KR102286453B1 - 베타-사이클로덱스트린을 통한 호스트-게스트 상호작용에 의해 온도감응성 폴리포스파젠에 결합된 생리활성 물질을 포함하는 하이드로젤 포접 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

베타-사이클로덱스트린을 통한 호스트-게스트 상호작용에 의해 온도감응성 폴리포스파젠에 결합된 생리활성 물질을 포함하는 하이드로젤 포접 복합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 호스트 분자가 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및 게스트 분자가 연결된 생리활성 물질을 포함하는, 하이드로젤 조성물로서, 상기 호스트 분자에 상기 게스트 분자가 호스트-게스트 상호작용(host-guest interaction)에 의하여 포접(inclusion)되어 상기 폴리포스파젠과 상기 생리활성 물질이 컨쥬게이트를 형성하는 것인, 하이드로젤 조성물에 관한 것이다.
본원의 하이드로젤 조성물이 생체 내에 투입될 경우 생리활성 물질을 서서히 방출하며 줄기세포 분화에 유리한 조건을 제공한다. 뿐만 아니라, 줄기세포의 특정 분화에 적합하도록 생리활성 물질의 종류, 비율 및 배열이 제어된 본원의 하이드로젤 조성물을 높은 재현성으로 제조될 수 있다.

Description

베타-사이클로덱스트린을 통한 호스트-게스트 상호작용에 의해 온도감응성 폴리포스파젠에 결합된 생리활성 물질을 포함하는 하이드로젤 포접 복합체 및 이의 용도{Hydrogel inclusion complex comprising physiologically active materials bound to thermosensitive polyphosphazene by host-guest interaction using β-cyclodextrin and use thereof}
본 발명은 온도감응성 폴리포스파젠에 치환된 베타-사이클로덱스트린을 통한 호스트-게스트 상호작용에 의해 생리활성 물질이 결합된 하이드로젤 포접 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
조직 재생의 목적으로 신 조직을 구축하기 위한 생체적합성 물질로서, 생접합 기술을 기반으로 하는 나노 입자, 탈세포화된 매트릭스, 하이드로젤과 같은 수많은 물질들이 이용되고 있다. 이러한 재료들 중에서 하이드로젤은 엄청난 양의 물 흡수능력, 높은 생체 적합성, 생체 조직 유사성으로 인해 조직 공학에 있어 훌륭한 소재이다. 구체적으로, 폴리(락트산-글리콜산) 유도체, 폴리(락트산) 유도체, 히알루론산, 폴리우레탄 아크릴레이트, 및 많은 다른 생의학 폴리머들과 같은 합성 하이드로젤은 생리활성 물질과 줄기세포 모두를 이용한 조직 재생에 사용되고 있다.
생체에 이식되어 원하는 방향으로 조직 재생이 나타나도록, 생체 적합성 물질을 미세-조정하려는 노력이 이루어지고 있다. 미세-조정된 생체 적합성 물질은 물리적 화학적 측면 모두에서 잘 조절된 물질을 의미한다. 이러한 생체 적합성 물질의 미세-조정은 다양한 치료적 관점, 예를 들어 약물 전달 시스템의 증가된 치료적 기회 제공, 면역 요법의 효능(자가 면역 반응 또는 면역 독성을 회피하기 위한), 질병 특이적 표적화, 및 재생공학을 위한 적절한 줄기세포 자극에서 요구된다. 일반적으로, 생체 적합성 물질의 물리적 제어는 세포 특성이나 치료 약물 방출 패턴에 영향을 주는 기계적 특성 제어 및 미세구조 제어를 의미한다. 생체 적합성 물질의 화학적 제어는 화학적 결합을 제어하는 것을 의미하며, 구체적으로 두 분자 사이의 화학적 연결은 생접합(bio-conjugation)으로 불린다(Kalia J, Raines RT. Advances in Bioconjugation., Current organic chemistry14, 138-147 (2010)). 생접합 기술은 생재료에 있어 화학적 분해로 인한 구조 안정화, 향상된 체내 체류 시간 및 면역원성의 감소와 같은 장점을 제공하지만, 독성 문제, 낮은 재현성, 및 복잡한 합성과정과 같은 문제가 있다. 특히, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 구리(I) 촉매화 아지드 알킨 고리화(CuAAC), 및 자유라디칼의 사용으로 인한 화학적 선택성이 높기 때문에 이러한 그룹의 잔류물에 대한 독성의 위험이 높다(Spicer CD, Pashuck ET, Stevens MM. Achieving Controlled Biomolecule-Biomaterial Conjugation. Chemical reviews118, 7702-7743 (2018)). 또한, 낮은 재현성으로 인해 생체 적합성 물질의 미세조정이 어렵다.
특히, 생리활성 물질을 함유하는 하이드로젤을 사용하여 줄기세포의 분화를 조절하려는 시도가 이루어지고 있다. MSC의 증식 및 분화를 위한 작은 화학물질, 단백질, 및 펩타이드와 같은 다양한 생활성 분자가 있다. MSC 단독의 투여는 원하는 계통으로 분화시키기 어렵고 가혹한 환경에서 생존하기 어렵기 때문에 이러한 하이드로젤 및 생체 활성 분자의 도움이 이상적인 조직 재생을 위해 필수적이다. 최근, MSC를 이용하여 조직 재생을 하기 위한 다양한 접근법이 원하는 MSC 분화를 위한 여러 종류의 단백질을 사용하여 연구되었다. 그러나, 줄기세포, 생활성 분자, 및 하이드로젤의 물리적 화학적 제어를 통하여도 줄기세포 분화의 미세한 조절은 여전히 만족할 수준으로 달성되지 못하고 있다.
한편, 호스트-게스트 상호작용은, 두 개 이상의 분자가 분자-자기 인식 시스템의 독특한 구조 인식을 통해 비공유 결합의 복합체를 형성하는 것이다. 사이클로덱스트린(CD), 크라운 에테르 류, 사이클로판류(cyclophanes), 크립탄드류 (cryptand), 및 쿠커비투릴류(Cucurbituril)와 같은 많은 매크로사이클릭 호스트 분자가 있다. 이러한 호스트 분자들 중에서 사이클로덱스트린은 독성이 적고 면역원성이 낮기 때문에 조직공학적 또는 생물학적 응용에 적합하다. 산업 및 연구 영역에서 주로 활용되고 유명한 사이클로덱스트린은, α-, β-, 및 γ-CD이다. 무엇보다 β-CD는 변형 후 높은 수용성, 게스트 분자 로딩을 위한 우수한 내부 공동 크기 및 상대적으로 저렴한 비용 때문에 탁월한 분자이다. β-CD를 이용한 호스트-게스트 상호작용은 초분자 구조를 쉽게 만들 수 있는 생체적합 물질에 여러 가지 이점을 제공하며, 제조과정에 있어 다수의 합성단계 및 복잡한 정화 과정을 피할 수 있다. 실제로 β-CD는 수십년 동안 약물 전달 시스템, 진단 응용, 및 조직공학과 같은 다양한 생의학 응용에 사용되어 왔다.
그러나, 현재까지 온도감응성 폴리포스파젠과 같은 하이드로젤에 호스트-게스트 상호작용을 이용하여 생리활성 물질을 도입하려는 시도는 이루어진 바 없다. 이러한 상황에서 본 발명자들은 β-CD를 함유한 폴리(오가노포스파젠){poly(organophosphazene)}의 3D 하이드로젤에 여러 종류의 생리활성 인자의 조절을 위한 호스트-게스트 상호작용을 도입하고자 시도하였다. PPZ는 수십 년 동안 본 발명자들에 의해 생체 적합성 및 열 감응성을 갖는 하이드로젤로 개발된 바 있고(공개특허공보 20050012533A 및 10-2008-0110472 A 등 참조), 화학약물, 단백질, 및 유전자와 같은 치료학적으로 의미있는 약물을 전달할 수 있다.
본 발명자들은 β-CD PPZ의 합성에 성공하여, 생접합 시스템의 한계를 극복하기 위해 β-CD PPZ의 생활성 게스트 분자의 화학량론적 제어를 연구하였다. 호스트에서 다양한 게스트 분자 비율의 조합을 통해, β-CD PPZ의 추가 합성 배치 없이 하이드로젤을 생성하는 기능적으로 다양한 게스트 분자를 형성하였고, 줄기세포 등에 적용시켜 미세하게 분화를 조절할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 호스트 분자로서 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD)이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및 게스트 분자로서 아다만틴(adamantine), 아조벤젠(azobenzene), 콜레스테롤(cholesterol), tert-부틸(tert-butyl), 사이클로헥실 에스테르(cyclohexyl ester), 및 나프틸(naphthyl)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가 직접 또는 링커를 통해 연결된 생리활성 물질을 포함하는, 하이드로젤 복합체로서, 상기 베타-사이클로덱스트린에 게스트 분자가 호스트-게스트 상호작용(host-guest interaction)에 의하여 포접(inclusion)되어 전체 또는 일부 베타-사이클로덱스트린에서 컨쥬게이트를 형성하는 것인, 하이드로젤 포접 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및 게스트 분자로서 아다만틴, 아조벤젠, 콜레스테롤, tert-부틸, 사이클로헥실 에스테르, 및 나프틸로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가가 직접 또는 링커를 통해 연결된 줄기세포-분화조절 인자;를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 분화 조절용 하이드로젤 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및 게스트 분자로서 아다만틴, 아조벤젠, 콜레스테롤, tert-부틸, 사이클로헥실 에스테르, 및 나프틸로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가가 직접 또는 링커를 통해 연결된 IL-2;를 유효성분으로 포함하는, 암세포 증식 또는 전이 억제용 하이드로젤 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태로서, 본 발명은 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 호스트 분자로서 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD)이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및 게스트 분자로서 아다만틴(adamantine), 아조벤젠(azobenzene), 콜레스테롤(cholesterol), tert-부틸(tert-butyl), 사이클로헥실 에스테르(cyclohexyl ester), 및 나프틸(naphthyl)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가 직접 또는 링커를 통해 연결된 생리활성 물질을 포함하는, 하이드로젤 복합체로서, 상기 베타-사이클로덱스트린에 게스트 분자가 호스트-게스트 상호작용(host-guest interaction)에 의하여 포접(inclusion)되어 전체 또는 일부 베타-사이클로덱스트린에서 컨쥬게이트를 형성하는 것인, 하이드로젤 포접 복합체를 제공한다.
본원의 '하이드로젤(hydrogel)'은 수용액 중에 존재하는 고분자로부터 형성된 3차원 망상 구조를 지칭하는 것으로서, 보통 공유결합에 의한 화학적 가교에 의하여 형성되는 것과 분자들 사이의 물리적 상호작용에 의한 물리적 가교에 의하여 형성되는 것으로 구분된다. 본원의 하이드로젤은 기본적으로 온도감응성 폴리포스파젠의 기본 골격을 가지고 있으며, 여기에 호스트 분자가 치환되어 있고 상기 호스트 분자와 호스트-게스트 상호작용을 하며, 생리활성 물질이 연결되는 게스트 분자가 상기 폴리포스파젠과 컨쥬게이트를 형성한다. 상기 하이드로젤 조성물은 체내에 주입될 수 있는 생체 적합성 물질이다.
본원에서 '온도감응성'은 낮은 온도에서는 고분자 수용액이 액상(sol)을 유지하나 온도 상승에 따라 고분자 수용액이 젤(gel)로 변하는 성질을 의미한다. 구체적으로, 실온에서는 액상을 나타내며, 35℃ 내지 37℃ 이상의 온도에서 젤 상태로 변하는 성질을 의미한다.
본원의 하이드로젤은 체내에 투입되어 체온에 의해 3차원 구조의 젤을 형성함에 따라, 액상으로 주입하기가 용이함과 동시에 젤상이 되어 약물을 천천히 방출할 수 있는 장점이 있다. 또한, 젤상에서 줄기세포의 분화에 적합한 니치(niche: 미세환경)를 형성할 수 있다. 예컨대, 줄기세포를 단순 주입하는 경우, 비특이적으로 전신에 퍼지는 현상이 일어나는 반면, 줄기세포를 젤과 혼합된 상태로 주입하는 경우, 원하는 부위를 표적화하여 줄기세포를 전달 및 머무르게 하는 등 단순히 주입을 용이하게 할 뿐만 아니라 원하는 부위에 국소 전달하는데 도움을 줄 수 있다.
