CN114269391A - 包含通过使用β-环糊精的主体-客体相互作用与热敏性聚(磷腈)结合的生理活性物质的水凝胶包合复合物及其用途 - Google Patents

包含通过使用β-环糊精的主体-客体相互作用与热敏性聚(磷腈)结合的生理活性物质的水凝胶包合复合物及其用途 Download PDF

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CN114269391A CN202080059215.4A CN202080059215A CN114269391A CN 114269391 A CN114269391 A CN 114269391A CN 202080059215 A CN202080059215 A CN 202080059215A CN 114269391 A CN114269391 A CN 114269391A
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宋秀昶
洪起铉
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Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
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Abstract

本申请涉及一种水凝胶组合物，包括：热敏性聚磷腈，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和主体分子被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和生理活性物质，其与客体分子连接，其中所述客体分子通过主体‑客体相互作用而包含在主体分子中，并且在所述聚磷腈和生理活性物质之间形成偶联物。当本申请的水凝胶组合物被引入活体时，其逐渐释放生理活性物质并为干细胞分化提供有利条件。此外，可以以高重现性制备本申请的水凝胶组合物，其中生理活性物质的种类、比例和布置被控制为适合于干细胞分化。

Description

包含通过使用β-环糊精的主体-客体相互作用与热敏性聚(磷 腈)结合的生理活性物质的水凝胶包合复合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种水凝胶包合复合物及其用途，该水凝胶包合复合物经由被取代至热敏性聚(磷腈)上的β-环糊精通过主体-客体相互作用而与生理活性物质结合。
背景技术
作为以组织再生为目的构建新组织的生物相容性物质，使用了多种基于生物偶联技术的物质，例如纳米颗粒、脱细胞基质和水凝胶。在这些物质中，水凝胶由于在吸收大量水、高生物相容性和活组织相似性方面的能力而是组织工程的优良物质来源。具体而言，合成水凝胶，如聚(乳酸-乙醇酸)衍生物、聚(乳酸)衍生物、透明质酸、聚氨酯丙烯酸酯和许多其他种类的生物医学聚合物通过利用生理活性物质和干细胞而用于组织再生。
已经致力于微调生物相容性物质，以便将它们植入活体中并且以期望的方向发生组织再生。微调的生物相容性物质意味着在物理和化学方面都受到良好控制的物质。这种对生物相容性物质的微调在一些治疗方面是非常需要的，例如，药物递送系统中增强的治疗窗口、免疫治疗功效(以避免自身免疫反应或免疫毒性)、疾病特异性靶向和对再生工程中适当的干细胞刺激。通常，生物相容性物质的物理控制是指机械性能控制和微观结构控制，影响细胞特性或治疗药物释放模式。生物相容性物质的化学控制是指化学键的控制。具体来说，两个分子之间的化学键称为生物偶联(Kalia J,Raines RT.Advances inBioconjugation.,Current organic chemistry14,138-147(2010))。尽管生物偶联技术为生物物质提供了优势，包括化学降解的结构稳定性、改善的体内停留时间和降低免疫原性，但仍然存在例如毒性问题、重现性低和合成过程复杂等问题。特别是，由于使用丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、铜(I)-催化的叠氮化物炔烃环加成(copper(I)-catalyzed azide alkynecycloaddition，CuAAC)和自由基导致了高化学选择性，因此由于这些基团的残留，存在对毒性的高风险问题(Spicer CD,Pashuck ET和Stevens MM,Achieving ControlledBiomolecule-Biomaterial Conjugation,Chemical reviews,118,7702-7743(2018))。此外，低重现性阻碍了生物相容性物质的微调。
特别是，已经尝试使用包括生理活性物质的水凝胶来控制干细胞的分化。有多种生物活性分子可用于MSC(mesenchymal stem cells，间充质干细胞)的增殖和分化，例如小化学物质、蛋白质和肽。由于单独施用MSC会使它们分化成所需的谱系，并且在恶劣的身体环境中难以生存，因此用此类水凝胶和生物活性分子的帮助对于理想的组织再生至关重要。最近，开发了使用多种蛋白质通过利用MSC进行组织再生的各种方法，以实现所需的MSC分化。然而，即使通过干细胞、生物活性分子和水凝胶的物理和化学控制，对干细胞分化的微调仍未达到令人满意的水平。
同时，主体-客体相互作用通过经由分子自识别系统的独特结构识别而形成了两个或多个分子的非共价复合物。存在许多大环主体分子，例如环糊精(cyclodextrins，CDs)、冠醚、环烷、穴状配体和葫芦脲。在这些主体分子中，环糊精因其低毒性和低免疫原性而适用于组织工程或生物学应用。主要用于工业和研究领域的著名环糊精是α-CD、β-CD和γ-CD。最重要的是，β-CD是一种极好的分子，因为它具有高水溶性后修饰、用于客体分子负载的出色内腔尺寸以及相对较低的成本。使用β-CD的主体-客体相互作用为生物相容性物质提供了一些好处，包括易于构建超分子结构，避免了制造过程中的多个合成步骤和复杂的纯化过程。在过去的几十年中，β-CD已实际用于各种生物医学应用，例如药物递送系统、诊断应用和组织工程。
然而，尚未尝试将使用主体-客体相互作用的生理活性物质引入水凝胶，例如热敏性聚(磷腈)。在这种情况下，本发明人试图以调节多种生物活性因子的目的在承载β-CD的聚(有机磷腈)的3D水凝胶中引入主体-客体相互作用。本发明人在过去几十年中已将PPZ开发为一种生物相容性和热敏性水凝胶(参见韩国专利申请公开号10-2005-0012533A和10-2008-0110472A等)，以及具有治疗价值的药物，例如化学药物、蛋白质和基因，都可以由该水凝胶递送。
本发明人成功合成了β-CD PPZ，并研究了β-CD PPZ的生物活性客体分子的化学计量控制，以克服生物偶联系统的局限性。他们通过主体中客体分子比例的不同组合形成了各种功能性客体分子，无需进一步合成一批β-CD PPZ即可产生水凝胶，并发现通过应用这些水凝胶可以实现微调的分化，从而完成本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种水凝胶包合复合物，其包括：热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和作为主体分子的β-环糊精(贝塔-环糊精；β-CD)被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和生理活性物质，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，并选自由以下组成的群组：金刚烷(adamantine)、偶氮苯(azobenzene)、胆固醇(cholesterol)、叔丁基(tert-butyl)、环己酯(cyclohexyl ester)和萘基(naphthyl)，其中通过经由主体-客体相互作用将客体分子包含在β-环糊精中，客体分子与全部或部分β-环糊精偶联。
本发明的另一个目的是提供一种用于控制干细胞分化的水凝胶，其包括：作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和干细胞分化调节剂，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，干细胞分化调节剂选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
本发明的又一个目的是提供一种再生组织的方法，该方法包括将水凝胶组合物注射到受损组织部位的步骤，水凝胶组合物包括作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸，亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和干细胞分化调节剂，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，所述干细胞分化调节剂选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
本发明的又一个目的是提供一种用于抑制癌细胞增殖或转移的水凝胶组合物，其包括作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和IL-2，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，IL-2选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
本发明的又一个目的是提供热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上。
附图说明
图1示出了β-CD PPZ合成的示意图。
图2示出了β-CD PPZ的化学结构及其表征，其中图2A示出了β-CD-偶联酸PPZ的化学结构。图2的B示出了包含异亮氨酸、PEG和β-CD的β-CD PPZ的示意图，图2的C示出了β-CDPPZ和酸性PPZ的1H NMR结果，图2的D示出了与酸性PPZ、β-CD和酸性PPZ的混合物相比，β-CD-偶联PPZ的FT-IR。
图3示出了Ad-RGD合成过程的示意图。
图4示出了Ad-PEG-NH2的NMR结果。
图5示出了Ad-PEG-NH2的FT-IR结果。
图6示出了Ad-PEG-MeAc的NMR结果。
图7示出了Ad-PEG-RGD的NMR结果。
图8的A示出了β-CD PPZ和Ad-RGD的2D-NOESY NMR结果，图8的B示出了β-CD和金刚烷的确切质子位置，和图8的C示出了根据各种Ad-RGD浓度(β-CD:Ad-RGD＝100:0至100:100)的β-CD PPZ和Ad-RGD-混合水凝胶的交叉峰的2D-NOESY积分值。
图9示出了β-CD PPZ和β-CD PPZ/Ad-RGD混合物的凝胶化特性，其中图9的A示出酸性PPZ(黑色)和β-CD PPZ(红色)的粘度，图9的B示出在体温下凝胶化的发生情况，图9的C示出酸PPZ和β-CD PPZ的热敏性胶凝特性的细节。
图10示出了通过活/死测定和CCK-8验证的MSC的存活率结果，其中图10的A示出当将0mL至100mL的β-CD PPZ和Ad-RGD的组合应用于MSC时活/死测定的结果(绿色代表活的MSC，红色代表死的MSC)(在以下时间点进行测量：第0天、第1天、第3天和第7天)，图10的B示出了在ECM模拟3D水凝胶中培养的MSC的示意，图10的C示出7天后使用CCK-8的MSC的存活率的比较结果。
