CN100415296C

CN100415296C - 含包合配合物的组合物

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Publication number: CN100415296C
Application number: CNB018227295A
Authority: CN
Inventors: S·王潘; H·贡扎莱斯; M·E·达维斯; N·贝洛克; J·程
Original assignee: California Institute of Technology CalTech; Insert Therapeutics Inc
Current assignee: California Institute of Technology CalTech; Calando Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-19
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2021-12-19
Also published as: WO2002049676A2; US20110256104A1; US7968123B2; US20030017972A1; AU2906502A; JP2004523502A; JP4476545B2; AU2002229065B2; CN1491117A; CA2431207A1; MXPA03005394A; US20150050233A1; US8277846B2; HUP0400655A3; IL156398A; US20060182795A1; JP2010031284A; JP2014210810A; WO2002049676A3; US20130197210A1

Abstract

本发明提供了含聚合物颗粒复合物和治疗剂的组合物。此组合物还含有配位剂。聚合物与配位剂以主-客或客-主相互作用而相互作用，形成包合配和物。本发明的治疗组合物可在各种疾病的治疗中用于递送治疗剂。颗粒复合物聚合物和配位剂都可用于治疗组合物的官能导入。本发明还涉及制备组合物的方法。此方法结合了治疗剂、具主体或客体官能团的聚合物，以及具主体或客体官能团的配位剂，以形成治疗组合物。配位剂与聚合物形成了包合配合物。本发明还涉及递送治疗剂的方法。根据本发明，有效治疗量的本发明组合物在确认需要此治疗剂时，为哺乳动物(例如，人或动物)所服用。

Description

含包合配合物的组合物

技术领域

本发明涉及用于递送治疗剂的组合物及方法。更特定地，本发明涉及含有聚合物、治疗剂和配位剂的组合物，其中聚合物与配位剂通过主-客或客-主相互作用形成包合配合物。本发明的组合物可在各种疾病的治疗中用于递送治疗剂。

发明背景

环糊精是含有天然生成的α-(1，4)键合D(+)-吡喃(型)葡萄糖单元的环多糖。最常见的环糊精是(α)-环糊精、(β)-环糊精和(γ)-环糊精，它们分别含有6个、7个或8个吡喃(型)葡萄糖单元。从结构上看，环糊精的环特性形成了圆环面或圆环形状，它具有非极性的或憎水性的内部空腔，仲羟基位于环糊精圆环面的一边，而伯羟基位于另一边。因此，以(β)-环糊精为例，环糊精通常用下面的图示表示：

仲羟基所位于的那一面的直径比伯羟基所位于的那一面的直径要宽。环糊精内腔的憎水特性允许其包合各种化合物(综合超分子化学Comprehensive Supramolecular Chemistry，第3卷，J.L.Atwood等编辑，Pergamon Press(1996)；T.Cserhati，分析生物化学Analytical Biochemistry，225：328-332(1995)；Husain等，应用光谱学Applied Spectroscopy，46：652-658(1992)；FR 2 665169)。

通过形成含各种适于包含入环糊精憎水性空腔的药物的包合配合物，或形成与其它生物活性分子如寡聚核苷酸及其衍生物的非共价键合配合物，环糊精已用作各种治疗化合物的递送工具。例如，美国专利4,727,064描述了药学配制物，配制物含有水溶性很低的药物和无定形、水溶性环糊精基混合物。药物与混合物中的环糊精形成了包合配合物。在美国专利5,691,316中，描述了寡聚核苷酸的环糊精细胞递送系统。在此系统中，寡聚核苷酸与环糊精非共价配合或是，寡聚核苷酸与金刚烷共价键合，而金刚烷随后与环糊精非共价键合。

在本领域中各种含环糊精的聚合物及其制备方法都是熟知的。(综合超分子化学，Comprehensive Supramolecular Chemistry，第3卷，J.L.Atwood等编辑，Pergamon Press(1996))。一种生产含固定环糊精的聚合物的工艺描述于美国专利5,608,015中。如此工艺所述，环糊精衍生物要么与α，β-不饱和酸的酸性卤化物单体或其衍生物反应，要么与含末端异氰酸酯基团或其衍生物的α，β-不饱和酸或其衍生物反应。环糊精衍生物通过将环糊精与诸如羰基卤化物和酸酐的化合物反应而得到。所得聚合物含有作为脱离线性聚合物主链的侧链的环糊精单元。

美国专利5,276,088描述了合成环糊精聚合物的方法，该方法通过将聚乙烯醇或纤维素或其衍生物和环糊精衍生物反应，或是通过将环糊精衍生物和醋酸乙烯酯或甲基丙烯酸甲酯共聚，而合成环糊精聚合物。同样，所得环糊精聚合物含有作为脱离聚合物主链的侧链部分的环糊精部分。

组装了超分子结构的可生物降解药物聚合物描述于WO 96/09073A1和美国专利5,855,900中。此组装包含许多载有药物的环状化合物，此环状化合物是通过将药物键合在α，β，或γ-环糊精上，然后将药物/环糊精化合物沿线性聚合物排列而制备的，此线性聚合物的两端均结合有可生物降解部分。据报道这样的组装能够对应于疾病中发生的特定的生物降解而释放出药物。这些组装通常被称作“项链型”环糊精聚合物。

然而，本领域存在着对更有效的无病毒递送系统的需求，此系统显示某些性质，如，提高的稳定性(例如，在生理学条件下)和有效的瞄准能力。本发明回应了这一需求。

发明简述

本发明提供了含有聚合物、治疗剂和配位剂的组合物。聚合物与配位剂通过主-客和/或客-主相互作用形成包合配合物。本发明的组合物可在各种疾病的治疗中用于递送治疗剂。聚合物以及配位剂都可用于向组合物中导入官能团。

本发明提供了组合物，此组合物含有聚合物和治疗剂的颗粒复合物以及聚合物和配位剂的内含配合物。颗粒复合物中的聚合物可具有主体官能团，并与客体配位剂形成了包合配合物。选择性的，至少颗粒复合物中的一种聚合物具有客体官能团，并与主体配位剂形成了包合配合物。在另一实施方案中，形成包合配合物的聚合物或配位剂可以既具有主体官能团又具有客体官能团。这允许多种配位剂形成包合配合物，并因此与治疗组合物结合。这也允许在本发明的治疗组合物中导入各种官能团。

本发明还涉及制备治疗组合物的方法。此方法结合了治疗剂、具有主体或客体官能团的聚合物，以及具有主体或客体官能团的配位剂，以形成治疗组合物。配位剂与聚合物形成了包合配合物。

本发明还涉及递送治疗剂的方法。根据本发明的方法，有效治疗量的本发明组合物在确认需要此治疗剂时，给哺乳动物(例如，人或动物)服用。从而，本发明提供了使用本发明组合物递送适当的治疗剂来治疗疾病的方法。

附图简述

在描绘了本发明的各种实施方案的图中，化合物12也称作βCDP6。在颗粒复合物中含有核酸和阳离子聚合物的复合物定义为polyplex。附图简述如下。

图1.各种金刚烷-PEG分子的结构

图2.GALA和GALA-Ad修饰组合物的流体力学直径，实施例30。

图3.GALA和GALA-Ad修饰组合物的Z电势，实施例32。

图4.BHK-21细胞对GALA和GALA-Ad修饰组合物的摄取，实施例31。

图5.HUH-7细胞对GALA和GALA-Ad修饰polyplex组合物的摄取，实施例33。

图6.BHK-21细胞的荧光素酶转染，用GALA和GALA-Ad修饰的基于β-环糊精-DMS共聚物12的组合物，实施例34。

图7.GALA和GALA-Ad修饰的polyplexes对BHK-21细胞的毒性，实施例35。

图8.通过接枝进行后-DNA-配合PEG化的流程图，实施例39。

图9.PEI和12颗粒复合物以及polyplex组合物在后-DNA-配合过程中的粒径，实施例39。

图10.PEG化的polyplex组合物的稳定性，实施例40。

图11.12polyplex和PEG₃₄₀₀-FITC的共递送，实施例42。

图12.乳糖-12的结构，实施例37。

图13.12和LAC-CDP6polyplex对HUH-7细胞的转染，实施例43。

图14.实验性方案流程图，实施例47。

图15.粒径，实施例47。

图16.由配位沉淀导致的DNA损失，实施例47。

图17.用于修饰12/DNA复合物的包合配合物，实施例48。

图18.修饰Polyplex对HepG2细胞的转染，实施例49。

图19.竞争性置换实验，实施例52。

图20.金刚烷-PEG-转铁蛋白(Ad-PEG-Tf)的合成，实施例55。

图21.转铁蛋白的铁装载，实施例55。

图22.转铁蛋白-PEG-Ad的键合亲和力，实施例55。

图23.通过赖氨酸基团的转铁蛋白偶合，实施例56。

图24.转铁蛋白-PEG-Ad对PC3细胞上转铁蛋白受体的键合亲和力，实施例57。

图25.转铁蛋白和PEG-修饰的polyplex中Z电势的变化和作为颗粒修饰函数的粒径，实施例58。

图26.Z电势测量，Ad-阴离子性-PEG，实施例62。

图27.稳定性测量，实施例62。

图28.增量转铁蛋白配位剂的添加，实施例62。

图29.组氨酰化12的合成。

图30.用于内体逃逸的pH敏感性聚合物(含仲胺聚合物的合成)。

发明详述

本发明涉及使用包合配合物来递送治疗剂的组合物。包合配合物是具有加合物的特征结构的分子化合物，其中一种化合物(主体化合物)在其空间内罩有至少部分的另一种化合物。所罩有的化合物(客体化合物)位于主体分子的空腔内，并不影响主体的框架结构。包合配合物的一个特性在于可提供的空腔的大小和形状通常实际上保持不变，除了轻微变形之外。“主体”可以是本领域熟知的任何主体化合物或分子。合适的“主体”的实例包括但不限于，环糊精、carcerand、cavitand、冠醚、穴状配位体、cucurbituril、杯芳烃、球状配位体等。适用于配位剂的包合客体的实例包括那些本领域内熟知的，例如，但不限于，金刚烷、二金刚烷、萘和胆固醇。

环糊精是优选的主体，可以和许多种离子和分子种类相互作用，且所得包合化合物属于“主体-客体”类配合物。为实现主客体关系必须满足几个要求；其中之一是主客体分子的结合位置应该在立体电子感应方面是互补的。环糊精可以和尺寸能与其空腔尺寸兼容的化合物形成包合配合物。然而配位形成的程度也依赖于客体分子的极性。与明显大于其空腔尺寸的分子形成配位，这在有的情况下也是可能的，即只有某些基团或侧链刺入了碳水化合物轨道。见，J.Szejtli，Akademiai Kiado，环糊精及其包合配合物，Cyclodextrins and theirinclusion complexes，Budapest，1982。

本发明的组合物含有至少一种聚合物和至少一种治疗剂，通常以聚合物和治疗剂的颗粒复合物形式存在。治疗组合物还含有一种或多种配位剂。颗粒复合物中至少一种聚合物与配位剂相互作用，它们在主体-客体或客体-主体相互作用中于聚合物和配位剂之间形成包合配合物。聚合物和，更特定的是配位剂可用于在本发明的组合物中引入官能团。在某实施方案中，颗粒复合物中至少一种聚合物具有主体官能团并和具有客体官能团的配位剂形成包合配合物。在另一实施方案中，颗粒复合物中至少一种聚合物具有客体官能团并和具有主体官能团的配位剂形成了包合配合物。在进一步的实施方案中，颗粒复合物中的聚合物可以既含有主体官能团又具有客体官能团，并和客体配位剂及主体配位剂形成包合配合物。

1.颗粒复合物

治疗剂和聚合物的颗粒复合物是治疗剂和聚合物的结合或综合。颗粒复合物是一种联合结构，在多维聚合物网中含有一种或多种治疗剂。可以使用单一的聚合物或聚合物混合物。如下面讨论的，除了能形成颗粒复合物的多维聚合物网，复合物中的至少一种聚合物具有主体和/或客体官能团，它可以和一种或多种配位剂形成包合配合物。

A.聚合物

在本发明组合物中，可以使用任何能与治疗剂形成颗粒复合物并具有主体和/或客体官能团的聚合物。聚合物可以是线性或支链的聚合物。聚合物可以是均聚物或共聚物。如果使用共聚物，共聚物可以是无规共聚物或支链共聚物。优选的聚合物是水分散性的且更优选是水溶性的。例如，合适的聚合物包括但不限于，多糖、聚酯、聚酰胺、聚醚、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯等。为了用于治疗药物学，聚合物应当具有低毒性且优选无毒或无细胞毒性。如下面讨论的，用于本发明组合物的优选聚合物是环糊精基聚合物。下述分子量在3,000-100,000范围内的水溶性线性环糊精共聚物是优选的，且那些分子量为3,000-50,000的是尤其优选的。

依照本发明，颗粒复合物中的聚合物可以是单一聚合物或两种或多种相同或不同聚合物的混合物，颗粒复合物中的每种聚合物可进一步含有或作进一步修饰以含有交联基团，通过交联基团使聚合物结合以形成颗粒复合物。

颗粒复合物中至少一种聚合物是能形成包合配合物的聚合物。“能形成包合配合物的聚合物”可以是任何能通过非键合作用(例如，范德华力、氢键、偶极-偶极相互作用、离子切削、憎溶剂作用等)与另一种化合物(配位剂)或化合物上的取代部分进行一种或多种主客体结合的聚合物。换句话说，至少一种聚合物具有主体或客体官能团以和配位剂或配位剂上的取代基形成包合配合物。主体或客体官能团可以是聚合物主链的一部分或可以作为取代基存在或可以在侧链或支链中存在。聚合物主链上具有主体官能团的聚合物实例是如下述的线性环糊精聚合物。具有不是聚合物主链上的客体官能团的聚合物实例将是具有侧链金刚烷基团的聚合物。可与聚合物使用的其它合适的“主体”的实例包括但不限于，carceronds、cavitands、冠醚、穴状配位体、cucurbiturils、杯芳烃、球状配位体等。适用于这些主体的包合客体的实例包括那些本领域内熟知的，例如，但不限于，金刚烷、二金刚烷、萘和胆固醇。

在某优选的实施方案中，聚合物可含有不同类型的主体或客体官能团，或是聚合物可以既具有主体官能团又具有客体官能团。这允许在给定的聚合物上形成不同的包合配合物时具有更大的灵活性。同一聚合物具有多个主体、多个客体，或既具有主体官能团又具有客体官能团，这提高了可通过包合配合物引入到本发明治疗组合物中的官能团的多样性。

作为主客体结合的结果，聚合物与配位剂相互作用以形成包合配合物。优选地，作为非键合作用或结合的结果，所得包合配合物显示出约＞10²的键合常数，优选地，约＞10³，且更优选地，约＞10⁴。典型地，键合常数将在10²-10⁶内变化。

颗粒复合物中的聚合物可用一种或多种配体修饰。配体可以在颗粒复合物形成时或形成后，通过治疗剂和/或颗粒复合物中聚合物的配体修饰而引入。配体可以是任何允许瞄准和/或键合所需细胞的配体。应该为本领域技术人员了解的是，对于某细胞的瞄准和键合可包括细胞受体结合，细胞受体结合反过来会引起受体介导的内吞。如果结合了两个或多个配体，配体可以是相同或不同的。合适的配体的实例包括但不限于，维他命(例如，叶酸)、蛋白质(例如，转铁蛋白和单克隆抗体)、单糖(例如，半乳糖)、肽和多糖。配体的选择，作为普通技能鉴别之一，可依赖所需的递送类型而变化。作为另一实施方案，配体可以是膜渗透性的或可渗透膜的试剂，例如来自HIV-1的TAT蛋白。TAT蛋白是病毒引起的转录活化物，它被激活引入到细胞核中。Torchilin，V.P.等，PNAS.98，8786-8791，(2000)。

在本发明的某优选实施方案中，颗粒复合物内至少一种聚合物是具有可以形成包合配合物的主体和/或客体官能团的基本上线性的聚合物。基本上线性的聚合物可以用本领域熟知的方法制备。聚合物可以用合适的能形成包合配合物的单体制备，或用单体混合物制备，其中至少一种单体具有主体或客体官能团。主体或客体官能团可存在于聚合物主链、聚合物侧链(或支链)内，或作为末端基团存在。选择性的，当聚合物形成后，它可以进一步修饰以增加主体和/或客体官能团，如上所述，以形成基本线性的能形成包合配合物的聚合物。基本线性的聚合物可以是嵌段共聚物，其中嵌段引入了一些性质，例如主体官能团、水分散性和/或水溶性。这些嵌段的实例包括，例如，线性聚乙烯亚胺(PE I)，含环糊精的线性聚合物、二(2-氨基乙基)-1，3-丙烷二胺(AEPD)以及N₂，N₂，N₃，N₃-(3’-PEG₅₀₀₀氨基丙烷)-二(2-氨基乙基)-1，3-丙烷二铵二-三氟乙酸盐(AEPD-PEG)。

在另一优选实施方案中，用于形成颗粒复合物的聚合物是含环糊精的聚合物，更优选如下所述的基本线性的环糊精聚合物。聚合物也可以是聚乙烯亚胺(PEI)或具有侧链环糊精的聚合物。线性环糊精共聚物是含有作为其聚合物主链组成部分的环糊精部分的聚合物。含有不是聚合物主链一部分而是附着于聚合物主链上的侧链环糊精部分的聚合物也可以用于本发明的组合物中。线性的含环糊精的聚合物可以是任何含有至少一个作为聚合物部分主链的环糊精部分的线性聚合物。含环糊精的聚合物优选水溶性的。更优选的，线性的含环糊精的聚合物是线性环糊精共聚物或线性氧化环糊精共聚物，分别如下所述。聚合物内的环糊精基团为聚合物提供了主体官能团，允许其形成包合配合物。能形成包合配合物的基本线性聚合物可进一步含有或可进一步修饰以含有附加官能团。(例如，硫醇基团)。

