JP7373702B2 - ベータ－シクロデキストリンを通じたホスト－ゲスト相互作用により感温性ポリホスファゼンに結合した生理活性物質を含むヒドロゲル包接複合体及びその使用 - Google Patents

ベータ－シクロデキストリンを通じたホスト－ゲスト相互作用により感温性ポリホスファゼンに結合した生理活性物質を含むヒドロゲル包接複合体及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP7373702B2
JP7373702B2 JP2021576096A JP2021576096A JP7373702B2 JP 7373702 B2 JP7373702 B2 JP 7373702B2 JP 2021576096 A JP2021576096 A JP 2021576096A JP 2021576096 A JP2021576096 A JP 2021576096A JP 7373702 B2 JP7373702 B2 JP 7373702B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
beta
hydrogel
ppz
cyclodextrin
guest
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021576096A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022538821A (ja
Inventor
チャン ソン，ス
ヒョン ホン，キ
Original Assignee
ネックスジェル バイオテック カンパニー，リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ネックスジェル バイオテック カンパニー，リミテッド filed Critical ネックスジェル バイオテック カンパニー，リミテッド
Publication of JP2022538821A publication Critical patent/JP2022538821A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7373702B2 publication Critical patent/JP7373702B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G79/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen, and carbon with or without the latter elements in the main chain of the macromolecule
    • C08G79/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen, and carbon with or without the latter elements in the main chain of the macromolecule a linkage containing phosphorus
    • C08G79/025—Polyphosphazenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C08B37/0012—Cyclodextrin [CD], e.g. cycle with 6 units (alpha), with 7 units (beta) and with 8 units (gamma), large-ring cyclodextrin or cycloamylose with 9 units or more; Derivatives thereof
    • C08B37/0015—Inclusion compounds, i.e. host-guest compounds, e.g. polyrotaxanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/40—Cyclodextrins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/605—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the macromolecule containing phosphorus in the main chain, e.g. poly-phosphazene
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6903—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being semi-solid, e.g. an ointment, a gel, a hydrogel or a solidifying gel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5036—Polysaccharides, e.g. gums, alginate; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/20—Compounding polymers with additives, e.g. colouring
    • C08J3/203—Solid polymers with solid and/or liquid additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
    • C08J3/245—Differential crosslinking of one polymer with one crosslinking type, e.g. surface crosslinking
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/16—Cyclodextrin; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L85/00—Compositions of macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage in the main chain of the macromolecule containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen and carbon; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L85/02—Compositions of macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage in the main chain of the macromolecule containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen and carbon; Compositions of derivatives of such polymers containing phosphorus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G2210/00—Compositions for preparing hydrogels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)

Description

本発明は、感温性ポリホスファゼンに置換されたベータ-シクロデキストリンを通じたホスト-ゲスト相互作用により生理活性物質が結合したヒドロゲル包接複合体及びその使用に関する。
組織再生の目的で新たな組織を構築するための生体適合性物質として、生接合技術に基づくナノ粒子、脱細胞化マトリックス、ヒドロゲルなどの多数の物質が用いられている。これらの材料の中で、ヒドロゲルは膨大な量の吸水能力、高い生体適合性、及び生体組織の類似性により組織工学にとって優れた材料である。具体的には、ポリ(乳酸-グリコール酸)誘導体、ポリ(乳酸)誘導体、ヒアルロン酸、ポリウレタンアクリレート、及び他の多くの生医学ポリマーなどの合成ヒドロゲルは、生理活性物質と幹細胞の両方を用いた組織再生に使われている。
生体に移植され、所望の方向に組織再生が現れるように、生体適合性物質を微調整する努力がなされている。微調整された生体適合性物質は、物理的化学的の側面の両方で十分に調節された物質を意味する。そのような生体適合性物質の微調整は、様々な治療的視点、例えば、薬物送達システムの増加した治療的機会の提供、免疫療法の効能(自己免疫反応または免疫毒性を回避するための)、疾患特異的標的化、及び再生工学のための適切な幹細胞の刺激で必要とされる。一般に、生体適合性物質の物理的制御は、細胞特性や治療薬物放出パターンに影響を与える機械的特性制御及び微細構造制御を意味する。生体適合性物質の化学的制御は、化学的結合を制御することを意味し、具体的には、二つの分子間の化学的結合は、生体接合(bio-conjugation)と呼ばれる(Kalia J, Raines RT. Advances in Bioconjugation., Current organic chemistry14, 138-147 (2010)（非特許文献1）)。生体接合技術は、生材料における化学的分解による構造安定化、向上した体内滞留時間及び免疫原性の減少などの利点を提供するが、毒性問題、低い再現性、及び複雑な合成過程などの問題がある。特に、アクリレート、メタクリレート、銅(Ｉ)触媒化アジドアルキン環化(ＣｕＡＡＣ)、及びフリーラジカルの使用による化学的選択性が高いため、これらのグループの残留物に対する毒性のリスクが高い(Spicer CD, Pashuck ET, Stevens MM. Achieving Controlled Biomolecule-Biomaterial Conjugation. Chemical reviews118, 7702-7743 (2018)（非特許文献2）)。さらに、低い再現性により生体適合性物質の微調整が困難である。
特に、生理活性物質を含有するヒドロゲルを用いて幹細胞の分化を調節しようとする試みがなされている。MSCの増殖及び分化のための小さな化学物質、タンパク質、及びペプチドのような様々な生活性分子がある。ＭＳＣ単独の投与は、所望の系統に分化し難く、過酷な環境で生存し難いため、このようなヒドロゲル及び生体活性分子の助けが理想的な組織再生のために必須である。最近、ＭＳＣを用いて組織再生を行うための様々なアプローチが、所望のＭＳＣ分化のための様々な種類のタンパク質を使用して研究された。しかしながら、幹細胞、生活性分子、及びヒドロゲルの物理的化学的制御によっても、幹細胞分化の微調整は、依然として満足できるレベルに達成されていない。
一方、ホスト-ゲスト相互作用は、二つ以上の分子が分子-自己認識システムの独特の構造認識を通じて非共有結合の複合体を形成することである。シクロデキストリン(ＣＤ)、クラウンエーテル類、シクロファン類(cyclophanes)、クリプタンド類(cryptand)、及びククルビツリル類(Cucurbituril)などの多くのマクロサイクリックホスト分子がある。これらのホスト分子のうち、シクロデキストリンは毒性が低く、免疫原性が低いため、組織工学的または生物学的応用に適している。産業及び研究の領域で主に活用され、有名なシクロデキストリンは、α-、β-、及びγ-CDである。とりわけ、β-CDは、変形後の高い水溶性、ゲスト分子ローディングのための優れた内部キャビティサイズ、及び相対的に低コストのために優れた分子である。β－ＣＤを用いたホスト－ゲスト相互作用は、超分子構造を容易に作る生体適合物質に様々な利点を提供し、製造過程において多数の合成段階及び複雑な浄化過程を避けることができる。実際、β-CDは、数十年間、薬物送達システム、診断応用、及び組織工学などの様々な生医学応用に使用されてきた。
しかしながら、これまで感温性ポリホスファゼンなどのヒドロゲルにホスト-ゲスト相互作用を利用して生理活性物質を導入する試みはなされていない。このような状況において、本発明者らは、β－ＣＤを含有するポリ(オルガノホスファゼン){poly(organophosphazene)}の３Ｄヒドロゲルに様々な種類の生理活性因子の調節のためのホスト－ゲスト相互作用を導入しようと試みた。ＰＰＺは、数十年にわたって本発明者らにより生体適合性及び熱感受性を有するヒドロゲルとして開発されており(韓国公開特許公報20050012533A（特許文献1）及び10-2008-0110472A（特許文献2）などを参照)、化学薬物、タンパク質、及び遺伝子などの治療学的に意味のある薬物を送達することができる。