图11示出在添加了各种浓度的Ad-RGD的MSC正常生长培养基中7天的相对基因表达水平(标准化到β-肌动蛋白)，其中，图11的A和图11的D各自示出ALP和胶原蛋白I(骨生成因子的标志物)的相对基因表达水平，图11的B和图11的E各自示出胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖(软骨形成因子的标志物)的相对基因表达水平，图11的C和图11的F各自显示了C/EBPα和PPARγ(脂肪形成因子的标志物)的相对基因表达水平。
图12示出了基于实施例1的水凝胶组合物的MSC分化控制活性的β-CD PPZ和Ad-RDG的偶联物的MSC分化活性的示意图。
图13示出了实施例2的水凝胶组合物中Ad-TGF/Ad-HAV合成过程的示意图。
图14示出了Ad-TGF的NMR结果。
图15示出了Ad-HAV的NMR结果。
图16示出了β-CD PPZ/Ad-TGF或HAV偶联物通过主体-客体相互作用的热敏特性，其中图18的A示出了β-CD PPZ、β-CD PPZ/Ad-TGF 100和β-CD PPZ/Ad-HAV 100的热敏性胶凝化细节(阐明了每组在体温(37℃)下的粘度)，图18的B示出了β-CD PPZ(顶部)、β-CDPPZ/Ad-TGF 100(中部)和β-CD PPZ/Ad-HAV 100(底部)的溶胶-凝胶转变的可视化，图18的C示出了用于证明β-CD PPZ和Ad-TGF之间的主体-客体相互作用的2D NOESY结果(左)和用于证明PPZ和Ad-HAV之间的主体-客体相互作用的2D NOESY结果(右)。
图17的A示出了β-CD PPZ和Ad-肽之间的主体-客体相互作用的示意图，图17的B示出了β-CD PPZ、β-CD PPZ/Ad-TGF和Ad-HAV(n＝3)的流体动力学直径的结果，图17的C示出了β-CD PPZ、β-CD PPZ/Ad-TGF、Ad-HAV和单独的Ad-肽(Ad-TGF和Ad-HAV)的尺寸分布结果和TEM图像(对于β-CD PPZ、β-CD PPZ/Ad-TGF和Ad-HAV比例尺代表50nm，对于单独的Ad-肽比例尺代表500nm)，图17的D示出了单独的Ad-肽在水性状态中的聚集的说明，图17的E示出了单独的Ad-肽的流体动力学直径的结果。
图18示出了β-CD PPZ/Ad-TGF 120和β-CD PPZ/Ad-HAV 120的尺寸分布结果。
图19示出了使用IVIS系统依赖于Ad-肽比率梯度的主体-客体相互作用的维持，其中图17的A示出了主体-客体相互作用的图片，其中Ad-TGF和Ad-HAV在小鼠中分别与用FITC标记的β-CD PPZ和用罗丹明(Rho)标记的MSC相互作用(在21天期间，Ad-TGF和Ad-HAV中的每一个梯度荧光在IVIS系统中被检测)，图17的B示出了Ad-TGF(顶部)和Ad-HAV(底部)21天的平均辐射效率值。
图20示出了不同浓度的β-CD PPZ/Ad-肽/MSC复合物的组织相容性及其基本分化能力，其中图19的A示出了用于MSC的组织相容性验证的H&E染色的结果(左)和用于演示软骨形成分化的番红-O染色的结果(比例尺代表100μm)，图19的B示出了使用IVIS系统测量的在β-CD PPZ与各种浓度的Ad-肽的偶联物中的干细胞的维持，图19的C示出了GFP标记的MSC在小鼠中21天(n＝3)的平均辐射效率值，图19的D示出了体内实验方案的基本图示。
图21示出了实施例2的β-CD/Ad-肽的MSC软骨形成诱导活性(注射后第21天处死小鼠)，其中图20的A示出了使用聚集蛋白聚糖的免疫组织化学结果，聚集蛋白聚糖是用于检测软骨形成的代表性蛋白质(比例尺代表20μm),图20的B示出了Agg荧光强度的分析结果(n＝3)。图20的C示出了小鼠组织中的Agg基因表达水平(n＝3)。
图22示出了实施例2的β-CD/Ad-肽的MSC软骨形成诱导活性(注射后第21天处死小鼠)，其中图21的A示出了用Col II的免疫组织化学结果，Col II是用于软骨形成检测的代表性蛋白质(比例尺＝20μm),图20的B示出了Col II荧光强度的分析结果(n＝3)，图20的C示出了小鼠组织中的Col II基因表达水平(n＝3)。
图23示出了实施例2的β-CD/Ad-肽不诱导MSC骨生成，其中图22的A示出了用各种Ad-肽/β-CD PPZ/MSC的Von Kossa染色结果(比例尺代表100μm)，图22的B示出了Runx2的基因表达水平，Runx2是对于骨生成的典型基因(n＝3)。
图24示出了施用用实施例2的水凝胶组合物处理的间充质干细胞(mesenchymalstem cell，MSC)的示意图，其中为了控制MSC命运以适合软骨形成，与客体分子结合的TGF-β1肽和N钙粘蛋白肽可以以化学计量的灵活性顺利引入水凝胶组合物中。
图25示出了使用治疗性蛋白质例如实施例3的水凝胶组合物作为生理活性物质的示意图。
图26示出了通过点击化学形成Ad-IL2的示意图。
图27示出了通过EDC化学形成Ad-IL2的示意图。
图28示出了通过经由胺-聚乙二醇-金刚烷而偶联蛋白质的硫醇基团来检查Ad-IL2形成的电泳结果。
图29示出了与金刚烷化学偶联的Ad-IL2的肿瘤生长抑制作用。
具体实施方式
下文将更详细地阐述本发明。
同时，本文公开的每个描述和实施例也可以应用于其他描述和实施例。也就是说，本文公开的各种元素的所有组合都落入本发明的范围内。此外，本发明的范围不受以下具体描述的限制。
此外，本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同物。此外，这些等同物应被解释为落入本发明的范围内。
为实现以上目的，本发明的一个方面是提供一种水凝胶包合复合物，其包括：热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和作为主体分子的β-环糊精(贝塔-环糊精；β-CD)被取代到所述热敏性聚(磷腈)上；和一种生理活性物质，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，并选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基，其中通过经由主体-客体相互作用将客体分子包含到β-环糊精中而使客体分子与全部或部分β-环糊精偶联。
如本文所用，“水凝胶”是指由存在于水溶液中的聚合物形成的三维网络结构，通常分为通过经由共价键而化学交联来形成的水凝胶和通过经由分子之间的物理相互作用而物理交联来形成的水凝胶。本公开的水凝胶通常具有热敏性聚(磷腈)的基本骨架，其中主体分子被取代到热敏性聚(磷腈)，并且主体分子与客体分子形成偶联物，该客体分子参与与主体分子的主体-客体相互作用，并且生理活性物质与客体分子连接。水凝胶组合物是可注射到活体中的生物相容性物质。
如本文所用，“热敏性”是指聚合物水溶液在低温下保持液态(溶胶)但聚合物水溶液随着温度升高而转变为凝胶的性质。具体而言，是指在室温下保持液态，在35℃至37℃以上的温度下转变为凝胶状的性质。
由于本发明的水凝胶被引入体内以通过体温形成三维结构的凝胶，存在因为液态而易于注射的优点，同时由于其转变为凝胶状态，药物可以缓慢释放。此外，凝胶状态的水凝胶可以形成适合干细胞分化的生态位(微环境)。例如，当干细胞被简单地注射时，它们会非特异性地扩散到全身。相比之下，当干细胞以与凝胶混合的状态注射时，它不仅简单地使注射变得容易，例如靶向所需部位，从而允许干细胞被输送到所需部位并保留在其中，而且还有助于就地递送到所需位点。
同时，干细胞的特点是具有i)自我更新和ii)多能性，调节干细胞的分化是一个重要因素，尤其是在组织再生中。此外，可以通过用包含根据本发明的干细胞分化调节剂的水凝胶组合物处理干细胞来调节干细胞分化。在这方面，通过调节干细胞分化调节剂的类型或比例或两者，可以维持干细胞的干性，或者可以调节干细胞分化为特定状态。
此外，本发明的水凝胶组合物可用于组织再生。如上所述，由于包含本发明的干细胞分化调节剂的水凝胶组合物可以调节干细胞分化，因此可以通过将组合物注射到受损组织部位来调节相应部位的干细胞分化并促进所需组织的再生。就此而言，组合物可进一步包含干细胞，但不限于此，水凝胶组合物本身可发挥促进组织再生的作用。
如本文所用，“聚(磷腈)”被疏水性氨基酸和亲水性聚合物取代，以使其表现出热敏性质。具体地，可以将分子量在350至2500范围内的疏水性氨基酸酯和亲水性甲氧基-聚乙二醇引入二氯磷腈的线性聚合物中，并且可以将能够控制聚合物降解速率的氨基酸、肽或缩酚酸肽酯部分地引入聚合物中。此外，可以将官能团引入到本发明的基于磷腈的聚合物中，例如，通过将侧链上具有官能团如羟基、酰胺基、氨基、硫醇基或羧基的取代基直接引入到主链中，或将其中官能团被保护基取代的氨基酸酯或肽酯取代基引入到聚合物的主链中，随后除去保护基，或通过将引入有具有官能团的取代基的聚合物转化成另一官能团的方法。用于本公开的热敏性聚(磷腈)可以是本领域已知的那些(参见韩国专利申请公开No.20050012533A和10-2008-0110472A等)。在这点上，热敏性聚(磷腈)可以以(55至80)：(5至25)：(5至20)的摩尔比包括多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精，但不限于此。
疏水性氨基酸可以是选自以下组成的群组中的任何一种或多种：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。疏水性氨基酸具有NHCH(R1)CO2R2的结构，其中R1可选自以下组成的群组：H、CH3、CH2SH、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)C2H5、CH2CH2SCH3、CH2C6H5、CH2C6H4OH和CH2C2NH2C6H4，且R2可选自以下组成的群组：H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、CH2C6H5和CH2CHCH2。
亲水性聚合物可以是分子量在550至2500范围内的聚亚烷基二醇，具体地，聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇，或乙二醇和丙二醇的嵌段共聚物。聚亚烷基二醇的亚烷基重复单元的数目可以在7至50的范围内。
可以调节疏水性氨基酸和亲水性聚合物的类型或取代量，以及聚(磷腈)的浓度等，以控制聚(磷腈)的胶凝温度、凝胶强度和/或生物降解速率。例如，随着疏水性氨基酸的组成增加，胶凝温度可能降低，而随着聚磷腈浓度的增加，胶凝温度变得降低，胶凝强度增加。此外，随着亲水性聚合物的链长增加，凝胶强度增加并且凝胶化温度变得更高。
本公开的结合生理活性物质的水凝胶包合复合物可以将通过“主体-客体相互作用”连接到客体分子的生理活性物质递送到体内。“主体-客体相互作用”通过分子自识别系统的独特结构识别形成两个或更多个分子的非共价结合的复合物。与通过共价键进行的偶联系统相比，通过主体-客体相互作用保持生物活性分子更简单地可再现的。根据本公开的实验实施例1至4，发现以混合之前制备的客体分子的含量和/或比率成比例地制成了特定偶联物。如上所述，由于使用主体-客体相互作用，可以容易地控制连接到聚(磷腈)表面的生理活性物质的含量和/或比例。此外，与客体分子连接的生理活性物质可以通过与主体分子的连接在体内的裂解而缓慢释放。
