시할 수 있다.
선형 사이클로덱스트린 공중합체는 산화 사이클로덱스트린 공중합체가 중합체 골격의 절대 필요 부분이 되도록 공중합체에 적어도 하나의 산화 사이클로덱스트린 단량체를 도입함으로써 산화시킬 수 있다. 적어도 하나의 산화 사이클로덱스트린 단량체를 보유하는 선형 사이클로덱스트린 공중합체는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체로 정의한다. 이후, 선형 산화 사이클로덱스트린은 선형 공중합체 골격에서 사이클로덱스트린의 하나이상 글루코피라노즈 고리의 2, 3 또는 6번 위치를 통하여 선형 사이클로덱스트린 중합체의 사이클로덱스트린을 연결하는 이중기능 성분(주로, A 성분)에 이중기능기로 결합되는 치환되거나 또는 치환되지 않은 사이클로덱스트린 성분을 보유하는데, 여기서 사이클로덱스트린 성분의 글루코피라노즈 고리는 산화된다. 사이클로덱스트린 단량체는 사이클로덱스트린 성분의 이차 또는 일차 하이드록실 부위에서 산화될 수 있다. 하나이상의 산화 사이클로덱스트린 단량체가 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체에 존재하면, 일차 하이드록실 부분, 이차 하이드록실 부분, 또는 둘 모두에 동일하거나 상이한 산화 사이클로덱스트린 단량체가 존재할 수 있다. 가령, 산화된 이차 하이드록실기를 보유하는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체는 화학식 Ⅵa 또는 Ⅵb중 적어도 한가지 단위를 보유한다:
Figure 112003021806745-pct00024
Figure 112003021806745-pct00025
화학식 Ⅵa와 Ⅵb에서, C는 치환되거나 또는 치환되지 않은 산화 사이클로덱스트린 단량체이고 A는 산화 사이클로덱스트린 C에 공유결합된 공단량체이다. 화학식 Ⅵa와 Ⅵb에서, 이차 하이드록실기의 산화는 사이클로덱스트린 성분의 고리 개방 및 알데하이드기의 생성을 유도한다.
선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체는 전술한 바와 같이 선형 사이클로덱스트린 공중합체의 산화로 만들 수 있다. 선형 사이클로덱스트린 공중합체의 산화는 당분야에 공지된 산화 기술로 달성할 수 있다(Hisamatsu et al., Starch 44: 188-191(1992)). 적절하게는, 과산화나트륨과 같은 산화제를 사용한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 표준 산화 조건하에 산화 정도는 공중합체마다 달라진다. 따라서, 한 구체예에서 선형 산화 공중합체는 하나의 산화 사이클로덱스트린 단량체 를 보유할 수 있다. 다른 구체예에서, 공중합체의 실질적으로 모든 사이클로덱스트린 단량체가 산화될 수 있다.
선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체를 제조하는 다른 방법에는 전술한 바와 같이 산화된 이중요오드화 또는 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 형성하기 위한 이중요오드화 또는 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 산화 및 공단량체 A 전구물질로 산화된 이중요오드화 또는 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 공중합화 단계가 포함된다. 적절한 구체예에서, 화학식 Ⅶa, Ⅶb, Ⅶc 또는 이들의 혼합물의 산화된 이중요오드화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질:
Figure 112003021806745-pct00026
Figure 112003021806745-pct00027
Figure 112003021806745-pct00028
산화 사이클로덱스트린 단량체는 전술한 바와 같이 화학식 Ⅳa, Ⅳb, Ⅳc 또는 이들의 혼합물의 이중요오드화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 산화로 만들 수 있다. 다른 구체예에서, 화학식 Ⅷa, Ⅷb, Ⅷc 또는 이들의 혼합물의 산화된 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 화학식 Ⅶa, Ⅶb, Ⅶc 또는 이들의 혼합물의 산화된 이중요오드화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 아미노화로 만들 수 있다:
Figure 112003021806745-pct00029
Figure 112003021806745-pct00030
Figure 112003021806745-pct00031
또 다른 구체예에서, 화학식 Ⅸa, Ⅸb, Ⅸc, Ⅸd, Ⅸe, Ⅸf 또는 이들의 혼합물의 산화된 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 요오드 다른 적합한 이탈기가 분포된 산화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질의 요오드 또는 다른 적합한 이탈기를 -SCH2CH2NH2 성분을 보유하는 아미노기로 치환하여 만들 수 있다.
Figure 112003021806745-pct00032
Figure 112003021806745-pct00033
Figure 112003021806745-pct00034
Figure 112003021806745-pct00035
Figure 112003021806745-pct00036
Figure 112003021806745-pct00037
대안으로, 전술한 바와 같이 산화된 이중요오드화 디카르복실산 또는 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 산화시켜 산화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질을 형성하고, 이후 산화 사이클로덱스트린 단량체를 이중요오드화 및/또는 이중아미노화하여 만들 수 있다. 임의의 이중아미노화된 산화 사이클로덱스트린 단량체의 아민기는 원치않는 부작용을 피하기 위하여 보호된 형태로 존재할 수 있다. 전술한 바와 같이, 사이클로덱스트린 성분은 요오드기를 제외한 다른 이탈기 및 다른 아미노기-보유 기능기로 변형될 수 있다. 이후, 산화된 이중요오드화 또는 이중아미노화 사이클로덱스트린 단량체 전구물질은 공단량체 A 전구물질로 공중합하여 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체를 형성할 수 있다.
선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체는 적어도 하나의 공단량체 A 전구물질 또는 공단량체 A 전구물질의 가수분해물로 종결된다. 적어도 하나의 공단량체 A 전구물질로 사이클로덱스트린 공중합체 종결의 결과로, 전술한 바와 같이 선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체당 하나의 유리 파생기(derivatizing group)가 존재한다. 가령, 파생기는 산 작용기 또는 산 작용기로 가수분해될 수 있는 파생기일 수 있다. 본원 발명에 따라, 파생기는 사이클로덱스트린 공중합체의 특성, 예를 들면, 콜로이드 안전성과 트랜스펙션 효율을 강화시키기 위하여 화학적으로 추가 변형될 수 있다. 가령, 파생기는 PEG와의 반응으로 변형시켜 PEG로 종결되는 사이클로덱스트린 공중합체를 형성하고 콜로이드 안정성을 증가시키거나, 또는 히스티딘이나 이미다졸 아세트산과 반응시켜 이미다졸릴로 종결되는 사이클로덱스트린 공중합체를 형성하고 세포내(예, 엔도솜) 방출과 트랜스펙션 효율을 증가시킬 수 있다(도 29와 30).
추가적인 화학적 성상은 변형된 파생기를 통하여 사이클로덱스트린 공중합체에 실시할 수 있다. 가령, 변형된 이탈기는 선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체를 동일하거나 상이한 사이클로덱스트린 또는 비-사이클로덱스트린 중합체에 연결시킴으로써 중합체 사슬을 연장하는데 사용될 수 있다. 추가되는 중합체는 동일하거나 상이한 선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체인데, 이들 역시 추가적인 변형을 위하여 공단량체 A 전구물질로 종결될 수 있다.
대안으로, 전술한 바와 같이 말단 파생기 혹은 말단 변형된 파생기를 보유하는 적어도 2개의 동일하거나 상이한 선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체는 기능기 또는 변형된 파생기를 통하여 서로 반응하고 결합할 수 있다. 적절하게는, 기능기 또는 변형된 파생기의 반응직후에 분해가능 성분, 예를 들면, 이황화결합이 형성된다. 가령, 시스테인으로 말단 파생기의 변형은 유리 티올기를 보유하는 선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체를 생산하는데 사용될 수 있다. 유리 티올기를 보유하는 동일하거나 상이한 사이클로덱스트린 공중합체와의 반응 역시 두 공중합체간 이황화결합을 결과한다. 기능기 또는 변형된 파생기는 상이한 분해 속도(예, 효소 분해를 통하여)를 보이는 결합을 제공하고, 따라서 원하는 경우에 치료약물에 대한 시간 조절 시스템을 제공하도록 선택될 수 있다. 생성된 중합체는 본원에서 밝힌 바와 같이 가교결합될 수 있다. 본원에서 밝힌 바와 같이 치료약물은 중합체의 가교결합 이전에 또는 이후에 첨가될 수 있다. 리간드 역시 변형된 파생기를 통하여 사이클로덱스트린 공중합체에 결합될 수 있다. 가령, 선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체는 사이클로덱스트린 공중합체에 부착된 리간드로 변형될 수 있다. 리간드는 사이클로덱스트린 단량체 C 또는 공단량체 A를 통하여 사이클로덱스트린 공중합체에 부착될 수 있다. 적절하게는, 리간드는 사이클로덱스트린 공중합체의 사이클로덱스트린 성분에 부착된다(WO 00/01734).
분지된 사이클로덱스트린-보유 중합체
또한, 호스트 및/또는 게스트 기능분자를 보유하는 미립자 혼합물의 중합체는 실질적으로 분지된 중합체, 예를 들면, 분지된 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 분지된 사이클로덱스트린-보유 중합체, 바람직하게는 분지된 사이클로덱스트린-보유 중합체일 수 있다. 분지된 사이클로덱스트린-보유 중합체는 적어도 한가지 사이클로덱스트린 성분을 보유하는 임의의 수용성 분지된 중합체일 수 있고, 상기 성분은 중합체 골격의 일부이거나 및/또는 중합체 골격에 매달려 있을 수 있다. 분지된 사이클로덱스트린-보유 중합체는 분지된 사이클로덱스트린 공중합체 또는 분지된 산화 사이클로덱스트린 공중합체이다. 분지된 사이클로덱스트린 공중합체 또는 분지된 산화 사이클로덱스트린 공중합체는 전술한 바와 같이 종속 사슬이 분지되는 선형 사이클로덱스트린 공중합체 또는 선형 산화 사이클로덱스트린 공중합체이다. 분지하는 종속 사슬은 다양한 파생기 또는 치환체, 예를 들면, 하이드록실, 아미노, 산, 에스테르, 아미노, 케토, 포밀, 질소기를 추가로 보유할 수 있다. 분지하는 종속 사슬은 또한, 사이클로덱스트린 또는 다른 호스트나 게스트 기능성분을 보유할 수도 있다. 분자 종속 사슬은 또한, 리간드로 변형될 수 있다. 이런 리간드 변형에는 분지하는 종속 사슬에서 사이클로덱스트린 성분에 대한 리간드의 부착이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
적절하게는, 분지된 사이클로덱스트린-보유 중합체는 분지하는 종속 사슬이 사이클로덱스트린 성분을 보유하는 분지된 사이클로덱스트린 공중합체 또는 분지된 산화 사이클로덱스트린 공중합체이다. 분지하는 종속 사슬이 사이클로덱스트린 성분을 보유하면, 사이클로덱스트린 성분은 내포 복합체 형성 및 치료약물의 캡슐화를 촉진할 수 있다. 적절하게는, 분지하는 종속 사슬의 사이클로덱스트린 성분은 중합체 골격에서 사이클로덱스트린 성분과 함께, 내포 복합체 형성 및 치료약물의 캡슐화를 촉진할 수 있다. 분지된 사이클로덱스트린-보유 중합체는 사이클로덱스트린 단량체 전구물질로 중합체(예, 선형이나 분지된 PEI)의 파생화(예, 치환)를 비롯한 당분야에 공지된 임의의 방법으로 만들 수 있다. 펜던트 사이클로덱스트린을 보유하는 중합체의 예는 Tojima, et al., J. Polym. Sci. Part A:Polym. Chem. 36, 1965(1998), Crini, et al., Eur. Polym. J. 33, 1143, (1997), Weickenmeier et al., Maromel. Rapid Commun. 17, 731(1996), and Bachmann, et al., J. Carbohydrate Chemistry 17, 1359(1998)에서 기술한다(Weickenmeier 논문에서는 사이클로덱스트린 측쇄 폴리에스테르, 이들의 합성 및 아다만테인 유도체의 내포를 기술한다). 분지된 사이클로덱스트린-보유 중합체는 전술한 바와 같이 가교결합될 수 있다.
본원 발명에 사용되는 폴리(에틸렌이민)(PEI)는 대략 800 내지 800,000 달톤, 바람직하게는 2,000 내지 100,000 달톤, 더욱 바람직하게는 2,000 내지 25,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEI는 선형이나 분지형일 수 있다. 적합한 PEI 화합물은 Aldrich Chemical Company의 폴리에틸렌이민, Polysciences의 폴리에틸렌이민, BASF Corporation의 POLYMIN 폴리(에틸렌이민)와 LUPASOLTM 폴리(에틸렌이민)을 비롯한 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다.
다른 호스트-기능적 중합체
전술한 바와 같이, 미립자 혼합물의 적어도 한가지 중합체는 내포 복합체를 형성할 수 있는 중합체이다. 다양한 제조방법과 함께, 적절한 사이클로덱스트린 호스트 기능분자를 보유하는 중합체를 전술하였다. 동일한 방식으로, 호스트 기능분자를 보유하는 선형이나 분지된 임의의 중합체가 본원 발명의 실시에 사용될 수 있다. 중합체와 함께 사용되는데 적합한 "호스트"의 다른 예에는 카비탄드(cavitand), 크라운 에테르(crown ethers), 크립탄드(cryptand), 쿠쿠르비투릴(cucurbituril), 칼릭사렌(calixarenes), 스페란드(spherands) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 다른 호스트의 중합체는 사이클로덱스트린-보유 중합체에 대하여 전술한 바와 동일한 방식으로 만들어 질 수 있다. 관심있는 호스트는 요오드, 토실레이트 등과 같은 이탈기를 부착하도록 하이드록실기와 같은 기능기로 파생시키고 이탈기를 치환하는 적합한 공단량체 A와 반응시켜 호스트 공중합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 호스트는 아민이나 카르복실기와 같은 기능기를 보유거나 또는 이를 보유하도록 파생시켜, 호스트가 공단량체 A와 응축 반응을 진행하고 호스트 공중합체를 형성하도록 할 수 있다. 이후, 호스트 공중합체는 중합체 골격 및 공중합체가 분지되는 경우에 분지에서 호스트 기능분자의 혼합물을 보유하도록 만들 수 있다.
게스트 기능적 중합체
게스트 기능적 중합체는 호스트-기능적 착화제와 내포 복합체를 형성할 수 있는 임의의 중합체일 수 있다. 전형적으로, 게스트 기능분자는 측쇄 또는 말단기에 존재한다. 중합체 골격의 일부가 아닌 게스트 기능분자를 보유하는 중합체의 예는 펜던트 아다만테인 기를 보유하는 중합체이다. 중합체에 통합될 수 있는 내포 기능분자의 예에는 아다만테인, 디아다만테인, 나프탈렌, 콜레스테롤이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
B. 치료약물
본원 발명에 따라, 적어도 한가지 치료약물은 전술한 바와 같이 중합체에 캡슐화되어 미립자 혼합물을 형성할 수 있다. "치료약물"에는 약리학적 또는 치료요법적으로 사용되는 임의의 활성 작용제 및 후술한 바와 같이 살균용도로 사용되는 활성 화합물이나 작용제가 포함된다. 이런 치료약물(또는 활성 작용제)의 예는 후술한다. 캡슐화는 치료약물이 중합체와 결합하는 임의의 수단(예, 정전 상호작용, 소수성 상호작용, 실제 캡슐화)으로 정의된다. 결합의 정도는 형광 조사, DNA 이동도 조사, 광 분사, 전자 현미경을 비롯한 당분야에 공지된 기술로 측정할 수 있는데, 치료약물에 따라 달라진다. 가령, 전달 양식으로 전술된 미립자 혼합물의 중합체 및 DNA로부터 만들어진 다중-차원 중합체 네트워크를 보유하는 치료 조성물은 트랜스펙션, 즉 DNA의 동물(예, 사람) 세포로의 유입을 보조하는데 사용될 수 있다(Boussif, O. Proceedings of the national Academy of Sciences, 92:7297-7301(1995); Zanta et al. Bioconjugate Chemistry, 8:839-844(1997); Gosselin et al. "Efficient Gene Transfer Using Reversibly Cross-Linked LowMolecular Weight Polyethylenmine", College of Pharmacy, The Ohio State Universitym published on web, revised manuscript July 5, 2001)). 치료약물이 핵산-기초(예, DNA)한 경우에, 혼합물을 형성하는 치료약물의 중합체는 "폴리플렉스(polyplex)" 형태일 수 있다. 폴리플렉스는 핵산과 어카운팅(accounting) 중합체간 혼합물이다(Felgner, et al. "Nomenclature for Synthetic Gene Delivery Systems". Hum. Gene Ther. 8, 511-512(1997)).
치료약물의 혼합물이 본원 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 미립자 혼합물을 형성한 직후, 치료약물은 생물학적 또는 치료요법적 활성을 유지하거나 또는 유지하지 않을 수 있다. 치료 조성물, 특히 미립자 혼합물의 중합체로부터 방출직후, 치료약물의 활성이 복원되거나 또는 프로드러그(prodrug)의 경우에 활성에 대한 잠재력이 복원된다. 따라서, 미립자 혼합물은 예로써 분해에 기인한 활성의 상실로부터 치료약물을 보호하고 강화된 생체이용효율을 제공한다. 이와 같이, 본원 발명의 조성물은 치료약물 또는 임의의 활성 화학적 화합물에 안정성, 특히 저장이나 분해 안정성을 제공하는데 사용될 수 있다. 지질친화성 치료약물의 캡슐화는 완전하지는 않지만 지질친화성 치료약물의 용해도를 강화시킨다. 치료약물은 미립자 조성물 또는 치료 조성물 형성에 앞서 또는 이후에 리간드로 추가로 변형될킬 수 있다.
치료약물은 당분야에 공지된 치료약물을 비롯하여 지질친화성이나 친수성의 합성되거나 자연 발생한 생물학적 활성 치료약물일 수 있다(Merck Index, An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, 13th Edition, 2001, Merck and Co., Inc., Whitehouse Station, NJ). 이런 치료약물에는 소형 분자 치료제, 항생제, 스테로이드, 폴리뉴클레오티드(예, 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 바이러스, 키메라 폴리뉴클레오티드), 플라스미드, 펩티드, 펩티드 단편, 소형 분자(예, 독소루비신), 킬레이트제(예, 데페록사민(DESFERAL), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)), 자연 산물(예, 탁솔, 암포테리신), 다른 생물학적 활성 거대분자(예, 단백질과 효소)가 포함된다. 미국 특허 6,048,736에서는 사이클로덱스트린 중합체와 내포 화합물을 형성하는 게스트로 사용되는 활성약물(치료약물)을 기술한다. 소형 분자 치료약물은 혼합물 입자내에서 치료약물일 뿐만 아니라 다른 구체예의 혼합물에서 중합체에 공유결합될 수 있다. 적절하게는, 공유결합은 가역적(예, 프로드러그 형태, 또는 이황화결합과 같은 생분해성 결합을 통하여)이고 치료약물을 전달하는 다른 방법을 제공한다.