韓国公開特許公報20050012533A 韓国公開特許公報10-2008-0110472A
Kalia J, Raines RT. Advances in Bioconjugation., Current organic chemistry14, 138-147 (2010) Spicer CD, Pashuck ET, Stevens MM. Achieving Controlled Biomolecule-Biomaterial Conjugation. Chemical reviews118, 7702-7743 (2018) Sohn, Y. S. et al., Macromolecules 1995, 28 (22), 7566-7568 Loccufier, J.; Crommen et al., Die Makromolekulare Chemie, Rapid Communications 1991, 12 (3), 159-165 Liu, Y.-Y.; Fan et al., Macromolecular Bioscience 2003, 3 (12), 715-719
本発明者らは、β－ＣＤ ＰＰＺの合成に成功し、生接合システムの限界を克服するために、β－ＣＤ ＰＰＺの生活性ゲスト分子の化学量論的制御を研究した。ホストで様々なゲスト分子比率の組み合わせにより、β-CD PPZのさらなる合成配置なしにヒドロゲルを生成する機能的に多様なゲスト分子を形成し、幹細胞などに適用して微細に分化を調節できることを確認し、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びホスト分子としてベータ-シクロデキストリン(β-cyclodextrin; β-CD)が置換された感温性ポリホスファゼン;及びゲスト分子として、アダマンチン(adamantine)、アゾベンゼン(azobenzene)、コレステロール(cholesterol)、tert-ブチル(tert-butyl)、シクロヘキシルエステル(cyclohexyl ester)、及びナフチル(naphthyl)からなる群から選択される一つ以上の分子が直接またはリンカーを介して連結された生理活性物質を含む、ヒドロゲル複合体であって、前記ベータ-シクロデキストリンにゲスト分子がホスト－ゲスト相互作用(host-guest interaction)により包接(inclusion)され、全体または一部のベータ-シクロデキストリンでコンジュゲートを形成する、ヒドロゲル包接複合体を提供することにある。
本発明の他の目的は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン；及びゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子が直接またはリンカーを介して連結された幹細胞-分化調節因子；を有効成分として含む幹細胞分化調節用ヒドロゲル組成物を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン；及びゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子が直接またはリンカーを介して連結された幹細胞-分化調節因子；を有効成分として含むヒドロゲル組成物を損傷した組織部位に注入する段階を含む組織再生方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン；及びゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子が、直接またはリンカーを介して連結されたIL-2;を有効成分として含むがん細胞増殖または転移抑制用ヒドロゲル組成物を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼンを提供することにある。
本願のヒドロゲル組成物は、感温性ポリホスファゼンにホスト－ゲスト相互作用を通じて生理活性物質が結合したものであり、生体内に投入される場合、生理活性物質を徐々に放出し、幹細胞の分化に有利な条件を提供する。それだけでなく、幹細胞の特定の分化に適するように生理活性物質の種類、比率及び配列が制御されたヒドロゲル組成物は、高い再現性で製造することができる。
β-CD PPZの合成過程を示す模式図である。 β-CD PPZの化学構造とその特性分析を示す図である。図２のＡは、β－ＣＤがコンジュゲートされた酸ＰＰＺの化学構造である。図２のＢは、イソロイシン、ＰＥＧ、及びβ－ＣＤを含むβ－ＣＤ ＰＰＺの簡単な概略図である。図２のＣは、β－ＣＤ ＰＰＺ及び酸ＰＰＺについての1Ｈ ＮＭＲ結果である。図２のＤは、酸ＰＰＺとβ－ＣＤ混合物及び酸ＰＰＺと比較したβ－ＣＤコンジュゲート化ＰＰＺのＦＴ－ＩＲを示す図である。 Ａｄ－ＲＧＤの合成過程を示す模式図である。 Ａｄ－ＰＥＧ－ＮＨ２のＮＭＲ結果を示す図である。 Ａｄ－ＰＥＧ－ＮＨ２のＦＴ－ＩＲ結果を示す図である。 Ａｄ－ＰＥＧ－ＭｅＡｃのＮＭＲ結果を示す図である。 Ａｄ－ＰＥＧ－ＲＧＤのＮＭＲ結果を示す図である。 図８のＡは、β－ＣＤ ＰＰＺ及びＡｄ－ＲＧＤの２Ｄ－ＮＯＥＳＹ ＮＭＲ結果を示す図である。図８のＢは、β－ＣＤ及びアダマンタンの正確なプロトン位置を示す図である。図８のＣは、様々なＡｄ－ＲＧＤ濃度(β－ＣＤ：Ａｄ－ＲＧＤ＝１００：０～１００：１００)に応じたβ－ＣＤ ＰＰＺ及びＡｄ－ＲＧＤを混合したヒドロゲルのクロスピークの２Ｄ－ＮＯＥＳＹ積分値を表示した図である。 β－ＣＤ ＰＰＺ及びβ－ＣＤ ＰＰＺとＡｄ－ＲＧＤ混合物のゲル化特性を示す図である。図９のＡは酸ＰＰＺ(黒色)とβ－ＣＤ ＰＰＺ(赤色)の粘度を示し、図９のＢは体温でゲル化形成の有無を示す図であり、図９のＣは酸ＰＰＺ及びβ－ＣＤ ＰＰＺの温度感応型ゲル化の詳細を示す図である。 生死分析及びＣＣＫ－８から確認されたＭＳＣの生存率分析結果を示す図である。図１０のＡは、β－ＣＤ ＰＰＺとＡｄ－ＲＧＤ ０～１００ｍｌの組み合わせをＭＳＣに適用したときの生／死分析結果である(緑色は生きているＭＳＣを表し、赤色は死んだＭＳＣを示す)。測定された時間は0、1、3、及び7日目である。図１０のＢは、ＥＣＭを模倣するヒドロゲル３ｄ培養ＭＳＣを示す。図１０のＣは、７日後のＣＣＫ－８を用いたＭＳＣの生存率比較を示す。 様々な濃度でＡｄ－ＲＧＤを添加したＭＳＣの正常培養培地で７日間発現された相対的遺伝子発現レベルを示す図である(βactinで正規化される)。図１１のＡ及びＤはそれぞれＡＬＰ及びコラーゲンＩの相対的遺伝子発現レベルを示す図であり(骨形成因子のマーカー)、Ｂ及びＥはそれぞれコラーゲンＩＩ及びaggrecanの相対的遺伝子発現レベルを示す図である(軟骨形成因子のマーカー)、Ｃ及びＦは、それぞれＣ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγの相対的遺伝子発現レベルを示す図である(脂肪形成因子のマーカー)。 実施例１のヒドロゲル組成物のＭＳＣ分化調節活性に基づいて作成したβ－ＣＤ ＰＰＺとＡｄ－ＲＧＤのコンジュゲートのＭＳＣ分化活性に関する模式図である。 実施例２のヒドロゲル組成物におけるＡｄ－ＴＧＦ／Ａｄ－ＨＡＶの合成過程を示す模式図である。 Ａｄ－ＴＧＦのＮＭＲ結果を示す図である。 Ａｄ－ＨＡＶのＮＭＲ結果を示す図である。 ホスト-ゲスト相互作用によるβ-CD PPZ/Ad-TGF、HAVコンジュゲートの感温性を示す図である。図１６のＡは、β－ＣＤ ＰＰＺ、β－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＴＧＦ １００、及びβ－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＨＡＶ １００の感温性ゲル化の有無を示す図である。各グループにおいて体温(37℃)における粘度を明らかにした。図１６のＢは、β－ＣＤ ＰＰＺ(上段)、β－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＴＧＦ１００(中段)、及びβ－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＨＡＶ １００(下段)のゾル－ゲル転移を可視化した図である。図１６のCは、β-CD PPZとAd-TGFのホスト-ゲスト相互作用の証拠のための2D-NOESY結果(左)と、PPZとAd-HAVのホスト-ゲスト相互作用の証拠のための2D-NOESY結果(右)である。 図１７のＡは、β－ＣＤ ＰＰＺ及びＡｄ－ペプチド間のホスト－ゲスト相互作用を示す模式図である。図１７のＢは、β－ＣＤ ＰＰＺ、β－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＴＧＦ、Ａｄ－ＨＡＶの流体力学的直径結果を示す図である(ｎ＝３)。図１７のＣは、β－ＣＤ ＰＰＺ、β－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＴＧＦ、Ａｄ－ＨＡＶ、及びＡｄ－ペプチド自体(Ａｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶ)のサイズ分布結果及びＴＥＭイメージを示す図である(β-CD PPZ、β-CD PPZ/Ad-TGF、Ad-HAVスケールバーは50nmであり、Ad-ペプチド自体に対するスケールバーは500nmである。図１７のＤは、水性状態のＡｄ－ペプチド単独の凝集に対する模式図である。図１７のＥは、Ａｄ－ペプチド自体に対する流体力学的直径を示す図である。 β－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＴＧＦ １２０及びβ－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＨＡＶ １２０のサイズ分布結果を示す図である。 ＩＶＩＳシステムを用いてＡｄ－ペプチドの比率勾配に依存するホスト－ゲスト相互作用の維持を示す図である。図１９のＡは、ラットにおいてＡｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶがＦＩＴＣ及びローダミン(Ｒｈｏ)でタグ付けされたβ－ＣＤ ＰＰＺ及びＭＳＣと相互作用したホスト－ゲスト反応を示す図である。21日の期間で、それぞれのAd-TGF及びAd-HAV勾配蛍光はIVISシステムで検出した。図１９のＢは、２１日間のＡｄ－ＴＧＦ(上段)及びＡｄ－ＨＡＶ(下段)の平均放射効率値を示す図である。 β－ＣＤ ＰＰＺ／様々な濃度を有するＡｄ－ペプチド／ＭＳＣの複合体の組織適合性、及びその基本的な分化能を示す図である。図２０のＡは、軟骨分化の実証のためのＭＳＣの組織-適合性確認のためのＨ＆Ｅ結果(左)及びsafranin－Ｏ染色の結果である(スケールバーは１００μｍである)。図２０のＢは、ＩＶＩＳシステムを用いて測定された様々な濃度を有するＡｄ－ペプチドがβ－ＣＤ ＰＰＺと結合したコンジュゲート内で幹細胞が維持されるかどうかを確認した図である。図２０のＣは、２１日間のＧＦＰがタグ付けされたＭＳＣのマウスにおける平均放射能効率値を示す図である(ｎ＝３)。図２０のＤは、インビボ実験スケジュールに対する基本模式図である。 実施例2のβ-CD/Ad-ペプチドが有するMSC軟骨形成誘導活性に関する。ラットは21日後に屠殺された。図２１のＡは、軟骨形成の検出のための代表的なタンパク質であるaggrecanの免疫組織化学染色の結果である(スケールバー＝２０μｍ)。図２１のＢは、Ａｇｇ蛍光強度分析結果である(ｎ＝３)。図２１のＣは、マウス組織におけるＡｇｇ遺伝子発現レベルを示す(ｎ＝３)。 実施例2のβ-CD/Ad-ペプチドが有するMSC軟骨形成誘導活性に関する。ラットは21日後に屠殺された。図２２のＡは、軟骨形成の検出のための代表的なタンパク質であるコラーゲンＩＩの免疫組織化学染色の結果である(スケールバー＝２０μｍ)。図２２のＢはＣｏｌ ＩＩ蛍光強度分析の結果である(ｎ＝３)。図２２のＣは、マウス組織におけるＣｏｌ ＩＩ遺伝子発現レベルを示す(ｎ＝３)。 実施例２のβ－ＣＤ／Ａｄ－ペプチドが有するＭＳＣ骨形成を誘導しないことを示す図である。図２３のＡは、様々なＡｄ－ペプチド／β－ＣＤ ＰＰＺ／ＭＳＣでＶｏｎ Ｋｏｓｓａ染色した結果を示す図である(スケールバー＝１００μｍ)。図２３のＢは、骨形成の典型的な遺伝子であるＲｕｎｘ２遺伝子発現レベルを示す図である(ｎ＝３)。 実施例２のヒドロゲル組成物を処理した間葉系幹細胞の投与を模式化した図である。MSCの運命を軟骨形成に適切に制御するためにゲスト分子に結合したTGF-β1のペプチド及びN-カドヘリンペプチドは、ヒドロゲル組成物において化学量論的に柔軟に導入することができる。 実施例３のヒドロゲル組成物のように治療用タンパク質を生理活性物質として使用した場合の模式図を示す。 click chemistryを用いたＡｄ－ＩＬ２の生成反応の模式図を示す。 EDC chemistry化学を用いたＡｄ－ＩＬ２の生成反応の模式図を示す。 タンパク質のチオール基をアミン－ポリエチレングリコール－アダマンチンで接合したＡｄ－ＩＬ２生成反応を電気泳動で確認した結果を示す。 アダマンチンが化学的に接合したＡｄ－ＩＬ２による腫瘍増殖抑制効果を示す。