如本文所用，术语“主体分子”是指能够捕获客体分子并具有疏水腔和亲水表面的任何物质。具体地，本公开的结合生理活性物质的水凝胶包括β-环糊精作为主体分子。由于其低毒性和低免疫原性，β-环糊精适用于组织工程或生物学应用。
如本文所用，术语“客体分子”是指被受困在主体分子的空腔中的分子。由于主体分子的空腔显示疏水性，客体分子也显示疏水性，并且可以使用具有适合包含在空腔中的尺寸的物质。例如，本公开的水凝胶包合复合物包括β-环糊精作为主体分子，因此优选包括金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯、萘基或其组合作为客体分子，其可以与主体分子特异性相互作用。在这方面，客体分子可以被进一步修饰以促进生理活性物质的活性。
如本文所用，术语“生理活性物质”是指当注射到身体或细胞中时表现出活性的物质，并且可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：蛋白质、肽、疫苗、基因、激素、抗癌药、血管生成抑制剂、糖、多元醇、含糖多元醇、含聚合物多元醇、含糖氨基酸和含糖离子。
蛋白质可以选自由以下组成的群组：毒蜥外泌肽-4、促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、生长激素(人、猪、牛、等)、生长激素释放因子、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)、凝血因子、胰岛素、催产素、加压素、促肾上腺皮质激素、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growthfactor，PDGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子-β(transforminggrowth factor-beta，TGF-β)、神经生长因子、脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)、神经营养蛋白-3(neurotrophin-3，NT-3)、神经营养蛋白-4/5、催乳素、促黄体素释放素、促黄体激素释放激素(luteinizing hormone releasinghormone，LHRH)、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、生长抑素、胰高血糖素、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-11(interleukin-11，IL-11)、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、促胰液素、降血钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、促甲状腺激素释放激素(thyrotropin releasing hormone，TRH)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand，TRAIL)、肝素酶、骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein，BMP)、人心房利钠肽(uman atrial natriuretic peptide，hANP)、胰高血糖素样肽(glucagon-likepeptide，GLP-1)、肾素、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽、环孢菌素、神经降压素、速激肽、神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)、肽YY(peptide YY，PYY)、血管活性肠多肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)和垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP)。
肽可以是衍生自天然蛋白质的仿生肽。例如，肽可以选自由以下组成的群组：胶原蛋白1衍生的GFOGER和DGEA；层粘连蛋白衍生的YIGSR、SIKVAV、IKVAV、IKLLI、LRGDN和SINNNR；层粘连蛋白γ1衍生的LRE、PDGSR、GTFALRGDNGQ、CFALRGDNP、NPWHSIYITRFG、TWYKIAFQRNRK、KAFDITYVRLKF和LGTIPG；纤连蛋白衍生的GRGDS、PKRGDL、NGRAHA、GACRGDCLGA(环状)、IDAPS、REDV、PHSRN、KQAGDV、LDV、WQPPRARI、SPPRRARV、LIGRKK、IWKHKGRDVILKKDVRFYC、KLDAPT和PRARI；玻连蛋白衍生的CKKQRFRHRNRKG；骨桥蛋白衍生的KRSR、FHRRIKA、CGGNGEPRGDTYRAY、SVVYGLR和ELVTDFPTDLPAT；弹性蛋白衍生的VPGIG和VGVAPG；胶原蛋白4衍生的MNYYSNS和CNYYSNS；血小板反应蛋白衍生的CSVTCG、GRGDAC、FQGVLQNVRFVF、AELDVP和VALDEP；巢蛋白-1衍生的GFRGDGQ和SIGFRGDGQTC；N-钙粘蛋白衍生的HAV；和TGF-β1衍生的FLPASGL、PWPLPYL、WGLLDLT、PAERLRS、RNLDGWS、NLSSSWI、TLPSNTH、MSAFPFL、SRLGQYI、PFGPLPP、TIASTLH、PRAPADV和ESPLKRQ。
疫苗可以是选自由肝炎疫苗等组成的群组中的一种或多种。
基因可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：小干扰RNA(smallinterference RNA，siRNA)、质粒DNA、反义寡脱氧核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)等。
激素可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：睾酮、雌二醇、孕酮、前列腺素和它们的合成类似物，以及被修饰或显示相同效果的物质。
抗癌药可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、替加氟(tegafur)、伊立替康(irinotecan)、多西他赛(docetaxel)、环磷酰胺、西西他滨(cemcitabine)、异环磷酰胺、丝裂霉素C、长春新碱(vincristine)、依托泊苷(etoposide)、甲氨蝶呤、拓扑替康(topotecan)、他莫昔芬(tamoxifen)、长春瑞滨(vinorelbine)、喜树碱(camptothecin)、柔红霉素(danuorubicin)、苯丁酸氮芥、苔藓抑素-1、加利车霉素(calicheamicin)、玛雅坦(mayatansine)、左旋咪唑、DNA重组干扰素alfa-2a、米托蒽醌(mitoxantrone)、尼莫司汀(nimustine)、干扰素alfa-2a、多西氟利定(doxifluridine)、福美坦(formestane)、醋酸亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、卡莫氟(carmofur)、替尼泊苷(teniposide)、博来霉素(bleomycin)、卡莫司汀(carmustine)、庚铂(heptaplatin)、依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrozole)、雌莫司汀(estramustine)、卡培他滨(capecitabine)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、多糖钾、醋酸甲羟孕酮、表柔比星(epirubicin)、来曲唑(letrozole)、吡柔比星(pirarubicin)、托泊替康(topotecan)、六甲蜜胺(altretamine)、柠檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、BCNU、泰索帝(taxotere)、放线菌素D、阿那曲唑(anasterozole)、贝洛替康(belotecan)、伊马替尼(imatinib)、氟尿苷、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、唑来膦酸盐(zoledronate)、长春新碱(vincristine)、氟他胺(flutamide)、伐柔比星(valrubicin)、链脲佐菌素、聚乙二醇偶联抗癌剂，及其合成类似物，以及经修饰或显示相同效果的物质。
血管生成抑制剂可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：氯膦酸盐、6-脱氧-6-去甲基-4-去二甲氨基四环素(COL-3)、强力霉素、马马司他(marimastat)、2-甲氧基雌二醇、角鲨胺(squalamine)、SU5164、沙利度胺(thalidomide)、TNP-470、考布他汀A4(combretastatin A4)、大豆异黄酮、恩扎司他林(enzastaurin)、CC 5013(Revimid；Celgene Corp,Warren,NJ)、塞来昔布(celecoxib)、ZD 6474、氢溴酸卤夫酮、干扰素-α、贝伐单抗(bevacizumab)、鲨鱼软骨提取物(AE-941)、白介素-12、血管内皮生长因子-陷阱(VEFG-trap)、西妥昔单抗(cetuximab)、瑞比司他(rebimastat)、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)抑制剂(例如，BMS-275291(Bristol-Myers Squibb,New York,NY)、S-3304)等)、蛋白激酶Cβ抑制剂(例如，LY317615)、内皮抑素、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK 222584)、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)(SU11248)、西仑吉肽(cilengitide)(EMD-121974)、人源化单克隆抗体MEDI-522、EOS-200-4、整合素α-5-β-1拮抗剂(ATN-161),及其合成类似物，以及经过修饰或显示相同效果的物质。
糖可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：乳糖、葡萄糖、葡聚糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖和聚蔗糖。
多元醇可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：肌醇、甘露醇和山梨醇。
含糖多元醇可以是蔗糖-甘露醇、葡萄糖-甘露醇或它们的组合。