2. 착화제
본원 발명에 따라, 착화제는 상응하는 게스트 또는 호스트 기능분자를 보유하는 미립자 혼합물에서 중합체와 내포 복합체를 형성할 수 있는 호스트 또는 게스트 기능분자를 보유하는 화합물이다. 전술한 바와 같이, 게스트 착화제는 호스트 기능분자를 보유하는 미립자 혼합물의 중합체, 또는 호스트 기능분자를 보유하는 중합체의 단량체를 변형시켜 내포 복합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 호스트 착화제는 중합체 게스트 기능분자에 호스트로 작용함으로써 미립자 혼합물의 적어도 한가지 중합체와 내포 복합체를 형성할 수 있다. 착화제는 2개 이상의 내포 기능분자를 보유할 수 있다. 가령, 2개의 내포 기능분자를 보유하는 착화제는 게스트, 게스트; 호스트, 호스트; 또는 호스트, 게스트 착화제일 수 있다. 착화제는 다수 호스트 및/또는 게스트 기능분자의 혼합물을 보유할 수도 있다. 착화제는 본원 발명의 조성물에 이점을 제공하는 기능기를 보유한다. 이러한 기능기는 예로써 리간드, 친수성이나 소수성 작용기, 다른 치료약물 등일 수 있다. 또한, 착화제는 내포 게스트 또는 호스트 및 기능기 사이에 스페이서(spacer) 작용기를 포함할 수도 있다.
적절하게는, 착화제는 대략 >102, 바람직하게는 대략 >103, 더욱 바람직하게는 대략 >104의 결합 상수를 보인다. 전형적으로, 결합 상수는 102-106이다. 착화제에 적합한 내포 게스트는 당분야에 공지된 것으로, 예로써 아다만테인, 디아다만테인(diadamantane), 나프탈렌(naphthalene), 콜레스테롤 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(Amiel et al., Int. J. Polymer Analysis & Characterization, Vol. 1, 289-300(1995); Amiel et al., Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry, 25:61-67(1996); Amiel et al., Advances in Colloid and Interface Science, 79, 105-122(1999); Sandier et al., Langmuir, 16, 1634-1642(2000)).
착화제는 본원 발명의 조성물에 이점을 제공하는 기능기를 보유한다. 기능기, 예를 들면, 하이드록실이나 아민 기능기를 단순히 추가하는 것은 기능기를 도입하는 한가지 방법이다. 적절한 구체예에서, 착화제는 미립자 혼합물의 중합체와 내포 복합체를 형성할 뿐만 아니라 혼합물을 변화시켜 예로써, 세포 접촉, 세포내 소통(trafficking) 및/또는 세포 유입과 방출을 촉진할 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 착화제가 사용될 수 있다. 적합한 "기능적" 작용기의 예에는 리간드, 핵 배치 신호(Zanta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, pp. 91-96(1999)), 엔도솜 방출 펩티드, 엔도솜 방출 중합체, 막 투과제, 또는 이들의 혼합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 핵 배치 신호(NLS)는 당분야에 공지된 임의의 핵 배치 신호일 수 있다. 엔도솜 방출 펩티드 또는 중합체는 당분야에 공지된 임의의 엔도솜 방출 펩티드 또는 중합체(예, HA-2와 GALA)일 수 있다("Gene delivery by negatively charged peptides" Simoes S, Slepushkin V, Gaspar R, de Lima MCP, Duzgunes N, GENE THERAPY 5:(7)955-964JUL 1998). 세포막 투과제(또는 세포막 투과가능제)의 예는 HIV-1로부터 유래된 TAT 단백질이다. TAT 단백질은 세포핵으로 활발하게 유입되는 바이러스 전사 활성물질이다(Torchilin, V.P. et al, PNAS. 98, 8786-8791,(2001)).
또한, 착화제는 특히 생물학적 조건하에 용해도를 증가시키거나 또는 안정화를 제공하는 중합체로 기능화될 수 있다. 조성물의 안정화는 친수성이나 지질친화성 작용기를 보유하는 착화제의 사용으로 달성할 수 있다. 적합한 유형의 친수성 작용기는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-보유 공중합체(PEG)이다. 적합한 폴리에틸렌 에틸렌 글리콜은 화학식 HO(CH2CH2O)zH이고, 여기서 z는 2 내지 500, 바람직하게는 10-300이다. PEG600, PEG3400, PEG5000은 본원 발명에 사용될 수 있는 폴리에틸렌 글리콜을 대표한다. 일반적으로, 착화제에서 PEG의 분자량이 높을수록 조성물의 더욱 높은 안정화가 달성된다. 더욱 많은 분자량의 PEG가 바람직하다. 적합한 착화제는 페길화된 아다만테인 또는 페길화된 디아다만테인이다. 착화제로 유용한 일부 아다만테인-PEG 분자의 구조는 도 1에 도시한다. 지질친화성(소수성)을 증가시키기 위하여, 착화제는 긴 사슬 알킬, 지방산 등과 같은 지질친화성 작용기를 포함할 수 있다. 지질친화성 작용기의 선택은 원하는 지질친화성의 정도에 좌우된다. 본원에서, 착화제는 임의 유형의 기능기로 변형시켜 조성물에 원하는 특성을 도입할 수 있다. 착화제는 표준 유기 공학으로 만들 수 있다. 상이한 착화제의 혼합물을 사용하는 것은 원하는 조성물 특성을 달성하는데 있어 더욱 많은 변화와 특이성을 가능하게 한다.
스페이서 기는 기능기를 착화제에 연결하는데 사용될 수 있다. 스페이서 기는 게스트 착화제 또는 기능기의 특성에 부정적인 영향을 주지 않는 당분야에 공지된 임의의 스페이서 기일 수 있다. 가령, 스페이서 기는 기능기가 착화제가 직접적으로 결합하는 직접 결합일 수 있다. 대안으로, 스페이서 기는 수용성이거나, 생리 pH에서 고도 음이온(anionic)이거나 또는 산성 조건하에 융해(fusogenic) 활성을 갖는 성분일 수 있다. 적절하게는, 스페이서 기는 내포 복합체에서 중합체와 착화제의 결합 친화성을 강화시킨다(예, 글루탐산 잔기를 보유하는 음이온 스페이서 기, 카르복실산 작용기 등). 또한, 스페이서 기는 환원가능 결합(예, 이황화결합)을 보유하는데, 이의 환원은 착화제로부터 기능기를 방출시킨다. 적합한 스페이서 기의 예에는 직접 결합, 폴리글루탐산, GALA, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
기능기는 추가적인 치료약물일 수도 있다. 치료약물은 착화제에 가역적으로 결합될 수 있다(예, 프로드러그 형태 또는 생화학적 결합을 통하여). 이는 착화제를 통하여 추가적인 치료 약물을 전달하는 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본원의 조성물에 사용되는 착화제는 하기 화학식 화합물이다:
Figure 112003021806745-pct00038
여기서,
J는 -NH-, -C(=O)NH-(CH2)d-, -NH-C(=O)-(CH2)d-, -CH2SS-, -C(=O)O-(CH2)e-O-P(=O)(O-(CH2)e-Y)O-,
Figure 112003021806745-pct00039
,
펩티드 또는 펩티드 잔기, 또는 -NH-(C=O)-CH(R1)-NH-(C=0)-CH(R1)-NH-이고;
Y는 아다만틸이며;
R1은 -(CH2)a-CO2H, 이의 에스테르 또는 염; 또는 -(CH2 )a-CONH2이고;
PEG는 -O(CH2CH2O)z-, 여기서 z는 2 내지 500이며;
L은 H, -NH2, -NH-(C=O)-(CH2)e-(C=O)-CH2-, -S(=O)2 -HC=CH2-, -SS-, -C(=O)O- 또는 탄수화물 잔기이고;
a는 0 또는 1이며;
b는 0 또는 1이고;
d는 0 내지 6이며;
e는 1 내지 6이고;
n은 0 내지 6이며;
y는 0 또는 1이고;
x는 0 또는 1이다.
착화제는 하기 화학식 화합물일 수도 있다:
Figure 112003021806745-pct00040
여기서, 변수는 상기와 동일하고, z는 1 내지 5이며, q는 1 내지 5이고, w는 1 내지 5이다.
전술한 바와 같이, 게스트 기능분자의 예에는 아다만틸, 나프틸, 콜레스테롤이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 바람직한 호스트 기능분자는 사이클로덱스트린이다. 화학식에 표시된 바와 같이, 호스트와 게스트 기능분자의 혼합물은 착화제내에 존재한다.
아다만테인 게스트 기능분자를 보유하는 바람직한 일군의 착화제는 하기 화학식 화합물이다:
Figure 112003021806745-pct00041
여기서,
J는 -NH-, -C(=O)NH-(CH2)d-, -NH-C(=O)-(CH2)d-, -CH2SS-, -C(=O)O-(CH2)e-O-P(=O)(O-(CH2)e-Y)O-,
Figure 112003021806745-pct00042
,
펩티드나 펩티드 잔기, 또는 -NH-(C=O)-CH(R1)-NH-(C=0)-CH(R1)-NH-이고;
Y는 아다만틸이며;
R1은 -(CH2)a-CO2H, 이의 에스테르 또는 염; 또는 -(CH2 )a-CONH2이고;
PEG는 -O(CH2CH2O)z-, 여기서 z는 2 내지 500이며;
L은 H, -NH2, -NH-(C=O)-(CH2)e-(C=O)-CH2-, -S(=O)2 -HC=CH2-, -SS-, -C(=O)O- 또는 탄수화물 잔기이고;
a는 0 또는 1이며;
b는 0 또는 1이고;
d는 0 내지 6이며;
e는 1 내지 6이고;
n은 0 내지 6이며;
y는 0 또는 1이고;
x는 0 또는 1이다.
기능화된 착화제의 사용으로, 본원 발명의 조성물은 변형 또는 기능화시켜 세포 접촉 및/또는 세포 유입을 촉진할 수 있다. 다중 기능 및/또는 이점을 달성하기 위하여, 조성물은 상이한 기능분자를 보유하는 착화제를 사용하여 2개 이상 유형의 내포 복합체를 형성할 수 있다. 전술한 바와 같이, 리간드는 미립자 혼합물의 중합체 또는 착화제를 변형시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원 발명에 따른 조성물은 내포 복합체를 통하여 한가지이상의 리간드를 보유하고, 따라서 세포 표적화 및/또는 전달을 위한 하나이상의 부위를 보유할 수 있다. 다중 리간드-또는 다른-기능화 착화제를 보유하는 미립자 혼합물은 페길화된 착화제와 같은 안정화 또는 용해성 기능분자를 보유하는 착화제를 추가하여 안정화시킬 수 있다.
중합체는 여러 기능화된 착화제의 혼합물과 다중 내포 복합체를 형성할 수 있기 때문에, 본원 발명의 치료 조성물은 예로써 다중 치료약물, 상이한 리간드 및/또는 다양한 안정화 중합체를 함유할 수 있다. 착화제가 치료약물 또는 프로드러그로 기능화되는 경우에, 다중 내포 복합체를 형성하는 것은 동일한 치료 조성물로 여러 치료약물의 전달을 가능하게 한다. 리간드가 존재하면, 치료약물의 전체 조합(또는 칵테일)은 특정 세포형, 질환, 또는 다른 치료 용도를 지향할 수 있다.
기능화된 게스트 착화제는 당분야에 공지된 임의의 수단으로 만들 수 있다(Amiel et al., Int. J. Polymer Analysis & Characterization, Vol. 1, 289-300(1995); Amiel et al., Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry, 25:61-67(1996); Sandier et al., Langmuir, 16, 1634-1642(2000)).
3. 본원 발명에 따른 조성물의 제조
본원 발명은 또한, 조성물의 제조 방법에 관한다. 상기 방법은 치료약물, 호스트 또는 게스트 기능분자를 보유하는 중합체 및 착화제를 결합시켜 치료 조성물을 생산하는 단계로 구성된다. 게스트 또는 호스트로 작용하는 착화제는 중합체와 내포 복합체를 형성한다. 다른 구체예에서, 먼저 치료약물과 중합체를 결합시켜 미립자 혼합물을 만들고, 이후 미립자 혼합물을 착화제와 결합시켜 치료 조성물의 내포 복합체를 생산한다. 또한, 조성물은 먼저 중합체와 착화제를 결합시켜 내포 복합체를 만들고, 이후 내포 복합체를 치료약물과 결합시켜 미립자 혼합물 및 궁극적으로 본원 발명의 조성물을 생산할 수도 있다.
A. 중합체-약물 미립자 혼합물의 형성
치료약물과 중합체의 미립자 혼합물은 당분야에 공지된 적합한 수단으로 만들 수 있다. 가령, 미립자 혼합물은 치료약물과 중합체를 단순히 접촉시키거나, 혼합하거나, 또는 분산시켜 형성할 수 있다. 가령, 중합체와 치료약물은 이들 둘 모두 용해되는 용매, 중합체는 용해되지만 치료약물은 분산되는 용매, 또는 중합체와 치료약물이 분산되지만 미립자 혼합물을 안정화시키는 용매에서 혼합할 수 있다. 제약학적 용도에서, 용매는 임의의 생리학적으로 수용가능한 수용액일 수 있다. 미립자 혼합물은 중합체와 치료약물의 결합, 중합체의 자가 결합, 또는 화학적 수단으로 형성될 수 있다. 미립자 혼합물의 형성에 앞서, 미립자 혼합물의 중합체는 중합체 겔과 같은 실질적으로 결합된 구조로 존재하지 않는다. 하지만, 중합체와 치료약물의 특성에 따라, 미립자 혼합물의 일부로서 중합체는 겔과 같은 실질적으로 결합된 구조를 형성할 수도 있다. 미립자 혼합물은 또한, 치료약물의 존재하에 선형이나 분지된 중합체를 형성하는 동일하거나 상이한 단량체를 중합시켜 만들 수도 있다. 미립자 혼합물은 또한, 치료약물의 존재하에 선형이나 분지된 중합체를 형성할 수 있는 동일하거나 상이한 단량체를 중합시켜 만들 수도 있는데, 여기서 치료약물은 중합화를 위한 주형 역할을 한다(Trubetskoy et al., Nucleic Acids Research, Vol. 26, No. 18, pp. 4178-4185(1998)).
사용되는 중합체와 치료약물의 함량은 미립자 혼합물이 집합되도록 하는 임의의 함량일 수 있다. 전형적으로, 중합체는 과량의 치료약물에 사용된다. 미립자 혼합물을 형성하는데 사용되는 중합체가 양으로 하전된 공단량체 A 또는 폴리알킬렌 이민(예, PEI)에서처럼 양이온이나 음이온 전하를 보유하는 경우 및 치료약물 이 음이온성 폴리뉴클레오티드와 같은 전하를 보유하는 경우에, 중합체 대 치료약물의 비율은 전하 비율로 표시할 수 있다. 전하 비율은 중합체 전하 대 치료약물 전하의 비율이다. 실시예에서 밝힌 바와 같이, 양이온성 사이클로덱스트린 중합체와 음이온성 DNA의 미립자 혼합물은 DNA의 1 음이온 전하에 대한 사이클로덱스트린 중합체의 5 양이온 전하인 5+/- 전하로 공식화된다. 전하 비율은 미립자 혼합물이 필요한 최소 전하 비율을 달성하고 과잉의 최소 전하 비율로 존재할 수 있도록 하는 임의의 비율이다. 중합체 및/또는 치료약물이 하전되지 않으면, 중합체 대 치료약물의 비율 결과는 당분야에 공지된 바와 같이 중량, 몰 또는 농도로 표시할 수 있다.
본원 발명에 따라, 미립자 혼합물의 중합체는 치료약물과 다중-차원 중합체 네트워크를 포함하는 미립자 혼합물을 형성할 수 있을 만큼 충분한 조건하에 처리할 수도 있다. 이런 다중-차원 중합체 네트워크는 WO 00/33885에서 기술한다. WO 00/33885에서, 다중-차원 중합체 네트워크를 형성하는데 충분한 조건하에 미립자 복합물의 중합체 처리는 미립자 혼합물의 중합체와 치료약물의 결합을 촉진하는 추가적인 작용제나 반응물의 추가를 비롯한 임의의 적합한 반응 조건으로 달성할 수 있다. 중합체는 중합체간 공유결합, 비-공유 결합(예, 이온 결합), 또는 비-공유 상호작용(예, 반 데르 발스 상호작용)을 통하여 결합시킬 수 있다. 중합체의 중합체내 공유결합, 비-공유결합, 또는 비-공유 상호작용을 통한 결합 역시 가능하다. 이런 결합의 결과로, 미립자 혼합물의 중합체는 상호작용하여 다중-차원 중합체 네트워크를 형성한다.
본원 발명의 한 구체예에서, 치료약물과 다중-차원 중합체 네트워크를 포함하는 미립자 혼합물을 형성하는 데에는 가교결합 반응이 포함된다. 가령, 미립자 혼합물의 중합체가 단일 중합체 분자이면 중합체는 가교결합을 촉진하거나, 또는 미립자 혼합물의 중합체내 가교결합이나 단일 중합체 분자와 실제 가교결합이 달성되도록 가교결합을 형성하는 분자, 올리고머, 혹은 별개의 중합체와 반응시킬 수 있다. 유사하게, 미립자 혼합물의 중합체가 2가지이상 중합체의 혼합물이면 중합체는 가교결합을 촉진하거나, 또는 교차결합을 형성하는 분자, 올리고머, 혹은 별개의 중합체와 반응시킬 수 있다.
생성된 가교결합은 미립자 혼합물의 중합체의 중합체내 및/또는 중합체간, 바람직하게는 중합체간 가교결합이다.
가교결합제는 당분야에 공지된 임의의 가교결합제일 수 있다. 가교결합제는 미립자 혼합물의 중합체내에서 가교결합을 촉진할 수 있는 또는 이들 중합체와 실제로 가교결합할 수 있는 임의의 올리고머 또는 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체, 폴리에틸렌 중합체)일 수 있다. 가교결합 올리고머 또는 중합체는 미립자 혼합물의 중합체로서 동일하거나 상이할 수 있다. 유사하게, 가교결합제는 미립자 혼합물의 중합체와 가교결합할 수 있는 임의의 적합한 분자일 수 있다. 가교결합제 자체가 리간드를 보유할 수도 있다.
WO 00/33885에서 밝힌 바와 같이, 다중-차원 중합체 네트워크를 형성하는 미립자 혼합물의 중합체의 결합 정도는 부분 결합에서 완전 결합까지 다양하다. 중합체의 결합 정도를 변화시킴으로써, 짧은 사슬 중합체는 원하는 짧은 사슬 중합체의 특성을 유지하면서 긴 사슬 중합체의 특성을 보이도록 만들 수 있다. 가령, 긴 사슬 중합체 특성은 표적 세포에 도달할 때까지 전반적인 안정성, 즉 분해에 대한 저항성을 촉진하고, 반면 짧은 사슬 중합체 특성은 표적 세포내에서 DNA 방출을 촉진한다. 이런 이중성은 치료약물과 다중-차원 중합체 네트워크를 함유하는 치료 조성물이 비-생리학적/생리학적 조건에서 향상된 안정성 및 더욱 높은 저장 안정성을 보일 수 있도록 한다. 또한, 치료 조성물의 중합체의 결합 정도를 변화시켜 치료약물의 방출을 조절할 수도 있다.