以下では、本発明をさらに詳細に説明する。
一方、本願に開示されるそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本願に開示される様々な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。なお、下記の具体的な説明により本発明の範疇が制限されるとは言えない。
なお、当技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを使用し、本出願に記載された本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識または確認することができる。また、そのような等価物は本発明に含まれることが意図される。
前記課題を解決するための本発明の一態様として、本発明は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びホスト分子としてベータ-シクロデキストリン(β-cyclodextrin; β-CD)が置換された感温性ポリホスファゼン;及びゲスト分子として、アダマンチン(adamantine)、アゾベンゼン(azobenzene)、コレステロール(cholesterol)、tert-ブチル(tert-butyl)、シクロヘキシルエステル(cyclohexyl ester)、及びナフチル(naphthyl)からなる群から選択される一つ以上の分子が直接またはリンカーを介して連結された生理活性物質を含む、ヒドロゲル複合体であって、前記ベータ-シクロデキストリンにゲスト分子がホスト－ゲスト相互作用(host-guest interaction)により包接(inclusion)され、全体または一部のベータ-シクロデキストリンでコンジュゲートを形成する、ヒドロゲル包接複合体を提供する。
本願における「ヒドロゲル(hydrogel)」とは、水溶液中に存在する高分子から形成された三次元網状構造を指すものであり、通常の共有結合による化学的架橋により形成されるものと分子間の物理的相互作用による物理的架橋により形成されるものに区別される。本願のヒドロゲルは、基本的に感温性ポリホスファゼンの基本骨格を有しており、これにホスト分子が置換されており、前記ホスト分子とホスト－ゲスト相互作用をし、生理活性物質が連結されるゲスト分子が前記ポリホスファゼンとコンジュゲートを形成する。前記ヒドロゲル組成物は、体内に注入することができる生体適合性物質である。
本願において「感温性」とは、低温では高分子水溶液が液状(sol)を維持するが、温度上昇に伴って高分子水溶液がゲル(gel)に変化する性質を意味する。具体的には、室温では液状を示し、３５℃～３７℃以上の温度でゲル状態に変化する性質を意味する。
本願のヒドロゲルは、体内に投入され、体温により三次元構造のゲルを形成することにより、液状での注入が容易であると共にゲル状になり薬物をゆっくり放出することができる利点がある。また、ゲル状で幹細胞の分化に適したニッチ(niche：微小環境)を形成することができる。例えば、幹細胞を単純注入する場合、非特異的に全身に広がる現象が起こるのに対し、幹細胞をゲルと混合した状態で注入する場合、所望の部位を標的化して幹細胞を伝達及び滞留させるなど、単純に注入を容易にするだけでなく、所望の部位に局所伝達するのに役立つ。
したがって、本発明による幹細胞-分化調節因子を含むヒドロゲル組成物を幹細胞に処理して幹細胞分化を調節することができ、このとき、幹細胞-分化調節因子の種類、比率及び両方を調節することにより、幹細胞の幹細胞能を維持したり、幹細胞が特定の状態に分化するように調節することができる。
さらに、本発明によるヒドロゲル組成物は、組織再生に使用することができる。上述のように、本発明による幹細胞-分化調節因子を含むヒドロゲル組成物は、幹細胞の分化を調節することができるため、前記組成物を損傷した組織部位に注入することにより該当部位での幹細胞の分化を調節して所望の組織への再生を促進することができる。このとき、前記組成物は、幹細胞をさらに含むことができるが、これに限定されず、ヒドロゲル組成物自体として組織再生を促進させる効果を発揮することができる。
本願の「ポリホスファゼン」は、感温性を示すように疎水性アミノ酸及び親水性高分子が置換される。具体的には、ジクロロホスファゼン線状高分子に疎水性アミノ酸エステルと親水性分子量３５０～２５００の範囲のメトキシポリエチレングリコールが導入され、高分子の分解速度を調節できるアミノ酸、ペプチドまたはデプシペプチドエステルが一部導入されてもよい。また、側鎖にヒドロキシ基、アミド基、アミノ基、チオール基またはカルボキシル基のような官能基を有する置換基を直接高分子主鎖に導入したり、前記官能基を保護基で置換したアミノ酸エステルまたはペプチドエステルを高分子主鎖に導入した後、保護基を分離したり、前記官能基を有する置換基が導入された高分子を他の官能基に変換する方法で、本発明のホスファゼン系高分子に官能基を導入することができる。本願の感温性ポリホスファゼンは公知のものを使用することができる(韓国公開特許公報20050012533A（特許文献1）及び10-2008-0110472A（特許文献2）などを参照)。このとき、前記感温性ポリホスファゼンは、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンを(５５～８０)：(５～２５)：(５～２０)のモル比率で含むことができるが、これに限定されない。
前記疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であってもよい。疎水性アミノ酸は、NHCH(R1)CO2R2の構造を有し、R1はH, CH3, CH2SH, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)C2H5, CH2CH2SCH3, CH2C6H5, CH2C6H4OH及びCH2C2NH2C6H4からなる群から選択されたものであり、R2は、H, CH3, C2H5, C3H7, C4H9, CH2C6H5及びCH2CHCH2からなる群から選択されるものであってもよい。
前記親水性高分子は、分子量が５５０～２５００の範囲であるポリアルキレングリコールであってもよく、具体的には、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、またはエチレングリコールとプロピレングリコールのブロック共重合体であってもよい。前記ポリアルキレングリコールのアルキレン繰り返し単位の数は７～５０であってもよい。
前記疎水性アミノ酸及び親水性高分子の種類や置換量、及びポリホスファゼンの濃度などを調節してポリホスファゼンのゲル化温度、ゲル強度、及び／又は生分解速度などを調節することができる。例えば、疎水性アミノ酸の組成が増加する場合、ゲル化温度を下げることができ、ポリホスファゼンの濃度が増加するほどゲル化温度は低くなり、ゲル強度は増加する。また、親水性高分子の鎖長が長くなるほどゲル強度が増加し、ゲル化温度が高くなる。
本願の生理活性物質が結合したヒドロゲル包接複合体は、「ホスト－ゲスト相互作用(host-guest interaction)」を通じてゲスト分子と連結された生理活性物質を体内に伝達する。「ホスト-ゲスト相互作用」は、二個以上の分子が分子-自己認識システムの独特の構造認識を通じて非共有結合の複合体を形成することである。ホスト-ゲスト相互作用によるコンジュゲートは、共有結合によるコンジュゲートと比較して合成が複雑ではなく再現性が保障される。本願の実験例１及び４によれば、混合前に準備されたゲスト分子の含有量及び／または比率に比例して特異的なコンジュゲートが生成されたことが分かった。このように、ホスト－ゲスト相互作用を利用した結果、ポリホスファゼンの表面に付着した生理活性物質の含有量及び／又は比率を容易に調節することができる。さらに、体内では、ホスト分子が連結している部位が分解することにより、ゲスト分子が連結した生理活性物質がゆっくり放出されることができる。
本願において「ホスト分子」とは、ゲスト分子を捕捉することができる任意の物質を意味し、疎水性キャビティ(cavity)を有し、親水性表面を有する。具体的には、本願の生理活性物質が結合したヒドロゲルは、ホスト分子としてベータ-シクロデキストリンを含む。ベータ-シクロデキストリンは、毒性が低く免疫原性が低いため、組織工学的または生物学的応用に適している。
本願において「ゲスト分子」とは、ホスト分子のキャビティに包接される分子を意味する。ホスト分子のキャビティは疎水性を示すため、ゲスト分子も疎水性を示し、キャビティに包接するのに適したサイズの物質を使用することができる。例えば、本願のヒドロゲル包接複合体は、ホスト分子としてベータ-シクロデキストリンを含むところ、ゲスト分子として、それに特異的に相互作用するアダマンチン(adamantine)、アゾベンゼン(azobenzene)、コレステロール(cholesterol)、tert-ブチル(tert-butyl)、シクロヘキシルエステル(cyclohexyl ester)、及びナフチル(naphthyl)またはそれらの組み合わせを含むことが好ましい。このとき、ゲスト分子は、生理活性物質の活性を促進するために追加の変形が可能である。
本願において用語「生理活性物質」とは、体内または細胞内に注入されて活性を示す物質を意味する。タンパク質、ペプチド、ワクチン、遺伝子、ホルモン、抗がん剤、新生血管抑制剤、糖類、ポリオール類、糖含有ポリオール類、ポリマー含有ポリオール類、糖含有アミノ酸及び糖含有イオン類からなる群から選択される１種以上であってもよい。
前記タンパク質は、エキセンジン-4(exendin-4)、エリスロポエチン(erythropoietin、EPO)、インターフェロン-アルファ、インターフェロン-ベータ、インターフェロン-ガンマ、成長ホルモン(ヒト、豚、牛など)、成長ホルモン放出因子(growth hormone releasing factor)、神経成長因子(nerve growth factor、NGF)、G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor)、GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor)、M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)、血液凝固因子(blood clotting factor)、インスリン、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone)、線維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor, FGF)、表皮成長因子(epidermal growth factor, EGF)、血小板由来成長因子(platelet-derived growth factor, PDGF), インスリン様成長因子(insulin-like growth factor, IGF)、血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、変換成長因子(transforming growth factor-beta, TGF- β)、神経成長因子(nerve growth factor)、脳神経成長因子(brain-derived neurotrophic factor、BDNF)、ニューロトロフィン-3(neurotrophin-3、NT-3)、ニューロトロフィン-4/5(neurotrophin- 4/5)、プロラクチン、ルリベリン(luliberin)、黄体形成ホルモン放出ホルモン(luteinizing hormone releasing