包含聚合物的多元醇可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：海藻糖-聚乙二醇(trehalose-PEG)、蔗糖-聚乙二醇(sucrose-PEG)和蔗糖-葡聚糖。
含糖氨基酸可以是山梨糖醇-甘氨酸、蔗糖-甘氨酸或它们的组合。
含糖离子可以是海藻糖-硫酸锌(trehalose-ZnSO4)、麦芽糖-硫酸锌(maltose-ZnSO4)或它们的组合。
生理活性物质可以是干细胞分化调节剂。在这种情况下，水凝胶组合物当与干细胞共培养时，水凝胶组合物可用于控制干细胞分化。干细胞分化调节剂与下述相同。
或者，生理活性物质可以是在体内表现出治疗效果的物质，但不限于此。
在本公开的水凝胶包合复合物中，生理活性物质可以通过连接器被连接。“连接器”(或间隔物)在客体分子和生理活性物质之间提供间隙，使3D水凝胶的生理活性物质易于粘附到生物活性位点。例如，作为客体分子与生理活性物质之间的连接器，聚乙二醇(PEG)、聚醚酰亚胺(PEI)或聚丙二醇(PPG)具有200Da至5000Da的分子量，或可以使用多肽，所述多肽选自由以下组成的群组：聚甘氨酸、聚组氨酸和聚(RADA)。在本公开的非限制性示例性实施例中，使用了1.0kDA的PEG(实施例1和2)。
本发明的另一个方面提供了一种用于控制干细胞分化的水凝胶组合物，水凝胶组合物包括：作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸，亲水性聚合物和β蛋白质例如天然蛋白质的使用产生了与稳定性和经济压力相关的问题，因此可以使用由其衍生的仿生肽。-环糊精被取代到所述热敏性聚(磷腈)上；和干细胞分化调节剂，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，并选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
本文使用的术语与上述相同。
此外，本发明提供了水凝胶组合物在控制干细胞分化中的用途，所述水凝胶组合物包括：作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸，亲水性聚合物和β蛋白质例如天然蛋白质的使用产生了与稳定性和经济压力相关的问题，因此可以使用由其衍生的仿生肽。-环糊精被取代到所述热敏性聚(磷腈)上；和干细胞分化调节剂，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，并选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
如本文所用，术语“干细胞”统指在分化为构成各组织的细胞之前的阶段的未分化细胞，并且干细胞在特定的分化刺激(环境)下分化为特化细胞。与停止细胞分裂的分化细胞不同，干细胞具有增殖(扩增)的特性，因为它们能够通过细胞分裂(自我更新)产生与自身相同的细胞，并且干细胞在分化中也具有可塑性，因为它们在受到分化刺激时分化成特化细胞，也可能在不同环境或不同分化刺激下分化成不同细胞。这些干细胞可以根据其来源分为胚胎干细胞和成体干细胞，在本发明中，优选使用成体干细胞，而不是使用具有许多生物学、伦理和法律问题并且在临床应用中受到限制的胚胎干细胞。在成体干细胞中，可以使用骨髓和脂肪组织等成体组织中很少存在的间充质干细胞(MSCs)。
在本公开中，用于控制干细胞分化的用途是指用于控制干细胞以诱导干细胞分化为特化细胞，例如软骨细胞、骨细胞、神经细胞、成神经细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等的用途。
本公开的用于控制干细胞分化的水凝胶组合物可以与干细胞一起直接植入个体的疾病部位，并且可以在体外培养。对于植入，使用导管的非手术治疗和在切开疾病部位后注射的手术治疗都是可能的。
如本文所用，“干细胞分化调节剂”是指影响干细胞分化的化学物质、蛋白质或肽。特别地，存在于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中并控制细胞增殖和分化的物质可以与其对应。其非限制性实例可包括蛋白质，例如BMP、N-钙粘蛋白、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)。使用天然蛋白质会产生与稳定性和经济压力有关的问题，因此可以使用衍生自其的仿生肽。
本公开的干细胞分化调节剂可以是包含精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸(RGD)的肽。在水凝胶组合物中，当RGD的摩尔数与主体分子的摩尔数之比在50％至100％的范围内时，水凝胶组合物可以是用于诱导软骨细胞和/或骨细胞分化的组合物。具体而言，水凝胶组合物可以在早期肥大阶段诱导分化。当RGD的摩尔数与主体分子的摩尔数之比在0％至25％的范围内时，水凝胶组合物可以是用于诱导脂肪细胞分化的组合物。
在这点上，在本公开的非限制性示例性实施例中，在ECM分子候选者中，精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸(RGD)是有粘附性的并是对MSC的发育有效的肽，其在本发明中被选为干细胞分化调节剂(实施例1)。RGD是一种参与MSC识别、附着、存活和分化的三肽，是纤连蛋白内的主要结合位点。因此，在3D水凝胶中拥有RGD对于MSC的存活和分化是必要的。RGD对MSC的刺激导致各种分化，例如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。根据本公开的实验性实验例3，发现仅通过控制Ad-RGD的量就可以控制MSC的命运(见图12)。该结果表明有必要设计一个高度可控的MSC生态位，并且需要RGD作为生理活性物质，以便为MSC分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞提供水凝胶组合物。
此外，在需要通过控制ECM中存在的各种生理活性物质的浓度来合成水凝胶来尝试几个合成批次的情况下，骨/软骨/脂肪的产生可以通过使用本公开中的主体-客体相互作用根据需要控制Ad-RGD的浓度来诱导(图11)。该结果表明在本公开的水凝胶中可以容易地控制要精细控制的生理活性物质的浓度。
同时，干细胞分化调节剂可以是包含CESPLKRQ的肽和包含CLRAHAVDIN的肽。这里，包含CESPLKRQ的肽和包含CLRAHAVDIN的肽的摩尔比可以在4:6至6:4的范围内。在这种情况下，水凝胶组合物可以是用于诱导分化成软骨细胞的组合物。
在这方面，分子量为25kDa的TGF-β1存在于胚胎骨和软骨发育部位，对于促进软骨特异性基因表达的细胞内信号级联具有关键作用。特别是，TGF-β1调节MAPK，所述MAPK包括p38、细胞外信号调节激酶1(ERK 1)和c-Jun N-末端激酶(JNK)作为软骨形成控制器。在本公开的非限制性示例性实施例中，使用CESPLKRQ，它是TGF-β1的整个肽序列中对TGF-β1受体而言最强的反应结合位点。
接下来，用于模拟作为肽的天然蛋白质来源是N-钙粘蛋白(N-cadherin)，对细胞间相互作用和软骨形成具有重要意义。N-钙粘蛋白的分子量约为99.7kDa。在最近十年中，许多研究都强调了诱导MSC软骨形成和模拟N-钙粘蛋白作用的His-Ala-Val(HAV)基序。尽管单独的HAV序列足以诱导MSC软骨形成，但扩展的HAV序列如CLRAHAVDIN被证明作为有效基序更为出色。因此，在本公开的非限制性示例性实施例中，选择了这种扩展的HAV肽序列。因此，本发明人在通过主体-客体相互作用的化学计量肽比例控制下，选择了一对衍生自天然蛋白质的肽序列，例如模拟TGF-β1的CESPLKRQ和模拟N-钙粘蛋白的CLRAHAVDIN。这些肽可以分别通过细胞间相互作用和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated proteinkinase，MAPK)的细胞内信号传导机制影响MSCs以诱导MSC的连续反应。
在本公开的实验性实施例6中，在T50和H50中观察到最高的软骨形成基因和蛋白质表达水平(参见图20和21)。换言之，同时使用合成的金刚烷-PEG-CESPLKRQ(Ad-TGF)和金刚烷-PEG-CLRAHAVDIN(Ad-HAV)来诱导优化的软骨形成。协调MAPK因子(p38、ERK-1/2和JNK)的复杂控制的TGF-β1与MSC软骨形成的启动密切相关。即使在合成水凝胶中，N-钙粘蛋白也通过细胞间相互作用来诱导MSCs的软骨形成。用于软骨形成分化的MAPK活化可以通过TGF-β1和N-钙粘蛋白两者协调。由于已经阐明了仅在TGF-β1或N-钙粘蛋白刺激下的MSC的软骨形成，因此这些蛋白质对软骨形成至关重要，并且对于MAPK因子的调解是相互关联的。实验例6的结果表明，N-钙粘蛋白不仅可以让MSC相互凝聚，还可以通过MAPK影响TGF-β1以表达软骨形成基因，例如Col II和Agg。由于这些原因，可以得出结论，就软骨形成的发展而言，这两个因素并不相互支配。最终，这两种平衡的Ad-肽如T50，H50基团的协调可以诱导最佳的软骨形成，因为它们对MAPK的非主导特征。
本发明的又一个方面是提供一种用于抑制癌细胞增殖或转移的水凝胶组合物，该水凝胶组合物包括：作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和IL-2，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，IL-2选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
另外，本发明的又一个方面提供一种水凝胶组合物在抑制癌细胞增殖或转移中的用途，所述水凝胶组合包括：作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和IL-2，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，IL-2选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
同时，本发明的水凝胶包合复合物可以通过以下方法制备，包括：第一步，制备热敏性聚磷腈，其中多个疏水氨基酸、亲水聚合物和主体分子被取代至所述热敏性聚磷腈上；第二步，制备通过连接器与客体分子连接的生理活性物质；第三步，将聚(磷腈)与生理活性物质混合。
在本公开中，证实了用于MSC的优化的软骨形成分化的水凝胶组合物可以在化学计量控制Ad-TGF和Ad-HAV之后基于主体-客体相互作用制备而无需进一步的合成过程(图23)。
尽管在本公开中为了说明的目的而用一些Ad-肽组合制备了一些水凝胶，但是也可以使用更多的Ad-肽比例组合和序列来容易地制备优化的生态位以将干细胞分化为所需状态。最终，该技术通过切换客体分子或比例从而提供了一个平台系统来制造理想的3D生物医学构造。因此，本公开的水凝胶组合物可以容易地制备，其中适合干细胞分化的生理活性物质的种类、比例和序列受到控制。
在这种情况下，基于已知的将干细胞分化为特定状态所需的ECM的组成，在第二步之前可以获得关于生理活性物质的种类和比例的已知信息。基于这些信息，可以根据上述信息和比例制备第二步的生理活性物质。因此，所制备的水凝胶组合物可以进行被精细控制以使其包括根据该种类和比例的生理活性物质。