미립자 조성물의 입자 크기는 본원 발명의 조성물을 형성하기 위하여 사용된 중합체 및 치료약물에 좌우된다. 하기의 실시예에서 밝힌 바와 같이, 입자 크기는 50-1000 nm, 바람직하게는 50-500 nm이다. 전형적으로, 내포 복합체의 형성은 입자 크기를 현저하게 증가시키지 않는다. 조성물은 개별 입자로 유지된다. 후술한 바와 같이, 페길화된 착화제를 함유하는 조성물은 염 용액에서 뛰어난 안정성을 보인다. 적절하게는, 조성물은 생리조건하에 안정하고 다양한 질환의 치료에서 치료약물의 전달 수단으로 사용가능하다.
B. 내포 복합체의 형성
내포 복합체는 당분야에 공지된 임의의 적합한 수단으로 만들 수 있다. 가령, 내포 복합체는 미립자 혼합물과 착화제를 단순히 접촉시키거나, 혼합하거나, 또는 분산시켜 형성할 수 있다. 가령, 미립자 혼합물과 착화제는 이들 둘 모두 용해되는 용매, 미립자 혼합물 또는 착화제는 용해되지만 다른 하나는 분산되는 용매, 또는 미립자 복합물과 착화제가 분산되지만 내포 복합체를 안정화시키는 용매에서 혼합할 수 있다. 적절하게는, 내포 복합체는 중합체와 치료약물을 혼합하는데 사용된 용기와 동일한 용기에서 미립자 혼합물에 착화제를 첨가함으로써 형성한다. 제약학적 용도에서, 용매는 임의의 생리학적으로 수용가능한 수용액일 수 있다.
착화제는 내포 복합체를 형성하는 혼합물의 중합체에 존재하는 호스트 및/또는 게스트 기능분자의 몰에 대하여 임의의 몰비율로 혼합물 입자에 첨가된다. 일반적으로, 착화제는 호스트 및/또는 게스트 기능분자의 몰에 대하여 1:1 몰비율로 첨가된다. 더욱 낮은 몰비율(중합체에서 과잉 게스트 및/또는 게스트 기능분자)은 조성물이 적어도 한가지 착화제 및 중합체에서 적어도 한가지 호스트 또는 게스트 기능분자를 보유하고 내포 복합체를 형성하면 이용될 수 있다. 과잉 착화제 역시 사용될 수 있다. 전형적으로, 착화제 대 중합체 호스트 및/또는 게스트 기능분자 몰의 몰비율은 0.01:1 내지 1:0.01, 바람직하게는 0.5:1 내지 1:0.5이다. 다수 착화제가 사용되는 경우에, 개별 착화제의 몰비율은 조성물에 도입되기 원하는 기능분자에 의해 선택된다. 가령, 일정한 조성물에서 페길화된 안정화 착화제는 0.9:1 몰비율로 존재하고 리간드를 함유하는 착화제는 소량, 예를 들면, 전체 착화제의 1-2%로 존재할 수 있다. 전형적으로, 이런 조성물에서 착화제의 전체 함량은 전술한 범위에 내재한다.
4. 조성물 및 치료 방법
본원 발명의 치료 조성물은 고체, 액체, 현탁액 또는 에멀젼 형태로 만들 수 있다. 적절하게는, 본원 발명의 치료 조성물은 정맥내 주사할 수 있는 형태이다. 본원 발명에 따른 치료 조성물의 다른 투여 방식에는 경구 투여, 흡입, 국소 투여, 장관외, 정맥내, 비강내, 안구내, 두개내 또는 복강내 주사 및 폐 투여와 같은 당분야에 공지된 방법이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다. 투여 방법은 종종, 치료 조성물의 제형에 좌우된다. 투여에 앞서, 치료 조성물은 당분야에 공지된 임의의 수단, 예를 들면, 원심분리, 투석 및/또는 동결 건조로 분리 및 정제할 수 있다.
본원 발명은 본원 발명에 따른 치료 조성물의 효과량 및 생리학적으로 수용가능한 담체로 구성되는 제약학적 조성물에 관한다. 적합한 고체 또는 액체 갈레닉(galenic) 제형은 예로써 과립, 분말, 코팅된 정제, 마이크로캡슐, 좌약, 시럽, 엘렉시르, 현탁액, 에멀젼, 안약 또는 주사용액이다. 제약학적 조성물에 통상적으로 사용되는 첨가제에는 부형제, 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽창제, 윤활제, 향료, 감미료 또는 가용화제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 빈번하게 사용되는 첨가제는 예로써 탄산마그네슘, 이산화티타늄, 락토오스, 만니톨과 다른 당, 활석, 젖알부민, 젤라틴, 전분, 셀룰로오스와 이의 유도체, 동물과 식물 기름, 폴리에틸렌 글리콜, 용매이다. 용매에는 무균수 및 일가(monohydric) 또는 다가(polyhydric) 알코올(예, 글리세롤)이 포함된다.
사용되는 치료약물의 유형에 따라, 본원 발명의 치료 조성물은 선천적 또는 후천적 질환, 예를 들면, 낭포성 섬유증, 고셔병, 근이영양증, AIDS, 암(예, 다발성 골수종, 백혈병, 흑색종, 난소암종), 심혈관 질환(예, 진행성 심부전, 협착, 혈우병), 신경 질환(예, 뇌 외상)에 사용될 수 있다. 본원 발명에 따른 치료 방법은 본원 발명에 따른 치료 조성물의 치료요법적 효과량을 사람이나 포유동물에 투여하는 단계로 구성된다. 당업자가 인지하는 바와 같이 치료요법적 효과량은 사례별로 결정된다. 고려해야할 인자에는 치료 질환 및 이런 질환으로 고생하는 환자의 신체 특징이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
6. 다른 용도
본원 발명의 내포 복합체는 농업에 사용되는 화학약품을 전달하는 데에도 사용될 수 있다. 본원 발명의 다른 구체예에서, "치료약물"은 살균과 농업 용도로 사용되는 생물학적 활성 화합물이다. 이들 생물학적 활성 화합물에는 당분야에 공지된 화합물이 포함된다. 가령, 농업적으로 적합한 생물학적 활성 화합물에는 비료, 살균제, 제초제, 살충제, 살곰팡이제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 살균제는 상수도와 공업용수(예, 냉각수, 제지에서 백수 시스템)를 처리하는 용수-처리에도 사용된다. 미생물 공격이나 분해에 취약한 수성계(Aqueous system)는 가죽 산업, 직물 산업, 코팅이나 페인트 산업에서도 발견된다. 이런 살균제의 예 및 용도는 미국 특허 5,693,631, 6,034,081, 6,060,466에서 기술한다. 이들에서 밝힌 활성 작용제를 함유하는 조성물은 활성 성분 자체에 대하여 공지된 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 특히, 이런 용도는 제약학적 용도가 아니기 때문에, 혼합물의 중합체는 제약학적 용도에 요구되는 독성 프로필을 충족시킬 필요가 없다.
다음의 실시예는 본원 발명을 설명하기 위한 것으로, 본원 발명을 제한하지 않는다.
재료. β-사이클로덱스트린(Cerestar USA, Inc., Hammond, IN)은 사용에 앞서 120℃에서 진공(<0.1 mTorr)하에 12시간동안 건조시킨다. 비페닐-4,4'-디설포닐 클로라이드(Aldrich Chemical Company, Inc., Milwauke, WI)는 클로로포름/헥산으로부터 재결정화시킨다. 요오드칼륨은 막자사발과 막자로 분쇄하고 200℃ 오븐에서 건조시킨다. 모든 다른 시약은 상업적인 공급업자로부터 구하고 추가 정제없이 사용한다. 중합체 시료는 0.3M NaCl 또는 물을 용리액으로 하여, Anspec RI 검출기, Precision DLS 검출기, Progel-TSK G3000PWXL 칼럼이 구비된 Hitachi HPLC 시스템에서 1.0 ㎖min-1 유속으로 분석한다.
실시예 1: 비페닐-4,4'-디설포닐-A,D-Capped-β-사이클로덱스트린, 화합물 1(Tabushi et al. J. Am. Chem. Soc. 106, 5267-5270(1984))
자석 막대, Schlenk 어댑터, 격막(septum)이 구비된 500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 7.92 g(6.98 mmol) 건조 β-사이클로덱스트린 및 250 ㎖ 무수성 피리딘(Aldrich Chemical Company, Inc.)으로 채운다. 생성된 용액은 질소하에 50℃에서 교반하고, 2.204 g(6.28 mmol) 비페닐-4,4'-디설포닐 클로라이드를 15분 간격으로 4회 동등 분량으로 첨가한다. 50℃에서 추가로 3시간동안 교반한 이후, 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 물에서 0-40% 아세토니트릴의 농도 구배를 이용한 역상 칼럼 크로마토그래피를 실시한다. 분취량은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하고, 적합한 분취물은 모은다. 회전 증발기에서 아세토니트릴을 제거한 이후, 생성된 수성 현탁액은 동결 건조시킨다. 여기에서 무 색 고체로 3.39g(38%) 화합물 1을 수득한다.
실시예 2: 6A,6D-디요오드-6A,6D-디데옥시-β-사이클로덱스트린, 화합물 2(Tabusi et al. J. Am. Chem. 106, 4580-4584(1984))
자석 막대, Schlenk 어댑터, 격막(septum)이 구비된 40 ㎖ 원심분리 튜브는 1.02 g(7.2 mmol) 화합물 1, 3.54 g(21.3 mmol) 건조 분쇄된 요오드 칼륨(Aldrich), 15 ㎖ 무수성 N,N-디메틸포름아마이드(DMF)(Aldrich)로 채운다. 생성된 현탁액은 질소하에 80℃에서 2시간동안 교반한다. 실온으로 냉각한 이후, 고체는 여과로 분리하고, 상층액은 수거한다. 고체 침전물은 무수성 DMF의 두 번째 분량으로 세척하고, 상층액은 모으고 진공하에 농축시킨다. 그 다음, 잔류물은 14 ㎖ 물에 녹이고 얼음 용액기에서 냉각시키며, 이후 빠르게 교반하면서 0.75 ㎖(7.3 mmol) 테트라클로로에틸렌(Aldrich)을 첨가한다. 침전된 산물은 중등 유리 프릿에 여과하고 소량의 아세톤으로 세척하며, 이후 P2O5에서 진공하에 14시간동안 건조시킨다. 여기서 백색 고체로 0.90g(92%) 화합물 2를 수득한다.
실시예 3: 6A,6D-디아자이도-6A,6D-디데옥시-β-사이클로덱스트린, 화합물 3(Tabusi et al. Tetrahedron Lett. 18, 1527-1530(1997))
자석 막대, Schlenk 어댑터, 격막(septum)이 구비된 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 1.704 g(1.25 mmol) β-사이클로덱스트린 디요오드, 0.49g(7.53 mmol) 아자이드나트륨(EM Science, Gibbstown, NJ), 10 ㎖ 무수성 N,N-디메틸포름아마이드(DMF)로 채운다. 생성된 현탁액은 질소하에 60℃에서 14시 간동안 교반한다. 이후, 용매는 진공하에 제거한다. 생성된 잔류물은 충분한 물에 녹여 0.2M 염 용액을 만들고, 11.3g Biorad AG501-X8(D) 수지에 통과시켜 잔류 염을 제거한다. 그 다음, 용리액을 동결 건조시켜 백색 비결정성 고체로 1.232g(83%) 화합물 3을 수득하는데, 이는 추가 정제없이 다음 단계에 사용된다.
실시예 4: 6A,6D-디아미노-6A,6D-디데옥시-β-사이클로덱스트린, 화합물 4(Mungall et al., J. Org. Chem. 1659-1662(1975))
자석 막대와 격막(septum)이 구비된 250 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 1.232 g(1.04 mmol) β-사이클로덱스트린 비사자이드(bisazide)와 50 ㎖ 무수성 피리딘(Aldrich)으로 채운다. 이 교반 현탁액에 0.898g(3.42 mmol) 트리페닐포스핀을 첨가한다. 생성된 현탁액은 실온에서 1시간동안 교반하고, 이후 10 ㎖ 농축된 수성 암모니아를 첨가한다. 암모니아의 첨가는 신속 가스 방출로 달성하고, 용액은 동질해진다. 14시간후, 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 50 ㎖ 물로 연화(trituration)시킨다. 고체는 여과하고, 여과액은 10% HCl로 산성화시키고(pH<4), 이후 Toyopearl SP-650M(MH4 + 형태) 수지를 함유하는 이온 교환 칼럼에 가한다. 산물(4)은 0-0.5 M 중탄산 암모늄의 농도 구배로 용출한다. 적합한 분취물은 모으고 동결 건조시켜 비스(탄산수소)염으로 0.832g(71%) 산물(4)을 수득한다.
실시예 5: β-사이클로덱스트린-DSP 공중합체, 화합물 5
20 ㎖ 신틸레이션 바이알은 1 ㎖ 물에 녹인 화합물 4의 92.6 ㎎(7.65x10-5 mol) 비스(탄산수소)염 용액으로 채운다. 용액의 pH는 1M NaOH로 10으로 조정하고, 이후 1 ㎖ 클로로포름에 녹인 30.9 ㎎(7.65x10-5 mol) 디티오비스(숙시미니딜 프로피오네이트)(DSP, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) 용액을 첨가한다. 생성된 이상(biphasic) 혼합물은 Vortex 혼합기로 0.5시간동안 교반한다. 그 다음, 수층은 따라버리고 3 x 1㎖의 새로운 클로로포름으로 추출한다. 이후, 수성 중합체 용액은 물을 용리액으로 하여 Toyopearl HW-40F 수지에서 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 실시한다. 분취물은 GPC로 분석하고, 적합한 분취물은 동결 건조시켜 무색 비결정성 분말로 85 ㎎(85%)을 수득한다.
실시예 6: β-사이클로덱스트린-DSS 공중합체, 화합물 6
β-사이클로덱스트린-DSS 공중합체(화합물 6)는 DSP 시약 대신에 디숙시니미딜 수베레이트(DSS, Pierce chemical Co., Rockford, IL)를 사용한 점을 제외하고, DSP 중합체(화합물 5)와 유사한 방식으로 합성된다. 화합물(6)은 67% 수율로 수득된다.
실시예 7: β-사이클로덱스트린-DTBP 공중합체, 화합물 7
20 ㎖ 신틸레이션 바이알은 1 ㎖ 물에 녹인 화합물 4의 91.2 ㎎(7.26x10-5 mol) 비스(탄산수소)염 용액으로 채운다. 용액의 pH는 1M NaOH로 10으로 조정하고, 이후 22.4 ㎎(7.26x10-5 mol) 디메틸 3,3'-디티오비스(프로피온이미데이트)ㆍ2HCl(DTBP, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) 용액을 첨가한다. 생성된 동질성 용액은 Vortex 혼합기로 0.5시간동안 교반한다. 이후, 수성 중합체 용액은 Toyopearl HW-40F 수지에서 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 실시한다. 분취물은 GPC로 분석하고, 적합한 분취물은 동결 건조시켜 무색 비결정성 분말로 67 ㎎(67%)을 수득한다.
실시예 8: 폴리에틸렌 글리콜(PEG)600 이산(diacid) 클로라이드, 화합물 8
Figure 112003021806745-pct00043
자석 막대와 격막(septum)이 구비된 50 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 5.07 g(ca. 8.4 mmol) 폴리에틸렌 글리콜 600 이산(diacid)(Fluka Chemical Corp., Milwauke, WI)과 10 ㎖ 무수성 클로로포름(Aldrich)으로 채운다. 이 교반 용액에 3.9 ㎖(53.4 mmol) 티오닐 클로라이드(Aldrich)를 첨가하고, 생성된 용액은 1시간동안 환류로 가열하는데, 이 시간동안 가스 방출이 분명하다. 생성된 용액은 실온으로 냉각시키고, 이후 용매와 과량의 티오닐 클로라이드는 진공하에 제거한다. 생성된 오일은 건조 상자에 저장하고 추가 정제없이 사용한다.
실시예 9: β-사이클로덱스트린-PEG 600 공중합체, 화합물 9
Figure 112003021806745-pct00044
20 ㎖ 신틸레이션 바이알은 6A,6D-디아미노-6A,6D-디데옥시-β-사이클로덱스트린(화합물 4)의 112.5 ㎎(8.95x10-5 mol) 비스(탄산수소)염, 50 ㎕(3.6x10-4 mol) 트리에틸아민(Aldrich), 5 ㎖ 무수성 N,N-디메틸아세트아마이드(DMAc, Aldrich)의 용액으로 채운다. 이후, 생성된 현탁액은 58 ㎎(9.1x10-5 mol) 폴리에틸렌 글리콜600 이산(diacid) 클로라이드(화합물 8)로 처리한다. 생성된 용액은 Vortex 혼합기로 5분동안 교반하고, 이후 25℃에서 1시간동안 방치하는데, 이 시간동안 균질해진다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 물을 용리액으로 하여 Toyopearl HW-40F 수지에서 겔 투과 크로마토그래피를 실시한다. 분취물은 GPC로 분석하고, 적합한 분취물은 동결 건조시켜 무색 비결정성 분말로 115 ㎎(75%)을 수득한다.
실시예 10: 6A,6D-비스-(2-아미노에틸티오)-6A,6D-디데옥시-β-사이클로덱스트린(화합물 10)(Tabushi, I: Shimokawa, K; Fugia, K. Tetrahedron Lett. 1977, 1527-1530)
Figure 112003021806745-pct00045
자석 막대와 격막(septum)이 구비된 25 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 에탄올에 녹인 0.91 ㎖(7.37 mmol)의 0.81M 소디움 2-아미노에틸티올레이트 용액으로 채운다(Fieser, L.F.; Fiester, M. Reagents for Organic Synthesis; Wiley: New York, 1967; Vol. 3, pp. 265-266). 용액은 증발 건조시키고, 고체는 5 ㎖ 무수성 DMF(Aldrich)에 다시 용해시킨다. 6A,6D-디요오드-6A,6D-디데옥시-β-사이클로덱스트린(화합물 2)(100 ㎎, 7.38x10-5 mol)을 첨가하고, 생성된 현탁액은 질소하에 60℃에서 2시간동안 교반한다. 실온으로 냉각한 이후, 용액은 진공하에 농축하고, 잔류물은 물에 다시 용해시킨다. 0.1N HCl로 산성화시킨 이후, 용액은 Toyopearl SP-650M 이온-교환 칼럼(MH4 + 형태)에 가하고, 산물은 0-0.4 M 중탄산 암모늄 농도 구배로 용출한다. 적합한 분취물은 모으고 동결 건조시킨다. 여기서 백색 분말로 80㎎(79%) 화합물 10을 수득한다.
디시스테아민 β-CD(화합물 10)의 대안적 합성
탈가스된 100 ㎖ 물에 녹인 화합물 2의 4.69(3.17 mmol) 용액에 새로 정화된 시스테아민 0.489 g(6.34 mmol)을 첨가한다. 용액은 환류하에 2시간동안 교반한 다. 실온으로 냉각하고 1N HCl로 산성화시킨 이후, 용액은 Toyopearl SP-650M 이온-교환 칼럼(MH4 + 형태)에 가하고, 산물은 0-0.2 M 중탄산 암모늄 농도구배로 용출한다. 적합한 분취물은 모으고 동결 건조시킨다. 여기서 1.87 g(39% 수율) 백색 고체를 수득한다. 상기 고체는 TLC(실리카겔, n-PrOH-AcOEt-H2O-NH3aq5/3/3/1, 닌하이드린에 의한 검출)로 특성화되는데, 화합물 10에 상응하는 주요 스팟을 보인다. 매트릭스-보조된 레이저 고분해능 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 비행시간(TOF) 질량 스펙트럼은 PerSeptive Biosystems, Inc.에서 제공한 2미터 ELITE 장치에 기록한다. 화합물 3에서 계산된 MALDI-TOF m/z: 1252, found: 1253.5[M+H}+, 1275.5{M+Na]+, 1291.4[M+K]+, 13C NMR(Bruker 500 MHZ, D2O) δppm: 32.1(S-CH2)과 38.8(CH2-NH2), 32.9(S에 인접한 C6), 60.2(OH에 인접한 C6), 70.8, 71.4, 72.5(C2, C3, C5), 81.8(C4), 101.7(C1).