hormone, LHRH)、LHRHアゴニスト(agonists)、LHRHアンタゴニスト(antagonists)、成長ホルモン放出抑制因子(somatostatin)、グルカゴン、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-11(IL-11)、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン(urogastrone)、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン(enkephalins)、エンドルフィン(endorphins)、アンジオテンシン(angiotensins)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(thyrotropin releasing hormone, TRH)、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor、TNF)、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)、ヘパリン分解酵素(heparinase)、骨形成タンパク質(bone morphogenic protein、BMP)、hANP(human atrial natriuretic peptide)、グルカゴン様ペプチド(glucagon-like peptide、GLP-1)、レニン(renin)、ブラジキニン(0bradykinin)、バシトラシン(bacitracins)、ポリミキシン(polymyxins)、コリスチン(colistins)、チロシジン(tyrocidine)、グラミシジン(gramicidins)、シクロスポリン(cyclosporins)、ニューロテンシン(neurotensin)、タキキニン(tachykinin)、ニューロペプチドY(neuropeptide Y、NPY)、ペプチドYY(peptide YY、PYY)、血管作動性腸管ポリペプチド(vasoactive intestinal polypeptide. VIP)、及び下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチド(pituitray adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)からなる群から選択されたものであってもよい。
前記ペプチドは、前記天然タンパク質に由来する生体模倣ペプチドであってもよい。例えば、ペプチドはコラーゲン１由来のGFOGER及びDGEA;laminin由来のYIGSR, SIKVAV, IKVAV, IKLLI, LRGDN,及びSINNNR; laminin γ1由来のLRE, PDGSR, GTFALRGDNGQ, CFALRGDNP, NPWHSIYITRFG, TWYKIAFQRNRK, KAFDITYVRLKF,及びLGTIPG; Fibronectin由来のGRGDS, PKRGDL, NGRAHA, GACRGDCLGA(cyclic), IDAPS, REDV, PHSRN, KQAGDV, LDV, WQPPRARI, SPPRRARV, LIGRKK, IWKHKGRDVILKKDVRFYC, KLDAPT,及びPRARI; Vitronectin由来のCKKQRFRHRNRKG; Osteopotin由来のKRSR, FHRRIKA, CGGNGEPRGDTYRAY, SVVYGLR,及びELVTDFPTDLPAT; Elastin由来のVPGIG及びVGVAPG; Collagen 4由来のMNYYSNS及びCNYYSNS; Thrombospondin由来のCSVTCG, GRGDAC, FQGVLQNVRFVF, AELDVP,及びVALDEP; Nidogen-1由来のGFRGDGQ及びSIGFRGDGQTC; N-cadherin由来のHAV;及びTGF-β1由来のFLPASGL, PWPLPYL, WGLLDLT, PAERLRS, RNLDGWS, NLSSSWI, TLPSNTH, MSAFPFL, SRLGQYI, PFGPLPP, TIASTLH, PRAPADV,及びESPLKRQからなる群から選択されるものであってもよい。
前記ワクチンは、肝炎ワクチンなどからなる群から選択される１種以上のワクチンであってもよい。
前記遺伝子は、短い干渉リボ核酸(samll interfernce RNA; siRNA)、プラスミドデオキシリボ核酸(plasmid DNA)及びアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(antisense oligodeoxynucleotide; AS-ODN)などからなる群から選択される１種以上のものであってもよい。
前記ホルモンは、テストステロン(testosterone)、エストラジオール(estradiol)、プロゲステロン(progesterone)、プロスタグランジン(prostaglandins)及びそれらの合成アナログ、及び変形または同じ薬効を示す物質からなる群から選択される少なくとも１種のものであってもよい。
前記抗癌剤としては、パクリタキセル(paclitaxel)、ドキソルビシン(doxorubicin)、5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、オキサリプラチン(oxaliplatin)、テガフール(tegafur)、イリノテカン(irinotecan)、ドセタキセル(docetaxel)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、ゲムシタビン(gemcitabine)、イホスファミド(ifosfamide)、ミトマイシンC(mitomycin C)、ビンクリスチン(vincristine)、エトポシド(etoposide)、メトトレキサート(methotrexate)、トポテカン(topotecan)、タモキシフェン(tamoxifen)、ビノレルビン(vinorelbine)、カンプトテシン(camptothecin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、クロラムブシル(chlorambucil)、ブリオスタチン-1(bryostatin-1)、カリケアミシン(calicheamicin)、メイタンシン(maytansine)、レバミゾール(levamisole)、DNA組換えインターフェロンアルファ-2a(DNA recombinant interferon alfa-2a)、ミトサントロン(mitoxantrone)、ニムスチン(nimustine)、インターフェロンα-2a(interferon alfa-2a)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、フォルメスタン(formestane)、酢酸ロイプロリド(leuprolide acetate)、酢酸メゲストロール(megestrol acetate)、カルモフール(carmofur)、テニポシド(teniposide)、ブレオマイシン(bleomycin)、カルムスチン(carmustine)、ヘプタプラチン(heptaplatin)、エキセメスタン(exemestane)、アナストロゾール(anastrozole)、エストラムスチン(estramustine)、カペシタビン(capecitabine)、酢酸ゴセレリン(goserelin acetate)、ポリサッカリドカリウム(polysaccharide potassuim)、メドロキシプロゲステロンアセテート(medroxyprogesterone acetate)、エピルビシン(epirubicin)、レトロゾール(letrozole)、ピラルビシン(pirarubicin)、トポテカン(topotecan)、アルトレタミン(altretamine)、トレミフェンクエン酸塩(toremifene citrate)、BCNU、タキソテール(taxotere)、アクチノマイシンD(actinomycin D)、アナストロゾール(Anasterozole)、ベロテカン(Belotecan)、イマチニブ(Imatinib)、フロクスウリジン(Floxuridine)、ゲムシタビン(Gemcitabine)、ヒドロキシ尿素(Hydroxyurea)、ゾレドロネート(Zoledronate)、ビンクリスチン(Vincristine)、フルタミド(Flutamide)、バルルビシン(Valrubicin)、ストレプトゾシン(Streptozocin)、ポリエチレングリコール接合抗癌剤及びそれらの合成アナログ、ならびに変形または同じ薬効を示す物質からなる群から選択される１種以上の物質であってもよい。
前記新生血管抑制剤は、クロドロネート(Clodronate)、６－デオキシ－６－デメチル－４－デジメチルアミノテトラサイクリン(6-deoxy-6-demethyl-4-dedimethylaminotetracycline; COL-3)、ドキシサイクリン(Doxycycline)、マリマスタット(Marimastat)、2-メトキシエストラジオール(2-Methoxyestradiol)、スクアラミン(Squalamine)、SU5164、サリドマイド(Thalidomide)、TNP-470、コンブレタスタチンA4(Combretastatin A4)、ソイイソフラボン(Soy Isoflavone)、エンザスタウリン(Enzastaurin)、CC 5013(Revimid; Celgene Corp、Warren、NJ)、セレコキシブ(Celecoxib)、ZD 6474、ハロフジノン臭化水素酸塩(Halofuginone hydrobromide)、インターフェロン-アルファ、ベバシズマブ(Bevacizumab)、サメ軟骨抽出物(AE-941)、インターロイキン-12、血管内皮成長因子トラップ(VEFG-trap)、セツキシマブ(Cetuximab)、レビマスタト(Rebimastat)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)阻害剤(例えば、BMS-275291(Bristol-Myers Squibb, New York, NY)、S-3304など)、プロテインキナーゼCベータ阻害剤(Protein kinase C beta inhibitor、例えば、LY317615)、エンドスタチン(Endostatin)、バタラニブ(vatalanib、PTK787/ZK 222584)、りんご酸スニチニブ(sunitinib malate、SU11248)、シレンジタイド(cilengitide、EMD-121974)、ヒト化モノクローナル抗体MEDI-522、E ２００－４、インテグリンアルファ－５－ベータ－１アンタゴニスト(ATN－161)及びそれらの合成アナログ及び変形または同じ薬効を示す物質からなる群から選択される１種以上の物質であってもよい。
前記糖類は、乳糖(lactose)、グルコース(glucose)、デキストラン(dextran)、マンノース(mannose)、スクロース(sucrose)、トレハロース(trehalose)、マルトース(maltose)、及びフィコール(ficoll)からなる群から選択される１種以上の物質であってもよい。
前記ポリオール類は、イノシトール(inositol)、マンニトール(mannitol)、及びソルビトール(sorbitol)からなる群から選択される１種以上の物質であってもよい。
前記糖含有ポリオール類は、スクロース-マンニトール(sucrose-mannitol)、グルコース-マンニトール(glucose-mannitoal)、またはそれらの組み合わせであってもよい。
前記ポリマー含有ポリオール類は、トレハロース-ポリエチレングリコール(trehalose-PEG)、スクロース-ポリエチレングリコール(sucrose-PEG)、及びスクロース-デキストラン(sucrose-dextran)からなる群から選択される１種以上の物質であってもよい。
前記糖含有アミノ酸は、ソルビトール-グリシン(sorbitol-glycine)、スクロース-グリシン(sucrose-glycine)、またはそれらの組み合わせであってもよい。
前記糖含有イオン類は、トレハロース-硫酸亜鉛(trehalose-ZnSO4)、マルトース-硫酸亜鉛(maltose-ZnSO4)、またはそれらの組み合わせであってもよい。
前記生理活性物質は、幹細胞-分化調節因子であってもよい。この場合、ヒドロゲル組成物は幹細胞と共に培養して幹細胞の分化を調節するのに使用されてもよい。幹細胞-分化調節因子は後述する通りである。
