TWI321054B - Compositions containing inclusion complexes - Google Patents

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TWI321054B
TWI321054B TW090131376A TW90131376A TWI321054B TW I321054 B TWI321054 B TW I321054B TW 090131376 A TW090131376 A TW 090131376A TW 90131376 A TW90131376 A TW 90131376A TW I321054 B TWI321054 B TW I321054B
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TW
Taiwan
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polymer
composition
cyclodextrin
group
therapeutic agent
Prior art date
Application number
TW090131376A
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English (en)
Inventor
Hwang Pun Suzie
Gonzalez Hector
E Davids Mark
Bellocq Nathalie
Cheng Jianjun
Original Assignee
California Inst Of Techn
Insert Therapeutics Inc
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Description

1321054 a A7 B7 五、發明説明（1 ) 相關申請案之交叉參考 本案請求美國臨時申請案60/256,341，申請日2000年 12月19日；60/256,344，申請日2000年12月19日；及 60/293,543 ’中請日2001年5月29日之優先中請權，各案以 引用方式併入此處。 發明範疇 本發明係關於用於輪送治療劑之組成物及方法。特 別，本發明係關於一種組成物含有聚合物、治療劑及複合 劑，此處聚合物與複合劑於主_賓或賓_主交互作用反應而 形成包涵複體。本發明之組成物可用於輸送治療劑治療多 種病症。 發明背景 環糊精為含有天然D(+)-葡萄糖吡喃糖單位呈 -(1，4)-鍵聯之環狀多醣類。最常見的環糊精為分別含有6 7或8個葡萄糖吼喃糖單位之⑷-環糊精、⑷_環糊精及 (r)_環糊精。於結構上’環糊精之環狀性質形成環圈或圏 ㈣^有個内部非極性或疏水性空腔，二次經基位於環 糊精敁圏之-側，以及一.次羥基係位於環糊精環圈之另— ^如此’使用⑷·環糊精為例，環糊精經常示意表示如 本紙張尺度· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（2 )
沒-¾•糊精 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ 7二次羥基 一次經基 二之羥基所在該侧具有比一次羥基所在該側更寬的 直徑。環糊精内部腔穴之疏水性質允許包含多種化合物（理 解超分子化學，第3期，J丄_ Atwood等人編輯，帕格曼 (Pergamon)出版社（1996年）；T. Cserhati，分析生物化學， 225 : 328-332 (1995年）；Husain等人，應用光譜術，46 : 652-658 (1992年）；FR 2 665 169) ° 環糊精經由與多種可嵌合於環糊精的疏水腔穴的藥 物形成包涵複體、或經由與其它生物活性分子如寡核苷酸 或其衍生物形成非共價結合複體而用作為多種治療性化合 物之輸送媒介。例如美國專利4,727,064敘述由一種帶有實 質低水溶解度以及一種以非晶形水溶性環糊精為主的混合 物組成的醫藥製劑。該藥物係與混合物之環糊精形成包涵 複體。於美國專利5,691，316，描述寡核苷酸用環糊精細胞 輸送系統。於此種系統，寡核苷酸係與環糊精非共價複合； 或另外寡核苷酸可共價結合金剛烷，而其又非共價結合環 糊精。 多種含環糊精之聚合物及其製備為業界已知（理解超 分子化學，第3期，J丄_ Atwood等人編輯，帕格曼出版社 (1996年））。製造含制動環糊精之聚合物之方法述於美國專 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1321054 五、發明説明（3 ) 利5,6〇8，G15»根據該方法，環糊精分子與“，卜未飽和酸 之醯基i單體或其衍生物反應、或與具有端末異氮酸基之 未飽和酸或其.衍生物或其射物反應。經由環_ 與幾基鹵及及軒類等化合物反應獲得環糊精衍生物。社果 所得聚合物含有環糊精單位作為由線性聚合物主鏈伸出\ 支鍵。 美國專利5,276,088描述一種經由聚乙烯醇或纖維素 或其衍生物與環糊精衍生物反應、或經由環糊精衍生物與 乙酸乙烯醋或甲基丙烯酸甲醋共聚合而合成環糊精聚合物 之方法。再度’結果所得環糊精聚合物含有環糊精部分作 為由聚合物主鏈伸出的旁出部分。具有超分子結構之可生 物刀解之醫藥聚合物總成述於w〇 96/〇97〇3 A1及美國專 利第5,855,900。遠總成包含多種載有藥物之環狀化合物， 該，合物係經由將藥物結合至α、石或r環糊精，然後串 起藥物/環糊精化合物連同線性聚合物製備，該聚合物帶有 可生物刀解。h結合至聚合物兩端。此種總成據報告可回 應於於疾病中出現之特定生物分解而釋放藥物。此種總成 俗稱為「項鏈型」環糊精聚合物。 但業界需要有_種更有效的非病毒性輸送系統，其具 有例如較问安定性（例如於生理條件下）以及有效鎖定目標 能力等性質。本發明可符合此項需求。 發明概尊 本發明提供一種組成物其含有一種聚合物、一種治療 片J及種複5劑。该聚合物與複合劑以主賓及/或賓主交 本紙張尺度適财關家 1321054 A7 B7 五、發明説明（4 ) 互作用反應而形成包涵複體。本發明組成物可用於輪送产 療劑以及用於治療多種病症。聚合物以及複合劑皆可用於 將官能基引進複合物。 本發明提供一種組成物其包含聚合物以及治療劑之 微粒狀複合物以及聚合物與複合劑之包涵複體。微粒狀複 合物之聚合物具有主官能基其可與賓複合劑形成包涵複 體。另外，至少一種微粒狀複合物之聚合物具有賓官能基， 其可與主複合劑形成包涵複體。於另一具體實施例，聚合 物或複合劑可具有主及賓兩種官能基而形成包涵複體。如 此允許多種複合劑形成包涵複體，因而變成與治療組成物 組合。如此也允許多重官能基被引入本發明之治療組成物。 本發明亦係關於一種製備治療組成物之方法。該方法 包含一種治療劑’一種具有主或賓官能基之聚合物，以及 一種具有賓或主官能基之複合劑而形成治療組成物。複合 劑與聚合物形成包涵複體。 本發明亦係關於一種輸送治療劑之方法。根據該方 法’治療有效量之本發明組成物投予被認知有治療劑需求 的哺乳類（例如人類或動物）。如此，本發明提供使用本發 明組成物輸送適當治療劑而治療疾病。 圖式之簡簞銳明 附圖說明本發明之各具體實施例，化合物丨2也標示為 /3 CDP6。帶有核酸以及陽離子性聚合物呈微粒狀複合物之 複合物標示為複聚物。圖式之簡單說明如後。 第1圖多種金剛烷-PEG分子結構式 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1321054 A7 ___ B7_ 五、發明説明（5 ) 第2圖GALA及GALA-Ad改性組成物之液壓動力學直 徑，實例30。 第3圖GALA及GALA-Ad改性組成物之日塔（Zeta)電 位，實例3 2。 第4圖GALA-Ad及GALA改性組成物由BHK-21細胞攝 取，實例31 〇 第5圖GALA-Ad及GALA改性複聚物複聚物組成物由 HUH-7細胞攝取，實例33。 第6圖BHK-21細胞使用以GALA及GALA-Ad改性之冷 -環糊精-DMS共聚物12為主的組成物進行蟲螢光素酶轉移 感染，實例34。 第7圖GALA及GALA-Ad改性複聚物對BHK-2 1細胞之 毒性，實例35。 第8圖藉接枝進行DNA-複合物後之PEG化反應圖，實 例3 9。 第9圖於DNA複合後期間，PEI及12微粒狀複合物以及 複聚物複聚物組成物之粒徑，實例39。 第10圖藉PEG化穩定複聚物組成物，實例40。 第11圖共同輸送12複聚物與PEG3400-FITC，實例42。 第12圖乳糖-12結構，實例37。 第13圖12及LAC-CDP6複聚物轉移感染至HUH-7細 胞，實例43。 第14圖實驗方案示意圖，實例47。 第15圖粒子直徑，實例47。 9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（6 ) 第16圖因複合體沉澱造成DNA損失，實例47。 第17圖包涵複體修改12/DNA複合物，實例48。 第18圖改性複聚物轉移感染HepG2細胞，實例49。 第19圖競爭置換實驗，實例52。 第 20 圖金剛烷-PEG-轉移素（Transferrin)(Ad-PEG-Tf) 之合成，實例5 5。. 第21圖轉移素之鐵載荷，實例55。 第22圖結合親和轉移素-PEG-Ad，實例55。 第23圖透過離胺酸基之轉移素偶合，實例56。 第24圖轉移素-PEG-AD對PC3細胞上轉移素受體之結 合親和力，實例5 7。 第25圖日塔電位變化及粒徑隨轉移素及PEG改性複聚 物之粒子修改之函數而改變，實例58。 第26圖日塔電位測量，Ad-陰離子性-PEG，實例62。 第27圖安定性測量，實例62。 第28圖添加增加轉移素複合劑，實例62。 第29圖組胺醯化12之合成。 第30圖内囊胞逃逸用· pH敏感聚合物（含二次胺聚合物 之合成）。 發明之詳細說明 本發明係關於一種採用包涵複體來輸送治療劑之組 成物。包涵複體為具有加合物特性結構之分子化合物，其 中化合物（主分子）之一於空間上包圍另一化合物之至少部 分。包圍化合物（賓分子）係位於主分子腔穴内部而不影響 10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）
五、發明説明（7 ) 主分子之架構結構。包涵複體之特性為除了略微變形之 外，可利用的腔穴大小及形狀仍保持大半經常實際未改 變。「主」可為業界已知之任一種主化合物或分子。適當「主」 例如包括但非限於環糊精、卡色命類（carcerands)、卡維坦 類（cavitands)、冠醚類、克利普坦類（cryptands)、久久必塔 類（cucurbiturils)、卡利瑟林類（caiixarenes) ' 沙芙侖.類 (spherands)等。適合用於複合劑之包涵賓分子包括業界已 知之分子，例如但非限於金剛烷、二金剛烷、萘及膽固醇。 環糊精為較佳主，其可與多種離子物種及分子物種交 互作用，結果所得包涵化合物係屬於「主-賓」複體類別。 為了實現主-賓關係，必須滿足若干要求；其中一項要求為 主與賓分子之結合位置就立體電子而言必須互補。環糊精 類可與下述化合物形成包涵複體，該化合物之大小係與腔 穴維度相容。複體形成程度也依據賓分子的極性決定。與 顯著大於腔穴的分子形成複體亦屬可能，此時僅有某些基 或支鏈穿入竣水化合物通道内部。參考j Szejtu，Akademiai Kiado ’環糊精及其包涵複體’布達佩斯，1982年。 本發明組成物含有至少一種聚合物以及至少一種治 療劑，通常係呈聚合物及治療劑之微粒狀複合物形式。治 療組成物也含有一或多種複合劑。微粒狀複合物之至少一 種聚合物與複合劑以主-賓或賓-主交互作用而形成聚合物 與複合劑間之包涵複體。聚合物特別複合劑可用於將官能 基引導入本發明化合物。一具體實施例中，微粒狀複合物 之至少一種聚合物具有主官能基，且與具有賓官能基之複 本纸張尺度適用争國國家標準（挪〉A4規格（21〇χ297公着） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
11 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（8 ) 合劑形成包涵複體。另一具體實施例中，微粒狀複合物之 至少一種聚合物具有賓官能基，且與具有主官能基之複合 劑形成包涵複體。又一具體實施例中，微粒狀複合物之聚 合物可含有主及賓官能基二者，且與賓複合劑及主複合劑 形成包涵複體。 1.微粒狀複合物 治療劑與聚合物之微粒狀複合物為治療劑為聚合物 的組合或整合。微粒狀複合物為一種組合結構包含一或多 種治療劑於多維聚合物網路。可使用單一聚合物或聚合物 混合物。了可形成微粒狀複合物之多維聚合物網路外，如 後文討論，複合物之至少一種聚合物帶有主及/或賓官能 基，且可與一或多種複合劑形成包涵複體。 A.聚合物 任一型可與治療劑形成微粒狀複合物且具有主及/或 賓官能基聚合物皆可用於本發明組成物。聚合物可為線性 或分支聚合物。聚合物可為均聚物或共聚物。若使用共聚 物，則共聚物可為隨機共聚物或分支共聚物。較佳聚合物 為水分散性，更佳為水溶'性。例如適當聚合物包括但非限 於多醣類、聚酯類、聚醯胺類、聚醚類、聚碳酸酯類、聚 丙稀酸酯類等。供治療藥用，聚合物須具有低毒性，且較 佳為無毒或非細胞毒性。如後文討論，用於本發明組成物 之較佳聚合物為以環糊精為主之聚合物。容後詳述，以具 有分子量於3,000至100,000之範圍之水溶性線性環糊精共 聚物為較佳，而以具有分子量3,000至50,000為特佳。 12 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 固 官 五、發明説明（9 ) 根據本發明，微粒狀複合物之聚合物可為單―聚人物 或兩種或多種聚合物之混合物，其可為相同或相異聚合物 。微粒狀複合物之聚合物可進—步含有或進一步改性而含 有交聯基，經由該轉基組合聚合物而形成㈣狀複合物。 微粒狀複合物之至少一種聚合物為可形成包涵複體 之聚合物。「可形成包涵複體之聚合物」可透過非鍵結交互 作用（例如凡得瓦爾力、氫鍵、雙極·雙極交互作用、離子 對、溶劑疏離交互作用等）而與另一種化合物（錯合劑）或化 合物上的取代基進行_或多種主_賓組合之聚合物。換言 之’至少一種聚合物其具有主或賓官能基而可與複合劑或 複合劑的取代基形成包涵複體。主或賓官能基可為聚合物 鏈之邙刀或可存在作為取代基或存在於旁出或分支 鏈。具有主官能基於聚合物主鏈之聚合物例如為線性環糊 精聚合物，容後料。具有賓官能基而非構成聚合物主鍵 一部分之聚合物例如為具有旁出金剛烷基之聚合物。其它 可用於聚合物之適當「主」例如包括但非限於卡色侖類' 卡維坦類、冠醚類、克利普坦類、久久必塔類、卡利瑟林 類、沙芙侖類等。適合用於此種主分子之包涵賓分子實例 為業界已知，例如但非限於金剛烷、二金剛烷、萘及膽 醇。 較佳具體實施例中，聚合物可含有不同類型主或賓 能基’或聚合物可含有主及賓官能基二者。如此讓欲形成 於指定分子的不同包涵複體有更大彈性。於同一聚合物上 有夕個主、多個賓或主及賓官能基二者可增加經由包涵複 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) M規格（21〇χ297公釐） …r……；…， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ·，?τ_ 13 - 1321054 A7 ___B7_ 五、發明説明（10 ) 體引進本發明之治療性組成物之官能基變化。 由於主-負結合結果’聚合物與複合劑交互作用而形成 包涵複體。較佳由於非鍵結交互作用或結合結果，結果所 得包涵複體具有結合常數約> 1 〇2，較佳約> 1 〇3，及更佳約 > 1 〇4。典型結合常數係於約1 02_ 1 〇6之範圍。 微粒狀複合物之聚合物可以一或多種配體改性。配體 可於微粒狀複合物形成時或形成後，透過複體改性微粒狀 複合物之治療劑及/或聚合物而引進。配體可為任何允許鎖 定目標及/或結合預定細胞的複體。如業界人士已知，鎖定 目標及結合於細胞包括細胞受體附接，而其又導致受體媒 介的細胞攝粒作用。若附接二或多個配體，則配體可相同 或相異。適當配體例如包括但非限於維生素類（如葉酸）、 蛋白質類（如轉移素及單株抗體）、單醣類（如半乳糖）、肽類 及多醣類。如熟諳技藝人士了解，配體的選擇係依據預定 輸送類型改變。至於另一實例，配體可為膜穿透性或膜穿 透劑例如得自HIV-1的TAT蛋白質。TAT蛋白質經病毒轉錄 活化而被主動運輸進入細胞核。Torchilin，V.P.等人，paNs 98 ’ 8786-8791 (2001)。 本發明之較佳具體實施例中，微粒狀複合物之多種聚 合物中之至少一者為具有主及/或賓官能基其可形成包涵 複體之實質線性聚合物。實質線性聚合物可藉業界已知任 種手ί又製備。聚合物可由可形成包涵複體之適當單體或 其中至少一者具有主或賓官能基之單體混合物製備。主或 賓官能基可於聚合物鏈内部 '旁出（或分支）於聚合物鏈、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐〉 Ί4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂— 14 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（11 ) 或存在為端基。另外，如前文討論，於聚合物形成後，可 進一步改性而加入主及/或賓官能基俾形成可實質形成包 涵複體之實質線性聚合物。實質線性聚合物可為嵌共聚 物，此處嵌段引進主官能基、水分散性、及/或水溶性等性 質。此等嵌段例如包括線性聚伸乙基亞胺（PEI)、含線性環 糊精之聚合物、貳（2-胺基乙基）-1,3-丙烷二胺（AEPD)、及 沁,：^,沁,^[3-(3’-?£05_胺基丙烷）-貳（2-胺基乙基）-1，3-丙 烷二-三氟乙酸銨（AEPD-PEG)。 另一較佳具體實施例中，用來形成微粒狀複合物之聚 合物為含環糊精之聚合物，更佳為如後述之實質線性環糊 精聚合物。聚合物亦可為聚伸乙基亞胺（PEI)或具有旁出環 糊精之聚合物。線性環糊精共聚物為含有環糊精部分作為 其聚合物主鏈整合一體之一部分之聚合物。帶有旁出環糊 精部分非構成聚合物主鏈一部分反而係附接於聚合物主鏈 之聚合物也可用於本發明組成物。線性含環糊精聚合物可 為含有至少一個環糊精部分作為聚合物主鏈之一部分之線 性聚合物。含環糊精聚合物較佳為水溶性。更佳線性含環 糊精聚合物為線性環糊精·共聚物或線性氧化環糊精共聚物 (各自容後詳述）。聚合物内部之環糊精基對聚合物提供主 官能基，讓其形成包涵複體。可形成包涵複體之實質線性 聚合物進一步含有或可進一步改性而含有一個額外官能基 (例如魏基）。 線性含環糊精聚合物 可用於形成微粒狀複合物之線性環糊精共聚物含有 15 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（l2 ) 雙官能基結合於線性共聚物主鏈的經取代或未經取代環糊 精部分，其經由環糊精之至少一個葡萄糖°比喃糖環之編號 2、3或6位置而結合至線性環糊精共聚物之聯結環糊精之二 價部分。如WO 00/01734討論，此種線性環糊精共聚物具 有式la、lb重複單位（如下示）或其組合。線性環糊精共聚 物、其製備及性質也述於Gonzalez, H., Hwang, S.及Davis, Μ. (1999年）輸送巨分子治療劑之新穎聚合物類別，生物軛 合物化學，10’ 1068-1074以及Hwang, S., Bellocq, Ν及Davis, Μ. (2001年）。含召-環糊精聚合物結構對基因輸送的影響， 生物軛合物化學，12(2)，280-290，二者以引用方式併入 此處。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