본원의 '폴리포스파젠'은 온도감응성을 나타내도록 소수성 아미노산 및 친수성 고분자가 치환된다. 구체적으로, 디클로로포스파젠 선형고분자에 소수성 아미노산 에스테르와 친수성 분자량 350 내지 2500 범위의 메톡시폴리에틸렌글라이콜이 도입되고, 고분자의 분해 속도를 조절할 수 있는 아미노산, 펩타이드 또는 뎁시 펩타이드 에스테르가 일부 도입될 수 있다. 또한, 곁가지에 하이드록시기, 아마이드기, 아미노기, 티올기 또는 카복실기와 같은 관능기를 갖는 치환체를 직접 고분자 주쇄에 도입하거나 상기 관능기를 보호기로 치환한 아미노산 에스테르 또는 펩타이드 에스테르를 고분자 주쇄에 도입한 후, 보호기를 떼어내거나, 상기 관능기를 갖는 치환체가 도입된 고분자를 다른 관능기로 전환하는 방법으로 본 발명의 포스파젠계 고분자에 관능기가 도입될 수 있다. 본원의 온도감응성 폴리포스파젠은 공지된 것을 사용할 수 있다(공개특허공보 20050012533A 및 10-2008-0110472 A 등 참조). 이때, 상기 온도감응성 폴리포스파젠은 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린을 (55 내지 80) : (5 내지 25) : (5 내지 20)의 몰비율로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 소수성 아미노산은 NHCH(R1)CO2R2의 구조를 가지며, R1은 H, CH3, CH2SH, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)C2H5, CH2CH2SCH3, CH2C6H5, CH2C6H4OH 및 CH2C2NH2C6H4로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, R2는 H, CH3, C2H5, C3H7, C4H9, CH2C6H5 및 CH2CHCH2로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
상기 친수성 고분자는 분자량이 550 - 2500 범위인 폴리알킬렌글리콜일수 있으며, 구체적으로 폴리에틸렌글리콜, 모노메톡시 폴리에틸렌글리콜, 또는 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 블록 공중합체일 수 있다. 상기 폴리알킬렌글리콜의 알킬렌 반복단위의 수는 7 내지 50일 수 있다.
상기 소수성 아미노산 및 친수성 고분자의 종류나 치환된 양, 및 폴리포스파젠의 농도 등을 조절하여 폴리포스파젠의 젤화 온도, 젤 강도, 및/또는 생분해 속도 등을 조절할 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산의 조성이 증가할 경우 젤화 온도를 낮출 수 있으며, 폴리포스파젠의 농도가 증가할수록 젤화온도는 낮아지고 젤 강도는 증가하게 된다. 또한, 친수성 고분자의 사슬의 길이가 증가할수록 젤 강도가 증가하고 젤화온도가 높아진다.
본원의 생리활성 물질이 결합된 하이드로젤 포접 복합체는 '호스트-게스트 상호작용(host-guest interaction)'을 통해 게스트 분자와 연결된 생리활성 물질을 체내에 전달한다. '호스트-게스트 상호작용'은, 두 개 이상의 분자가 분자-자기 인식 시스템의 독특한 구조 인식을 통해 비공유 결합의 복합체를 형성하는 것이다. 호스트-게스트 상호작용에 의한 컨쥬게이트는 공유 결합에 의한 컨쥬게이트와 비교하여 합성이 복잡하지 않고 재현성이 보장된다. 본원의 실험예 1 및 4에 따르면, 혼합 전에 준비된 게스트 분자의 함량 및/또는 비율에 비례하여 특이적인 컨쥬게이트가 생성되었음을 알 수 있었다. 이와 같이 호스트-게스트 상호작용을 이용한 결과 폴리포스파젠의 표면에 부착된 생리활성 물질의 함량 및/또는 비율을 손쉽게 조절할 수 있다. 더욱이, 체내에서는 호스트 분자가 연결된 부위가 분해됨에 따라 게스트 분자가 연결된 생리활성 물질이 천천히 방출될 수 있다.
본원에서 용어, '호스트 분자'는 게스트 분자를 포획할 수 있는 임의의 물질을 뜻하는 것으로, 소수성 공동(cavity)을 가지며 친수성 표면을 갖는다. 구체적으로 본원의 생리활성 물질이 결합된 하이드로젤은 호스트 분자로서 베타-사이클로덱스트린을 포함한다. 상기 베타-사이클로덱스트린은 독성이 적고 면역원성이 낮기 때문에 조직공학적 또는 생물학적 응용에 적합하다.
본원에서 용어, '게스트 분자'는 호스트 분자의 동공에 포접되는 분자를 의미한다. 호스트 분자의 동공은 소수성을 나타내므로, 게스트 분자 또한 소수성을 나타내며, 동공에 포접되기에 적합한 크기의 물질이 사용될 수 있다. 예컨대, 본원의 하이드로젤 포접 복합체는 호스트 분자로서 베타-사이클로덱스트린을 포함하는 바, 게스트 분자로는 이에 특이적으로 상호작용할 수 있는 아다만틴(adamantine), 아조벤젠(azobenzene), 콜레스테롤(cholesterol), tert-부틸(tert-butyl), 사이클로헥실 에스테르(cyclohexyl ester), 나프틸(naphthyl) 또는 이들의 조합을 포함하는 것이 바람직하다. 이때, 게스트 분자는 생리활성 물질의 활성을 촉진하도록 추가적인 변형이 가능하다.
본원에서 용어, '생리활성 물질'은 체내 또는 세포 내에 주입되어 활성을 나타내는 물질을 의미한다. 단백질, 펩타이드, 백신, 유전자, 호르몬, 항암제 및 신생혈관억제제로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
상기 단백질은 엑센딘-4(exendin-4), 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO), 인터페론-알파, 인테페론-베타, 인터페론-감마, 성장호르몬(인간, 돼지, 소 등), 성장 호르몬 방출 인자(growth hormone releasing factor), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor), GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), M-CSF(macrophage-colony stimulating factor), 혈액 응고 인자(blood clotting factor), 인슐린, 옥시토신, 바소프레신, 부신 피질 자극 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 섬유아 세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 변환 성장 인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 신경 성장 인자(nerve growth factor), 뇌신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 뉴로트로핀-3(neurotrophin-3, NT-3), 뉴로트로핀-4/5(neurotrophin-4/5), 프로락틴, 를리베린(luliberin), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(luteinizing hormone releasing hormone, LHRH), LHRH 작용제(agonists), LHRH 길항제(antagonists), 성장호르몬방출 억제인자(somatostatin), 글루카곤, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-11(IL-11), 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 유로가스트론(urogastrone), 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린(enkephalins), 엔돌핀(endorphins), 안지오텐신(angiotensins), 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(thyrotropin releasing hormone, TRH), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF), 종양 괴사 인자 관련 세포 자멸사 유발 리간드(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL), 헤파린 분해효소(heparinase), 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), hANP(human atrial natriuretic peptide), 글루카곤 유사 펩타이드(glucagon-like peptide, GLP-1), 레닌(renin), 브라디키닌(0bradykinin), 바시트라신(bacitracins), 폴리믹신(polymyxins), 콜리스틴(colistins), 티로시딘(tyrocidine), 그라미시딘(gramicidins), 사이클로스포린(cyclosporins), 뉴로텐신(neurotensin), 타키티닌(tachykinin), 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y, NPY), 펩타이드 YY(peptide YY, PYY), 혈관활성장내폴리펩타이드(vasoactive intestinal polypeptide. VIP), 및 하수체성 아데닐레이트 사이클레이즈-활성폴리펩타이드(pituitray adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 펩타이드는 상기 천연 단백질로부터 유래된 생체모방 펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드는 콜라젠 1 유래의 GFOGER 및 DGEA; laminin 유래의 YIGSR, SIKVAV, IKVAV, IKLLI, LRGDN, 및 SINNNR; laminin γ1 유래의 LRE, PDGSR, GTFALRGDNGQ, CFALRGDNP, NPWHSIYITRFG, TWYKIAFQRNRK, KAFDITYVRLKF, 및 LGTIPG; Fibronectin 유래의 GRGDS, PKRGDL, NGRAHA, GACRGDCLGA(cyclic), IDAPS, REDV, PHSRN, KQAGDV, LDV, WQPPRARI, SPPRRARV, LIGRKK, IWKHKGRDVILKKDVRFYC, KLDAPT, 및 PRARI; Vitronectin 유래의 CKKQRFRHRNRKG; Osteopotin 유래의 KRSR, FHRRIKA, CGGNGEPRGDTYRAY, SVVYGLR, 및 ELVTDFPTDLPAT; Elastin 유래의 VPGIG 및 VGVAPG; Collagen 4 유래의 MNYYSNS 및 CNYYSNS; Thrombospondin 유래의 CSVTCG, GRGDAC, FQGVLQNVRFVF, AELDVP, 및 VALDEP; Nidogen-1 유래의 GFRGDGQ 및 SIGFRGDGQTC; N-cadherin 유래의 HAV; 및 TGF-β1 유래의 FLPASGL, PWPLPYL, WGLLDLT, PAERLRS, RNLDGWS, NLSSSWI, TLPSNTH, MSAFPFL, SRLGQYI, PFGPLPP, TIASTLH, PRAPADV, 및 ESPLKRQ으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 백신은 간염 백신 등으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 백신일 수 있다.
상기 유전자는 짧은 간섭 리보헥산(samll interfernce RNA; siRNA), 플라스미드 디옥시리보헥산(plasmid DNA) 및 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드(antisense oligodeoxynucleotide; AS-ODN) 등으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
상기 호르몬은 테스토스테론(testosterone), 에스트라디올(estradiol), 프로게스테론(progesterone), 프로스타글란딘(prostaglandins) 및 이들의 합성 아날로그, 및 변형되거나 동일한 약효를 나타내는 물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 테가푸르(tegafur), 이리노테칸(irinotecan), 도세탁셀(docetaxel), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 셈시타빈(cemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 미토마이신 C(mitomycin C), 빈크리스틴(vincristine), 에토포사이드(etoposide), 메토트렉세이트(methotrexate), 토포테칸(topotecan), 타모시펜(tamoxifen), 비노렐빈(vinorelbine), 캄토테신(camptothecin), 다누오루비신(danuorubicin), 클로람부실(chlorambucil), 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 칼리케아미신(calicheamicin), 마이아탄신(mayatansine), 레바이솔(levamisole), DNA 재조합 인터페론 알파-2a(DNA recombinant interferon alfa-2a), 미토산트론(mitoxantrone), 니무스틴(nimustine), 인터페론 알파-2a(interferon alfa-2a), 독시플루리딘(doxifluridine), 포메스테인(formestane), 류프롤라이드 아세테이트(leuprolide acetate), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 카모포르(carmofur), 테니포사이드(teniposide), 블레오마이신(bleomycin), 카무스틴(carmustine), 헵타플라틴(heptaplatin), 엑세메스탄(exemestane), 아나스트로졸(anastrozole), 에스트라무스틴(estramustine), 카페시타빈(capecitabine), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 폴리사카라이드 칼륨(polysaccharide potassuim), 메드록시포게스테론 아세테이트(medroxypogesterone acetate), 에피루비신(epirubicin), 레트로졸(letrozole), 피라루비신(pirarubicin), 토포테칸(topotecan), 알트레타민(altretamine), 토레미펜 시트레이트(toremifene citrate), BCNU, 탁소텔(taxotere), 악티노마이신 D(actinomycin D), 아나스트로졸(Anasterozole), 벨로테칸(Belotecan), 이메티닙(Imatinib), 플록수리딘(Floxuridine), 젬시타빈(Gemcitabine), 하이드로시유리아(Hydroxyurea), 졸레드로네이트(Zoledronate), 빈크리스틴(Vincristine), 플루타마이드(Flutamide), 발루비신(Valrubicin), 스트렙토조신(Streptozocin), 폴리에틸렌글라이콜 접합 항암제 및 이들의 합성 아날로그, 및 변형되거나 동일한 약효를 나타내는 물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 물질일 수 있다.
상기 신생혈관억제제는 클로드로네이트(Clodronate),6-데옥시-6-데메틸-4-데디메틸아미노테트라시클린(6-deoxy-6-demethyl-4-dedimethylaminotetracycline; COL-3), 독시사이클린(Doxycycline), 마리마스타트(Marimastat), 2-메톡시에스트라디올(2-Methoxyestradiol), 스쿠알라민(Squalamine), SU5164, 탈리도미드(Thalidomide), TNP-470, 콤브레타스타틴 A4(Combretastatin A4), 소이 이소플라본(Soy Isoflavone), 엔자스타우린(Enzastaurin), CC 5013(Revimid; Celgene Corp, Warren, NJ), 셀레콕십(Celecoxib), ZD 6474, 할로푸지논 하이드로브로마이드(Halofuginone hydrobromide), 인터페론-알파, 베바시주맵(Bevacizumab), 상어연골추출물(AE-941), 인터루킨-12, 혈관 내피 성장 인자 트랩(VEFG-trap), 세툭시맵(Cetuximab), 레비마스타트(Rebimastat), 매트릭스 메탈로프로테이네이즈(MMP) 억제제(예컨대, BMS-275291(Bristol-Myers Squibb, New York, NY), S-3304 등), 프로테인 카이네이즈 C 베타 억제제(Protein kinase C beta inhibitor, 예컨대, LY317615), 엔도스타틴(Endostatin), 바탈라니브(vatalanib, PTK787/ZK 222584), 수니티니브 말레이트(sunitinib malate, SU11248), 실렌퀴타이드(cilenqitide, EMD-121974), 인간화 모노클로날 항체 MEDI-522, EOS-200-4, 인테그린 알파-5-베타-1 길항제(ATN-161) 및 이들의 합성 아날로그 및 변형되거나 동일한 약효를 나타내는 물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 물질일 수 있다.
상기 생리활성 물질은 줄기세포-분화조절 인자일 수 있다. 이 경우, 하이드로젤 조성물은 줄기세포와 함께 배양되어 줄기세포 분화를 조절하는데 사용될 수 있다. 줄기세포-분화조절 인자는 후술하는 바와 같다.
상기 생리활성 물질은 체내에서 치료적 효과를 나타내는 물질일 수 있다.