また、生理活性物質は、体内で治療効果を示す物質であってもよいが、これらに限定されない。
本願のヒドロゲル包接複合体において、生理活性物質はリンカーを介して連結されてもよい。「リンカー」(またはスペーサー)は、ゲスト分子と生理活性物質との間に隙間を与え、３Ｄヒドロゲルの生理活性物質が生理活性部位に接着しやすくする。例えば、前記ゲスト分子と生理活性物質は、リンカーとして分子量２００～５，０００Ｄａのポリエチレングリコール(polyethylene glycol; PEG)、ポリエーテルイミド(polyetherimide; PEI)、ポリプロピレングリコール(polypropylene glycol; PPG)またはポリグリシン(polyglycine),(polyhistidine)及びポリ(ＲＡＤＡ)からなる群から選択されるポリペプチドであるリンカー(linker)を介して連結することができる。本願で限定されない一実施例では、１．０ｋＤＡのＰＥＧが使用された(実施例１及び２)。
本発明の他の態様は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン；及びゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子が直接またはリンカーを介して連結された幹細胞-分化調節因子；を有効成分として含む幹細胞分化調節用ヒドロゲル組成物を提供する。
ここで使用される用語は前記の通りである。
さらに、本発明は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン；及びゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子が直接またはリンカーを介して連結された幹細胞-分化調節因子；を有効成分として含む、ヒドロゲル組成物の幹細胞分化調節における使用を提供する。
本願において「幹細胞」とは、組織を構成する各細胞に分化(differentiation)する前の段階の未分化細胞を総称する用語であり、特定の分化刺激(環境)により特定の細胞に分化が進行する。幹細胞は、細胞分裂が停止した分化細胞とは異なり、細胞分裂により自分と同じ細胞を産生(self-renewal)することができ、増殖(proliferation; expansion)する特性があり、また分化刺激が加わると、特定細胞に分化するが、他の環境または他の分化刺激により他の細胞にも分化することができ、分化に柔軟性(plasticity)を有しているのが特徴である。このような幹細胞は、それらの発生起源により胚性幹細胞と成体幹細胞に区分することができるが、本発明では、生物学的、倫理的、そして法的な問題が多く、臨床適用に制限の多い胚性幹細胞ではなく、成体幹細胞を用いることが望ましい。成体幹細胞の中でも、骨髄及び脂肪組織などの成体組織内にまれに存在する間葉系幹細胞(MSC)を用いることができる。
本願において幹細胞の分化調節における使用とは、幹細胞が軟骨細胞、骨細胞、神経細胞、神経芽細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などの特定細胞に分化誘導されるように調節する使用を意味する。
本願の幹細胞の分化調節用ヒドロゲル組成物は、幹細胞と共に個体の疾患部位に直接移植することができ、インビトロで培養することができる。移植には、カテーテルを用いた非外科的投与及び疾患部位の切開後に注入する外科的投与方法がいずれも可能である。
本願において「幹細胞-分化調節因子」とは、化学物質、タンパク質、及びペプチドであり、幹細胞の分化に影響を及ぼす物質を意味する。特に、ＥＣＭ(Extracellular matrix)に存在する物質であり、細胞の増殖と分化を制御する物質がこれに該当することができる。限定されない例として、ＢＭＰ、Ｎ－カドヘリン(N-cadherin)、ＩＧＦ(insulin-like growth factor)、ＦＧＦ(fibroblast growth factor)、及びＴＧＦ－β(transforming growth factor β)などのタンパク質があり得、天然のタンパク質を使用することは安定性及び財政的圧迫に関連する問題があるため、それに由来する生体模倣ペプチドを使用することができる。
本願の幹細胞-分化調節因子は、ＲＧＤ(arginine-lysine-aspartic acid)を含むペプチドであってもよい。ヒドロゲル組成物で、前記ＲＧＤモル数の割合がホスト分子のモル数を基準に５０～１００％である場合、前記ヒドロゲル組成物は、軟骨及び／または骨細胞分化誘導用組成物であってもよい。具体的には、初期の肥大性段階に分化を誘導することができる。前記ＲＧＤモル数の割合がホスト分子のモル数を基準として０～２５％である場合、前記ヒドロゲル組成物は脂肪細胞分化誘導用組成物であってもよい。
これに関連し、本願で限定されない実施例では、幹細胞-分化調節因子としてＥＣＭ分子候補物質の中で本研究には、ＭＳＣに接着性が強く、ＭＳＣ発達に有効なペプチドであるＲＧＤ(arginine-lysine-aspartic acid)が選択された(実施例１)。RGDは、MSC認識、付着、生存、及び分化に関与するトリ-ペプチドであり、fibronectin内の主要な結合部位である。したがって、３ＤヒドロゲルにおけるＲＧＤの保有は、ＭＳＣの生存と分化のために必要である。MSCに対するRGD刺激は、骨細胞、軟骨細胞、及び脂肪細胞などの様々な分化を誘導する。本願の実験例３によれば、Ａｄ－ＲＧＤの量の調節だけでＭＳＣの運命を調節できることが分かった(図１２を参照)。このような結果から、MSCに対する骨細胞、軟骨細胞、及び脂肪細胞に分化するためのヒドロゲル組成物を提供するために、高度に制御されたMSCニッチの設計が必要であり、生理活性物質としてRGDが必要であることが分かった。
また、ECMに存在する様々な生理活性物質の濃度を調節してヒドロゲルを合成することが複数の合成配置を作るために必要な状況の中で、本願ではホスト-ゲスト相互作用を用いたAd-RGDの濃度を所望に応じて調節して骨／軟骨／脂肪の生成を誘導することができた(図１１)。このような結果から、微調整されなければならない生理活性物質の濃度を本願のヒドロゲルでは容易に制御できることが分かる。
一方、幹細胞－分化調節因子は、ＣＥＳＰＬＫＲＱを含むペプチドとＣＬＲＡＨＡＶＤＩＮを含むペプチドであってもよい。ここで、ＣＥＳＰＬＫＲＱを含むペプチド及びＣＬＲＡＨＡＶＤＩＮを含むペプチドのモル数は、４：６～６：４であってもよい。この場合、ヒドロゲル組成物は、軟骨細胞への分化誘導用組成物であってもよい。
これに関連し、分子量25kDaのTGF-β1は、胎児骨と軟骨発達部位に存在し、軟骨特異的遺伝子の発現を促進する細胞内シグナル伝達系統において重要な役割を果たす。特に、TGF-β1は、軟骨形成調節因子としてp38、ERK-1(extracellular signal-regulated kinase-1)、及びJNK(c-Jun N-terminal kinase)を含むMAPKを調節する。本願で限定されない実施例では、TGF-β1の全ペプチド配列におけるTGF-β1受容体に対する最も反応性の高い結合部位であるCESPLKRQを使用した。
次に、ペプチドを模倣するための天然タンパク質供給源は、細胞対細胞の相互作用及び軟骨形成に重要なN-カドヘリンである。N-カドヘリンは、約99.7kDAの分子量を有する。最近10年間、MSC軟骨形成を誘導し、N-カドヘリンの作用を模倣したHis-Ala-Val(HAV)モチーフが多くの研究で強調された。ＨＡＶ単独の配列がＭＳＣ軟骨形成を誘導するのに十分であっても、ＣＬＲＡＨＡＶＤＩＮなどの延長ＨＡＶ配列が有効なモチーフとしてより優秀であった。これに対し、本願で限定されない実施例では、延長ＨＡＶペプチド配列が本願で選択された。結果として、我々は、ホスト－ゲスト相互作用による化学量論的ペプチド比率制御下でＴＧＦ－β１を模倣するＣＥＳＰＬＫＲＱ及びＮ－カドヘリンを模倣するＣＬＲＡＨＡＶＤＩＮなどの天然タンパク質から誘導されたペプチド配列対を選択した。これらのペプチドはMSCに影響を及ぼし、MSC連鎖反応を誘発することができ、細胞間の相互作用とMAPK(mitogen-activated protein kinase)の細胞内シグナル伝達メカニズムを誘発することができる。
本願の実験例６では、Ｔ５０及びＨ５０における軟骨形成遺伝子及びタンパク質発現の程度が最も高く示された(図２０及び図２１を参照)。すなわち、合成されたアダマンタン-PEG-CESPLKRQ(Ad-TGF)及びアダマンタン-PEG-CLRAHAVDIN(Ad-HAV)を同時に使用して最適化された軟骨形成を誘導する。MAPK因子(p38、ERK-1/2、及びJNK)の精巧な調節を調律するTGF-β1は、MSC軟骨形成の開始とかなり関連している。N-カドヘリンも合成されたヒドロゲルでも細胞間の相互作用を通じてMSCの軟骨形成を誘導する。軟骨形成の分化のためのMAPK活性化は、TGF-β1及びN-カドヘリンの両方により調和することができる。TGF-β1またはN-カドヘリン自体の刺激によるMSCの軟骨形成を示すことができるという点で、これらタンパク質は、軟骨形成にとって重要であり、MAPK因子の仲裁のために互いに関連している。実験例６の結果は、Ｎ－カドヘリンがＭＳＣを互いに凝縮させるだけでなく、ＭＡＰＫによりＣｏｌ ＩＩ及びＡｇｇなどの軟骨形成遺伝子を発現するようにＴＧＦ－β１に影響を与えることを意味する。このような理由により、軟骨形成の発達の観点から、二つの要因が互いに優勢ではないという結論が得られた。結論として、T50 H50群のように、二つのAd-ペプチドがバランスの取れた群はMAPKに対する優性を示さないため、最適な軟骨形成を誘導することができる。
本発明のもう一つの態様は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン;及びゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子が、直接またはリンカーを介して連結されたIL-2;を有効成分として含む癌細胞増殖または転移抑制用ヒドロゲル組成物を提供する。
また、本発明は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン;及びゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子が、直接またはリンカーを介して連結されたIL-2;を有効成分として含む、ヒドロゲル組成物の癌細胞増殖または転移抑制における使用を提供する。
一方、本発明のヒドロゲル包接複合体は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びホスト分子が置換された感温性ポリホスファゼンを準備する第１段階; ゲスト分子とリンカーとが連結された生理活性物質を準備する第２段階;及び前記ポリホスファゼンを生理活性物質と混合する段階を含む工程を通じて製造されてもよい。
本願では、このようなＭＳＣを軟骨形成への最適化した分化のためのヒドロゲル組成物を、ホスト－ゲスト相互作用に基づいてＡｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶを化学量論的に調節した後、追加の合成工程なしに製造することができることを確認した(図２３)。
たとえ本願では、例示的に、いくつかのＡｄ－ペプチドの組み合わせでいくつかのヒドロゲルを作っても、より多くのＡｄ－ペプチド比率の組み合わせと配列を通じて所望の状態に幹細胞を分化するために最適化したニッチを容易に製造することができる。結局、そのような技術は、ゲスト分子または比率の変換を通じて理想的な３Ｄ生体医学構造物を製造するプラットフォームシステムを提供する。これにより、幹細胞の分化に適した生理活性物質の種類、比率及び配列が制御された本発明のヒドロゲル組成物を容易に製造することができる。
このような文脈で、前記第２段階の前に幹細胞が特定の状態に分化するのに必要であることが知られているＥＣＭの組成に基づいて生理活性物質の種類及び比率について既知の情報を入手することができ、このような情報に基づいて前記第２段階の生理活性物質は、前記情報による情報及び比率で調製することができる。これにより製造されたヒドロゲル組成物は、生理活性物質を前記種類及び比率を有するように微調整することができる。
前記製造方法において、前記生理活性物質のモル数がホスト分子のモル数より多い場合、過剰の生理活性物質は結合しないため、前記生理活性物質のモル数は、前記ホスト分子のモル数以下であることが好ましい。