线性含环糊精的聚合物

可用于形成颗粒复合物的线性环糊精共聚物，从环糊精的至少一个吡喃(型)葡萄糖环的2、3或6位，到联接线性环糊精聚合物的环糊精的二价部分，含有双官能键合在其线性共聚物主链上的取代或非取代的环糊精部分。如WO 00/01734中所述，此线性环糊精共聚物含有分子式Ia、Ib(见下面)或其组合的重复单元。线性环糊精共聚物的制备和性质也描述于Gonzalez，H.，Hwang，S.和Davis，M.(1999)的《用于大分子治疗剂递送的新型聚合物》New class of polymer forthe delivery of macromoleculart herapeutics.生物共轭化学Bioconjugate Chem，10，1068-1074以及Hwang，S.，Bellocq，N.和Davis，M.(2001)的《在基因递送中含β-环糊精的聚合物的结构的影响》Effects of Structure of Beta-Cyclodextrin-ContainingPolymers on Gene Delivery.生物共轭化学Bioconjugate Chem，12(2)，280-290中，它们均在此引入作为参考。

在分子式Ia和Ib中，C是取代或非取代的环糊精单体而A是共聚单体，即，与环糊精C共价键合的共聚单体。环糊精单体C前体与共聚单体A前体聚合得到了线性环糊精共聚物。在单一的线性环糊精共聚物中，环糊精单体C单元可以是相同或不同的，且类似的，共聚单体A可以是相同或不同的。

环糊精单体前体可以是任何环糊精或本领域已知的衍生物。如上讨论，环糊精定义为通常含6-8个天然生成的α-(1，4)键合D(+)-吡喃(型)葡萄糖单元的环多糖。优选地，环糊精单体前体是含有6个、7个或8个吡喃(型)葡萄糖单元的环糊精，即，分别为(α)-环糊精、(β)-环糊精和(γ)-环糊精。环糊精衍生物可以是任何本领域已知的取代环糊精，如下所述，其中取代部分不干扰与共聚单体前体A的共聚合。环糊精衍生物可以是中性的、阳离子化的或阴离子化的。合适的取代部分的实例包括但不限于，羟烷基，例如羟丙基、羟乙基；醚基团，例如二羟丙基醚、甲基羟乙基醚、乙基羟乙基醚和乙基羟丙基醚；烷基，例如甲基；糖类，例如葡糖基和麦芽糖基；酸基，例如羧酸、磷酸、亚磷酸、膦酸、亚膦酸、硫代磷酸和磺酸；咪唑基；硫酸盐基；和受保护的硫醇基。

环糊精单体前体可进一步化学修饰(例如，卤化、氨基化)以促进或影响环糊精单体前体与共聚单体前体A的共聚合，如下所述。环糊精单体前体的化学修饰允许在每个环糊精部分上只有两个位置聚合，即，生成双官能化的环糊精部分。每个吡喃(型)葡萄糖环的C1-C6位置的编号图如下所示：

在优选的实施方案中，聚合发生在环糊精部分的C2、C3和C6中的任意两个位置，包括其组合。例如，一个环糊精单体前体可以在两个C6位置聚合而另一个环糊精单体前体可以在环糊精部分的C2和C6位置聚合。使用β-环糊精作为实例，环糊精中每个吡喃(型)葡萄糖环相对位置的字母图如下所示：

在线性环糊精共聚物的优选实施方案中，环糊精单体C具有下面的通式(II)：

在式(II)中，n和m代表整数，它们与其它两个吡喃(型)葡萄糖环一起，定义了环糊精单体中总的吡喃(型)葡萄糖单元数。式(II)代表环糊精单体，它可以在环糊精单元的两个C6位置聚合。式(II)的环糊精单体实例包括但不限于，6^A，6^B-二脱氧-α-环糊精(n＝0，m＝4)、6^A，6^C-二脱氧-α-环糊精(n＝1，m＝3)、6^A，6^D-二脱氧-α-环糊精(n＝2，m＝2)、6^A，6^B-二脱氧-β-环糊精(n＝0，m＝5)、6^A，6^C-二脱氧-β-环糊精(n＝1，m＝4)、6^A，6^D-二脱氧-β-环糊精(n＝2，m＝3)、6^A，6^B-二脱氧-γ-环糊精(n＝0，m＝6)、6^A，6^C-二脱氧-γ-环糊精(n＝1，m＝5)、6^A，6^D-二脱氧-γ-环糊精(n＝2，m＝4)和6^A，6^B-二脱氧-γ-环糊精(n＝3，m＝3)。

在另一个线性环糊精共聚物的优选实施方案中，共聚物可含有葡萄糖开环环糊精单体C单元，其中环糊精的一个或几个吡喃(型)葡萄糖环在保持环糊精环体系的同时被打开了。下面的通式(III)描绘了在C2、C3位置开环的吡喃(型)葡萄糖开环环糊精。

在式(III)中，p在5-7变化。式(III)中，环糊精单体的至少一个D(+)-吡喃(型)葡萄糖单元经历过开环，以允许在环糊精单元的C2、C3位置发生聚合反应。式(III)的环糊精单体，例如2^A，3^A-二氨基-2^A，3^A-二脱氧-β-环糊精和2^A，3^A-二醛基-2^A，3^A-二脱氧-β-环糊精，可从Carbomer of Westborough，MA商购。式(III)的环糊精单体的实例包括但不限于2^A，3^A-二脱氧-2^A，3^A-二氢-α-环糊精、2^A，3^A-二脱氧-2^A，3^A-二氢-β-环糊精、2^A，3^A-二脱氧-2^A，3^A-二氢-γ-环糊精，它们通常分别称作2，3-二脱氧-α-环糊精、2，3-二脱氧-β-环糊精和2，3-二脱氧-γ-环糊精。

共聚单体A前体可以是任意的直链或支链、对称或不对称化合物，如上所述，此化合物在与环糊精单体前体反应时，将两个环糊精单体连接在一起。优选地，共聚单体A前体是含有至少两个交联基团的化合物，通过此交联基团可进行环糊精单体的反应及键合。每个共聚单体A前体的可能的交联基团的实例，它们可以是相同或不同的、末端或内部的，包括但不限于，氨基、酸、酯、咪唑和卤化酰基以及它们的衍生物。在优选的实施方案中，两个交联基团是相同的且是末端基团。在共聚单体A前体与环糊精单体前体共聚时，可以通过将一个环糊精单体的伯羟基侧与另一个环糊精单体的伯羟基侧结合、通过将一个环糊精单体的仲羟基侧与另一个环糊精单体的仲羟基侧结合、或通过将一个环糊精单体的伯羟基侧与另一个环糊精单体的仲羟基侧结合，而将两个环糊精单体键合在一起。因此，最终共聚物中可能存在这些键合的组合。

共聚单体A前体和最终共聚物的共聚单体A都可以是中性、阳离子化(例如，通过含质子化基团如季铵基团)或阴离子化的(例如，通过含去质子化基团如硫酸盐、磷酸盐或碳酸盐阴离子基团)。带电共聚单体A前体或共聚单体A的反离子可以是任何合适的反阴离子或反阳离子(例如，阳离子化共聚单体A前体或共聚单体A的反阴离子可以是卤素(例如氯)阴离子)。共聚物的共聚单体A的电荷可以通过调节pH条件而调节。

合适的共聚单体A前体的实例包括但不限于，胱胺、1，6-二氨基己烷、二咪唑、二硫代咪唑、精胺、二硫代精胺、二组氨酸、二硫代组氨酸、琥珀酰亚胺(例如二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸盐)(DSP)和二琥珀酰亚胺基辛二酸盐(DSS))，以及酰亚胺盐(例如，二甲基-3，3’-二硫代二丙酰亚胺盐(DTBP))。共聚单体A前体与环糊精单体前体的共聚形成了线性环糊精共聚物，含有具下列通式的共聚单体A的键合：

-HNC(O)(CH₂)_xC(O)NH-，-HNC(O)(CH₂)_xSS(CH₂)_xC(O)NH-，

-⁺H₂N(CH₂)_xSS(CH₂)_xNH₂ ⁺-，-HNC(O)(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂C(O)NH-，

＝NNHC(O)(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂C(O)NHN＝，

-⁺H₂NCH₂(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂CH₂NH₂ ⁺-，

-HNC(O)(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂SS(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂C(O)NH-，

-HNC(NH₂ ⁺)(CH₂CH₂O)_xCH₂CH₂C(NH₂ ⁺)NH-，

-SCH₂CH₂NHC(NH₂ ⁺)(CH₂)_xC(NH₂ ⁺)NHCH₂CH₂S-，

-SCH₂CH₂NHC(NH₂ ⁺)(CH₂)_xSS(CH₂)_XC(NH₂ ⁺)NHCH₂CH₂S-，

-SCH₂CH₂NHC(NH₂ ⁺)CH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xC(NH₂ ⁺)NHCH₂CH₂S-，

在上面通式中，x＝1-50且y+z＝x。优选地，x＝1-30。更优选地，x＝1-20。在优选的实施方案中，共聚单体A含有可生物降解的键如二硫键。共聚单体A还可以含有酸不稳定官能团，例如酯或其它本领域技术人员已知的酸不稳定基团。

在另一个优选的实施方案中，共聚单体A前体及此共聚单体A可以选择性地挑选以获得合意的应用。例如，为了递送小分子治疗剂，带电聚合物可能不是必需的并且共聚单体A可以是，或者含有亲水基团，例如聚乙二醇基团，以进一步提高水溶性。对多肽治疗剂如DNA或蛋白而言，共聚单体A优选带有阳离子化电荷以提高线性环糊精共聚物与多肽治疗剂形成颗粒复合物的能力。还应了解，线性环糊精共聚物可以含有共聚单体A基团的混合物。

线性环糊精共聚物可通过环糊精单体前体的共聚而制备，此环糊精单体前体是由合适的离去基团及能代替离去基团的共聚单体A前体双取代的。离去基团，它可以是相同或不同的，可以是本领域中已知的任何离去基团，它可以在共聚时被共聚单体A前体代替。

线性环糊精共聚物可通过下面方式制备，即碘化环糊精单体前体形成二碘化环糊精单体前体，并将二碘化环糊精单体前体与共聚单体A前体共聚形成线性环糊精共聚物，它具有分别如上述式Ia、Ib的重复单元或其组合。

制备线性环糊精的另一种方法是将上述环糊精单体前体碘化，以形成式Iva、Ivb、Ivc的双碘化环糊精单体前体或其混合物：

二碘化环糊精可以通过本领域已知的任何方法制备(见，例如，Tabushi等，J.Am.Chem.106，5267-5270(1984)；Tabushi等，J.Am.Chem.106，4580-4584(1984))。例如，β-环糊精可以在无水吡啶存在下和联苯基-4，4’-二磺酰氯反应，生成联苯基-4，4’-二磺酰氯封端的β-环糊精，然后此联苯基-4，4’-二磺酰氯封端的β-环糊精可以和碘化钾反应，以生成二碘-β-环糊精。环糊精单体前体只在两个位置碘化。通过双碘化环糊精单体前体和共聚单体A前体的共聚，如上所述，可以制备具有上述式Ia、Ib的重复单元或其组合的线性环糊精聚合物。如果合适，碘基团可以用其它已知的离去基团代替。

碘基团或其它合适的离去基团可以用允许和共聚单体A前体反应的基团代替，如上所述。例如，式Iva、Ivb、Ivc的双碘化环糊精单体前体或其混合物可以氨基化以形成式Va、Vb、Vc的二氨基化环糊精单体前体或其混合物：

二氨基化环糊精单体前体可通过本领域已知的任何方法制备(见，例如，Tabusih等，《四面体快报》(Tetrahedron Lett.)18：1527-1530(1997)；Mungall等，《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)1659-1662(1975))。例如，二碘-β-环糊精可与叠氮化钠反应，接着还原成二氨基-β-环糊精。环糊精单体前体只在两个位置氨基化。然后二氨基化环糊精单体前体可与上述共聚单体A前体共聚，以生成具有上述式Ia、Ib的重复单元或其组合的线性环糊精共聚物。然而，二氨基化环糊精单体前体的氨基官能团不需要与环糊精部分直接相连。或者，可以通过用含氨基的部分，例如^-SCH₂CH₂NH₂来代替环糊精单体前体的碘或其它合适的离去基团而引入氨基官能团，生成式Vd、Ve、Vf、Vg、Vh和Vi的二氨基化环糊精单体前体或其混合物。

线性环糊精共聚物还可以通过还原线性氧化环糊精共聚物而制备，如下所述。只要共聚单体A不含有可还原的部分或基团，例如，二硫键就可以使用此方法。

可氧化线性环糊精共聚物以在共聚物中引入至少一个氧化的环糊精单体，使得氧化的环糊精单体是聚合物主链的组成部分。含有至少一个氧化的环糊精单体的线性环糊精共聚物被称之为线性氧化环糊精共聚物。于是，线性氧化环糊精在线性共聚物主链中具有与双官能化部分，即共聚单体A部分双官能化键合的取代或非取代环糊精部分，键合位置在环糊精的至少一个吡喃(型)葡萄糖环的2，3或6位，共聚单体A部分连接了线性环糊精聚合物的环糊精部分，其中环糊精部分的吡喃(型)葡萄糖环是被氧化的。环糊精单体可以在环糊精部分的仲或伯羟基侧氧化。如果在线性氧化环糊精共聚物中存在多于一个氧化环糊精单体，就可以存在伯羟基侧、仲羟基侧氧化的相同或不同的环糊精单体。为便于说明，带有氧化仲羟基的线性氧化环糊精共聚物具有，例如，至少一个式VIa或VIb单元。

在式VIa和VIb中，C是取代或非取代氧化环糊精单体且A是与氧化环糊精C键合，即共价键合的共聚单体。在式VIa和VIb中，仲羟基的氧化引起环糊精部分的开环并形成醛基。

线性氧化环糊精共聚物可通过上述线性环糊精共聚物的氧化而制备。线性环糊精共聚物的氧化可通过本领域已知的氧化技术完成(Hisamatsu等，《淀粉》(Starch)44：188-191(1992))。优选地，使用氧化剂如过氧化钠。应该为本领域普通技术人员了解的是，在标准氧化条件下每种共聚物的氧化程度可能不同。从而在某实施方案中，线性氧化共聚物可以含有一个氧化环糊精单体。在另一个实施方案中，基本上共聚物所有的环糊精单体都氧化了。

制备线性氧化环糊精共聚物的另一种方法包括氧化上述二碘化或二氨基化环糊精单体前体以生成氧化的二碘化或二氨基化环糊精单体前体，以及将氧化的二碘化或二氨基化环糊精单体前体与共聚单体A前体共聚。在优选的实施方案中，式VIIa、VIIb、VIIc的氧化二碘化环糊精单体前体或其混合物是：

氧化环糊精单体可通过氧化上述式IVa、IVb、Ivc的二碘化环糊精单体前体或其混合物而制备。在另一实施方案中，式VIIIa、VIIIb、VIIIc的氧化二氨基化环糊精单体前体或其混合物可通过氨基化上述式VIIa、VIIb、VIIc的氧化二碘化环糊精单体前体或其混合物而制备。

在另一实施方案中，式IXa、IXb、IXc、IXd、IXe、IXf的氧化二氨基化环糊精单体前体或其混合物可通过取代氧化环糊精单体前体上的碘或其他合适的离去基团而制备，其中氧化环糊精单体前体被碘或其他合适的离去基团以及含氨基的-SCH₂CH₂NH₂部分双取代。

或者，上述氧化二碘化、二羧酸或二氨基化环糊精单体前体的制备可通过氧化环糊精单体前体，形成氧化环糊精单体前体，然后二碘化和/或二氨基化上述氧化的环糊精单体。任何二氨基化氧化环糊精单体的胺基可以进行保护以避免不需要的副反应。如上所述，环糊精部分可用其它离去基团修饰而不用碘基团和其它含氨基的官能团。氧化二碘化或二氨基化环糊精单体前体接着同共聚单体A前体共聚合形成线性氧化环糊精共聚物。

线性环糊精共聚物或线性氧化环糊精共聚物用至少一个共聚单体A前体或共聚单体A前体的水合产物封端。用至少一个共聚单体A前体给环糊精共聚物封端的结果是，上述游离衍生基团出现在每一线性环糊精共聚物或每一线性氧化环糊精共聚物中。例如，衍生基团可以是酸性基团或与酸性基团水合的衍生基团。依照本发明，为了合意地提高环糊精共聚物的性质，如胶态稳定性和转染效率，衍生基团可进一步化学修饰。例如，衍生基团的修饰可以通过和PEG反应，生成PEG封端环糊精共聚物从而提高胶态稳定性，或通过和组氨酸或咪唑乙酸反应，生成咪唑基封端环糊精共聚物从而提高细胞内效率(如内体释放)和转染效率。见图29和图30。

环糊精共聚物上进一步的化学反应可通过修饰衍生基团来完成。例如，修饰衍生基团可用于延伸聚合物链，这是通过将线性环糊精共聚物或线性氧化环糊精共聚物与相同或不同环糊精共聚物或非环糊精聚合物连接而进行的。用于添加的聚合物可以是相同或不同的线性环糊精共聚物或线性氧化环糊精共聚物，它们也可以用共聚单体A前体封端以进一步修饰。

或者，至少两个相同或不同的含有上述封端衍生基团或封端修饰衍生基团的线性环糊精共聚物或线性氧化环糊精共聚物，可以通过官能团或修饰衍生基团反应并连接在一起。优选地，在官能团或修饰衍生基团的反应后，形成了可降解部分如二硫键。例如，用胱氨酸对封端衍生基团的修饰可用于生成具有游离硫醇基的线性环糊精共聚物或线性氧化环糊精共聚物。同含有游离硫醇基的相同或不同环糊精共聚物的反应会生成这两种共聚物间的二硫键。可以选择官能化的或修饰的衍生基团以提供具有不同降解速度的键(例如，借助酶降解)并且，如果需要，可提供用于治疗剂的时间释放体系。如这里所得聚合物可以交联。如这里所述，治疗剂可以在聚合物交联前或交联后加入。通过修饰的衍生基团可以在环糊精共聚物上键合配体。例如，线性环糊精共聚物或线性氧化环糊精共聚物可以用连接在环糊精共聚物上的配体进行修饰。配体通过环糊精单体C或共聚单体A连接到环糊精共聚物上。优选地，配体连接在环糊精共聚物的环糊精部分。见WO00/01734，在此引作参考。