式la及lb中，C為經取代或未經取代環糊精單體，Α為 結合換言之共價鍵結至環糊精C之共聚單體。環糊精單體C 前驅物與共聚單體A前驅物聚合結果導致獲得線性環糊精 16 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 五、發明説明（η ) 共聚物於單線性環糊精共聚物内部，環糊精單體c可 相同或相異，同理，共聚單體A可相同或相異。 環糊精單體前驅物可為業界已知之任-種環糊精或 其衍生物。如前述，環糊精定義為環狀多醣，最常見含有6 至8個以〇:-(1，4)鍵聯的天然D(+)-葡萄糖吡喃糖單位。較 佳’環糊精單體前驅物為具有6、7及8個葡萄糖單位之環糊 精，亦即分別為α _環糊精、$ _環糊精及^ _環糊精。環糊 精衍生物可為業界已知之任—種經取代之環糊精，此處取 代基不會干擾與共聚單體Α前驅物之共聚合（容後詳述）。環 糊精衍生物可為中性、陽離子性或陰離子性。適當取代基 例如包括但非限於羥烷基如羥丙基、羥乙基；醚基如二羥 丙基醚、甲基·羥乙基醚、乙基_羥乙基醚以及乙基-羥丙基 謎；烧基如甲基；酿類如葡萄糖基及麥芽糖基；酸基如缓 I、亞磷酸、亞膦酸、膦酸、磷酸、硫代膦酸及磺酸；咪 唑基；硫酸根；及經保護之巯基。 環糊精單體前驅物可進一步經化學改性（例如鹵化、胺 化）可輔助或影響環糊精單體前驅物與共聚合單體A前驅 物之共聚合，容後詳述。.環糊精單體前驅物之化學改性允 許於各個環糊精部分聚合至少兩個位置，亦即形成雙官能 環糊精部分。各個葡萄糖吡喃糖環C1-C6位置之編號圖如 張W適用中國國家標準（咖）从規格（21〇χ297公楚）
1321054 A7 B7 五、發明説明（i4) X囂6· 7·或8 較佳具體實施例中，於環糊精部分之C2、C3及C6位置 之任二位置包括其組合發生聚合反應。例如一種環糊精單 體前驅物可於兩個C6位置聚合，另一種環糊精單體前驅物 可於環糊精部分之C2及C6位置聚合。使用/5 -環糊精為 例，各個葡萄糖吡喃糖環於環糊精之相對位置之標示圖如 下： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
二葡萄糖0比喃糖環 /5 -¾糊精 線性環糊精共聚物之較佳具體實施例中，環糊精單體 C具如下通式（II): 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（is
式（II)中，η及m表示整數，其連同另二葡萄糖。比喘糠 環’定義於環糊精單體之葡萄糖吼味糖單位總數。式⑼ 表示環糊精單體，其可於環糊精單位的兩個C6位置聚合。 式（II)環糊精單體例如包括但非限於6a，6b_二 精(η 一吩W二去氧·α_環糊精(n=1，m^6；^ 二去氧-1環糊精㈣，m=2)，6'6b·二去氧1 ·環糊精 (n=0，m=5) ’ 6'6C-二去氧環糊精（㈣，m=4)，6Α，6〇_ 二去氧-冷-環糊精（n=2，m=3)，6A _丄严 A c ) 6，6 -去氣-r-環糊精 (n=0’ m=6)’ 6 ,6 -二去氧 _T_環糊精（㈣，m=5)， 二去氧-r -環糊精（η=2 ’ m=4)，以及 6Α 6Ε _ 4· ’ ，去氧環糊 精（η=3，m=3)。 線性環糊精共聚物之另一較佳呈舻杳 手乂1主/、體貫施例中可含右 或 環 一個葡萄糖環開環環糊精單體(：單位，此 ’ 爽衣糊精之— 多個葡萄糖〇比喃糖環已經被開環，同時 A待環糊精 糖 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，1Τ_ 糸。如下通式（III)說明’於C2、C3位置帶有 男開％之葡葙 吡喃糖環開環環糊精。 词 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） 19 1321054 五、發明説明（l6
式（III)中p係於5_7改變。式⑽）中環糊精單體之至少 -個D⑴-葡萄糖㈣糖單位進行開環，俾允許於環糊精單 位之〇位置聚合。式（ΠΙ)環糊精單體例如2A，3A-二胺 基_2八，3八_二去氧·環糊精以及2A，3A-二醛_2A，3A-二去氧 ^環糊精市面上可得自麻省’威斯波洛，卡㈣Carbomer) a司式（111)%糊精單體例如包括但非限於2A，3A_二去氧 -2A，3A-二氫-α-環糊精，2a，3a_二去氧_2a，3A-二氫_万_環糊 精，2A，3A-二去氧·2α，3α_二氣个環糊精，分別俗稱2,3_二 去氧-α-環糊精，2,3-二去氧-点―環糊精，以及2 3二去氧_ 7 -環糊精。 共聚單體Α前驅物可為任一種直鏈或分支對稱或非對 稱化合物，其當與前述環糊精單體前驅物反應時，將二環 糊精單體鏈結在一起。較好，共聚單體八前驅物為含有至 少2個交聯基之化合物，經由交聯基反應如此達成環糊精單 體的鍵聯。可能的交聯基（其可相同或相異，可位於各個共 聚單體A前驅物之端末或内部）例如包括但非限於胺基酸 本紙張从適财國國家標準（CNS)
,可· (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 1321054 A7 B7 五、發明説明（Π ) 基、酯及咪唑基、及醯鹵基及其衍生物。較佳具體實施例 中，二交聯基可為相同且位於端末。當共聚單體A前驅物 與環糊精單體前驅物共聚合時，二環糊精單體可鍵聯在一 起，鍵聯方式係經由接合一個環糊精單體之一次羥基側與 另一環糊精單體之一次羥基側，經由接合一個環糊精單體 之二次羥基側與另一環糊精單體之二次羥基侧，或經由接 合一個環糊精單體之一次羥基側與另一環糊精單體之二次 經基侧達成。如此，此種鍵聯的組合可存在於最終共聚物。 共聚單體A前驅物以及最終共聚物之共聚單體A可為 中性、陽離子性（例如經由含有質子化基如第四銨基）或陰 離子性（例如經由含有去質子化基如硫酸、磷酸或羧酸陰離 子基）。帶電共聚單體A前驅物或共聚單體A之對偶離子可 為對偶陰離子或對偶陽離子（例如陽離子性共聚單體A前 驅物或共聚單體A之對偶陰離子可為i陰離子（例如氣陰 離子））。共聚單體A或共聚物之電荷可藉調整pH條件而調 整。 適當共聚單體A例如包括但非限於胱胺、1,6-二胺基己 烷、二咪唑、二硫咪唑、·精胺、二硫精胺、二組織胺、二 硫組織胺、丁二醯亞胺[例如二硫貳（丁二醯亞胺基丙酸 酯）(DSP)及二丁二醯亞胺基癸二酸酯（DSS)]及醯亞胺酸酯 (如二曱基3,3’-二硫二丙醯亞胺酸酯（DTBP))。共聚單體A 前驅物與環糊精單體前驅物共聚合，結果導致含如下通式 之共聚單體A鍵聯之線性環糊精共聚物： 21 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（is ) -HNC(0)(CH2)xC(0)NH- > -HNC(0)(CH2)xSS(CH2)xC(〇)NH- > -+H2N(CH2)XSS(CH2)XNH2+，-hnc(o)(ch2ch2o)xch2ch2c(o)nh-， =NNHC(0)(CH2CH20)xCH2CH2C(0)NHN= > -+H2NCH2(CH2CH20)xCH2CH2CH2NH2 -hnc(o)(ch2ch2o)xch2ch2ss(ch2ch2o)xch2ch2c(o)nh-， -HNC(NH2+)(CH2CH20)xCH2CH2C(NH2+)NH- > -SCH2CH2NHC(NH2+)(CH2)XC(NH2+)NHCH2CH2S-， -SCH2CH2NHC(NH2+)(CH2)XSS(CH2)XNHCH2CH2S-， -SCH2CH2NHCCNH2+)CH2CH2(OCH2CH2)xC(NH2+)NHCH2CH2S-， •HNC(0)(CH2CH20)y(CHCH20)zCH2CH2C(0)NH- o h2n -NHC(0)(CH2CH20)y(CHCH20)zCH2CH2C(0)NH-
COOH 22 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（l9 )
-NHC(0)(CH2CH20)y(CHCH20)zCH2CH2C(0)NH- [ sso3H -NHC(0)(CH2CH20)y?ICH20)zCH2CH2C(0)NH· Ο N-
NH
一N •N H+
(ch2),
N， H+
一 N
(CH2)xSS(CH2)r 'N H+ N， H+ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 23 1321054 A7 B7 五、發明説明（2〇 N、 ^—(CHzCHjO^C^CHr H+ H+ - K N: -(ch2ch2o)xch2ch2ss(ch2ch2o)xch2ch2 y -N H+
N〆 H+ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •+H2N(CH2)x
N一(CH2)x-N·
-(CH2)xNH2+" .訂· -+h2n(ch2)x-
-(CH2)xSS(CH2)x- XI.
-(CH2)xNH2+- 争 及 -SCH,CH,
-N- +HN
-(CH2CH20)xCH2CH2-
NH+ -ch2ch2s- 上式中，x=l-50，及 y+z=x。較好x=l-30。更好 x=l-20。 較佳具體實施例中，共聚單體A含有可生物分解鍵聯例如 雙硫鍵。共聚單體A也包括含有酸不穩官能基如酯類、以 及其它熟諸技藝人士已知之此等酸不穩基。 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（2i ) 另一較佳具體實施例中，共聚單體A前驅物以及因而 共聚單體A可經選擇性擇定並達成預定用途。例如為了輸 送小分子治療劑，無需帶電聚合物，共聚單體A可為或含 有親水基如聚乙二醇基及進一步提高水中溶解度。用於多 治療劑例如DNA或蛋白質，共聚單體A較佳帶有一個陽 離子性電荷其可提高線性環糊精共聚單體與多肽治療劑形 成微粒狀複合物的能力。也需了解線性環糊精共聚物含有 多組共聚單體A混合物。 線性環糊精共聚物可經由共聚合以適當離去基二取 代之環糊精單體前驅物與可置換該離去基之共聚單體A前 驅物製備。離去基可相同或相異，可為任一種業界已知之 當與共聚單體A前驅物共聚合時可被置換之離去基。 線性環糊精共聚物之製備可經由碘化環糊精單體前 驅物而形成二碘化環糊精單體前驅物，以及共聚合二碘化 單體前驅物與共聚單體A前驅物形成一種線性環糊精共聚 物其具有式la、lb或其組合之重複單位（各自皆如前述）。 另一種製備線性環糊精之方法，係碘化如前述環糊精 單體前驅物而形成式IVa、IVb、IVc之二碘化環糊精單體前 驅物或其混合物： 25 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（22) (IVa) (IVb) (IVc) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 二碘化環糊精可利用業界已知之任一種手段製備（例 如參考Tabushi等人，美國化學會期刊106，5267-5270 (1984) ; Tabushi 等人，美國化學會期刊 106，4580-4584 (1984)。例如/5 -環糊精可與聯苯-4,4’-二磺醯氯於無水吡啶 存在下反應而形成以聯苯-4,4’-二磺醯氣為端基之0 -環糊 精，然後其可與碘化鉀反應而製造二碘-/5 -環糊精。環糊 精單體前驅物僅於二位置碘化。經由共聚合二碘化環糊精 單體前驅物與共聚單體A·前驅物（如前述），可製備具有式 la、lb重複單位或其組合（亦如前述）之線性環糊精聚合物。 若屬適宜，碘或碘基可以其它已知離去基替代。 碘基或其它適當離去基可以允許與前述共聚單體A前 驅物反應之基團置換。舉例言之，式IVa、IVb、IVc或其混 合物之二碘化環糊精單體前驅物可經胺化而形成式Va、 Vb、Vc或其混合物之二胺化環糊精單體前驅物： 26 本紙張尺度適用_國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（23 ) h2n nh2
H2N NH2 5 \r~~1 (Va) \ / (Vb) nh2
H2N (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1m 二胺化環糊精單體前驅物可藉業界已知之任一種手 段製備（例如參考Tabushi等人，四面體函件18 : 1527-1530 (1977) ; Mungall等人，有機化學期刊 1659-1662 (1975))。 舉例言之，二碘-/?-環糊精可與疊氮化鈉反應然後還原形 成二胺基-/3 -環糊精。環糊精單體前驅物僅於二位置胺 化。然後二胺化環糊精單體前驅物與前述共聚單體A前驅 物共聚合，而製造具有式la、lb或其組合之重複單位之線 性環糊精共聚物（亦如前述）。但二胺化環糊精單體前驅物 之胺基官能基無需直接附接於環糊精部分。另外，胺基官 能基可經由使用含胺基部分如_SCH2CH2NH2置換環糊精單 體前驅物之碘或其它適當離去基，形成式Vd、Ve、Vf'Vg、 Vh及Vi或其混合物之二胺化環糊精單體前驅物： 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（24 ) NH, (Vd)
(Ve)
(Vf) (Vg) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
HN nh2
H2N (Vh) HN (Vi)
H2N 線性環糊精共聚物也可經由還原線性經氧化的環糊 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 丄上 υ:>4 Α7
1321054 A7 _____B7 五、發明説明（26 )
(Via) A---
(Vlb) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -、可· 式Via及VIb中，C為經取代或未經取代之氧化環糊精 單體，以及A為結合換言之共價鍵結至氡化環糊精匚之丘聚 單體。又於式▽。及乂化，二次羥基氧化，結果導致環糊精 部分之開環，以及醛基之形成。 •9k! 線性氧化環糊精共聚單體如前文討論可經由氧化線 性環糊精共聚物製備。線性環糊精共聚物之氧化可藉業界 已知之氧化技術達成（Hi.samatsu等人，澱粉44 : 188]91 (1992年))。較佳使用氧化劑例如過碘酸鈉。熟諳技藝人士 須了解於標準氧化條件下，氧化程度可改變或因共聚物而 異。如此於一具體實施例中，線性氧化共聚物含有-個氧 化環掏精單體。另一具體實施例中，共聚物之實質全部至 全部環糊精單體皆可經氧化。 另—種製備線性氧化環糊精之方法涉及如前述氧化 ▲崎適用 -- -30 - 1321054 A7 _ B7_五、發明説明（27 ) 二碘化或二胺化環糊精單體前驅物，俾形成經氧化之二碘 化或二胺化環糊精單體前驅物，以及氧化二碘化或二胺化 環糊精單體前驅物與共聚單體A前驅物共聚合。較佳具體 實施例中，式Vila、Vllb、Vile或其混合物之氧化二碘化 環糊精單體前驅物： I-/ / (VHb)
I I
I I (Vila) Ο Ο I (vnc) 氧化環糊精單體可經由氧化前述式IVa、IVb、IVc之二 碘化糊精單體前驅物或其混合物製備。另一具體實施例 中，式Villa、Vlllb、VIIIc之氧化二胺化環糊精單體前驅 物或其混合物：
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 31 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1321054 A7 B7 五、發明説明（28 Ο Ο (Villa)
(VlUb)
(vmc) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 可經由胺化前述式Vila ' Vllb、Vile之氧化二碘化環 糊精單體前驅物或其混合物製備。 又另一具體實施例中，式IXa、IXb、IXc、IXd、IXe、 IX f之氧化二胺化環糊精單體前驅物或其混合物 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（29 )
h2n nh2 5
<> II II nh2
h2n (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ·#_ .,?τ— t- 可經使用含胺基部分_sch2ch2nh2置換以碘或其它適 當離去基二取代之氧化環糊精單體前驅物之碘或其它適當 離去基製備。 另外，前述氧化二碘化二羧酸、或二胺化環糊精單體 前驅物可經由氧化環糊精單體前驅物形成氧化環糊精單體 前驅物，以及然後二碘化及/或二胺化前述氧化環糊精單體 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 五、發明説明（3〇 ) 而製備。二胺化氧化環糊精單體之胺基可呈經保護形成以 防止非期望的副反應。如前文討論，環糊精部分可以碘基 以外的離去基以及其它含胺基之官能基改性。然後氧化二 碘化或二胺化環糊精單體前驅物可與共聚單體八前驅物共 聚合而形成線性氧化環糊精共聚物。 線性環糊精共聚物或線性氧化環糊精共聚物係以至 少一個共聚單體A前驅物或共聚單體A前驅物水解產物為 端基。由於環糊精共聚物與至少一個共聚單體八前驅物為 端基的結果，每個線性環糊精共聚物或每個線性氧化環糊 精共聚物存在有前述自由態衍生基。例如衍生基可為酸 基’或衍生基可被水解成為酸基。根據本發明，衍生基可 進一步視需要接受化學改性俾增進環糊精共聚物之性質， 例如膠體安定性以及轉移感染效率等性質。舉例言之，衍 生基可經由與PEG反應改性而形成以pEG為端基之環糊精 共聚物以提升膠體安定性；或衍生基使用組織胺或咪唑乙 酸改性而形成以咪峻基為端基之環糊精共聚物俾提升分子 内（例如内囊胞釋放）及轉移感染效率。參考第29及3〇圖。 經由改性衍生基可對環糊精共聚物進行額外化學。例 如改性衍生基可用以經由鍵聯線性環糊精共聚物或線性氧 化環糊精共聚物至相同或相異環糊精共聚物'或鍵聯至非 環糊精共聚物而延長聚合物鏈。欲加成的聚合物可為相同 或相異線性環糊精共聚物或線性氧化環糊精共聚物其也 可以共聚單體Α前驅物為端基俾進一步改性。 另外，至少兩種前述相同或相異含有端末衍生基或端 本紙張以適财_家標準⑽）A4規格⑵狀撕公楚） 五、發明説明（3l ) 末改性衍生基的線性環糊精共聚物或線性氧化環糊精丘聚 物可透過官能或改性衍生基反應及鍵聯。較好，當官能或 改性衍生基反應時，形成雙硫鍵之可分解部分。例如以半 肤胺酸改性端末衍生基，可用來製造具有自由疏基之線性 環糊精共聚物或線絲化馳精絲物。與亦含游離魏美 之相同或相異環糊精共聚物反應，將形成㈣共聚物間的 雙硫鍵。官能錢性衍生基可經選擇俾提供具有不同分解 速率（例如透過酶分解）的鍵聯；以及若有所需提供治療劑 之定時釋放系統。如此處所述，所得聚合物可經交聯。如 此處所述，治療射於聚合物交聯前錢添加。配體也可 經由改性衍生基結合至環糊精共㈣1如線性環糊精共 聚物或線性氧化環糊精絲物可謂接於環糊精共聚物之 配體改性。配體可經由環糊精單體C或共聚單體續接於環 糊精”聚物。#父好’配體係附接於環糊精共聚物之環糊精 部分。參考W〇_h734,以引財式併入此處。 分支含環糊精聚合物 具有主及/或賓官能基微粒狀複合物聚合物實質上也 可為分支聚合物’例如分支聚伸乙基亞胺(PEI)或分支含環 糊精聚合物，較好為分支含環糊精聚合物。分支含環糊精 =物可為任—種水溶性分支聚合物含有至少-個環糊精 部分，該環糊精部分可為聚合物主鏈的—部分及/或由聚^ 物主鍵旁出。分支含環糊精聚合物為分支環糊精共聚物或 分支氧化_精共聚物。分支環糊精共聚物或分支氧化環 糊精共聚物分別為前述線性環糊精共聚物或線性氧化環糊