실시예 11: β-사이클로덱스트린(시스타민)-DTBP 공중합체, 화합물 11
Figure 112003021806745-pct00046
4 ㎖ 바이알은 0.5 ㎖의 0.1M NaHCO3에 녹인 화합물 10의 19.6 ㎎(1.42x10-5 mol) 비스(탄산수소)염 용액으로 채운다. 용액은 얼음 용액기에서 냉각시키고, 이후 4.4 ㎎(1.4x10-5 mol) 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트-2HCl(DTBP, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)를 첨가한다. 생성된 용액은 Voltex 혼합기로 교반하고, 1시간동안 0℃로 방치한다. 반응은 1M Tris-HCl로 중단시키고, 이후 0.1N HCl로 pH 4로 산성화시킨다. 그 다음, 수성 중합체 용액은 Toyopearl HW-40 수지에서 겔 투과 크로마토그래피를 실시한다. 분취물은 GPC로 분석하고, 적합한 분취물은 동결 건조시킨다. 여기서 백색 분말로 21.3 ㎎(100%) 화합물 11을 수득한다.
실시예 12: β-사이클로덱스트린(시스타민)-DMS 공중합체, 화합물 12
Figure 112003021806745-pct00047
자석 막대와 격막(septum)이 구비된 10 ㎖ Shlenk 플라스크는 200 ㎎(1.60x10-4 mol) 화합물 10, 44 ㎕(3.2x10-4 mol) 트리에틸아민(Aldrich Chemical Co,m Milwauke, WI), 43.6 ㎎(1.60x10-4 mol) 디메틸수베르이미데이트ㆍ2HCl(DMS, Pierce Chemical Co., Rockford, IL), 3 ㎖ 무수성 DMF(Aldrich Chemical Co, Milwauke, WI)로 채운다. 생성된 슬러리는 지속적인 질소 흐름하에 18시간동안 80℃로 가열하는데, 이 시간동안 대부분의 용매가 증발된다. 남아있는 잔류물은 10 ㎖ 물에 다시 용해시키고, 생성된 용액은 10% HCl로 pH 4로 산성화시킨다. 이후, 상기 용액은 Amicon Centricon Plus-20 5,000 NMWL 원심분리 필터에 통과시킨다. 2x10 ㎖ 물로 세척한 이후, 중합체 용액은 동결 건조시켜 41.4 ㎎(18%) 회색이 도는 흰색의 비결정질성 고체를 수득한다.
대안적 합성:
β-사이클로덱스트린(시스타민)-DMS 공중합체는 기존 문헌(Gonzalez, et al. 1999)에서 보고된 바와 같이 합성한다. 전형적인 실험에서, 25 ㎖ 바이알은 500 ㎕의 0.5M Na2CO3에 용해된 디시스테아민 β-CD(화합물 10)(399.6 ㎎, 0.269 mmol)의 비스(탄산수소)염 용액으로 채운다. 디메틸수베르이미데이트ㆍ2HCl(DMS, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; 73.5 ㎎, 0.269 mmol)을 첨가하고, 용액은 짧게 원심분리하여 구성 요소를 용해시킨다. 생성된 혼합물은 25℃에서 15시간동안 교반한다. 이후, 혼합물은 10 ㎖ 물로 희석하고, pH는 1N HCl을 첨가하여 4이하로 낮춘다. 그 다음, 상기 용액은 dH2O에서 Spectra/Por 7 MWCO 3500 투석막(Spectrum)에 24시간동안 투석한다. 투석된 용액은 동결 건조시킨다. 13C NMR(Bruker 500 MHZ, D2O) δppm: 25.8, 26.0, 27.0, 28.7, 29.9, 32.2, 37.5, 38.1, 41.1, 60.0, 71.6.72.3, 72.6, 80.8, 101.4, 167.9.
실시예 13: 플라스미드와 고정된 영구 하전된 공중합체 복합체형성
일반적으로, 물에 녹인 고정된 동일 부피의 하전 CD-중합체와 DNA 플라스미드 용액은 적절한 중합체/플라스미드 전하 비율로 혼합한다. 이후, 혼합물은 실온에서 평형화되고 자가-조합된다. 복합체형성(complexation) 성공은 소량의 혼합물을 0.6% 아가로즈 겔에 이전하고 DNA 이동성을 조사하여 모니터한다. 유리 DNA는 가해진 전압하에 이동하는 반면, 고정된 DNA는 웰에서 지체된다.
증류수에서 1 ㎍ DNA는 중합체 아민에서 10 ㎕ 공중합체(화합물 12)와 0.1 ㎍/㎕ 농도로 혼합된다: 2.4, 6, 12, 24, 36, 60, 120의 DNA 인산염 전하 비율. 1 ㎍/㎕ 적하 완충액(40% 자당, 0.25% 브로모페놀 블루, 5 mM EDTA-함유 200 mM Tris-아세테이트 완충액(Gao et al., Biochemistry 35: 1027-1036(1996))은 각 용 액에 첨가한다. 각 DNA/중합체 시료는 1xTAE 완충액(40 mM Tris-아세테이트/1 mM EDTA)에서 6 ㎍ EtBr/100㎖를 함유하는 0.6% 아가로즈 전기영동 겔에 적하하고, 1시간동안 겔에 40V를 가한다. DNA/중합체 복합체형성의 정도는 겔 이동 패턴에서 DNA 지체로 나타난다. 공중합체(12)는 2이상의 전하 비율로 DNA를 지체시키는데, 이는 이들 조건하에 복합체형성을 암시한다.
실시예 14: 루시페라제 리포터 유전자를 인코드하는 플라스미드로 트랜스펙션 연구
BHK-21 세포는 트랜스펙션 24시간전에 60,000 세포/웰의 세포 밀도로 24 웰 평판에 도말한다. 루시페라제 유전자를 인코드하는 플라스미드는 실시예 13에서처럼 CD-중합체와 혼합한다. DNA/중합체 복합체를 함유하는 배지 용액은 배양된 세포에 첨가하고 37℃에서 24시간 배양한 이후 새로운 배지로 교체한다. 세포는 트랜스펙션 48시간이후에 용해시킨다. 루시페라제 광 분석에 적합한 기질을 세포 용해질에 첨가한다. 발생된 광 단위의 측면에서 측정된 루시페라제 활성은 발광계로 정량한다. DNA/중합체 복합체는 3이상의 전하 비율에서 BHK-21 세포를 성공적으로 트랜스펙션시키고, 40의 중합체 아민:DNA 인산염 전하 비율에서 최대 트랜스펙션을 보인다. 세포 용해질은 또한, Lowry 단백질 분석으로 세포 생존능을 측정하는데 사용된다(Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 193, 265-275(1951)). 최대 40의 전하 비율까지 독성은 관찰되지 않았다.
실시예 15: β-사이클로덱스트린(시스타민)-DMA 공중합체, 화합물 13의 합성
Figure 112003021806745-pct00048
자석 막대가 구비된 20 ㎖ 신틸레이션 바이알은 180 ㎎(0.131 mmol) 화합물 10과 32 ㎎ 디메틸 아디피미데이트(DMA, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)로 채운다. 여기에 500 ㎕의 0.5M Na2CO3을 첨가한다. 생성된 용액은 박막으로 둘러싸고 하룻밤동안 교반한다. 이후, 혼합물은 0.1N HCl로 산성화시키고 2일동안 Spectrapor MWCO 3,500 막으로 투석하며 동결 건조시켜 41 ㎎의 백색 비결정질성 고체(Mw=6 kDa, 광 분산으로 측정)를 수득한다.
실시예 16: β-사이클로덱스트린(시스타민)-DMP 공중합체, 화합물 14의 합성
Figure 112003021806745-pct00049
자석 막대가 구비된 20 ㎖ 신틸레이션 바이알은 160 ㎎(0.116 mmol) 화합물 10과 30.1 ㎎ 디메틸 피멜리미데이트(DMA, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)로 채운다. 여기에 500 ㎕의 0.5M Na2CO3을 첨가한다. 생성된 용액은 박막으로 둘러싸고 하룻밤동안 교반한다. 이후, 혼합물은 0.1N HCl로 산성화시키고 2일동안 Spectrapor MWCO 3,500 막으로 투석하며 동결 건조시켜 22 ㎎의 백색 비결정질성 고체(Mw=6 kDa, 광 분산으로 측정)를 수득한다.
실시예 17: β-사이클로덱스트린(시스타민)-PEG600 공중합체, 화합물 15
Figure 112003021806745-pct00050
자석 막대, Schlenk 어댑터, 격막(septum)이 구비된 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 1.564 g(1.25 mmol) 화합물 10과 25 ㎖의 새로 증류된 디메틸아세트아마이드(DMAc, Aldrich)로 채운다. 상기 슬러리에 0.7 ㎖(4 eq) 트리에틸아민 및 5 ㎖ DMAc에 녹인 화합물 8(2.39, 3.75 eq) 용액을 첨가한다. 생성된 용액은 Voltex 혼합기로 5분동안 교반하고, 이후 25℃에서 1시간동안 방치하는데, 이 시간동안 균질해진다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 물을 용리액으로 하여 Toyopearl HW-40F 수지에서 겔 투과 크로마토그래피를 실시한다. 분취물은 GPC로 분석하고, 적합한 분취물은 동결 건조시켜 무색 비결정성 분말을 수득한다.
실시예 18: β-사이클로덱스트린-토실레이트, 화합물 16의 합성(Melton, L.D., and Slessor, K. N., Carbohydrate Research, 18, p. 29(1971))
Figure 112003021806745-pct00051
자석 막대, 진공 어댑터, 격막(septum)이 구비된 500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 건조 β-사이클로덱스트린(8.530 g, 7.51 mmol)과 200 ㎖ 건조 피리딘의 용액으로 채운다. 상기 용액은 0℃로 냉각시키고, 이후 1.29 g(6.76 mmol) 토실 클로라이드를 첨가한다. 생성된 용액은 하룻밤동안 실온으로 데운다. 피리딘은 가능한 진공에서 제거한다. 이후, 생성된 잔류물은 40 ㎖ 뜨거운 물로부터 2회 재결정화시켜 7.54(88%)의 백색 결정성 고체를 수득한다.
실시예 19: β-사이클로덱스트린-요오드, 화합물 17의 합성
Figure 112003021806745-pct00052
자석 막대와 Schlenk 어댑터가 구비된 둥근 바닥 플라스크는 화합물 16, 15 당량의 요오드칼륨, DMF로 채운다. 생성된 혼합물은 80℃에서 3시간동안 가열하고, 이후 반응물 실온으로 냉각시킨다. 그 다음, 혼합물은 여과하여 침전물을 제거하고, 여과액은 증발 건조시키고 0℃에서 물에 다시 용해시킨다. 테트라클로로에틸렌을 첨가하고, 생성된 슬러리는 0℃에서 활발하게 20분동안 교반한다. 고체는 중등 유리 프릿에서 수거하고 아세톤으로 연화시키며 P2O5에 저장한다.
실시예 20: β-사이클로덱스트린-티올-PEG 부가된 중합체, 화합물 18의 합성
1 단계: β-사이클로덱스트린-티올의 합성(K. Fujita, et al., Bioorg. Chem., Vol. 11, p. 72(1982) and K. Fujita, et al., Bioorg. Chem., Vol. 11,p. 108(1982))
자석 막대와 Schlenk 어댑터가 구비된 50 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 1.00 g(0.776 mmol) 화합물 16, 0.59 g(7.75 mmol) 티오우레아(Aldrich), 7.8 ㎖의 0.1N NaOH 용액으로 채운다. 생성된 혼합물은 질소하에 80℃에서 6시간동안 가열한다. 이후, 0.62 g(15.5 mmol) 수산화나트륨을 첨가하고, 반응 혼합물은 질소하에 80℃에서 추가로 1시간동안 가열한다. 반응은 실온으로 냉각하고, 이후 10% HCl로 pH 4.0으로 산성화시킨다. 전체 용액 부피는 20 ㎖가 되게 하고 얼음 용액기에서 냉각하며, 이후 0.8 ㎖ 테트라클로로에틸렌을 첨가한다. 반응 혼합물은 0℃에서 0.5시간동안 활발하게 교반하고, 이후 침전된 고체는 가는 유리 프릿에서 수거한다. 고체는 하룻밤동안 바람을 불어넣어 0.60 g(67%) 백색 비결정질성 고체를 얻는다.
2 단계: 자석 막대와 환류 응축기가 구비된 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크는 1 단계에서 얻은 2.433 g(2.11 mmol) β-사이클로덱스트린-티올, 0.650 g 기능화된 PEG(펜던트 올레핀을 보유하는 PEG, Yoshiyuki Koyama of Otsuma Women's University, Tokyo, Japan), 50 ㎖ dH2O로 채운다. 생성된 혼합물은 환류에서 12시간동안 가열하고, 이 시간동안 β-사이클로덱스트린-티올이 용해된다. 반응 혼합물은 실온으로 냉각시키고, 침전된 고체는 원심분리로 제거한다. 상층액은 Spectra/Por 7 MWCO 1,000 막에 투석한다. 용액은 동결 건조시켜 비결정성 백색 고체를 수득한다.
Figure 112003021806745-pct00053
Figure 112003021806745-pct00054
실시예 21: 분지된 PEI-사이클로덱스트린 중합체, 화합물 19의 합성
자석 막대가 구비된 20 ㎖ 신틸레이션 바이알은 분지된 PEI(25 kD, Aldrich)와 화합물 17로 채운다. 여기에 탈가스된 탄산나트륨 완충액을 첨가한다. 생성된 용액은 80℃에서 4시간동안 교반한다. 혼합물은 0.1 N HCl로 산성화시키고 Spectra/Por MWCO 3,500 막에 2일동안 투석하며 동결 건조시킨다.
실시예 21B: PEI-사이클로덱스트린 가교결합된 중합체의 합성
분지된 PEI(Mw 1200, Aldrich)와 이중기능화된 사이클로덱스트린 단량체 2(1 eq)는 건조 DMSO에서 혼합한다. 혼합물은 80℃에서 4일동안 교반하고, 이후 Spectra/Por MWCO 10,000 막에 2일동안 투석하며 동결 건조시킨다.
실시예 22: Ad-PEG3400-Ad의 합성
240 ㎎ 1-아미노아다만테인(1.60 mmol, Aldrich)과 288 ㎎ PEG3400(SPA)2(0.085 mmol, Shearwater Polymers)는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가한다. 여기에 5 ㎖ 디클로로메탄을 첨가하고, 용액은 하룻밤동안 교반한다. 다음날, 용액은 여과하여 n-하이드록시숙시니미드 부산물을 제거하고, 디클로로메탄은 진공하에 제거한다. 잔류물은 물에 용해하고 원심분리하여 과량의 1-아미노아다만테인을 제거한다. 이후, 상층액은 Pierce의 Slide-A-Lyzer(MWCO=3500)에서 하룻밤동안 투석한다. 용액은 동결 건조시켜 백색의 솜털모양 고체로 248 ㎎ Ad-PEG3400-Ad를 수득한다.
실시예 23: Ad-PEG3400-NH2의 합성
347 ㎎ FMOC-PEG3400-NH2(0.110 mmol, Shearwater Polymers)와 155 ㎎ 1-아미노아다만테인(1.0 mmol, Aldrich)은 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가한다. 여기에 5 ㎖ 디클로로메탄을 첨가하고, 생성된 용액은 하룻밤동안 교반한다. 다음날, 용액은 여과하여 n-하이드록시숙시니미드 부산물을 제거하고, 디클로로메탄은 진공하에 제거한다. 잔류물은 물에 용해하고 여과하여 반응하지 않은 1-아미노아다만테인을 제거한다. 이후, 용액은 동결 건조시켜 물을 제거한다. FMOC 작용기는 DMF에 녹인 20% 피페리딘에 생성 고체를 20분동안 용해시켜 제거한다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 물에 다시 용해시킨다. 용액은 원심분리하여 분해되지 않은 FMOC를 제거하고, 이후 Pierce의 Slide-A-Lyzer(MWCO=3500)에서 하룻밤동안 투석한다. 그 다음, 용액은 동결 건조시켜 백색의 솜털모양 고체로 219 ㎎ Ad- PEG3400-NH2를 수득한다.
실시예 24: 아다만테인-PEG3400-NH2(Ad-PEG3400-NH2)
266 ㎎ FMOC-PEG3400-NHS(78.2 μmol, Shearwater Polymers, Huntville AL)는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가한다. 이후, 3 ㎖ 오프디클로로메탄에 용해된 10 eq. 1-아다만테인-메틸아민(1.5 mmol, Aldrich)을 첨가하고, 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반한다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류 용액에 물을 첨가하여 PEG 산물을 용해시킨다. 용액은 20K rcf에서 10분동안 원심분리하는데, 여기서 아다만테인-메틸아민은 더욱 농밀한 액체로 상-분리된다. 수성 부분은 수거하고, 물은 진공하에 제거한다. 남아있는 점성 액체는 FMOC 탈보호를 위하여 DMF에 녹인 20% 피페리딘에 다시 용해시키고 실온에서 30분동안 교반한다. 용매는 진공하에 제거하고 DMF로 수회 세척하며 물에 다시 용해시키고 음이온 교환 칼럼에 작동시켜 반응하지 않는 PEG를 제거한다. 첫 번째 분취물은 수거하고 동결 건조시켜 백색의 솜털모양 분말(76% 수율)로 222 ㎎의 원하는 산물을 수득한다(MALDI-TOF 분석으로 확증).
실시예 25: 아다만테인-PEG3400-락토오스(Ad-PEG3400-Lac)
실시예 24에서 만들어진 60 ㎎ Ad-PEG3400-NH2(16.8 μmol)와 5.0 eq 락토오스-모노숙시니미딜(50 ㎎, Pierce, Rockford, IL)은 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가한다. 이후, 2 ㎖의 50 mM NaHCO3을 첨가하고, 생성된 용액은 하 룻밤동안 교반한다. 아민의 반응은 아민 농도를 측정하는 TNBS 분석으로 모니터한다. 아민의 반응 완결(99% 아민 반응)직후, 용액은 투석관(Slide-A-Lyzer, MWCO=3500, Pierce)으로 이전하고 물에서 24시간동안 투석하며 동결 건조시켜 65.1 ㎎ 백색의 솜털모양 분말(93% 수율)을 수득한다.