본원의 하이드로젤 포접 복합체에서 생리활성 물질은 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 '링커'(또는 스페이서)는 게스트 분자와 생리활성 물질에 간격을 부여하여 3D 하이드로젤의 생리활성 물질이 생리활성 부위에 접착되기 용이하도록 한다. 예컨대, 상기 게스트분자와 생리활성 물질은 링커로서 분자량 200 내지 5,000 Da의 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG), 폴리에테르이미드(polyetherimide; PEI), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol; PPG) 또는 폴리글라이신(polyglycine),(polyhistidine) 및 폴리(RADA)로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드인 링커(linker)를 통해 연결될 수 있다. 본원에서 제한되지 않는 일 실시예에서는 1.0 kDA의 PEG가 사용되었다(실시예 1 및 2).
본 발명의 다른 양태는 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및 게스트 분자로서 아다만틴, 아조벤젠, 콜레스테롤, tert-부틸, 사이클로헥실 에스테르, 및 나프틸로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가가 직접 또는 링커를 통해 연결된 줄기세포-분화조절 인자;를 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 분화 조절용 하이드로젤 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본원에서 용어 '줄기세포'는 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 구분할 수 있는데, 본 발명에서는 생물학적, 윤리적, 그리고 법적인 문제가 많아 임상적용에 제한이 많은 배아 줄기세포가 아닌, 성체 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 성체 줄기세포 중에서도 골수 및 지방 조직 등의 성체조직 내에 드물게 존재하는 중간엽 줄기세포(MSC)를 사용할 수 있다.
본원에서 줄기세포의 분화 조절용도는, 줄기세포가 연골세포, 골세포, 신경세포, 신경아세포, 근육세포, 지방세포 등의 특정 세포로 분화 유도되도록 조절하는 용도를 의미한다.
본원의 줄기세포의 분화 조절용 하이드로젤 조성물은 줄기세포와 함께 개체의 질환 부위에 직접 이식될 수 있으며, 시험관 내에서 배양될 수 있다. 이식에는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환 부위 절개 후 주입하는 외과적 투여방법이 모두 가능하다.
본원에서 '줄기세포 분화 조절 인자'는 화학물질, 단백질, 및 펩타이드로서 줄기세포의 분화에 영향을 미치는 물질을 의미한다. 특히, ECM(Extracellular matrix)에 존재하는 물질로서 세포의 증식과 분화를 제어하는 물질이 이에 해당될 수 있다. 제한되지 않는 예로서, BMP, N-캐드헤린(N-cadherin), IGF(insulin-like growth factor), FGF(fibroblast growth factor), 및 TGF-β(transforming growth factor β)와 같은 단백질이 있을 수 있으며, 자연의 단백질을 이용하는 것은 안정성 및 재정적 압박과 관련된 문제가 있으므로, 이로부터 유래된 생체 모방 펩타이드가 사용될 수 있다.
본원의 줄기세포 분화 조절인자는 RGD(arginine-lysine-aspartic acid)를 포함하는 펩타이드일 수 있다. 하이드로젤 조성물에서 상기 RGD 몰수의 비율이 호스트 분자의 몰수를 기준으로 50 내지 100%인 경우, 상기 하이드로젤 조성물은 연골 및/또는 골세포 분화 유도용 조성물일 수 있다. 구체적으로, 초기 비대성 단계로 분화를 유도할 수 있다. 상기 RGD 몰수의 비율이 호스트 분자의 몰수를 기준으로 0 내지 25%인 경우, 상기 하이드로젤 조성물은 지방세포 분화 유도용 조성물일 수 있다.
이와 관련하여, 본원에서 제한되지 않는 실시예에서는, 줄기세포 분화 조절 인자로서 ECM 분자 후보물질 중에서 본 연구에는 MSC에 접착성이 강하고 MSC 발달에 효과적인 펩타이드인 RGD(arginine-lysine-aspartic acid)가 선택되었다(실시예 1). RGD는 MSC 인식, 부착, 생존, 및 분화에 관여하는 트리-펩타이드며, fibronectin 내의 주요 결합부위이다. 따라서, 3D 하이드로젤에서의 RGD의 보유는 MSC의 생존과 분화를 위해 필요하다. MSC에 대한 RGD 자극은 골 세포, 연골 세포, 및 지방세포와 같은 다양한 분화를 유도한다. 본원의 실험예 3에 따르면, Ad-RGD의 양의 조절만으로 MSC의 운명을 조절할 수 있음을 알 수 있었다(도 12 참조). 이러한 결과로부터, MSC에 대한 골 세포, 연골 세포, 및 지방세포로 분화하기 위한 하이드로젤 조성물을 제공하기 위해서, 고도로 제어된 MSC 니치의 설계가 필요하고 생리활성 물질로서 RGD가 필요함을 알 수 있었다.
또한, ECM에 존재하는 다양한 생리활성 물질의 농도를 조절하여 하이드로젤을 합성하는 것이 여러 합성 배치를 만들기 위해 필요한 상황 속에서, 본원에서는 호스트-게스트 상호작용을 이용한 Ad-RGD의 농도를 원하는 대로 조절하여 골/연골/지방 생성을 유도할 수 있었다(도 11). 이러한 결과로부터, 미세하게 조절되어야 하는 생리활성 물질의 농도를 본원의 하이드로젤에서는 손쉽게 제어할 수 있음을 알 수 있다.
한편, 줄기세포 분화 조절인자는 CESPLKRQ 를 포함하는 펩타이드와 CLRAHAVDIN를 포함하는 펩타이드일 수 있다. 여기에서 CESPLKRQ 를 포함하는 펩타이드 및 CLRAHAVDIN를 포함하는 펩타이드의 몰수는 4:6 내지 6:4일 수 있다. 이 경우 하이드로젤 조성물은 연골세포로 분화 유도용 조성물일 수 있다.
이와 관련하여, 분자량 25kDa의 TGF-β1은 배아 뼈와 연골 발달 부위에 존재하여 연골 특이적 유전자의 발현을 촉진하는 세포 내 신호 전달 계통에 중요한 역할을 한다. 특히, TGF-β1은 연골 형성 조절인자로서 p38, ERK-1(extracellular signal-regulated kinase-1), 및 JNK(c-Jun N-terminal kinase)를 포함하는 MAPK를 조절한다. 본원에서 제한되지 않는 실시예에서는, TGF-β1의 전체 펩타이드 서열에서 TGF-β1 수용체에 대한 가장 반응성이 강한 결합 부위인 CESPLKRQ 가 사용되었다.
다음으로, 펩타이드를 모방하기 위한 자연 단백질 공급원은 세포 대 세포 상호작용 및 연골 형성에 중요한 N-캐드헤린이다. N-캐드헤린은 대략 99.7kDA의 분자량을 가진다. 최근 10년 동안 MSC 연골 형성을 유도하며 N-캐드헤린의 작용을 모방한 His-Ala-Val(HAV) 모티프가 많은 연구에서 강조되었다. HAV 단독의 배열이 MSC 연골 형성을 유도하기에 충분하더라도, CLRAHAVDIN과 같은 연장된 HAV 서열이 효과적인 모티프로서 더 우수하였다. 이에, 본원에서 제한되지 않는 실시예에서는, 연장된 HAV 펩타이드 서열이 본원에서 선택되었다. 결과적으로, 우리는 호스트-게스트 상호작용에 의한 화학량론적 펩타이드 비율 제어 하에서 TGF-β1을 모방하는 CESPLKRQ 및 N-캐드헤린을 모방하는 CLRAHAVDIN와 같은 천연 단백질로부터 유도된 펩타이드 서열 쌍을 선택하였다. 이러한 펩타이드는 MSC에 영향을 주어 MSC 연쇄반응을 유도할 수 있으며, 세포 간 상호작용과 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 세포 내 신호 전달 메커니즘을 유발할 수 있다.
본원의 실험예 6에서는 T50 및 H50에서의 연골형성 유전자 및 단백질 발현 정도가 가장 높게 나타났다(도 20 및 도 21 참조). 즉, 합성된 아다만탄-PEG-CESPLKRQ(Ad-TGF) 및 아다만탄-PEG- CLRAHAVDIN(Ad-HAV)는 동시에 사용되어 최적화된 연골 형성을 유도한다. MAPK 인자(p38, ERK-1/2, 및 JNK)의 정교한 조절을 조율하는 TGF-β1은 MSC 연골형성의 개시와 꽤나 관련이 있다. N-캐드헤린 또한 합성된 하이드로젤에서도 세포간 상호작용을 통해 MSC의 연골형성을 유도한다. 연골형성 분화를 위한 MAPK 활성화는 TGF-β1 및 N-캐드헤린 모두에 의해 조화될 수 있다. TGF-β1 또는 N-캐드헤린 자체의 자극에 의한 MSC의 연골형성을 나타낼 수 있다는 점에서, 이들 단백질은 연골형성에 중요하며 MAPK 인자의 중재를 위해 서로 관련성이 있다. 실험예 6의 결과는 N-캐드헤린이 MSC를 서로 응축시킬 뿐만 아니라, MAPK에 의해 Col II 및 Agg 와 같은 연골형성 유전자를 발현하도록 TGF-β1에 영향을 주는 것을 의미한다. 이러한 이유로, 연골 형성의 발달 측면에서 2 가지 요인이 서로 우세하지 않다는 결론을 얻을 수 있었다. 결론적으로, T50 H50 군과 같이 두 Ad-펩타이드가 균형 잡힌 군은 MAPK에 대한 우성성을 나타내지 않으므로, 최적의 연골형성을 유도할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타와 같은 단백질이 있을 수 있으며, 자연의 단백질을 이용하는 것은 안정성 및 재정적 압박과 관련된 문제가 있으므로, 이로부터 유래된 생체 모방 펩타이드가 사용될 수 있다.-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및 게스트 분자로서 아다만틴, 아조벤젠, 콜레스테롤, tert-부틸, 사이클로헥실 에스테르, 및 나프틸로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가가 직접 또는 링커를 통해 연결된 IL-2;를 유효성분으로 포함하는, 암세포 증식 또는 전이 억제용 하이드로젤 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 하이드로겔 포접 복합체는 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 호스트 분자가 치환된 온도감응성 폴리포스파젠을 준비하는 제1단계; 게스트 분자와 링커가 연결된 생리활성 물질을 준비하는 제2단계; 및 상기 폴리포스파젠을 상기 생리활성 물질과 혼합하는 단계를 포함하는, 공정을 통해 제조될 수 있다.
본원에서는 이러한 MSC 을 연골형성으로의 최적화된 분화를 위한 하이드로젤 조성물을, 호스트-게스트 상호작용에 기초하여 Ad-TGF 및 Ad-HAV를 화학양론적으로 조절한 후 추가 합성 과정 없이 제조할 수 있음을 확인하였다(도 23).
비록 본원에서는 예시적으로 일부 Ad-펩타이드 조합으로 일부 하이드로젤을 만들었지만, 더 많은 Ad-펩타이드 비율 조합과 배열을 통해 원하는 상태로 줄기세포를 분화하기 위해 최적화된 니치를 손쉽게 제조할 수 있다. 결국, 이러한 기술은 게스트 분자 또는 비율의 전환을 통해 이상적인 3D 생체 의학 구조물을 제조하는 플랫폼 시스템을 제공한다. 이에 따라, 줄기세포 분화에 적합한 생리활성 물질의 종류, 비율 및 배열이 제어된 본 발명의 하이드로젤 조성물은 쉽게 제조될 수 있다.
이러한 맥락에서, 상기 제2단계 이전에 줄기세포가 특정 상태로 분화하는데 필요한 것으로 알려진 ECM의 조성을 토대로, 생리활성 물질의 종류 및 비율에 대해 알려진 정보를 입수할 수 있으며, 이러한 정보를 토대로 상기 제2단계의 생리활성 물질은 상기 정보에 따른 정보 및 비율로 준비될 수 있다. 이에 따라 제조된 하이드로젤 조성물은 생리활성 물질을 상기 종류 및 비율을 갖도록 미세 조절될 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 생리활성 물질의 몰수가 호스트 분자의 몰수보다 많을 경우, 과량의 생리활성 물질은 결합되지 않으므로, 상기 생리활성 물질의 몰수는 상기 호스트 분자의 몰수 이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 하나의 양태는 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠을 제공한다.
이때, 상기 베타-사이클로덱스트린은 C1-6 알킬렌디아민, 폴리(C1-6 알킬렌디아민), n-아미노-n-옥소알칸산(이때, n은 2 내지 6의 정수), 티올, 카르복실레이트, C2-6 히드록시알킬 m-아미노-m-옥소알칸산(이때, m은 2 내지 6의 정수), 시아노-아미노-C1-4 알킬티오-C1-6 알칸을 링커로 이의 6번 탄소상의 히드록실기를 통해 폴리포스파젠 주쇄에 결합된 것이 특징이다. 상기와 같이 소정의 작용기를 갖는 적정 길이의 링커로 연결된 베타-사이클로덱스트린을 포함함으로써 상기 치환에 따른 온도감응성 폴리포스파젠의 젤화 온도에 대한 영향을 조절하여 체온 근처의 온도에서 젤화하도록 조절된 온도감응성 젤을 제공할 수 있다.