本紙張尺度適用中關家標準（CNs)順格（2脈撕公爱) 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（32) 精共聚物，而由其中分支附屬鏈。分支附屬鏈可為飽和或 未飽和線性或分支烴鏈。分支附屬鏈可進一步可含有多種 衍生基或取代基如羥基、胺基、酸基、酯基、醯胺基、酮 基、曱醯基及硝基。分支附屬鏈也含有環糊精或其它主或 賓官能部分。分支附屬鏈也可以配體改性。此種配體改性 包括但非限於配體附.著於分支附屬鏈的環糊精部分。 較好，分支含環糊精聚合物為分支環糊精共聚物或分 支氧化環糊精共聚物而其分支附屬鏈含有一個環糊精部 分。若分支附屬鏈含有一個環糊精部分，則該環糊精部分 將有助於包涵複體的形成以及治療劑的包囊。較好，分支 附屬鏈之環糊精部分結合聚合物主鏈的環糊精部分而輔助 包涵複體的形成以及治療劑的包囊。分支含環糊精聚合物 可藉業界已知之任一種手段製備，包括但非限於使用環糊 精單體前驅物衍生（如取代）聚合物（如線性或分支PEI)。具 有旁出環糊精之聚合物例如述於Tojima等人，聚合物科學 期刊A部分：聚合物化學36，1965 (1998)，Crini等人，歐 洲聚合物】.33，1143，（1997)，\\^丨〇1^111116丨61'等人，巨分子 快訊17，731 (1996)，以及Bachmann等人，碳水化合物化 學期刊17，1359 (1998);各文獻以引用方式併入此處。 (Weickenmeier文章敘述環糊精支鏈聚酯、其合成以及金剛 烷衍生物的包含）。分支環糊精含聚合物可如前文討論交 聯。 本發明使用之聚（伸乙基亞胺）(PEI)具有重量平均分子 量約800至約800,000道耳吞，較好約2,000至100,000道耳 36 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（33 ) 吞，更好約2,000至25,000道耳吞。PEI可為線性或分支。 適當PEI化合物可由商業上之多種來源獲得，包括聚伸乙基 亞胺得自亞利希（Aldrich)化學公司，聚伸乙基亞胺得自聚 科學（Polysciences)以及玻利明（POLYMIN)聚（伸乙基亞胺) 以及路帕索（LUPASOL)聚（乙基亞胺）得自BASF公司。 其它賓-官能聚合物. 如前述，微粒狀複合物中之至少一種聚合物為可形成 包涵複體之聚合物。前文已經說明具有較佳環糊精主官能 基之聚合物及多種製法。任何具有主官基之聚合物包括線 性或分支皆可以相同方式用於本發明之實施。其它適合用 於聚合物之「主」例如包括但非限於卡維坦類、冠醚類、 克利普坦類、久久必塔類、卡利瑟林類、沙芙侖類等。此 等其它主聚合物可以前述含環糊精聚合物之相同方式製 備。感興趣的主分子可經由羥基等官能基衍生而附接離去 基例如碘化物、甲苯磺酸根等，且與適當共聚單體A反應， 置換離去基而形成主共聚物。另外，主分子可含有或經過 衍生而含有胺基或羧基等官能基，俾允許主分子與共聚單 體A進行縮合反應而形成主共聚物。然後主共聚物可製備 成具有主官能基混合物於聚合物主鏈，以及若共聚物為分 支則含有主官能基混合物於支鏈。 賓官能基聚合物 賓官能基聚合物可為任一種可與主官能基複合劑形 成包涵複體之聚合物。典型賓官能基係存在於支鏈或端 基。具有賓官能基非構成聚合物主鏈之一部分之聚合物例 37 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 五、發明説明（34 ) 如為具有旁出金剛烧基之聚合物。可攙混於聚合物之包涵 官能基例如包括業界已知之包涵官能基，例如但非限於金 剛烷、二金剛烷、萘及膽固醇。 B.治療劑 根據本發明，至少-種治療劑包囊於聚合物而形成前 述微粒狀複合物。「治療劑」—詞意圖涵蓋任何具有藥理或 治療用途的活性劑’如後文討論係用作為具有殺微生物用 途之活性化合物或活生劑。此等治療劑（或活性劑）之實例 。寸«如後。包囊疋義為治療劑結合（例如靜電交互作用、疏 尺父互作用真正包嚢）聚合物之任一種手段。結合程度可 藉業界已知技術決定，包括例如螢光研究、DNA移動性研 究' 光繞射、電子顯微術、且將依據治療劑決定。至於輸 送模式，例如含有由前述微粒狀複合物之多聚合物以及 DNA形成的多維聚合物網路之治療性組成物，可用來輔助 轉移感染，換言之，輔助DNA攝取入動物（如人類）細胞。 (B〇Ussif，〇.國家科學院議事錄，92 : 7279_73〇1 〇995); Zanta等人，生物扼合化學，8 : 839 844 (1997) ; G〇sse如 等人’「使用可逆交聯低分.子量聚伸乙基亞胺之有效基因轉 移」’俄亥俄州立大學，藥學院，公開於網路，修訂本2〇〇 i 年，7月5曰）。當治療劑為以核酸（例*DNA)為主的聚合物 時，形成複合物的治療劑可呈「複聚物」形式。複聚物為 核酸與陽離子性聚合物之複合物。參考Fe|gner等人，「合 成基因輸送系統命名」，人類基因治療學8，51丨_512 (1997)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21〇><297公釐） 五、發明説明（35 ) 任何治療劑之治療劑混合物可用於本發明組成物。形 成微粒狀複合物時，治療劑可保有或可未保有其生物或治 、陡*由療組成物釋放時，特別由微粒狀複合物之 聚合物釋放時，治療劑活性恢復。或於前驅藥之例，則治 療劑之活性潛力恢復。如此，微粒狀複合物可有利提供治 療劑防護效果，避免.例如因分解造成活性損失且提供較高 生物利用率。如此，本發明組成物可用於對治療劑或任何 ’线化α物提供安定性等別储存或溶液安定性。親脂治療 劑之包囊可提供較高（即使並非完全），親脂治療劑的溶解 度。治療劑於微粒狀複合物或治療性組成物形成前或後可 進一步使用配體改性。 治療劑可為任一種親脂或親水、合成或天然生物活性 療齊j包括業界已知治療劑。莫克索引，化學、藥物及 生物百科，第13版’ 2001年’莫克公司，紐澤西州，白宮 站。此種治療劑例如包括但非限於小分子藥物抗生素、 類固醇、聚核苷酸（例如基因體DNA、cDNA、mRNA、反 訊息寡核苷酸、病毒、以及嵌合體聚核苷酸）、質體、肽、 肽片段、小分子（例如道索汝必辛（dox〇rubicin))、螯合劑（例 如德弗洛沙明（deferoxamine)、德斯弗拉（desferal))、伸 乙基二胺四乙酸（EDTA))、天然製品（例如紫杉酚、親兩性 素）、以及其它生物活性巨分子例如蛋白質及酵素。也參考 美國專利6,048,736 ’其列舉用作為賓而與環糊精聚合物形 成包含化合物之活性劑（治療劑）。美國專利6,〇48,736之揭 示以引用方式併入此處。 1321054 A7 ______B7 五、發明說明（36) 2.複合舞丨 根據本發明，治療劑為一種具有主或賓官能基之化合 物，其可與微粒狀複合物中具有對應賓或主官能基之聚合 物形成包涵複體。如前述，賓複合劑可用來改性微粒狀複 合物帶有賓官能基之聚合物、或帶有主官能基之聚合物之 單體而形成包涵複體。又如前述，主複合劑經由作為聚合 物賓官能基的主，可與微粒狀複合物之至少一種聚合物形 成包涵複體。複合劑可帶有兩個或多個包涵官能基。例如 帶有一包涵官能基之複合劑可為賓、賓；主、主；戋主、 賓複合劑。複合劑也可具有多重主及/或賓官能基混合物。 複合劑也含有官能基，官能基對本發明組成物提供有利性 貝Β 基例如為配體、親水或疏水基、額外治療劑等。 複合劑也包含介於包涵賓或主與官能基間的間隔基。 較好，複合劑具有結合常數約> 1 〇，較好約 > 丨〇3，及更 好約>104。典型結合常數係於約1〇2_1〇6之範圍。適合用於 複合劑之包涵賓分子例如包括業界已知，例如但非限於金 剛烷、二金剛烷、萘、膽固醇及其衍生物。較好使用金剛 烷或二金剛烷^ Amiel等人，國際聚合物分析與特徵化期 刊，第1期，289-300 (1995) ; Amiel等人，包涵現象以及化 學之分子辨識期刊，25 : 61-67 (1996) ; Amiel等人，膠體 及界面科學進展，79，】〇5-122 (〗999);以及Sandier等人， Langmuir ’ 16，1634-1642 (2000)。 複合劑含有一官能基’該官能基對本發明組成物提供 效盈。官能基可單純為添加羥基，或胺官能基係引進官能 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼ *?τ_ 40 1321054 A7 ____B7_ 五、發明説明（37 ) 基之一種方式。較佳具體實施例中，複合劑可與微粒狀複 合物聚合物形成包涵複體，以及有助於細胞接觸分子内行 進、及/或細胞進入與釋放。可使用業界已知之任一種基 團。適當「官能」基例如包括但非限於配體、核侷限化信 號（參考Zanta等人，美國國家科學院議事錄，96，91-96頁 (1999年）、内囊胞釋放肽、内囊胞釋放聚合物、穿膜劑、 或其混合物。核侷限化信號（NLS)可為業界已知之任一種 核侷限化信號。内囊胞釋放肽或聚合物可為業界已知之任 一種内囊胞釋放肽或聚合物（例如HA-2及GALA)。參考「藉 帶負電的DNA、陽離子性微脂粒、以及轉移素或融合基因 肚_ (fusigenic peptides)三元複體輸送基因」，Simoes S， Slepushkin V，Gaspar R，de Lima MCP，Duzgunes N，基 因治療學5 : (7) 955-964 1998年7月。細胞膜穿膜劑（或細 胞膜穿透劑）例如為得自HIV-1之TAT蛋白。TAT蛋白為病毒 轉錄活化劑，其積極運送入細胞核内部。Torchilin, V.P.等 人，PNAS. 98，8786-8791，（2001)。
複合劑也可帶有聚酯官能基，其提高溶解度及/或提供 安定性，特別於生物條件·下的安定性。組成物之安定可使 用具有親水基或親脂基複合劑達成或提升。較佳類別親水 基為聚乙二醇（PEG)。較佳聚伸乙基乙二醇具有式 H0(CH2CH20)zH，此處 z為 2 至 300。PEG 600、PEG 3400 及PEG 5000為可用於本發明之聚乙二醇之代表例。通常複 合劑中，PEG分子量愈高，則組成物之安定性愈高。通常 以較高分子量PEG為佳。較佳複合劑為PEG化金剛烷或PEG 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） .41 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— t 丄321054 A7 B7 五、發明説明（38) 化二金剛烧。若干可用作為複合劑之金剛烧PEG分子結構 式顯示於第1圖。為了提高親脂性（疏水性），複合劑含有親 脂基團如長鏈烷基、脂肪酸等。親脂基之選擇依據預定親 月曰夏決疋。由本文討論可知’複合劑可以任一類型官能基 改性而將預定性質引進组成物。複合劑可使用標準有機技 術製備。採用不同複合劑混合物可達成預定組成物性質之 較大變化以及特異性。 間隔基可用來接合官能基至複合劑。間隔基可為業界 已知之任一種對賓複合劑或官能基性質不會造成不良影響 的間隔基。例如間隔基可為直接鍵聯，因此官能基係直接 鍵結至複合劑。另外’間隔基可為水溶性、於生理pH為高 度陰離子性、或於酸性條件下具有融合基因性的間隔基。 較佳，間隔基可提升複合劑與聚合物於包涵複體（例如陰離 子性間隔基含有麩胺酸殘基、叛酸基等）之結合親和力。間 隔基也含有可還原鍵聯（例如雙硫鍵），該可還原鍵聯的還 原將由複合劑釋放出官能基。適當間隔基例如包括但非限 於直接鍵聯、聚麩胺酸、GALA、及聚乙二醇（PEG)。 具有金剛烷賓官能基之較佳複合劑類別為下式化合 物： ΊΨ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -*17— Φ,
42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（39) 其中 J 為-NH-，-C(=0)NH-(CH2)d—NH-C(=0)-(CH2)d-， -(CH2)e-0-P(=0)(0-(CH2)e-Ad)0- > PEG I .〇
:人 肽·或多版殘基，或 -NH-(C=0)-CH(R1)-NH-(C=0)-CH(R2)-NH-; Ad為金剛烷； R1為-(CH2)a-C02H，其酯或其鹽；或-(CH2)a-CONH2 ; PEG 為-0(CH2CH20)z-，此處 z為 2 至 300 ; L 為 Η ， -NH2 ， -NH-(C-0)-(CH2)e-(C=0)-CH2 ， -S(=0)2-HC=CH2或碳水化合物殘基； a為0或1 ; b為0或1 ; d為0至6 ; e為1至6 ; y為0或1 ;以及 X為0或1。 經由使用官能基複合劑，本發明治療性組成物可經改 性或官能化俾輔助細胞接觸及/或細胞進入。為了達成多重 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 43 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\|5· 1321054 A7 _B7___ 五、發明説明（40 ) 功能及/或效果，組成物可使用具有不同官能基之複合劑形 成兩型或多型包涵複體。如前述，配體可用以改性微粒狀 複合物之聚合物或複合劑。如此，根據本發明，本發明組 成物透過包涵複體’可含有多於一個配體，如此帶有多於 一個細胞鎖定目標及/或輸送位置。具有多重配體或其它官 能化複合劑之微粒狀複合物，可經由添加帶有穩定或溶解 官能基之複合劑如PEG化複合劑而予穩定化。 由於聚合物可與不同官能化複合劑混合物形成多種 包涵複體，故本發明之治療性組成物含有例如多種治療 劑、不同配體及/或多種安定聚合物。若複合劑使用治療劑 或前驅物官能化，則形成多重包涵複體將允許使用相同治 療性組成物輸送多種治療劑。若存在有配體，則治療劑之 全體組合（或雞尾酒）可被導引至特定細胞類型、疾病、或 其它治療用途。 g月&化食複合劑可藉業界已知之任一種手段製備β參 考Amiel等人，國際聚合物分析與特徵化期刊，第（期， 289-300 (1995) ; Amiel等人，包涵現象以及化學之分子辨 識期刊，25:6卜67 (1996);8_^等人，！^—此，16, 1634-1642 (2000)。 3-本發明組成物之劁借 本發明亦係關於一種製備組成物之方法。該方法組合 治療劑、具有主或賓官能基之聚合物、及複合劑而形成治 療性組成物。複合劑用作為賓或主，與聚合物形成包涵複 體。另-具體實施例中，聚合物及複合劑首先組合而形成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公登） \.....訂................ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 44 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（41 ) 微粒狀複合物。然後微粒狀複合物組合複合劑而形成治療 性組成物之微粒狀複合物。組成物也可首先混合聚合物與 複合劑，以及然後組合該混合物與治療劑而形成複合物， 如此形成本發明組成物。 A.聚合物-治療劑微粒狀複合物之形成 治療劑與聚合物之微粒狀複合物可藉業界已知之任 一種適當手段製備。例如微粒狀複合物可經由單純接觸、 混合或分散治療劑與聚合物形成。例如聚合物及治療劑可 混合於溶劑，於該溶劑，聚合物及治療劑二者皆為可溶、 其中聚合物為可溶但治療劑為分散性、或一種溶劑其分散 聚合物及治療劑但可溶微粒狀複合物。用於醫藥用途，溶 劑可為任一種生理可接受性水溶液。微粒狀複合物可經由 聚合物與治療劑組合、聚合物自行組合、或化學手段形成。 於形成微粒狀複合物前，微粒狀複合物聚合物通常並未存 在為實質結合結構如聚合物凝膠。但作為微粒狀複合物一 部分之聚合物，依據聚合物及治療劑性質而定，可形成實 質結合結構如凝膠。微粒狀複合物也有一種製法係於治療 劑存在下聚合單體（可相同或相異）而形成線性或分支聚合 物。微粒狀複合物也有一種製法，係經由於治療劑存在下 聚合單體（可相同或相異）而形成線性或分支聚合物，此處 治療劑係作為聚合樣板。Trubetskoy等人，核酸研究，26 卷，18期，4178-4185頁（1998年）。 聚合物及治療劑用量可為任一種允許微粒狀複合物 組裝的數量。典型聚合物之用量超過治療劑。當用來形成 45 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（42 ) 聚合物的聚合物帶有一個陽離子性或陰離子性電荷，例如 帶有陽離子性共聚單體A、或帶有聚伸烷基亞胺如PEI，當 治療劑帶有電荷如陰離子性聚核酸時，聚合物對治療劑之 比，可表示為電荷比。電荷比為聚合物電荷對治療劑對電荷 之比。如實例所示，陽離子性環糊精聚合物及陰離子性 DNA之微粒狀複合物典型係以5+/-電荷比調配，換言之，5 個得自環糊精聚合物之陽離子電荷對一個DNA陰離子電 荷。電荷比可為任何允許微粒狀複合物形成的比例，也可 超過所需最小電荷比。若聚合物及/或治療劑未帶電，則如 業界已知，聚合物對治療劑數量或比可以重量、莫耳數或 濃度表示。 根據本發明，微粒狀複合物之聚合物也可於足夠形成 包含治療劑及多維聚合物網路之微粒狀複合物條件下處 理。此種多維聚合物網路係述於WO 00/33885，以引用方 式併入此處。如WO 00/33885所述，於足夠形成多維聚合 物網路條件下，處理微粒狀複合物之聚合物可使用任一種 適當反應條件達成，包括添加額外作用劑或反應物其可促 成微粒狀複合物之聚合物與治療劑的結合。聚合物可透過 聚合物間共價鍵、非共價鍵（如離子鍵）、或非共價交互作 用（例如凡得瓦爾交互作用）。透過聚合物的聚合物内共價 鍵結、非共價鍵結或非共價交互作用的結合也可進行。由 於結合結果，微粒狀複合物之聚合物交互作用而形成多維 聚合物網路。 本發明之一具體實施例中，為了形成包含治療劑及多 46 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（43) 維聚合物網路之微粒狀複合物涉及交聯反應。舉例言之， 若微粒狀複合物之聚合物為單一聚合物分子，則該聚合物 可與促成交聯或形成交聯之分子、寡聚物、或不同聚合物 反應，結果導致微粒狀複合物之聚合物内交聯、或與微粒 狀複合物之單一聚合物分子的真正交聯。同理，若微粒狀 複合物之聚合物為兩種或多種聚合物之混合物，則該聚合 物與促成交聯或形成交聯之分子、寡聚物、或不同聚合物 反應。結果所得交聯可為微粒狀複合物之聚合物之聚合物 内及/或聚合物間較佳為聚合物間交聯。 交聯劑可為業界已知之任一種交聯劑。交聯劑可為可 促成微粒狀複合物内部交聯或可真正與微粒狀複合物之聚 合物交聯之任一種寡聚物或聚合物[例如聚乙二醇（PEG)聚 合物、聚乙烯聚合物]。交聯寡聚物或聚合物可與微粒狀複 合物之聚合物相同或相異。同理，交聯劑可為任一種可與 微粒狀複合物之聚合物交聯之適當分子。交聯劑本身也含 有配體。 如WO 00/33885所述，形成多維聚合物網路之微粒狀 複合物之聚合物之結合程度可由部分結合變化至完全結 合。經由變更聚合物結合程度，短鏈聚合物可具有長鏈聚 合物特徵，同時保有解離時的短鏈聚合物特徵。舉例言之， 長鏈聚合物特性促成整體安定性，亦即分解抗性，直到到 達目標細胞；而短鏈聚合物特性促成於目標細胞内部的 DNA釋放。此種雙重特性提供一種含治療劑及多維聚合物 網路之治療性組成物，其於非生理及生理條件下具有改良 47 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1321054 A7 ------B7___ 五、發明説明（44 ) 安定性及較高儲存安定性。變更治療性組成物之聚合物的 結合程度，也允許以控制方式釋放治療劑。 微粒狀複合物之粒徑係依據用來形成本發明組成物 之聚合物及治療劑決定。如後述實例所示，粒徑為5〇1〇〇〇 耄微米，且較佳50 — 500毫微米。形成包涵複體典型並未顯 著加大粒仅。組成物維持為離散粒子。容後詳述，含peg 化複合劑之組成物於鹽溶液具有絕佳安定性。較好，組成 物於生理條件下安定，讓其可用作為治療劑之輸送媒介， 以及用於治療多種疾病及病症。 Β·息複體之彬忐 包涵複體可藉業界已知之任一種適當手段製備。例如 包涵複體可，經由單純接m '或分散微粒狀複合物及 複合劑形成。例如微粒狀複合物及複合劑可混合於其中二 者白ΊΓ /谷的/谷劑、混合於微粒狀複合物或複合劑之一者可 /合仁另者為分散性之溶劑、或混合於可分散微粒狀複合 物及複合劑但可溶解包涵複體之溶劑。較好，包涵複體係 經由將複合劑添加至微粒狀複合物形&，使用容器為用來 扣σ聚0物及治療劑而形.成包涵複體的相同容器。供醫藥 應用，溶劑可為任一種生理可接受性水溶液。 複合劑可以任一種莫耳比添加至複合物粒子，該莫耳 比係私複α劑莫耳數對存在於形成包涵複體的複合物聚合 物之主及/或賓官能基之莫耳數之比。通常，複合劑係以對 主及/或賓宫能基莫耳數為1:1莫耳比添加。只要組成物含 有至少一種複合劑以及至少一個主及/或賓官能基於聚合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（21〇x297公楚） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ_ .0, 48 A7