在制备方法中，当生理活性物质的摩尔数大于主体分子的摩尔数时，大量的生理活性物质没有结合，因此生理活性物质的摩尔数优选小于主体分子的摩尔数。
本发明的又一个方面是提供一种热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至该热敏性聚(磷腈)上。
就这一点而言，β-环糊精的特征在于其通过作为连接器的以下的C6位置处的羟基而连接到聚(磷腈)的主链上：C1-6亚烷基二胺、聚(C1-6亚烷基二胺)、n-氨基-n-氧代链烷酸(其中n为2至6的整数)、硫醇、羧酸酯、C2-6羟烷基m-氨基-m-氧代链烷酸(其中m为2至6的整数)或氰基-氨基-C1-4烷硫基-C1-6烷烃。通过包括β-环糊精(其通过具有如上所述预定官能团的合适长度的连接器而被连接)，可以控制对根据取代的热敏性聚(磷腈)的胶凝温度的影响以提供在接近体温的温度下胶化的热敏性凝胶。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，本发明的范围不旨在限于此。
实施例1：包括β-CD PPZ和金刚烷-PEG-RGD的水凝胶组合物
材料
六氯环三磷腈(Aldrich)通过在真空(约0.1mmHg)下在55℃升华进行纯化。根据已知的方法制备聚(二氯磷腈)(Sohn,Y.S.等,Macromolecules,1995,28(22),7566-7568)。它是由六氯环三磷腈使用氯化铝(AlCl3)作为催化剂在250℃下进行5hr制备的。L-异亮氨酸乙酯盐酸盐(IleOEt·HCl)根据已知方法由L-异亮氨酸(Aldrich)制备。分子量为750Da的α-氨基-ω-甲氧基-聚(乙二醇)(AMPEG)根据已知方法制备(Loccufier,J.；Crommen等,DieMakromolekulare Chemie,Rapid Communications 1991,12(3),159-165)。四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)和三乙胺(triethylamine，TEA)(Junsei Chemical Co.,Ltd.)在干燥氮气环境下通过在金属钠/二苯甲酮(Acros)和氧化钡(Acros)上在沸点回流来纯化。从Aldrich购买的β-环糊精无需进一步纯化即可使用。单-6-OTs-βCD和单-6-二乙氨基-βCD(NH2-βCD)根据已知方法合成(Liu,Y.-Y.；Fan等,Macromolecular Bioscience 2003,3(12),715-719)。乙腈(ACN)、乙醇胺(AEtOH)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)、氯甲酸异丁酯(IBCF)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)购自Aldrich。具有超纯品质的二氯甲烷(DCM)购自Daejung化学公司(韩国)，无需进一步纯化即可使用。
(1)酸性PPZ的合成
如下所述合成酸性聚合物。将悬浮在含有TEA(16.54mL，0.12mmol)的干燥THF(200mL)中的IleOEt·HCl(7.36g，0.038mmol)缓慢加入到溶解在干燥THF(100mL)中的聚(二氯磷腈)(3.00g，0.03mmol)中。将反应混合物在干冰下用丙酮浴搅拌12小时，然后保持搅拌36hr直至室温。向该混合物中逐渐加入溶于含有TEA(2.16mL，0.02mmol)的干燥THF(20mL)中的AEtOH(2-氨基乙醇，0.46ml，0.008mmol)和溶于含有TEA(4.92g，0.04mmol)的干燥THF(50mL)中的AMPEG750(7.57g，0.01mmol)，并将反应混合物在室温搅拌24hr，然后在40℃至50℃搅拌24hr。根据已知方法纯化聚合物反应混合物。简言之，过滤反应混合物。将滤液浓缩后，将其倒入正己烷中以获得沉淀物，将其在相同的溶剂系统中再沉淀。将聚合物产物用透析膜(MW 12000至14000截止)针对甲醇透析3天，并且在4℃下蒸馏4天。最后透析的溶液随后冷冻干燥以获得携带AEtOH的聚(有机膦腈)。最后，通过以下反应获得羧酸封端的聚合物。将携带AEtOH(5.84g，0.01mmol)的聚合物的溶液在蒸馏的THF(200mL)中在室温下在氮气环境下搅拌。向该聚合物溶液中加入戊二酸酐(3.18g，0.02mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)(3.41g，0.02mmol)在蒸馏的THF(50mL)中的各溶液。将反应混合物在40℃下搅拌24hr。搅拌后，将反应混合物过滤并浓缩。通过在甲醇中透析3天，然后通过在蒸馏水中在4℃透析3天来纯化聚合物产物。将透析的溶液冷冻干燥以获得携带戊二酸的聚(有机膦腈)。合成的示意图如图1所示。
(2)β-CD PPZ的合成
在搅拌下将酸性聚合物(3.70g，6.77mmol)溶解在ACN(100mL)中。然后，将DMAP(2.48g，20.31mmol)、EDC(3.15g，20.31mmol)和TEA(2.83mL,20.31mmol)添加到完全溶解的聚合物溶液中。将NH2-βCD(0.54g,10.16mmol)溶解在去离子水(10mL)中。为了激活聚合物的羧基，在添加DMAP、EDC和TEA后30min，将NH2-βCD的去离子水溶液添加到聚合物溶液中。将反应混合物在室温下搅拌48小时，然后减压蒸发以收集聚合物。将收集的聚合物产物溶解在甲醇中。将聚合物产物用透析膜(MW 12000-14000截止)针对甲醇透析3天并在4℃针对去离子水透析4天，随后将最终透析后的溶液冷冻干燥。合成的示意图如图1所示。
在合成的β-CD PPZ中，在合成β-CD PPZ后，在β-CD的异头质子峰在4.83ppm处观察到β-CD偶联的特定证据(图2的C)。此外，在FT-IR数据中，由于在酸性PPZ和β-CD之间新形成的酰胺键(C＝O键)，由β-CD偶联产生的独特峰显示在1,550cm-1(图2的D)。合成的β-CD PPZ具有独特的热敏性特征，如溶胶-凝胶转变，这可导致疏水性IleOEt和亲水性PEG之间的分子协调，这取决于温度。例如，β-CD PPZ中的水的氢键随着温度增加而断裂，疏水性IleOEts随后形成强疏水性相互作用，从而形成凝胶。
(3)金刚烷-PEG-MeAc的合成
合成的示意图如图3所示。将金刚烷乙酸(1.07g,5.5mmol)溶解在DCM中。将TEA(3.53ml,35mmol)和DIC(2.35mL,18.6mmol)加入溶液中。在室温下搅拌溶液约30min后，加入NH2-PEG 1K-NH2(5.0g，5mmol)并在室温下反应1天。减压除去溶剂，加入去离子水使未反应的金刚烷乙酸沉淀。通过在14000rpm下离心3次20min收集沉淀物。通过0.45μm纸滤器过滤少量残留的金刚烷乙酸沉淀。通过冻干法收集未纯化的白色粉末产物。进行薄层色谱法(TLC)以从未纯化的白色粉末中分离出纯Ad-PEG-NH2。通过洗脱液组合物(DCM:MeOH＝93:7)，TLC中的Rf值为0.3。基于Rf值，通过液相色谱收集溶解在洗脱溶剂中的Ad-PEG-NH2的纯产物。在减压蒸发装置中除去包括Ad-PEG-NH2的洗脱溶剂。Ad-PEG-NH2用蒸馏水溶解，然后冻干得到白色粉末(3.19g，2.65mmol)。通过400MHz NMR(Bruker)和FT-IR分析产物。结果示于图4和5中。
将Ad-PEG-NH2(1g,0.8mmol)溶解在DMC中。随后，将甲基丙烯酰氯(0.97mL，9.3.mmol)和TEA(1.38mL，9.95mmol)添加到Ad-PEG-NH2溶液中。反应在50℃下进行1天。所得溶液通过减压蒸发、用MWCO 1kDa透析和冻干来纯化。制备的Ad-PEG-MeAc的NMR值示于图6。
(4)金刚烷-PEG-RGD(Ad-RGD)的合成
合成的示意图示于图3，将Ad-PEG-MeAc(0.3g,0.2mmol)溶解在pH调节至10.0的水溶液中。立即将TCEP(66mg,0.23mmol)和CGRGDS(0.41g,0.69mmol)添加到Ad-PEG-MeAc溶液中。将反应溶液在N2空气下吹扫10min。反应在室温下进行2hr。通过透析和冻干进行纯化。形成的Ad-RGD的NMR值示于图7。
(5)β-CD PPZ和Ad-RGD混合的偶联物的制备
通过混合β-CD PPZ和Ad-RGD制备偶联物。基于β-CD PPZ水凝胶中存在的主体分子的数量，制备的偶联物包括浓度为0％、25％、50％或100％的Ad-RGD分子。Ad-RGD 100、Ad-RGD 50和Ad-RGD 25意味着客体分子分别通过100％、50％、25％的主体-客体相互作用插入到β-CD聚合物的主体分子中。Ad-RGD 100、Ad-RGD 50和Ad-RGD 25的准确浓度在下表1中描述。
[表1]
Figure BDA0003513274900000141
如上所述，最终制备它们是为了控制3D水凝胶空间中干细胞粘附部分(即RGD)的含量。
(6)β-CD PPZ/Ad-RGD的表征
通过测量1H NMR(Bruker avance III 400MHz傅里叶变换模式(DMSO-d6和CDCl3)估计制备的聚合物的结构。聚合物水溶液的粘度在Brookfield RVDV-III+粘度计上在5℃至70℃之间和在0.1的固定剪切速率下评估。测量是在0.2rpm的设定主轴速度和0.33℃/min的加热速率下进行的。
空间信息从2D-NMR(NOESY)获得，其中β-CD和包含RGD的金刚烷的1：1至1：0摩尔混合物溶解在DMSO-d6中。在DD2 600Mhz FT NMR(Agilent Technologies)上记录2D-NMR光谱，并示于图8中。
实验实施例1：通过控制实施例1的偶联物中的Ad-RGD的量验证主体-客体相互作用的发生
在本实施例中，假设β-CD和Ad-RGD之间的结合亲和力将通过以不同量彼此插入的Ad-RGD来诱导良好控制的客体分子量。首先，β-CD PPZ和β-CD PPZ+Ad-RGD从动态光散射(DLS)的测量中给出了不同的结果。β-CD PPZ和β-CD PPZ+Ad-RGD在水性环境中的平均粒径分别为121.3±26.2nm和180.3±32.4nm。由于β-CD PPZ中包括Ad-RGD，β-CD PPZ+Ad-RGD的水性颗粒的实际尺寸增加。
为了阐明主体-客体相互作用的直接证据，随着客体分子的增加，测量了β-CD PPZ和Ad-RGD的2D-NOESY的积分值。首先，在2D-NOESY结果中，包合复合物在亚甲基(Ha,Hc)、甲烷(Hb)的Ad质子和H-5的β-CD内腔质子组成的交叉峰处得到证实(图8的A)。因此，β-CD内腔和Ad之间的交叉峰的积分值随着客体分子量的增加而成比例地增加(图8的C)。从这些结果证实，β-CD PPZ和AD-RGD之间的主体-客体相互作用很好地发生，因此，主体-客体相互作用的发生可以通过化学计量调制的Ad-RGD来控制。
实验实施例2：实施例1的偶联物的热敏特性
观察到酸性PPZ和β-CD偶联物之间的粘度变化。酸性PPZ Tmax(溶液达到其最大粘度的温度)为48.8℃，高于体温。其中酸性PPZ中的亲水羧酸基团仅被具有另一个亲水部分(即OH基团)的β-CD取代的β-CD PPZ的Tmax降低至约36.8℃(图9的A)。