本発明のもう一つの態様は、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼンを提供する。
このとき、前記ベータ-シクロデキストリンは、Ｃ１－６アルキレンジアミン、ポリ(Ｃ１－６アルキレンジアミン)、ｎ－アミノ－ｎ－オキソアルカン酸(このとき、ｎは２～６の整数)、チオール、カルボキシレート、Ｃ２－６ヒドロキシアルキルｍ－アミノ－ｍ－オキソアルカン酸(この時、ｍは２～６の整数)、シアノ－アミノ－Ｃ１－４アルキルチオ－Ｃ１－６アルカノールリンカーでその６番炭素上のヒドロキシル基を介してポリホスファゼン主鎖に結合したことが特徴である。前記のように所定の官能基を有する適正長のリンカーで連結されたベータ-シクロデキストリンを含むことにより、前記置換による感温性ポリホスファゼンのゲル化温度に対する影響を調節し、体温付近の温度でゲル化するように調節された感温性ゲルを提供することができる。
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
〔実施例１－β－ＣＤ ＰＰＺ及びadamantane-PEG-RGDを含むヒドロゲル組成物
材料〕
ヘキサクロロシクロトリホスファゼン(Hexachlorocyclotriphosphazene、Aldrich)を５５℃の真空(約０．１ｍｍＨｇ)の条件で昇華により精製した。ポリ(ジクロロホスファゼン)は、公知の方法により製造した(Sohn, Y. S. et al., Macromolecules 1995, 28 (22), 7566-7568（非特許文献3）)。これは、ヘキサクロロシクロトリホスファゼンを５時間、２５０℃の塩化アルミニウム(AlCl3)の触媒下で５時間反応させて調製した。Ｌ－イソロイシンエチルエステル塩酸塩(IleOEt・HCl)は、Ｌ－イソロイシン(Aldrich)から公知の方法に従って製造した。分子量７５０Ｄａのα－アミノ－ω－メトキシ－ポリ(エチレングリコール)(AMPEG)は、公知の方法に従って製造した(Loccufier, J.; Crommen et al., Die Makromolekulare Chemie, Rapid Communications 1991, 12 (3), 159-165（非特許文献4）)。テトラヒドロフラン(THF)及びトリエチルアミン(TEA)(Junsei Chemical Co Ltd.)は、乾燥窒素雰囲気中のナトリウム金属／ベンゾフェノン(Acros)及び酸化バリウム(Acros)の沸点で還流することにより精製した。Aldrichから購入したβ-シクロデキストリンを追加の精製なしに使用した。モノ-6-OTs-βCD及びモノ-6-ジエチルアミノ-βCD(NH2-βCD)は公知の方法に従って合成した(Liu, Y.-Y.; Fan et al., Macromolecular Bioscience 2003, 3 (12), 715-719（非特許文献5）)。アセトニトリル(ACN)、エタノールアミン(AEtOH)、4-(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)、イソブチルクロロホルメート(IBCF)、及び1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)は、Aldrichから入手した。ジクロロメタン(DCM)は、テジョン化学会社(韓国)から純粋な品質のものを購入し、追加の精製は行わなかった。
（１）PPZ酸(acid PPZ)の合成
酸ポリマーは、以下に記載のように合成された。乾燥ＴＨＦ(100mL)に溶解したポリ(ジクロロホスファゼン)(3.00g、0.03mmol)にＴＥＡ(16.54mL、0.12mmol)を含む乾燥ＴＨＦ(200mL)に懸濁したＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ(7.36g、0.038mmol)をゆっくりと加えた。反応混合物をドライアイスで、アセトン浴で１２時間撹拌した後、室温まで３６時間撹拌を続けた。この混合物に、ＴＥＡ(2.16mL、0.02mmol)を含有する乾燥ＴＨＦ(20mL)を溶解したＡＥｔＯＨ(0.46mL、0.008mmol)、及びＴＥＡ(4.92g、0.04mmol)を含む乾燥ＴＨＦ(50mL)に溶解したＡＭＰＥＧ７５０(7.57g、0.01mmol)を徐々に添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した後、４０～５０℃で２４時間撹拌した。ポリマー反応混合物を公知の方法に従って精製した。簡単に言えば、反応混合物を濾過した。濾液を濃縮した後、それをｎ－ヘキサンに注いで沈殿物を得、これは同じ溶媒システムで再沈殿された。ポリマー生成物を透析膜(MW12,000～14,000カットオフ)でメタノールに対して３日間透析し、４日間４℃で蒸留した。最後に、透析した溶液を凍結乾燥してAEtOHを有するポリ(有機ホスファゼン)を得た。最後に、カルボン酸末端ポリマーは、以下のような反応により得た。蒸留ＴＨＦ(200mL)中のＡＥｔＯＨ(5.84g、0.01mmol)を有するポリマー溶液を室温で窒素雰囲気下で撹拌した。このポリマー溶液に、蒸留ＴＨＦ(50ml)中の無水グルタル酸(3.18g、0.02mmol)及び４－(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP、3.41g、0.02mmol)の各溶液を加えた。反応混合物を４０℃で２４時間撹拌した。撹拌後、反応混合物を濾過した後、濃縮した。ポリマー生成物をメタノールで３日間透析した後、４℃で、３日間蒸留水で透析して精製した。透析した溶液を凍結乾燥してグルタル酸を有するポリ(有機ホスファゼン)を得た。合成過程の模式図を図１に示す。
（２）β-CD PPZの合成
酸ポリマー(3.70g、6.77mmol)をＡＣＮ(100mL)に溶解して撹拌した。次に、完全に溶解したポリマー溶液にDMAP(2.48g、20.31mmol)、EDC(3.15g、20.31mmol)、TEA(2.83mL、20.31mmol)を加えた。ＮＨ２－βＣＤ(0.54g、10.16mmol)を脱イオン化水(１０ｍＬ)に溶解した。ポリマーのカルボキシル基を活性化するために、ＤＭＡＰ、ＥＤＣ、及びＴＥＡを添加した３０分後にＮＨ２－βＣＤの脱イオン化水溶液をポリマー溶液に添加した。反応混合物を室温で48時間撹拌した後、減圧下で蒸発させてポリマーを集めた。集められたポリマー生成物をメタノールに溶解した。ポリマー生成物を透析膜(MW12,000～14,000カットオフ)で３日間メタノールに対して透析し、４℃で４日間脱イオン水で透析した後、最終透析溶液を凍結乾燥した。合成過程の模式図を図１に示す。
合成されたβ－ＣＤ ＰＰＺにおいて、β－ＣＤのコンジュゲート化に対する具体的な証拠は、β－ＣＤ ＰＰＺの合成後、４．８３ｐｐｍでβ－ＣＤのアノマー化プロトンピークから分かる(図２のＣ)。また、FT-IRデータにおいて、酸PPZとβ-CDとの間に新たに形成されたアミド結合(C=O)により、1550cm-1でβ-CDコンジュゲートによる固有のピークが示された(図2のD)。合成されたβ-CD PPZは、温度に応じて疎水性IleOEtと親水性PEGとの間の分子の調和により現れるゾル-ゲル転移(sol-gel translation)などの感温性の特徴を有する。例えば、β－ＣＤ ＰＰＺにおける水の水素結合は、温度の上昇により破壊され、疎水性ＩｌｅＯＥｔは、強い疎水性相互作用を形成してゲルを形成した。
（３）アダマンタン-PEG-MeAcの合成
合成過程の模式図を図３に示す。アダマンタン酢酸(1.07g、5.5mmol)をＤＣＭに溶解した。TEA(3.53mL、35mmol)及びDIC(2.35mL、18.6mmol)を溶液に添加した。前記溶液を室温で約30分間撹拌した後、NH2-PEG 1K-NH2(5.0g、5mmol)を加え、室温で1日間反応させた。溶媒を減圧により除去し、脱イオン水を加えて未反応のアダマンチン酢酸を沈殿させた。沈殿物を１４，０００ｒｐｍで２０分間３回遠心分離して回収した。アダマンチン酢酸の微細な残留沈殿物を０．４５μｍの紙フィルターで濾過した。未精製の白色粉末の生成物を凍結乾燥により集めた。未精製の白色粉末から純粋なAd-PEG-NH2を分離するためにTLC(thin layer chromatography)を行った。ＴＬＣにおけるＲｆ値は、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９３：７の溶離液の組成により０．３であった。Ｒｆ値に基づいて溶出溶媒に溶解したＡｄ－ＰＥＧ－ＮＨ２の純粋な生成物を液体クロマトグラフィーで収集した。Ａｄ－ＰＥＧ－ＮＨ２を含む溶出溶媒は、圧力が低下した蒸発装置から除去された。Ad-PEG-NH2をD.Wに溶解した後、凍結乾燥して白色粉末(3.19g、2.65mmol)を得た。生成物を４００ＭＨｚのＮＭＲ(Bruker)及びＦＴ－ＩＲで分析し、その結果を図４及び図５に示す。
Ad-PEG-NH2(1g、0.8mmol)をDMCに溶解した。次いで、メタクリル酸クロリド(0.97mL、9.3mmol)及びＴＥＡ(1.38mL、9.95mmol)をＡｄ－ＰＥＧ－ＮＨ２溶液に添加した。反応は５０℃で１日間行った。反応液を減圧下で蒸発させ、MWCO 1 kDAで透析し、凍結乾燥して精製した。製造されたAd-PEG-MeAcのNMR値を図6に示す。
（４）アダマンタン-PEG-RGD(Ad-RGD)の合成
合成過程の模式図を図３に示す。Ad-PEG-MeAc(0.3g、0.2mmol)をpH10.0に調整した水溶液に溶解した。TCEP(66mg、0.23mmol)及びCGRGDS(0.41g、0.69mmol)をAd-PEG-MeAc溶液に直ちに添加した。反応溶液を窒素雰囲気下で１０分間パージした。室温で２時間反応を行い、透析及び凍結乾燥により精製を行った。形成されたＡｄ－ＲＧＤのＮＭＲ値を図７に示す。
（５）β-CD PPZとAd-RGDを混合したコンジュゲートの製造
前記で調製したβ－ＣＤ ＰＰＺとＡｄ－ＲＧＤを混合してコンジュゲートを製造した。調製したコンジュゲートは、β－ＣＤ ＰＰＺヒドロゲル中に存在するホスト分子の数に基づいてＡｄ－ＲＧＤ分子を０、２５、５０、１００％の濃度で含む。Ad-RGD 100、50、25は、ゲスト分子がβ-CDポリマーのホスト分子に100％、50％、25％のホスト-ゲスト相互作用を通じて挿入されることを意味する。Ad-RGD 100、50、25に対する正確な濃度は、以下の表1に記載の通りである。
このように、３Ｄヒドロゲル空間における幹細胞の接着部分であるＲＧＤの含有量を制御するために最終的に準備した。
（６）β-CD PPZ/Ad-RGDの特性分析
製造されたポリマーの構造を、1H NMR(Bruker avance III 400 MHzフーリエ変換モード(DMSO-d6及びCDCl3))の測定により評価した。水溶性ポリマー溶液の粘度は、Brookfield RVDV-III+粘度計において固定剪断速度０．１で５～７０℃で評価した。前記測定は、０．２ｒｐｍの設定スピンドル速度と０．３３℃／ｍｉｎの加熱速度で行った。
空間情報は、DMSO-d6に溶解したRGDを含むβ-CDとアダマンチンの1：1～1：0モル比の混合物を用いて2D-NMR(NOESY)から得た。2D-NMRスペクトルはDD2 600MHz FT NMR(Agilent Technologies)に記録した。これを図８に示す。
＜実験例１：実施例１のコンジュゲートにおけるＡｄ－ＲＧＤ量の調節によるホスト－ゲスト相互作用の発生の確認＞
本願においてβ-CDとAd-RGDとの間の結合親和性に起因し、互いに異なる量で挿入されたAd-RGDを通じて十分に調節されたゲスト分子量を誘導すると仮定した。まず、β-CD PPZとβ-CD PPZ + Ad-RGDにおいて動的光散乱(DLS)測定時に互いに異なる。水溶性環境における前者の平均粒径は１２１．３±２６．２ｎｍであり、後者の場合は１８０．３±３２．４ｎｍである。Ad-RGDがβ-CD PPZに含まれることにより、β-CD PPZ+ Ad-RGDの実際の水性粒子のサイズが増加した。
ホスト-ゲストの相互作用の直接的な証拠を明らかにするために、ゲスト分子の増加に応じてβ-CD PPZとAd-RGDの2D-NOESY積分値を測定した。まず、２Ｄ－ＮＯＥＳＹの結果においてメチレン(Ha、Hc)、メタン(Hb)、及びＨ－５のβ－ＣＤ内部キャビティ陽子のＡｄ陽子からなる交差ピークで挿入された複合体が確認された(図８のＡ)。結果的に、β－ＣＤ内部キャビティとＡｄ間の交差ピークの積分値は、ゲスト分子の量が増加するにつれて比例的に増加することが分かった(図８のＣ)。このような結果から、β-CD PPZ及びAD-RGDはホスト-ゲスト相互作用が微細に起こるため、化学量論的に調節されたAD-RGDを通じてホスト-ゲスト相互作用の発生を調節することができる。