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐) 49 1321054 A7 -------B7___ 五、發明説明（46 ) 溶劑。特別常用添加劑例如為碳醆鎂、二氧化鈦、乳糖、 甘露糖醇及其它糖類、滑石、乳白蛋白、明膠、激粉、纖 $素及其衍生物、動物油及植物油、聚乙二醇類及溶劑。 溶劑包括無菌水及一羥基或多羥基醇如甘油。 依據使用的治療劑類型決定，本發明之治療性組成物 可用於多種治療方法（例如DNA疫苗、抗生素、抗病毒劑） 用於治療先天性或後天性疾病囊性纖維硬變、古曲氏病 (Gaucher’s disease) '肌肉萎縮、愛滋病癌症（例如多發 性骨趙瘤、白血病、黑素瘤及#巢癌）、心血管病（如進行 T心臟衰竭、血管再度狹窄及血友病）、以及神經疾病（如 月包外傷）。根據本發明，治療方法係對經辨識為需要治療的 個人或哺乳動物投予治療有效量之本發明之治療性組成 物。如热諳技藝人士了解，治療有效量將依各病歷決定。 考慮因素包括但非限於欲治療的疾病以及患有該病症個體 的徤康特質。 6· AjSjJt. 本發明之包涵複體也可用於輸送農業用化學品。本發 明之另一具體實施例中，「治療劑」為具有微生物或農業用 途的生物活性化合物。生物活性化合物包括業界已知化合 勿例如適S辰業用生物活性化合物包括但非限於肥料、 殺真菌劑、殺草劑、殺蟲劑及殺粉霉劑。殺微生物劑也可 用於水處理，處理都市水源、工業水系統例如冷卻水、造 紙廠白水系統。對微生物攻擊或分解敏感的水系統也包括 皮革業'纺織業及塗裝或塗料業。殺微生物劑及其用途例 本紙張尺度適用中國國家標準（咖）A4規格（2wx297公楚） 50
美國專利5,693,631， 6,034,081 及 如個別及組合述於 6,060,466 ’以引用方式併入此處。含活性劑組成物如前文 討論組成物可以活性劑本身已知使用方式使用。值得注意 由；此種用途非藥理用途，故複合物之聚合物無需符 合醫藥用途要求的毒性標準。
7. tM 下列實例用於舉例說明本發明。但須了解，本發明非 僅限於此等實例所述特m或細節。 材料。召-環糊精（西瑞斯塔（Cerestar)美國公司，印地 安納州，哈夢）於使用前於真空（<〇·1毫托耳）於120t乾燥12 小時。聯苯·4,4，-二續醯氣（威斯康辛州，密瓦基，亞利希 化學公司）由氯仿/己烷類再結晶。碘化鉀使用研砵及研杵 磨粉，及於20〇t烘箱乾燥。由商店來源獲得的所有其它反 應d係以獲付的形式使用，未經進一步純化。聚合物試樣 於日立公司HPLC系、統分析，該系統配備有安史佩克 (Anspec) RI偵測器、精密偵測器DLS偵測器 '以及普羅吉 (Progel)_TSK G3GGGPWXL管柱，使用〇3觀化納或水作為 洗提劑，採用1.0毫升·分鐘-I流速。 貫例1 :聯笨_4,4’-二磺醯基_A，D_端基-冷_環糊精， UTabushi等人，美國化學會期刊 1〇6，5267 527〇(1984)) 5〇〇毫升圓底瓶配備有磁攪棒史藍克（Sch丨enk)配接器 以及隔膜，燒瓶内進給7.92克（6.98毫莫耳）無水環糊精 及250¾升無水吡啶（亞利希化學公司卜所得溶液於5〇。〇於 氣氣下授拌，同時以15分鐘間隔時間分成四等份加入2.204 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 五、發明説明（48 ) 克（6.28毫莫耳）聯笨_4,4，_二磺醯氯。又於5〇。(：攪拌3小時 後’真空去除溶劑及殘餘物使用〇_4〇%乙腈於水之梯度洗 提’接受反相管柱層析術。洗提分藉高效液相層析術（HPLC) 分析’合併適當洗提分。於旋轉蒸發器上去除大半乙腈後， 所得水性懸浮液經凍乾。如此獲得3 39克（38%)1呈無色固 體。 貫例2 : 6A，6D-二碘-6A，6D-二去氧_万_環糊精，2(Tabushi等 人’美國化學會期刊1〇6，4580-4584 (1984)) 40毫升離心瓶配備有磁攪棒、史藍克配接器及隔膜， 離心管内進給1.02克（7.2毫莫耳）1，3_54克（21_3毫莫耳） 水’蛾化鉀（亞利希公司）及15毫升無水N，N_二曱基曱醯胺 (DMF)(亞利希公司）。所得懸浮液於80。(：於氮下攪拌2小時 。冷卻至室溫後，固體藉過濾分離及收集上清液。固體沉 氣以第一份無水DMF洗蘇，上清液經組合及真空濃縮。然 後殘餘物溶解於14毫升水’及於以快速揽拌加入〇 7 5毫升 (7.5毫莫耳）四氣乙烯（亞利希公司）及於冰浴冷卻。沉澱產 物於玻璃料媒介過濾’以小份丙酮洗滌，隨後以五氧化二 硫真空脫水14小時。獲得0.90克（92%)2呈白色固體。 實例3 . 6，6D-二疊氮-6A，6D-二去氧-召-環糊精，3(Tabushi 等人，四面體函件18，1527-1530 (1977)) 100毫升圓底瓶配備有磁攪棒、史藍克配接器及隔 膜，圓底瓶内進給1.704克（1.25毫莫耳）点-環糊精二碘化 物’ 0.49克（7.53毫莫耳）疊氮化鈉（紐澤西州’吉伯鎮，EM 科學公司）及10毫升無水N，N-二曱基甲醯胺（DMF)。所得懸 1321054 五、發明説明（49 浮液於W：於氮下搜拌14小時。然後真空去除溶劑。結果 所得殘餘物溶解於足量水而調整〇2 M於鹽溶液，然後通過 11.3克拜爾拉（Biorad)AG501_X8(D)樹脂去除殘餘物。然後 洗提劑經珠乾，獲得^克⑻即，呈白色非晶形固體， 其未經進一步純化即繼續進行次一步驟。 貫例4 . 6，6 -一胺基_6A，6D·二去氧_点_環糊精，4(Mungall 等人，有機化學期刊1659-1662 (1975)) 250¾升圓底瓶配備有磁授棒及隔膜，瓶内進給us〗 克（1.04毫莫耳）冷-環糊精戴疊氮及毫升無水η比咬（亞利 希公司）。於此授拌懸浮液内加入克（3·42毫莫耳）三笨 基膦。結果所得懸浮液於周圍溫度攪拌丨小時，及加入1 〇 爱升濃水性氨。氨之添加伴隨氣體快速放出，以及溶液變 均質。14小時後，真空去除溶劑，殘餘物使用5〇毫升水濕 磨。固體經過濾出，濾液以丨〇%鹽水調整為酸性（ρΗ<4)， 隨後施用於含東洋珍珠SP_65〇M (νη4+形式）樹脂的離子交 換管柱。產物4使用〇_〇·5 μ碳酸氫銨梯度洗提。適當洗提 分經組合及凍乾獲得0.832克（71°/。)產物4呈貳（碳酸氫）鹽。 實例5 : 環糊精_DSP共.聚物，5 20毫升閃爍瓶内進給92 6毫克（7 65χ 1〇-5莫耳）4之貳 (碳酸氫）鹽於1毫升水溶液。溶液ρΗ以丨M氫氧化鈉調整為 10,隨後加入30.9毫克（7·65χ 1〇·5莫耳）二硫貳（丁二醯亞胺 基丙酸酯）(DSP ’皮爾斯（pjerce)化學公司，伊利諾州，洛 克福）於1毫升氯仿溶液。所得二相混合物使用弗特斯 (Vortex)混合機攪動〇·5小時。然後水層經傾析，及以3χ 1 53 (請先間讀背面之注意事項再填窝本頁) t 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公楚：） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（5〇 ) 毫升新鮮氯仿萃取。然後水性聚合物溶液於東洋珍珠HW-40F樹脂使用水作為洗提劑接受凝膠滲透層析術（GPC)。洗 提分藉GPC分析，適當洗提分經凍乾獲得85毫克（85%)呈無 色非晶形粉末。 實例6 :沒-環糊精-DSS共聚物，6 /5 -環糊精-DSS共聚物6係以類似DSP聚合物5之方式 合成，但以二丁二醯亞胺基癸二酸酯（DSS，伊利諾州，洛 克，皮爾斯化學公司）取代DSP反應劑。獲得化合物6，67% 產率。 實例7 :冷-環糊精-DTBP共聚物，7 20毫升閃爍瓶内進給91.2毫克（7.26x 10·5莫耳）貳（碳 酸氫）鹽4於1毫升水溶液。溶液pH以1 Μ氫氧化鈉調整至 10,然後加入22.4毫克（7.26χ 10·5莫耳）二曱基（3,3，-二硫貳 (丙醯亞胺酸酯）.2HC1 (DTBP，伊利諾州，洛克福，皮爾 斯化學公司）。所得均質溶液使用弗特斯混合機攪拌0.5小 時。然後水性聚合物溶液於東洋珍珠HW-40F樹脂接受凝膠 滲透層析術（GPC)。洗提分藉GPC分析，適當洗提分經凍乾 獲得67毫克（67%)無色非晶形粉末。 實例8 :聚乙二醇（PEG) 600二醯氣，8
1 Ϊ X X HCT^PEGeST^OH or 5 0毫升圓底瓶配備有磁攪棒及回流冷凝器，圓底瓶内 進給5.07克（約8.4毫莫耳）聚乙二醇600二酸（福路卡（Fluka) 54 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（5i ) 化學公司，威斯康辛州，密瓦基）及10毫升無水氯仿（亞利 希公司）。此攪拌溶液内加入3.9毫升（53.4毫莫耳）亞磺醯氯 (亞利希公司），所得溶液回流加熱1小時，期間氣體的逸出 顯著。讓所得溶液冷卻至室溫，隨後真空去除溶劑及過量 亞磺醯氣。所得油儲存於乾燥箱内可未經進一步純化即供 使用。 實例9 : /3 -環糊精-PEG 600共聚物，9
20毫升閃爍瓶内進給112.5毫克（8.95 X 10_5莫耳） 6A,6D-二胺基-6A,6D-二去氧-冷-環糊精之貳（碳酸氫）鹽 (4)，50微升（3.6x 10_4莫耳）三乙基胺（亞利希公司），及5毫 升無水Ν,Ν-二曱基乙醯胺(DMAc，亞利希公司）之溶液。隨 後所得懸浮液使用58毫克（9.1 X 1(Γ5莫耳）聚乙二醇600二 酸氯，8處理。所得溶液使用弗特斯混合機攪拌5分鐘，然 後讓其於25°C放置1小時，期間變均質。真空去除溶劑，殘 餘物使用水作為洗提劑，以東洋珍珠HW-40F樹脂接受凝膠 滲透層析術。洗提分藉GPC分析，適當洗提分經凍乾獲得 115毫克（75%)無色非晶形粉末。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 55 ............,ν …訂........ ,、_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 五、發明説明（52) 實例10 : 6A，6D-貳-(2-胺基乙基硫）·6α，6〇·二去氧·環糊 精 ’ 10(Tabushi，I: Shimokawa，K; Fugita，K.四面體函件 1997 ， 1527-1530)
配備有磁攪棒及隔膜之25毫升史藍克瓶内進給〇.91毫 升（7.37¾莫耳）0.81 Μ 2-胺基乙硫醇酸鈉於乙醇溶液 (Fieser，L.F. ’ Fieser，Μ.有機合成反應劑；威利公司，紐約， 1967年；第3期’ 265-266頁）。溶液經真空脫水，固體再度 溶解於5毫升無水DMF(亞利希公司）。加入6a，6d_二峨 -6A，6D-二去氧-万-環糊精⑺（100毫克，7 38χ ι〇-5莫耳）所得 懸浮液於60°C於氮下攪拌2小時。冷卻至室溫後，溶液經真 空濃縮，及殘餘物再度溶解於水。以〇丨N鹽酸酸化後，溶 液施用至東洋珍珠SP-650M離子交換管柱（Nh4+形式），產 物使用0至0.4 Μ碳酸氫銨梯度洗提。合併適當洗提分及凍 乾。如此獲得80毫克（79%) 1 〇呈白色粉末。 一 +脱胺/9 -CD 10之另一合成法 於4.69克（3.17毫莫耳）2於1〇〇毫升除氣水溶液内加入 0.489克（6·34毫莫耳）新鮮昇華半胱胺。溶液回流攪拌2小 時。冷卻至室溫及以1Ν鹽酸酸化後，溶液施用至東洋珍珠 SP-650M離子交換管柱（Νη/形式），產物使用〇至〇 2 Μ碳 B7 B7 五、 發明説明（53 ) 酸氫銨梯度洗提。適當洗提分經合併及凍乾。此種程序獲 得1.87克（39%產率）白色固體。固體藉TLC(矽膠，正丙醇-乙酸乙醋-水-敦水溶液5/3/3/1，藉尼海金（ninhydrinH貞測） 決定特徵，主要點係對應於10。母質輔助雷射解吸附/離子 化（MALDI)飛行時間（TOF)質譜記錄於2米ELITE儀器（普塞 普堤（PerSeptive)生物系統公司供應）"MALDI-TOF m/z 3 之計算值：1252,實測值：1253.5 [M+H]+，1275.5 [M+Na]+， 1291.4 [M+K]+。l3C NMR(布魯克（Bruker)500 MHz，D20) 5ppm : 32_1 (S-CH2)及 38.8(CH2-NH2)，32.9 (C6 毗鄰 S)， 60.2 (C6 毗鄰 OH)，70.8，71.4，72.5 (C2，C3, C5)，81.8 (C4)，101.7 (Cl)。 實例11 : /5-環糊精（胱胺）-DTBP共聚物，11
4毫升瓶内進給19.6毫克（1·42χ 10·5莫耳）10之貳（碳酸 氫）鹽於0.5毫升於0.1 Μ碳酸氫鈉溶液。溶液於冰浴冷卻’ 57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（54) 隨後加入4.4毫克（1·4χ 1〇·5莫耳）二甲基3 3，·二硫貳丙醯亞 胺酸酯· 2HC1 (DTBP，伊利諾州，洛克福，皮爾斯化學公 司）。然後所得溶液使用弗特斯混合機攪拌，及讓其於 放置1小時。反應使用.1 M Tris-HCl淬熄，隨後以〇. 1 Ν鹽酸 酸化至pH 4。聚合物水溶液於東洋珍珠hw-40F樹脂接受凝 膠滲透層析術。藉GPC分析洗提分，適當洗提分經凍乾。 如此獲得21.3毫克（100〇/〇)11呈白色粉末。 實例12 : /3-環糊精（脱胺）_DMS共聚物，12 (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) NH, DMS H:0
DMS<
-、tr· 配備有磁攪棒及隔膜之10毫升史藍克瓶内進給2〇〇毫 克（1.60X丨0.4莫耳）1()，44微升（32χ 1〇.4莫耳）三乙基胺（亞 利希公司，威斯康辛州，密瓦基），43 6毫克（1 6〇χ 1〇.4莫 耳）二曱基癸二醯亞胺酸醋.2HC1 (DMS，皮爾斯化學公 司，伊利祐州’洛克福）’及3毫升無水DMF(亞利希化學公 司。，威斯康辛州’密瓦基）。所得料漿於穩定氮流下加熱至 80 C歷18小時’期間大部分溶劑皆被蒸發去除。殘餘物再 度溶解於1G毫升水，所得溶独10%鹽酸酸化至PH 4。然 後溶液通過阿米空山奇空普拉斯（Amic〇n Centrica 本紙張W適用中_家標準（CNS) A4規格⑵〇χ297公幻 58 1321054 A7 B7 五、發明説明（55 )
Plus)-20 5,000 NMWL離心過濾器。以2x 10毫升水洗滌 後，聚合物溶液經凍乾獲得41.4毫克（18%)灰白色非晶形固 體。 另一種合成法：召-環糊精（胱胺）-DMS共聚物如前述 合成（Gonzales等人1999)。典型實驗中，25毫升瓶内進給二 半胱胺/5-CD之貳（碳酸氫鹽）10 (399.6毫克，0.269毫莫耳) 溶解於50微升0.5 Μ碳酸鈉溶液。加入二曱基癸二醯亞胺酸 酯2HC1 (DMS，皮爾斯化學公司，伊利諾州，洛克福，73.5 毫克，0.269毫莫耳），溶液經簡短離心去除各組成分。所 得混合物於25°C攪拌15小時。混合物以10毫升水稀釋，藉 加入1N鹽酸調整pH低於4。然後溶液對史佩查/波爾 (Spectra/Por) 7 MWCO 3500 透析膜史佩傳（Spectrum)公司 去離心水透析24小時。透析溶液經凍乾。13C NMR(布魯克 500 MHz，D20)5 ppm : 25.8, 26.0, 27.0, 28.7, 29.9, 32.2, 37.5, 38.1, 41.1，60.0, 71.6, 72.3, 72.6, 80.8, 101.4, 167.9。 實例13:固定永久帶電共聚物與質體複合 概略言之，等容積固定帶電CD-聚合物及DNA質體於 水溶液係以適當聚合物/質體電荷比混合。然後讓混合物平 衡，於室溫自行組裝。經由將小量混合物轉移至0.6%瓊脂 糖凝膠，且檢查DNA移動性而監視複合是否成功。自由 DNA於施加電壓下移動，複合DNA被延遲於孔。 1微克DNA於蒸餾水濃度0.1微克/微升混合10微升共 聚物11，聚合物胺：DNA磷酸鹽電荷比為2.4，6，12，24， 36，60及120。1微克/微升載荷緩衝液[40%蔗糖，0.25%溴 59 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（56 ) 紛藍，及200 mM Tris-乙酸鹽緩衝液含5 mM EDTA(Gar等 人，生物化學35 : 1027-1036 (1996))加入各溶液。各個DNA/ 聚合物樣本載荷至0.6%瓊脂糖電泳凝膠，凝膠含有6微克 乙基溴/100毫升於lx.TAE緩衝液（40 mM Tris-乙酸鹽/1 mM EDTA)，且施加40伏特至凝膠歷1小時。DNA/聚合物 複合程度係藉DNA延遲於凝膠遷移圖樣指示。共聚物（12) 以電荷比2或2以上延遲DNA，指示於此等條件下複合。 實例14 :使用編碼蟲螢光素酶報告子基因之質體之轉移感 染研究： BHK-21細胞於轉移感染前24小時以60,000細胞/孔之 細胞密度接種於24孔平板。編碼蟲螢光素酶基因的質體如 實例13混合CD-聚合物。含DNA/聚合物複體之培養基溶液 添加至培養後的細胞，於37°C培育24小時後以新鮮培養基 更換。細胞於轉移感染後48小時溶解。蟲螢光素酶光檢定 分析之適當酶基質添加至細胞分解產物。以產生的光單位 測量的蟲螢光素酶活性，藉亮度計定量。DNA/聚合物複體 以高於3之電荷比成功地轉移感染BHK-21細胞，最大轉移 感染為聚合物胺：DNA碟被鹽電荷比40。細胞溶解產物也 用於藉羅利（Lowry)蛋白質檢定分析測定細胞存活率（羅利 等人，生物化學期刊，193期，265-275 (1951))。至電荷比 40仍未觀察得毒性。 實例15 : /3-環糊精（胱胺）-DMA共聚物，13之合成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 60 ...........、可--------------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1321054 A7 B7 五、發明説明（57)