支化的含环糊精的聚合物

具有主体和/或客体官能团的颗粒复合物的聚合物也可以是基本上支化的聚合物，例如，支化的聚乙烯亚胺(PEI)或支化的含环糊精聚合物，优选地，支化的含环糊精聚合物。支化的含环糊精聚合物可以是任意含至少一个环糊精部分的水溶性支化聚合物，其环糊精部分是聚合物主链的一部分和/或聚合物主链的侧基。支化的含环糊精聚合物是支化的环糊精共聚物或支化的氧化环糊精共聚物。支化的环糊精共聚物或支化的氧化环糊精共聚物分别是上述线性的环糊精共聚物或线性氧化环糊精共聚物中有支化的侧链。支化的侧链可以是任意的饱和或不饱和、线性或支化的碳氢链。支化的侧链可进一步包含不同的衍生基团或取代基，例如，羟基、氨基、酸、酯、酰胺，酮、甲酰基和硝基。支化的侧链还可包含环糊精或其它主体或客体官能化部分。支化的侧链可以用配体修饰。此类配体修饰包括但不限于将配体连接到支化侧链中的环糊精部分上。

优选地，支化的含环糊精聚合物是支化的环糊精共聚物或支化的氧化环糊精共聚物，其中支化的侧链包含环糊精部分。如果支化侧链包含环糊精部分，环糊精部分有助于包合配合物的形成以及治疗剂的包封。优选地，支化侧链的环糊精部分有助于包合配合物的形成以及将治疗剂包合进聚合物主链中的环糊精部分。支化的含环糊精聚合物可以按照本领域中任意的已知方法制备，方法包括但不限于用环糊精单体前体进行聚合物(例如线性或支化的聚乙烯亚胺)衍生化(例如，取代)。具有侧链环糊精的聚合物的实施例描述于Tojima等，J.Polym.Sci.Part A：Polym.，Sci.Part.A：Polym.Chem.361965(1998)，Crini等，Eur.Polym.J.33，1143，(1997)，Weichenmeier等，Maromol.Rapid Commum.17，731(1996)，以及Bachmann等，J.Carbohydrate Chemistry 17，1359(1998)；在此引入作为参考。(weichenmei er的文章描述了环糊精侧链聚酯，其合成及金刚烷衍生物的包合)。支化的含环糊精聚合物可按上述方法交联。

用于本发明的聚乙烯亚胺的重均分子量在约800-800,000道尔顿之间，优选的在约2,000-100,000道尔顿之间，更优选的在约2,000-25,000道尔顿之间。聚乙烯亚胺可以是线性或支化的。合适的聚乙烯亚胺化合物有很多商业来源，包括Aldrich化学品公司的聚乙烯亚胺、Polysicencs的聚乙烯亚胺以及BASF公司的POLYMIN聚乙烯亚胺和LUPASOL^TM聚乙烯亚胺。

其它主体官能化聚合物

如上面讨论的颗粒复合物的至少一种聚合物是能够形成包合配合物的聚合物。具有优选的环糊精主体官能团的聚合物以及大量的制备方法在上面均有描述。以同样的方法，具有主体官能团的任何线性或支化聚合物可用于本发明的实践中。其它可以同聚合物一起使用的合适的“主体”的实施例包括但不限于，cavitands、冠醚、穴状配位体、cucurbiturils、杯芳烃、球状配位体等。这些其它的主体聚合物可以用上述制备含环糊精聚合物的同样方法进行制备。感兴趣的主体可以通过官能团如羟基进行衍生以连接离去基团如碘、甲苯磺酸盐等，并和合适的共聚单体A反应以取代离去基团并形成主体共聚物。或者，主体可包含或衍生化后包含官能团如胺或羧基，使得主体能够同共聚单体A进行缩合反应而生成主体共聚物。然后可以制备在聚合物主链中含有主体官能团混合物的主体共聚物，和在支链中含有主体官能团混合物的主体共聚物，如果共聚物是支化的。

客体官能化聚合物

客体官能化聚合物可以是任何能与主体官能化配位剂形成包合配合物的聚合物。典型地，客体官能团将存在于侧链或端基上。具有不作为聚合物主链一部分的客体官能团的聚合物实例是具有侧链金刚烷基团的聚合物。可引入到聚合物中的内含官能团的实例包括那些本领域已知的如，但不限于，金刚烷、二金刚烷、萘和胆固醇。

B.治疗剂

依照本发明，至少一种治疗剂包合在聚合物中以形成上述颗粒复合物。术语“治疗剂”意指包含任意具有制药学或治疗学用途的下述活化剂作为活性化合物或有杀微生物用途的试剂。此类治疗剂(或活化剂)的实例如下述。包合定义为任意将治疗剂与聚合物结合(例如静电相互作用、亲水相互作用、实际包合)的方法。结合度可由本领域已知的技术决定且依赖治疗剂而变化，技术包括例如，荧光研究、DNA迁移研究、光散射、电子显微术。作为递送模式例如，含有由颗粒复合物的聚合物生成的多维聚合物网络的上述治疗组合物，和DNA可用于协助转染，即将DNA吸收到动物(例如人类)细胞内。(Boussif，O.国家科学学术进展Proceedings of the Natioanl Academy ofSciences，92：7297-7301(1995)；Zanta等，生物共轭化学Bioconjugate Chemistry，8：839-844(1997)；Gosselin等，“用可逆交联的低分子量聚乙烯亚胺进行有效的基因传递”“EfficientGene Transfer Using Reversibly Cross-Linked Low MolecularWeight Polyethylenimine”，药学院，俄亥俄州立大学College ofPharmacy，The Ohio Statue University，网络版，修改稿July5，2001.))。当治疗剂是基于核酸(例如DNA)时，聚合物和治疗剂所形成的复合物可以是“polyplex”形式。polyplex是一种核酸和计量聚合物之间的复合物。见，Felgner等，“合成基因传递系统的命名规则”“Nomenclature for Synthetic Gene Delivery Systems”.Hum Gene Ther.8，511-512(1997)。

治疗剂的任意治疗剂混合物可与本发明的组合物一起使用。形成颗粒复合物后，治疗剂可以或不可以保持它的生物或治疗活性。从治疗组合物中释放后，特别地，从颗粒复合物的聚合物中释放后治疗剂保留活性。或者，在前药的情形中保留了潜在活性。从而，颗粒复合物有利地为治疗剂提供了保护使之不因为，例如降解而失去活性并提供了增强的生物药效率。因此，本发明的组合物可用于为治疗剂或任意活性化学化合物提供稳定性，尤其是存储或溶液稳定性。亲脂性的治疗剂的包合给亲脂性的治疗剂提供了增加的，如果不是完全的，溶解性。在形成颗粒复合物或治疗组合物之前或之后，治疗剂可进一步用配体修饰。

治疗剂可以是任意亲脂的或亲水的、合成的或天然生成的生物活性治疗剂，包括那些本领域已知的。Merck索引，化学品、药物和生物制剂百科全书，The Merck Index，An Encyclopedia of Chemicals，Drugs，and Biological，13^th Edition，2001，Merck and Co.，Inc.，Whitehouse Station，NJ.这些治疗剂的实例包括但并不限于小分子药物、抗生素、类固醇、多(聚)核苷酸(例如基因组DNA、cDNA、mRNA、反义寡(聚)核苷酸、病毒和嵌合多(聚)核苷酸)、质粒、肽、肽片段、小分子(例如阿霉素)、螯合剂(如去铁胺(DESFERAL)、乙二胺四乙酸(EDTA))、天然产物(如紫杉醇、两性霉素)和其它生物活性大分子如蛋白质和酶。参见美国专利6,048,736，其列举了作为客体同环糊精聚合物形成内含化合物的活性剂(治疗剂)。美国专利6,048,736的公开内容在此引作参考。小分子治疗剂并不仅仅是复合物颗粒内的治疗剂，而是，在另外的实施方案中，可以是共价键合到复合物中的聚合物上。优选地，共价键是可逆的(例如通过前药形式或可生物降解连接键如二硫键)并且提供递送治疗剂的另一种方法。

2.配位剂

根据本发明，配位剂是一种具有主体或客体官能团的化合物，其能够和颗粒复合物中具有相应客体或主体官能团的聚合物形成包合配合物。如上所述，客体配位剂可用于修饰具有主体官能团的颗粒复合物的聚合物或具有主体官能团的聚合物的单体以形成包合配合物。还如上所述，主体配位剂作为对聚合物客体官能团的主体可以同至少一种颗粒复合物中的聚合物形成包合配合物。配位剂具有两个或更多内含官能团。例如，具有两个内含官能团的配位剂可以是客体，客体；主体，主体；或主体，客体配位剂。配位剂可以含有多个主体和/或客体官能团的混合物。配位剂也包含为本发明组合物提供有益性能的官能团。官能团可以是，例如，配体、亲水或憎水基团、额外的治疗剂等。配位剂也可以包括内含客体或主体和官能团之间的空间臂基团。

优选地，配位剂键合常数约大于10²，优选地，约大于10³和更优选地约大于10⁴。一般地，键合常数在约10²和10⁶之间。适合用作配位剂的内含客体的实例包括那些本领域已知的，例如，但并不限于金刚烷、二金刚烷、萘、胆固醇或其衍生物。优选地，使用金刚烷和二金刚烷。Amiel等，聚合物分析和表征国际杂志Int.J.PolymerAnalysis & Characterization，Vol.1，289-300(1995)；Amiel等，化学中的内含现象和分子识别杂志Journal of Inclusion Phenomenaand Molecular Recognition in Chemistry，25：61-67(1996)；Amiel等，胶体和界面科学进展Advances in Colloid and InterfaceScience，79，105-122(1999)；和Sandier等Langmuir，16，1634-1642(2000)。

配位剂还可以包含能够为本发明组合物提供益处的官能团。通过简单地加上羟基或氨基官能团就可以引入官能团。在一个优选的实施方案中，配位剂可以同颗粒复合物中的聚合物形成包合配合物，同时也改变了复合物，以利于细胞接触，细胞内运输和/或细胞输入和释放。可以使用本领域熟知的任何基团。合适的“官能”团的实例包括但并不限于配体、核定位信号(见Zanta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，pp.91-96(1999)、内体释放肽、内体释放大分子、膜渗透剂或其混合物。核定位信号(NLS)可以是本领域熟知的任何核定位信号。内体释放肽或大分子可以是本领域熟知的任意内体释放肽或大分子(例如，HA-2和GALA)。见“Gene delivery by negativelycharged ternary complexs of DNA，cationic liposomes andtransferrin or fusigenic peptides”Simoes S，Slepushkin V，Gaspar R，de Lima MCP，Duzgunes N，《基因治疗》GENE THERAPY5：(7)955-964 JUL 1998。细胞膜渗透(或细胞膜渗透剂)的实例是源自HIV-1的TAT蛋白。TAT蛋白是能够活性地引入细胞核的病毒转录活化剂。Torchilin，V.P.等，PNAS.98，8786-8791，(2001)。

配位剂也可用聚合物进行官能化以增加溶解度和/或赋予稳定性，尤其是在生理条件下。组合物的稳定性可以通过使用具有亲水基团或亲油基团的配位剂实现或提高。优选的亲水基团类型是聚乙二醇或含聚乙二醇的共聚物。优选的聚乙二醇的分子式为HO(CH₂CH₂O)_zH，其中z从2到500，优选10-300。PEG600、PEG3400和PEG5000是能够用于本发明的代表聚乙二醇。一般地，配位剂中聚乙二醇的分子量越高，组合物的稳定性就越大。一般优选较高分子量的聚乙二醇。优选的配位剂是PEG化的金刚烷或PEG化的二金刚烷。一些用作配位剂的金刚烷-聚乙二醇分子结构见图1。为了增加亲脂性(憎水性)，配位剂可以包含亲脂性基团如长链烷基，脂肪酸等。亲脂性基团的选择依赖于需要的亲脂程度。从这一讨论可以看出，配位剂可以用任何的官能团修饰以在组合物中引入所需要的性能。配位剂可以采用标准的有机技术制备。采用不同配位剂的混合物可以在得到所需组合物性能方面有比较大的变化和特异性。

可利用空间臂将官能团连接到配位剂上。空间臂可以是本领域熟知的任意空间臂，其不会对客体配位剂或官能团的性能产生不利影响。例如，空间臂可以是直接连接，使官能团直接连接到配位剂上。或者，空间臂是水溶性部分，在生理pH下高度阴离子化或在酸性条件下具有融合能力。优选地，空间臂提高了包合配合物中的配位剂同聚合物的键合亲和性(例如，含谷氨酸残基、羧酸基等的阴离子空间臂)。空间臂也可包含可还原的连接(如二硫键)，其还原可以从配位剂释放官能团。合适的空间臂例子包括但并不限于直接连接、聚谷氨酸、GALA和聚乙二醇(PEG)。

官能团也可以是额外的治疗剂。治疗剂可逆地键合在配位剂上(例如通过前药形式或可生物降解连接键)。这借助配位剂提供了一种传递额外治疗剂的方法。

从上面的讨论可以理解，本发明组合物采用的配位剂是分子式如下的化合物：

其中

J是-NH-，-C(＝O)NH-(CH₂)_d-，-NH-C(＝O)-(CH₂)_d-，-CH₂SS-，-C(＝O)O--(CH₂)_c-O-P(＝O)(O-(CH₂)_c-Y)O-，

肽或多肽残基，或

-NH-(C＝O)-CH(R¹)-NH-(C＝O)-CH(R¹)-NH-；

Y是额外的主体/客体官能团；

R¹是-(CH₂)_a-CO₂H，其酯或盐；或-(CH₂)_a-CONH₂；

PEG是-O(CH₂CH₂O)_z-，其中z从2到500；

L是H，-NH₂，-NH-(C＝O)-(CH₂)_c-(C＝O)-CH₂-，-S(＝O)₂-HC＝CH₂，-，-SS-，-C(＝O)O-或碳水化合物残基；

a是0或1；

b是0或1；

d在0-6范围内；

e在1-6范围内；

n在0-6范围内；

y是0或1；且

x是0或1。

配位剂也可以是下式的化合物：

其中变量与上述相同，其中m在1-5范围内，q在1-5范围内，且w在1-5范围内。

如所述，客体官能团的实例包括但不限于金刚烷基、萘基、胆固醇且优选的主体官能团是环糊精。主体和客体官能团的混合物，如式中所指，可存在于配位剂中。

具有金刚烷客体官能团的优选配位剂类型是下式的化合物：

其中

J是-NH-，-C(＝O)NH-(CH₂)_d-，-NH-C(＝O)-(CH₂)_d-，-CH₂SS-，-C(＝O)O--(CH₂)_c-O-P(＝O)(O-(CH₂)_c-Ad)O-，

肽或多肽残基，或

-NH-(C＝O)-CH(R¹)-NH-(C＝O)-CH(R²)-NH-；

Ad是金刚烷基；

R¹是-(CH₂)_a-CO₂H、其酯或其盐；或-(CH₂)_a-CONH₂；

PEG是-O(CH₂CH₂O)_z-，其中z在2-500范围内变化；

L是H，-NH₂，-NH-(C＝O)-(CH₂)_c-(C＝O)-CH₂-，-S(＝O)₂-HC＝CH₂-，-SS-，-C(＝O)O-或碳水化合物残基；

a是0或1；

b是0或1；

d在0-6范围内；

e在1-6范围内；

y是0或1；且

x是0或1。

通过使用官能化配位剂，本发明的治疗组合物可被修饰或官能化以利于细胞接触和/或细胞进入。为获得多功能和/或益处，组合物可使用具不同官能团的配位剂而形成两种或多种类型的包合配合物。如上所述，可使用配体来修饰颗粒复合物的聚合物或配位剂。因此，依照本发明，本发明的组合物可通过包合配合物而含有多于一种的配体，并因此含有多于一个的细胞定位和/或传输位点。具有多配体或其它官能化配位剂的颗粒复合物可通过加入有稳定或溶解官能团的配位剂而稳定，如PEG化的配位剂。

由于聚合物可与不同的官能化配位剂混合物形成多种包合配合物，本发明治疗组合物可含有，例如，多种治疗剂、不同的配体和/或各种稳定性聚合物。配位剂用治疗剂或前药进行官能化而形成多种包合配合物，这允许使用相同的治疗组合物来递送多种治疗剂。如果存在配体，则治疗剂的整个组合(或鸡尾酒)可直接指向特定的细胞类型、疾病或其它治疗作用。

官能化客体配位剂可通过本领域已知的任意方法制备。见Amiel等，聚合物分析和表征国际期刊Int.J.Polymer Analysis &Characterization，Vol.1，289-300(1995)；Amiel等，化学中的包合现象和分子识别期刊Journal of Inclusion Phenomena andMolecular Recognition in Chemistry，25，61-67(1996)；Sandier等，Langmuir，16，1634-1642(2000)。

3.本发明组合物的制备

本发明还涉及制备组合物的方法。此方法结合了治疗剂、具主体或客体官能团的聚合物和配位剂以形成治疗组合物。用作客体或主体的配位剂与聚合物形成了包合配合物。在另一实施方案中，聚合物首先同治疗剂结合形成了颗粒复合物。然后颗粒复合物与配位剂结合形成了治疗组合物的包合配合物。组合物的形成也可以通过首先将聚合物与配位剂混合，然后将混合物与治疗剂结合，以形成复合物并从而得到本发明的组合物。

A.聚合物-试剂颗粒复合物的形成

治疗剂和聚合物的颗粒复合物可以按照本领域已知的任何方法制备。例如，通过简单地将治疗剂同聚合物接触、共混或分散制备颗粒复合物。例如，聚合物和治疗剂可以在可溶解两者的溶剂中共混；在可溶解聚合物而分散治疗剂的溶剂中共混；或能够分散聚合物和治疗剂但溶解颗粒复合物的溶剂中共混。对于制药应用来说，溶剂是任何生理上可接受的水溶液。颗粒复合物可以通过将聚合物和治疗剂结合、聚合物的自身结合或按照化学方法来制备。在形成颗粒复合物以前，颗粒复合物中的聚合物一般不以基本结合的结构存在，例如，聚合物凝胶。但是，聚合物作为依赖于聚合物特点的颗粒复合物的一部分，可以和治疗剂形成基本结合的结构如凝胶。颗粒复合物也可以通过治疗剂存在情况下聚合相同或不同的单体以形成线性或支化聚合物来制备。颗粒复合物也可以通过聚合相同或不同的单体来制备，单体聚合能够在治疗剂存在情况下形成线性或支化聚合物，其中治疗剂作为聚合的模板。Trubetskoy等，Nucleic Acids Research，Vol.26，No.18，pp4178-4185(1998)。