실시예 26: Ad-PEG5000의 합성
279 ㎎ PEG5000-NHS(0.053 mmol, Shearwater Polymers)는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가한다. 여기에 3 ㎖ 디클로로메탄에 용해된 46 ㎕ 1-아다만테인 메틸아민(0.42 mmol, Aldrich)을 첨가하고, 용액은 하룻밤동안 교반한다. 다음날, 용액은 여과하여 n-하이드록시숙시니미드 부산물을 제거하고, 디클로로메탄은 진공하에 제거한다. 잔류물은 물에 용해하고 원심분리한다. 과량의 1-아다만테인 메틸아민은 상-분리하고, 상부 수상은 제거하고 Pierce의 Slide-A-Lyzer(MWCO=3500)에서 하룻밤동안 투석한다. 이후, 용액은 동결 건조시켜 백색의 솜털모양 고체로 253 ㎎ Ad-PEG5000을 수득한다. 상기 산물은 Richard Scientific ELS 검출기와 C18 칼럼이 구비된 Beckman Gold HPLC 시스템에서 분석하는데 순수한 것으로 확인되었다(PEG5000-NHS의 머무름 시간: 10.7 min; 산물의 머무름 시간: 12.0 min; 아세토니트릴/물 농도구배).
대안적 합성: 아다만테인-PEG5000(AD-PEG5000)
674 ㎎ PEG5000-NHS(135 μmol, Shearwater Polymers)는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가한다. 10 ㎖ 디클로로메탄에 용해된 5 eq. 1-아다만테인 메틸아민(675 μmol, Aldrich)을 첨가하고, 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반한다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류 용액에 물을 첨가한다. 용액은 20K rcf에서 10분동안 원심분리하는데, 여기서 아다만테인-메틸아민은 더욱 농밀한 액체로 상-분리된다. 수성 부분은 수거하고, 물에서 24시간동안 투석한다(Slide-A-Lyzer, MWCO=3500). 용액은 동결 건조시켜 530 ㎎ 백색의 솜털모양 분말(75% 수율, 하기에 도시된 산물)을 수득한다. 상기 산물은 Richard Scientific ELS 검출기와 C18 칼럼이 구비된 Beckman Gold HPLC 시스템에서 분석하는데 순수한 것으로 확인되었다(PEG5000-NHS의 머무름 시간: 10.7 min; 산물의 머무름 시간: 12.0 min; 아세토니트릴/물 농도구배). AD-PEG3400은 유사한 프로토콜로 합성된다(56% 수율; Maldi-TOF 분석으로 확증).
Figure 112003021806745-pct00055
실시예 27: 아다만테인-(PEG5000)2(Ad-(PEG5000)2)
315 ㎎ (PEG5000)2-NHS(30 μmol, Shearwater Polymers)는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가한다. 3 ㎖ DCM에 용해된 10 eq. 1-아다만테인 메틸아민(300 μmol, Aldrich)을 첨가하고, 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반한다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류 용액에 물을 첨가하여 PEG 산물을 용해시킨다. 용액은 20K rcf에서 10분동안 원심분리하는데, 여기서 아다만테인-메틸아민은 더욱 농밀한 액체로 상-분리된다. 수성 부분은 수거하고, 물에서 24시간동안 투석한다(Slide-A-Lyzer, MWCO=3500). 용액은 동결 건조시켜 286 ㎎ 백색의 솜털모양 분말(91% 수율)을 수득한다.
실시예 28: 아다만테인-PEG3400-플루레신(Ad-PEG3400-FITC)
20 ㎎ Ad-PEG3400-NH2는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에서 3 ㎖ 0.01M Na2CO3에 용해시킨다. 상기 용액에 DMSO(4 ㎎/㎖, 1.6 ㎖)에 녹인 3 eq 플루레신 이소티오시아네이트(FITC, Sigma)를 첨가하고, 생성된 용액은 암실에서 하룻밤동안 교반하고, 이후 투석관(MWCO=3500)으로 이전하고 암실에서 물에 대하여 48시간동안 투석한다. 용액은 수거하고 동결 건조시켜 23 ㎎ 황색의 솜털모양 고체를 수득한다. PEG3400-FITC는 동일한 프로토콜로 PEG3400-NH2(Shearwater Polymers)로부터 23 ㎎의 대조 중합체로 합성한다.
실시예 29: GALA 펩티드의 합성
GALA 펩티드(서열: W-E-A-A-L-A-E-A-L-A-E-A-L-A-E-H-L-A-E-A-L-A-E-A-L-E- A-L-A-A, MW 3032)는 자동 서열화기를 이용한 Biopolymer Synthesis Facility(Beckman Institute, California Institute of technology)로 합성한다. 수지로부터 펩티드를 절단하기에 앞서, 수지의 1/3은 아다만테인 공액을 위하여 남겨둔다. HPLC에 의한 펩티드의 분석은 95%이상의 순도를 암시한다. L-아다만테인-카르복실산(Aldrich)은 DCC 결합 화학으로 GALA-펩티드의 N-말단에 공액한다. 생성된 펩티드(GALA-Ad, MW 3194)는 수지로부터 절단한다. HPLC에 의한 상기 펩티드의 분석은 90%이상의 순도를 암시한다. 펩티드의 실체는 MALDI-TOF 분석(Biopolymer Analysis Facility, Beckman Institutem California Institute of Technology)으로 확증한다.
실시예 30: GALA 펩티드를 이용한 본원 발명에 따른 조성물의 제조
플라스미드와 올리고뉴클레오티드. SV40 프로모터의 조절하에 루시페라제 유전자를 보유하는 플라스미드 pGL3-CV(Promega, Madison, WI)는 대장균(Esherichia Coli)으로 증폭하고 Qiagen의 엔도톡신-없음 Megaprep 키트(Valencia, CA)로 정제한다. 플루레신-표지된 올리고뉴클레오티드(FITC-올리고, 25-mer, 5'-FITC-ACT GCT TAC CAG GGA TTT CAG TGC A-3')는 Biopolymer Synthesis Facility(California Institute of Technology)로 합성한다.
입자 형성과 특성화. 본원 발명의 조성물은 적합한 전하 비율로 동등 부피의 화합물 12(dH2O에 용해됨)와 DNA(dH2에서 0.1 ㎎/㎖)를 혼합하여 준비한다. 이후, 50 mM 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2)에 용해된 동등 부피의 GALA 또는 GALA-Ad를 복합체에 첨가한다. 가령, 입자 특성화 연구에서 2 ㎍ 플라스미드 DNA(20 ㎕)는 5+/- 전하 비율로 화합물 12(20 ㎖)와 복합된다. 그 다음, 20 ㎕ GALA 용액, GALA-Ad 용액 또는 50 mM PBS(대조 시료)를 복합체에 첨가한다. 이후, 용액은 1.2 ㎖ dH2O 첨가로 희석한다. 입자의 크기와 전하는 ZetaPals 동적 광 분산 검출기(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY)를 이용한 각각 동적 광 분산과 제타 전위 측정으로 결정한다. 이들 수치의 평균 ㅁ표준 편차로 표시된 이들 결과는 도 2에 도시한다. 5+/- 전하 비율에서 만들어진 화합물 12/pGL3-CV 조성물의 유체역학적 직경은 동적 광 분산으로 측정하는데, 260 nm로 확인되었다. 20 ㎕에서 2 ㎍ 플라스미드 DNA는 5+/- 전하 비율에서 동등 부피의 화합물 12와 혼합한다. 이후, 다양한 비율의 GALA 또는 GALA-Ad를 입자에 첨가한다. 유체역학적 직경은 광 분산 측정으로 결정한다. 결과는 3회 측정의 평균 ㅁ표준 편차로 표시한다. GALA 펩티드는 pH 7.5에서 수용성 무작위 코일 입체형태로부터 pH 5에서 수용성 나선으로 전이된다. GALA와 아다만테인-변형된 GALA(GALA-Ad) 펩티드는 50 mM PBS(pH 7.2)에 용해시키고 다양한 펩티드/사이클로덱스트린 비율로 치료 조성물에 첨가한다. 혼합물은 dH2O로 희석하고, 입자 크기는 동적 광 분산으로 결정한다(도 2). 도 2는 GALA의 유체학적 직경(파선) 및 GALA-Ad 변형된 폴리플렉스의 유체학적 직경(실선)을 도시한다.
결과. 입자 계수율(count rate)이 첨가된 펩티드의 모든 농도에서 동일하기 때문에, 펩티드의 첨가는 조성물을 파괴시키지 않는 것으로 보인다. GALA와 GALA-Ad 첨가의 함수로서 입자 크기 프로필은 매우 유사하다. 유체역학적 직경은 250 nm(1% GALA 또는 GALA-Ad) 내지 400 nm(10% GALA 또는 GALA-Ad)에서 증가한다. 더욱 많은 펩티드가 첨가됨에 따라, 입자 크기는 변형되지 않은 치료 조성물의 크기로 다시 줄어든다. 직경은 30%이상 GALA-Ad 및 50%이상 GALA의 첨가로 대략 250 nm까지 복귀한다(도 2).
실시예 31: GALA-변형된 조성물의 BHK-21 세포로의 흡수
세포 배양. BHK-21 세포는 ATCC(Rockville, MD)로부터 구입하고 HUH-7 세포는 Valigen(Rockville, MD)으로부터 기부받았다. 양 세포주는 37℃ 5% CO2에서 작동하는 가습 배양기에서, 10% 우태아혈청, 100 단위/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/㎖ 암포테리신으로 보충된 DMEM에 배양하고 4-5일마다 계대배양한다. 배지와 보충물질은 Gibco BTL(Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다.
배양된 세포에 의한 치료 조성물 흡수. BHK-21 세포는 150,000 세포/웰로 6-웰 평판에 도말하고 37℃에서 24시간동안 배양한다. 5 ㎍ FITC-올리고는 5+/- 전하 비율로 화합물 12와 복합시킨다. 5분간의 복합체형성 시간이후에, 50 mM PBS(pH 7.2)에 녹인 50 ㎕ GALA 또는 GALA-Ad를 복합체에 첨가한다. 배지는 세포로부터 제거하고, 세포는 PBS로 세척한다. 트랜스펙션을 위하여, 900 ㎕ Optimen을 각 치료 조성물 용액에 첨가하고, 전체 용액을 세포로 옮긴다. 세포는 5시간동안 트랜스펙션 혼합물과 함께 배양하고, 이후 배지를 제거하고 세포는 PBS로 2회 세척한다. 세포는 트립신처리(trypsinization)로 수거하고 FAC 분석을 준비한다. 세포는 세척 완충액(DNase와 MgCl2를 함유하는 한크 균형 염 용액)에서 2회 세척하고, 500 ㎕ FACS 완충액(한크 균형 염 용액, 2.5 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민, 10 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드)에 재현탁시킨다. FACS 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)와 CellQuest 소프트웨어로 실시한다. 결 과는 도 4에 도시한다. 도 4 a-d에 도시된 바와 같이, BHK-21 세포(4a)는 화합물 12/FITC-올리고(4b), 화합물 12/FITC-올리고/50% GALA(4c), 화합물 12/FITC-올리고/50%GALA-Ad(4d)로 트랜스펙션시킨다. 흡수는 유세포 분석법으로 확인한다. 데이터는 형광 프로필로 제시하는데, 세포 개체수는 y-축을 따라 플랏하고 플루레신 형광 강도는 x-축을 따라 플랏한다.
실시예 32: 변형된 복합체의 제타 전위
20 ㎕에서 2 ㎍ 플라스미드 DNA는 5+/- 전하 비율에서 동등 부피의 화합물 12와 혼합한다. 다양한 비율의 GALA 또는 GALA-Ad는 다양한 펩티드/CD 비율로 입자에 첨가하고 dH2O로 희석한다. 입자 전하는 전기이동도 측정으로 결정하고 입자 제타 전위(mV)로 표시한다. 5+/- 전하 비율에서 화합물 12/pGL3-CV 조성물의 입자 전하는 제타 전위 측정으로 결정하는데, +13 mV로 확인되었다. 펩티드의 존재하에 입자의 제타 전위를 측정하고, 결과는 3회 측정의 평균 ㅁ표준 편차로 표시한다(도 3).
결과. GALA 펩티드는 pH 7.2에서 음이온성 펩티드이기 때문에(여러 글루탐산 잔기를 보유한다), 조성물과 GALA 및 GALA-Ad의 결합은 제타 전위를 감소시킨다. 조성물은 30% GALA(-11 mV) 또는 GALA-Ad(-23 mV)에 의해 음으로 하전된다. GALA + 치료 조성물 용액의 제타 전위는 이 지점에서 정체된다; GALA를 더욱 첨가해야만 제타 전위가 약간(150% GALA에서 -15 mV) 증가한다. 하지만, 입자는 더욱 높은 GALA-Ad 농도에서 더욱 음으로 하전된다. 150% GALA-Ad가 첨가된 조성물은 -42 mV의 제타 전위를 갖는다(도 3).
실시예 33: 조성물의 DNA 전달 효율
HUH-7 세포: 간암 세포주, HUH-7 역시 5+/- 전하 비율에서 화합물 12/FITC-올리고 및 화합물 12/FITC-올리고/50%GALA-Ad 조성물로 트랜스펙션시킨다. DNA 흡수는 BHK-21 세포에서 밝힌 바와 같이 모니터한다. 트랜스펙션되지 않은 HUH-7 세포에 대한 형광 프로필은 첫 번째 십분위수(decile)에 존재한다(도 5a). FITC-올리고는 화합물 12에 의해 HUH-7 세포중 95%에 성공적으로 전달된다(도 5b). 조성물에 50% GALA-Ad의 첨가는 BHK-21 세포에서 관찰되는 바와 같이, 2 크기 자리수로 FITC-올리고 흡수를 저해한다.
실시예 34: 본원 발명에 따른 조성물의 루시페라제 트랜스펙션 효율
GALA와 GALA-Ad 변형된 조성물의 트랜스펙션 능력은 배양된 세포에 루시페라제 리포터 유전자의 전달로 측정한다. BHK-21 세포는 24-웰 평판에 도말하고, 5+/- 전하 비율에서 미립자 혼합물을 형성하는 화합물 12와 복합된 1 ㎍ pGL-CV3(루시페라제 유전자를 보유하는 플라스미드)으로 트랜스펙션시킨다. 이들 미립자 혼합물은 다양한 펩티드/사이클로덱스트린 비율로 GALA 또는 GALA-Ad의 첨가로 변형시킨다. 세포는 트랜스펙션 48시간후 용해시키고 루시페라제 활성을 분석하고, 도 6에 도시된 결과는 상대광도(RLU)로 보고한다. 데이터는 3회 실험의 평균 ㅁ SD로 표시한다. 배경=300RLV.
세포는 RLU ~1x105에서 화합물 12/pGL-CV3 조성물로 성공적으로 트랜스펙션 시킨다. GALA의 첨가는 트랜스펙션 효율에 별다른 영향을 주지 않는다. 하지만, GALA-Ad로 조성물 변형은 트랜스펙션을 현저하게 저해한다. 1% GALA은 2x105 RLU로 트랜스펙션을 2배 증가시키고, 화합물 12/pGL-CV3/10% GALA 역시 약간 더 높은 트랜스펙션(1.5x105 RLU)을 결과한다. 100% GALA의 첨가는 5x104 RLU로 트랜스펙션을 50% 정도 감소시킨다.
실시예 35: GALA와 ALA-Ad 조성물의 독성
GALA와 ALA-Ad 변형된 조성물의 독성은 트랜스펙션 실험에서 얻은 세포 용해질의 단백질 농도를 측정하여 확인한다. BHK-21 세포는 5+/- 전하 비율로 화합물 12와 복합된 1 ㎍ pGL-CV3으로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션에 앞서, 다양한 lq율의 GALA와 ALA-Ad를 복합체에 첨가한다. GALA(속이 채워진 막대)와 ALA-Ad(백색 막대)의 존재하에 트랜스펙션에 대한 세포 생존은 트랜스펙션 48시간이후에 전체 단백질 농도를 분석하고 트랜스펙션되지 않은 세포에 대한 단백질 수준으로 각 시료를 표준화시켜 확인한다. 단백질 농도는 3회 반복의 평균 ㅁSD로 표시하는데, 이는 평균하고 화합물 12/pGL-CV3 조성물 단독으로 트랜스펙션된 세포의 평균 단백질 농도로 나누어 세포 생존 분율로 표시한다(도 7). 트랜스펙션 용액에 GALA와 GALA-Ad의 첨가는 BHK-21 세포에 관찰가능한 독성을 유발한다.
실시예 36: 락토오스-β-사이클로덱스트린-DMS 공중합체, 화합물 20(Lac-β-사이클로덱스트린-DMS 공중합체)
화합물 12(20.5 ㎎, 3 μmol), 10 eq α-락토오스(21 ㎎, 60 μmol, Sigma), 18.6 ㎎ 소디움 시아노보로하이드라이드(300 μmol)는 유리 바이알에 첨가한다. 1 ㎖ 보레이트 완충액, pH 8.5는 고체에 첨가하고, 생성 용액은 짧게 교반하고 37℃ 수조에서 30시간동안 배양한다. 용액은 1M HCl의 첨가로 pH 6.0으로 산성화시키고 물에서 24시간동안 투석한다. 중합체 아민에 대한 TNBS 분석에서 87% 공액이 확인되었다. 화합물 20의 구조.
실시예 37: 락토오스-(CH2)6-β-사이클로덱스트린-DMS 공중합체, 화합물 21(Lac-C6-β-사이클로덱스트린-DMS 공중합체)
화합물 12(43.2 ㎎, 7.4 μmol)와 5.6 eq 모노(락토실아미도)모노(숙시니미딜)수베레이트(50 ㎎, 84 μmol, Pierce)는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가하고 2 ㎖의 50 mM NaHCO3에 용해시킨다. 생성된 용액은 하룻밤동안 교반한다. 반응은 TNBS 분석으로 중합체 아민 말단기의 소멸을 모니터하여 추적하는데, 여기서 90% 공액이 확인되었다. 용액은 1M HCl 첨가로 pH 5.0으로 산성화시키고, 생성된 용액은 동결 건조에 앞서 Pierce MWCO 3500 Slide-A-Lyzer에서 2시간동안 물에 투석한다. 백색의 솜털모양 분말이 70% 수율로 수득된다. 화합물 21의 구조는 도 12에 도시한다.
실시예 38: PEG3400-종결되는 β-사이클로덱스트린-DMS 공중합체, 화합물 22; 전-DNA 복합체형성 페길화
20.3 ㎎ 화합물 12(3 μmol)와 10 eq FMOC-PEG3400-NHS(190 ㎎, 60 μmol)는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가하고 1 ㎖의 50 mM NaHCO3, pH 8.5에 용해시킨다. 용액은 실온의 암실에서 20시간동안 교반하고 동결 건조시킨다. 고체는 DMF에 녹인 0.5 ㎖의 20% 피페리딘에 용해시키고 FMOC 탈보호를 위하여 30분동안 교반한다. 용매는 진공하에 제거하고, 남아있는 점성 액체는 물에 용해시키고, pH는 0.M HCl로 6.0이하로 산성화시킨다. 중합체는 음이온 교환 크로마토그래피로 반응하지 않은 PEG로부터 분리하고 동결 건조시켜 백색의 솜털모양 분말을 산출한다. 화합물 22의 구조는 하기에 도시한다.
Figure 112003021806745-pct00056
전-DNA 복합체형성 페길화. 화합물 12와 22는 입자 크기 측정을 위하여 플라스미드 DNA와 혼합한다. βCDP6 화합물 12는 플라스미드 DNA를 유체역학적 직경; 130 nm의 균일한 입자로 응축하는 반면, 페길화된 화합물 22는 DNA를 응축할 수 없다. 중합체 말단에서 PEG의 존재는 DNA 응축을 교란시킨다.