配備有磁攪棒之20毫升閃爍瓶進給180毫克（0.131毫 莫耳）10及32毫克己二醯亞胺酸二甲酯（DMA，皮爾斯化學 公司，伊利諾州，洛克福）。於其中加入500微升0.5M碳酸 鈉。結果所得溶液以箔覆蓋及攪拌隔夜。混合物以〇· 1 N鹽 酸酸化，及以史佩查波爾（8卩已(^&卩〇11)河\\/_(1!〇 3,5 00膜透析2 曰，凍乾獲得41毫克白色非晶形固體，Mw=6kDa，藉光散 射測定。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例16 : yS-環糊精（胱胺）-DMP共聚物，14之合成
配備有磁攪棒之20毫升閃爍瓶進給160毫克（0.116毫 莫耳）10及30.1毫克庚二醯亞胺酸二甲酯（DMP，皮爾斯化 學公司，伊利諾州，洛克福）。於其中加入500微升0.5M碳 酸鈉。結果所得溶液以箔覆蓋及攪拌隔夜。混合物以0.1 N 鹽酸酸化，及以史佩查波爾（8卩6(^3卩〇1*)1^1\\^0 3,500膜透 析2曰，凍乾獲得22毫克白色非晶形固體，Mw=6 kDa ’藉 光散射測定。 實例17 :召-環糊精（胱胺）-PEG 600共聚物，15 61 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（58 ) 丫
CI 0
H)N NH) Ο
kNH PC〇m ο \ 配備有磁攪棒、史藍克配接器及隔膜之100毫升圓底 瓶内進給1.564克（1.25毫莫耳）10及25毫升稀餾二曱基乙醯 胺（DMAc，亞利希公司）。料漿内加入0.7毫升（4當量）三乙 基胺及8(2.39克，3.75當量）於5毫升DMAc溶液。所得溶液 使用弗特斯混合機攪拌5分鐘，然後於25°C放置1小時，期 間變均質。真空去除溶劑，殘餘物於東洋珍珠HW-40F樹脂 使用水作為洗提劑接受凝膠滲透層析術。洗提分藉GPC分 析，適當洗提分經凍乾獲得無色非晶形粉末。 實例18 : /9 -環糊精-甲苯磺酸酯，.16之合成（Melton, L.D.， 及Slessor, Κ·Ν·，碳水化合物研究，18期，29頁（1971年）） OS〇2 配備有磁攪棒、真空配接器及隔膜之500毫升圓底瓶 内進給無水yS-環糊精（8.530克，7.51毫莫耳）及200毫升無 水吡啶溶液。溶液冷卻至0°C，然後加入1_29克（6_76毫莫耳) 曱苯磺醯氣。所得溶液溫熱至室溫隔夜。真空移除盡量多 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） 62 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ· 1321054 A7 B7 五、發明説明（59 ) 1 °比咬。所得殘餘物隨後由40毫升熱水再結晶兩次獲得 7.54克（88%)白色結晶固體。 實例19 : yS -環糊精_碘化物，η之合成
+ KI 〇S〇3 -ο- 配備有磁攪棒及史藍克配接器之圓底瓶内進給16，15 當量碘化及DMF。所得混合物於80°C加熱3小時，隨後讓 反應冷卻至至溫。混合物經過波去除沉殿，濾、液經蒸發至 乾及再度溶解於(Tc水。加入四氣乙烯，所得料漿於〇。〇激 烈攪拌20分鐘。於中等玻璃料上收集固體，使用丙酮濕磨 及儲存於五氧化二罐上。 實例20: /5-環糊精硫醇_peg附接聚合物，18之合成 步驟1 :環糊精-硫醇之合成（K· Fujita等人，生物有 機化學第11期，72頁（1982年）以及K. Fujita等人，生物有機 化學第11期，108頁（1982年）） 配備有磁攪棒及史藍克配接器之5〇毫升圓底瓶内進 給1.00克（0.776毫莫耳）16,0_59克（7.75毫莫耳）硫肽（亞利希 公司）及7_8毫升0.1N氫氧化納溶液。所得混合物於 氮下加熱6小時。其次，加入〇,62克（15.5毫莫耳）氫氧化鈉 反應混合物於80°C於氮下又加熱1小時。讓反應冷卻至 溫，隨後以10%鹽酸調整至pH 4_0。總溶液容積調整至2〇 毫升，然後於冰浴冷卻，接著加入0.8毫升四氯乙烯。反應 於 室 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210 X 297公釐） 63 1321054 A7 B7 五、發明説明（6〇 ) 混合物於0°C激烈攪拌0.5小時。接著於細小玻璃料上收集 沉澱固體。固體向下泵送隔夜獲得0.60克（67%)白色非晶形 固體。 步驟2 :配備有磁攪棒及回流冷凝器之100毫升圓底瓶 内進給2.433克（2.11毫莫耳）/3 -環糊精硫醇（步驟1製備）， 0.650克官能化PEG(帶有旁出烯烴之PEG，得自曰本東京 Otsuma女子大學，Yoshiyuki Koyama)及50毫升去離子水。 所得混合物回流加熱1 2小時，期間yS -環糊精硫醇溶解。讓 反應混合物冷卻至室溫，藉過濾去除沉澱固體。上清液於 史佩查波爾7 MWCO 1，000膜對水透析。溶液經凍乾獲得非 晶形白色固體。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁)
實例21 :分支PEI-環糊精聚合物，19之合成
配備有磁攪棒之20毫升之閃爍瓶進給分支PEI (25 kD 64 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（61 ) ，亞利希公司）之17。於其中加入除氣碳酸鈉緩衝液。所得 溶液於80°C攪拌4小時。混合物於0.1N鹽酸酸化，以及使用 史佩查波爾MWCO 3,500膜透析2曰及凍乾。 實例21B : PEI-環糊精交聯聚合物之合成 分支PEI(分子量1200，亞利希公司）及二官能化環糊精 單體2(1當量）於無水DMSO混合。混合物於80°C攪拌4日， 然後使用史佩查波爾MWCO 10,000膜透析2曰及凍乾。 實例 22 : Ad-PEG34〇〇-Ad之合成 240毫克1-胺基金剛烷（1.60毫莫耳，亞利希公司）及288 毫克 PEG3400(SPA)2(0.085 毫莫耳，西爾瓦特（Shearwater)聚 合物公司）加至配備有攪棒之玻璃瓶。於其中加入5毫升二 氯曱烷，溶液攪拌隔夜。次日過濾出溶液而去除N-羥丁二 醯亞胺副產物，真空去除二氯曱烷。殘餘物溶解於水，離 心去除過量1 -胺基金剛烷。然後上清液於皮爾斯公司玻片 -A-分析儀使用MWCO = 3 500透析隔夜。溶液經凍乾獲得248 毫克白色絮狀固體Ad-PEG3400-Ad。 實例 23 : Ad-PEG34〇crNH2之合成 347毫克FMCO- PEG3400-NH2(0.110毫莫耳，西爾瓦特 聚合物公司）及155毫克1-胺基金剛烷（1.0毫莫耳，亞利希公 司）加至配備有攪棒之玻璃瓶。於其中加入5毫升二氣曱 烷，所得溶液攪拌隔夜。次日，溶液經過濾去除N-羥丁二 醯亞胺副產物，真空去除二氣甲烷。殘餘物溶解於水，過 濾去除未反應1-胺基金剛烷。然後溶液經凍乾去除水。藉 溶解所得固體於20%哌啶於DMF歷20分鐘去除FMOC基。 65 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（62 ) 真空去除溶劑及殘餘物再度溶解於水。溶液經離心去除未 溶解的FMOC ’然後於皮爾斯公司玻片-A-分析儀，MWCO 3500透析隔夜。溶液經凍乾獲得219毫克白色絮狀固體 Ad-PEG3400-NH2。 實例24 :金剛烷-PEG3400-NH2(Ad-PEG34。。-NH2) 266毫克FMOC-PEG3400-NHS(78.2微莫耳，西爾瓦待聚 合物公司’阿拉巴馬州’漢茲威爾）添加至配備有磁攪棒的 玻璃瓶内。然後加入10當量1-金剛烷-曱基胺（1.5毫莫耳， 亞利希公司）溶解於3毫升二氣曱烷，溶液於室溫攪拌隔 夜。真空去除溶劑，加水至其餘溶液而溶解PEG產物。溶 液於20K ref離心10分鐘’其時金剛烷-甲基胺相分離成較 為緻密的液體。水液部分經收集及真空去除水。其餘黏稠 液體再度溶解於20%哌啶於DMF接受FMOC脫保護，其於 室溫攪拌30分鐘。真空去除溶劑，以DMF洗數次，再度溶 解於水，於陰離子交換管柱跑而去除未反應PEG。收集第 一洗提分經凍乾獲得222毫克白色絮狀粉末（76%產率）所需 產物，經MALDI-TOF分析證實。 實例 25 :金剛烷-PEG3400-乳糖（Ad-PEG3400-Lac) 60毫克如實例24製備之Ad-PEG3_-NH2(16.8微莫耳） 及5.0當量乳糖-一 丁二醯亞胺基（50毫克，皮爾斯公司，伊 利諾州，洛克福）添加至配備有攪棒之玻璃瓶。加入2毫升 50 mM碳酸氫鈉，所得溶液攪拌隔夜。胺之反應藉TNBS 檢定分析監視，決定胺濃度。胺完全反應時（99%胺反應）， 溶液移至透析管（玻片-A-分析儀’ MWCO=3500，皮爾斯公 本紙張尺度適用中國國家標準（0^) A4規格（21〇><297公楚') 66 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（63 ) 司），對水透析24小時及凍乾獲得65.1毫克白色絮狀粉末 (93%產率）。 實例26 : Ad-PEG5_之合成 279毫克PEG5_-NHS(0.053毫莫耳，西爾瓦特聚合物 公司）加至配備有攪棒之玻璃瓶。於其中加入46微升1-金剛 烷-f基胺（0.42毫莫耳，亞利希公司）溶解於3毫升二氣甲 烷，溶液攪拌隔夜。次日，溶液經過濾去除N-羥丁二醯亞 胺副產物，及真空去除二氣曱烧。殘餘物溶解於水及離心。 相分離過量1-金剛烷-甲基胺，去除頂水相，於皮爾斯公司 玻片-A-分析儀使用MWCO=3500透析隔夜。溶液經凍乾獲 得253毫克白色絮狀固體Ad-PEG5000。產物於配備有理查科 學公司ELS偵測器及C18管柱之貝克曼金HPLC系統分析， 發現為純質（？£〇5000屮1^滯留時間：10.7分鐘；產物滯留 時間：12.0分鐘；乙腈/水梯度）。AD-PEG340〇係使用類似方 案合成（56%產率；產物藉Maldi-TOF分析證實）。 金剛院- PEG5〇〇〇(AD-PEGs〇〇〇)之另一種合成法 674毫克PEG5000-NHS(135微莫耳，西爾瓦特聚合物公 司）添加至配備有磁攪棒之玻璃瓶。然後加入5當量1-金剛 烷-曱基胺（675微莫耳，亞利希公司）溶解於10毫升二氯曱 烷，溶液於室溫攪拌隔夜。真空去除溶劑，加水至其餘溶 液。溶液於20K ref離心10分鐘，此時金剛烷-甲基胺相分 離為較為緻密的液體。收集水性部分及對水透析24小時（玻 片-A-分析儀，MWCO=3500)。溶液經凍乾獲得530毫克白 色絮狀粉末（75%產率，產物示意說明如後）。產物於貝克曼 67 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 ____Β7_ 五、發明説明（64) 金HPLC系統分析，分析系統配備有理查科學公司ELS偵測 器及C18管枉且發現為純質（PEG5_-NHS滯留時間：10.7 分鐘；產物滯留時間：12.0分鐘；乙腈/水梯度）。AD-PEG3400 係使用類似方案合成（56%產率；產物藉Maldi-TOF分析證 實）。 丫 ώ。 金剛炫^PEG 5000 實例 27 :金剛烷-(PEG5()()())2(Ad-(PEG5()()0)2) 3 1 5毫克（PEG5_)2-NHS(30微莫耳，西爾瓦特聚合物 公司）添加至配備有磁攪棒之玻璃瓶。然後加入10當量1-金剛烷-曱基胺（300微莫耳，亞利希公司）溶解於3毫升 DCM，溶液於室溫攪拌隔夜。產物經真空去除，加水至其 餘溶液溶解PEG產物。溶液於20K ref離心10分鐘，此時金 剛烷-曱基胺呈較緻密液體相分離。水性部分經收集及對水 透析24小時（玻片-A-分析儀，MWCO=3500)。溶液經凍乾 獲得280毫克白色絮狀粉末（91%產率）。 實例28 :金剛院-PEG34。。-螢光素（Ad-PEG34G〇_FITC) 20毫克Ad-PEG34〇〇-NH2於配備有磁攪棒之玻璃瓶内溶 解於3毫升0.1 Μ碳酸鈉。溶液内加入3當量螢光素異硫氰酸 酯（FITC，西格瑪（Sigma)公司）於DMSO(4毫克/毫升，1.6 毫升），所得溶液於暗處攪拌隔夜，然後轉移至透析管 本纸張尺度適用中國國家標準（™s) A4規格（210 X 297公楚） -68 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼訂丨 1321054 A7 ___B7_ 五、發明説明（65 ) (MWCO=3500)，於暗處對水透析48小時。收集溶液經凍乾 獲得23毫克黃色絮狀固體。PEG3400-FITC使用相同方案由 PEG3400-NH2(西爾瓦特聚合物公司）合成作為對照聚合 物，產率23毫克》 實例29: GALA 之合成 GALA (序列：W-E-A-A-L-A-E-A-L-A-E-A-L-A-E-H-L-A-E-A-L-A-E-A-L-E-A-L-A-A ’ MW 3032)係藉生物聚合 物合成場（貝克曼研究所，加州技術研究院）使用自動合成 儀合成。由樹脂割裂肽之前，三分之一樹脂放置一旁用於 金剛炫耗合。藉HPLC分析肽指示大於95%純度。1 -金剛烧 •羧酸（亞利希公司）使用DCC偶合化學而軛合至GALA肽之 N-終端。結果所得狀（GALA-Ad，MW 3194)由樹脂割裂。 藉HPLC分析肽指示純度大於90%。肽之身分藉 MALDI-TOF證實（生物聚合物分析設施，加州技術研究 院，貝克曼研究所）。 實例30 :使用GALA肽製備本發明愈成物 質體及寡核苷酸。於SV 40啟動機控制下，含蟲螢光 素酶基因之質體pGL3-CV(波密加（Promega)公司，威斯康 辛州，麥迪森）藉大腸桿菌擴增及使用快而金（Qiagen’s)公 司不含内毒素密加普雷套件組（Megaprep kit)(加州，汎倫 西亞）純化。經螢光素標記的募核苷酸（FITC-寡，25元體， 5，-FITC-ACT GCT TCA CTG GGA TTTCAG TGC A-3’)係 藉生物聚合物合成設施（加州技術學院）合成。 粒子之形成及決定特徵。本發明組成物係經由混合等 69 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 ____B7_ 五、發明説明（66 ) 容積12溶解於去離子水與DNA(0.1毫克/毫升於去離子水） 以適當電荷比製備。等容積GALA或GALA-Ad溶解於5〇 mM磷酸鹽缓衝鹽水（PBS，pH 7.2)隨後添加至複體。例如 使用粒子特徵化研究，2微克質體DNA(20微升）以5+/-電荷 比複合12(20毫升）。20微升GALA溶液、GALA-Ad溶液或 50 mM PBS(用於對照樣本）隨後添加至複體《然後溶液藉 加入1.2毫升去離子水稀釋。粒子大小及電荷分別係藉動態 光繞射及日塔電位測量，使用曰塔帕爾（ZetaPals)動態光繞 射偵測器布魯克海文（Brookhaven)儀器公司，紐約州，赫 特維）測定。結果以此等測量值之平均值±標準差表示，示 於第2圖。於5+/-電荷比製備的12/pGL-3-CV組成物之流體 力學直徑藉動態光繞射測得為260毫微米。2微克質體DNA 於20微升混合等容積12於5+/-電荷比。然後將各種不同比 例的GALA或GALA-Ad添加至粒子。流體力學直徑係藉光 繞射測量測定。結果以3次測量的平均±標準差表示。 GALA肽由pH 7.5之水溶性隨機盤捲組態轉成於pH 5之水 不溶性螺旋。GALA及金剛烷改性GALA(GALA-Ad)溶解於 50 mM PBS (pH 7.2)，以各種肽/環糊精比添加至治療性組 成物。混合物以去離子水稀釋，粒徑藉動態光繞射測定（第 2圖）。第2圖顯示GALA(虛線）及GALA-Ad(實線）改性複聚 物之流體力學直徑。 結果。因粒子計數速率對全部肽之添加濃度維持相 等，添加肽顯然不會破壞組成物。因GALA及GALA-Ad添 加變化之粒徑情況極為類似。流體力學直徑由250毫微米 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X 297公釐） -70 - -.....訂............... (請先聞讀背面之注意事項再塡寫本頁) 1321054 A7 ____B7_ 五、發明説明（67 ) (1% GALA 或 GALA-Ad)增加至 400 毫微米（10% GALA 或 GALA-Ad)。隨著添加更多肽，粒徑再度縮小至未改性治 療性組成物之粒徑。直徑藉添加30%或以上GALA-Ad及 50%或以上GALA返回250毫微米粒徑。參考第2圖。 實例31 :細胞轉移感染 細胞培養。BHK-2 1細胞係購自ATCC(馬里蘭州，洛克 維爾），HUH-7細胞係由維力金（Valigen)公司（賓州，牛頓) 慷慨捐贈。二細胞系於DMEM(補充10%胎牛血清、100單 位/毫升青黴素、1〇〇微克/毫升鏈黴素、及0.25微克/毫升兩 性素）於濕化培育器於37°C 5%二氧化碳培養，每隔4-5曰繼 代培養一次。培養基及補充物係購自吉伯可（Gibco)BRL (馬里蘭州，蓋塞堡）。 由培養細胞攝取治療性組成物。BHK-21細胞以 150,000細胞/孔接種於6孔平板，於37°C培育24小時。5微 克FITC-寡以5+/-電荷比複合12。經5分鐘複合時間後，50 微升0八1^八或0八]^八-八(!於5〇1111^下88(?117.2)添加至複合 體。培養基由細胞移出，細胞以PBS洗滌。用於轉移感染， 900微升歐堤門（Optimem)'力σ至各治療性組成物溶液，整體 溶液移至細胞。細胞與轉移感染混合物共同培育5小時，隨 後去除培養基及以PBS洗滌細胞兩次。藉胰蛋白酶分解收 集細胞，準備進行FACs分析《細胞於洗滌緩衝液（漢克氏 平衡鹽溶液含DNase及氣化鎂）洗滌兩次，再度懸浮於500 微升FACS緩衝液（漢克氏平衡鹽溶液，2_5毫克/毫升牛血清 白蛋白，10微克/毫升蛾化波皮點（propidium))。使用費克 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 71 I ) ......... 訂_ _ ...... (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1321054 A7 ______B7_ 五、發明説明（68) 斯卡利伯（FACSCalibur)流動細胞計（貝克坦狄金森（Becton Dickinson)公司，加州，聖荷西）及塞爾奎斯特（Cel丨Quest) 軟體進行FACS分析。