본원의 하이드로젤 조성물은 온도감응성 폴리포스파젠에 호스트-게스트 상호작용을 통해 생리활성 물질이 결합된 것으로, 생체 내에 투입될 경우 생리활성 물질을 서서히 방출하며 줄기세포 분화에 유리한 조건을 제공한다. 뿐만 아니라, 줄기세포의 특정 분화에 적합하도록 생리활성 물질의 종류, 비율 및 배열이 제어된 하이드로젤 조성물은 높은 재현성으로 제조될 수 있다.
도 1은 β-CD PPZ의 합성과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 β-CD PPZ의 화학구조와 이의 특성분석을 나타낸 도이다. 도 2의 A는 β-CD가 컨쥬게이트된 산 PPZ의 화학적 구조이다. 도 2의 B는 이소류신, PEG, 및 β-CD를 포함하는 β-CD PPZ의 간단한 개략도이다. 도 2의 C는 β-CD PPZ 및 산 PPZ에 대한 1H NMR 결과이다. 도 2의 D는 산 PPZ와 β-CD 혼합물 및 산 PPZ와 비교한 β-CD 컨쥬게이트화된 PPZ의 FT-IR을 나타낸 도이다.
도 3는 Ad-RGD의 합성과정을 나타낸 모식도이다.
도 4은 Ad-PEG-NH2의 NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 Ad-PEG-NH2의 FT-IR 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 Ad-PEG-MeAc의 NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 Ad-PEG-RGD의 NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 8의 A는 β-CD PPZ 및 Ad-RGD의 2D-NOESY NMR 결과를 나타낸 도이다. 도 8의 B는 β-CD 및 아다만탄의 정확한 프로톤 위치를 나타낸 도이다. 도 8의 C는 다양한 Ad-RGD 농도(β-CD:Ad-RGD=100:0~100:100)에 따른 β-CD PPZ 및 Ad-RGD가 혼합된 하이드로젤의 크로스피크의 2D-NOESY 적분 값을 표시한 도이다.
도 9은 β-CD PPZ 및 β-CD PPZ와 Ad-RGD 혼합물의 겔화 특성을 나타낸 도이다. 도 9의 A는 산 PPZ(검정색)과 β-CD PPZ(붉은색)의 점도를 나타내었고, 도 9의 B는 체온에서 젤화 형성 여부를 나타낸 도이고, 도 9의 C는 산 PPZ 및 β-CD PPZ의 온도감응형 젤화의 세부정보를 나타낸 도이다.
도 10은 생사 분석 및 CCK-8로부터 확인된 MSC의 생존률 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 10의 A는 β-CD PPZ와 Ad-RGD 0 내지 100ml 조합을 MSC에 적용하였을 때의 생/사 분석 결과이다(초록색은 살아있는 MSC를 나타내며, 붉은색은 죽은 MSC를 나타낸다). 측정된 시간은 0, 1, 3, 및 7일차이다. 도 10의 B는 ECM을 모방하는 하이드로젤 3d 배양된 MSC를 나타낸다. 도 10의 C는 7일 후의 CCK-8을 사용한 MSC의 생존율 비교를 나타낸다.
도 11은 다양한 농도로 Ad-RGD가 첨가된 MSC의 정상 배양 배지에서 7일 동안 발현된 상대적 유전자 발현 수준을 나타낸 도이다(βactin으로 정규화됨). 도 11의 A 및 D는 각각 ALP 및 콜라젠 I의 상대적 유전자 발현 수준을 나타낸 도이고(골형성 인자의 마커), B 및 E는 각각 콜라젠 II 및 aggrecan의 상대적 유전자 발현 수준을 나타낸 도이며(연골형성 인자의 마커), C 및 F는 각각 C/EBPα 및 PPARγ의 상대적 유전자 발현 수준을 나타낸 도이다(지방형성 인자의 마커).
도 12는 실시예 1의 하이드로젤 조성물의 MSC 분화 조절 활성을 토대로 작성한 β-CD PPZ와 Ad-RGD의 콘쥬게이트의 MSC 분화 활성에 관한 모식도이다.
도 13은 실시예 2의 하이드로젤 조성물에서 Ad-TGF/Ad-HAV의 합성과정을 나타낸 모식도이다.
도 14는 Ad-TGF의 NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 Ad-HAV의 NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 호스트 게스트 상호작용에 의한 β-CD PPZ/Ad-TGF, HAV 컨쥬게이트의 온도감응성을 나타낸 도이다. 도 18의 A는 β-CD PPZ, β-CD PPZ/Ad-TGF 100, 및 β-CD PPZ/Ad-HAV 100의 온도감응성 겔화 여부를 나타낸 도이다. 각 그룹에서 체온(37℃)에서의 점도를 밝혔다. 도 18의 B는 β-CD PPZ(상단), β-CD PPZ/Ad-TGF 100(중단), 및 β-CD PPZ/Ad-HAV 100(하단)의 솔-젤 전이를 가시화한 도이다. 도 18의 C는 β-CD PPZ와 Ad-TGF의 호스트-게스트 상호작용의 증거를 위한 2D-NOESY결과(좌측)와 PPZ와 Ad-HAV의 호스트-게스트 상호작용의 증거를 위한 2D-NOESY결과(우측)이다.
도 17의 A는 β-CD PPZ 및 Ad-펩타이드 사이의 호스트-게스트 상호작용을 나타내는 모식도이다. 도 17의 B는 β-CD PPZ, β-CD PPZ/Ad-TGF, Ad-HAV의 유체 역학적 직경 결과를 나타낸 도이다(n=3). 도 17의 C는 β-CD PPZ, β-CD PPZ/Ad-TGF, Ad-HAV, 및 Ad-펩타이드 자체(Ad-TGF 및 Ad-HAV)의 크기 분포 결과 및 TEM 이미지를 나타낸 도이다(β-CD PPZ, β-CD PPZ/Ad-TGF, Ad-HAV 기준자는 50 nm 이며, Ad-펩타이드 자체에 대한 기준자는 500 nm이다). 도 17의 D는 수성 상태의 Ad-펩타이드 단독의 응집에 대한 모식도이다. 도 17의 E는 Ad-펩타이드 자체에 대한 유체 역학적 직경을 표시한 도이다.
도 18은 β-CD PPZ/Ad-TGF 120 및 β-CD PPZ/Ad-HAV 120의 크기 분포 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 IVIS 시스템을 사용하여 Ad-펩타이드의 비율 구배에 의존한 호스트-게스트 상호작용 유지를 나타내는 도이다. 도 17의 A는 쥐에서 Ad-TGF 및 Ad-HAV가 FITC 및 로다민(Rho)으로 태그된 β-CD PPZ 및 MSC와 상호작용한 호스트-게스트 반응을 보여주는 도이다. 21일의 기간에서 각각의 Ad-TGF 및 Ad-HAV 구배 형광은 IVIS 시스템에서 검출되었다. 도 17의 B는 21일 동안 Ad-TGF(상단) 및 Ad-HAV(하단)의 평균 방사 효율 값을 나타낸 도이다.
도 20은 β-CD PPZ/다양한 농도를 갖는 Ad-펩타이드/MSC의 복합체의 조직 적합도, 및 이의 기본적인 분화능을 나타낸 도이다. 도 19의 A는 연골분화의 입증을 위해 MSC의 조직-적합성 확인을 위한 H&E 결과(좌측) 및 safranin-O 염색 결과이다(기준자는 100 ㎛이다). 도 19의 B는 IVIS 시스템을 사용하여 측정된 다양한 농도를 갖는 Ad-펩타이드가 β-CD PPZ와 결합된 컨쥬게이트 내에서 줄기세포가 유지되는지 여부를 확인한 도이다. 도 19의 C는 21일 동안 GFP가 태그된 MSC의 마우스에서 평균 방사능 효율 값을 나타낸 도이다(n=3). 도 19의 D는 생체 내 실험 일정에 대한 기본 모식도이다.
도 21은 실시예 2의 β-CD/Ad-펩타이드가 갖는 MSC 연골형성 유도활성에 관한 것이다. 쥐는 21일 이후에 희생되었다. 도 20의 A는 연골형성 검출을 위한 대표 단백질인 aggrecan의 면역조직화학염색 결과이다(기준자=20 ㎛). 도 20의 B는 Agg 형광 강도 분석 결과이다(n=3). 도 20의 C는 마우스 조직에서 Agg 유전자 발현수준을 나타낸다(n=3).
도 22는 실시예 2의 β-CD/Ad-펩타이드가 갖는 MSC 연골형성 유도활성에 관한 것이다. 쥐는 21일 이후에 희생되었다. 도 21의 A는 연골형성 검출을 위한 대표 단백질인 콜라젠 II의 면역조직화학염색 결과이다(기준자=20㎛). 도 20의 B는 Col II 형광 강도 분석 결과이다(n=3). 도 20의 C는 마우스 조직에서 Col II 유전자 발현수준을 나타낸다(n=3).
도 23은 실시예 2의 β-CD/Ad-펩타이드가 갖는 MSC 골형성을 유도하지 않음을 나타낸 도이다. 도 22의 A는 다양한 Ad-펩타이드/β-CD PPZ/MSC 로 Von Kossa 염색한 결과를 나타낸 도이다(기준자=100㎛). 도 22의 B는 골형성의 전형적인 유전자인 Runx2 유전자 발현 수준을 나타낸 도이다(n=3).
도 24는 실시예 2의 하이드로젤 조성물이 처리된 중간엽 줄기세포의 투여를 모식화한 도이다. MSC의 운명을 연골 형성에 적합하게 제어하기 위해 게스트 분자에 결합된 TGF-β1의 펩티드 및 N-캐드헤린 펩티드는 하이드로젤 조성물에서 화학양론적으로 유연하게 도입될 수 있다.
도 25는 실시예 3의 하이드로젤 조성물과 같이 치료적 단백질이 생리활성 물질로 사용된 경우의 모식도를 나타낸다.
도 26은 click chemistry를 이용한 Ad-IL2의 생성반응의 모식도를 나타낸다.
도 27은 EDC chemistry를 이용한 Ad-IL2의 생성반응의 모식도를 나타낸다.
도 28은 단백질의 티올기를 아민-폴리에틸렌글리콜-아다만틴으로 접합한 Ad-IL2 생성 반응을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 29는 아다만틴이 화학적으로 접합된 Ad-IL2에 의한 종양 성장 억제 효과를 나타낸다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 - β-CD PPZ 및 adamantane -PEG- RGD를 포함하는 하이드로젤 조성물
재료
헥사클로로사이클로트리포스파젠(Hexachlorocyclotriphosphazene, Aldrich)을 55℃의 진공(약 0.1 mmHg) 조건에서 승화에 의해 정제하였다. 폴리(디클로로포스파젠)은 알려진 방법에 따라 제조하였다(Sohn, Y. S. et al., Macromolecules 1995, 28 (22), 7566-7568). 이는 헥사클로로사이클로트리포스파젠을 5시간 동안 250℃의 알루미늄 클로라이드(AlCl3) 촉매 하에서 반응시켜 제조하였다. L-이소류신 에틸 에스테르 하이드로클로라이드(IleOEt·HCl)는 L-이소류신(Aldrich)으로부터 공지된 방법에 따라 제조하였다. 분자량이 750 Da인 α-아미노-ω-메톡시-폴리(에틸렌글리콜)(AMPEG)은 알려진 방법에 따라 제조하였다(Loccufier, J.; Crommen et al., Die Makromolekulare Chemie , Rapid Communications 1991, 12 (3), 159-165). 테트라하이드로퓨란(THF)과 트리에틸아민(TEA)(Junsei Chemical Co Ltd.)은 건조 질소 분위기에서 나트륨 금속/벤조페논(Acros) 및 산화바륨(Acros)의 끓는 점에서 환류시킴으로써 정제하였다. Aldrich로부터 구입한 β-사이클로덱스트린은 추가 정제 없이 사용하였다. 모노-6-OTs-βCD 및 모노-6-디에틸아미노-βCD(NH2-βCD)는 공지된 방법에 따라 합성하였다(Liu, Y.-Y.; Fan et al., Macromolecular Bioscience 2003, 3 (12), 715-719). 아세토니트릴(ACN), 에탄올 아민(AEtOH), 4-(디메틸아미노) 피리딘(DMAP), 이소부틸 클로로포르메이트(IBCF), 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)는 Aldrich로부터 입수하였다. 디클로로메탄(DCM)은 대정화학 회사(한국)으로부터 순수한 품질의 것으로 구매하여 추가 정제하지 않았다.