检查制备β-CD PPZ和Ad-RGD的混合物后的凝胶化。结果，在温度低于体温的条件下(4℃)，添加了Ad-RGD 0、Ad-RGD 50和Ad-RGD 100的β-CD PPZ显示了水状态(图9的B)。当温度升高到37℃时，在所有组中都观察到形成良好的凝胶化。从这些结果证实，作为客体分子偶联物的Ad-RGD不影响β-CD PPZ水凝胶在体温下的凝胶化。
实验实施例3：实施例1的偶联物的对于间充质干细胞活力和分化对照的活性的测量
(1)细胞培养法
小鼠间充质干细胞(Mouse mesenchymal stem cell，mMSC)购自CyagenBiosciences Inc.。mMSC用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Gibco BRL,GrandIsland,NY)在37℃的培养皿中，在5％CO2和95％空气的加湿空气中培养，DMEM含有1％青霉素-链霉素(Sigma-aldrich,USA)和10％胎牛血清(FBS)(Welgene,Korea)。
(2)间充质干细胞的活/死细胞活力测定和用3D水凝胶生态位培养的CCK-8的测量
将收获的mMSC(第7代、5×105个细胞)悬浮在0.1mL的10wt％制备的水凝胶中。mMSC/水凝胶混合物在带有细胞插入物的24孔培养板中孵育。
在第0天、第1天、第3天和第7天，除去细胞培养基，使用溶解在DPBS溶液中的钙黄绿素AM/溴乙啡锭二聚体-1(活/死细胞活力测定试剂盒，Thermo Fisher ScientificInc.)进行间充质干细胞的活/死细胞活力测定。所有图像均通过共聚焦显微镜(Zeiss LSM800,DE)在3D状态下获得。
对于CCK-8测定，在第7天，所有包括mMSC的3D水凝胶都被培养基破坏。将培养的水凝胶移至96孔培养板(SPL life Sciences,KR)，向各孔中加入10μL CCK-8(DojindoMolecular Technology,Inc.JP)溶液。将包含水凝胶的CCK-8溶液置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的湿润空气中2hr。孵育后，使用酶标仪(BIO-RAD，Hercules，CA，USA)在450nm波长处测量吸光度。
(3)用3D水凝胶生态位培养的间充质干细胞的基因检测(RT-PCR)
使用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)制备RNA提取物。用DNase(Invitrogen)处理样品后，使用1mg总RNA进行cDNA合成(Superscript First-strand synthesis system,GibcoBRL,Life Technologies)。简而言之，在20mL混合物(1RT缓冲液、1.25mM MgCl2、5mMDTT、2.5g随机六聚体、各0.5mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，以及50U的Superscript II酶)中进行逆转录反应。逆转录反应后，RNA被2U大肠杆菌(Escherichia coli)核糖核酸酶H降解。在含有2U Takara Taq，1×PCR缓冲液，0.8mM dNTP混合物和100pmol特异性引物的50mL反应缓冲液中进行PCR。标准PCR条件如下：在95℃下进行3min，随后95℃下变性5sec，60℃下复性34sec，72℃延伸1min的循环。用作引物的寡核苷酸描述于表2中。基因表达值针对β-肌动蛋白的管家基因而被标准化。
[表2]
Figure BDA0003513274900000161
(4)实验结果
设计了一个简单的混合介导的RGD浓度可控系统，以制造基于主体-客体相互作用的干细胞3D生态位。主要的整合素结合域RGD在ECM蛋白如纤连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、骨钙蛋白和骨唾液蛋白中是丰富的。制造的3D水凝胶干细胞生态位由客体分子Ad-RGD的量调节。在最近的研究中用几种合成材料的3D支架评估了MSC存活率，结果显示在特定条件下的存活率达到50％或更高。
干细胞培养系统中MSC存活率的评价结果如图10的C所示。在活/死细胞活力测定图像中，包含主体和客体分子的MSC在3D培养系统中的7天里相当活跃。此外，由于RGD-整合素结合，在RGD存在下(具体地，在Ad-RGD 25、Ad-RGD 50和Ad-RGD 100组中)观察到MSC的生长形态(图10的A)。与RGD 0(存活率：57.5％)相比，在RGD 25、RGD 50和RGD 100(存活率：72.2％至77.8％)存在的情况下，3D培养后7天的MSC存活率也更高。然而，Ad-RGD 25、Ad-RGD 50和Ad-RGD 100中的MSC存活率彼此相似。根据这些结果，确认了MSC存活率受RGD的有无的影响。换言之，该结果表明即使在合成的3D干细胞生态位中，RGD分子的存在在干细胞存活中也起着重要作用。
根据实施例1制备了这样的偶联物：其中添加了基于β-CD PPZ水凝胶中β-CD的摩尔数的0％、25％、50％和100％的Ad-RGD，并且添加偶联物到MSC。
对于MSC分化，当使用Ad-RGD 50和Ad-RGD 100时，Ad-RGD与MSC的α5β1-整合素之间的高结合可能性导致骨生成因子(ALP和胶原蛋白I)和软骨形成因子(聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II)的基因表达增强(图11的A、图11的B、图11的D和图11的E)。在发育过程中，软骨形成过程暂时先于骨生成，然后肥大阶段是这些过程之间的中间通道。具体而言，时空软骨形成相关因子和骨生成相关因子在肥大期同时增强。也就是说，当使用RGD 50和RGD 100时，骨生成因子大大增加，而当使用RGD 100时，软骨形成因子显著增加，证实了用Ad-RGD 50和Ad-RGD 100培养的MSC面临着肥大阶段。尤其是与使用相对较低的Ad-RGD 50相比，软骨形成因子在Ad-RGD 100中表现出高水平，证实了高水平的RGD是在早期肥大期造成的。
另一方面，脂肪生成相关因子(C/EBPα和PPARγ)在Ad-RGD低水平或不存在(如RGD0和RGD 25)的情况下高度表达(图11的C和图11的F)。因此，MSC的命运只能通过控制与β-CDPPZ结合的Ad-RGD的量来控制。
根据这些结果，图12示出了本发明的β－CD PPZ和Ad-RDG的偶联物的MSC分化活性的示意图。
实施例2：包括β-CD PPZ、Ad-TGF和Ad-HAV的水凝胶组合物
(1)β-CD PPZ的合成
β-CD PPZ以与实施例1的(1)和(2)中所述相同的方式制备。
(2)Ad-PEG-MeAc的合成
Ad-PEG-MeAc以与实施例1(3)中所述相同的方式制备。
(3)Ad-TGF的合成
将制备的Ad-PEG-MeAC(M.W.1302.6Da,200mg,0.15mmol)溶解在pH调节至10.0的水溶液中。三(2-羧乙基)膦(TCEP)(44.0mg，0.15mmol)和TGF-β1模拟肽(CESPLKRQ，960.12Da，442.2mg，0.46mmol)同时加入水溶液中。将反应溶液在N2气氛中吹扫10min。反应在室温下进行2hr。反应后，通过透析和冻干进行纯化。合成的示意图示于图13。
(4)Ad-HAV的合成
将制备的Ad-PEG-MeAc(M.W.1302.6Da,300mg,0.23mmol)溶解在pH调节至10.0的水溶液中。将TCEP(66.0mg,0.23mmol)和N-钙粘蛋白模拟肽(CLRAHAVDIN,1111.29da,767.8mg)同时添加到水溶液中。将反应溶液在N2气氛中吹扫10min。反应在室温下进行2hr。反应后，通过透析和冻干进行纯化。合成的示意图示于图13。
(5)通过将β－CD PPZ与Ad-TGF和Ad-HAV混合制备偶联物
将制备的β-CD PPZ与Ad-TGF和Ad-HAV以下表3的比例混合以制备偶联物。
[表3]
Figure BDA0003513274900000181
*每0.01gβ-CD PPZ实际消耗的Ad肽的量
(6)β-CD PPZ/Ad-TGF和(或)HAV的表征
制备的β-CD PPZ、Ad-HAV和Ad-TGF的结构通过测量1H NMR估计(使用DMSO-d6和CDCl3的Bruker avance III 400MHz傅里叶变换模式)(图2、图14和图15)。
聚合物水溶液的粘度在Brookfield RVDV-III+粘度计上在5℃至70℃之间和在0.1的固定剪切速率下评估。测量是在0.2rpm的设定主轴速度和0.33℃/min的加热速率下进行的(图16的A)。
从2D－NMR(NOESY)获得空间信息，其中β-CD和含金刚烷的肽的1：1摩尔混合物溶解在D2O中。在DD2 600Mhz FT NMR(Agilent Technologies)上记录A2D－NMR光谱(图16的C)。
实验实施例4：验证实施例2的偶联物中β-CD PPZ与Ad-肽之间的主体-客体相互作用的发生
为了验证β-CD PPZ和Ad-肽之间的主体-客体相互作用，测量了在与制备的偶联物水凝胶相同的条件下在具有D2O的水性状态下的2D NOESY光谱。2D NMR是观察分子间相互作用和/或包合复合物构型的最强方法。2D-NOESY中的交叉峰可以从在空间上比偶联键更近的核共振连接获得。金刚烷的Ha，C和Hb(δ0.6ppm至1.3ppm)和β-CD内腔的H-5'(δ3.4ppm至3.5ppm)，其是在涉及主体-客体相互作用的2D－NOESY光谱中的交叉峰，在图16的C中清楚地阐明。
此外，为了确定Ad-肽是否按化学计量地和准确地插入到主体分子中，通过混合主体分子和客体分子进行动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测量，使得主体分子与客体分子的比例为1:1,1:1.2和0:1。最重要的是，在主体分子：客体分子的比例为1:1的偶联物中观察到增加的流体动力学直径(图17的C)。在其中主体分子：客体分子的比例为1:1的偶联物的该DLS结果中，未显示仅涉及客体分子的任何峰(图17的C)。这意味着没有客体分子从β-CD PPZ中分离出来。由于单独的Ad-TGF和Ad-HAV的粒径分别为353.63±31.71nm和460.78±49.53nm(图17的E)，并且与β-CD PPZ相比，这些Ad-TGF和Ad-HAV的更大的粒径导致疏水性金刚烷分子在水性状态下的聚集。这意味着在水性环境中，所有的Ad-肽都掺入了β-CD PPZ和Ad-肽(主体分子：客体分子＝1:1)的偶联物中。另一方面，确认了当Ad-肽与β-CD PPZ(主体分子：客体分子＝1：1.2)过度混合时，多余的Ad-肽形成了它们自己的其他峰，其类似于单独的Ad-TGF的峰和单独的Ad-HAV的峰(图18)。因此，从2D NOESY结果证实，由于β-CD PPZ和Ad-肽之间的主体-客体相互作用，良好地形成了偶联物。