＜実験例２：実施例１のコンジュゲートの温度感応型の特性＞
PPZ酸とβ-CDのコンジュゲートとの間の粘度の変化を観察した。Acid PPZのTmax(溶液が最大粘度に達する温度)は48.8℃で体温より高かった。Acid PPZにおいて、親水性カルボン酸基が他の親水性モイエティであるOH基を有するβ-CDだけで置換されたβ-CD PPZのTmaxは、36.8℃に低下した(図9のA)。
β-CD PPZ及びAd-RGD混合物の調製後のゲル化形成について確認した。その結果、体温より低い条件(４℃)において、Ａｄ－ＲＧＤ ０、Ａｄ－ＲＧＤ ５０、及びＡｄ－ＲＧＤ １００を添加したβ－ＣＤ ＰＰＺは溶液状態を示した(図９のＢ)。温度を３７℃に上げることにより、全てのグループで良好に形成されたゲル化が示された。これから、ゲスト分子コンジュゲートであるAd-RGDが体温でβ-CD PPZヒドロゲルのゲル形成に影響を及ぼさないことが分かる。
＜実験例３：実施例１のコンジュゲートの間葉系幹細胞の生存率及び分化調節活性の測定＞
（１）細胞培養方法
マウスの間葉系幹細胞(mMSC)は、Cyagen Biosciences Incから購入した。mMSCを、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma-aldrich, US)及び10%ウシ胎児血清(FBS)(Welgene, KR)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco BRL, Grand Island, NY)で３７℃の５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気下で培養した。
（２）間葉系幹細胞の生死分析＆3Dヒドロゲルニッチで培養したCCK-8の測定
収穫されたmMSC(passage 7, 5×105 cells)を、0.1重量％の調製されたヒドロゲル10重量％に懸濁した。ｍＭＳＣ／ヒドロゲル混合物を２４-ウェル培養プレートで細胞インサートで培養した。
0、1、3、及び7日目に細胞培地を除去し、DPBS溶液に溶解したcalcein AM/ethidium homodimer-1(生死分析キット、Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて間葉系幹細胞の生死を分析した。すべてのイメージは共焦点顕微鏡(Zeiss LSM 800、DE)により3D状態で得られた。
CCK-8の分析のために、7日目にmMSCを含むすべての3Dヒドロゲルを培地で崩壊させた。培養したヒドロゲルを96ウェル培養プレート(SPL life sciences、KR)に移し、10μlのCCK-8(Dojindo Molecular Technology、Inc.JP)溶液を各ウェルに添加した。ヒドロゲルを含有するＣＣＫ－８溶液は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で細胞培養器内に２時間置いた。インキュベーション後、４５０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダー(BIO－RAD、Hercules、CA、US)を用いて吸光度を測定した。
（３）3Dヒドロゲルニッチで培養した間葉系幹細胞の遺伝子分析(RT-PCR)
Trizol(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いてRNA抽出物を調製した。サンプルをDNase(Invitrogen)で処理した後、総RNA 1 mgをcDNA合成に使用した(Superscript First-strand synthesis system, GibcoBRL, Life Technologies)。要約すると、20mLの混合物(1 RT緩衝液、1.25mMのMgCl2、5mMのDTT、2.5gのランダムヘキサマー、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTPそれぞれ0.5mM、及び50UのSuperscript II酵素)内で逆転写反応を行った。逆転写反応後、RNAは、2UのEscherichia coli RNase Hにより分解された。2UのTakara Taq、1×PCR緩衝液、0.8mM dNTP混合物、及び100pmolの特定のプライマーを含む50mLの反応緩衝液においてPCR反応を行った。標準ＰＣＲ条件は、以下の通りである：９５℃で３分間、９５℃で５秒間の変性、６０℃で３４秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間延長するサイクル、プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、下記表２に記載の通りである。遺伝子発現値はβ-actinのハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。
（４）実験結果
ホスト－ゲスト相互作用に基づいて３Ｄニッチ幹細胞を製造するために、単に混合されるＲＧＤの濃度を調節するシステムをデザインした。主要なintegrin結合ドメインであるRGDはfibronectin、vitronectin、fibrinogen、osteoponin、及びbone sialoproteinのようなECM蛋白質に豊富である。調製した3Dヒドロゲル幹細胞のニッチは、ゲスト分子であるAd-RGDにより調節された。MSC生存率は、いくつかの合成物質の3D人工支持体に対する最近の研究で評価され、その結果は、特定の条件内で50％以上の生存率を示した。
幹細胞の培養システムにおけるＭＳＣの生存率を評価した結果を図１０のＣに示す。生死分析イメージにおいて、ホスト及びゲスト分子に囲まれたMSCは、7日間3D培養システムでかなり生存した。また、ＲＧＤ－インテグリン結合(図１０のＡ)により、ＭＳＣの成長形態がＲＧＤの存在下で(特に、Ad－RGD 25、50、100)示された。３Ｄ培養７日後のＭＳＣの生存率は、ＲＧＤ０を用いた場合(生存率５７．５％)と比較してＲＧＤ２５、５０、１００を用いた場合(生存率７２．２～７７．８％)増加した。しかしながら、Ad-RGD 25、50、100を使用した場合、MSC生存率は互いに類似した。このような結果から、RGDの有無によりMSC生存率が影響を受けることが分かる。すなわち、RGD分子の存在が合成3D幹細胞ニッチにおいて幹細胞の生存に重要な役割を果たすことが分かった。
実施例１に従って、Ａｄ－ＲＧＤをβ－ＣＤ ＰＰＺヒドロゲル中のβ－ＣＤのモル数に基づいて０％、２５％、５０％、及び１００％の比率のモル数で添加したコンジュゲートを調製し、これをＭＳＣに加えた。
ＭＳＣの分化に関し、Ａｄ－ＲＧＤ５０及び１００を使用した場合のＡｄ－ＲＧＤとＭＳＣのα５β１インテグリンと高い結合可能性が増加した骨形成因子(ALP及びcollagen I)及び軟骨形成因子(aggrecan及びcollagen II)の発現を誘導した(図１１のＡ、Ｂ、Ｄ、及びＥ)。発達過程において軟骨形成プロセスは骨形成に一時的に先行し、肥大性段階(hypertrophic stage)は、前記プロセス間の中間関門である。具体的には、時空間的に軟骨形成関連因子と骨形成関連因子は、肥大性段階で同時に強化される。すなわち、RGD 50及びRGD 100を使用した場合、骨形成因子が大幅に増加し、RGD 100を使用した場合、軟骨形成因子が大幅に増加した結果から、Ad-RGD 50及び100で培養されたMSCは肥大性段階に直面することが分かった。特に、軟骨形成因子はＡｄ－ＲＧＤ １００で高く示されたため、相対的に低いＡｄ－ＲＧＤ ５０を使用した場合と比較し、ＲＧＤの高レベルが初期肥大性段階として現れることが分かった。
一方、脂肪生成関連因子(Ｃ/ＥＢＰα及びＰＰＡＲγ)は、ＲＧＤ ０、ＲＧＤ ２５などのＡｄ－ＲＧＤが低いか、または存在しない場合に高く発現された(図１１のＣ及びＦ)。結局、この結果は、β-CD PPZと組み合わせたAd-RGDの量を調節するだけでMSCの運命を調節できることが分かった。
このような結果から、本発明におけるβ-CD PPZとAd-RGDのコンジュゲートのMSC分化活性に関する模式図を図12に記載した。
〔実施例２：β－ＣＤ ＰＰＺ、Ａｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶを含むヒドロゲル組成物〕
（１）β-CD PPZの合成
実施例１の(１)及び(２)に記載したことと同様の方法でβ－ＣＤ ＰＰＺを製造した。
（２）Ad-PEG-MeAcの合成
実施例１の(３)に記載したことと同様の方法でＡｄ－ＰＥＧ－ＭｅＡｃを製造した。
（３）Ad-TGFの合成
調製したＡｄ－ＰＥＧ－ＭｅＡＣ(M.W.1302.6Da、200mg、0.15mmol)をｐＨ１０．０に調整した水溶液に溶解した。TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine, 44.0 mg, 0.15 mmol)及びTGF-β1模倣ペプチド(CESPLKRQ、960.12 Da、442.2 mg、0.46 mmol)を前記水溶液に同時に添加した。反応溶液をＮ２雰囲気下で１０分間パージした。そして室温で２時間反応を行った。反応後、透析及び凍結乾燥により精製を行った。製造工程の模式図を図１３に示す。
（４）Ad-HAVの合成
調製したＡｄ－ＰＥＧ－ＭｅＡｃ(Ｍ．Ｗ．１３０２．６Ｄａ、３００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ)をｐＨ１０．０に調整した水溶液に溶解した。TCEP(66.0mg、0.23mmol)及びN-カドヘリン模倣ペプチド(CLRAHAVDIN, 1111.29 Da, 767.8 mg)を前記水溶液に同時に添加した。反応溶液をＮ２雰囲気下で１０分間パージした。そして室温で２時間反応を行った。反応後、透析及び凍結乾燥により精製を行った。製造工程の模式図を図１３に示す。
（５）β-CD PPZにAd-TGF及びAd-HAVを混合してコンジュゲートを作製
前記調製したβ－ＣＤ ＰＰＺにＡｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶの下記表３の割合で混合してコンジュゲートを製造した。
（６）β-CD PPZ/Ad-TGF及び／またはHAVの特性分析
調製したβ-CD PPZ、Ad-HAV及びAd-TGFの構造は、1H NMR(DMSO-d6及びCDCl3を用いたBruker電位III400MHzフーリエ変換モード)を測定して評価した(図２、図１４、及び図１５)。
ポリマー水性溶液の粘度は、Brookfield RVDV-III+粘度計で５～７０℃で０．１の固定剪断速度で評価した。測定は、０．２ｒｐｍの設定スピンドル速度と０．３３℃／minの加熱速度で行った(図１６のＡ)。
空間情報は、２Ｄ－ＮＭＲ(NOESY)でＤ２Ｏにペプチドが溶解したβ－ＣＤとアダマンチンの１：１モル混合物を用いて得た。A2D-NMRスペクトルは、DD2 600MHz FT NMR(Agilent Technologies)に記録された(図１６のＣ)。
＜実験例４：実施例２のコンジュゲートにおけるβ－ＣＤ ＰＰＺとＡｄ－ペプチドとの間のホスト－ゲスト相互作用の発生の確認＞
β－ＣＤ ＰＰＺとＡｄ－ペプチドのホスト－ゲスト相互作用を検証するために、調製されたコンジュゲートヒドロゲルの同じ条件下でＤ２Ｏを用いた２Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを水溶性状態で測定した。2D-NMRは、分子間相互作用及び/または挿入された複合体(inclusion complex)形状を観察するための強力な方法である。2D-NOESYのクロスピークは、結合された結合より空間的に近い核共鳴結合を得ることができる。ホスト－ゲスト相互作用に含まれる２Ｄ－ＮＯＥＳＹにおけるクロスピークであるアダマンタンのＨａ、ｃ、Ｈｂ(δ０．６～１．３ｐｐｍ)及びβ－ＣＤ内部キャビティのＨ－５'(δ３．４～３．５ｐｐｍ)は、図１６のＣで見られるように明瞭に現れた。