所用聚合物和治疗剂的量可以是任意可以组装颗粒复合物的量。一般地，聚合物的用量要超过治疗剂的量。当用于制备的聚合物带正电荷或负电荷，例如带正电荷的共聚单体A或聚烷撑亚胺如PEI和当治疗剂带电如阴离子多(聚)核苷酸时，聚合物和治疗剂的比例可以用电荷比来表示。电荷比为聚合物的电荷和治疗剂的电荷之比。如实施例中所示，阳离子环糊精聚合物和阴离子DNA的颗粒复合物一般按照5+/-的比例配制，也就是环糊精聚合物的五份正电荷和DNA的一份负电荷的比。电荷比可以是能够形成颗粒复合物的任意比例并且可以超过必须的最小电荷比。如果聚合物和/或治疗剂不带电，聚合物和治疗剂的量或比例可以根据本领域熟知的重量、摩尔或浓度来表示。

根据本发明，可以在足以形成包含治疗剂和多维聚合物网络的颗粒复合物的条件下处理颗粒复合物中的聚合物。此类多维聚合物网络描述于WO00/33885，在此引作参考。如WO00/33885所述，在足以形成多维聚合物网络的条件下处理颗粒复合物的聚合物可以采用任何合适的反应条件来完成，这些条件包括加入能够促进颗粒复合物的聚合物和治疗剂连接的额外试剂或反应剂。聚合物可以通过聚合物内的共价键、非共价键(如离子键)或非共价相互作用(如范德华相互作用)连接。通过聚合物的聚合物间共价键、非共价键或非共价相互作用连接也会发生。作为这样连接的结果，颗粒复合物的聚合物相互作用形成多维聚合物网络。

在本发明的一个实施方案中，形成包含治疗剂和多维聚合物网络的颗粒复合物涉及交联反应。例如，如果颗粒复合物的聚合物是单独的聚合物分子，聚合物可以和分子、寡聚物或不同的聚合物反应以促进交联或形成交联，使之得到颗粒复合物的聚合间部交联或与颗粒复合物中单独的聚合物分子的实际交联。类似地，如果颗粒复合物的聚合物是两种或更多种聚合物的混合物，聚合物可以同分子、寡聚物或不同聚合物反应以促进交联或形成交联。所得交联可以是聚合物内和/或聚合物间的，优选聚合物内的颗粒复合物的聚合物交联。

交联剂可以是本领域熟知的任何交联剂。交联剂可以是任何能够促进颗粒复合物内部交联或可以实际上同颗粒复合物的聚合物交联的寡聚物或聚合物(如聚乙二醇、聚乙烯)。交联寡聚物或聚合物可以与颗粒复合物的聚合物相同或不同。同样地，交联剂可以是任何能够同颗粒复合物的聚合物交联的合适分子。交联剂本身可以包含配体。

形成多维聚合物网络的颗粒复合物的聚合物的连接程度，描述于WO00/33885，可以从部分连接到完全连接。通过改变聚合物的连接程度，短链聚合物可以得到长链聚合物的特征而一旦解除连接就可以保留所要的短链聚合物特征。例如，长链聚合物特征促进总体的稳定性，即，对降解的抵抗力，直到达到靶细胞的位置，而短链聚合物特征促进DNA在靶细胞内的释放。这种双重性提供了一种包含治疗剂和多维聚合物网络的治疗组合物，组合物具有非生理条件和生理条件下改善的稳定性和更高的保存稳定性。改变治疗组合物的聚合物连接程度也可以控制释放治疗剂。

颗粒复合物的粒径尺寸依赖于用于制备本发明组合物的聚合物和治疗剂。如下面的实施例，颗粒的尺寸从50-1000nm，优选50-500nm。形成包合配合物一般不会明显影响粒径。组合物仍然是分散的颗粒。如下面的讨论，包含PEG化的配位剂的组合物在盐溶液中表现出了优异的稳定性。有利地，组合物在生理条件下的稳定性使得它能够用作治疗剂的递送工具和治疗大量疾病和功能紊乱。

B.包合配合物的制备

包合配合物可以按照本领域已知的任何合适方法制备。例如，通过简单地将颗粒复合物同配位剂接触、共混或分散制备包合配合物。例如，颗粒复合物和配位剂可以在可溶解两者的溶剂中共混；在可溶解颗粒复合物或配位剂中一种而分散另一种的溶剂中共混；或能够分散颗粒复合物和配位剂但溶解包合配合物的溶剂中共混。优选地，通过将配位剂和颗粒复合物加入到同一容器中共混制备包合配合物，如同将聚合物和治疗剂共混一样。对于制药应用来说，溶剂是任何生理上可接受的水溶液。

配位剂可以以和形成包合配合物的复合物中的聚合物主体和/或客体官能团的任意摩尔比加入到复合物颗粒中。一般地，配位剂以和主体和/或客体官能团的摩尔比为1∶1的量加入。只要组合物包含形成包合配合物的至少一种配位剂和至少一种具有主体或客体官能团的聚合物，就可以采用更低的摩尔比(过量的聚合物中主体和/或客体官能团)。也可以采用过量的配位剂。因此，一般地，配位剂和聚合物主体和/或客体官能团的摩尔比范围从0.01∶1到1∶0.01，优选0.5∶1到1∶0.5之间。当使用多种配位剂时，单独配位剂的摩尔比可以根据引入到组合物中的所需官能团进行选择。例如，在某一给定组合物中，PEG化的稳定配位剂的摩尔比为0.9∶1，而含配体的配位剂仅占少量，例如1-2％的配位剂。这样一种组合物中的配位剂总量一般在上面所讨论的范围内。

4.组合物和治疗方法

本发明的治疗组合物可以调配成固体、液体、悬浮液或乳液。优选地，本发明的治疗组合物采取静脉注射的形式。其它施用本发明治疗组合物的方法包括本领域熟知的方法但并不限于口服、吸入、局部滴旋、非肠道注射、静脉注射、鼻内、眼球内、颅骨内或腹膜内注射，和肺部施用。施用的方法经常依赖于治疗组合物的配方。在施用以前，可以采用本领域任意熟知的方法分离和纯化治疗组合物，例如，离心、透析和/或冷冻干燥。

本发明涉及药物组合物，其包含有效量的本发明治疗组合物和制药学和生理学上可接受的载体。合适的固态或液态制剂配方是，例如，颗粒、粉末、涂敷的药片、微包囊、栓剂、糖浆、酒剂、悬浮液、乳液、点滴或可注射溶液。药物组合物一般所用的添加剂包括，但并不限于制剂，它们是赋形剂、崩解剂、粘合剂、涂敷剂、溶胀剂、助流剂或润滑剂、香料、甜味剂或增溶剂。更具体地讲，经常使用的添加剂是，例如，碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、白蛋白、明胶、淀粉、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇和溶剂。溶剂包括无菌水和单羟基醇或多羟基醇如二醇。

根据所使用治疗剂的类型，本发明治疗组合物可以以大量的治疗方法(如DNA疫苗、抗生素、抗病毒剂)使用，用于治疗遗传或获得性疾病如囊肿性纤维化、高歇病、肌肉萎缩症、AIDS、癌(如多发性骨髓瘤、白血病、黑素瘤和卵巢癌)、心血管疾病(如渐进心脏衰竭、(心瓣手术后的)再狭窄和血友病)和神经性疾病(如脑损伤)。根据本发明，治疗方法为给需要治疗的病人或哺乳动物施用有效量的本发明治疗组合物。有效的治疗用量，为本领域的技术人员熟知，将由病例基础决定。应该考虑的因素包括，但并不限于，将要治疗的疾病和患此病病人的身体条件。

6.其它用途

本发明包合配合物也可以在用于农业的递送化学品中得到应用。在本发明的另一个实施方案中，“治疗剂”是一种具有杀微生物和农业用途的生物活性化合物。这些生物活性化合物包括那些本领域已知的。例如，合适的农业生物活性化合物包括，但不限于，肥料、杀真菌剂、除草剂、杀虫剂和防霉剂。杀微生物剂也用于水处理中以处理市政水供应和产业用水系统如冷却水、造纸中的白水系统。易于受到微生物攻击或降解的水系统也用在皮革工业、纺织工业和涂料工业中。这些杀微生物剂及其用途的实例单独或作为组合描述于美国专利5,693,631，6,034,081和6,060,466，在此引作参考。包含如上面所讨论活性剂的组合物可以用与活性剂本身使用方法同样的方法使用。需要注意的是，因为这些用途不是制药应用，复合物中的聚合物不需要符合制药用途所要求的毒性标准。

7.实施例

给出下面的实施例用以说明本发明。但是，应该理解，本发明并不限于这些实施例中描述的具体条件或细节。

材料：β-环糊精(Cerestar USA，Inc.of Hammond，IN)在使用前于120℃真空干燥(＜0.1mTorr)12小时。联苯基-4，4’-二磺酰氯(Aldrich Chemical Company，Inc.of Milwaukee，WI)用氯仿/正己烷重结晶。碘化钾用研钵研磨成粉末并在200℃烘箱中干燥。所有其它试剂从供应商直接获得，使用前不需要进一步纯化。聚合物样品分析用Hitachi HPLC系统，配有Anspec红外检测器、PrecisionDetectors DLS检测器和Progel-TSK G3000_PWXL柱，用0.3M NaCl或水作洗脱剂，流速为1.0mL min^-1。

实施例1：联苯基-4，4’-二磺酰基-A，D-封端β-环糊精，1(Tabushi等，J.Am.Chem.Soc.106，5267-5270(1984))

在一个配有电磁搅拌棒、Schlenk接头和隔板的500mL圆底烧瓶中加入7.92g(6.98mmol)的干燥β-环糊精和250mL无水吡啶(AldrichChemical Company，Inc)。所得到溶液在氮气保护下于50℃搅拌，同时将2.204g(6.28mmol)的联苯基-4，4’-二磺酰氯分成四份以15分钟的间隔加入。在50℃下继续搅拌3小时后，真空下除去溶剂，残留物上反相柱色谱分离，采用0-40％的梯度乙腈水溶液作为淋洗液。分离产物用高效液相色谱(HPLC)进行分析，并合并近似的组分。在旋转蒸发仪上除掉乙腈后，所得到的水悬浮液冷冻干燥。得到3.39g(38％)的无色固体1。

实施例2：6^A，6^D-二碘-6^A，6^D-二脱氧-β-环糊精，2(Tabushi等，J.Am.Chem.Soc.106，4580-4584(1984))

在一个配有电磁搅拌棒、Schlenk接头和隔板的40mL离心管中加入1.02g(7.2mmol)1，3.54g(21.3mmol)干燥粉末状碘化钾(Aldrich)和15mL的无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(Aldrich)。所得到悬浮液在氮气保护下于80℃搅拌2小时。在冷却到室温后，过滤分离固体，收集上清液。固体沉淀再用一份的无水DMF淋洗，合并上清液并真空下浓缩。残留物接着溶解在14mL的水中并在冰浴中冷却，然后在快速搅拌的同时加入0.75mL(7.3mmol)的四氯乙烯(Aldrich)。所得到的沉淀产物在中型玻璃粉上过滤并用少量的丙酮淋洗，然后置于P₂O₅上真空干燥14小时。得到0.90g(92％)的白色固体2。

实施例3：6^A，6^D-二叠氮-6^A，6^D-二．脱氧-β-环糊精，3(Tabushi等，Tetrahedron Lett. 18，1527-1530(1977))

在一个配有电磁搅拌棒、Schlenk接头和隔板的100mL圆底烧瓶中加入1.704g(1.25mmol)β-环糊精二碘化物，0.49g(7.53mmol)叠氮化钠(EM Science of Gibbstown，NJ)和10mL的无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。所得到悬浮液在氮气保护下于60℃搅拌14小时。真空除掉溶剂。所得到残留物溶解在足量的水中得到0.2M的盐溶液，然后通过11.3g的BioradAG501-X8(D)树脂除掉残留的盐。洗脱液冷冻干燥得到1.232g(83％)的白色无定形固体3，其不需要进一步纯化，直接用于下一步的反应。

实施例4：6^A，6^D-二氨基-6^A，6^D-二脱氧-β-环糊精，4(Munga11等，J.Org.Chem.1659-1662(1975))

在一个配有电磁搅拌棒和隔板的250mL圃底烧瓶中加入1.232g(1.04mmol)β-环糊精双叠氮化物和50mL的无水吡啶(Aldrich)。在此搅拌着的悬浮液中加入0.898g(3.42mmol)的三苯基膦。所得到的悬浮液在室温下搅拌l小时，然后加入10mL的浓缩氨水。氨水的加入会伴随着快速的气体蒸发，溶液变得均匀。14小时后，真空除去溶剂，残留物用50mL的水粉碎。过滤掉固体，滤液用10％HCl调节到酸性(pH＜4)，然后转移到含Toyopearl SP-650M(NH₄ ⁺形式)树脂的离子交换柱上。产物4用0-0.5M的碳酸氢铵梯度液洗脱。合并近似的组分并且冷冻干燥得到0.832g(71％)的产物4，以双(碳酸氢)盐形式存在。

实施例5：β-环糊精-DSP共聚物，5

在20mL的闪烁管中加入92.6mg(7.65×10^-5mol)产物4的双(碳酸氢)盐于1mL水中的溶液。溶液的pH值用1M的NaOH调节到10，然后加入1mL氯仿中的30.9mg(7.65×10^-5mol)二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP，Pierce Chemical Co.of Rockford，IL)溶液。得到的两相混合物用Vortex混合器搅拌0.5小时。倾倒出水层，接着用3×1mL的新鲜氯仿溶液提取。水性聚合物溶液接着应用到装有Toyopearl HW-40F树脂的凝胶渗透色谱(GPC)上，水做洗脱剂。组分用GPC分析，相近的组分冷冻干燥得到85mg(85％)的无色无定形粉末。

实施例6：β-环糊精-DSS共聚物，6

β-环糊精-DSS共聚物6的合成方式和DSP共聚物5的方式类似，除了二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS，Pierce Chemical Co.of Rockford，IL)取代了DSP试剂。化合物6的产率为67％。

实施例7：β-环糊精-DTBP共聚物，7

将91.2mg(7.26×10^-5mol)产物4的双(碳酸氢)盐1mL水溶液加入到一个20mL的闪烁管中。溶液的pH值用1M的NaOH调节到10，然后加入22.4mg(7.26×10^-5mol)的二甲基3，3’-二硫代双(丙酸酰亚胺)二盐酸盐(DTBP，Pierce Chemical Co.of Rockford，IL)。得到的均相溶液用Vortex混合器搅拌0.5小时。水性聚合物溶液接着应用到装有Toyopearl HW-40F树脂的凝胶渗透色谱(GPC)上。组分用GPC分析，相近的组分冷冻干燥得到67mg(67％)的无色无定形粉末。

实施例8：聚乙二醇(PEG)600二酸酰氯，8

在一个配有电磁搅拌棒和回流冷凝器的50mL圆底烧瓶中加入5.07g(约8.4mmol)聚乙二醇(PEG)600二酸(Fluka Chemical Corpof Milwaukee，WI)和10mL的无水氯仿(Aldrich)。在此搅拌的溶液中加入3.9mL(53.4mmol)的亚硫酰氯(Aldrich)，所得到溶液加热回流1小时，在此过程中可以看到有明显气体产生。

得到的溶液冷却到室温，溶剂和过量的亚硫酰氯真空除掉。所得到的油状物置于干燥容器中保存，使用前不需要纯化。

实施例9：β-环糊精-聚乙二醇(PEG)600共聚物，9

将112.5mg(8.95×10^-5mol)6^A，6^D-二氨基-6^A，6^D-二脱氧-β-环糊精(4)的双(碳酸氢)盐、50μL(3.6×10^-4mol)三乙胺(Aldrich)和5mL无水N，N-二甲基乙酰胺(DMAc，Aldrich)溶液加入到一个20mL的闪烁管中。得到的悬浮液用58mg(9.1×10^-5mol)的聚乙二醇600二酸酰氯，8处理。得到的溶液用Vortex混合器搅拌5分钟，接着在25℃下静置1小时，期间溶液变得均匀。真空除掉溶剂，残留物接着应用到装有Toyopearl HW-40F树脂的凝胶渗透色谱(GPC)上，水做洗脱剂。组分用GPC分析，相近的组分冷冻干燥得到115mg(75％)的无色无定形粉末。

实施例10：6^A，6^D-双-(2-氨基乙基硫)-6^A，6^D-二脱氧-β-环糊精，10(Tabushi，I：Shimokawa，K；Fugita，K.四面体快报TetrahedronLett.1977，1527-1530)

在一个配有电磁搅拌棒和隔板的25mL Schlenk烧瓶中加入0.91mL(7.37mmol)0.81M 2-氨基乙基硫醇钠的乙醇溶液。(Fieser，L.F.；M.有机合成用试剂Reagents for Organic Synthesis；Wiley：New York，1967；Vol.3，pp.265-266)。将溶液蒸发干燥，固体重新溶解于5mL的无水DMF(Aldrich)中。加入6^A，6^D-二碘-6^A，6^D-二脱氧-β-环糊精(2)(100mg，7.38×10^-5mol)，所得到悬浮液在氮气保护下于60℃搅拌2小时。在冷却到室温后，溶液真空下浓缩。残留物接着溶解于水中。在用0.1NHCl酸化后，溶液应用到Toyopearl SP-650M离子交换柱(NH₄ ⁺形式)上。产物用0-0.4M的碳酸氢铵梯度液洗脱。合并近似的组分并且冷冻干燥得到80mg(79％)的白色粉末10。

二半胱胺β-CD 10的另一种合成方法

在4.69g(3.17mmol)2的100mL脱气水溶液中加入0.489g(6.34mmol)新升华的半胱胺。溶液在搅拌下回流2小时。冷却到室温并用0.1NHCl酸化后，溶液应用到Toyopearl SP-650M离子交换柱(NH₄ ⁺形式)上。产物用0-0.2M的碳酸氢铵梯度液洗脱。合并近似的组分并且冷冻干燥得到1.87g(39％)的白色固体，固体用TLC表征(硅胶，n-PrOH-AcOEt-H₂O-NH₃(5/3/3/1)，(水合)茚三酮检测)且产生对应10的主点。矩阵辅助激光脱附/离子化(MALDI)飞行时间(TOF)质谱记录在PerSeptive Biosystems，Inc提供的2米ELITE设备上。产物3的MALDI-TOF m/z计算值：1252，测量值：1253.5[M+H]⁺，1275.5[M+Na]⁺，1291.4[M+K]⁺.¹³C NMR(Bruker 500MHz，D₂O)δppm：32.1(S-CH₂)和38.8(CH₂-NH₂)，32.9(C6邻接S)，60.2(C6邻接OH)，70.8，71.4，72.5(C2，C3，C5)，81.8(C4)，101.7(C1).