同时，对活体动物使用体内成像系统(in vivo imaging system，IVIS)检查了是否可以维持这样的偶联物：其中Ad-TGF和Ad-HAV最初以不同含量在β-CD PPZ中结合。在Ad-TGF和Ad-HAV的分子尾中，罗丹明(Rho)和异硫氰酸酯荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)分别在偶联过程中连接。然后，将这些表达荧光的客体分子和β-CDPPZ一起注射以制造MSC包合后复合物。由于PPZ中的β-CD因为PPZ的生物可降解性或溶解性而释放到外部，随着时间的推移，包含荧光的Ad-肽信号变小。此外，使用不同的客体分子进行21天观察到Ad-TGF/Ad-HAV的化学计量控制模式(图19的A)。例如，Ad-TGF的荧光强度为T100 H0、T75 H25、T50 H50和T25 H75依次升高。该结果来源于依赖主体-客体相互作用而保持的化学计量不同的客体分子。然后，如图19的B所示计算表达的荧光的感兴趣区域(region of interest，ROI)值。由于Ad-肽与酸性PPZ混合(PPZ中缺乏β-CD)，Ad-肽从3D水凝胶中发生快速逸出。尽管在所有组(T100 H0、T75 H25、T50 H50、T25 H75和T0 H100)中，由于β-CD PPZ的生物降解性和溶解性，ROI值随着时间的推移而降低，但β-CD PPZ中的受控Ad-肽荧光表达由于主体-客体相互作用而通过在所有组和所有时间点当中最初不同添加的Ad-肽的比率来维持。该结果表明，即使在活体动物中，3Dβ-CD PPZ水凝胶中的主体-客体相互作用也可以长期维持。
实验实施例5：热敏特性
在合成主体和客体分子之后，进行流变测量和使用掺入T100 H0和T0 H100的β－CD PPZ的热敏性溶胶凝胶转变的可视化。即使将Ad-TGF 100和Ad-HAV 100掺入到β-CD PPZ中，所制备的偶联物的水凝胶在体温下也显示出凝胶化特性和足够的粘度(图16)。与β-CDPPZ本身相比，通过主体-客体相互作用制备的β-CD PPZ/Ad-TGF 100和β-CD PPZ/Ad-HAV100的T值由于占有Ad-TGF和Ad-HAV中的亲水性PEG而转移到略高的温度(图16的A)。特别是，β-CD PPZ、β-CD PPZ/Ad-TGF 100和β-CD PPZ/Ad-HAV 100在体温下的粘度值分别为268.75pa·s、387.50pa.s和325.00pa.s(图16的A)。基于该热敏性粘度结果，可以将实施例2中制备的水凝胶适当地注射到活体动物体内。
实验实施例6：实施例2的偶联物的组织相容性和MSC的软骨形成诱导
(1)生物相容性的测定方法
将具有恒定密度(1×104个细胞/孔)的mMSC(小鼠间充质干细胞)和NIH3T3(小鼠成纤维细胞)接种在96孔组织培养板(SPL，韩国)中。每个细胞系与溶解良好的β-CD PPZ(浓度：0μg/mL至20000μg/mL)一起孵育24hr。孵育后，弃去所用培养基并用DMEM和新鲜PBS洗涤细胞一次。加入新鲜培养基(200mL/孔)后，向细胞中加入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯基溴化四唑(MTT)溶液(100mg/孔)，然后在37℃和5％CO2的加湿空气中孵育4hr。通过将细胞与DMSO一起孵育来溶解形成的甲臜晶体。使用酶标仪(Bio-Tek Instruments，USA)在570nm处测量溶液的吸光度。从[ab]测试/[ab]对照×100％计算细胞活力(％)。
(2)体内组织生成试验
所有活小鼠实验均按照韩国科学技术研究院(Korea Institute of Science andTechnology，KIST)机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)的相关法律和机构指南完成。IACUC批准了该实验(批准文号：2017-092)。Balb/c裸鼠(4周大，20-25g，雌性)购自Nara Bio INC.(韩国京畿道)。用平衡氧氮中的3％异氟醚麻醉裸鼠。使用带有31号针头的注射器将MSCs/β-CD PPZ(10wt％)/0％至100％Ad-TGF(T,金刚烷-PEG1000-CESPLKRQ,2248.70Da)和Ad-HAV(H,金刚烷-PEG1000-CLRAHAVDIN,2399.87Da)注射到小鼠背部中线右侧的皮下袋中。每只小鼠接受含有与10wt％的β-CD PPZ混合的2X106个细胞的100μL注射。注射后4周收集所有组织，用于组织学检查和基因分析。
(3)组织学和免疫组织学分析
将所有收集的组织包埋在石蜡中，并用切片机切片(厚度为6μm)。对于组织学评估，将组织切片脱蜡、再水化并用H&E、番红-O、Von kossa和免疫组织化学染色。对于免疫组织化学染色，将切片组织在4℃下与抗聚集蛋白聚糖(1:500，Abcam，ab3778)和抗胶原蛋白II(1:500，Abcam，ab34712)的一抗孵育过夜。洗涤3次后，将载玻片和与荧光染料偶联的适当二抗(例如山羊抗小鼠IgG(TRICT，Abcam，ab6786)和山羊抗兔IgG(Alexa 488，Abcam，ab150077))孵育。使用共焦激光扫描显微镜(Zeiss)和明亮的成像显微镜(Zeiss)捕获图像。
(4)人工组织中的基因检测
使用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)制备RNA提取物。用DNase(Invitrogen)处理组织后，使用1mgRNA进行cDNA合成(Superscript First-strand synthesis system,GibcoBRL,Life Technologies)。简而言之，在20mL混合物(1RT缓冲液、1.25mM MgCl2、5mMDTT、2.5g随机六聚体、各0.5mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，以及50U的Superscript II酶)中在42℃下进行逆转录反应。逆转录反应后，RNA被2U大肠杆菌(Escherichia coli)核糖核酸酶H降解。在含有2U Takara Taq，1×PCR缓冲液，0.8mM dNTP混合物和100pmol特异性引物的50mL反应缓冲液中进行PCR。标准PCR条件如下：在95℃下进行3min，随后95℃下变性5sec，60℃下复性34sec，72℃延伸1min的循环。用作引物的寡核苷酸描述于下表4中。基因表达值针对β-肌动蛋白的管家基因而被标准化。
[表4]
Figure BDA0003513274900000211
(5)实验结果
根据上述(1)，使用MTT检测在MSC和NIH3T3的细胞系中都进行体外细胞毒性试验。尽管每个细胞系都用高浓度(10000μg/mL)的β-CD PPZ聚合物溶液处理，但MSC和NIH3T3的细胞活力仍然保持在80％以上的高水平。因此，该聚合物被认为适用于体内动物试验的下一步研究。
在体内组织生成试验中，使用H&E染色证实了给予β-CD PPZ/比例受控的Ad-肽/MSC在体内的生物相容性。根据H&E染色的组织学结果，在用β-CD PPZ/比例受控的Ad-肽处理的所有组中均未观察到任何异物反应，例如异物巨细胞的产生和任何毒性(图20的A)。然后，使用番红-O染色观察到异位注射的β-CD PPZ/比例受控的Ad肽/MSC的新软骨形成。软骨和细胞质分别被染成红色和绿色。除了T0 H0组之外，在所有组中都非常明显地观察到软骨中染的红色(图20的A)。
此外，测量了活体中的MSC维持，以检查局部MSC维持是否能提高其治疗效率。因此，能够表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的MSC被包含在β-CD PPZ/Ad-肽偶联物的内含物中，以证实这些MSC是否维持在活的动物中。局部注射的MSC在其注射部位维持21天。然而，在T0 H0组中监测到MSC荧光的显著低维持，其中排除了受体介导的MSC附着和细胞间相互作用可用因子(图20的B)，表明细胞间相互作用和TGF-β1刺激可以提高干细胞的存活率以及软骨分化。与其他包含Ad-肽的组相比，对剩余MSC的感兴趣区域(ROI)值的评估也证实了T0 H0组中这种低MSC维持(图20的C)。具有MSC的Ad-肽的存在有助于注射部位的局部MSC维持。简而言之，这些客体分子的以化学计量掺入的β-CD PPZ水凝胶在体外水平上和体内水平上都是生物相容的。此外，在T0 H0组以外的组中也观察到使用β-CD PPZ/Ad-肽复合物的MSC软骨形成诱导。
为了评估灵活的和不同的客体分子含量中的确切MSC软骨形成水平，使用II型胶原蛋白(Col II)和聚集蛋白聚糖(Agg)的典型软骨形成标志物进行了分析。基于输出，在番红-O染色结果中显示了具有客体分子的灵活性的MSC软骨形成分化。除T0 H0组外，所有组均显示软骨形成分化。基于番红-O染色的结果，使用基因表达水平和免疫组织化学的测量来评估准确的软骨形成后果。从所有实验组中提取由β-CD PPZ和Ad-肽所包含的MSC的局部和皮下注射产生的新组织。作为软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白质的Agg在所有Ad-TGF和/或Ad-HAV掺入组中显著合成和表达。特别是，与T100 H0、T75 H25、T25 H75和T0 H100组相比，在T50 H50中观察到最高的Agg特异性荧光和基因表达水平(图21的B和图21的C)。T50和H50中的基因和蛋白质表达水平几乎是其他基因组(如T100 H0、T75 H25和T25 H75)的两倍。在没有Ad-肽的情况下，没有Agg表达。Col II，其为软骨的主要蛋白质，被选为软骨形成评估的下一个标志物。Col II还根据特定的荧光和基因表达进行了评估。与T0 H0组相比，ColII在β-CD PPZ/Ad-肽处理组中形成良好(图22的A)。Col II基因和蛋白质表达在免疫组织化学和基因测定的测量中显示出与Agg相似的模式(图22的B和图22的C)。此外，Col II的最高表达也显示在T50 H50组中。
骨生成是一个单一的连续发育过程，其包括作为前体的软骨形成。详细地说，即使肥大软骨细胞在特定刺激例如矮小相关转录因子2(runt-related transcription factor2，Runx2)和osterix下分化为骨细胞，本公开中使用的Ad-肽也应防止软骨细胞进一步向骨生成终止的过程。抑制骨生成很重要，因为在软骨形成过程中末端MSC处的分化产物不正确。通常，Runx2被认为是骨生成的典型和关键转录因子。因此，Runx2被选为检测骨生成进一步进展的基因检测标记。此外，通过Von kossa染色确认了作为骨生成最终产物的钙的产生。结果，没有钙点(图23的A)。此外，没有检测到过量的Runx2基因表达水平(图23的B)。最终，即使使用TGF-β1衍生的肽，实施例2的系统中的骨生成也被完全阻断，并且仅在掺入Ad-肽的组中观察到软骨形成诱导。
根据这些结果，本发明的β-CD PPZ/比例受控的Ad-TGF/Ad-HAV偶联物的MSC分化活性的示意图示于图12中。
实施例3:通过主体-客体相互作用的β-CD PPZ和Ad-IL2的偶联物
(1)主体分子β-CD PPZ的合成
β-CD PPZ以与实施例1的(1)和(2)中所述相同的方式制备。
(2)Ad-PEG-MeAc的合成
Ad-PEG-MeAc以与实施例1(3)中所述相同的方式制备。
(3)Ad-IL2的合成
1)方法1(通过点化学)
将制备的Ad-PEG-MeAc(0.09mg,0.00007mmol)溶解在pH调节至10.0的水溶液中。将TCEP(0.2mg,0.0007mmol)和rhIL-2(1mg)同时添加到水溶液中。将反应溶液在N2气氛中吹扫10min。反应在室温下进行2hr。反应后，通过透析和冻干进行纯化。合成的示意图示于图26。