(1) PPZ 산(acid PPZ )의 합성
산 중합체는 하기에 설명된 바와 같이 합성되었다. 건조된 THF(100 mL)에 용해된 폴리(디클로로포스파젠)(3.00 g, 0.03 mmol)에 TEA(16.54 mL, 0.12 mmol)을 포함하는 건조된 THF(200 mL)에 현탁시킨 IleOEt·HCl(7.36 g, 0.038 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물은 드라이 아이스에서 아세톤 배쓰로 12시간 동안 교반한 후, 실온까지 36시간 동안 계속 교반하였다. 이 혼합물에 TEA(2.16 mL, 0.02 mmol)를 함유하는 건조된 THF(20 mL)가 용해된 AEtOH(0.46 mL, 0.008 mmol), 및 TEA(4.92 g, 0.04 mmol)를 포함하는 건조된 THF(50 mL) 에 용해된 AMPEG750(7.57 g, 0.01 mmol)를 점진적으로 첨가하였고, 반응 혼합물은 실온에서 24시간 동안 교반한 다음, 40 내지 50℃에서 24시간 동안 교반하였다. 중합체 반응 혼합물을 공지된 방법에 따라 정제하였다. 간단히 말해, 반응 혼합물을 여과하였다. 여액을 농축한 후, 이를 n-헥산에 부어서 침전물을 얻었고, 이는 동일한 용매 시스템에서 재침전되었다. 중합체 생성물을 투석막(MW 12,000-14,000 컷오프)에서 메탄올에 대하여 3일 동안 투석하였고, 4일 동안 4℃에서 증류하였다. 최종적으로 투석된 용액을 동결건조하여 AEtOH를 갖는 폴리(유기포스파젠)을 수득하였다. 최종적으로, 카르복실산 말단 중합체는 다음과 같은 반응에 의해 수득하였다. 증류된 THF(200 mL) 중의 AEtOH(5.84 g, 0.01 mmol)를 갖는 중합체 용액을 실온에서 질소 분위기 하에서 교반하였다. 이 중합체 용액에, 증류된 THF(50 ml) 중의 글루타르산 무수물(3.18 g, 0.02 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP, 3.41 g, 0.02 mmol) 각 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 24시간 동안 교반하였다. 교반 후, 반응 혼합물을 여과한 후 농축하였다. 중합체 생성물을 메탄올에서 3일간 투석한 후 4℃에서 3일 동안 증류수로 투석하여 정제하였다. 투석된 용액을 동결건조하여 글루타르산을 갖는 폴리(유기포스파젠)을 수득하였다. 합성과정의 모식도를 도 1에 나타내었다.
(2) β-CD PPZ의 합성
산 중합체(3.70 g, 6.77 mmol)을 ACN (100 mL)에 용해하여 교반하였다. 그 다음, 완전히 용해된 중합체 용액에 DMAP (2.48 g, 20.31 mmol), EDC (3.15 g, 20.31 mmol), TEA (2.83 mL, 20.31 mmol)를 첨가하였다. NH2-βCD(0.54 g, 10.16 mmol)를 탈이온화 수 (10 mL)에 용해하였다. 중합체의 카르복실기를 활성화하기 위해, DMAP, EDC, 및 TEA이 첨가된 30분 이후에 NH2-βCD의 탈이온화수 용액을 중합체 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반한 후, 감압하에 증발시켜 중합체를 수집하였다. 수집된 중합체 생성물을 메탄올에 용해하였다. 중합체 생성물은 투석막(MW 12,000-14,000 컷오프)으로 3일 동안 메탄올에 대하여 투석하고 4℃에서 4일 동안 탈이온수로 투석한 후, 최종 투석된 용액을 동결건조하였다. 합성과정의 모식도를 도 1에 나타내었다.
합성된 β-CD PPZ에서, β-CD의 컨쥬게이트화에 대한 구체적인 증거는 β-CD PPZ의 합성후 4.83ppm에서 β-CD의 아노머화 프로톤 피크로 알 수 있다(도 2의 C). 또한, FT-IR 데이터에서 산 PPZ와 β-CD사이에 새롭게 형성된 아미드 결합(C=O)으로 인해 1550 cm-1에서 β-CD 컨쥬게이트로 인한 고유의 피크가 나타났다(도 2의 D). 합성된 β-CD PPZ는 온도에 따라 소수성 IleOEt와 친수성 PEG 사이의 분자 조화로 나타날 수 있는 솔-젤 전이(sol-gel translation)와 같은 온도 감응성의 특징을 가지고 있다. 예를 들어, β-CD PPZ에서 물의 수소 결합은 온도 증가에 따라 파괴되며, 소수성 IleOEt는 강한 소수성 상호작용을 형성하여 젤을 형성하였다.
(3) 아다만탄-PEG-MeAc의 합성
합성과정의 모식도는 도 3에 나타내었다. 아다만탄 아세트산 (1.07 g, 5.5 mmol)을 DCM에 용해하였다. TEA(3.53 mL, 35 mmol) 및 DIC(2.35 mL, 18.6 mmol)는 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 약 30분 동안 교반 한 후, NH2-PEG 1K-NH2(5.0 g, 5 mmol)를 첨가하고 실온에서 1일 동안 반응시켰다. 용매는 감압을 통해 제거하고, 탈이온수를 첨가하여 미반응의 아다만틴 아세트산을 침전시켰다. 침전물을 14,000 rpm에서 20분 동안 3회 원심분리하여 회수하였다. 아다만틴 아세트산의 미세한 잔류 침전물을 0.45 ㎛ 종이 필터로 여과하였다. 정제되지 않은 백색 분말 생성물을 동결건조로 수집하였다. 정제되지 않은 백색분말로부터 순수한 Ad-PEG-NH2를 분리하기 위해 TLC(thin layer chromatography)를 수행하였다. TLC에서 Rf값은 DCM:MeOH=93:7의 용리액 조성을 통해 0.3이었다. 상기 Rf 값에 기초하여 용리 용매에 용해된 Ad-PEG-NH2의 순수한 생성물을 액체 크로마토그래피로 수집하였다. Ad-PEG-NH2를 포함하는 용리 용매는 감소된 압력을 갖는 증발 장치에서 제거되었다. Ad-PEG-NH2를 D.W에서 용해시킨 후, 동결건조하여 백색 분말(3.19 g, 2.65 mmol)을 얻었다. 생성물을 400 MHz NMR(Bruker) 및 FT-IR로 분석하였고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
Ad-PEG-NH2(1 g, 0.8 mmol)를 DMC에 용해시켰다. 이어서, 메타크릴산 클로라이드(0.97 mL, 9.3 mmol) 및 TEA(1.38 mL, 9.95 mmol)를 Ad-PEG-NH2 용액에 첨가하였다. 반응은 50℃에서 1일 동안 수행되었다. 반응액을 감압 하에서 증발시키고 MWCO 1 kDA로 투석하고, 동결건조하여 정제하였다. 제조된 Ad-PEG-MeAc의 NMR값은 도 6에 나타내었다.
(4) 아다만탄-PEG-RGD (Ad-RGD)의 합성
합성과정의 모식도는 도 3에 나타내었다. Ad-PEG-MeAc(0.3 g, 0.2 mmol)를 pH 10.0으로 조정된 수용액에 용해시켰다. TCEP(66 mg, 0.23 mmol) 및 CGRGDS(0.41 g, 0.69 mmol)를 Ad-PEG-MeAc 용액에 즉시 첨가하였다. 반응 용액을 질소 분위기 하에서 10분 동안 퍼징하였다. 실온에서 2시간 동안 반응을 수행하였고, 투석 및 동결 건조로 정제를 수행하였다. 형성된 Ad-RGD의 NMR값을 도 7에 나타내었다.
(5) β-CD PPZ와 Ad- RGD이 혼합된 컨쥬게이트의 제조
상기 제조된 β-CD PPZ와 Ad-RGD를 혼합하여 컨쥬게이트를 제조하였다. 준비된 컨쥬게이트는 β-CD PPZ 하이드로젤 내에 존재하는 호스트 분자의 수를 기준으로 Ad-RGD 분자를 0, 25, 50, 100%의 농도로 포함하였다. Ad-RGD 100, 50, 25는 게스트 분자가 β-CD 중합체의 호스트 분자에 100%, 50%, 25% 호스트-게스트 상호작용을 통해 삽입되는 것을 의미한다. Ad-RGD 100, 50, 25에 대한 정확한 농도는 하기의 표 1에 기재한 바와 같다.
Figure 112019063002410-pat00001
이와 같이 3D 하이드로젤 공간에서 줄기세포 접착 부분인 RGD의 함량을 제어하기 위해 최종적으로 준비되었다.
(6) β-CD PPZ / Ad- RGD의 특성분석
제조된 중합체의 구조를 1H NMR(Bruker avance Ⅲ 400 MHz 푸리에 변환 모드(DMSO-d6 및 CDCl3))의 측정으로 평가하였다. 수용성 중합체 용액의 점도는 Brookfield RVDV-III+ 점도계에서 고정전단 속도 0.1에서 5 내지 70℃ 사이에서 평가되었다. 상기 측정은 0.2rpm의 설정 스핀들 속도와 0.33℃/min의 가열속도로 수행되었다.
공간 정보는 DMSO-d6에 용해된 RGD를 함유하는 β-CD 및 아다만틴의 1:1 내지 1:0몰비의 혼합물을 사용하여 2D-NMR(NOESY)로부터 얻었다. 2D-NMR 스펙트럼은 DD2 600MHz FT NMR(Agilent Technologies)에 기록되었다. 이는 도 8에 표시되었다.
실험예 1: 실시예 1의 컨쥬게이트에 있어 Ad- RGD 양 조절에 따른 호스트- 게스트 상호작용의 발생 확인
본원에서 β-CD와 Ad-RGD 사이의 결합 친화도에 기인하여 서로 다른 양으로 삽입된 Ad-RGD를 통해 잘 조절된 게스트 분자량을 유도할 것이라고 가정하였다. 먼저, β-CD PPZ와 β-CD PPZ + Ad-RGD에서 동적 광 산란(DLS) 측정시 서로 다르다. 수용성 환경에서 전자의 평균 입자 크기는 121.3 ± 26.2nm이며, 후자의 경우 180.3 ± 32.4nm이다. Ad-RGD가 β-CD PPZ에 포함됨에 따라, β-CD PPZ + Ad-RGD의 실제 수성 입자의 크기가 증가되었다.
호스트-게스트 상호작용의 직접적인 증거를 밝히기 위해, 게스트 분자의 증가에 따라 β-CD PPZ와 Ad-RGD의 2D-NOESY 적분 값을 측정하였다. 먼저, 2D-NOESY 결과에서 메틸렌(Ha, Hc), 메탄(Hb), 및 H-5의 β-CD 내부 공동 양성자의 Ad 양성자로 구성된 교차 피크에서 삽입된 복합체가 확인되었다(도 8의 A). 결과적으로, β-CD 내부 공동과 Ad사이의 교차 피크의 적분 값은 게스트 분자의 양이 증가함에 따라 비례적으로 증가함을 알 수 있었다(도 8의 C). 이러한 결과로부터, β-CD PPZ 및 AD-RGD는 호스트-게스트 상호작용이 미세하게 일어나므로, 화학량론적으로 조절된 AD-RGD를 통해 호스트-게스트 상호작용 발생을 조절할 수 있다.
실험예 2: 실시예 1의 컨쥬게이트의 온도감응형 특성
PPZ 산과 β-CD의 콘쥬게이트 사이의 점도 변화를 관찰하였다. Acid PPZ의 Tmax(용액이 최대 점도에 이르는 온도)는 48.8℃로 체온보다 높았다. Acid PPZ에서 친수성 카르복시산기가 다른 친수성 모이어티인 OH기를 갖는 β-CD으로만 치환된 β-CD PPZ의 Tmax는 36.8℃로 낮아졌다(도 9의 A).
β-CD PPZ 및 Ad-RGD 혼합물 제조 후의 겔화 형성에 대해 확인하였다. 그 결과, 체온보다 낮은 조건(4℃)에서, Ad-RGD 0, Ad-RGD 50, 및 Ad-RGD 100가 첨가된 β-CD PPZ는 용액 상태를 나타내었다(도 9의 B). 온도를 37℃로 올림에 따라 모든 그룹에서 잘 형성된 젤화가 나타났다. 이로부터, 게스트 분자 컨쥬게이트인 Ad-RGD가 체온에서 β-CD PPZ 하이드로젤의 젤 형성에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.
실험예 3: 실시예 1의 컨쥬게이트의 중간엽줄기세포의 생존률 및 분화조절 활성 측정
(1) 세포배양 방법
마우스의 중간엽 줄기세포(mMSCs)는 Cyagen Biosciences Inc에서 구입하였다. mMSCs를 1% 페니실린-스트렙토마이신(Sigma-aldrich, US) 및 10% 소태아혈청(FBS) (Welgene, KR) 을 함유한 둘베코 변형 이글배지(DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 37℃의 5% CO2 및 95% 공기의 가습 분위기 하에서 배양하였다.
(2) 중간엽줄기세포 생사 분석 & 3D 하이드로젤 니치로 배양된 CCK -8 측정
수확된 mMSC (passage 7, 5×105 cells)는 0.1중량%의 제조된 하이드로젤 10중량%에 현탁시켰다. mMSC/하이드로젤 혼합물을 24-웰 배양 플레이트에서 세포 인서트로 배양하였다.
0, 1, 3, 및 7일차에 세포 배지를 제거하고 DPBS 용액에 용해된 calcein AM / ethidium homodimer-1(생사 분석 키트, Thermo Fisher Scientific Inc.)을 이용하여 중간엽줄기세포 생사를 분석하였다. 모든 이미지는 공 초점 현미경(Zeiss LSM 800, DE)에 의해 3D 상태에서 얻어졌다.