实施例11：β-环糊精(胱胺)-DTBP共聚物，11

将19.6mg(1.42×10^-5mol)产物10的双(碳酸氢)盐在0.5mL的0.1M NaHCO₃溶液加入到一个4mL的管中。溶液在冰浴中冷却，然后加入4.4mg(1.4×10^-5mol)二甲基3，3’-二硫代双(丙酸酰亚胺)二盐酸盐(DTBP，Pierce Chemical Co.of Rockford，IL)。所得溶液随后用Vortex混合器搅拌并在0℃静置1小时，反应用1M Tris-HCl猝灭，随后用0.1MHCl调节pH到4.0。水性聚合物溶液接着应用到装有Toyopearl HW-40F树脂的凝胶渗透色谱上。组分用GPC分析，相近的组分冷冻干燥得到21.3mg(100％)的白色粉末11。

实施例12：β-环糊精(半胱胺)-DMS共聚物，12

在一个装备有磁力搅拌棒和隔板的10mL Schlenk烧瓶中装有200mg(1.60×10^-4mol)的10、44μL(3.2×10^-4mol)三乙胺(AldrichChemical Co.，Milwaukee，WI)、43.6mg(1.60×10^-4mol)二甲基辛二酰亚胺二盐酸盐(DMS，Pierce Chemical Co.of Rockford，Illinois)，以及3mL无水DMF(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)。所得浆状物在持续的氮气流中加热到80℃达18小时，在此期间大部分溶剂蒸发了。剩余残渣重新溶解在10mL水中，然后将所得溶液用10％的盐酸酸化至pH4。然后将溶液流经Amicon Centricon Plus-205,000NMWL离心滤器。在用2×10mL的水淋洗后，聚合物溶液冷冻干燥得到41.4mg(18％)的灰白色无定形固体。

另一种合成方法：β-环糊精(半胱胺)-DMS共聚物按照以前的方法(Gonzales等，1999)合成。在典型的实验中，将二半胱胺β-CD 10的双(碳酸氢)盐(399.6mg，0.269mmol)的500μL 0.5M Na₂CO₃溶液加入到一个25mL的管中。加入二甲基辛二酰亚胺二盐酸盐(DMS，Pierce Chemical Co.of Rockford，Illinois，73.5mg，0.269mmol)，快速离心溶液以溶解组分。得到的混合物在25℃下搅拌15小时。混合物接着用10mL的水稀释，加入1N HCl调节pH低于4。接着溶液用Spectra/Por 7MWCO 3500透析膜(Spectrum)在氘代水中透析24小时。透析后的溶液冷冻干燥。¹³C NMR(Bruker 500MHz，D₂O)δppm：25.8，26.0，27.0，28.7，29.9，32.2，37.5，38.1，41.1，60.0，71.6，72.3，72.6，80.8，1014，167.9.

实施例13：固定永久带电共聚物与质粒的复合

一般地，等体积的带电荷CD-聚合物和DNA质粒溶液在水中以恰当的聚合物/质粒电荷比共混。接着在室温下使混合物平衡和自组装。复合的成功通过将少量的混合物转移到0.6％的琼脂糖凝胶中并检查DNA迁移来检测。游离DNA在施加的电压下移动，而复合的DNA在井中受到阻滞。

1μg浓度为0.1μg/μL的DNA在蒸馏水中同10μL的共聚物12共混，聚合物胺和DNA磷酸盐电荷比为2.4，6，12，24，36，60和120。1μg/μL负载缓冲液(40％蔗糖、0.25％溴酚蓝和包含5mMEDTA的200mMTris-醋酸盐缓冲液(Gao等，生物化学Biochemistry 35：1027-1036(1996))加入到每一溶液中。每一DNA/聚合物样品在1×TAE缓冲液(40mMTris-醋酸盐/1mM EDTA)中加载到含6μgEtBr/100mL的琼脂糖电泳凝胶上，在40V进行电泳1小时。DNA/聚合物复合的程度通过DNA在凝胶迁移图谱中的阻滞程度来指示。共聚物(12)在电荷比为2或更高时阻滞DNA，表明这些条件下发生了复合。

实施例14：用编码荧光素酶报告基因的质粒进行转染研究

在转染前24小时将BHK-21细胞种植在24孔板中，细胞密度为60,000细胞/孔。将编码荧光素酶基因的质粒同实施例13中的CD-聚合物共混。包含DNA/聚合物复合物的培养基溶液加入到培养细胞中，并在37℃培养24小时后用新鲜的培养基替换。在转染后48小时裂解细胞。用于荧光素酶光分析的恰当底物加入到细胞裂解液中，荧光素酶活性根据产生的光单位测量，用荧光计定量。DNA/聚合物复合物的电荷比高于3时成功地转染了BHK-21细胞，在聚合物胺和DNA磷酸盐电荷比为40时转染率最大。通过Lowry蛋白分析，细胞裂解液还用于检测细胞的变化(Lowry等，生物化学杂志Journal of BiologicalChemistry，Vol.193，265-275(1951))。在电荷比高达40时没有发现毒性。

实施例15：β-环糊精(胱胺)-DMA共聚物，13的合成

将180mg(0.131mmol)10和32mg的二甲基己二酰亚胺盐(DMA，Pierce Chemical Co.of Rockford，Illinois)加入到一个20mL的配有电磁搅拌棒的闪烁管中。在此闪烁管中加入500μL的0.5MNa₂CO₃。得到的溶液用铝箔密封并搅拌过夜。混合物用0.1N HCl酸化，接着用Spectra/Por 7MWCO 3500透析膜透析2天。透析后的溶液冷冻干燥得到41mg的白色无定形固体，Mw＝6,000道尔顿，由光散射测定。

实施例16：β-环糊精(胱胺)-DMP共聚物，14的合成

将160mg(0.116mmol)10和30.1mg的二甲基庚二酰亚胺盐(DMP，Pierce Chemical Co.of Rockford，Illinois)加入到一个20mL的配有电磁搅拌棒的闪烁管中。在此闪烁管中加入500μL的0.5MNa₂CO₃。得到的溶液用铝箔密封并搅拌过夜。混合物用0.1N HCl酸化，接着用SpectraPor MWCO 3500透析膜透析2天。透析后的溶液冷冻干燥得到22mg的白色无定形固体，Mw＝6,000道尔顿，由光散射测定。

实施例17：β-环糊精(胱胺)-PEG600共聚物，15

在一个配有电磁搅拌棒、Schlenk接头和隔板的100mL圆底烧瓶中加入1.564g(1.25mmol)的10和25mL新蒸馏的二甲基乙酰胺(DMAc，Aldrich)。在此糊状物中加入0.7mL(4摩尔)三乙胺和溶于5mL DMAc的产物8溶液(2.39g，3.75mmol)。所得溶液用Vortex混合器搅拌5分钟，接着在25℃下静置1小时，期间溶液变得均匀。真空除掉溶剂，残留物接着应用到装有Toyopearl HW-40F树脂的凝胶渗透色谱(GPC)上，水做洗脱剂。组分用GPC分析，相近的组分冷冻干燥得到无色无定形粉末。

实施例18：β-环糊精-甲苯磺酸酯，16(Melton，L.D.，和Slessor，K.N.，Carbohydrate Research，18，p.29(1971))的合成

在一个配有电磁搅拌棒、真空接头和隔板的500mL圆底烧瓶中加入干燥的β-环糊精(8.530g，7.51mmol)和200mL无水吡啶的溶液。溶液冷却到0℃，然后加入1.29g(6.76mmol)甲苯磺酰氯。得到的溶液回到室温过夜，吡啶在真空下尽可能地除去。得到的残留物用40mL热水重结晶两次，得到7.54mg(88％)白色结晶固体。

实施例19：β-环糊精-碘化物17的合成

在一个配有电磁搅拌棒、Schlenk接头的圆底烧瓶中加入产物16、15当量的碘化钾和DMF。所得到混合物在80℃下加热3小时，然后反应冷却到室温。过滤混合物，除掉沉淀，并将滤液蒸发干燥，在0℃重新溶于水。加入四氯乙烯，所得糊状物在0℃下剧烈搅拌20分钟。在中型玻璃粉上收集固体，并用丙酮淋洗然后置于P₂O₅上保存。

实施例20：β-环糊精-硫醇-PEG附加聚合物，18的合成

步骤1：β-环糊精-硫醇(K.Fujita等，Bioorg.Chem.，Vol.11，p.72(1982)和K.Fujita等，Bioorg.Chem.，Vol.11，p.108(1982))的合成。

在一个配有电磁搅拌棒、Schlenk接头的50mL圆底烧瓶中加入1.00g(0.776mmol)16、0.59g(7.75mmol)硫脲(Aldrich)和7.8mL的0.1N NaOH溶液。得到的混合物在氮气保护下于80℃加热6小时。然后，加入0.62g(15.5mmol)氢氧化钠，反应混合物在氮气保护下于80℃加热1小时。反应冷却到室温，然后用10％HCl调节pH到4。总的溶液体积为20mL，接着在冰浴中冷却，然后加入0.8mL四氯乙烯。所得反应混合物在0℃下剧烈搅拌0.5小时，然后沉淀的固体在精细玻璃粉上收集。固体用泵抽过夜得到0.60g(67％)的白色无定形固体。

步骤2：在一个配有电磁搅拌棒、回流冷凝器的100mL圆底烧瓶中加入2.433g(2.11mmol)步骤1制备的β-环糊精-硫醇、0.650g的官能化PEG(带有侧链烯烃的PEG，由Yoshiyuki Koyama of Otsuma女子大学，东京，日本提供)和50ml的氘代水。得到的混合物加热回流12小时，期间β-环糊精-硫醇溶解。反应混合物冷却到室温，沉淀的固体通过离心除去。上清液在水中用Spectra/Por 7 MWCO 1000透析膜透析。透析后的溶液冷冻干燥得到白色无定形固体。

实施例21：支化PEI-环糊精聚合物，19的合成

在一个配有电磁搅拌棒的20mL闪烁管中加入支化的PEI(25kD，Aldrich)和17。在闪烁管中加入脱气的碳酸钠缓冲液。得到的溶液在80℃搅拌4小时。混合物用0.1N HCl酸化并用Spectra/Por 7MWCO3,500透析膜透析两天后冷冻干燥。

实施例21B：PEI-环糊精交联聚合物的合成

支化PEI(Mw1200，Aldrich)和双官能化环糊精单体2(1当量)共混加入到干燥的DMSO中。混合物在80℃搅拌4天然后用Spectra/Por MWCO 10,000透析膜在水中透析两天后冷冻干燥。

实施例22：Ad-PEG₃₄₀₀-Ad的合成

将240mg的1-氨基金刚烷(1.60mmol，Aldrich)和288mg的PEG₃₄₀₀(SPA)₂(0.085mmol，Shearwater Polymers)加入配有搅拌棒的玻璃瓶中。在玻璃瓶中加入二氯甲烷，溶液搅拌过夜。第二天，过滤溶液除掉正羟基琥珀酰亚胺副产物，真空除掉二氯甲烷。残留物溶于水中，离心除去过量的1-氨基金刚烷。上清液在MWCO＝3500的Pierce’sSlide-A-Lyzer中透析过夜。溶液冷冻干燥得到248mg的白色蓬松固体Ad-PEG₃₄₀₀-Ad。

实施例23：Ad-PEG₃₄₀₀-NH₂的合成

将347mg的FMOC-PEG₃₄₀₀-NH₂(0.110mmol，Shearwater Polymers)和155mg的1-氨基金刚烷(1.0mmol，Aldrich)加入配有搅拌棒的玻璃瓶中。在玻璃瓶中加入5mL的二氯甲烷，溶液搅拌过夜。第二天，过滤溶液除掉正羟基琥珀酰亚胺副产物，真空除掉二氯甲烷。残留物溶于水中，过滤除掉未反应的1-氨基金刚烷。冷冻干燥溶液以除掉水。FMOC基团的去除可以通过将得到的固体溶解在20％哌啶在DMF中的溶液20分钟实现。真空除掉溶剂，残留物重新溶于水。离心溶液除掉未溶解的FMOC，接着在Pierce’s Slide-A-Lyzer，MWCO3500中透析过夜。溶液冷冻干燥得到219mg的白色蓬松固体Ad-PEG₃₄₀₀-NH₂。

实施例24：金刚烷-PEG₃₄₀₀-NH₂(Ad-PEG₃₄₀₀-NH₂)

将266mg的FMOC-PEG₃₄₀₀-NHS(78.2μmol，Shearwater Polymers，Huntsville AL)加入到配有电磁搅拌棒的玻璃瓶中。10当量的1-金刚烷-甲基胺(1.5mmol，Aldrich)溶解于3mL的二氯甲烷后加入，溶液在室温下搅拌过夜。真空除掉溶剂，剩余的溶液中加入水以溶解PEG产物。溶液在20000的转速下离心10分钟，而金刚烷-甲基胺作为较浓液体发生相分离。收集水相，真空除水。剩余的粘性液体重新溶解于20％哌啶在DMF中的溶液，用于FMOC的脱保护，室温下搅拌30分钟。真空除掉溶剂，用DMF淋洗几次，重新溶于水，然后在阴离子交换柱上除掉未反应的PEG。收集第一组分并冷冻干燥得到所要的222mg(76％)的白色蓬松粉末，由MALDI-TOF分析确定。

实施例25：金刚烷-PEG₃₄₀₀-乳糖(Ad-PEG₃₄₀₀-Lac)

将实施例24制备的60mgAd-PEG₃₄₀₀-NH₂(16.8μmol)和5当量的乳糖-单琥珀酰亚胺(50mg，Pierce，Rockford，IL)加入到配有搅拌棒的玻璃瓶中。加入2mL的50mM NaHCO₃，得到的溶液在室温下搅拌过夜。胺的反应通过TNBS检测，由此可以确定胺的浓度。一旦胺完全反应(99％胺反应)，溶液转移到透析管中(Slide-A-Lyzer，MWCO＝3500，Pierce)，在水中透析24小时，冷冻干燥得到65.1mg(93％)的白色蓬松粉末。

实施例26：Ad-PEG₅₀₀₀的合成

将279mgPEG₅₀₀₀-NHS(0.053mmol，Shearwater Polymers)加入到配有搅拌棒的玻璃瓶中。46μL的1-金刚烷-甲基胺(0.42mmol，Aldrich)溶解于3mL的二氯甲烷后加入，溶液在室温下搅拌过夜。第二天，过滤溶液除掉正羟基琥珀酰亚胺副产物，真空除掉二氯甲烷。残留物溶于水中并离心。过量的1-金刚烷-甲基胺相分离，除掉上层水相并用MWCO＝3500的Pierce’s Slide-A-Lyzer透析过夜。溶液冷冻干燥得到253mg的白色蓬松固体Ad-PEG₅₀₀₀。产物用配有RichardsScientific ELS检测器和C18柱的Beckman Gold HPLC系统分析，发现很纯(PEG₅₀₀₀-NHS的保留时间：10.7分钟，产物的保留时间：12.0分钟；乙腈/水梯度洗脱)。

金刚烷-PEG ₅₀₀₀ (Ad-PEG ₅₀₀₀ )的另一种合成方法

将674mgPEG₅₀₀₀-NHS(135μmol，Shearwater Polymers)加入到配有电磁搅拌棒的玻璃瓶中。5当量的1-金刚烷-甲基胺(675μmol，Aldrich)溶解于10mL的二氯甲烷后加入，溶液在室温下搅拌过夜。真空除掉溶剂，剩余的溶液中加入水。溶液在20000的转速下离心10分钟，而金刚烷-甲基胺作为较浓液体发生相分离。收集水相，在水中透析24小时(Slide-A-Lyzer，MWCO＝3500)。溶液冷冻干燥得到530mg的白色蓬松粉末(产率75％，产物的图示如下)。产物用配有RichardsScientific ELS检测器和C18柱的Beckman Gold HPLC系统分析，发现很纯(PEG₅₀₀₀-NHS的保留时间：10.7分钟，产物的保留时间：12.0分钟；乙腈/水梯度洗脱)。Ad-PEG₃₄₀₀的合成采用类似的方法(产率56％，产物用Maldi-TOF确定)。

实施例27：金刚烷-(PEG₅₀₀₀)₂(Ad-(PEG₅₀₀₀)₂)的合成

将315mg(PEG₅₀₀₀)₂-NHS(30μmol，Shearwater Polymers)加入到配有电磁搅拌棒的玻璃瓶中。10当量的1-金刚烷-甲基胺(300μmol，Aldrich)溶解于3mL的DCM后加入，溶液在室温下搅拌过夜。真空除掉溶剂，剩余的溶液中加入水以溶解PEG产物。溶液在20000的转速下离心10分钟，而金刚烷-甲基胺作为较浓液体发生相分离。收集水相，在水中透析24小时(Slide-A-Lyzer，MWCO＝3500)。溶液冷冻干燥得到286mg的白色蓬松粉末(产率91％)。

实施例28：金刚烷-PEG₃₄₀₀-荧光素(Ad-PEG₃₄₀₀-FITC)

将20mgAd-PEG₃₄₀₀-NH₂溶解于3mL的0.1MNa₂CO₃中加入到配有搅拌棒的玻璃瓶中。加入3当量荧光素异硫氰酸盐(FITC，Sigma)的DMSO溶液(4mg/mL，1.6mL)，得到的溶液在黑暗中搅拌过夜，然后转移到透析管中(MWCO＝3500)，于暗处在水中透析48小时。收集溶液并冷冻干燥得到23mg黄色蓬松固体。PEG₃₄₀₀-FITC作为PEG₃₄₀₀-NH₂(Shearwater Polymers)的对照聚合物，其合成步骤相同，得到23mg。

实施例29：GALA肽的合成

GALA肽(序列W-E-A-A-L-A-E-A-L-A-E-A-L-A-E-H-L-A-E-A-L-A-E-A-L-E-A-L-A-A，Mw3032)由Biopolymer SynthesisFacility(Beckman Institute，California Institute ofTechnology)采用自动合成仪合成。在将肽从树脂切除以前，保留1/3的树脂用于金刚烷的连接。肽用HPLC分析纯度大于95％。1-金刚烷-羧酸(Aldrich)用DCC偶联而连接到GALA肽的N端。得到的肽(GALA-Ad，Mw3194)从树脂上切除。肽用HPLC分析纯度大于90％。肽的鉴定用MALDI-TOF分析确认(Biopolymer Synthesis Facility(BeckmanInstitute，California Institute of Technology)。