結果示於第4圖。如第4a-d圖所示， BHK-21 細胞（4a)係以 12/FITC-01igo(4b)、12/FITC-Oligo/50% 0八1^(4(〇及12$11'(：-01丨§〇/50%0八1^-八(1(4(1)轉移感染。藉 流動細胞計分析測定攝取率。資料係以螢光側繪表示，涪y 軸計算細胞計數，沿X軸作圖螢光素螢光強度。 從蟲光素酶轉移感染的毒性。BHK-21細胞以50,000細 胞/孔接種於24孔平板及於37 °C培育24小時。3微克 PGL3-CV質體於5+/-電荷比複合12。然後30微升GALA或 GALA-Ad於50 mM PBS，pH 7.2加至複體。轉移感染前由 細胞移出培養基，細胞以PBS洗滌。900微升歐堤門加至各 治療性組成物而形成轉移感染溶液，其中230微升加至3孔 之各孔歷4小時。經4小時後，800微升完全培養基加至各 孔。轉移感染後24小時變更培養基，細胞於轉移感染後48 小時於50微升細胞培養溶解緩衝液（波密加公司，威斯康辛 州，麥迪森）溶解。蟲螢光素酶活性係使用波密加蟲螢光素 酶檢定分析計分析，經由使用拜爾拉公司DC蛋白質檢定分 析（加州，赫克利斯）測定總細胞蛋白質測量細胞存活率。 Gonzales等人，生物軛合化學 10，1068-1074，1999。 實例32 :改性複體之日塔電位 2微克質體DNA於20微升以5+/-電荷比混合等容積 12。然後各種比例GALA或GALA-Ad以各種肽/CD比添加至 粒子，隨後以去離子水稀釋。粒子電荷係藉電泳移動性測 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X 297公釐） 72 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -訂· 1321054 A7 ----!Z__ 五、發明説明（69 ) 量決定，以粒子曰塔電位表示，以毫伏特為單位。於5+/ 電荷比之12/pGL3-CV組成物粒子電荷係藉曰塔電位測量 決定’發現為+13毫伏特。粒子於肽存在下之日塔電位細 測量’以三次測量值之平均±標準差示於第3圖。 結果。因GALA肽於pH 7·2為陰離子性肽（含有數個麵 胺酸殘基）’ GALA及GALA-Ad組合組成物降低日塔電位。 組成物藉30% GALA(-11毫伏特）或GALA-Ad(-23毫伏特） 變成帶負電。GALA+治療性組成物之日塔電位於此點造成 平台；加入更大量GALA只能略為升高日塔電位（於150% GALA -15毫伏特）。但使用較高GALA-Ad濃度，粒子變成 更加帶負電。添加150% GALA-Ad之組成物具有日塔電位 -42毫伏特。參考第3圖。 實例33 :組成物之DNA輸送效率 HUH-7細胞：肝腫瘤細胞系（HUH-7也以12/FITC-Oligo 於5+/-電荷比以及12/FITC-Oligo/50% GALA-Ad組成物轉 移感染。DNA之攝取係如BHK-21細胞所述監測。未經轉移 感染之HUH-7細胞之螢光曲線位於第一十分位（第5a圖）。 FITC-Oligo成功地使用12輸送至95% HUH-7細胞（第5b圖） 。添加50% GALA-Ad之組成物抑制FITC-Oligo之攝取達二 次冪幅度，如使用BHK-21細胞觀察（第5c圖）。 實例34 :本發明組成物之蟲螢光素酶轉移感染效率 GALA及GALA-Ad改性組成物之轉移感染能力係藉輸 送蟲螢光素酶報告子基因至培養細胞測定。BHK·21細胞接 種於24孔平板，轉移感染1微克pGL-CV3(含蟲螢光素酶基 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公釐） -73 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂. 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（70 ) 因質體）以5+/-電荷比複合12而形成微粒狀複合物。微粒狀 複合物以各種肽/環糊精比添加GALA或GALA-Ad改性。轉 移感染後48小時細胞溶解，分析蟲螢光素酶活性，結果如 第6圖所示係以相對光單位（RLUs)報告。資料係以三個試 樣的平均土標準差報告。背景值=300 RLV。 細胞成功地使用12/pGL-CV3組成物轉移感染，標示為 RLUs約等於lx 105。添加GALA對轉移感染效率不會產生 重大影響。但以GALA-Ad改性組成物則大為抑制轉移感染 。添加1 % GALA可提高轉移感染2倍至2x 105 RLU， 12/pGL-CV3/10%也獲得略高的轉移感染（1·5χ 105 RLU)。 添加100% GALA降低轉移感染達50%至5χ 104 RLU。 實例35 : GALA及GALA-Ad組成物毒性 GALA及GALA-Ad改性組成物毒性係經由測量轉移感 染實驗所得細胞溶解產物之蛋白質濃度測定。Β Η K - 21細胞 使用1微克PGL-CV3以5+/-電荷比複合12轉移感染。轉移感 染前，各種比例之GALA及GALA-Ad添加至複體。於 GALA(實心柱）及GALA-Ad(白柱）存在下轉移感染細胞之 存活率之測定方式，係經'由於轉移感染後48小時檢定分析 總蛋白質濃度，使用未轉移感染細胞之蛋白質濃度規度化 各試樣濃度。蛋白質濃度係以三次重複求平均的平均±標 準差報告，該平均除以單獨使用12/pGL-CV3組成物轉移感 染細胞之平均蛋白質濃度，且以細胞存活分數報告（第7 圖）。添加GALA及GALA-Ad至轉移感染溶液，結果未見對 BHK-21細胞造成毒性。 74 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _ B7_ 五、發明説明（71 ) 實例36 :乳糖-/S -環糊精-DMS共聚物20(Lac-冷-環糊精 -DMS共聚物20) 12 (20.5毫克，3微莫耳），10當量α -乳糖（21毫克，20 微莫耳，西格瑪公司）及18.6毫克氰基硼氫化鈉（300微莫耳) 添加至玻璃容器。1毫升硼酸鹽緩衝液pH8.5添加至固體， 結果所得溶液於37°C.水浴培育30分鐘前簡短渦旋。溶液以 添加1Μ鹽酸酸化至pH 6.0，對水透析24小時。對聚合物胺 進行TNBS檢定分析顯示87%軛合。化合物20結構式。 實例 37 :乳糖-(CH2)6-/3 -環糊精-DMS共聚物21(Lac-C6-/? -環糊精-DMS共聚物21) 12 (43.2毫克，7.4微莫耳）及5.6當量一（乳糖基醯胺基) 一（丁二醯亞胺基）癸二酸酯（50毫克，84微莫耳，皮爾斯公 司）添加至配備有磁攪棒且溶解於2毫升50 mM碳酸氫鈉。 所得溶液攪拌隔夜。反應藉TNBS檢定分析監視聚合物胺端 基的消失跟蹤，顯示90%軛合。溶液藉添加1M鹽酸酸化至 pH 5.0,所得溶液於皮爾斯公司MWCO 3500玻片-A-分析儀 對水透析2曰隨後凍乾。獲得白色絮狀粉末，產率70%。2 1 之結構式示於第12圖。 實例38 :(比較例）：Pre DNA複合PEG化，以PEG34〇〇為端 基之-環糊精-DMS共聚物22 20.3 毫克 12 (3 微莫耳）及 10 當量 FMOC- PEG340〇-NHS (190毫克，60微莫耳）添加至配備有磁攪棒之玻璃瓶内，溶 解於1毫升50 mM碳酸氫鈉pH 8.5。溶液於室溫於暗處攪拌 20小時然後凍乾。固體溶解於0.5毫升20%哌啶於DMF，攪 75 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 __B7___ 五、發明説明（72 ) 拌30分鐘進行FMOC脫保護。真空去除溶劑’剩餘黏稠液 體溶解於水，pH以0.1 Μ鹽酸調整至低於6.0。聚合物藉陰 離子交換層析術由未反應之PEG分離及凍乾獲得白色絮狀 粉末。
12及22混合質體DNA作粒徑測量。ySCDP6 12縮合質 體DNA成為帶有流體力學直徑的均一粒子；130毫微米’ PEG化22無法縮合DNA。聚合物端末存在有PEG破壞DNA 的結合。 實例39(比較例）：藉接枝進行後-DNA-複合PEG化 使用之程序係由Ogris等人基因治療，6,595-605(1999) 修改獲得。5微克pGL3-CV於500微升去離子水混合等容積 PEI(於去離子水），電荷比3+/-或6+/-。12/DNA微粒狀複合 物係以電荷比5+/-以相同方式製備。微粒狀複合物之粒徑 係藉動態光掃描（DLS)測量。形成微粒狀複合物後’ PEG5〇〇0-SPA(10毫克/毫升於DMF)添加至溶液，於室溫混合 2小時。測定粒徑後，作為第二階段，500微升PBS pH 7.2 添加至溶液。溶液於室溫培育30分鐘，隨後藉DLS測定最 終粒徑。參考第8圖之示意圖。 於第1階段，PEI/DNA或12/DNA微粒狀複合物係於1.2 毫升去離子水形成。粒徑係藉動態光掃描（DLS)測量。 PEGsgoo-SPA添加至第2階段微粒狀複合物溶液，讓其與聚 合物第一胺基反應1小時。「PEG化」樣本大小係藉DLS測 量。於第3階段，600微升PBS ’ pH 7_2添加至各樣本試驗 PEG化粒子之鹽安定性。粒徑係於添加鹽後3 0分鐘湏丨J定 本紙張尺度適用中國國家標準（™s) A4規格（210X 297公楚） -76 - I #............... (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 __B7_ 五、發明説明（73) ’俾決定粒子聚集程度。 PEI微粒狀複合物係以3+/-及6+/-電荷比調配，12/DNA 微粒狀複合物之複體係於5+/-電荷比調配（第1階段）。 PEG5_-SPA根據 Ogris 等人，基因治療 6 ’ 595-606，1999 公開的程序，以10:1 w/w添加至PEI。12使用1〇〇〇/0、150% 及200% PEG :胺（莫耳％)PEG化。至於對照，未反應PEG 也以100%添加至12。各階段之粒子直徑示於第9圖之表。 PEG化時，PEI微粒狀複合物大小略增（對3+/-電荷比由58 毫微米增至65毫微米，對6+/-電荷比由55毫微米增至60毫 微米）。PEG化保護PEI微粒狀複合物不會因鹽誘生聚集。 雖然添加鹽後，未改性PEI粒子直徑增加至800毫微米，但 PEG化PEI微粒狀複合物之大小僅略增至78毫微米（6+/-電 荷比）及115毫微米（3+/-電荷比）。 添加150%及200% PEG5〇〇〇-SPA至以12為主的微粒狀 複合物結果導致粒子崩潰；粒子數目遽減，且未見一致交 互關係。12之PEG化可防止聚合物/DNA結合。粒徑於PEG 化後使用100% PEGwoo-SPA維持於67毫微米。但隨時間變 化監視粒子大小，顯示添加PEG後約30秒粒子崩潰，隨後 再度觀察到小粒子。因此添加100% PEG5_-SPA可PEG化 部分12。因聚合物12相對於DNA為過量添加（5+/-電荷 比），故隨後粒子重排，讓未改性聚合物與質體DNA形成複 聚物，同時大部分PEG化聚合物維持游離於溶液。添加鹽 至此等粒子，結果導致粒子聚集（3〇〇毫微米），但未聚集至 未改性12微粒狀複合物的程度（7〇〇毫微米）。要言之，後 中國國家標準（CNS) A4規格（210X 297公釐） -77 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂· A7 ^ --------B7_ 1、發明説明（74 ) 'DNA-複合PEG化而與聚合物一次第一胺基反應可有效用 於具高電荷密度之高分子量聚合物。但與12反應，即使為 後-DNA複合，結果導致於1〇〇% PEG5tKHrSPA加成缺鹽安定 性’於更高PEG5_-SPA濃度粒子崩潰。 實例40 :藉包涵複體形成進行後-DNA-複合PEG化 使用後述程序，金剛烷-PEG(Ad-PEG)分子添加至預先 形成組成物溶液，該溶液為1 〇〇%金剛烷對環糊精（莫耳 °/〇)。然後PBS添加至溶液，以2分鐘間隔時間藉DLS監視粒 徑。結果顯示於第1 〇圖。 程序：2微pGL3-CV於600微升去離子水以5+/-電荷比 混合等容積12(於去離子水）。需要量之Ad-PEG(10毫克/毫 升於去離子水）添加至其中及藉DLS測定粒徑。600微升 PBS，pH 7.2加至溶液，以2分鐘時間間隔監視粒徑8分鐘》 未經PEG化12粒子平均直徑於鹽添加後之8分鐘内由 58毫微米增至250毫微米。溶液中存在有游離PEG無法防止 聚集（鹽添加後平均直徑240毫微米）。但透過含線性 Ad-PEG分子包涵複體進行PEG化，以長度相依性方式減少 粒子聚集。添加鹽後8分鐘，以Ad-PEGwooPEG化之粒子聚 集至直徑210毫微米，而以Ad-PEG340〇-LacPEG化之粒子聚 集至直徑200毫微米。以Ad-PEG5〇〇() PEG化之粒子於添加鹽 後8分鐘直徑僅增至90毫微米，而添加鹽後2小時增至160 毫微米。以Ad-(PEG5_)2改性對聚集有微小影響（添加鹽後 粒徑200毫微米）。 也以PEG密度相依性方式出現安定化（第10A圖）。添加 本紙張尺度適用中國國家標準（Ο®) A4規格（210X297公釐） 78 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1321054 A7 B7 五、發明説明（75 ) 鹽10分鐘後測得平均粒徑，對未改性複聚物增加4.7$(58 毫微米至272毫微米），但添加150%或200%金剛燒對環_ _ 改性複聚物粒徑僅增加1.2倍。 實例41 :因複合後PEG化降低細胞攝取 步驟1 :轉移感染混合物製備如後：等容積陽離子十生 12以3+/-電荷比聚合物對DNA添加至3微克FlTC-〇lig()s (0.1微克/微升於水）。複體内以1:1 PEG對環糊精比添加自 由態PEG或Ad-PEG5_(如實例40製備）。 步驟2。HUH-7細胞係以3x 105細胞/孔接種於6孔平 板’且於4毫升DMEM+10% FBS+抗生素/抗黴菌素維持μ 小時。24小時後，細胞以PBS洗滌，1毫升含步驟轉移感$ 混合物之歐堤門添加至細胞。培育1 5分鐘後，移出轉移感 染培養基’細胞以PBS洗滌，添加1毫升歐堤門至各孔。細 胞又於37°C培育30分鐘。然後細胞以細胞刷洗緩衝液（基因 治療系統）洗滌去除表面結合複體及PBS，然後藉胰蛋白酶 處理而由孔脫落。然後製備細胞，藉FACS分析分析 FITC-01ig〇的攝取。结果示於下表1。藉Ad-PEG5〇〇()修改複 體，降低FITC-Oligo/聚合物複體的攝取。 表1 樣本 轉移感染百分比 單獨細胞 0% 細胞+ HTC-Oligo 0% 細胞+微粒狀複合物+自由態PEG 43% 細胞+改性Ad-PEG5〇〇〇微粒狀複合物 27% 本纸張尺度適用中國國家標準（°^〉A4規格（210X 297公釐） -79 - ..................訂·.............. (請先閱讀背面之注意事项再填寫本頁} 1321054 A7 _____B7_ 五、發明説明（76 ) 貫例42 : 12/Ad-PEG34Q〇-FITC組成物之形成及輸送至培養 細胞 BHK-21細胞以200,000細胞/孔接種於6孔平板，且於 37°C培育24小時。3微克oligo (0.1毫克/毫升於去離子水） 以5+/-電荷比複合等容積12(2毫克/毫升於去離子水）。經5 分鐘複合時間後，1.5微升PEG-FITC或Ad-PEG-FITC(10微 克/毫升於去離子水）加至複體。由細胞去除培養基，細胞 以PBS洗滌。用於轉移感染，940微升歐堤門加至各治療性 組成物溶液，全體溶液移出細胞。細胞於去除培養基之前 與轉移感染混合物共同培育4小時，以PBS洗滌細胞，及添 加於4毫升完全培養基\細胞於去除培養基之前又於37°C培 育24小時，細胞以PBS洗兩次。細胞藉胰蛋白酶分解收集 且準備接受FACs分析。細胞於洗滌緩衝液（漢克氏平衡鹽 溶液含DNase及氣化鎂）洗滌兩次，再度懸浮於500微升 FACS緩衝液（漢克氏平衡鹽溶液，2.5毫克/毫升牛血清白蛋 白，10微克/毫升碘化波皮點）。FACS分析係使用費克斯卡 利伯（FACSCalibur)流動細胞計（貝克坦狄金森公司，加 州，聖荷西）以及塞爾奎斯特軟體進行FACS分析。第11圖 顯示分析結果。 與AD-PEG34()(rFITC形成包涵複體，結果導致螢光素 攝取比於AD-PEG3400-FITC共同培育之12增高（43%相對於 14%，第11圖）。培養基之自由態AD-PEG3400-FITC攝取於 細胞作為胞飲或細胞攝粒路徑之一部分。但當複合至12時’ AD-PEG34〇(rFITC也可進入細胞。12微粒狀複合物以低比例 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -80 - ..............................訂............... (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（77 ) (10%)改性AD-PEG3400-FITC可抑制進入細胞内部。但12微 粒狀複合物容易結合至細胞表面，當其被攝入細胞内部時 同時輸送AD-PEG34GG-FITC。12微粒狀複合物輔助輸送，結 果導致於12/Ad-PEG3_-FITC轉移感染細胞觀察得螢光素 螢光增高。此種方法連同感興趣基因也可應用於共同輸送 小分子治療劑。 實例43 : HU47細胞之轉移感染 蟲螢光素酶轉移感染。HUH-7細胞以50,000細胞/孔接 種於24孔平板，且於37°C培育24小時。3微克pGL3-CV質體 (0.1毫克/毫升於去離子水）以各種電荷比複合等容積12或 21(參考第13圖）。轉移感染前由細胞去除培養基，細胞以 PBS洗滌。600微升歐堤門加至各治療性組成物形成轉移感 染溶液，230微升轉移感染溶液加至3孔之各孔歷4小時。經 4小時後，800微升完全培養基加至各孔。轉移感染後24小 時變更培養基，轉移感染後48小時，細胞於50微升細胞培 養溶解缓衝液（波密加，威斯康辛.州，麥迪森）溶解。使用 波密加蟲螢光素酶檢定分析試劑分析蟲螢光素酶活性。結 果示於第13圖。 實例44:金剛烷衍生PEI(Ad-PEI)之合成 聚伸乙基亞胺（PEI)及金剛烷羧酸於無水二氣甲烷混 合且冷卻至0°C。DCC(1當量），1-羥苯曱醯基（1當量），及 三乙基胺（1當量）加至混合物。溶液緩慢溫熱至室溫，及攪 拌16小時。過濾去除沉澱然後藉真空去除溶劑。加水至殘 餘黃色固體。離心去除不溶性固體。水溶液小心移至透析 81 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（78 ) 袋内對水透析24小時。凍乾後獲得ΡΕΙ-CD。 實例45 :環糊精-PEG (CD-PEG)之合成 PEG- 丁二醯亞胺化丙酸（SPA)(西爾瓦特聚合物公司） 及環糊精-一胺（1.2當量）溶解於DMSO及於室溫攪拌24小 時。環糊精-PEG產物藉透析純化。 實例46 : Ad-PEI/DNA微粒狀複合物之調配以及隨後以 CD-PEG改性 1微克質體DNA(0.1微克/微升於去離子水）以5+/-電荷 比混合實例42之Ad-PEI。然後實例46之CD-PEG(溶解於去 離子水）以預定CD : Ad比添加至複體。 實例47 :藉PEG化穩定化：以高濃度調配 4微克質體DNA混合等容積聚合物混合物（以2.5+/-電 荷比含環糊精聚合物12，某些例中，含金剛烷-PEG50()0或 PEG5_於1 CD : 1 PEG5_之比例），終DNA濃度係由0.1毫 克/毫升至4毫克/毫升（參考第14圖）。半量溶液以1.2毫升水 稀釋，直徑藉動態光繞射測定。另外半量溶液通過快而金 (Qiagen)快而奎（Qiaquick)管柱而萃取出溶液中剩餘的 DNA。DNA濃度係藉於；I +=260之紫外光吸光比測定。 結果（第15及16圖）：以金剛烷-PEG5000改性之小型均勻 微粒狀複合物（直徑<100毫微米），可以高達（含）4毫克DNA/ 毫升之濃度調配而未沉澱。未改性複聚物於高於0.2毫克/ 毫升形成大粒子（>300毫微米），於全部調配濃度皆觀察到 大量沉澱（DNA損失>50%)。 實例48 :藉複聚物表面改性抑制非特異攝取 82 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 ________B7 _ 五、發明説明（79) BHK-21細胞接種於6孔平板。細胞以3微克FITC-Oligo 轉移感染（轉移感染終濃度：0.05毫克DNA/毫升）， FlTC-〇lig(m2 5+/_電荷比12/dna複合等容積12。然後微 粒狀複合物以下列鍵聯基改性：