2)方法2(通过EDC化学)
将制备的Ad-PEG-MeAC(0.09mg,0.00007mmol)溶解在含有EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)(0.28mg,0.0015mmol)的水溶液中。将rhIL-2(1mg)溶解在Ad-PEG-NH2+EDC的水溶液中。将反应溶液在N2气氛中吹扫10min。反应在室温下进行2hr。反应后，通过透析和冻干进行纯化。合成的示意图示于图27。
(4)β-CD PPZ/Ad-IL2的表征
作为梯形电泳的结果，IL-2和Ad-IL2根据其分子量分布在聚丙烯酰胺凝胶上，发现Ad-IL2的分子量高于IL-2的分子量。
实验实施例7：实施例3的偶联物的癌细胞生长抑制活性
(1)实验方法
将5.0×105个B16黑色素瘤细胞系细胞注射到B6小鼠中(0天，n＝5)。当癌组织的大小达到100mm3或更大时，制备β-CD PPZ+Ad-IL2复合物和单独的PBS，并分别直接注射到每只小鼠的癌组织中。共测量小鼠癌组织的大小12天，并计算其平均值。
(2)实验结果
在对照的PBS注射组中，证实了癌组织的大小不受控制地生长。实验期间，PBS组5只小鼠中有2只因癌组织增生而死亡。相比之下，与对照组相比，在注射β-CD PPZ+Ad-IL2复合物的组中，所有的小鼠都存活了下来，并且癌组织的大小也得到了显著很好的抑制。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开可以以不同的具体形式实施而不改变其技术精神或本质特征。因此，应当理解，上述实施例不是限制性的，而是在所有方面都是示例性的。本公开的范围由所附权利要求而不是由它们之前的描述来定义，因此落入权利要求范围，或这些范围的等同物内的所有改变和修改旨在被权利要求所包含。
本发明的效果
本公开的水凝胶组合物通过经由主体-客体相互作用将生理活性物质连接至热敏性聚(磷腈)来制备。水凝胶组合物当注射到活体中时，缓慢释放生理活性物质并提供用于干细胞分化的有利条件。此外，其中生理活性物质的种类、比例和顺序被控制以适于干细胞分化的水凝胶组合物可以以高重现性制备。

Claims (18)

1.一种水凝胶包合复合物，包括：热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和作为主体分子的β-环糊精(β-CD)被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和
生理活性物质，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，所述生理活性物质选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基，
其中，通过经由主体-客体相互作用将所述客体分子包含在所述β-环糊精中，所述客体分子与全部或部分所述β-环糊精偶联。
2.根据权利要求1所述的水凝胶包合复合物，其中，所述热敏性聚(磷腈)以(55至80)：(5至25)：(5至20)的摩尔比包括多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精。
3.根据权利要求1所述的水凝胶包合复合物，其中，所述生理活性物质为选自由以下组成的群组中的一种或多种：蛋白质、肽、疫苗、基因、激素、抗癌药、血管生成抑制剂、糖类、多元醇、糖类、含糖多元醇、含聚合物多元醇、含糖氨基酸和含糖离子。
4.根据权利要求3所述的水凝胶包合复合物，其中，所述蛋白质选自由以下组成的群组：毒蜥外泌肽-4、促红细胞生成素(EPO)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、生长激素(人、猪、牛、等)、生长激素释放因子、神经生长因子(NGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、凝血因子、胰岛素、催产素、加压素、促肾上腺皮质激素、纤维母细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、神经生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5、催乳素、促黄体素释放素、促黄体激素释放激素(LHRH)、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、生长抑素、胰高血糖素、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-11(IL-11)、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、促胰液素、降血钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、促甲状腺激素释放激素(TRH)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、肝素酶、骨形态发生蛋白(BMP)、人心房利钠肽(hANP)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、肾素、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽、环孢菌素、神经降压素、速激肽、神经肽Y(NPY)、肽YY(PYY)、血管活性肠多肽(VIP)和垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)。
5.根据权利要求3所述的水凝胶包合复合物，其中，所述肽选自由以下组成的群组：胶原蛋白1衍生的GFOGER和DGEA；层粘连蛋白衍生的YIGSR、SIKVAV、IKVAV、IKLLI、LRGDN和SINNNR；层粘连蛋白γ1衍生的LRE、PDGSR、GTFALRGDNGQ、CFALRGDNP、NPWHSIYITRFG、TWYKIAFQRNRK、KAFDITYVRLKF和LGTIPG；纤连蛋白衍生的GRGDS、PKRGDL、NGRAHA、GACRGDCLGA(环状)、IDAPS、REDV、PHSRN、KQAGDV、LDV、WQPPRARI、SPPRRARV、LIGRKK、IWKHKGRDVILKKDVRFYC、KLDAPT和PRARI；玻连蛋白衍生的CKKQRFRHRNRKG；骨桥蛋白衍生的KRSR、FHRRIKA、CGGNGEPRGDTYRAY、SVVYGLR和ELVTDFPTDLPAT；弹性蛋白衍生的VPGIG和VGVAPG；胶原蛋白4衍生的MNYYSNS和CNYYSNS；血小板反应蛋白衍生的CSVTCG、GRGDAC、FQGVLQNVRFVF、AELDVP和VALDEP；巢蛋白-1衍生的GFRGDGQ和SIGFRGDGQTC；N-钙粘蛋白衍生的HAV；和TGF-β1衍生的FLPASGL、PWPLPYL、WGLLDLT、PAERLRS、RNLDGWS、NLSSSWI、TLPSNTH、MSAFPFL、SRLGQYI、PFGPLPP、TIASTLH、PRAPADV和ESPLKRQ。
6.根据权利要求1所述的水凝胶包合复合物，其中，所述客体分子和所述生理活性物质通过连接器连接，所述连接器是分子量为200Da至5000Da的聚乙二醇(PEG)、聚醚酰亚胺(PEI)或聚丙二醇(PPG)，或多肽，所述多肽选自由聚甘氨酸、聚组氨酸和聚(RADA)组成的群组。
7.一种控制干细胞分化的水凝胶，包括：作为活性成分的热敏聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏聚(磷腈)上；和干细胞分化调节剂，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，所述干细胞分化调节剂选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
8.根据权利要求7所述的水凝胶，其中，通过经由主体-客体相互作用将所述客体分子包含在所述β-环糊精中，所述客体分子与全部或部分所述β-环糊精偶联。
9.根据权利要求7所述的水凝胶，其中，所述热敏性聚(磷腈)和所述干细胞分化调节剂独立地或以复合物的形式提供，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上，所述干细胞分化调节剂作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，所述干细胞分化调节剂选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基，所述复合物通过经由主体-客体相互作用将所述客体分子包含在所述β-环糊精中形成偶联物而形成。
10.根据权利要求7所述的水凝胶，其中，通过控制所述干细胞分化调节剂的类型或比例，或通过控制两者来控制所述干细胞分化为特定状态。
11.根据权利要求7所述的水凝胶，其中，所述干细胞分化调节剂是包括精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸(RGD)的肽。
12.根据权利要求7所述的水凝胶，其中，所述干细胞分化调节剂是包括CESPLKRQ的肽和包括CLRAHAVDIN的肽。
13.一种再生组织的方法，所述方法包括将水凝胶组合物注射到受损组织部位的步骤，所述水凝胶组合物包括：作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和干细胞分化调节剂，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，所述干细胞分化调节剂选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇，叔丁基、环己酯和萘基。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述水凝胶组合物还包含干细胞。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述水凝胶组合物通过注射引入。
16.一种抑制癌细胞增殖或转移的水凝胶，包括：作为活性成分的热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上；和IL-2，其作为客体分子直接或通过连接器与一个或多个分子连接，所述IL-2选自由以下组成的群组：金刚烷、偶氮苯、胆固醇、叔丁基、环己酯和萘基。
17.一种热敏性聚(磷腈)，其中多个疏水性氨基酸、亲水性聚合物和β-环糊精被取代至所述热敏性聚(磷腈)上。
18.根据权利要求17所述的热敏性聚(磷腈)，其中，所述β-环糊精通过作为连接器的以下的C6位置处的羟基而连接到所述聚(磷腈)的主链上：C1-6亚烷基二胺、聚(C1-6亚烷基二胺)、n-氨基-n-氧代链烷酸(其中n是2至6的整数)、硫醇、羧酸酯、C2-6羟烷基m-氨基-m-氧代链烷酸(其中m是2至6的整数)，或氰基-氨基-C1-4烷硫基-C1-6烷烃。
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