CCK-8 분석을 위해, 7일차에 mMSC를 포함한 모든 3D 하이드로젤을 배지로 붕괴시켰다. 배양된 하이드로젤을 96웰 배양 플레이트(SPL life sciences, KR)에 옮기고 10 ㎕의 CCK-8(Dojindo Molecular Technology, Inc. JP) 용액을 각 웰에 첨가하였다. 하이드로젤이 함유된 CCK-8 용액은 37℃, 5% CO2의 가습 분위기 하에서 세포 배양기 내에서 2시간 두었다. 배양 후 450nm의 파장에서 마이크로 플레이트 판독기(BIO-RAD, Hercules, CA, US)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
(3) 3D 하이드로젤 니치로 배양한 중간엽 줄기세포의 유전자 분석 (RT- PCR )
Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 RNA 추출물을 준비하였다. 샘플을 DNase(Invitrogen)로 처리한 후, 총 RNA 1mg을 cDNA 합성에 사용하였다(Superscript First-strand synthesis system, GibcoBRL, Life Technologies). 요약하면, 20 mL 혼합물(1 RT 완충액, 1.25 mM의 MgCl2, 5 mM의 DTT, 2.5 g의 무작위 헥사머, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 각각 0.5 mM, 및 50 U의 Superscript II 효소) 내에서 역전사 반응이 수행되었다. 역전사 반응 이후, RNA는 2U의 Escherichia coli RNase H에 의해 분해되었다. 2U의 Takara Taq, 1× PCR 완충액, 0.8mM dNTP 혼합물, 및 100 pmol의 특정 프라이머를 포함하는 50 mL의 반응 완충액에서 PCR 반응이 수행되었다. 표준 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분, 95℃에서 5초 변성, 60℃에서 34초 어닐링, 및 72℃에서 1분간 연장하는 사이클. 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 2에 기재된 바와 같다. 유전자 발현 값은 β-actin의 하우스 키핑 유전자에 대하여 정상화되었다.
Figure 112019063002410-pat00002
(4) 실험결과
호스트-게스트 상호작용을 바탕으로 3D 니치 줄기 세포를 제조하기 위한, 단순히 혼합되는 RGD의 농도를 조절하는 시스템을 디자인하였다. 주요 integrin 결합 도메인인, RGD는 fibronectin, vitronectin, fibrinogen, osteoponin, 및 bone sialoprotein와 같은 ECM 단백질에 풍부하다. 제조된 3D 하이드로젤 줄기세포의 니치는 게스트 분자인 Ad-RGD에 의해 조절되었다. MSC 생존율은 여러 가지 합성 물질의 3D 인공 지지체에 대한 최근 연구에서 평가되었으며, 그 결과는 특정 조건 내에서 50% 이상의 생존율을 나타내었다.
줄기세포 배양시스템에서 MSC의 생존율을 평가한 결과를 도 10의 B에 나타내었다. 생사 분석 이미지에서 호스트 및 게스트 분자에 둘러싸인 MSC는 7일 동안 3D 배양 시스템에서 상당히 생존하였다. 또한, RGD-인테그린 결합 (도 10의 A)으로 인해 MSC의 성장된 형태가 RGD의 존재하에서(특히, Ad-RGD 25, 50, 100) 나타났다. 3D 배양 7일 후의 MSC의 생존율은 RGD 0을 사용한 경우 (생존율 57.5%)와 비교하여 RGD 25, 50, 100을 사용한 경우(생존율 72.2 내지 77.8%) 증가하였다. 그러나, Ad-RGD 25, 50, 100을 사용한 경우에서 MSC 생존율은 서로 유사하였다. 이러한 결과로부터 RGD 의 존재 여부에 의해 MSC 생존율이 영향받음을 알 수 있다. 즉, RGD 분자의 존재가 합성 3D 줄기세포 니치에 있어 줄기세포의 생존에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
실시예 1에 따라 Ad-RGD를 β-CD PPZ 하이드로젤 중 β-CD의 몰수를 기준으로 0%, 25%, 50%, 및 100% 비율의 몰수로 첨가한 컨쥬게이트를 제조하였고, 이를 MSC에 첨가하였다.
MSC의 분화와 관련하여, Ad-RGD 50 및 100을 사용한 경우 Ad-RGD와 MSC의 α5β1 인테그린과 높은 결합 가능성이 증가된 골형성 인자(ALP 및 collagenⅠ) 및 연골형성 인자(aggrecan 및 collagenⅡ)의 발현을 유도하였다(도 11의 A, B, D, 및 E). 발달과정에서 연골형성 과정은 골형성에 일시적으로 앞서며, 비대성 단계(hypertrophic stage)는 상기 과정들 사이의 중간 관문이다. 구체적으로, 시공간적으로 연골형성 관련 인자와 골형성 관련인자는 비대성 단계에서 동시에 강화된다. 즉, RGD 50 및 RGD 100을 사용한 경우 골형성 인자가 크게 증가되었으며, RGD 100을 사용한 경우 연골형성 인자가 크게 증가된 결과로부터, Ad-RGD 50 및 100으로 배양된 MSC는 비대성 단계에 직면함을 알 수 있었다. 특히, 연골형성 인자는 Ad-RGD 100에서 높게 나타나므로, 상대적으로 낮은 Ad-RGD 50을 사용한 경우와 비교하여 RGD의 높은 수준이 초기 비대성 단계로 나타남을 알 수 있었다.
반면, 지방생성 관련 인자 (C/EBPα 및 PPARγ)는 RGD 0, RGD 25와 같이 Ad-RGD가 낮거나 없는 경우에 높게 발현되었다(도 11의 C 및 F). 결국, 이 결과는 β-CD PPZ와 결합된 Ad-RGD의 양의 조절만으로 MSC의 운명을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
이러한 결과로부터 본 발명에서 β-CD PPZ와 Ad-RGD의 콘쥬게이트의 MSC 분화 활성에 관한 모식도를 도 12에 기재하였다.
실시예 2: β-CD PPZ , Ad- TGF 및 Ad- HAV를 포함하는 하이드로젤 조성물
(1) β-CD PPZ의 합성
실시예 1의 (1) 및 (2) 에 기재된 것과 동일한 방법으로 β-CD PPZ 를 제조하였다.
(2) Ad-PEG- MeAc의 합성
실시예 1의 (3)에 기재된 것과 동일한 방법으로 Ad-PEG-MeAc를 제조하였다.
(3) Ad-TGF 의 합성
제조된 Ad-PEG-MeAC(M.W. 1302.6 Da, 200 mg, 0.15 mmol)를 pH 10.0으로 조정된 수용액에 용해하였다. TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine, 44.0 mg, 0.15 mmol) 및 TGF-β1 모사 펩타이드(CESPLKRQ, 960.12 Da, 442.2 mg, 0.46 mmol)를 상기 수용액에 동시에 첨가하였다. 반응 용액을 N2 분위기하에서 10분 동안 퍼징하였다. 그리고 실온에서 2시간 동안 반응이 수행되었다. 반응 후, 투석 및 동결 건조로 정제를 실시하였다. 제조과정의 모식도를 도 13에 나타내었다.
(4) Ad-HAV의 합성
제조된 Ad-PEG-MeAc (M.W. 1302.6 Da, 300 mg, 0.23 mmol)를 pH 10.0으로 조정된 수용액에 용해하였다. TCEP(66.0 mg, 0.23 mmol) 및 N-캐드헤린 모사 펩타이드(CLRA HAV DIN, 1111.29 Da, 767.8 mg)를 상기 수용액에 동시에 첨가하였다. 반응 용액을 N2 분위기하에서 10분 동안 퍼징하였다. 그리고 실온에서 2시간 동안 반응이 수행되었다. 반응 후, 투석 및 동결 건조로 정제를 실시하였다. 제조과정의 모식도를 도 13에 나타내었다.
(5) β-CD PPZ에 Ad- TGF 및 Ad- HAV를 혼합하여 컨쥬게이트의 제조
상기 제조된 β-CD PPZ에 Ad-TGF 및 Ad-HAV의 하기 표 3의 비율로 혼합하여 컨쥬게이트를 제조하였다.
Figure 112019063002410-pat00003
(6) β-CD PPZ / Ad- TGF 및(또는) HAV의 특성분석
제조된 β-CD PPZ, Ad-HAV 및 Ad-TGF의 구조는 H NMR(DMSO-d6 및 CDCl3를 사용한 Bruker 전위 III400 MHz 푸리에 변환 모드)을 측정하여 평가되었다(도 2, 도 14, 및 도 15).
중합체 수성 용액의 점도는 Brookfield RVDV-III+ 점도계에서 5 내지 70℃ 사이에서 0.1의 고정 전단 속도로 평가되었다. 측정은 0.2 rpm의 설정 스핀들 속도와 0.33℃/min의 가열 속도로 수행되었다(도 16의 A).
공간정보는 2D-NMR(NOESY)에서 D2O에 펩타이드가 용해된 β-CD와 아다만틴의 1:1 몰 혼합물을 사용하여 얻었다. A2D-NMR 스펙트럼은 DD2 600MHz FT NMR(Agilent Technologies)에 기록되었다(도 16의 C).
실험예 4: 실시예 2의 컨쥬게이트에 있어 β-CD PPZ와 Ad- 펩타이드 사이에 호스트-게스트 상호작용 발생 확인
β-CD PPZ와 Ad-펩타이드의 호스트-게스트 상호작용을 검증하기 위해, 제조된 컨쥬게이트 하이드로젤의 동일한 조건하에서 D2O를 사용한 2D-NOESY 스펙트럼을 수용성 상태에서 측정하였다. 2D-NMR은 분자간 상호작용 및/또는 삽입된 복합체(inclusion complex) 형상을 관찰하기 위한 강력한 방법이다. 2D-NOESY의 크로스 피크는 커플링된 결합보다 공간적으로 가까운 핵 공명 연결을 얻을 수 있다. 호스트-게스트 상호작용에 포함된 2D-NOESY에서 크로스 피크인 아다만탄의 Ha, c, Hb (δ 0.6 내지 1.3 ppm) 및 β-CD 내부 공동의 H-5'(δ 3.4 내지 3.5 ppm)는 도 16의 C에서 알 수 있듯이 명료하게 나타났다.
또한, 호스트 분자에 Ad-펩타이드가 화학양론적으로 정확하게 삽입된 것인지를 확인하기 위해, 호스트 분자: 게스트 분자를 1:1, 1:1.2, 및 0:1의 비율이 되도록 혼합한 후 동적 광 산란(DLS)를 측정하였다. 무엇보다도 호스트 분자와 게스트 분자가 1:1인 컨쥬게이트에서 증가된 유체 역학적 직경이 나타났다(도 17의 C). 호스트 분자: 게스트 분자가 1:1인 컨쥬게이트의 DLS 결과에서 게스트 분자 단독인 경우의 피크는 나타나지 않았다(도 17의 C). 이로부터 그들은 β-CD PPZ로부터 분리된 게스트 분자가 있지 않음을 의미한다. Ad-TGF 및 Ad-HAV 단독의 입자는 각각 353.63±31.71 nm 및 460.78 ±49.53 nm이므로(도 17의 E), β-CD PPZ와 비교하여 훨씬 큰 Ad-TGF 및 Ad-HAV의 입자 크기는 수용액 상태에서 소수성 아다만탄 분자가 삽입의 응집에 따른 결과이다. 이는 호스트 분자: 게스트 분자= 1:1인 경우에 수용성 환경에서 β-CD PPZ와 Ad-펩타이드의 컨쥬게이트에 모든 Ad-펩타이드가 혼입된 것임을 의미한다. 반면, Ad-펩타이드가 과하게 β-CD PPZ와 혼합되면(호스트 분자: 게스트 분자 = 1:1.2), Ad 펩타이드의 남는 양은 Ad-TGF 및 Ad-HAV 단독의 피크와 유사한 피크를 나타냄을 알 수 있었다(도 18). 결과적으로, 2D-NOESY는 β-CD PPZ와 Ad-펩타이드 사이에 호스트-게스트 상호작용으로 인해 컨쥬게이트를 잘 형성함을 알 수 있었다.
한편, 살아 있는 동물의 생체 이미징 시스템(IVIS)을 이용하여, β-CD PPZ에서 Ad-TGF 및 Ad-HAV가 초기에 다른 함량으로 결합된 컨쥬게이트가 유지되는지를 확인하였다. Ad-TGF 및 Ad-HAV의 분자 꼬리에서는, 로다민(Rho) 및 플루오르세인 이소치오시아네이트(FITC)이 컨쥬게이트화 과정에서 연결되었다. 그리고, 형광을 발휘하는 게스트 분자들이 MSC 사후-삽입 복합체(post-inclusion complex) 제조에 β-CD PPZ와 함께 투여되었다. PPZ의 생분해성 또는 용해 때문에 PPZ에 연결된 β-CD는 밖으로 유출되었고, 시간이 지남에 따라 형광을 포함하는 Ad-펩타이드의 신호가 작아졌다. 더욱이, Ad-TGF/Ad-HAV의 화학량론적 패턴의 조절은 다른 게스트 분자를 21일 동안 사용하는 것으로 관찰되었다(도 19의 A). 예를 들어, Ad-TGF의 형광 강도는 T100H0, T75H25, T50H50, 및 T25H75의 순서대로 높았다. 이러한 결과는 호스트-게스트 상호작용에 의존하는 화학양론적으로 상이한 게스트 분자의 홀딩으로부터 유래한 것이다. 다음, 표현된 형광에 대한 관심 영역(ROI) 값은 도 19의 B에 계산된 바와 같다. Ad-펩타이드가 산성 PPZ와 혼합됨에 따라(PPZ에서 β-CD가 결여), 3D 하이드로젤로부터 Ad-펩타이드의 빠른 탈출이 나타났다. 모든 그룹(T100 H0, T75 H25, T50 H50, T25 H75, 및 T0 H100)에서 ROI 값은 β-CD PPZ의 생분해 및 용해 때문에 시간이 지남에 따라 감소하였으나, 모든 그룹 및 모든 시간에서 초기에 다르게 첨가된 Ad-펩타이드 비율에 의해 조절된 β-CD PPZ 내에서 Ad-펩타이드 형광 발현이 호스트-게스트 상호작용에 의해 유지되었다. 이 결과로부터 살아있는 동물에서도 3D β-CD PPZ 하이드로젤의 호스트-게스트 상호작용을 상당히 장기간 유지하는 결과를 알 수 있었다.