实施例30：使用GALA肽制备本发明组合物

质粒和寡核苷酸。质粒pGL3-CV(Promega，Madison，WI)，在SV40启动子控制下包含荧光素酶基因，用大肠杆菌扩增，并用Qiagen’s无内毒素Megaprep试剂盒(Valencia，CA)纯化。荧光素标记的寡核苷酸(FITC-oligos，25-mer，5’-FITC-ACT GCT TAC CAG GGA TTTCAGTGC A-3’)由Biopolymer Synthesis Facility(CaliforniaInstitute of Technology)合成。

颗粒的制备和表征。以恰当电荷比混合等体积12(溶解于dH₂O)和DNA(0.1mg/mL，在dH₂O中)制备本发明组合物。相同体积的GALA或GALA-Ad溶于50mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)中而后加入到复合物。例如，对于颗粒表征的研究，2μg质粒DNA(20μL)以5+/-电荷比同12复合(20mL)。20μL的GALA溶液、GALA-Ad溶液或50mMPBS(对于对照样品)接着加入到复合物中。然后溶液加入1.2mLdH₂O稀释。颗粒的尺寸和电荷分别通过动态光散射和ζ电势测量来确定，仪器采用ZetaPals动态光散射检测器(Brookhaven InstrumentsCorporation，Holtsville，NY)。结果表示为平均值±测量结果的标准偏差，如图2所示。按照5+/-电荷比制备的12/pGL3-CV组合物的流体力学直径用动态光散射测量，结果为260nm。2μg质粒DNA(20μL)以5+/-电荷比同等体积的12混合。不同比例的GALA或GALA-Ad加入到颗粒中。流体力学直径用动态光散射测量。结果表示为平均值±三次测量结果的标准偏差。GALA肽从pH7.5时水溶性无规线圈构象转变到pH5时的水不溶螺旋构象。GALA和金刚烷修饰的GALA(GALA-Ad)肽溶解于50mMPBS(pH7.2)，然后以不同的肽/环糊精比例加入到治疗组合物中。混合物用dH₂O稀释，颗粒直径用动态光散射测量(图2)。图2表示了GALA(虚线)和GALA-Ad(实线)修饰的polyplex的流体力学直径。

结果。因为对于所加肽的所有浓度，颗粒的记数率都是一样的，肽的加入不会破坏组合物。作为加入GALA和GALA-Ad的函数的粒径范围非常接近。流体力学直径从250nm(1％GALA或GALA-Ad)增加到400nm(10％GALA或GALA-Ad)。随着更多肽的加入，粒径又下降到未修饰治疗组合物的水平。随着加入30％或更多的GALA-Ad和50％或更多的GALA，直径回复到约250nm。见图2。

实施例31：BHK-21细胞对GALA-修饰组合物的摄取

细胞培养BHK-21细胞从ATCC购买(Rockville，MD)，而HUH-7细胞由Valigen(Newtown，PA)慷慨赠送。两种细胞用含10％胎牛血清、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素的DMEM培养，培养条件为潮湿的培养箱，37℃，5％CO₂，每4-5天传代一次。培养基和辅剂从Gibco BRL(Gaitherburg，MD)购买。

培养细胞对治疗组合物的吸收BHK-21细胞以150,000细胞/孔种植到6孔培养板中，在37℃培养24小时。5μgFITC-oligo以5+/-电荷比同12复合，复合5分钟后，50μL的GALA或GALA-Ad在50mMPBS(pH7.2)加入到复合物中。从细胞处移除培养基并用PBS冲洗细胞。对于转染，900μL的Optimem加入到每一治疗组合物溶液中，全部的溶液转移到细胞。细胞同转染混合物一起孵育5小时，然后移除培养基并用PBS冲洗细胞两次。胰酶消化收集细胞用于FACs分析。细胞在淋洗缓冲液(含DNA酶和MgCl₂的Hank’s平衡盐溶液)中淋洗两次并重新悬浮于500μLFAC s缓冲液中(Hank’s平衡盐溶液，2.5mg/mL牛血清白蛋白，10μg/mL碘化丙啶)。FACs分析用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)和CellQuest软件进行。结果见图4。如图4a-d所示，BHK-21细胞(4a)用12/FITC-Oligo(4b)、12/FITC-Oligo/50％GALA(4c)、12/FITC-Oligo/50％GALA-Ad(4d)转染。吸收量用流式细胞仪分析确定。数据用荧光图表示，y轴作图表示细胞数量，x轴作图表示荧光素荧光强度。

实施例32：修饰复合物的ζ电势

2μg质粒DNA(20μL)以5+/-电荷比与等体积的12复合。不同比例的GALA或GALA-Ad以不同的肽/CD比例加入到颗粒中，然后用dH₂O稀释。颗粒电荷由电泳迁移率测量确定，表示为颗粒的ζ电势，以mV计。电荷比为5+/-的12/pGL3-CV组合物的颗粒电荷由ζ电势测量确定，结果为+13mV。在肽存在时的颗粒ζ电势测量后以平均值±三次测量结果的标准偏差表示于图3中。

结果因为GALA肽在pH7.2时为阴离子肽(包含几个谷氨酸残基)，GALA和GALA-Ad同组合物的结合降低了组合物的ζ电势。组合物因为30％GALA(-11mV)或GALA-Ad(-23mV)而带上负电。GALA+治疗组合物溶液的ζ电势在此处达到稳定状态；加入更多的GALA仅仅轻微地增加了ζ电势(-15mV，150％GALA)。但是，如果GALA-Ad浓度增高，颗粒会带有更多的负电荷。加入150％GALA-Ad组合物的ζ电势为-42mV。见图3。

实施例33：组合物的DNA传递效率

HUH-7细胞：肝细胞瘤细胞系，HUH-7，也用5+/-电荷比的12/FITC-oligo和12/FITC-oligo/50％GALA-Ad组合物转染。DNA吸收用测量BHK-21细胞的方法检测。未转染的HUH-7细胞的荧光图在开始的1/10(图5a)。FITC-oligo同12成功地传递到95％的HUH-7细胞中(图5b)。在组合物中加入50％的GALA-Ad抑制了FITC-oligo两个数量级的吸收，在BHK-21细胞中可以看到(图5c)。

实施例34：本发明组合物的荧光素酶转染效率

GALA和GALA-Ad修饰组合物的转染能力通过将荧光素酶报告基因传递到培养细胞中来确定。BHK-21细胞种植在24孔培养板中，用和12以5+/-电荷比形成颗粒复合物的1μg pGL3-CV(包含荧光素酶基因的质粒)转染。这些颗粒复合物用以不同的肽/环糊精比例加入的GALA或GALA-Ad修饰。细胞在转染48小时后裂解，分析荧光素酶的活性，结果示于图6，以相对光单位计(RLUs)。数据表示为平均值±三个样品的标准偏差。背景＝300RLV。

用12/pGL-CV3组合物成功地转染了细胞，RLUs约为1×10⁵。加入GALA不能对转染效率产生巨大影响。但是，用GALA-Ad修饰的组合物极大地抑制了转染。加入1％GALA增加了两倍的转染效率，达到2×10⁵RLU，12/pGL-CV3/10％GALA也会产生轻微升高的转染(1.5×10⁵RLU)。加入100％GALA转染下降了50％，达到5×10⁴RLU。

实施例35：GALA和GALA-Ad组合物的毒性

GALA和GALA-Ad修饰组合物的毒性通过测量转染实验中获得的细胞裂解液中蛋白的浓度来确定。用与12以5+/-电荷比复合的1μgpGL-CV3转染BHK-21细胞。在转染以前，在复合物中加入不同比例的GALA和GALA-Ad。GALA(网格条)和GALA-Ad(空白条)转染的细胞存活率通过分析转染后48小时总的蛋白浓度并将每一样品同未转染细胞的蛋白水平均一化来确定。蛋白浓度用平均值±三个样品的标准偏差表示，除以经12/pGL-CV3组合物单独转染细胞的平均蛋白浓度，得到细胞存活率(图7)。GALA和GALA-Ad加入到转染溶液中没有对BHK-21细胞产生明显的毒性。

实施例36：乳糖-β-环糊精-DMS共聚物20

12(20.5mg，3μmol)、10当量的α-乳糖(21mg，60μmol，Sigma)和18.6mg的氰基硼氢化钠(300μmol)加入到玻璃瓶中。固体中加入1mL硼酸盐缓冲液，pH8.5，得到的溶液简单旋转混合，然后用37℃水浴培育30小时。溶液加入1.0MHCl酸化到pH为6.0，在水中透析24小时。用于分析聚合物胺的TNBS显示有87％结合。化合物20的结构。

实施例37：乳糖-(CH₂)₆-β-环糊精-DMS共聚物21

12(43.2mg，7.4μmol)和5.6当量的单(乳酸酰氨)单(琥珀酰亚胺基)辛二酸盐(50mg，84μmol，Pierce)加入到配有电磁搅拌棒的玻璃瓶中，并溶解于2mL的50mM的NaHCO₃中。得到的溶液搅拌过夜。通过TNBS分析测量聚合物胺端基的消失来检测反应的进行，达到90％结合。溶液加入1.0MHCl酸化到pH为5.0，在Pierce MWCO3500Slide-A-Lyzer透析袋中于水中透析2天，然后冷冻干燥。得到了白色、蓬松粉末，产率70％。21的结构示于图12。

实施例38：PEG₃₄₀₀-封端β-环糊精-DMS共聚物22；Pre-DNA复合PEG化

将20.3mg 12(3μmol)和10当量的FMOC-PEG₃₄₀₀-NHS(190mg，60μmol)加入到配有电磁搅拌棒的玻璃瓶中并溶解于1mL的50mM的NaHCO₃，pH8.5中。溶液黑暗中在室温下搅拌20小时，接着冷冻干燥。固体溶解于0.5mL 20％哌啶在DMF中的溶液搅拌30分钟用于FMOC的脱保护，室温下搅拌30分钟。真空除掉溶剂，剩余的粘性液体溶于水，用1.0MHCl酸化到pH小于6.0。然后在阴离子交换柱上除掉未反应的PEG，冷冻干燥得到白色蓬松粉末。22结构如下。

预-DNA复合PEG化：12和22同质粒DNA混合用于粒径测量。βCDP612凝聚质粒DNA形成流体力学直径均匀的颗粒；130nm，聚乙二醇化的22不能凝聚DNA。聚合物末端PEG的存在破坏了DNA凝聚。

实施例39(对比实施例)：通过接枝进行后-DNA复合聚乙二醇化

所用步骤在Ogris等，Gene Therapy，6，595-605(1999)基础上改进。5μg pGL 3-CV在500μL的dH₂O中同等体积的PEI(dH₂O中)以电荷比3+/-或6+/-共混。12/DNA以电荷比为5+/-采用相同的方法制备。颗粒复合物颗粒直径用动态光散射(DLS)测量。在颗粒复合物形成后，PEG₅₀₀₀-SPA(10mg/mL，DMF)在室温下加入到溶液共混2小时。作为粒径测定第二阶段，500μLPBS，pH7.2加入到溶液中。溶液在室温下培育30分钟，然后最终粒径用DLS测量。见图8的示例性说明。

在第一阶段，PEI/DNA或12/DNA颗粒复合物在1.2mLdH₂O中形成。颗粒的尺寸用DLS测量。PEG₅₀₀₀-SPA加入到颗粒复合物溶液中，作为阶段2，同聚合物的伯氨基反应一个小时。“聚乙二醇化”样品的尺寸用DLS测量。对于阶段3，600μLPBS，pH7.2加入到每一样品中以测试聚乙二醇化颗粒的盐稳定性。粒径在加入盐30分钟后测量以测定颗粒聚集的程度。

第一阶段，PE I颗粒复合物以电荷比3+/-和6+/-配制，12/DNA颗粒复合物以5+/-配制。PEG₅₀₀₀-SPA根据Ogris等，基因治疗GeneTherapy，6，595-606(1999)出版的步骤以10/1加入到PEI中。12用PEG：胺(mol％)100％、150％、200％进行聚乙二醇化。作为对照，未反应PEG也以100％比例加入到12中。每一阶段的颗粒直径列于图9的表中。PEI颗粒复合物一旦聚乙二醇化尺寸稍有增长(对于3+/-电荷比从58nm增加到65nm，对于6+/-电荷比从55nm增加到60nm)。聚乙二醇化防止了PEI颗粒复合物由盐引起的聚集。尽管没有修饰的PEI在加入盐后直径增加到800nm，但是聚乙二醇化PEI颗粒复合物尺寸增加到78nm(3+/-)和115nm(6+/-)。

150％和200％PEG₅₀₀₀-SPA加入到基于12的颗粒复合物中导致颗粒破坏；颗粒数量急剧下降，没有观察到恒定的相关函数关系。12的聚乙二醇化可能阻止了聚合物/DNA键合。在用100％PEG₅₀₀₀-SPA聚乙二醇化后粒径保持在67nm。但是，检测粒径作为时间函数可以发现在加入PEG约30秒后颗粒被破坏，然后又可以看到更小的颗粒。因此，100％PEG₅₀₀₀-SPA的加入可以将部分12聚乙二醇化。因为加入的聚合物12对于DNA(电荷比5+/-)是过量的，颗粒可以重排使得未修饰的聚合物同质粒DNA形成polyplex，而大多数聚乙二醇化聚合物在溶液中保持自由状态。在这些颗粒中加入盐导致颗粒聚集(300nm)，尽管没有达到未修饰12颗粒复合物的程度(700nm)。总之，同聚合物伯胺基团反应的后-DNA配位聚乙二醇化可能对于具有高电荷密度高分子量聚合物是有效的。但是，同12的反应，甚至后-DNA配位，会导致100％PEG₅₀₀₀-SPA加入时盐缺乏稳定性以及高的PEG₅₀₀₀-SPA浓度会导致颗粒的破坏。

实施例40：通过包合复合物的形成进行后-DNA配位聚乙二醇化

采用下面的步骤，金刚烷-PEG(Ad-PEG)分子加入到预先制备的100％金刚烷：环糊精(mol％)组合物溶液中。在溶液中加入PBS，颗粒的尺寸以2分钟的时间间隔用DLS检测。结果列于图10。

步骤：2μg pGL3-CV在600μL的dH₂O中同等体积的12(dH₂O中)以电荷比5+/-共混。加入所需量的Ad-PEG(10mg/mL，dH₂O中)，颗粒的尺寸用DLS检测。600μL PBS，pH7.2加入到溶液中，颗粒的尺寸以2分钟的时间间隔共8分钟检测。

未聚乙二醇化12颗粒的平均直径在加入盐后8分钟内从58nm增加到了250nm。溶液中游离PEG的存在不会阻止聚集(加入盐后平均直径为240nm)。但是，通过包合复合物用线性Ad-PEG分子的聚乙二醇化以一种可靠的方式降低了颗粒的聚集。加入盐8分钟后，用Ad-PEG₃₄₀₀聚乙二醇化的颗粒聚集直径210nm，而用Ad-PEG₃₄₀₀-Lac聚乙二醇化的颗粒聚集直径200nm。用Ad-PEG₅₀₀₀聚乙二醇化的颗粒在加入盐后8分钟直径增加到90nm，加入盐后2小时增加到160nm。用Ad-(PEG₅₀₀₀)₂修饰对聚集的影响比较小(加入盐后颗粒直径为200nm)。

稳定性也会出现在PEG密度依赖方式中(图10A)。加入盐后10分钟测量的平均直径相对于未修饰polyplexes(58nm到272nm)增加了4.7倍，但仅仅是将150％或200％金刚烷添加到环糊精而修饰的polyplexes的1.2倍。

实施例41：由于后-复合聚乙二醇化引起的下降的细胞吸收

步骤1：转染混合物制备如下：等体积的阳离子12以聚合物/DNA的电荷比为3+/-的比例加入到3μgFITC-oligos(0.1μg/μL于水中)。在复合物中按PEG和环糊精比例1∶1加入游离PEG或Ad-PEG₅₀₀₀(实施例40中制备)。

步骤2：HUH-7细胞以3×10⁵细胞/孔种植到6孔培养板中，在4mL的DMEM+10％胎牛血清+抗生素/抗霉素中培养24小时。24小时后，细胞用PBS漂洗，然后加入1mL含步骤1转染混合物的Optimem。孵育15分钟后，移除转染培养基，用PBS漂洗，在每一孔中加入1mLOptimem。这些细胞在37℃下继续孵育30分钟。接着细胞用细胞清洗缓冲液(基因治疗体系Gene Therapy Systems)清洗以移除表面连接的复合物和PBS，然后胰酶消化使细胞脱附。准备细胞进行FACs分析以分析FITC-oligo的吸收。结果列于下面表1中。用Ad-PEG₅₀₀₀修饰复合物降低了FITC-oligo/聚合物复合物的吸收。

表1

样品	转染百分比
样品	转染百分比	细胞对照	0％
细胞+FITC-oligo	0％	细胞对照	0％
细胞+FITC-oligo	0％	细胞+颗粒复合物+游离PEG	43％
细胞+修饰的Ad-PEG<sub>5000</sub>颗粒复合物	27％	细胞+颗粒复合物+游离PEG	43％

实施例42：12/Ad-PEG₃₄₀₀-FITC组合物的制备和传递到培养细胞中

BHK-21细胞以200,000细胞/孔种植到6孔培养板中，在37℃培养24小时。3μg oligo(0.1mg/mL在dH₂O中)以5+/-电荷比同12(2mg/mL在dH₂O中)复合，复合5分钟后，1.5μL的PEG-FITC或Ad-PEG-FITC(10μg/mL在dH₂O中)加入到复合物中。从细胞处移除培养基并用PBS冲洗细胞。对于转染，940μL Optimem加入到每一治疗组合物溶液中，全部的溶液转染到细胞中。细胞同转染混合物一起孵育4小时，然后移除培养基并用PBS冲洗细胞，加入完全培养基。细胞在37℃继续培养24小时，然后移除培养基并用PBS冲洗细胞两次。胰酶消化收集细胞用于FACs分析。细胞在淋洗缓冲液(含脱氧核糖核酸酶和MgCl₂的Hank’s平衡盐溶液)中淋洗两次并重新悬浮于500μLFACs缓冲液中(Hank’s平衡盐溶液，2.5mg/mL牛血清白蛋白，10μg/mL碘化丙啶)。FACs分析用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)和CelQuest软件进行。结果见图11。