실시예 39(비교): 결합(grafting)에 의한 후-DNA 복합체형성 페길화
이용된 과정은 Ogris et al., Gene Therapy, 6, 595-605(1999)에서 변형된다. 500 ㎕ dH2O에 녹인 5 ㎍ pGL3-CV은 3+/- 또는 6+/-의 전하 비율로 동등 부피의 PEI(dH2O에서)와 혼합한다. 화합물 12/DNA 미립자 혼합물은 5+/- 전하 비율로 동일한 방식으로 준비한다. 미립자 혼합물의 입자 직경은 동적 광 분산(DLS)으로 측정한다. 미립자 혼합물 형성이후, PEG5000-SPA(10 ㎎/㎖/DMF)를 첨가하고 실온에서 2시간동안 혼합한다. 입자 크기 측정이후 2번째 단계로, 500 ㎕ PBS, pH 7.2를 용액에 첨가한다. 용액은 실온에서 30분동안 배양하고, 이후 DLS로 최종 입자 크기를 측정한다(도 8).
1 단계에서, PEI/DNA 또는 화합물 12/DNA 미립자 혼합물은 1.2 ㎖ dH2O에서 형성된다. 입자의 크기는 동적 광 분산으로 측정한다. 2 단계에서, PEG5000-SPA는 미립자 혼합물 용액에 첨가하고 중합체 일차 아민기와 1시간동안 반응시킨다. "페길화" 시료의 크기는 DLS로 측정한다. 3 단계에서, 600 ㎕ PBS, pH 7.2를 각 시료에 첨가하여 페길화 입자의 염 안정성을 검사한다. 입자 크기는 염 첨가 30분후에 측정하여 입자 응집의 정도를 확인한다.
1 단계에서 PEI 미립자 혼합물은 3+/-와 6+/- 전하 비율로 조직되고 화합물 12/DNA 미립자 혼합물은 5+/- 전하 비율로 조직된다. PEG5000-SPA는 Ogris et al. Gene Therapy 6, 595-606, 1999에서 밝힌 과정에 따라 10:1 w/w로 PEI에 첨가한다. 화합물 12는 100%, 150%, 200% PEG/아미노(몰 %)로 페길화된다. 대조로서, 반응하지 않은 PEG 역시 100%로 화합물 12에 첨가한다. 각 단계에서 입자 직경은 도 9의 표에 제시한다. PEI 미립자 혼합물은 페길화 직후에 크기가 약간 증가한다(3+/- 전하 비율에서 58 nm에서 65 nm; 6+/- 전하 비율에서 55 nm에서 60 nm). 페길화는 염-유도된 응집으로부터 PEI-미립자 혼합물을 보호한다. 변형되지 않은 PEI 입자는 염 첨가이후 직경이 800 nm까지 증가하는 반면, 페길화 PEI 미립자 혼합물은 크 기가 78 nm(6+/- 전하 비율에서)과 115 nm(3+/- 전하 비율에서)로 약간 증가한다.
화합물 12-기초한 미립자 혼합물에 150%와 200% PEG5000-SPA 첨가는 입자 파괴를 유발한다; 입자수가 급격하게 감소하고 일관된 상관함수가 관찰되지 않는다. 화합물 12의 페길화는 중합체/DNA 결합을 예방할 가능성이 높다. 입자 크기는 100% PEG5000-SPA로 페길화이후 67 nm로 유지된다. 하지만, 시간의 함수로 입자 크기의 모니터링에서, PEG 첨가로부터 대략 30초후에 입자가 파괴되고 이후 소형 분자가 다시 관찰되는 것으로 확인되었다. 따라서, 100% PEG5000-SPA의 첨가는 화합물 12의 일부를 페길화시킬 수 있다. 중합체 12가 DNA와 비교하여 과량으로 첨가되기 때문에(5+/- 전하 비율에서), 변형되지 않은 중합체가 플라스미드 DNA와 폴리플렉스를 형성하고 대부분의 페길화 중합체가 용액에서 자유로운 상태로 유지되도록 입자가 재배열될 수 있다. 이들 입자에 염 첨가는 변형되지 않은 12 미립자 혼합물의 수준(700 nm) 정도는 아니지만 입자 응집(300 nm)을 유발한다. 요약하면, 중합체 일차 아미노기와의 반응에 후-DNA 복합체형성 페길화는 높은 전하 밀도를 갖는 높은 MW 중합체에 효과적일 것으로 생각된다. 하지만, 화합물 12와의 반응, 심지어 후-DNA 복합체형성도 100% PEG5000-SPA 첨가에서 염 안정화의 결핍 및 더욱 높은 PEG5000-SPA 농도에서 입자 파괴를 유발한다.
실시예 40: 내포 복합체 형성에 의한 후-DNA 복합체형성 페길화
하기의 과정을 이용하여, 아다만테인-PEG(Ad-PEG) 분자는 사이클로덱스트린(mol%)에 100% 아다만테인으로 미리 형성된 조성물 용액에 첨가한다. 이후, 상기 용액에 PBS를 첨가하고, 입자 크기는 2분 간격으로 DLS로 모니터한다. 결과는 도 10에 도시한다
과정: 600 ㎕ dH2O에 녹인 2 ㎍ pGL3-CV는 5+/- 전하 비율에서 동등 부피의 화합물 12(dH2O에서)와 혼합한다. 원하는 함량의 Ad-PEG(10 ㎎/㎖, dH2O에서)를 첨가하고, 입자 크기는 DLS로 측정한다. 상기 용액에 600 ㎕ PBS, pH 7.2를 첨가하고, 입자 크기는 2분 간격으로 8분동안 모니터한다.
페길화되지 않은 화합물 12 입자의 평균 직경은 염 첨가이후 8분내에 58 nm에서 250 nm로 증가한다. 용액에서 유리 PEG의 존재는 응집(염 첨가이후 240 nm의 평균 직경)을 예방하지 못한다. 하지만, 선형 Ad-PEG 분자로 내포 복합체를 통한 페길화는 길이 의존한 방식으로 입자 응집을 감소시킨다. 염 첨가 8분후, Ad-PEG3400으로 페길화된 입자는 210 nm 직경까지 응집하고, Ad-PEG3400-Lac으로 페길화된 입자는 200 nm 직경까지 응집한다. Ad-PEG5000으로 페길화된 입자는 직경이 염 첨가 8분후에 90 nm, 2시간후 160 nm로 증가한다. Ad-(PEG5000)2로 변형은 응집에 약간의 영향을 준다(염 첨가이후 200 nm의 입자 직경).
안정화 역시 PEG-밀도-의존한 방식으로 진행된다(도 10A). 염 첨가 10분후에 측정된 평균 입자 직경은 변형되지 않은 폴리플렉스에서는 4.7배(58 nm에서 272 nm로) 증가하지만, 사이클로덱스트린 150% 또는 200% 아다만테인의 첨가로 변형된 폴리플렉스에서는 단지 1.2배 증가한다.
실시예 41: 후-복합체형성 페길화에 의한 감소된 세포 흡수
1 단계: 트랜스펙션 혼합물은 다음과 같이 준비한다: 동등 부피의 양이온성 화합물 12는 3+/- 전하 비율의 중합체:DNA로 3 ㎍ FITC-올리고(0.1 ㎍/㎕, 물에서)에 첨가한다. 복합체에 1:1 PEG:사이클로덱스트린 비율로 유리 PEG 또는 Ad-PEG5000(실시예 40)을 첨가한다.
2 단계: HUH-7 세포는 3x105 세포/웰로 6-웰 평판에 도말하고 4 ㎖ DMEM + 10% FBS + 항생제/항진균제에 24시간동안 유지시킨다. 24시간후, 세포는 PBS로 세척하고, 1 단계의 트랜스펙션 혼합물을 함유하는 1 ㎖ Optimen을 세포에 첨가한다. 15분간 배양후, 트랜스펙션 배지는 제거하고, 세포는 PBS로 세척하며, 각 웰에 1 ㎖ Optimen을 세포에 첨가한다. 세포는 37℃에서 추가로 30분동안 배양한다. 이후, 세포는 Cell Scrub 완충액(Gene Therapy Systems)으로 세척하여 표면-결합된 복합체와 PBS를 제거하고, 트립신 처리로 웰로부터 분리한다. 그 다음, 세포는 FACS 분석법으로 FITC-올리고 흡수를 분석한다. 결과는 하기 표 1에 제시한다. Ad-PEG5000에 의한 복합체의 변형은 FITC-올리고/중합체 복합체의 흡수를 감소시킨다.
표 1.
Figure 112008501690159-pct00106
실시예 42: 화합물 12/Ad-PEG3400-FITC 조성물 제형 및 배양된 세포로의 전달
BHK-21 세포는 200,000 세포/웰로 6-웰 평판에 도말하고 37℃에서 24시간동안 배양한다. 3 ㎍ 올리고(0.1 ㎎/㎖, dH2O에서)는 5+/- 전하 비율로 동등 부피의 화합물 12(2 ㎎/㎖, dH2O에서)와 복합한다. 5분간의 복합체형성 시간이후에, 1.5 ㎕ PEG-FITC 또는 Ad-PEG-FITC(10 ㎍/㎖, dH2O에서)를 복합체에 첨가한다. 배지는 세포로부터 제거하고, 세포는 PBS로 세척한다. 트랜스펙션을 위하여, 940 ㎕ Optimen을 각 치료 조성물 용액에 첨가하고, 전체 용액을 세포로 옮긴다. 세포는 4시간동안 트랜스펙션 혼합물과 함께 배양하고, 이후 배지를 제거하고 세포는 PBS로 세척하며 4 ㎖ 완전 배지에 첨가한다. 세포는 37 ㎖에서 추가로 24시간동안 배양하고, 이후 배지는 제거하고 세포는 PBS로 2회 세척한다. 세포는 트립신처리(trypsinization)로 수거하고 FAC 분석을 준비한다. 세포는 세척 완충액(DNase와 MgCl2를 함유하는 한크 균형 염 용액)에서 2회 세척하고, 500 ㎕ FACS 완충액(한크 균형 염 용액, 2.5 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민, 10 ㎍/㎖ 프로피디움 요오드)에 재현탁시킨다. FACS 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)와 CellQuest 소프트웨어로 실시한다. 도 11은 결과를 도시한다.
Ad-PEG3400-FITC와 내포 봉합체 형성은 Ad-PEG3400-FITC와 함께 배양된 화합물 12에서 플루레신 흡수를 실질적으로 증가시킨다(43% vs. 14%, 도 11). 배지에서 유리 Ad-PEG3400-FITC는 식세포작용 또는 세포내이입 경로의 일부로 세포에 유입될 수 있다. 하지만, Ad-PEG3400-FITC는 화합물 12와 복합될 때에도 세포에 유입될 수 있다. 낮은 비율(10%)로 12 미립자 혼합물의 Ad-PEG3400-FITC 변형은 내재화(internalization)를 저해하지 않는 것으로 보인다. 오히려, 12 미립자 혼합물은 세포 표면에 용이하게 결합하고 Ad-PEG3400-FITC를 세포에 전달하여 이를 내재화시킨다. 12 미립자 혼합물-보조된 전달은 화합물 12/Ad-PEG3400-FITC 트랜스펙션된 세포에서 관찰되는 더욱 높은 플루레신 형광을 결과한다. 상기 방법은 관심있는 유전자와 함께 소형 분자 치료약물의 동시-전달에도 적용될 수 있다.
실시예 43: HU47 세포의 트랜스펙션
루시페라제 트랜스펙션. HUH-7 세포는 50,000 세포/웰로 24-웰 평판에 도말하고 37℃에서 24시간동안 배양한다. 3 ㎍ pGL3-CV 플라스미드(0.1 ㎎/㎖, dH2O에서)는 다양한 전하 비율로 동등 부피의 화합물 12 또는 21(도 13)과 복합한다. 트랜스펙션에 앞서 배지는 세포로부터 제거하고, 세포는 PBS로 세척한다. 각 치료 조성물에 60㎕ Optimen을 첨가하여 트랜스펙션 용액을 만들고, 상기 용액 230 ㎕는 4시간동안 3개의 웰 각각에 첨가한다. 배지는 트랜스펙션 24시간이후에 교체하고, 세포는 트랜스펙션 48시간이후에 50 ㎕ 세포 배양 용해 완충액(Promega, Madison, WI)에서 용해시킨다. 루시페라제 활성은 Promega의 루시페라제 분석 시약으로 분석한다. 결과는 도 13에 도시한다.
실시예 44: 아다만테인-파생된 PEI(Ad-PEI)의 합성
폴리에틸렌이민(PEI)과 아다만테인 카르복실산은 건조 CH2Cl2에서 혼합하고 0℃로 냉각한다. DCC(1 eq.), 1-하이드록시벤조일트리아졸(1 eq.), 트라에틸아민(1 eq.)은 혼합물에 첨가한다. 용액은 실온으로 서서히 데우고 16시간동안 교반한다. 침전물은 여과로 제거하고, 이후 용매는 진공으로 제거한다. 남아있는 누르스름한 고체에 물을 첨가한다. 불용성 고체는 원심분리로 제거한다. 수용액은 투석 백으로 조심스럽게 옮기고 물에서 24시간동안 투석한다. 동결 건조후 PEI-CD를 수득한다.
실시예 45: 사이클로덱스트린-PEG(CD-PEG)의 합성
PEG-숙시니미딜 프로피온산(SPA)(Shearwater Polymers)과 사이클로덱스트린-모노아민(1.2 eq.)은 DMSO에 용해시키고 실온에서 24시간동안 교반한다. 사이클로덱스트린-PEG 산물은 투석으로 정제한다.
실시예 46: Ad-PEI/DNA 미립자 혼합물의 형성 및 CD-PEG로 후속 변형
1 ㎍ 플라스미드 DNA(0.1 ㎍/㎕, dH2O에서)는 5+/- 전하 비율로 실시예 42의 Ad-PEI와 혼합한다. 이후, 실시예 46의 CD-PEG(dH2O에 용해됨)를 원하는 CD:Ad 비율로 복합체에 첨가한다.
실시예 47: 페길화(PEGylation)에 의한 안정화: 높은 농도에서 제형
4 ㎍ 플라스미드 DNA는 0.1 ㎎/㎖ 내지 4 ㎎/㎖ 범위의 다양한 최종 DNA 농도로 동등 부피의 중합체 혼합물(2.5+/- 전하 비율로 사이클로덱스트린 중합체 12, 일부 경우에 1 CD:1 PEG5000으로 아다만테인-PEG5000 또는 PEG5000을 함유)과 혼합한다(도 14). 용액의 절반은 1.2 ㎖ 물로 희석하고, 동적 광 분산으로 직경을 측정한다. 용액의 나머지 반은 Qiagen Qiaquick 칼럼에 통과시켜 용액에 남아있는 DNA를 추출한다. DNA 농도는 λ=260에서 UV 흡수도로 측정한다.
결과(도 15와 16): 아다만테인-PEG5000으로 변형된 작고 균일한 미립자 혼합물(직경<100 nm)은 침전없이 최대 4 ㎎ DNA/㎖ 농도로 조직할 수 있다. 변형되지 않은 폴리플렉스는 0.2 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 대형 입자(>300 nm)를 형성하고 모든 제형 농도에서 광범위한 침전이 관찰된다(>50% DNA 손실).
실시예 48: 폴리플렉스 표면 변형에 의한 비-특이적 흡수의 저해
BHK-21 세포는 6-웰 평판에 도말한다. 세포는 2.5+/- 전하 비율로 동등 부피의 화합물 12와 복합된 3 ㎍ FITC-올리고(트랜스펙션 혼합물의 최종 농도: 0.05 ㎎ DNA/㎖)로 트랜스펙션시킨다. 이후, 미립자 혼합물은 다음과 같은 링커로 변형시킨다:
음이온성 링커: WEAALAEALAEALAEAC
Ad-음이온성 링커: Ad-WEAALAEALAEALAEAC
Ad-PEG: Ad-PEG5000
Ad-음이온성 링커-PEG: Ad-WEAALAEALAEALAEAC-PEG5000
1 ㎖ Optimem은 트랜스펙션 혼합물에 첨가하고, 전체 용액은 미리 세척된 BHK-21 세포(PBS로 세척)에 15분동안 옮긴다. 이후, 배지를 제거하고, 세포는 CellScrub으로 세척하고 트립신처리하며 FAC 분석을 준비한다.
결과: 내포 게스트(아다만테인), 스페이서(음이온성 링커), 기능기(PEGD5000)로 화합물 12/DNA 미립자 혼합물을 변형하고 배양된 세포로의 비-특이적 흡수를 저해한다(도 17). 최적 저해는 3가지 성분의 조합으로 달성된다.
실시예 49: 간암 세포로의 갈락토오스-매개된 흡수
HepG2 세포는 50,000 세포/웰로 24-웰 평판에 도말한다. 1 ㎍ pCMV-Luc는 동등 부피의 화합물 12와 접촉시키고 후술한 바와 같이 변형시킨다. PEG-함유 착화제로 변형은 2:1 CD:PEG 비율로 실시하는데, 여기서 CD는 화합물 12에서 사이클로덱스트린을 나타낸다.
화합물 12/pcMV-Luc 미립자 혼합물 - 변형없음
Glu-PEG-Pep-Ad 글루코오스-PEG3400-CAEAEAEAE-Ad, 2 CD:1 PEG
Gal-PEG-Pep-Ad 글루코오스-PEG3400-CAEAEAEAE-Ad, 2 CD:1
PEG
PEG-Pep-Ad PEG5000-CAEAEAEAE-Ad, 2 CD:1 PEG
200 ㎕ Optimem은 각 트랜스펙션 혼합물에 첨가하고 세포의 각 웰로 옮긴다. 트랜스펙션 4시간후, 800 ㎕ 완전 배지를 각 웰에 첨가한다. 배지는 제거하고, 세포는 PBS로 세척하고, 트랜스펙션 24시간이후에 각 웰에 1 ㎖ 완전 배지를 첨가한다. 트랜스펙션 48시간후, 세포는 PBS로 세척하고 용해시키며 루시페라제 활성을 분석한다. 전술한 트랜스펙션 과정은 경쟁 저해물질로서 1 mM 글루코오스 또는 1 mM 갈락토오스의 존재하에서도 진행된다.
결과: Glu-PEG-Pep-Ad 또는 PEG-Pep-Ad로 변형된 미립자 혼합물은 네거티브 제타 전위를 보유하고, 따라서 세포를 트랜스펙션시키지 않는다. 하지만, Gal-PEG-Pep-Ad로 변형된 폴리플렉스는 유리 갈락토오스의 존재하에 저해되는 강화된 트랜스펙션을 보이고, 따라서 간암 세포로의 갈락토오스-매개된 트랜스펙션을 예증한다(도 18).
실시예 50: 디아다만테인 화합물의 합성
참고문헌: Breslow, et al. JACS(1996) v118 p8495-8496.
Zhang et al. JACS(1993) v115 p9353-9354
무수성 피리딘(5 ㎖)은 작은 자석 막대가 구비된 반응장치에 넣고 수조에서 냉각시킨다. 메틸디클로로포스페이트(1.0 ㎖)를 방울방울 첨가한다. 혼합물은 추가로 15분동안 차갑게 유지시키는데, 이 시간동안 N-메틸피리디늄 디클로로포스페이트의 침전물이 형성된다.