실험예 5: 온도 감응형 특성
호스트 분자와 게스트 분자의 합성에 따라, β-CD PPZ가 혼입된 T100 H0 및 T0 H100의 유동성 측정 및 열감응성 솔-젤 전이의 가시화를 수행하였다. β-CD PPZ에 Ad-TGF 100 및 Ad-HAV 100이 삽입되었더라도, 제조된 컨쥬게이트의 하이드로젤 또한 젤화 특성 및 체온에서 충분한 점도를 나타내었다(도 16). 호스트-게스트 상호작용을 통해 제조된 β-CD PPZ / Ad-TGF 100, 및 β-CD PPZ / Ad-HAV 100의 T값은, Ad-TGF 및 Ad-HAV의 친수성 PEG의 보유로 인해, β-CD PPZ 자체와 비교하여 약간 더 높은 온도로 이동하였다(도 16의 A). 특히, β-CD PPZ, β-CD PPZ / Ad-TGF 100, 및 β-CD PPZ / Ad-HAV 100의 체온에서의 점도는 268.75, 387.50, 및 325.00 pa·s였다(도 16의 A). 이러한 온도감응성 점도 결과에 기초하여, 실시예 2에서 제조된 하이드로젤은 살아있는 동물에 적합하게 투여될 수 있다.
실험예 6: 실시예 2의 컨쥬게이트의 조직적합성 및 MSC의 연골형성 유도
(1) 생체 적합성 측정방법
96웰 조직 배양 플레이트(SPL, Korea)에 일정한 농도(1×104 cells/well)의 mMSC(쥐의 중간엽 줄기세포) 및 NIH3T3(쥐의 섬유아세포)를 접종하였다. 각 세포주는 잘 용해된 β-CD PPZ(농도: 0-20,000 μg/mL)와 함께 24시간 배양되었다. 접종 후, 사용된 배지를 버리고 세포를 DMEM 및 신선한 PBS로 1회 세척하였다. 신선한 배지(200 mL/well)를 첨가한 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazoliumbromide(MTT) 용액(100 mg/well)을 세포에 첨가한 후 4시간 동안 37℃의 가습된 5% CO2 분위기 하의 인큐베이션을 하였다. 형성된 포르마잔 결정을 DMSO로 세포를 배양함으로써 가용화되었다. 마이크로 플레이트 리더(Bio-Tek Instruments, USA)를 사용하여 570 nm에서 용액의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%)은 [ab]실험군/[ab]대조군×100%으로 계산되었다.
(2) 생체 내 조직 재생 실험
동물실험과 관련된 법률 및 한국과학기술연구원(KIST)의 실험동물운영위원회(IACUC)의 가이드라인에 따라서 모든 살아있는 동물 실험이 수행되었다. IACUC는 실험을 허가하였다(허가 번호: 2017-092). Balb/c 누드 마우스(4 주령, 20-25 g, 암컷)를 Nara Bio INC(경기도, 한국)으로부터 구매하였다. 누드 마우스를 균형있는 산소 및 질소 속에서 3% 이소플루란으로 마취시켰다. MSC/ β-CD PPZ(10 wt %)/0 내지 100%의 Ad-TGF(T, adamantane-PEG1000-CESPLKRQ, 2248.70 Da) 및 Ad-HAV(H, adamantane-PEG1000-CLRAHAVDIN, 2399.87 Da)를 31 게이지 바늘의 주사기를 사용하여 등쪽 정중선의 오른쪽 측면에 있는 마우스의 피하 포켓에 주사하였다. 각 마우스는 10 중량% β-CD PPZ와 혼합된 2×106 cells을 포함하는 100μL의 주사를 받았다. 모든 조직을 주사 후 4 주 후에 수집하여 조직 검사와 유전자 분석에 사용하였다.
(3) 조직학적 및 면역조직학적 분석
수집된 모든 조직을 파라핀에 끼우고 마이크로톰(6 ㎛ 두께)으로 절단하였다. 조직학적 평가를 위해 조직 절편을 탈 파라핀화하고 재 수화하여, H&E, safranin-O, Von kossa, 및 면역조직화학으로 염색하였다. 면역조직화학 염색을 위해 절편 조직을 1차 항체인 anti-aggrecan (1:500, Abcam, ab3778)과 and anti-collagen II(1:500, Abcam, ab34712)으로 4℃에서 밤새 배양하였다. 3회 세척한 후, 슬라이드를 염소 항-마우스 IgG(TRICT, Abcam, ab6786), 및 염소 항-토끼 IgG(Alexa 488, Abcam, ab150077)와 같은 형광염료에 접합된 적절한 2차 항체와 함께 배양하였다. 이미지는 공촛점 레이저 스캐닝 현미경(Zeiss)과 밝은 이미지 현미경(Zeiss)을 사용하여 포착하였다.
(4) 인공 조직에서 측정된 유전자 분석
Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 RNA 추출물을 제조하였다. 조직을 DNase(Invitrogen)로 처리한 후, 1 mg의 RNA를 cDNA 합성을 위해 사용하였다(Superscript First-strand synthesis system, GibcoBRL, Life Technologies). 요약하면, 역전사 반응은 20ml의 혼합물(1 RT 완충액, 1.25 mM MgCl2, 5 mM DTT, 2.5g 랜덤 헥사머, 각 0.5mM의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 50 U의 Superscript II enzyme)에서 42℃에서 수행되었다. 역전사 반응 후, RNA는 2U의 Escherichia coli RNase H에 의해 분해되었다. 2U의 Takara Taq, 1× PCR 완충액, 0.8 mM dNTP 혼합물, 및 100 pmol 의 특정 프라이머를 포함하는 50 mL의 반응 완충액에서 PCR 반응이 수행되었다. 표준 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분, 95℃에서 5초 변성, 60℃에서 34초 어닐링, 및 72℃에서 1분간 연장하는 사이클. 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 4에 기재된 바와 같다. 유전자 발현 값은 β-actin의 하우스 키핑 유전자에 대하여 정상화되었다.
Figure 112019063002410-pat00004
(5) 실험결과
전술한 (1) 에 따라서, MSC 와 NIH3T3의 세포주에서 MTT 분석을 하여 시험관내 세포 독성 시험을 수행하였다. 고농도(10,000μg/mL)의 β-CD PPZ중합체 용액으로 각 세포주를 처리했음에도 불구하고, MSC와 NIH3T3의 세포 생존율은 80% 이상으로 나타났다. 따라서, 이 중합체는 in-vivo 동물의 다음 연구에 적합하다고 간주되었다.
생체 내 조직 재생 실험에서, β-CD PPZ/비율조절된 Ad-펩타이드/MSC가 투여된 생체 내에서 생체 적합성은 H&E 염색을 통해 확인되었다. H&E 염색의 조직학적 결과에 따르면, 외인성 거대 세포의 생성 및 독성과 같은 이물질 반응은 β-CD PPZ/비율 조절된 Ad-펩타이드로 처리된 모든 군에서 관찰되지 않았다(도 20의 A). 그리고 나서, 정상적으로 β-CD PPZ/비율조절된 Ad-펩타이드/MSC가 주사된 연골신생은 safranin-O 염색을 통해 관찰되었다. 연골과 세포질의 색은 각각 붉은색과 초록색으로 염색된다. T0 H0 이외에 모든 군에서는 연골에 염색된 붉은색이 명확히 관찰되었다(도 20의 A).
더욱이, 생체 내에서 MSC의 유지는 국소적으로 장기간 치료 효율을 유지할 수 있는지를 파악하기 위해 측정되었다. 따라서, 녹색 형광단백질(GFP)을 발현할 수 있는 MSC는 β-CD PPZ/ Ad-펩타이드 컨쥬게이트 삽입에 의해 둘러싸였고, 이러한 MSC가 살아 있는 동물에서 유지되는지 확인하였다. 국소 주입된 MSC는 21일 동안 주사 부위에서 유지되었다. 그러나, MSC 부착 및 세포 간 상호작용 인자가 배제된 T0 H0 그룹에서는 MSC 형광이 현저히 낮게 확인되었다(도 20의 B). 이를 통해 세포간 상호작용과 TGF-β1 자극이 연골분화뿐만 아니라 줄기세포의 생존율까지 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다. 남아있는 MSC에 대한 관심영역(ROI) 값의 측정을 통해 다른 Ad-펩타이드를 포함하는 군과 비교하여 T0 H0의 낮은 MSC 유지를 확인하였다(도 20의 C). MSC에 Ad-펩타이드가 존재하는 것은 주사 부위에 국소적 MSC 유지를 도왔다. 간단히 말해, 이들 게스트 분자의 화학양론적으로 결합된 β-CD PPZ 하이드로젤은 시험관 및 생체 내에서 생체 적합성이었다. 더욱이, β-CD PPZ/Ad-펩타이드 복합체를 이용한 MSC 연골 형성 유도가 T0 H0 그룹 외에서 관찰되었다.
유연하고 다른 게스트 분자 내용물의 정확한 MSC 연골 형성 수준을 평가하기 위해 II형 콜라젠(Col II) 및 aggrecan(Agg)의 전형적인 연골형성 마커를 사용하여 분석을 수행하였다. 우리의 결과를 바탕으로, 게스트 분자의 유연성에 따른 MSC 연골형성 분화가 safranin-O 염색에 의해 표시되었다. T0 H0 군을 제외한 모든 그룹에서 연골 분화가 나타났다. safranin-O 염색 결과에 기초하여, 정확한 연골형성이 유전자 발현 수준 및 면역조직화학에 의해 측정되었다. β-CD PPZ 및 Ad-펩타이드가 둘러싸인 MSC의 국소적 피하 주사에 의해 신생된 조직은 모든 실험 군에서 추출되었다. 연골 특이적 프로테오글리칸 코어 단백질인 Agg는 모든 Ad-TGF 및/또는 Ad-HAV 군에서 상당히 합성되고 발현되었다. 특히, T50 H50 군에서는 T100 H0, T75 H25, T25 H75, 및 T0 H100 군과 비교하여 가장 높은 Agg 특이적 형광 및 유전자 발현이 확인되었다(도 21의 B 및 C). T50 및 H50의 유전자 및 단백질 발현 정도는 T100 H0, T75 H25, 및 T25 H75와 같은 다른 유전자 군에 비해 2배로 나타났다. Ad-펩타이드가 존재하지 않는 경우, Agg 발현이 측정되지 않았다. 연골에 주요 단백질인 Col II은 연골생성 평가의 다음 마커로 선택되었다. Col II 또한 특이적 형광 및 유전자 발현을 통해 관찰되었다. Col II는 T0 H0 군과 비교하여 β-CD PPZ/Ad-펩타이드가 처리된 군에서 잘 생성되었다(도 22의 A). Col II 유전자 및 단백질 발현은 면역조직분석 및 유전자 분석에서 Agg와 같은 패턴을 나타내었다(도 22의 B 및 C). 또한, Col II의 가장 높은 발현도 T50 H50 군에서 나타났다.
골 형성(osteogenesis)은 연골 형성을 전구 물질로 포함하는 연속적인 발달 과정 중 하나이다. 구체적으로, runt-관련 전사 인자 2(Runx 2) 및 osterix와 같은 특정 자극하에서 비대성의 연골세포가 골세포로 분화된다고 할지라도, 본원에서 사용된 Ad-펩타이드는 연골세포의 골 형성 종결에 대한 추가 과정을 방지해야 한다. 연골형성 과정에서 말단부 MSC의 부정확한 분화 산물로 인하여, 골형성의 억제는 중요하다. 일반적으로, Runx2는 골형성에 전형적이고 중요한 전사 인자이다. 즉, Runx2는 추가 골형성이 관측되는지 아닌지에 대한 유전자 분석 마커로서 선택되었다. 나아가, 골형성의 최종 생성물인 칼슘 생성을 Von kossa 염색을 통해 확인하였다. 그 결과, 칼슘 점은 발견되지 않았다(도 23의 A). 또한, Runx2 유전자의 발현이 과량으로 검출되지 않았다(도 23의 B). 결국, 실시예 2의 시스템에 의한 골 형성은 TGF-β1 유도 펩타이드를 사용해도 완벽하게 차단되었으며, Ad-펩타이드가 혼입된 군에서만 연골 형성 유도만이 나타났다.
이러한 결과로부터 본 발명에서 β-CD PPZ와 비율이 조절된 Ad-TGF 및 Ad-HAV의 콘쥬게이트의 MSC 분화 활성에 관한 모식도를 도 12에 기재하였다.