陰離子性鍵聯基： WEAALAEALAEALAEAC
Ad-陰離子性鍵聯基： Ad-WEAALAEALAEALAEAC
Ad'PEG Ad-PEG
Ad-陰離子性鍵聯基 _pEG Ad-WEAALAEALAEALAEAC-PEGsooo 1毫升歐堤門添加至轉移感染混合物，全部溶液轉移 感給預先洗滌後之BHK-21細胞（以PBS清洗）歷15分鐘。然 後去除培養基，細胞以細胞刷洗系統洗滌，以胰蛋白酶處 理及準備接受FACs分析。 結果：包含賓（金剛烷）、間隔基（陰離子性聯結基）、 及官能基（PEGDmoo)用來改性12/DNA微粒狀複合物，抑制 非特異性攝取於培養細胞。參考第17圖。最理想抑制係以 全部三種組成分的組合達成。 實例49:半乳糖媒介攝取入肝腫瘤細胞
HepG2細胞以50,000細胞/孔接種於24孔平板。1微克 pCMV-Luc接觸等容積12，如後示改性《以含PEG複合劑改 性係以2:1 CD : PEG比進行，此處CD表示12中的環糊精。 12/pcMV-Luc微粒狀複合物未改性
Glu-PEG-Pep-Ad 葡萄糖-PEG34〇〇-CAEAEAEAE-Ad，2 CD: 1 PEG Gal-PEG-Pep-Ad 半乳糖-PEG3400-CAEAEAEAE-Ad，2 CD: 1 PEG
PEG-Pep-Ad PEG5〇〇〇-CAEAEAEAE-Ad, 2 CD :1 PEG 本纸張尺度適用中國國家標準（0^) A4规格（2】0X297公釐） -83 - ............訂 ....... (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（8〇 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 200微升歐堤門添加至各轉移感染混合物及轉移感染 至各孔細胞。轉移感染後4小時，800微升完全培養基加至 各孔。去除培養基，細胞以PBS洗滌，轉移感染後24小時1 毫升完全培養基添加至各孔。轉移感染後48小時，細胞以 PBS洗滌，溶解及分析蟲螢光素酶活性°所述轉移感染程 序亦係於1 mM葡萄糠或1 mM半乳糖作為競爭抑制劑存在 下執行。 結果：以Glu-PEG-Pep-Ad或PEG-Pep-Ad改性之微粒狀 複合物具有負日塔電位，因而不容易轉移感染細胞。但以 Gal-PEG-Pep-Ad改性之複聚物顯示轉移感染提升，該轉移 感染於自由態半乳糖存在下受抑制，因而證實半乳糖媒介 之轉移感染入肝腫瘤細胞。參考第18圖。 實例50 :二金剛烷化合物之合成 參考文獻：8^51〇\¥^1&1.】八€8(1996)¥118卩8495-8496· Zhang et al. JACS (1999) v 115 p9353-9354 無水°比啶（5毫升）置於含小型磁攪棒且於冰浴冷卻的 反應器内。二氣磷酸曱酯(1.0毫升）逐滴加入其中。混合物 又冷卻15分鐘，於期間形成N-甲基二氯磷酸吼啶鑌沉澱。 金剛烷乙醇溶解於5毫升吡啶添加至反應器，反應混合物冷 凍後密封反應器。所得混合物於室溫攪拌隔夜。然後開啟 密封反應器，所得混合物倒入10%碳酸氫鈉（50毫升）。然後 所得溶液真空蒸發。添加800毫升水至其餘固體，產物以150 毫升醚萃取。水相以2N鹽酸酸化至pH 1.4，然後以3x 1 50 毫升氣仿：正丁醇（7:3)萃取。有機層以水洗滌，混合溶劑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐〉 -84 - 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（8i ) 經真空蒸發形成固相。固體以丙酮/己烷再結晶，獲得白色 固體，產率27%。電喷霧質譜術分析顯示為純質所需產物。 實例51 :二金剛烷-PEGsqqo之合成 Ο
二金剛烧-PEG5000 二氯曱烷以氫化鈣回流隔夜脫水，然後新餾用於反應 。PEG-環氧化物（分子量5000)於新餾二氣甲烷（0.2毫升）之 攪拌溶液内緩慢加入貳（2-(1-金剛烷基）乙基）磷酸酯（實例 51所述二金剛烷化合物）0.4毫升二氣甲烷溶液。所得溶液 於35°C攪拌4日。真空去除溶劑至乾燥。添加6毫升水至形 成的固體，產生沉澱。所得混合物於室溫攪拌半小時，然 後離心去除固體（未反應二金剛烷化合物）。上清液於3500 MWCO膜對水透析隔夜及凍乾，獲得白色固體，99%產率。 MaldiTof分析顯示為所需產物。 實例52: Ad-PEGs·與二金剛烷-PEG5_間之競爭置換反應 競爭吸附實驗係經由添加diAdPEG5G()()溶液至預先形 成的AdPEG34()()、聚合物及DNA組成物進行。然後添加鹽溶 液，隨著時間的變化測量粒徑。 最初係添加12溶液（16.6微升水+ 2.61微升12於5毫克/ 毫升+ 2.37微升AdPEG3400於12.5毫克/毫升）至DNA溶液 (20微升DNA於0_1毫克/毫升）。組成物溶液特徵如後： 85 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 五、發明説明（82) [DNA]=0.05毫克/毫升 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
AdPEG34〇o · CD莫耳比= 1:1 電荷比=3+/-總調配容積=40微升 添加di-AdPEG5K溶液（10毫克/毫升）前讓組成物培育 10分鐘。溶液容積經測定讓diAdPEG5000與AdPEG34〇〇間之 莫耳比為1:1、1:2、1:4或1:6。例如當比例為1:2時，加入 2.38微升土八(1?£05_溶液。 又培育10分鐘後，添加1.2毫升水稀釋，讓其可藉DLS 儀器讀取。粒徑測量10分鐘，然後600微升1X PBS快速混 合入組成物溶液。然後其次3 0分鐘時間每分鐘觀察粒徑變 化。 供比較用，調配另二組成物。一例中，未添加 diAdPEG5_。另一例中，未添力口 AdPEG34〇〇。可知於此等 條件下，使用AdPEG34()()無法穩定微粒狀複合物大小。鹽造 成平均粒徑於30分鐘時間由70毫微米增至350毫微米。但單 獨diAdPEG5_確實顯示鹽的安定化。添加鹽溶液後，粒徑 維持穩定。即使diAdPEG.5K之存在量為AdPEG34〇〇之1/6時 亦如此。結果顯示於第19圖。 實例53 : pH敏感金剛烷-PEG改性劑
HjN—PEG5 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -86 - 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（83) 包涵化合物賓與主間之結合常數於賓或主帶電時降 低。例如金剛烷羧酸之質子化形式（中性形式）具有結合常 數約500,000 ;而金剛烷羧酸之未質子化（陰離子）形式具有 結合常數約30,000。如此可用來結合pH敏感行為至含包涵 化合物物質。例如，可以含第二胺之金剛烷-PEG(Ad-PEG) 化合物改性的接近金剛烷。Ad-PEG化合物對生理pH具高 度親和加，但於酸性pH較為容易釋放，如於細胞内囊胞實 驗可證。於内囊胞加速脫囊胞將促成已經進入細胞内部的 複聚物釋放DNA。 pH-敏感可水解金剛烷-PEG改性劑之合成 PEG5k-NH2(132毫克，0.0264毫莫耳）溶解於水及冷卻 至0°C。混合物内加入氫氧化鈉溶液（5N，0.053毫升，0.264 毫莫耳，10當量）及氟曱酸1-金剛烷酯（52毫克，0.264毫莫 耳，10當量）THF溶液（3毫升）。混合物於此溫度攪拌5分鐘， 然後溫熱至室溫及攪拌2小時。真空去除THF。藉離心去除 非可溶性固體。其餘水溶液轉移至史佩查/波爾MWCO 3,500膜，對水透析1日。結果所得金剛烷-胺基甲酸酯 -PEG5k(80毫克）係於凍乾獲得。化合物結構藉1H NMR， HPLC及 MALDI TOF MS證實。 可水解金剛炫-席夫驗-PEG之合成 PEG5K-ALD及1-金剛烷甲基胺（1當量）於甲醇混合。混 合物内加入加入數滴曱酸作為形成席夫鹼的催化劑。混合 物於6(TC攪拌12小時，然後真空蒸發去除溶劑。混合物於 水中透析獲得所需金剛炫-席夫驗-PEG5k。 87 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（84 ) 實例55 :金剛烷-PEG-轉移素（Ad-PEG-Tf)之合成，第20圖 1.透過碳水化合物基之轉移偶合 步驟1 : Ad-PEG-NH-NH2之合成 FMOC-NH-PEG5000-NHS(西爾瓦特聚合物，0.2毫莫 耳，1克）添加至配備有攪棒之圓底瓶。於其中加入胺基曱 酸第三丁酯（亞利希公司，1.6毫莫耳，0.2112克）溶解於7 毫升二氯曱烷/乙酸乙酯（1:1)。所得溶液於室溫攪拌隔夜。 次日，真空去除溶劑。經由將所得固體於1 〇毫升20%哌啶 於二甲基曱醯胺歷5小時去除FMOC基。真空去除溶劑，殘 餘物再度溶解於水。所得溶液經離心去除未溶解FMOC 基，然後於皮爾斯-玻片-A分析儀，3500 MWCO透析隔夜。 然後溶液經凍乾獲得790毫克H2N-PEG5_-NH-NH-CO-OtBu。 N-羥丁二醯亞胺（亞利希公司，0.24毫莫耳，27.3毫克) 及金剛烷羧酸（亞利希公司，0.39毫莫耳，71.2毫克）隨後添 加至 H2N-PEG5〇〇〇-NH-NH-CO-OtBu(2)(0.16毫莫耳，790毫 克）溶解於7毫升二氯曱烷。所得溶液内加入1,3-二環己基 甲二醯亞胺（亞利希公司，1.6毫莫耳，0.326毫克）溶解於3 毫升二氣曱烷。所得溶液於室溫攪拌隔夜。次日，於細玻 璃料過濾形成的固體，濾液於旋轉蒸發器真空濃縮。殘餘 物溶解於10毫升水，離心去除未反應金剛烷羧酸。真空去 除溶劑，殘餘物再度溶解於6毫升4M鹽酸於二鑕烷，俾將 第三-丁氧羰基脫保護。所得溶液於室溫攪拌4小時，真空 去除溶劑，殘餘物再度溶解於水。所得溶液於皮爾斯玻片 -A-分析儀，3500 MWCO透析隔夜及凍乾，獲得635毫克 88 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 B7 市 五、發明説明（85
Ad-PEG5_-NH-NH2。 步驟2 :轉移素-PEG-Ad-輕合物的合成 100毫克（1.28微莫耳）人類轉移素（乏鐵）（西格瑪-亞利 希公司）於1毫升30 miy[乙酸鈉緩衝液（pH 5)之溶液於西法 德斯（Sephadex)G-25速沛克（Supelco)管柱接受凝膠過濾。 所得4毫升含轉移素溶液（監視：於280毫微米之紫外光吸收） 冷卻至0°C，加入80微升含4毫克（19微莫耳）過碘酸鈉之30 mM乙酸鈉緩衝液（pH 5)。混合物維持於冰浴及暗處歷2小 時。去除低分子量產物後，又進行一次凝膠過濾（西法德斯 G-25，30 mM乙酸鈉緩衝液（pH 5))。如此獲得含約85毫克 (1.09微莫耳）氧化轉移素溶液。改性轉移素溶液添加至含 54.5毫克（1〇.9微莫耳）八(1-?£05000-\11-：^112於1毫升1〇〇11114 乙酸鈉（pH 5)之溶液。所得溶液於室溫攪拌隔夜。然後藉 加入1 Μ之碳酸氫鈉將pH調整至7.5，以1小時時間間隔加 入4份9.5毫克（150微莫耳）氰基硼氫化鈉。18小時後，PEG 化轉移素經純化使用山奇空（Centricon)YM-50,000 NMWI 裝置（米利波（Millipore)公司）離心。 步驟3 :藉轉移素氧化合成轉移素-PEG-Ad之鐵載荷 40毫克以阿朴轉移素為主之化合物（阿朴-轉移素或阿 朴-轉移素-PEG-Ad)溶解於700微升去離子水。溶液内加入 200微升5 mM檸檬酸鐵及100微升84毫克/毫升碳酸氣納。 讓溶液放置2-3小時，然後對PBS透析隔夜。鐵栽荷致率 計算方式係測定於465毫微米附光比（得自氧化鐵）對於^ 毫微米之吸光比（得自蛋白質之色胺酸殘基），規度化& 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 89 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· A7 B7 明説明（86 售全-轉移素之A465/A28〇比。轉移素、於氧化緩衝液（乙酸 執PH 5)之轉移素及新鮮氧化轉移素之鐵載荷經測定及示 於第21圖。轉移素之氧化可減少蛋白質之鐵載荷效率。 步驟4 :轉移素-PEG-AD(藉轉移素氧化合成）對PC3細胞之 轉移素受體之結合親和力 PC3細胞以不等量未加標記之轉移素及轉移素-PEG-Ad而與250 nM螢光素-轉移素（FITC-TF)共同培育。FITC-hTF細胞結合係藉FACS分析評估。未加標記轉移素極為有 效地與FITC-hTF競爭，而轉移素-PEG-AD與FITC-hTF之競 爭不佳，最可能原因係對受體親和力減低故。結果顯示於 第22圖。 實例56 :經由離胺酸基之轉移素偶合，第23圖 步驟1 : VS-PEG34〇o_Ad之合成 乙稀基颯-PEG34〇〇-NHS(西爾瓦特聚合物公司，0.147 毫莫耳，0.5克）添加至配備有攪棒之圓底瓶，及溶解於5毫 升DMSO。於其中加入金剛烷曱基胺（亞利希公司，0.147 毫莫耳，0.0243克）。所得溶液於室溫攪拌卜】、時。真空去 溶劑，殘餘物再度溶解於水。所得混合物對1〇〇〇 MWCO膜 (史佩查波爾）透析隔夜。然後溶液經凍乾獲得〇_49克乙婦 基石風- PEG34〇o_Ad。 步驟2 :轉移素-PEG-Ad(Tf-PEG-Ad)軛合物的合成 250毫克（3.21微莫耳）人類轉移素（乏鐵）（西格瑪-亞利 希公司）於10毫升0.1 Μ四硼酸鈉緩衝液（pH 9_4)之溶液添 加109毫克（32.1微莫耳）乙烯基碾-PEG34()()-Ad。所得溶液於 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X 297公釐） 90 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ΑΎ, 蒈- 〜U54 A7 _____B7_ 五、發明説明（87) 室溫攪拌2小時。PEG化轉移素使用山奇空ΥΜ-50,000 NMWI裝置（米利波公司）由未經反應之乙烯基颯 -pEG3400-Ad純化，以及使用疏水交互作用管柱丁基 650S(投索拜爾塞（Tosoh Biosep))由未經反應之轉移素純化 (藉HPLC及MALI-TOF分析證實）。 步驟3 :透過離胺酸基藉偶合合成之轉移素-PEG-Ad 之鐵載荷 阿朴轉移素及Tf-PEG-Ad根據實例55所述程序載荷 鐵。鐵載荷程度係如所述定量。透過離胺酸基藉偶合合成 的Tf-PEG-Ad之鐵載荷效率接近100%。 實例57 :轉移素-PEG-AD(透過離胺酸基藉偶合合成）對PC3 細胞之轉移素受體之結合親和力 PC3細胞以125,000細胞/毫升接種於6孔平板。24小時 後，細胞曝露於250 nM FITC-Tf混合各種濃度hTf， hTf-PEG-Ad(藉氧化hTf合成），hTf-PEG-Ad(藉VS-離胺酸反 應合成及純化）及hTf-(PEG-Ad)2(藉VS-離胺酸反應合成及 純化）。曝露20分鐘後，藉FACS測定攝取量。不似藉轉移 素氧化合成Tf-PEG-Ad，藉離胺酸偶合合成的Tf-PEG-Ad 化合物有效與FITC-Tf競爭PC3細胞表面之受體。結果示於 第24圖。 實例58 : Tf-改性複聚物之日塔電位 一份等容積12以3+/-電荷比添加至一份質體DNA(2微 克DNA，0·1毫克/毫升於水）而形成微粒狀複合物。全轉移 素或全-Tf-PEG-Ad( 17毫克/毫升於水）隨後添加至微粒狀 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21〇X297公釐） -91 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 参- 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（88 ) 複合物。粒子藉加入1 · 2毫升水稀釋，日塔電位經由於曰塔 帕爾（ZetaPals)動態光繞射儀器布魯克海文（Brookhaven)儀 器公司）測量。結果顯示於第25圖。未經改性全-轉移素藉 靜電交互作用結合微粒狀複合物。加入2毫微莫耳Tf/微克 DNA時，微粒狀複合物趨近於中性。全-轉移素-PEG-Ad(第 25圖標示為Tf-PEG-Ad)可能因靜電交互作用以及包涵化 合物交互作用而結合至微粒狀複合物。因此，全 -Tf-PEG-Ad與粒子之結合程度較高，如使用較高濃度全 -Tf-PEG-Ad改性粒子之日塔電位持續降低可證。於2毫微 莫Tf/微克，以全Tf-PEG-Ad改性之微粒狀複合物帶負電（日 塔電位約等於-7毫伏特）。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例59 : AD-Phos-PEG5_-半乳糖之合成