5 ㎖ 피리딘에 용해된 아다만테인 에탄올을 반응장치에 첨가하고, 상기 반응장치는 반응 혼합물이 동결된 이후에 밀봉한다. 생성된 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반한다. 이후, 밀봉된 반응장치는 개방하고, 생성된 혼합물은 10% 중탄산나트륨(50 ㎖)에 넣는다. 생성된 용액은 진공하에 증발시킨다. 남아있는 고체에 800 ㎖ 물을 첨가하고, 산물은 150 ㎖ 에테르로 추출한다. 수상은 2N HCl로 pH 1.4로 산성화시키고, 이후 3x150 ㎖ CHCl3:nBuOH(7:3)으로 추출한다. 유기층은 물 로 세척하고, 혼합된 용매는 진공하에 증발시켜 고체상을 얻는다. 상기 고체는 아세톤/헥산으로 재결정화시켜 27% 수율로 백색 고체를 수득한다. 전기스프레이 질량 분광분석에서 순수한 소요의 산물로 확인되었다.
실시예 51: 디아다만테인-PEG5000의 합성
Figure 112003021806745-pct00057
디클로로메탄은 환류하에 CaH2에서 하룻밤동안 건조시키고, 반응에 사용하기에 앞서 새로이 증발시킨다. 새로이 증류된 디클로메탄(0.2 ㎖)에 녹인 PEG-에폭사이드(MW 5000)의 교반 용액에 0,4 ㎖ 디클로로메탄에 녹인 비스(2-(1-아다만틸)에틸 포스페이트(실시예 51에서 밝힌 디아다만테인 화합물) 용액을 천천히 첨가한다. 생성된 용액은 35℃에서 4일동안 교반한다. 용매는 건조때까지 진공하에 제거한다. 생성된 고체에 6 ㎖ 물을 첨가하는데, 여기서 침전물이 만들어진다. 생성된 혼합물은 실온에서 30분동안 교반하고, 이후 원심분리하여 고체(반응하지 않은 디아다만테인 화합물)를 제거한다. 상층액은 물에서 3500MWCO 막에 대하여 하룻밤동안 투석하고 동결 건조시키는데, 여기서 99% 수율로 백색 고체를 수득한다. Maldi Tof 분석에서 원하는 산물로 확인되었다.
실시예 52: Ad-PEG3400과 디아다만테인-PEG5000간 경쟁 치환 실험
경쟁 흡수 실험은 diAdPEG5000 용액을 AdPEG3400, 중합체, DNA의 미리 형성된 조성물에 첨가하여 실시한다. 이후, 염 용액을 첨가하고, 입자 크기는 시간의 함수로 측정한다.
최초 조성물은 DNA 용액(20 ㎕ DNA, 0.1 ㎎/㎖)에 화합물 12 용액(16.6 ㎕ 물 + 2.61 ㎕ 화합물 12(5 ㎎/㎖) + 2.37 ㎕ AdPEG3400(12.5 ㎎/㎖)의 첨가로 형성된다. 이런 조성물 용액의 특징은 다음과 같다:
[DNA]=0.05 ㎎/㎖
AdPEG3400:CD의 몰비율=1:1
전하 비율=3+/-
전체 조직 부피=40 ㎕
상기 조성물은 di-AdPEG5K 용액(10 ㎎/㎖)의 첨가 10분전에 배양한다. 상기 용액의 부피는 diAdPEG5000과 AdPEG3400간 몰 비율이 1:1, 1:2, 1:4 또는 1:6이 되도록 결정한다. 가령, 몰 비율이 1:2이면, 2.38 ㎕의 diAdPEG5000 용액을 첨가한다.
추가로 30분동안 배양한 이후, 1.2 ㎖ 물을 첨가하여 DLS 장치에 의해 판독될 수 있을 만큼 희석한다. 입자 크기는 10분동안 측정하고, 이후 600 ㎕ 1xPBS를 조성물 용액에 신속하게 혼합한다. 추가로 30분동안 매 1분마다 입자 크기를 측정한다.
비교를 위하여, 2가지 다른 조성물 용액을 준비한다. 한 경우에는 diAdPEG5000이 첨가되지 않는다. 다른 경우에는 AdPEG3400이 첨가되지 않는다. 이들 조건하에, 미립자 혼합물은 AdPEG3400의 사용으로 안정화되지 않는다. 염은 평균 입자 크기를 30분 과정동안 70 nm에서 350 nm로 증가시킨다. 하지만, diAdPEG5000 단독은 염에 안정화를 보인다. 입자 크기는 염 용액의 첨가이후에도 일정하게 유지된다. 이는 diAdPEG5K가 AdPEG3400의 1/6 함량으로 존재하는 경우에도 유효하다. 결과는 도 19에 도시한다.
실시예 53: pH 감수성 아다만테인-PEG 변형물질
Figure 112003021806745-pct00058
내포 화합물 게스트와 호스트간 결합 상수는 게스트 또는 호스트가 하전되면 감소한다. 가령, 양성자화된 형태(중성 형태)의 아다만테인카르복실산은 500,000의 결합 상수를 갖는 반면, 양성자화되지 않은 형태(음성 형태)의 아다만테인카르복실산은 ~30,000의 결합 상수를 갖는다. 이는 내포 화합물을 함유하는 재료에 pH-감수성 반응을 통합하는데 사용될 수 있다. 가령, 아다만테인에 근접하여 이차 아민을 보유하는 아다만테인-PEG(Ad-PEG) 화합물로 변형시킬 수 있다. Ad-PEG 화합물은 생리 pH에서 높은 친화성을 갖지만 세포 엔도솜에서처럼 산성 pH에서는 더욱 쉽게 방출된다. 엔도솜에서 촉진된 풀기(unpackaging)는 DNA 방출 및 폴리플렉스의 세포 내재화를 촉진한다.
pH-감수성 가수분해가능 아다만테인-PEG 변형물질의 합성
PEG5K-NH2(132 ㎎, 0.0264 mmol)는 물에 용해시키고 0℃로 냉각시킨다. 혼합물에 NaOH 용액(5N, 0.053 ㎖, 0.264 mmol, 10 eq)과 1-아다만틸 플루오르포름산염(52 ㎎, 0.264 mmol, 10 eq) THF 용액(3 ㎖)을 첨가한다. 혼합물은 상기 온도에서 5분동안 교반하고, 이후 실온으로 데우고 2시간동안 교반한다. THF는 진공하에 제거한다. 불용성 고체는 원심분리로 제거한다. 남아있는 수용액은 Spectra/Por MWCO 3,500 막으로 이전하고 물에서 하루동안 투석한다. 동결 건조후에 아다만테인 카르바메이트-PEG5K(80 ㎎)를 수득한다. 상기 화합물의 구조는 1H NMR, HPLC, MALDI TOF MS로 확증한다.
가수분해가능 아다만테인-Schiff 염기-PEG의 합성
PEG5K-ALD와 1-아다만테인메틸아민(1 eq)은 메탄올에 혼합한다. Schiff 염기의 형성을 위한 촉매로 몇방울의 포름산을 혼합물에 첨가한다. 상기 혼합물은 60℃에서 12시간동안 교반하고, 이후 용매는 진공하에 증발시킨다. 상기 혼합물은 물에서 투석하여 원하는 아다만테인-Schiff 염기-PEG5K를 수득한다.
실시예 55: 아다만테인-PEG-트랜스페린(Ad-PEG-Tf)의 합성(도 20)
1. 탄수화물 작용기를 통한 트랜스페린 결합(coupling)
FMOC-NH-PEG5000-NHS(Shearwater Polymers, 0.2 mmol, 1 g)는 자석 막대가 구비된 둥근 바닥 플라스크에 첨가한다. 여기에 7 ㎖ 디클로로메탄/에틸 아세테이트(1:1)에 녹인 tert-부틸 카르바제이트(Aldrich, 1.6 mmol, 0.2112 g)를 첨가한다. 다음날, 용매는 진공하에 제거한다. FMOC기는 디메틸포름아마이드에 녹인 10 ㎖의 20% 피페리딘에 생성 고체를 5시간동안 용해시켜 제거한다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 물에 다시 용해시킨다. 생성된 용액은 원심분리하여 용해되지 않은 FMOC기를 제거하고, 이후 Pierce의 Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO에서 하룻밤동안 투석한다. 용액은 동결 건조시켜 790 ㎎ H2N-PEG5000-NH-NH-CO-OtBu를 얻는다.
이후, N-하이드록시숙시니미드(Aldrich, 0.24 mmol, 27.3 ㎎)와 아다만테인카르복실산(Aldrich, 0.39 mmol, 71.2 ㎎)은 7 ㎖ 디클로로메탄에 녹인 H2N-PEG5000-NH-NH-CO-OtBu(2)(0.16 mmol, 790 ㎎)에 첨가한다. 생성된 용액에 3 ㎖ 디클로로메탄에 녹인 1,3-디사이클로헥실카르보디이미드(Aldrich, 1.6 mmol, 0.326 g)를 첨가한다. 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반한다. 다음날, 생성된 고체는 가는 유리 프릿에서 여과하고, 여과액은 진공하에 회전 증발기에서 농축한다. 잔류물은 10 ㎖ 물에 용해시키고 원심분리하여 반응하지 않은 아다만테인카르복실산을 제거한다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 디옥산에 녹인 6 ㎖의 4M HCl에 다시 용해시켜 t-부톡시카르보닐기를 탈보호한다. 생성된 용액은 실온에서 4시간동안 교반한다. 이후, 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 물에 다시 용해시킨다. 생성된 용액은 Pierce의 Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO에서 하룻밤동안 투석하고 동결 건조시켜 635 ㎎ Ad-PEG5000-NH-NH2를 얻는다.
2 단계: 트랜스페린-PEG-Ad 공액체 합성
1 ㎖의 30 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5)에 녹인 100 ㎎(1.28 μmol) 사람 트랜스페린(철 불량)(Sigam-Aldrich) 용액은 Sephadex G-25(Supelco) 칼럼에서 겔 여과한다. 트랜스페린을 함유하는 생성된 4 ㎖ 용액(모니터링: 280 nm에서 흡수도)은 0℃로 냉각시키고, 4 ㎎(19 μmol) 과산화나트륨을 함유하는 80 ㎕의 30 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5)을 첨가한다. 혼합물은 암실에서 수조에 2시간동안 유지시킨다. 저분자량 산물의 제거를 위하여, 추가적인 겔 여과(Sephadex G-25, 30 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5))를 실시한다. 여기서 85 ㎎(1.09 μmol) 산화 트랜스페린을 함유하는 용액을 얻는다. 변형된 트랜스페린 용액은 1 ㎖의 100 mM 아세트산나트륨(pH 5)에 녹인 54.5 ㎎(10.9 μmol) Ad-PEG5000-NH-NH2를 함유하는 용액에 즉시 첨가한다. 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반한다. 이후, pH는 1M 중탄산나트륨의 첨가로 7.5가 되게 하고, 9.5 ㎎(150 μmol) 소디움 시아노보로하이드라이드의 4회 분량을 1시간 간격으로 첨가한다. 18시간후, 페길화된 트랜스페린은 Centricon YM-50,000 NMWI 장치(Millipore)로 정제하고 농축한다.
3 단계: 트랜스페린 산화로 합성된 트랜스페린-PEG-Ad의 철-적하
40 ㎎ 아포-트랜스페린-기초한 화합물(아포-트랜스페린 또는 아포-트랜스페린-PEC-Ad)은 700 ㎕ dH2O에 용해시킨다. 상기 용액에 200 ㎕의 5 mM 구연산 제2철(iron citrate)과 100 ㎕의 84 ㎎/㎖ NaHCO3을 첨가한다. 상기 용액은 2-3시간동안 방치하고, 이후 하룻밤동안 PBS에서 투석한다. 철-적하 효율은 465 nm에서 흡수도(산화된 철로부터) 비율 대 280 nm에서 흡수도(단백질에서 트립토판 잔기로 부터) 비율을 측정하고 상업적으로 입수가능한 홀로-트랜스페린(holo-transferin)의 A465/A280 비율에 표준화시켜 계산한다. 트랜스페린, 산화 완충액(아세트산나트륨, pH 5)에서 트랜스페린, 새로 산화된 트랜스페린에 대한 철 적하 효율을 측정하여 도 21에 도시한다. 트랜스페린의 산화는 단백질의 철 적하 효율을 감소시킨다.
4 단계: PC3 세포에서 트랜스페린 수용체에 대한 트랜스페린-PEG-Ad(트랜스페린 산화에 의해 합성됨)의 결합 친화성
PC3 세포는 다양한 함량의 표지되지 않은 트랜스페린과 트랜스페린-PEG-Ad를 함유하는 250 nM 플루레신-트랜스페린(FITC-TF)과 함께 배양한다. FITC-hTF 세포 결합은 FACS 분석으로 평가한다. 표지되지 않은 트랜스페린은 FITC-hTF와 효과적으로 경쟁하고, 반면 트랜스페린-PEG-Ad는 FITC-hTF와 매우 불량하게 경쟁하는데, 이는 수용체에 대한 감소된 친화성에 기인하는 것으로 생각된다. 결과는 도 22에 도시한다.
실시예 56: 리신기를 통한 트랜스페린 결합(coupling)(도 23).
1 단계: VS-PEG3400-Ad의 합성
비닐설폰-PEG3400-NHS(Shearwater Polymers, 0.147 mmol, 0.5 g)는 자석 막대가 구비된 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고 5 ㎖ DMSO에 용해시킨다. 여기에 아다만테인메틸아민(Aldrich, 0.147 mmol, 0.0243 g)을 첨가한다. 생성된 용액은 실온에서 1시간동안 교반한다. 용매는 진공하에 제거하고, 잔류물은 물에 다시 용해시킨다. 생성된 혼합물은 1000 MWCO 막(Spectra Por)에서 하룻밤동안 투석한다. 용 액은 동결 건조시켜 0.49 g 비닐설폰-PEG3400-Ad를 얻는다.
2 단계: 트랜스페린-PEG-Ad(Tf-PEG-Ad) 공액체 합성
10 ㎖의 0.1 M 테트라보론산나트륨 완충액(pH 9.4)에 녹인 250 ㎎(3.21 μmol) 사람 트랜스페린(철 불량)(Sigam-Aldrich) 용액은 109 ㎎(32.1 μmol) 비닐설폰-PEG3400-Ad를 첨가한다. 생성된 용액은 실온에서 2시간동안 교반한다. 페길화된 트랜스페린은 Centricon YM-50,000 NMWI 장치(Millipore)를 이용하여 반응하지 않은 비닐설폰-PEG3400-Ad로부터, 소수성 상호작용 칼럼 부틸-650S(Tosoh Biosep)를 이용하여 반응하지 않은 트랜스페린으로부터 정제한다(HPLC와 MALDI-TOF 분석으로 확증).
3 단계: 리신기를 통한 결합(coupling)으로 합성된 트랜스페린-PEG-Ad의 철-적하
아포-트랜스페린과 Tf-PEG-Ad는 실시예 55에서 밝힌 과정에 따라 철-적하한다. 철-적하의 정도는 전술한 바와 같이 정량한다. 리신기를 통한 결합으로 합성된 Tf-PEG-Ad의 철-적하 효율은 거의 100%이다.
실시예 57: PC3 세포에서 트랜스페린 수용체에 대한 트랜스페린-PEG-Ad(리신기를 통한 결합으로 합성)의 결합 친화성
PC3은 125,000 세포/㎖로 6-웰 평판에 도말한다. 24시간후, 세포는 다양한 농도의 hTf, hTf-PEG-Ad(hTf의 산화로 합성됨), hTf-PEG-Ad(VS-리신 반응으로 합성되고 정제됨), hTf-(PEG-Ad)2(VS-리신 반응으로 합성되고 정제됨)와 혼합된 250 nM FITC-Tf에 노출시킨다. 20분간 노출후 흡수는 FACS로 측정한다. 트랜스페린 산화로 합성된 Tf-PEG-Ad와 달리, 리신 결합으로 합성된 Tf-PEG-Ad 화합물은 PC3 세포 표면에서 수용체에 대하여 FITC-Tf와 효과적으로 경쟁한다. 결과는 도 24에 도시한다.
실시예 58: Tf-변형된 폴리플렉스의 제타 전위
화합물 12의 동부피 분취량은 3+/- 전하 비율로 플라스미드 DNA(2 ㎍ DNA, 물에서 0.1 ㎎/㎖)의 분취량에 첨가하여 미립자 혼합물을 형성한다. 이후, 홀로-트랜스페린 또는 홀로-Tf-PEG-Ad(물에서 17 ㎎/㎖)를 미립자 혼합물에 첨가한다. 입자는 1.2 ㎖ 물의 첨가로 희석하고, 제타 전위는 ZetaPals 동적 광 분산 장치(Brookhaven Instrument)로 측정한다. 결과는 도 25에 도시한다. 변형되지 않은 홀로-트랜스페린은 정전 상호작용으로 미립자 혼합물과 결합한다. 2 nmol Tf/㎍ DNA가 첨가되면, 미립자 혼합물은 중성에 가까워진다. 홀로-트랜스페린-PEG-Ad(도 25에서 Tf-PEG-Ad)는 정전 상호작용과 내포 화합물 상호작용 모두에 의해 미립자 혼합물에 결합할 가능성이 높다. 따라서, 더욱 높은 농도의 홀로-Tf-PEG-Ad에서 변형된 입자의 제타 전위의 지속적 감소으로 입증된 바와 같이, 홀로-Tf-PEG-Ad와 입자간에 더 많은 결합이 존재한다. 2 nmol Tf/㎍에서, 홀로-Tf-PEG-Ad로 변형된 미립자 혼합물은 음으로 하전된다(제타 전위 ~ 7mV).
실시예 59: Ad-Phos-PEG5000-갈락토오스의 합성
Figure 112003021806745-pct00059
아래의 화합물 번호는 상기 화학식을 참조한다.
I. 아다만테인포스폰산의 합성. 2. 디벤질 아인산염(0.712 g, 2.71 mmol)은 건조 CCl4에 녹인 아르곤 보호된 1-아다만테인메틸아민(0.493 g, 2.98 mmol) 용액에 주사한다. 백색 침전물은 디벤질 아인산염의 첨가직후에 관찰된다. 용액은 12시간동안 교반한다. 혼합물에 CH2Cl2(30 ㎖)를 첨가한다. 유기상은 희석된 산성수(pH 4)로 2회(2x40 ㎖) 세척한다. 이후, 유기상은 MgSO4로 건조시킨다. 용매는 진공하에 증발시킨다. 생성된 백색 고체는 CH2Cl2와 헥산의 용매 혼합물로 결정화시킨다. 바늘모양 결정(0.69 g)(1)은 60% 수율로 얻는다. 상기 결정은 에탄올(40 ㎖)에서 15 psi의 압력으로 10% Pd/C(200 ㎎)를 이용한 수소화 반응을 16시간동안 실시한다. 촉매는 여과로 제거한다. 여과액 용매는 진공으로 제거한다. (2)의 정량적 산출이 달성된다. 생성된 화합물 2는 추가 정제없이 사용된다.