用Ad-PEG₃₄₀₀-FITC形成包合配合物导致了荧光素吸收量比同Ad-PEG₃₄₀₀-FITC一起培养12的要高(43％比14％，图11)。培养基中自由Ad-PEG₃₄₀₀-FITC作为胞饮和胞吐作用一部分进入细胞。但是，Ad-PEG₃₄₀₀-FITC同12复合时也能够进入细胞。用Ad-PEG₃₄₀₀-FITC以低比例(10％)修饰12颗粒复合物不可能抑制内在化。相反，12颗粒复合物很容易键合到细胞表面并且辅助将Ad-PEG₃₄₀₀-FITC传递到细胞，因为它们被内在化了。12颗粒复合物辅助传递导致了在12/Ad-PEG₃₄₀₀-FITC转染细胞中较高的荧光素荧光。此方法可用于小分子治疗剂同感兴趣的基因一起使用的共同-传递上。

实施例43：HU47细胞的转染

荧光素酶转染。HU47细胞以50,000细胞/孔的密度种植在24孔培养板中，在37℃培养24小时。3μg pGL 3-CV质粒(0.1mg/mL在dH₂O中)同等体积的12或21(见图13)以不同电荷比复合。在转染前移除培养基，并用PBS漂洗。600μLoptimem加入到每一治疗组合物中形成转染组合物溶液，其230μL加入到3孔中培养4小时。4小时后，在每孔中加入800μL完全培养基。在转染后24小时更换培养基，在转染后48小时用50μL的细胞培养裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)裂解细胞。荧光素酶的活性用Promega’s荧光素酶分析试剂分析。结果列于图13。

实施例44：金刚烷衍生PEI的合成(Ad-PEI)

聚乙烯亚胺(PEI)和金刚烷羧酸在干燥的二氯甲烷中共混并冷却到0℃。DCC(1当量)、1-羟基苯(甲)酰三唑(1当量)和三乙胺(1当量)加入到混合物中。溶液缓慢升到室温并且搅拌16小时。过滤除掉沉淀，真空除掉溶剂。在残留的黄色固体中加入水。通过离心除掉非溶性固体。水溶液仔细地转移到透析袋中，在水中透析24小时。冷冻干燥得到PEI-CD。

实施例45：环糊精-PEG的合成(CD-PEG)

PEG-琥珀酰亚胺基丙酸(SPA)(Shearwater Polymers)和环糊精-单胺(1.2当量)溶解于DMSO中，并在室温下搅拌24小时。透析纯化环糊精-PEG产物。

实施例46：Ad-PEI/DNA颗粒复合物的制备和随后用CD-PEG修饰

1μg质粒DNA(0.1μg/μL在dH₂O中)以5+/-电荷比同实施例42的Ad-PEI共混。实施例46的CD-PEG(溶解在dH₂O中)以所需要的CD∶Ad比例加入到复合物中。

实施例47：聚乙二醇化实现稳定：高浓度下的制备

4μg质粒DNA同等体积的聚合物混合物(以2.5+/-电荷比含环糊精聚合物12，在某些情况下，金刚烷-PEG₅₀₀₀或PEG₅₀₀₀以1CD∶1PEG₅₀₀₀)混合，最终DNA浓度从0.1mg/mL到4mg/mL(见图14)。一半的溶液用1.2mL的水稀释，直径用光散射测定。另一半溶液通过QiagenQiaquick柱提取溶液中剩余的DNA。DNA的浓度用波长260nm的紫外检测。

结果(图15和16)：用金刚烷-PEG₅₀₀₀修饰的小、均匀颗粒复合物(直径小于100nm)可以在高达4mg并且包括4mgDNA/mL的浓度制备，而没有沉淀。在高于0.2mg/mL浓度下未修饰的polyplex形成大的颗粒(大于300nm)，在所有的配制浓度下可以看到明显的沉淀。

实施例48：通过polyplex表面修饰抑制非特异性吸收

BHK-21细胞种植到6孔培养板中。细胞用与等体积的12以2.5+/-12/DNA电荷比复合的3μg FITC-oligo(最终转染混合物的浓度：0.05mgDNA/mL)转染。颗粒复合物用下面的连接修饰：

阴离子连接： WEAALAEALAEALAEAC

Ad-阴离子连接： Ad-WEAALAEALAEALAEAC

Ad-PEG： Ad-PEG₅₀₀₀

Ad-阴离子连接-PEG： Ad-WEAALAEALAEALAEAC-PEG₅₀₀₀

1mL optimem加入到转染混合物中，全部的溶液转移到预先用PBS漂洗的BHK-21细胞中15分钟。然后移除培养基并用CellScrub冲洗细胞，胰酶消化收集细胞用于FACs分析。

结果：包合客体(金刚烷)、空间臂(阴离子连接)和官能团(PEG₅₀₀₀)一起修饰12/DNA颗粒复合物，抑制了培养细胞的非特异性吸收。见图17。最佳的抑制需要所有三种组分的结合。

实施例49：半乳糖-介导的吸收进入肝细胞瘤细胞

HepG2细胞以50,000细胞/孔种植到24孔板中。1μg的pCMV-Luc与等体积的12接触并用下面的方法修饰。修饰用含PEG的配位剂以2∶1CD∶PEG进行，其中CD代表12中的环糊精。

12/pCMV-Luc颗粒复合物未修饰

Glu-PEG-Pep-Ad 葡萄糖-PEG₃₄₀₀-CAEAEAEAE-Ad，2CD：1PEG

Gal-PEG-Pep-Ad 半乳糖-PEG₃₄₀₀-CAEAEAEAE-Ad，2CD：1PEG

PEG-Pep-Ad PEG₅₀₀₀-CAEAEAEAE-Ad，2CD：1PEG

200μL optimem加入到每一转染混合物中，转染到每孔细胞中。转染4小时后，加入800μL完全培养基。然后移除培养基并用PBS冲洗细胞，转染后24小时在每孔中加入1mL完全培养基。在转染后48小时后，用PBS冲洗细胞，裂解细胞用于分析荧光素酶的活性。描述的转染步骤也可以在1mM葡萄糖或1mM半乳糖作为竞争抑制剂存在时进行。

结果：用Glu-PEG-Pep-Ad或PEG-Pep-Ad修饰的颗粒复合物具有负的ζ电势，因此不容易转染细胞。但是，用Gal-PEG-Pep-Ad修饰的polyplexes表现出了提高的转染，这在游离半乳糖存在时会受到抑制，因此证实了半乳糖介导的转染进入肝细胞瘤细胞。见图18。

实施例50：二金刚烷化合物的合成

参考：Breslow等JACS(1996)v118 p8495-8496

Zhang等JACS(1993)v115 p9353-9354

无水吡啶(5mL)加入到配有小的电磁搅拌棒的反应器中，并在冰浴中冷却。逐滴加入甲基二氯磷酸盐(1.0mL)。混合物再保持低温15分钟，期间形成了N-甲基吡啶二氯磷酸盐的沉淀。金刚烷乙醇溶解于5mL的吡啶中加入到反应器中，在反应混合物冻结后密封反应器。得到的混合物在室温下搅拌过夜。密封的反应器打开，所得混合物注入10％碳酸氢钠中(50mL)。所得溶液真空蒸发。在剩余的固体中加入800mL的水，产物用150mL的醚提取。水相用2N HCl酸化到pH1.4，接着用3×150mL的氯仿：正丁醇(7∶3)抽提。有机层用水洗，真空蒸发混合溶剂得到固体相。固体用丙酮/己烷重结晶，形成白色固体，产率27％。电喷雾质谱仪分析确定为纯的所需产物。

实施例51：二金刚烷-PEG5000的合成

二金刚烷-PEG₅₀₀₀

二氯甲烷用氢化钙回流过夜干燥，在使用前新蒸。将双(2-(1-金刚烷基)乙基磷酸盐)(实施例51描述的二金刚烷化合物)溶解于0.4mL二氯甲烷中后，缓慢地加入到PEG-环氧化物(MW 5000)的新蒸二氯甲烷(0.2mL)溶液中。得到的溶液在35℃下搅拌4天。真空除掉溶剂至干燥。在形成的固体中加入6mL的水，会产生沉淀。得到的混合物在室温下搅拌半小时，离心除去固体(未反应的二金刚烷化合物)。上清液用3500MWCO透析袋在水中透析过夜，冷冻干燥，产生白色固体，产率99％。MaldiTof分析确定为所要的产物。

实施例52：Ad-PEG₃₄₀₀和二金刚烷-PEG₅₀₀₀之间的竞争取代实验

通过将二金刚烷-PEG₅₀₀₀溶液加入到预先制备的Ad-PEG₃₄₀₀聚合物和DNA的组合物中进行竞争性吸附实验。加入盐溶液，以时间作为函数测量粒径。

通过将12溶液(16.6μL的水+2.61μL的5mg/mL的12+2.37μL的12.5mg/mL的AdPEG₃₄₀₀)加入到DNA溶液(20μL的0.1mg/mL的DNA)，制备原液。此组合物溶液的表征如下：

[DNA]＝0.05mg/mL

AdPEG₃₄₀₀：CD的摩尔比＝1∶1

电荷比＝3+/-

总配制体积＝40μL

组合物培育10分钟后加入二金刚烷-PEG₅₀₀₀溶液(10mg/mL)。测定溶液的体积使得二金刚烷-PEG₅₀₀₀和AdPEG₃₄₀₀的摩尔比是1∶1、1∶2、1∶4或1∶6。例如，当比例为1∶2时，加入2.38μL的二金刚烷-PEG₅₀₀₀溶液。

再继续培育10分钟后，在溶液中加入1.2mL的水稀释，使得能够用DLS设备读数。粒径测量10分钟，600μL的1×PBS快速混进组合物溶液中。在下面的30分钟内，每分钟观察一次粒径。

作为对比，配制两种其它组合物溶液。一种情况下，未加入二金刚烷-PEG₅₀₀₀。另一种情况下，未加入AdPEG₃₄₀₀。可以看到在这些条件下，颗粒复合物的尺寸并不会因为使用AdPEG₃₄₀₀而稳定。盐导致了平均粒径在30分钟过程内从70nm增加到350nm。但是，二金刚烷-PEG₅₀₀₀的确单独表现出对盐的稳定性。在加入盐后，粒径保持不变。尤其是当二金刚烷-PEG₅₀₀₀的量为AdPEG₃₄₀₀的1/6时，结果示于图19中。

实施例53：pH敏感的金刚烷-PEG修饰剂

在包合化合物主体和客体间的连接常数，当主体和客体带电时会下降。例如，金刚烷羧酸的质子化形式(中性形式)具有约500,000的连接常数，而未质子化形式(阴离子)的连接常数约30,000。这可以用于在含包合化合物的材料中引入pH敏感行为。例如，可以用含靠近金刚烷的仲胺的金刚烷-PEG化合物进行修饰。Ad-PEG在生理pH下有比较高的亲和性但更容易在酸性pH值下释放，这会在细胞内涵体中发生。内涵体中加速的拆解作用会促进DNA的释放。

pH-敏感的可水解的金刚烷-PEG修饰剂的合成

PEG-NH₂(132mg，0.0264mmol)溶解于水中并冷却到0℃。在此混合物中加入NaOH溶液(5N，0.053mL，0.264mmol，10当量)和1-金刚烷基氟甲酸盐(52mg，0.264mmol，10当量)的四氢呋喃溶液(3mL)。混合物在此温度下搅拌5分钟，接着升温到室温并搅拌2小时。真空除掉四氢呋喃。通过离心除掉未溶的固体。剩余水溶液转移到Spectra/Por MWCO3,500透析膜中，在水中透析1天。冷冻干燥得到金刚烷-氨基甲酸盐-PEG5K(80mg)。此化合物的结构用1HNMR，HPLC和MALDI TOFMS确定。

可水解金刚烷-Schiff碱-PEG的合成

PEG5K-ALD和1-金刚烷基甲基胺(1当量)在甲醇中混合。几滴甲酸加入到混合物中作为Schiff碱生成的催化剂。混合物在60℃下搅拌12小时，真空除掉溶剂。混合物在水中透析产生所要的金刚烷-Schiff碱-PEG5K。

实施例55：金刚烷-PEG-转铁蛋白(Ad-PEG-Tf)的合成，图20

1.借助碳水化合物基团的转铁蛋白偶联

步骤1：Ad-PEG-NH-NH₂的合成

FMOC-NH-PEG₅₀₀₀-NHS(Shearwater Polymers，0.2mmol，1g)加入到配有搅拌棒的圆底烧瓶中。在烧瓶中加入溶解于7mL二氯甲烷/乙酸乙酯(1∶1)的叔丁基肼基甲酸酯(Aldrich，1.6mmol，0.2112g)。所得溶液在室温下搅拌过夜。第二天，真空除掉溶剂。通过将得到的固体溶解于10mL20％哌啶在二甲基甲酰胺中的溶液中5小时除掉FMOC基团。真空除掉溶剂，残留物重新溶解于水中。离心所得溶液除掉未溶解FMOC基团，在Pierce’s Slide-A-Lyser，3500MWCO中透析。冷冻干燥溶液得到790mgH₂N-PEG5000-NH-NH-CO-OtBu。

N-羟基琥珀酰亚胺(Aldrich，0.24mmol，27.3mg)和金刚烷羧酸(Aldrich，0.39mmol，71.2mg)加入到溶解于7mL二氯甲烷的H₂N-PEG5000-NH-NH-CO-OtBu(2)(0.016mmol，790mg)中。在所得溶液中加入溶解于3mL二氯甲烷中的1，3-二环己基碳二亚胺(Aldrich，1.6mmol，0.32g)。所得溶液在室温下搅拌过夜。第二天，用细玻璃粉过滤得到的固体，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。残留物溶解于10mL的水中，并离心除掉未反应的金刚烷羧酸。真空除掉溶剂，残留物重新溶解于6mL4MHCl在二噁烷的溶液中以脱保护叔-丁氧羰基。所得溶液在室温下搅拌4小时。真空除掉溶剂，残留物重新溶于水。所得溶液在Pierce’s Slide-A-Lyser，3500MWCO中透析过夜。冷冻干燥得到635mg Ad-PEG-NH-NH₂。

步骤2：转铁蛋白-PEG-Ad连接物的合成

100mg(1.28μmol)人转铁蛋白(贫铁)(Sigma-Aldrich)在1mL的30mM醋酸钠缓冲液(pH5)中应用到Sephadex G-25(Supelco)柱进行凝胶过滤。所得4mL含转铁蛋白(检测：280nm紫外吸收)溶液冷却到0℃，加入80μL含4mg(19μmol)过氧化钠的30mM醋酸钠缓冲液(pH5)。混合物保存在冰浴中，置于黑暗中2小时。为了除掉低分子量的产物，采用了额外的凝胶(Sephadex G-25，30mM醋酸钠缓冲液(pH5))过滤。得到含约85mg(1.09μmol)氧化的转铁蛋白的溶液。修饰的转铁蛋白溶液立即加入到1mL的100mM醋酸钠(pH5)含54.5mg(10.9μmol)的Ad-PEG₅₀₀₀-NH-NH₂溶液中。所得溶液在室温搅拌过夜。通过加入1M碳酸氢钠将pH调到7.5，四份的9.5mg(150μmol)氰基硼氢化钠以每小时一份加入。18小时后，纯化聚乙二醇化的转铁蛋白，采用CentriconYM-50,000 NMWI(Millipore)浓缩。

步骤3：通过转铁蛋白氧化合成的载铁转铁蛋白-PEG-Ad

40mg apo-转铁蛋白-基化合物(apo-转铁蛋白或apo-转铁蛋白-PEG-Ad)溶解于700μL的dH₂O中。溶液中加入200μL的5mM柠檬酸铁和100μL的84mg/mL NaHCO₃。允许静置此溶液2-3小时然后在PBS中透析过夜。载铁效率通过确定465nm(来自氧化铁)与280nm(来自蛋白中的色氨酸残基)处的吸收比率来计算，并用商购holo-转铁蛋白的A₄₆₅/A₂₈₀比率标准化。转铁蛋白、氧化缓冲液(醋酸钠pH5)中的转铁蛋白以及新氧化转铁蛋白的载铁效率已经确定并显示于图21中。转铁蛋白的氧化减少了蛋白质的铁装载效率。

步骤4：转铁蛋白-PEG-AD(通过转铁蛋白的氧化而合成)对PC3细胞上转铁蛋白受体的键合亲和力

PC3细胞用含有不同量的未标记转铁蛋白和转铁蛋白-PEG-AD的250nM的荧光素-转铁蛋白(FITC-TF)孵育。FITC-hTF细胞结合用FACS分析来测试。未标记的转铁蛋白与FITC-hTF非常有效地竞争，而转铁蛋白-PEG-AD与FITC-hTF的竞争很弱，这最有可能是由于对受体的亲和力减小。结果显示在图22中。

实施例56：通过赖氨酸基团偶合的转铁蛋白，图23。

步骤1：VS-PEG₃₄₀₀-Ad合成

乙烯基砜-PEG₃₄₀₀-NHS(Shearwater Polymers，0.147mmol，0.5g)加入到配有搅拌棒的圆底烧瓶内并溶解于5mLDMSO中。在烧瓶中加入金刚烷甲基胺(Aldrich，0.147mmol，0.0243g)。所得溶液在室温下搅拌1小时。真空除掉溶剂，残留物重新溶解于水中。所得混合物在1000MWCO膜(Spectra Por)中透析过夜。冷冻干燥溶液得到0.49g乙烯基砜-PEG₃₄₀₀-Ad。

步骤2：转铁蛋白-PEG-AD(Tf-PEG-Ad)共轭物的合成

将250mg(3.21μmol)的人转铁蛋白(贫铁)(Sigma-Aldrich)溶解于10mL 0.1M的四硼酸钠缓冲液(pH9.4)，加入109mg(32.1μmol)乙烯基砜-PEG₃₄₀₀-Ad。得到的溶液在室温下搅拌2小时。聚乙二醇化的转铁蛋白用Centricon YM-50,000 NMWI设备(Millipore)从未反应的乙烯基砜-PEG₃₄₀₀-Ad，和用疏水相互作用色谱柱Butyl-650S(Tosoh Biosep)从未反应的转铁蛋白中纯化出来(通过HPLC和MALI-TOF分析确定)。