실시예 3: β-CD PPZ가 Ad-IL2와 호스트- 게스트 상호작용으로 결합된 컨쥬게이트
(1) β-CD PPZ , the host molecule의 합성
실시예 1의 (1) 및 (2) 에 기재된 것과 동일한 방법으로 β-CD PPZ를 제조하였다.
(2) Ad-PEG- MeAc의 합성
실시예 1의 (3)에 기재된 것과 동일한 방법으로 Ad-PEG-MeAc를 제조하였다.
(3) Ad-IL2의 합성
1) 방법 1(click chemistry를 이용한 방법)
제조된 Ad-PEG-MeAC(0.09 mg, 0.00007 mmol)를 pH 10.0으로 조정된 수용액에 용해하였다. TCEP(0.2 mg, 0.0007 mmol) 및 rhIL-2(1 mg) 를 상기 수용액에 동시에 첨가하였다. 반응 용액을 N2 분위기하에서 10분 동안 퍼징하였다. 그리고 실온에서 2시간 동안 반응이 수행되었다. 반응 후, 투석 및 동결 건조로 정제를 실시하였다. 반응 모식도는 도 26에 기재하였다.
2) 방법 2( EDC chemistry를 이용한 방법)
제조된 Ad-PEG-MeAC(0.09 mg, 0.00007 mmol)을 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)(0.28 mg, 0.0015 mmol)와 함께 수용성 용해하였다. rhIL-2(1 mg)는 Ad-PEG-NH2 + EDC의 수용성 용액에 용해되었다. 반응 용액을 N2 분위기하에서 10분 동안 퍼징하였다. 그리고 실온에서 24시간 동안 반응이 수행되었다. 반응 후, 투석 및 동결 건조로 정제를 실시하였다. 반응 모식도는 도 27에 기재하였다.
(4) β-CD PPZ /Ad-IL2의 특성 분석
폴리아크릴아마이드 젤에 분자량에 따라 펼쳐지는 ladder, IL-2, 그리고 Ad-IL2를 전기영동을 통하여 내린 결과, IL-2에 비해 Ad-IL2의 분자량이 높은 것을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 실시예 3 컨쥬게이트의 암 세포 성장 저지 활성
(1) 실험방법
B16 melanoma cell line 5.0×105 cells의 양을 B6 mouse에 주입하였다(0 day, n=5). 암조직의 크기가 100 mm3 이상이 되면, β-CD PPZ+Ad-IL2 복합체와 PBS 단독을 준비하여 각각의 마우스의 암조직에 직접 주사 투여하였다. 총 12일 동안 마우스 암조직 크기를 측정하여 평균값을 산출하였다.
(2) 실험 결과
대조군인 PBS 주사 투여 그룹에서는 암조직의 크기가 통제할 수 없을 만큼 커지는 것을 확인하였고, 실험기간 도중 PBS 그룹 총 5마리 중 2마리는 암조직이 과도하게 비대해져 사망하였다. 그에 비해 β-CD PPZ+Ad-IL2 복합체를 주사 투여한 그룹에서는 모든 쥐들이 생존하였고, 암조직의 크기도 대조군에 비하여 상당히 잘 억제되어 있는 결과를 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 호스트 분자로서 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; β-CD)이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및
    게스트 분자로서 아다만틴(adamantine), 아조벤젠(azobenzene), 콜레스테롤(cholesterol), tert-부틸(tert-butyl), 사이클로헥실 에스테르(cyclohexyl ester), 및 나프틸(naphthyl)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가 직접 또는 링커를 통해 연결된 생리활성 물질을 포함하는, 하이드로젤 복합체로서,
    상기 베타-사이클로덱스트린에 게스트 분자가 호스트-게스트 상호작용(host-guest interaction)에 의하여 포접(inclusion)되어 전체 또는 일부 베타-사이클로덱스트린에서 컨쥬게이트를 형성하고,
    상기 베타-사이클로덱스트린과 상기 게스트 분자는 비공유 결합의 복합체를 형성하고,
    상기 폴리포스파젠은 3차원 구조의 젤을 형성하며, 3차원 구조의 젤 형태의 상기 폴리포스파젠에 치환되어 제공된 상기 호스트 분자와 상기 폴리포스파젠간 연결 부위가 분해되어 상기 호스트 분자에 포접된 상기 게스트 분자와 연결된 상기 생리활성 물질을 방출하는, 하이드로젤 포접 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 온도감응성 폴리포스파젠은 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린을 (55 내지 80) : (5 내지 25) : (5 내지 20)의 몰비율로 포함하는 것인, 하이드로젤 포접 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은 단백질, 펩타이드, 백신, 유전자, 호르몬, 항암제 및 신생혈관억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 하이드로젤 포접 복합체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단백질은 엑센딘-4(exendin-4), 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO), 인터페론-알파, 인테페론-베타, 인터페론-감마, 성장호르몬(인간, 돼지, 소 등), 성장 호르몬 방출 인자(growth hormone releasing factor), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor), GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), M-CSF(macrophage-colony stimulating factor), 혈액 응고 인자(blood clotting factor), 인슐린, 옥시토신, 바소프레신, 부신 피질 자극 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 섬유아 세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 변환 성장 인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 신경 성장 인자(nerve growth factor), 뇌신경 성장 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 뉴로트로핀-3(neurotrophin-3, NT-3), 뉴로트로핀-4/5(neurotrophin-4/5), 프로락틴, 를리베린(luliberin), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(luteinizing hormone releasing hormone, LHRH), LHRH 작용제(agonists), LHRH 길항제(antagonists), 성장호르몬방출 억제인자(somatostatin), 글루카곤, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-11(IL-11), 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 유로가스트론(urogastrone), 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린(enkephalins), 엔돌핀(endorphins), 안지오텐신(angiotensins), 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(thyrotropin releasing hormone, TRH), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF), 종양 괴사 인자 관련 세포 자멸사 유발 리간드(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL), 헤파린 분해효소(heparinase), 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), hANP(human atrial natriuretic peptide), 글루카곤 유사 펩타이드(glucagon-like peptide, GLP-1), 레닌(renin), 브라디키닌(0bradykinin), 바시트라신(bacitracins), 폴리믹신(polymyxins), 콜리스틴(colistins), 티로시딘(tyrocidine), 그라미시딘(gramicidins), 사이클로스포린(cyclosporins), 뉴로텐신(neurotensin), 타키티닌(tachykinin), 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y, NPY), 펩타이드 YY(peptide YY, PYY), 혈관활성장내폴리펩타이드(vasoactive intestinal polypeptide. VIP), 및 하수체성 아데닐레이트 사이클레이즈-활성폴리펩타이드(pituitray adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 하이드로젤 포접 복합체.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 펩타이드는 콜라젠 1 유래의 GFOGER 및 DGEA; laminin 유래의 YIGSR, SIKVAV, IKVAV, IKLLI, LRGDN, 및 SINNNR; laminin γ1 유래의 LRE, PDGSR, GTFALRGDNGQ, CFALRGDNP, NPWHSIYITRFG, TWYKIAFQRNRK, KAFDITYVRLKF, 및 LGTIPG; Fibronectin 유래의 GRGDS, PKRGDL, NGRAHA, GACRGDCLGA (cyclic), IDAPS, REDV, PHSRN, KQAGDV, LDV, WQPPRARI, SPPRRARV, LIGRKK, IWKHKGRDVILKKDVRFYC, KLDAPT, 및 PRARI; Vitronectin 유래의 CKKQRFRHRNRKG; Osteopotin 유래의 KRSR, FHRRIKA, CGGNGEPRGDTYRAY, SVVYGLR, 및 ELVTDFPTDLPAT; Elastin 유래의 VPGIG 및 VGVAPG; Collagen 4 유래의 MNYYSNS 및 CNYYSNS; Thrombospondin 유래의 CSVTCG, GRGDAC, FQGVLQNVRFVF, AELDVP, 및 VALDEP; Nidogen-1 유래의 GFRGDGQ 및 SIGFRGDGQTC; N-cadherin 유래의 HAV; 및 TGF-β1 유래의 FLPASGL, PWPLPYL, WGLLDLT, PAERLRS, RNLDGWS, NLSSSWI, TLPSNTH, MSAFPFL, SRLGQYI, PFGPLPP, TIASTLH, PRAPADV, 및 ESPLKRQ으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 하이드로젤 포접 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 게스트 분자와 생리활성 물질은 분자량 200 내지 5,000 Da의 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG), 폴리에테르이미드(polyetherimide; PEI), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol; PPG) 또는 폴리글라이신(polyglycine), (polyhistidine) 및 폴리(RADA)로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드인 링커(linker)를 통해 연결된 것인, 하이드로젤 포접 복합체.
  7. 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및
    게스트 분자로서 아다만틴, 아조벤젠, 콜레스테롤, tert-부틸, 사이클로헥실 에스테르, 및 나프틸로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가 직접 또는 링커를 통해 연결된 줄기세포-분화조절 인자;를 유효성분으로 포함하고,
    상기 베타-사이클로덱스트린과 상기 게스트 분자는 비공유 결합의 복합체를 형성하고,
    상기 폴리포스파젠은 3차원 구조의 젤을 형성하며, 3차원 구조의 젤 형태의 상기 폴리포스파젠에 치환되어 제공된 상기 베타-사이클로덱스트린과 상기 폴리포스파젠간 연결 부위가 분해되어 상기 베타-사이클로덱스트린 분자에 포접된 상기 게스트 분자와 연결된 상기 줄기세포-분화조절 인자를 방출하는, 줄기세포 분화 조절용 하이드로젤 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    베타-사이클로덱스트린에 게스트 분자가 호스트-게스트 상호작용에 의하여 포접되어 컨쥬게이트를 형성함으로써 복합체를 형성하는 것인, 줄기세포 분화 조절용 하이드로젤 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및 게스트 분자로서 아다만틴, 아조벤젠, 콜레스테롤, tert-부틸, 사이클로헥실 에스테르, 및 나프틸로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가가 직접 또는 링커를 통해 연결된 줄기세포-분화조절 인자;는 독립적으로 제공되거나, 베타-사이클로덱스트린에 게스트 분자가 호스트-게스트 상호작용에 의하여 포접되어 컨쥬게이트를 형성함으로써 형성된 복합체의 형태로 제공되는 것인, 줄기세포 분화 조절용 하이드로젤 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    줄기세포-분화조절 인자의 종류, 비율 및 둘 모두를 조절함으로써 줄기세포가 특정 상태로 분화되도록 조절하는 것인, 줄기세포 분화 조절용 하이드로젤 조성물.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 줄기세포-분화조절 인자는 RGD(arginine-lysine-aspartic acid)를 포함하는 펩타이드인 것인, 줄기세포 분화 조절용 하이드로젤 조성물.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 줄기세포-분화조절 인자는 CESPLKRQ를 포함하는 펩타이드 및 CLRAHAVDIN를 포함하는 펩타이드인 것인, 줄기세포 분화 조절용 하이드로젤 조성물.
  13. 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠; 및
    게스트 분자로서 아다만틴, 아조벤젠, 콜레스테롤, tert-부틸, 사이클로헥실 에스테르, 및 나프틸로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가 직접 또는 링커를 통해 연결된 IL-2;를 유효성분으로 포함하고,
    상기 베타-사이클로덱스트린과 상기 게스트 분자는 비공유 결합의 복합체를 형성하고,
    상기 폴리포스파젠은 3차원 구조의 젤을 형성하며, 3차원 구조의 젤 형태의 상기 폴리포스파젠에 치환되어 제공된 상기 베타-사이클로덱스트린과 상기 폴리포스파젠간 연결 부위가 분해되어 상기 베타-사이클로덱스트린 분자에 포접된 상기 게스트 분자와 연결된 상기 IL-2를 방출하는, 암세포 증식 또는 전이 억제용 하이드로젤 조성물.
  14. 복수의 소수성 아미노산, 친수성 고분자, 및 베타-사이클로덱스트린이 치환된 온도감응성 폴리포스파젠이고,
    상기 베타-사이클로덱스트린은 호스트-게스트 상호작용(host-guest interaction)에 의하여 게스트 분자를 포접(inclusion)하고,
    상기 베타-사이클로덱스트린과 상기 게스트 분자는 비공유 결합의 복합체를 형성하고,
    상기 폴리포스파젠은 3차원 구조의 젤을 형성하며, 3차원 구조의 젤 형태의 상기 폴리포스파젠에 치환되어 제공된 상기 베타-사이클로덱스트린과 상기 폴리포스파젠간 연결 부위가 분해되어 상기 베타-사이클로덱스트린 분자에 포접된 상기 게스트 분자와 연결된 줄기세포-분화조절 인자를 방출하는, 온도감응성 폴리포스파젠.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 베타-사이클로덱스트린은 C1-6 알킬렌디아민, 폴리(C1-6 알킬렌디아민), n-아미노-n-옥소알칸산(이때, n은 2 내지 6의 정수), 티올, 카르복실레이트, C2-6 히드록시알킬 m-아미노-m-옥소알칸산(이때, m은 2 내지 6의 정수), 시아노-아미노-C1-4 알킬티오-C1-6 알칸을 링커로 이의 6번 탄소상의 히드록실기를 통해 폴리포스파젠 주쇄에 결합된 것인, 온도감응성 폴리포스파젠.
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