II. NH2-PEG5000-갈락토오스(4)의 합성. FMOC-PEG3400-NHS(Shearwater, 760 ㎎, 0.152 mmol)는 DMSO(3.7 ㎖)에 용해시킨다. 상기 용액에 DMSO(14 ㎖)에 녹인 갈락토사민(385 ㎎, 1.52 mmol)과 디이소프로필에틸아민(0.264 ㎖, 1.52 mmol)의 용액을 첨가한다. 용액은 20분동안 교반하고, 이후 3500 MWCO 막(Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.)을 이용하여 물(4x4 ℓ)에서 24시간동안 투석한다. 그 다음, 용액은 동결 건조시켜 745 ㎎ FMOC-NH-PEG500-갈락토오스(3)를 얻는다. (3)은 피페리딘(3 ㎖)을 함유하는 DMF(12 ㎖)에 용해시킨다. 용액은 16시간동안 교반한다. 이후, DMF는 높은 진공하에 제거한다. 생성된 고체에 40 ㎖ 물을 첨가한다. 백색 고체는 원심분리로 제거한다. 수용액은 3500 MWCO 막(Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.)을 이용하여 물(4x4 ℓ)에서 24시간동안 투석한다. 용액은 동결 건조시켜 625 ㎎ NH2-PEG500-갈락토오스(4)를 얻는다.
Ⅲ. 아다만테인-Phos-PEG500-갈락토오스(5)의 합성. (4)(63 ㎎, 0.013 mmol)은 이미다졸 완충 용액(1 ㎖, 0.1 N, pH=6.5)에 용해시킨다. 상기 용액에 CH3CN(4 ㎖)에 녹인 (2) 용액을 첨가하고, 이후 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC, 100 ㎎, 40 eq.)를 첨가한다. 용액은 실온에서 16시간동안 교반한다. 용액은 3500 MWCO 막(Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.)을 이용하여 물(4x4 ℓ)에서 투석하고, 이후 동결 건조시켜 (5)를 수득한다.
실시예 60: Ad-Glu-Glu-PEG500-갈락토오스의 합성
Figure 112003021806745-pct00060
아래의 화합물 번호는 상기 화학식을 참조한다.
Ⅰ. H-Glu-Glu-아다만테인(7)의 합성. h-Glu(Bn)-OH(3.55 g, 15 mmol)은 중탄산나트륨(1.26 g, 15 mmol)을 함유하는 물(16 ㎖)에 용해시킨다. 혼합물에 THF(30 ㎖)에 녹인 Z-Glu(Bn)-OSu(4.68 g, 10 mmol)을 첨가한다. 상기 혼합물에 30 ㎖ THF, 20 ㎖ CH3CN, 10 ㎖ 2N NaOH를 추가로 첨가한다. 용액은 실온에서 16시간동안 교반한다. THF와 CH3CN은 높은 진공하에 증발시킨다. 상기 수성 혼합물에 1N HCl을 첨가하여 pH를 3으로 조정한다. 침전이 관찰된다. 혼합물은 클로로포름(3x30 ㎖)으로 추출한다. 유기상은 MgSO4로 건조시킨다. MgSO4는 여과로 제거한다. 유기 용매는 증발시켜 백색 점착성 고체(6)를 얻는다. (6)은 추가 정제없이 다음 단계에 사용된다.
(6)(3.51 g, 6.1 mmol)은 건조 THF(40 ㎖)에 용해시킨다. 아르곤하의 0℃에서 상기 용액에 1-아다만테인메틸아민(1.007 g, 6.1 mmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(0.93 g, 6.1 mmol), DCC(1.32 g, 6.4 mmol), 디이소프로필에틸아민(1.06 ㎖, 6.1 mmol)을 첨가한다. 이후, 혼합물은 실온으로 데우고 하룻밤동안 교반한다. 침전물은 여과한다. THF는 진공하에 제거하여 황색 고체를 얻는다. 상기 황색 고체는 메탄올에서 결정화시켜 플레이트 결정(6)(2.1 g, 49%)을 얻는다. 이후, (6)은 40 ㎖ 메탄올에 용해시키고, 200 ㎎ 10% Pd/C의 존재하에 25-30 psi 압력으로 수소화 반응 장치에서 진탕한다. 촉매는 24시간후 여과한다. H-Glu-Glu-Ad(7)은 진공하에 메탄올을 제거한 이후 정량적 수율로 얻는다. (7)은 추가 정제없이 사용된다.
Ⅱ. Ad-Glu-Glu-PEG500-갈락토오스(9)의 합성. 비닐설폰(VS)-PEG500- NHS(Shearwater, 423 ㎎, 0.085 mmol)과 갈락토사민(216 ㎎, 0.85 mmol)은 PBS 용액(2.25 ㎖, 1x, pH 7.2)에 첨가한다. 용액은 1시간동안 교반하고, 이후 3500 MWCO 막(Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.)을 이용하여 물(4x4 ℓ)에서 24시간동안 투석한다. 이후, 용액은 동결 건조시킨다. 산물(8)은 MALDI-TOF와 HPLC로 분석한다. (8)은 보락스(borax) 완충 용액(6 ㎖, 0.1 N, pH 9.4)에 용해시킨다. 화합물(7)(121 ㎎)은 DMSO 용액(2 ㎖)에 용해시키고, 이후 중합체 용액에 첨가한다. 혼합물은 35℃에서 16시간, 후속으로 50℃에서 7시간동안 교반한다. HPLC로 이 반응을 모니터한다. 중합체는 3500 MWCO 막을 이용하여 투석하고 동결 건조시켜 419 ㎎ Ad-Glu-Glu-PEG500-갈락토오스(9)를 90% 수율로 수득한다.
실시예 61: Ad-Glu-Glu-PEG5000의 합성
Figure 112003021806745-pct00061
Ad-Glu-Glu-mPEG5000(10)의 합성. mPEG5000-SPA(Shearwater, 300 ㎎, 0.06 mmol)과 (7)(실시예 60)은 DMSO(2 ㎖)와 CH3CN(1 ㎖)에 용해시킨다. 혼합물은 실온에서 24시간동안 교반한다. 이후, 용액은 3500 MWCO 막(Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.)을 이용하여 물(4x4 ℓ)에서 24시간동안 투석한다. 용액은 동결 건조시켜 276 ㎎ Ad-Glu-Glu-mPEG5000(10)을 수득한다. (10)은 MALDI-TOF MS, HPLC, 1H NMR로 확증한다.
실시예 62: 트랜스페린과 PEG-변형된 폴리플렉스의 제형
Tf-PEG-Ad(또는 Tf-(PEG-Ad)2)와 PEG-Ad(또는 PEG-Glu-Glu-Ad)로 변형된 폴리플렉스(3+/-의 중합체 대 DNA 전하 비율)는 다음과 같이 조직할 수 있다. 동등 부피의 모든 구성 요소가 사용된다. 물에 녹인 Tf-PEG-Ad(또는 Tf-(PEG-Ad)2)는 물에 녹인 (12) 용액에 첨가한다. 상기 혼합 용액에 PEG-Ad(또는 PEG-Glu-Glu-Ad)의 분취량을 첨가한다. 이후, 중합체의 3분자 혼합물을 DNA 용액에 첨가한다. 용액은 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고, 입자 크기, 제타 전위, 염 안정성은 전술한 바 와 같이 측정한다. 입자의 제타 전위는 Tf-PEG-Ad(또는 Tf-(PEG-Ad)2) vs. PEG-Ad(또는 PEG-Glu-Glu-Ad)의 상대적 비율을 변화시켜 조정할 수 있다. 입자 변형의 함수로 제타 전위 변화와 입자 크기의 일부 예는 도 26, 27, 28에 도시한다.
실시예 63: 아다만테인-음이온성 펩티드-PEG3400-갈락토오스/글루코오스(Ad-pep-PEG-gal/glu).
음이온성 펩티드(서열: E-A-E-A-E-A-E-A-C)는 자동 서열화기를 이용한 Biopolymer Synthesis Facility(Beckman Institute, California Institute of Technology)로 합성한다. 수지로부터 펩티드를 절단하기에 앞서, 아다만테인-카르복실산(ACA, Aldrich)은 DCC 결합 화학으로 펩티드의 N-말단에 공액시킨다. 생성 펩티드(ACA-E-A-E-A-E-A-E-A-C, MW 1084)는 수지로부터 절단하고 Maldi-TOF로 분석한다.
갈락토오스-와 글루코오스-PEG3400-비닐 설폰(gal/glu-PEG3400-VS)은 인산염 완충 식염수, pH 7.2에서 NHS-PEG3400-VS(Shearwater Polymers)와 20 당량의 글루코사민 또는 갈락토사민(Sigma)을 2시간동안 실온에 반응시켜 대략 95% 수율로 얻는다. 용액은 물에서 광범위하게 투석하고, 이후 동결 건조시킨다. 음이온성 펩티드(2 당량)의 티올은 10 mM TCEP를 함유하는 50 mM 보로산나트륨 완충액(pH 9.5)에서 갈락토오스-PEG3400-VS 또는 글루코오스-PEG3400-VS와 반응시킨다. 용액은 산성화시키고, 침전된 펩티드(pH 9.0 미만에서 불용성)는 원심분리로 제거한다. 상층액은 수 거하고 광범위하게 투석하며 동결 건조시킨다. 원하는 산물은 Maldi-TOF 분석법으로 확증한다(하기에 도시된 개략도).
Figure 112003021806745-pct00062
실시예 64: 나프탈렌-PEG5000의 합성
Figure 112003021806745-pct00063
500 ㎎ PEG5000-NHS(0.1 mmol, Shearwater Polymers)는 자석 막대가 구비된 유리 바이알에 첨가한다. 여기에 8 ㎖ 디클로로메탄에 용해된 146 ㎕ 1-나프탈렌메틸아민(1 mmol, 10 eq, Aldrich)을 첨가하고, 용액은 16시간동안 교반한다. 이후, 용매는 진공하에 제거한다. 혼합물에 20 ㎖ 물을 첨가한다. 불용성 잔류물은 원심분리로 제거한다. 수용액은 Spectra/Por 3500 MWCO 투석막에서 24시간동안 투석한다. 용액은 동결 건조시켜 백색의 솜털모양 고체로 나프탈렌-PEG5000을 수득한 다. 산물은 1H NMR, MALDI TOF MS, 역상 HPLC로 분석한다. 나프탈렌-PEG3400은 유사한 프로토콜로 합성한다(56% 수율; Maldi-TOF 분석으로 확증).
실시예 65: 나프탈렌-PEG5000-갈락토오스의 합성
Figure 112003021806745-pct00064
비닐설폰(VS)-PEG5000-NHS(Shearwater, 423 ㎎, 0.085 mmol)와 갈락토사민(216 ㎎, 0.85 mmol)은 PBS 용액(2.25 ㎖, 1x, pH 7.2)에 첨가한다. 용액은 1시간동안 교반하고, 이후 3500 MWCO 막(Spectra/Por 7, Spectrum Lab, Inc.)을 이용하여 물(4x4 ℓ)에서 24시간동안 투석한다. 이후, 용액은 동결 건조시켜 비닐설폰-PEG5000-갈락토오스를 얻는다. 산물은 MALDI-TOF와 HPLC로 분석한다. 비닐설폰-PEG5000-갈락토오스 300 ㎎(0.06 mmol)은 보락스(borax) 완충 용액(3 ㎖, 0.1 N, pH 9.4)에 용해시킨다. 1-나프탈렌메틸아민(8.8 ㎕, 0.06 mmol)은 DMSO 용액(3 ㎖)에 용해시키고, 이후 중합체 용액에 첨가한다. 혼합물은 55℃에서 36시간동안 교반한다. 중합체는 3500 MWCO 막을 이용하여 투석하고 동결 건조시켜 나프탈렌-PEG500-갈락토오스를 수득한다.
인지하는 바와 같이, 전술한 설명과 실시예는 적절한 구체예의 상세하게 설명하기 위한 것이다. 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 다양한 개조와 변화가 실시될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 본원에 언급된 모든 특허, 정기 간행물 논문, 다른 문서는 순전히 참고로 한다.

Claims (32)

  1. 하기 화학식 화합물:
    Figure 112008501690159-pct00107
    여기서,
    J는 -NH-, -C(=O)NH-(CH2)d-, -NH-C(=O)-(CH2)d-, -CH2SS-, -C(=O)O-(CH2)e-O-P(=O)(O-(CH2)e-Y)O-,
    Figure 112008501690159-pct00108
    ,
    펩티드나 펩티드 잔기, 또는 -NH-(C=O)-CH(R1)-NH-(C=0)-CH(R1)-NH-이고;
    Y는 아다만틸이며;
    R1은 -(CH2)a-CO2H, 이의 에스테르 또는 염; 또는 -(CH2)a-CONH2이고;
    PEG는 -O(CH2CH2O)m-, 여기서 m는 2 내지 500이며;
    L은 H, -NH2, -NH-(C=O)-(CH2)e-(C=O)-CH2-, -S(=O)2-HC=CH2-, -SS-, -C(=O)O- 또는 탄수화물 잔기이고;
    a는 0 또는 1이며;
    b는 0 또는 1이고;
    d는 0 내지 6이며;
    e는 1 내지 6이고;
    n은 0 내지 6이며;
    q는 1 내지 5이고;
    w는 1 내지 5이며;
    y는 1이고;
    x는 1이며;
    z는 1 내지 5이고;
    호스트 또는 게스트 기능분자는 각 경우에, 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 카르세론드(carcerond), 카비탄드(cavitand), 크라운 에테르(crown ether), 크립탄드(cryptand), 쿠쿠르비투릴(cucurbituril), 칼릭사렌(cal ixarene), 스페란드(spherand), 아다만테인(adamantane), 디아다만테인(diadamantane), 나프탈렌(naphthalene), 또는 콜레스테롤에서 독립적으로 선택된다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    q는 1이고;
    w는 1이며;
    z는 1인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, 호스트 또는 게스트 기능분자는 아다만틸, 나프틸, 콜레스테롤, 사이클로덱스트린, 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    Figure 112008501690159-pct00109
    는
    Figure 112008501690159-pct00110
    이고
    Y는 아다만틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 사이클로덱스트린-보유 중합체와 치료 약물의 미립자 혼합물 및 기능기를 보유하는 착화제를 함유하는 조성물에 있어서,
    착화제는 제 1 항 내지 4항중 어느 한 항에 따른 화합물이고,
    중합체와 착화제는 호스트-게스트 또는 게스트-호스트 상호작용으로 내포 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 착화제는 게스트 기능분자를 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 착화제는 호스트 기능분자를 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 중합체는 호스트 기능분자와 게스트 기능분자를 모두 보유하고, 상기 게스트 기능분자는 아다만테인(adamantane), 디아다만테인(diadamantane), 나프탈렌(naphthalene), 또는 콜레스테롤에서 선택되고, 게스트 기능분자와 호스트 기능분자를 보유하는 착화제의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 게스트 기능분자는 아다만테인 또는 디아다만테인(diadamantane)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 5 항에 있어서, 기능기는 리간드, 핵 배치 신호, 엔도솜 방출 펩티드, 엔도솜 방출 중합체, 추가적인 치료약물, 안정화 중합체 또는 안정화 친수성 중합체, 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 5 항에 있어서, 치료약물은 항생제, 스테로이드, 폴리뉴클레오티드, 소형분자 약물, 바이러스, 플라스미드, 펩티드, 펜티드 단편, 킬레이트제, 단백질, 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 치료약물은 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 6 항에 있어서, 착화제의 게스트 기능분자는 아다만테인 또는 디아다만테인에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 치료약물은 항생제, 스테로이드, 폴리뉴클레오티드, 소형 분자 약물, 바이러스, 플라스미드, 펩티드, 펩티드 단편, 킬레이트제, 단백질, 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 치료약물은 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 5 항에 있어서, 착화제는 아래 화학식의 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
    Figure 112008501690159-pct00111
    여기서,
    J는 -NH-, -C(=O)NH-(CH2)d-, -NH-C(=O)-(CH2)d-, -CH2SS-, -C(=O)O-(CH2)e-O-P(=O)(O-(CH2)e-Y)O-,
    Figure 112008501690159-pct00112
    ,
    또는 -NH-(C=O)-CH(R1)-NH-(C=0)-CH(R1)-NH-이고;
    Y는 아다만틸이며;
    R1은 -(CH2)a-CO2H, 이의 에스테르 또는 염; 또는 -(CH2)a-CONH2이고;
    PEG는 -O(CH2CH2O)z-, 여기서 z는 2 내지 500이며;
    L은 H, -NH2, -NH-(C=O)-(CH2)e-(C=O)-CH2-, -S(=O)2-HC=CH2-, -SS-, -C(=O)O- 또는 탄수화물 잔기이고;
    a는 0 또는 1이며;
    b는 0 또는 1이고;
    d는 0 내지 6이며;
    e는 1 내지 6이고;
    n은 0 내지 6이며;
    y는 1이고;
    x는 1이다.
  17. 제 6 항에 있어서, 치료약물은 항생제, 스테로이드, 폴리뉴클레오티드, 소형분자 약물, 바이러스, 플라스미드, 펩티드, 펩티드 단편, 킬레이트제, 단백질, 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 치료약물은 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 치료약물을 전달하기 위한 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 치료약물, 사이클로덱스트린-보유 중합체, 착화제를 결합시켜 조성물을 형성하는 단계로 구성되고,
    여기서 착화제는 제 1 항 내지 4 항중 어느 한 항에 따른 화합물이고,
    중합체와 치료약물은 미립자 혼합물을 형성하고,
    중합체와 착화제는 호스트-게스트 또는 게스트-호스트 상호작용으로 내포 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 치료약물과 중합체를 먼저 결합시켜 미립자 혼합물을 만들고, 이후 미립자 혼합물을 착화제와 결합시켜 상기 중합체와 상기 착화제가 내포 복합체를 형성하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 중합체와 착화제를 먼저 결합시켜 내포 복합체를 만들고, 이후 내포 복합체를 치료약물과 결합시켜 상기 중합체와 상기 치료약물이 미립자 혼합물을 형성하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 5 항에 있어서, 기능기는 중합체와 치료약물 단독의 조성물과 비교하여, 생리학적 조건하에 조성물을 안정화시키는 성분(moiety)을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 5 항에 있어서, 기능기는 착화제에 가역적으로 결합되는 치료약물을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 5 항에 있어서, 중합체는 착화제의 최소한 하나의 게스트 기능분자와 내포 복합체를 형성하는 최소한 하나의 호스트 기능분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 5 항에 있어서, 중합체는 착화제의 최소한 하나의 호스트 기능분자와 내포 복합체를 형성하는 최소한 하나의 게스트 기능분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 5 항에 있어서, 사이클로덱스트린-보유 중합체는 선형 사이클로덱스트린-보유 중합체를 포함하고, 여기서 사이클로덱스트린 성분(moiety)은 중합체의 골격 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 5 항에 있어서, 사이클로덱스트린-보유 중합체는 사이클로덱스트린-보유 중합체의 펜던트 사슬 또는 가지 사슬 내에서 최소한 하나의 사이클로덱스트린 성분(moiety)을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 5 항에 있어서, 착화제는 최소한 하나의 중합체 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 착화제의 최소한 하나의 중합체 부분은 PEG 또는 이의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 5 항에 있어서, 기능기는 최소한 하나의 중합체 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 5 항에 있어서, 중합체, 치료약물, 착화제는 별개의 분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 5 항에 있어서, 치료약물을 전달에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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