I.金剛烷膦酸2之合成。亞磷酸二苄酯（0.712克，2.71 毫莫耳）注入於無水四氯化碳經氬氣保護之1 -金剛烷甲基 胺（0.493克，2.98毫莫耳）。加入亞磷酸二苄酯後幾乎即刻 觀察得白色沉澱。溶液攪拌12小時。混合物内加入二氯甲 92 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _____B7_ 五、發明説明（89 ) 烷（30毫升）。有機相以稀酸性水（PH=4)洗兩次（2x 40毫 升）。然後有機相以硫酸鎂脫水。真空蒸發去除溶劑《所得 白色固體使用二氣曱烷及己烷之溶劑混合物結晶。獲得針 狀晶體（0.69克）1，60%產率。晶體使用l〇〇/0 Pd/C(200毫克） 使用15 psi壓力氫氣於乙醇（40毫升）接受氫化經歷16小 時。過濾去除催化劑。真空去除濾液溶劑。獲得2之定量產 率。所得化合物2未經進一步純化即供使用。 II. NH2-PEG5〇0()-半乳糖4之合成。FMOC-NH-PEG5000-NHS(西爾瓦特聚合物公司，760毫克，0.152毫莫耳）溶解於 DMSO(3.7毫升）。溶液内加入半乳糖胺（385毫克，1.52毫莫 耳）及二異丙基乙基胺（0.264毫升，1.52毫莫耳）於DMSO (14毫升）之溶液。溶液攪拌20分鐘，然後於水（4x 4升）使用 3500 MWCO膜（史佩查波爾7,史佩傳實驗室）透析24小時。 然後溶液經凍乾獲得745毫克FMOC-NH-PEG5(KKr半乳糖 3。3溶解於含哌啶（3毫升）之DMF( 12毫升）。溶液攪拌16小 時。然後於高度真空下去除DMF。所得固體内加入40毫升 水。藉離心去除白色固體。水溶液使用3500 MWCO膜（史 佩查波爾7，史佩傳實驗室）對水（4χ 4升）透析24小時。溶液 經康乾獲得625宅克NH2-PEG5000-半乳糖4。 III. 金剛烷-Phos-PEG5〇0。-半乳糖5之合成。4 (63毫 克，0.013毫莫耳）溶解於咪唑緩衝溶液（1毫升，0.1 N， pH=6.5)。溶液内加入2於乙腈（4毫升）之溶液，接著加入1-乙基-3-(3-二曱基胺基丙基）曱二醯亞胺鹽酸（EDC，1〇〇毫 克，40當量） 本纸張尺度適用中國國家標準（哪）A4規格（210X297公整） -93 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— .參- 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（9〇) 。溶液於室溫攪拌16小時。溶液使用3500 MWCO膜（史佩 查波爾7,史佩傳實驗室）對水（4x 4升）透析，然後凍乾獲得 實例60 : AD-G1u-G1u-PEG5_-半乳糖之合成
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I. H-Glu-Glu-金剛烷7之合成。H-Glu(Bn)-OH (3.55 克，15毫莫耳）溶解於含碳酸氫鈉（1.26克，15毫莫耳）水（16 毫升）。混合物内加入2-〇111(811)-〇811(4.68克，10毫莫耳) 於THF(30毫升）。混合物内又加入30毫升THF，20毫升乙腈 然後2N氫氧化鈉10毫升。溶液於室溫攪拌16小時。於高度 真空下蒸發去除THF及乙腈。水性混合物内加入1N鹽酸將 pH調整至3。觀察沉澱。混合物以氣仿（3x 30毫升）萃取。 有機相以硫酸鎂脫水。藉過濾去除硫酸鎂。有機溶劑經蒸 發獲得白色沾黏固體6。6未經進一步純化即用於次一步驟。 6 (3.51克，6.1毫莫耳）溶解於無水THF (40毫升）。溶 液内加入1-金剛烷曱基胺（1.007克，6.1毫莫耳），1-羥苯并 三唑（0_93克，6_1毫莫耳），DCC(1_32克，6.4毫莫耳），及 二異丙基乙基胺（1.06毫升，6.1毫莫耳），此種添加係於氬 94 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 -------- B7__ 五、發明説明（9i ) 下於0C進行。然後混合物溫熱至室溫及攪拌隔夜。過濾出 >儿;殿。真空去除THF獲得黃色固體。黃色固體於曱醇結晶 獲知板晶6 (2_1克’ 49%)。然後6溶解於40毫升甲醇，於氫 化裝置於200毫克Pd/c存在下，於25-30 psi氫氣下振搖。24 小時後過渡去除催化劑。真空去除曱醇後獲得h_g1u_ Glu-AD 7，定量產率。7未經進一步純化即供使用。 II· AD_Glu-G丨u-PEG5_-半乳糖9之合成。乙烯基颯 (VS)-PEG5〇00-NHS(西爾瓦特公司，423毫克，0.085毫莫耳) 及半乳糖胺（216毫克，〇·85毫莫耳）添加至Pbs溶液（2.252 亮升，lx ’ pH 7.2)。溶液攪拌1小時，然後使用35〇〇 MWCO 膜（史佩查波爾7，史佩傳實驗室）於水（4χ 4升）透析24小 時。然後溶液經凍乾。產物8使用MALDI-TOF及HPLC分 析。8溶解於硼砂緩衝液（6毫升，〇.1 Ν，pH 9.4)。化合物7 (121毫克）溶解於DMSO溶液（2毫升），然後添加至聚合物溶 液。混合物於35°C攪拌16小時，然後於50。(：攪拌7小時。 HPLC用於監視此種反應。聚合物使用3500 MWCO膜透析 及凍乾獲得419毫克AD-Glu-Glu-PEGwoo-半乳糖9，90%產 率0 貫例 61 · AD-GIu-GIu-PEGsggo之合成 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
95 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X297公釐） 叫 1054 A7 ~_______B7__ 五、發明説明（92) AD-G1u-G1u-PEG5000 10之合成。peg5_-spa(西爾瓦 特公司，300毫克，0.06毫莫耳）及7溶解於DMSO(2毫升）及 乙腈（1毫升）。混合物於室溫授拌24小時。然後溶液使用 3500 MWCO膜（史佩查波爾7，史佩傳實驗室）於水（4X 4升） 透析24小時。溶液經凍乾獲得276毫克Ad-Glu-Glu-PEG5_ 10。10經MALDI-TOF MS，HPLC及NMR證實。 實例62 :轉移素及PEG改性複聚物之調配 複聚物（聚合物對DNA電荷比3+/-)以Tf-PEG-AD(或 Tf-(PEG-AD)2)及PEG-AD(或PEG-Glu-Glu-AD)改性，調配 如後。各組成分皆使用等容積。Tf-PEG-AD(或 Tf-(PEG-AD)2)於水添加至12於水溶液。混合溶液内加入定 量PEG-AD(或PEG-Glu-Glu-AD)。然後聚合物之三元混合 物添加至DN A溶液。溶液藉滴量溫和混合，如前述穩定測 定粒徑、日塔電位及鹽安定性。粒子之日塔電位係藉改變 Tf-PEG-AD(或 Tf-(PEG-AD)2)相對於 PEG-AD(或 PEG-Glu-Glu-AD)之相對比例調整。部分日塔電位變化及 粒徑呈粒子改性之函數之變化顯示於第27、27及28圖。 實例63 :金剛烷·陰離子性肽-PEG3400-半乳糖/葡萄糖 (AD-pep-PEG-gal/glu)。陰離子性狀（序列：E-A-E-A-E-A-E-A-C)係使用自動合成儀藉生物聚合物合成設施（貝克曼研 究所，加州技術研究院）合成。由樹脂割裂肽之前，金剛烷 -羧酸（ACA，亞利希公司）使用DCC偶合化學而軛合至肽之 〜終端。結果所得肽（八〔八4-八-£-八-£-八-£-八-(：，]^\¥ 1084) 由樹脂割裂且藉Maldi-TOF分析。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） .96 - (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) -、可| 乂川54 A7 B7 五、發明説明（93 ) 半乳糖-及葡萄糖-PEG3400-乙烯基碼（ga丨/glu PEG__vs) 經由NHS-PEG34〇0-VS(西爾瓦特聚合物公司）與20當量葡萄 糖胺或半乳糖胺（西格瑪公司）於填酸鹽緩衝鹽水，pH 7.2 於室溫反應2小時製備’產率約95%。溶液對水徹底透析然 後凍乾。陰離子性肽之硫醇（2當量）與半乳糖-PEG34〇q-VS 或葡萄糖-PEG3400-VS於含1〇 mM TCEP之50 mM硼酸鈉缓 衝液（pH 9.5)反應。溶液經酸化，藉離心去除沉澱肽（低於 pH 9.0為不可溶）。收集上清液，徹底透析及凍乾。藉 Maldi-TOF分析證實為所需產物（示意顯示如後）。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Na+O
AD-pep-PEG-半乳糖
-、tT· .0, AD-pep-PEG-葡萄糖 實例64:召CDP6-PEG3400之製備 20.3毫克12 (召CDP6)(3微莫耳）及10當量FMOC-PEG3400-NHS (190毫克，60微莫耳，西爾瓦特聚合物公司） 97 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1321054 A7 _B7_ 五、發明説明（94) 添加至配備有磁攪棒之玻璃瓶且溶解於1毫升50 mM碳酸 氫鈉，pH 8.5。溶液於室溫於暗處攪拌20小時，然後凍乾。 固體溶解於0.5毫升20%哌啶於DMF，及攪拌30分鐘進行 FMCO脫保護。真空去除溶劑，其餘黏稠溶體溶解於水， pH以0.1 Μ鹽酸調整至低於6.0。藉TNBS胺定量證實完全 PEG偶合及FMOC脫保護。聚合物藉陰離子交換層析術及 凍乾而由未反應之PEG分離獲得白色絮狀粉末。
pCDP6-PEG34〇o (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
HlN、一又 須了解前文討論及實例僅供詳細說明某些較佳具體 實施例。熟諳技藝人士須了解可未悖離本發明之精髓及範 圍作出多種修改及相當變化。前文討論及引用之全部專利 案、期刊文章及其它文獻全文皆以引用方式併入此處。 98 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1321054 修正 六、申請專利範圍 第90131376號專利·再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：97年3月 1. 一種如下式之化合物 Η 主/賓 I5 Η / 1 -(peg)x -Lb 」Z 官能基團 w 其中 J^-NH- ' -C(=0)NH-(CH2)d- ^ -NH-C(=0)-(CH2)d--CH2SS—、-C(=0)0-(CH2)e-0-P(=0)(0—(CH2)e-Y)0-、 Os PEG I ,〇 < 〇 NH
Ο H 、 一肽或多狀殘基，或 -NH(C=0)-CH(R1)-NH-(C=0)-CH(R')-NH-; Y係一額外的主/賓官能基團； R1係-(CH2)a-C02H，一其酯類或鹽類；或 -(CH2)a-CONH2; PEG 係-0(CH2CH20)m-，其中 m 由 2 至 500 變化； 99 1321054
六、申請專利範圍 L #,-NH- ' 'NH-(C=0)-(CH2)e-(C=0)-CH2- -S(=0)2-HC=CH2---SS---C(=0)0-或碳水化合物 殘基； a係0或1; b係0或1;
d係於〇至6之範圍中； e係於1至6之範圍中； η係於〇至6之範圍中； q係於1至5之範圍中； w係於1至5之範圍中； y係1; X係1;以及 z係於1至5之範圍中。
2.如申請專利範圍第！項之化合物，其中 q係1 ; w係1;以及 z is 1 ° 3·如申請專利範圍第1項或第2項之化合物，其中該主/賓 體係選自於金剛烷基、萘基、膽固醇、環糊精或任何其 等之組合。 4’如申請專利範圍第1或2項之化合物，其中
-100 - 1321054 六、申請專利範圍
一種聚合物； 一種治療劑；以及 該聚合物與一種複合劑之包涵複體， 其中該包涵複體包含一官能基團且該聚合物具有主官 能基。 6. 如申請專利範圍第5項之組成物，其中該複合劑具有賓 官能基。 7. 如申請專利範圍第5項之組成物，其中該複合劑具有主 官能基。 8. 如申請專利範圍第5-7項中任一項之組成物，其中該聚 合物具有主及賓官能基，且包含具有賓及主官能基之複 合劑混合物。 9. 如申請專利範圍第5-7項中任一項之組成物，其中該主 官能基係選自於環糊精、卡色命（carcerand)、卡維坦 (cavitand)、冠_、克利普坦（cryptand)、久久必塔 (cucurbituril)、卡利瑟林（calixarene)、沙芙余（spherand) 或其等之任一組合物。 六、申請專利範圍 如申睛專利範圍第5-7項中任一項之組成物，其中該複 合劑進一步包含一個間隔基。 11·如申請專利範圍第5項之組成物，其中該賓官能基係選 自金剛烷、二金剛烷、萘及膽固醇。 12·如申請專利範圍第6項之組成物，其中該賓官能基係選 自金剛烷、二金剛烷、萘及膽固醇。 13·如申請專利範圍第7項之組成物，其中該賓官能基係選 自金剛烷、二金剛烷、萘及膽固醇。 14·如申請專利範圍第5項之組成物，其中該主官能基為環 糊精以及該賓官能基為金剛烷或二金剛烷。 15.如申請專利範圍第6項之組成物，其中該主官能基為環 糊精以及該賓官能基為金剛烷或二金剛烷。 M·如申請專利範圍第7項之組成物，其中該主官能基為環 糊精以及該賓官能基為金剛烷或二金剛烷。 17·如申請專利範圍第5項之組成物，其中該官能基團係選 自於配體、核局限信號、内囊胞釋放肽、内囊胞釋放聚 合物、第二治療劑、安定性聚合物/或安定用親水聚合 物、一間隔基或其組合物；以及該間隔基係選自於：直 接鍵聯、磷酸基、聚乙二醇及短陰離子肽序列。 18.如申請專利範圍第6項之組成物，其中該官能基團係選 自於配體、核局限信號、内囊胞釋放肽、内囊胞釋放聚 合物、第二治療劑、安定性聚合物/或安定用親水聚合 物、一間隔基或其組合物；以及該間隔基係選自於：直 接鍵聯、填酸基、聚乙二醇及短陰離子肽序列。 1321054 六 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 、申請專利範圍 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該官能基團係選 自於配體、核局限信號、内囊胞釋放肽、内囊胞釋放聚 合物、第二治療劑、安定性聚合物/或安定用親水聚合 物、一間隔基或其組合物；以及該間隔基係選自於：直 接鍵聯、構酸基、聚乙二醇及短陰離子肽序列。 如申請專利範圍第5項之組成物，其中該治療劑係選自 抗生素、類固醇、聚核苷酸、小分子藥物'病毒、質體、 狀、狀片段、螯合劑、蛋白質或其任一組合物。 如申請專利範圍第6項之組成物，其中該治療劑係選自 抗生素、類固醇、聚核苷酸、小分子藥物、病毒、質體、 肽、肽片段、螯合劑、蛋白質或其任一組合物。 如申清專利範圍第7項之組成物，其中該治療劑係選自 抗生素、類固醇、聚核音酸、小分子藥物、病毒、質體、 月太、肽片段、螯合劑、蛋白質或其任一組合物。 如申請專利範圍第5項之組成物，其中該治療劑為聚核 皆酸。 如申請專利範圍第6項之組成物，其中該治療劑為聚核 芽酸。 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該治療劑為聚核 势酸。 如申請專利範圍第5項之組成物，其中該聚合物係含環 糊精之聚合物且該複合劑進一步包含一種選自金剛烷 及二金剛烷之包涵賓體。 如申*奢專利範圍第26項之組成物，其中該治療劑係選自 27. 1321054 六、申請專利範圍 抗生素、類固醇、聚核芽酸、小分子藥物、病毒、質體、 肽、肽片段、螯合劑、生物活性巨分子或其等之任一組 合物。 28.如申請專利範圍第27項之組成物，其中該治療劑為聚核 苷酸。 29·如申請專利範圍第5-7及11-28項中任一項之組成物，其 中該複合劑為一如下式之化合物：
~LPEGx )
其中 J 係-NH-、-C(=〇)NH-(CH2)d-、 、NH-C(=0)-(CH2)d-、-CH2SS-、 'C(=〇)〇_(CH2)e-〇_p(=〇)(〇_(CH2)e-Ad)0- ' 1321054 六、申請專利範圍 PEG
-NH(C=0)-CH(R1)-NH-(C=0)_CH(R1)-NH-; Ad係金剛烷基； R1係-(CH2)a-C02H ’其酯類或其鹽類；或 -(CH2)a-CONH2; PEG 係-0(CH2CH20)z-，其中 z 由 2 至 300 變化； L 係-NH-、-NH-(C=0)-(CH2)e-(C=0)-CH2、 -S(=0)2-HC=CH2-、-SS-、-c(=0)0-或碳氫化合物 之殘基； a係0或1; b係〇或1; d係於〇至6之範圍中； e係於1至6之範圍中； n係於0至6之範圍中； y係1;以及 X係1 〇 30.如申請專利範圍第5項之組成物，其中該聚合物係含環 糊精聚合物，且該複合劑進一步包含一包涵賓體，其中 105
六、申請專利範圍 該複合劑係一如申請專利範圍第1·2項中任一項之化合 物。 31. 如申請專利範圍第30項之組成物，其中該治療劑係選自 於一抗生素、類固醇、聚核苷酸、小分子藥物、病毒、 質體、狀、狀片段、螯合劑、以及生物活性巨分子或其 等之任一組合物。
32. 如申請專利範圍第3〇項之組成物其中該治療劑係聚核 苦酸。 33· —種製備如申請專利範圍第5_7項中任_項之組成物之 方法，包含下式步驟： 組合該治療劑、該聚合物、及該複合劑以形成組成 物，其中該聚合物及該治療劑形成微粒狀複合物，以及 該聚合物及該複合劑形成包涵複體。 34, 如申請專利範圍第33項之方法，其中該治療劑首先與該 聚合物組合以形成該微粒狀複合物，然後該微粒狀複合
物與該複合劑組合以使得該聚合物與複合劑形成包涵 複體。 35. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該聚合物首先與該 複合劑組合以形成包涵複體，然後該包涵複體與該治療 劑組合以使得該聚合物與該治療劑形成該微粒狀複合 物。 36.如申請專利範圍第5-7、11-28及30-32項中任一項之組 成物，其中該官能基團包括一部份，相較於僅有該聚合 物以及治療劑之組成物，該部分在生物條件下安定化組 106 六、申請專利範圍 成物。 37·如申請專利範圍第5-7、n-28及30-32項中任一項之組 成物其中該g能基團包括一治療劑可逆的結合於該複 合劑。 38·如申請專利範圍第5-7、U-28及30-32項中任一項之組 成物其中該聚合物包含至少一主部分，該主部分與該 複合體之至少一賓部份形成一包涵複體。 Μ.如申請專利範圍第5-7、11-28及30-32項中任一項之組 成物其中该聚合物包含至少一賓部分，該賓部分與該 複合物之至少一主部分形成一包涵複體。 40. 如申請專利範圍第5項之組成物其中該聚合物係一含 環糊精聚合物。 41. 如申凊專利範圍第4〇項之組成物其中該含環糊精聚合 物包含一線性含環糊精聚合物，其中環糊精部分係存在 於該聚合物之主鏈中。 42. 如申請專利範圍第4〇項之組成物其該含環糊精聚合物 含有至少一環糊精部分於該含環糊精聚合物之旁出或 支鍵 43. 如申請專利範圍第5_7、u_28、3〇 32及4〇_42項中任一 項之組成物，其中該複合劑包含至少一聚合物部分。 44. 如申請專利範圍第43項之組成物，其中該複合物之至少 一聚合物部分包含PEG或其衍生物。 45·如申請專利範圍第5-7、11-28、30-32及40-42項中任一 項之組成物，其中該官能基團包含至少一聚合物部
46·如申請專利範圍第10項之組成物，其中該間隔基包含至 少一聚合物部分β 47·如申請專利範圍第5-7、U-28、30-32及40-42項之組成 物，其中該聚合物、治療劑以及複合物係獨立的分子。 48·如申請專利範圍第5-7、11-28、30-32及40-42項中任一 項之組成物，當其被製備時係藉由如申請專利範圍第 33-3 5項中任_項之方法。 49. 一種如申請專利範圍第1或2項之化合物或如申請專利 範圍第5-7 ' U_28、30-32及40-42項中任一項之組成物 供製造一藥物用之用途，該藥物係用於投予至一被認定 需要該藥物之非人類動物中。 50. 種如申凊專利範圍第1或2項之化合物或如申請專利 範圍第5-7、11_28、30-32及40-42項中任-項之組成物 供製造一藥物用之用途，該藥物係用於投予一被認定需 要該藥物之人中。
108
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