步骤3：通过赖氨酸基团偶联合成的载铁转铁蛋白-PEG-Ad

根据实施例55描述的步骤将Apo-转铁蛋白和Tf-PEG-Ad加载铁。载铁的程度如所述量化。通过赖氨酸基团偶联合成的Tf-PEG-Ad的载铁率接近100％。

实施例57：转铁蛋白-PEG-AD(通过赖氨酸基团偶联合成)对PC3细胞上转铁蛋白受体的键合亲和性

PC3细胞以125,000细胞/mL的密度种植于6孔培养板中。24小时后细胞暴露于与不同浓度的hTf、hTf-PEG-Ad(由hTf氧化合成)、hTf-PEG-Ad(由VS-赖氨酸反应及纯化而制备)和hTf-(PEG-Ad)₂(由VS-赖氨酸反应及纯化而制备)混合的250nM FITC-Tf中。暴露20分钟后的吸收量用FACS确定。与由转铁蛋白氧化合成的Tf-PEG-AD不同的是，由赖氨酸偶联合成的Tf-PEG-Ad化合物与FITC-TF有效竞争PC3细胞表面上的受体。结果见图24。

实施例58：Tf-修饰的polyplex的ζ电势

等体积的12以3+/-电荷比加入到质粒DNA(2μg DNA，0.1mg/mL水溶液)，形成颗粒复合物。然后将全-转铁蛋白或全-Tf-PEG-Ad(17mg/mL于水中)加入到颗粒复合物中。加入1.2mL的水稀释颗粒，并用Zetapals动态光散射仪器(Brookhaven Instruments)来测定ζ电势。结果见图25。未修饰的全-转铁蛋白通过静电作用和颗粒复合物连结。当加入2nmol Tf/μg DNA时，颗粒复合物接近中性。全-转铁蛋白-PEG-Ad(在图25中表示为Tf-PEG-Ad)有可能通过静电和包合化合物作用而同颗粒复合物连结。因此，会产生全-Tf-PEG-Ad同颗粒更高程度的连结，这可以由与更高浓度的全-Tf-PEG-Ad结合的修饰颗粒的ζ电势持续下降来证实。在2nmol/μg时，用全-Tf-PEG-Ad修饰的颗粒复合物带正电(ζ电势约7mV)。

实施例59：AD-Phos-PEG₅₀₀₀-半乳糖的合成

下面的化合物编号见上面的示意图

I.金刚烷膦酸2的合成。二苄基膦酸盐(0.712g，2.71mmol)用注射器加入到氩气保护的1-金刚烷甲基胺(0.493g，2.98mmol)的干燥四氯化碳溶液中。加入二苄基膦酸盐后，立即可看到白色沉淀生成，溶液搅拌12小时。在混合物中加入二氯甲烷(30mL)。有机相用稀释的酸性水溶液(pH＝4)洗涤2次(2×40mL)。有机相接着用硫酸镁干燥。真空蒸掉溶剂。得到的白色固体用二氯甲烷和正己烷的混合溶剂结晶。得到针状晶体1(0.69g)，产率60％。结晶于15psi的压力下于乙醇中(40mL)用10％的Pd/C(200mg)和氢还原16小时。过滤除掉催化剂。真空除掉滤液中的溶剂，得到定量产率的2。所得化合物2直接使用无需进一步纯化。

II.NH₂-PEG₅₀₀₀-半乳糖4的合成。将FMOC-NH-PEG₅₀₀₀-NHS(Shearwater，760mg，0.152mmol)溶解于DMSO(3.7mL)中。在此溶液中加入半乳糖胺(385mg，1.52mmol)和二异丙基乙胺(0.264mL，1.52mmol)的DMSO溶液(14mL)。溶液搅拌20分钟，在水(4×4L)中用3500 MWCO膜(Spectra/Por 7，S pectra Lab，Inc.)透析24小时。溶液冷冻干燥得到745mg的FOMC-NH-PEG₅₀₀₀-半乳糖3。3溶解于含哌啶(3mL)的DMF(12mL)中。溶液搅拌16小时。高真空除掉DMF，在得到的固体中加入40mL水。离心除掉水。水溶液在水(4×4L)中用3500 MWCO膜(Spectra/Por 7，Spectra Lab，Inc.)透析24小时。冷冻干燥溶液得到625mg NH₂-PEG₅₀₀₀-半乳糖4。

III.金刚烷-Phos-PEG₅₀₀₀-半乳糖5的合成。4(63mg，0.013mmol)溶解于咪唑缓冲液中(1mL，0.1N，pH＝6.5)。溶液中加入2的乙腈溶液(4mL)，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC，100mg，40eq)。在室温下搅拌溶液16小时。溶液在水(4×4L)中用3500 MWCO膜(Spectra/Por 7，Spectra Lab，Inc.)透析，然后冷冻干燥得到5。

实施例60：AD-Glu-Glu-PEG₅₀₀₀-半乳糖的合成

下面的化合物编号见上面的示意图

I.H-Glu-Glu-金刚烷7的合成。H-Glu(Bn)-OH(3.55g，15mmol)溶解到含碳酸氢钠(1.26g，15mmol)的水(16mL)中。在混合物中加入溶解于THF(30mL)的Z-Glu(Bn)-OSu(4.68g，10mmol)。混合物中再加入30mL THF、20mLCH₃CN，接着加入2N NaOH 10mL。溶液在室温下搅拌16小时。高真空蒸掉THF和CH₃CN。在水溶液混合物中加入1N的HCl，将pH值调至3。可以看到沉淀。混合物用氯仿(3×30mL)抽提。有机相用硫酸镁干燥，过滤除掉硫酸镁。蒸掉有机溶剂得到白色的棒状固体6。6直接用于下一步反应而无需纯化。

将3.51g 6溶解在无水THF(40mL)中。0℃时于氮气氛围下在此溶液中加入1-金刚烷甲基胺(1.007g，6.1mmol)、1-羟基苯并三唑(0.93g，6.1mmol)、DCC(1.32g，6.4mmol)以及二异丙基乙胺(1.06mL，6.1mmol)。然后将混合物暖至室温并搅拌过夜。滤去沉积物。然后真空除去THF生成黄色固体。黄色固体在甲醇中结晶得到片状晶体6(2.1g，49％)。然后将6溶于40mL甲醇中并在200mg 10％的Pd/C存在下，于氢化装置中的25-30psi氢气中震荡。24小时后滤掉晶体。在真空除去甲醇后，就得到了定量产率的H-Glu-Glu-AD 7。7不经纯化而直接使用。

II.AD-Glu-Glu-PEG₅₀₀₀-半乳糖9的合成。在PBS缓冲液(2.25mL，1×，pH7.2)中加入乙烯基砜(VS)-PEG₅₀₀₀-NHS(Shearwater，423mg，0.085mmol)和半乳糖胺(216mg，0.85mmol)。搅拌溶液1小时然后在水(4×4L)中用3500MWCO膜(Spectra/Por 7，Spectra Lab，Inc.)透析24小时。然后冷冻干燥溶液。产物8使用MALDI-TOF和HPLC分析。8溶解于硼砂缓冲液(6mL，0.1N，pH9.4)中。化合物7(121mg)溶解于DMSO溶液(2mL)中然后加入聚合物溶液中。混合物在35℃搅拌16小时然后在50℃搅拌7小时。HPLC用于监视此反应。聚合物用3500 MWCO膜透析并冷冻干燥得到419mg AD-Glu-Glu-PEG₅₀₀₀-半乳糖9，产率90％。

实施例61：AD-Glu-Glu-PEG₅₀₀₀的合成

AD-Glu-Glu-mPEG₅₀₀₀ 10的合成。将mPEG₅₀₀₀-SPA(Shearwater，300mg，0.06mmol)和7(实施例60)溶解于DMSO(2mL)和CH₃CN(1mL)中。混合物在室温下搅拌24小时。然后溶液在水(4×4L)中用3500MWCO膜(Spectra/Por 7，Spectra Lab，Inc.)透析24小时。冷冻干燥溶液得到276mg AD-Glu-Glu-mPEG₅₀₀₀ 10。10通过MALDI-TOF MS、HPLC和¹H NMR确认。

实施例62：转铁蛋白和PEG-修饰的Polyplexs的合成

用Tf-PEG-AD(或Tf-(PEG-AD)₂)和PEG-AD(或PEG-Glu-Glu-AD)修饰的Polyplex(聚合物与DNA的电荷比为3+/-)可如下述而合成。所有成分等量使用。Tf-PEG-AD(或Tf-(PEG-AD)₂)的水溶液加入到12的水溶液中。在此混合溶液中加入一份PEG-AD(或PEG-Glu-Glu-AD)。将三重混合物加入到DNA溶液中。用吸量管轻混溶液，粒径、ζ电势和盐稳定性如前述确定。颗粒的ζ电势可以通过改变Tf-PEG-AD(或Tf-(PEG-AD)₂)和PEG-AD(或PEG-Glu-Glu-AD)的相对比例而变化。作为颗粒修饰函数的ζ电势的变化及粒径的实例显示于下面图26、27和28中。

实施例63：金刚烷-阴离子肽-PEG₃₄₀₀-半乳糖/葡萄糖(AD-pep-PEG-gal/glu)。阴离子肽(序列：E-A-E-A-E-A-E-A-C)由BiopolymerSynthesis Facility(Beckman Institute，California Instituteof Technology)使用自动合成仪而合成。在从树脂中切除肽之前，金刚烷-羧酸(ACA，Aldrich)用DCC偶联共轭至肽的N-末端。所得肽(ACA-E-A-E-A-E-A-E-A-C，MW 1084)从树脂中切除并通过Maldi-TOF分析。

半乳糖-和葡萄糖-PEG₃₄₀₀-乙烯基砜(gal/glu-PEG₃₄₀₀-VS)通过NHS-PEG₃₄₀₀-VS(Shearwater Polymers)与20当量葡糖胺或半乳糖胺(Sigma)在磷酸盐缓冲盐中反应，以大约95％的产率制备，反应在室温下pH7.2时进行2小时。溶液在水中充分透析然后冷冻干燥。阴离子肽的硫醇(2当量)与半乳糖-PEG₃₄₀₀-VS或葡萄糖-PEG₃₄₀₀-VS在含10mMTCEP的50mM硼酸钠缓冲液(pH9.5)中反应。酸化溶液然后通过离心除去沉积的肽(在pH9.0以下不可溶)。收集上清液，充分透析并冷冻干燥。所需的产物通过Maldi-TOF分析确认(示意图显示如下)。

AD-pep-PEG-半乳糖

AD-pep-PEG-葡萄糖

实施例64：萘-PEG₅₀₀₀的合成

将500mg PEG₅₀₀₀-NHS(0.1mmol，Shearwater Polymers)加入到装备有搅拌棒的玻璃瓶中。在其中加入溶于8mL二氯甲烷的146μL1-萘甲胺(1mmol，10eq，Aldrich)，并搅拌溶液16小时。然后真空除去溶剂。混合物中加入20mL水。不可溶的残渣离心除去。水溶液用Spectra/Por 3500 MWCO透析膜透析24小时。然后冷冻干燥溶液得到白色絮状固体萘-PEG₅₀₀₀。产物用¹H NMR、MALDI TOF MS及反相HPLC分析。萘-PEG₃₄₀₀用类似的方案合成(产率56％；用Maldi-TOF分析确认产物)。

实施例65：萘-PEG5000-半乳糖的制备

乙烯基砜(VS)-PEG₅₀₀₀-NHS(Shearwater，423mg，0.085mmol)和半乳糖胺(216mg，0.85mmol)加入到PBS缓冲液中(2.25mL，1×，pH7.2)。搅拌溶液1小时然后在水(4×4L)中用3500MWCO膜(Spectra/Por 7，Spectra Lab，Inc.)透析24小时。然后冷冻干燥溶液生成乙烯基砜-PEG₅₀₀₀-半乳糖。用MALDI TOF及HPLC分析产物。将300mg(0.06mmol)乙烯基砜-PEG₅₀₀₀-半乳糖溶解于硼砂缓冲液(3mL，0.1N，pH9.4)中。1-萘甲胺(8.8μg，0.06mmol)溶解于DMSO溶液(3mL)中然后加入到聚合物溶液中。混合物在55℃搅拌36小时。聚合物用3500 MWCO膜透析并冷冻干燥溶液得到萘-PEG₅₀₀₀-半乳糖。

应该了解上述讨论和实施例仅仅展现了某些优选实施方案的详细描述。对本领域普通技术人员很显然的是，可以在不脱离本发明精神和范围的情况下进行各种修饰和同等操作。上述讨论或引用的所有专利、期刊文章及其它文献都在此整体引入作为参考。

Claims

1. 下式的化合物：

其中

J是-NH-，-C(＝O)NH-(CH₂)_d-，-NH-C(＝O)-(CH₂)_d-，-CH₂SS-，-C(＝O)O--(CH₂)_e-O-P(＝O)(O-(CH₂)_e-Y)O-，

肽或多肽残基，或-NH-(C＝O)-CH(R¹)-NH-(C＝O)-CH(R¹)-NH-；

Y是附加的主体/客体官能团；

R¹是-(CH₂)_a-CO₂H、其酯或其盐；或-(CH₂)_a-CONH₂；

PEG是-O(CH₂CH₂O)_z-，其中z在2-500范围内变化；

L是-NH-，

-NH-(C＝O)-(CH₂)_e-(C＝O)-CH₂-，-S(＝O)₂-HC＝CH₂-，-SS-，-C(＝O)O-或碳水化合物残基；

a是0或1；

b是0或1；

d在0-6范围内；

e在1-6范围内；

m在1-5范围内；

n在0-6范围内；

q在1-5范围内；

w在1-5范围内；

y是1；

x是1；且

主体/客体在每次出现时独立选自环糊精、carcerand、cavitand、冠醚、穴状配位体、cucurbituril、杯芳烃、球状配位体、金刚烷、二金刚烷、萘和胆固醇。

2. 权利要求1的化合物，其中q是1，w是1，和m是1。

3. 权利要求2的化合物，其中主体/客体选自金刚烷基、萘基、胆固醇、环糊精，或它们的任何混合物。

4. 权利要求1的化合物，其中主体/客体选自金刚烷基、萘基、胆固醇、环糊精，或它们的任何混合物。

5. 权利要求2的化合物，其中

是

以及Y是金刚烷基。

6. 一种组合物，含有聚合物和治疗剂以及所述聚合物与配位剂的包合配合物，其中所述配位剂是权利要求1的化合物，并且所述聚合物具有能与所述配位剂形成包合配合物的主体和/或客体官能团。

7. 权利要求6的组合物，其中所述聚合物具有主体官能团而所述配位剂具有客体官能团。

8. 权利要求6的组合物，其中所述聚合物具有客体官能团而所述配位剂具有主体官能团。

9. 权利要求6的组合物，其中所述聚合物具有主体和客体官能团，并含有具有主体和客体官能团的配位剂混合物。

10. 权利要求7-9中任一项的组合物，其中所述主体官能团选自环糊精、carcerand、cavitand、冠醚、穴状配位体、cucurbituril、杯芳烃、球状配位体或它们的任何混合物。

11. 权利要求7-9中任一项的组合物，其中所述配位剂进一步含有空间臂基团。

12. 权利要求7-9中任一项的组合物，其中所述客体官能团选自金刚烷基、二金刚烷基、萘基和胆固醇。

13. 权利要求12的组合物，其中所述主体官能团是环糊精而所述客体官能团是金刚烷基或二金刚烷基。

14. 权利要求6-9中任一项的组合物，其中所述官能团选自配体、核定位信号、内体释放肽、内体释放大分子、第二治疗剂、用于稳定的稳定聚合物/亲水聚合物和它们的任何混合物；且所述空间臂基团选自：直接键、磷酸酯基团、聚乙二醇和短的阴离子肽序列。

15. 权利要求6-9中任一项的组合物，其中所述治疗剂选自抗生素、类固醇、多聚核苷酸、小分子药物、病毒、质粒、肽、肽片段、螯合剂、生物活性大分子，及它们的任何混合物。

16. 权利要求15的组合物，其中所述治疗剂是多聚核苷酸。

17. 权利要求6的组合物，其中所述聚合物是含环糊精的聚合物，而所述配位剂还含有选自金刚烷基和二金刚烷基的包合客体。

18. 权利要求17的组合物，其中所述治疗剂选自抗生素、类固醇、多聚核苷酸、小分子药物、病毒、质粒、肽、肽片段、螯合剂、生物活性大分子，及它们的任何混合物。

19. 权利要求18的组合物，其中所述治疗剂是多聚核苷酸。

20. 权利要求17的组合物，其中所述配位剂是下式的化合物：

其中

J是-NH-，-C(＝O)NH-(CH₂)_d-，-NH-C(＝O)-(CH₂)_d-，-CH₂SS-，-C(＝O)O--(CH₂)_e-O-P(＝O)(O-(CH₂)_e-Ad)O-，

或

-NH-(C＝O)-CH(R¹)-NH-(C＝O)-CH(R¹)-NH-；

Ad是金刚烷基；

R¹是-(CH₂)_a-CO₂H、其酯或其盐；或-(CH₂)_a-CONH₂；

PEG是-O(CH₂CH₂O)_z-，其中z在2-300范围内变化；

L是-NH-，

a是0或1；

b是0或1；

d在0-6范围内；

e在1-6范围内；

n在0-6范围内；

y是1；且

x是1。

21. 权利要求6的组合物，其中所述聚合物是含环糊精的聚合物，所述配位剂还包含包合客体，所述配位剂是如权利要求3或4的化合物。

22. 权利要求21的组合物，其中所述治疗剂选自抗生素、类固醇、多聚核苷酸、小分子药物、病毒、质粒、肽、肽片段、螯合剂、生物活性大分子，及它们的任何混合物。

23. 权利要求22的组合物，其中所述治疗剂是多聚核苷酸。

24. 一种制备权利要求6的组合物的方法，包括步骤：

结合治疗剂、聚合物以及配位剂，以形成组合物，其中所述聚合物和所述治疗剂形成颗粒复合物，并且所述聚合物和所述配位剂形成包合配合物。

25. 权利要求24的方法，其中所述治疗剂首先与所述聚合物结合以形成所述颗粒复合物，然后所述颗粒复合物与所述配位剂结合，使得所述聚合物和所述配位剂形成包合配合物。

26. 权利要求24的方法，其中所述聚合物首先与所述配位剂结合以形成所述包合配合物，然后所述包合配合物与所述治疗剂结合，使得所述聚合物和所述治疗剂形成所述颗粒复合物。