また、ホスト分子にＡｄ－ペプチドが化学量論的に正確に挿入されたかどうかを確認するために、ホスト分子：ゲスト分子を１：１、１：１．２、及び０：１の割合になるように混合した後、動的光散乱(DLS)を測定した。とりわけ、ホスト分子とゲスト分子が１：１であるコンジュゲートで増加した流体力学的直径が示された(図１７のＣ)。ホスト分子：ゲスト分子が１：１のコンジュゲートのＤＬＳ結果において、ゲスト分子単独の場合のピークは現れなかった(図１７のＣ)。これから、それらはβ-CD PPZから分離されたゲスト分子がないことを意味する。Ad-TGF及びAd-HAV単独の粒子は、それぞれ353.63±31.71nm及び460.78±49.53nmであるため(図１７のＥ)、β-CD PPZと比較し、はるかに大きいAd-TGF及びAd-HAVの粒子サイズは水溶液状態で疎水性アダマンタン分子が挿入の凝集による結果である。これは、ホスト分子：ゲスト分子＝１：１の場合、水溶性環境においてβ－ＣＤ ＰＰＺとＡｄ－ペプチドのコンジュゲートに全てのＡｄ－ペプチドが組み込まれたことを意味する。一方、Ａｄ－ペプチドが過剰にβ－ＣＤ ＰＰＺと混合されると(ホスト分子：ゲスト分子＝１：１．２)、Ａｄペプチドの残量はＡｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶ単独のピークと類似したピークを示すことが分かった(図１８)。結果的に、2D-NOESYは、β-CD PPZとAd-ペプチドとの間のホスト-ゲスト相互作用によりコンジュゲートをうまく形成することが分かった。
一方、生きている動物の生体イメージングシステム(IVIS)を用い、β－ＣＤ ＰＰＺにおいてＡｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶが初期に異なる含量で結合したコンジュゲートが維持されるかどうかを確認した。Ad-TGF及びAd-HAVの分子尾では、ローダミン(Rho)及びフルオレセインイソチオシアネート(FITC)がコンジュゲート化過程で連結された。そして、蛍光を発揮するゲスト分子がＭＳＣポスト包接複合体(post-inclusion complex)の製造にβ－ＣＤ ＰＰＺと共に投与された。ＰＰＺの生分解性または溶解のために、ＰＰＺに結合したβ－ＣＤは、外に流出し、経時により蛍光を含むＡｄ－ペプチドのシグナルが小さくなった。さらに、Ad-TGF/Ad-HAVの化学量論的パターンの調節は、他のゲスト分子を21日間使用することが観察された(図１９のＡ)。例えば、Ad-TGFの蛍光強度は、T100H0、T75H25、T50H50、及びT25H75の順に高かった。そのような結果は、ホスト-ゲスト相互作用に依存する化学量論的に異なるゲスト分子のホールディングに由来する。次に、表現された蛍光に対する関心領域(ROI)値は、図１９のＢに計算された通りである。Ａｄ－ペプチドが酸性ＰＰＺと混合されることにより(ＰＰＺにおいてβ－ＣＤを欠く)、３ＤヒドロゲルからＡｄ－ペプチドの急速な脱出が示された。全てのグループ(T100 H0、T75 H25、T50 H50、T25 H75、及びT0 H100)において、ＲＯＩ値は、β－ＣＤ ＰＰＺの生分解及び溶解のために経時によって減少したが、全てのグループ及び全ての時間において初期に異なって添加されたＡｄ－ペプチドの比率により調節されたβ－ＣＤ ＰＰＺ内で、Ａｄ－ペプチド蛍光発現はホスト－ゲスト相互作用により維持された。この結果から、生きている動物でも3Dβ-CD PPZヒドロゲルのホスト-ゲスト相互作用をかなり長期間維持する結果が分かった。
＜実験例５：温度感応型特性＞
ホスト分子とゲスト分子の合成に応じて、β－ＣＤ ＰＰＺを組み込んだＴ１００ Ｈ０及びＴ０ Ｈ１００の流動性測定及び熱感応性ゾル－ゲル転移の可視化を行った。β－ＣＤ ＰＰＺにＡｄ－ＴＧＦ １００及びＡｄ－ＨＡＶ １００を挿入しても調製したコンジュゲートのヒドロゲルもゲル化特性及び体温で十分な粘度を示した（図１６）。ホスト－ゲスト相互作用により調製されたβ－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＴＧＦ １００及びβ－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＨＡＶ １００のＴ値は、Ａｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶの親水性ＰＥＧの保有のため、β－ＣＤ ＰＰＺ自体と比較してわずかに高い温度に移動した（図１６のＡ）。特に、β－ＣＤ ＰＰＺ、β－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＴＧＦ １００、及びβ－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ＨＡＶ １００の体温における粘度は、２６８．７５、３８７．５０、及び３２５．００ｐａ・ｓであった（図１６のＡ）。このような感温性粘度結果に基づいて、実施例２で調製されたヒドロゲルは生きている動物に適切に投与することができる。
＜実験例６：実施例２のコンジュゲートの組織適合性及びＭＳＣの軟骨形成の誘導＞
（１）生体適合性測定方法
96ウェル組織培養プレート(SPL、Korea)に一定濃度(1×104 cells/well)のmMSC(マウスの間葉系幹細胞)及びNIH3T3(マウスの線維芽細胞)を接種した。各細胞株は、十分に溶解したβ-CD PPZ(濃度：0～20,000μg/mL)と共に24時間培養した。接種後、使用した培地を捨て、細胞をDMEM及び新鮮なPBSで1回洗浄した。新鮮な培地(200mL/ウェル)を添加した後、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazoliumbromide(MTT)溶液(100mg/well)を細胞に添加した後、4時間３７℃の加湿された５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。形成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯで細胞を培養することにより可溶化した。マイクロプレートリーダー(Bio-Tek Instruments, USA)を使用し、570nmで溶液の吸光度を測定した。細胞生存率(％)は、［ａｂ］実験群／［ａｂ］対照群×１００％で計算された。
（２）in vivo組織再生実験
動物実験に関する法律及び韓国科学技術研究院(KIST)の実験動物運営委員会(IACUC)のガイドラインに従って、あらゆる生きている動物実験が行われた。IACUCは実験を許可した(許可番号：2017-092)。Balb/cヌードマウス(4週齢、20～25g、雌性)をNara Bio INC(京畿道、韓国)から購入した。ヌードマウスをバランスのとれた酸素及び窒素中で、３％イソフルランで麻酔した。MSC/β-CD PPZ(10wt％)/ 0～100％のAd-TGF(T, adamantane-PEG1000-CESPLKRQ, 2248.70 Da)及びAd-HAV(H, adamantane-PEG1000-CLRAHAVDIN, 2399.87 Da)を31ゲージ針の注射器を使用し、背中の正中線の右側にあるマウスの皮下ポケットに注射した。各マウスは、10重量％β-CD PPZと混合した2×106細胞を含む100μLの注射を打った。全ての組織を注射後４週間後に収集し、組織検査及び遺伝子分析に使用した。
（３）組織学的及び免疫組織学的分析
集められた全ての組織をパラフィンに挿入し、ミクロトーム(６μｍ厚)で切断した。組織学的評価のために、組織の切片を脱パラフィン化し、再水和し、H&E、safranin-O、Von kossa、及び免疫組織化学で染色した。免疫組織化学染色のために、切片の組織を一次抗体であるanti-aggrecan (1:500, Abcam, ab3778)とand anti-collagen II(1:500, Abcam, ab34712)で4℃で一晩中インキュベートした。3回洗浄した後、スライドをヤギ抗マウスIgG(TRICT, Abcam, ab6786)、及びヤギ抗ウサギIgG(Alexa 488, Abcam, ab150077)などの蛍光染料に接合された適切な二次抗体と共にインキュベートした。イメージは、共焦点レーザー走査顕微鏡(Zeiss)と明るいイメージ顕微鏡(Zeiss)を用いてキャプチャーした。
（４）人工組織で測定された遺伝子分析
Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてRNA抽出物を調製した。組織をDNase(Invitrogen)で処理した後、1 mgのRNAをcDNA合成のために使用した(Superscript First-strand synthesis system, GibcoBRL, Life Technologies)。要約すると、逆転写反応は、20mlの混合物(1RT緩衝液、1.25mM MgCl2、5mM DTT、2.5gランダムヘキサマー、各0.5mMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、及び50UのSuperscript II enzyme)で４２℃で行った。逆転写反応の後、RNAは2UのEscherichia coli RNase Hにより分解された。2UのTakara Taq、1×PCR緩衝液、0.8mM dNTP混合物、及び100pmolの特定のプライマーを含む50mLの反応緩衝液中でPCR反応を行った。標準ＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃で３分間、９５℃で５秒間の変性、６０℃で３４秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間延長するサイクル。プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、下記表４に記載の通りである。遺伝子発現値はβ-actinのハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。
（５）実験結果
前記(１)に従って、ＭＳＣとＮＩＨ３Ｔ３の細胞株でＭＴＴ分析を行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験を行った。高濃度(１０，０００μｇ／ｍＬ)のβ－ＣＤ ＰＰＺポリマー溶液で各細胞株を処理したにもかかわらず、ＭＳＣとＮＩＨ３Ｔ３の細胞生存率は８０％以上であった。したがって、このポリマーは、インビボ動物の次の研究に適していると考えられた。
インビボ組織再生実験において、β-CD PPZ/比率調節されたAd-ペプチド/MSCが投与されたインビボでの生体適合性は、H&E染色により確認された。Ｈ＆Ｅ染色の組織学的結果によれば、外因性マクロファージの産生及び毒性などの異物質反応は、β－ＣＤ ＰＰＺ／比率調節されたＡｄ－ペプチドで処理された全ての群において観察されなかった(図２０のＡ)。その後、正常にβ-CD PPZ/比率調節されたAd-ペプチド/MSCを注射した軟骨新生は、safranin-O染色により観察された。軟骨と細胞質の色はそれぞれ赤と緑色で染色される。T0 H0以外に、すべての群において軟骨に染色された赤色が明確に観察された(図２０のＡ)。
さらに、インビボでのＭＳＣの維持は、局所的に長期間の治療効率を維持できるかどうかを把握するために測定された。したがって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＭＳＣは、β－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ペプチドコンジュゲートの挿入により囲まれ、これらのＭＳＣが生きている動物で維持されるかどうかを確認した。局所注入されたＭＳＣは２１日間注射部位で維持された。しかしながら、ＭＳＣ付着及び細胞間の相互作用因子が排除されたＴ０ Ｈ０グループでは、ＭＳＣ蛍光が顕著に低いことが確認された（図２０のＢ）。これにより、細胞間の相互作用とＴＧＦ－β１刺激が軟骨分化だけでなく幹細胞の生存率まで向上させることが分かった。残っているＭＳＣに対する関心領域（ＲＯＩ）値の測定により、他のＡｄ－ペプチドを含む群と比較し、Ｔ０ Ｈ０の低いＭＳＣ維持を確認した（図２０のＣ）。ＭＳＣにＡｄ－ペプチドが存在することは、注射部位における局所的ＭＳＣ維持に役立つ。簡単に言えば、これらゲスト分子の化学量論的に結合したβ－ＣＤ ＰＰＺヒドロゲルは、インビトロ及びインビボで生体適合性であった。さらに、β－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ペプチド複合体を用いたＭＳＣ軟骨形成誘導がＴ０ Ｈ０グループ以外で観察された。
柔軟で他のゲスト分子内容物の正確なＭＳＣ軟骨形成レベルを評価するために、ＩＩ型コラーゲン(Col II)及びａｇｇｒｅｃａｎ(Agg)の典型的な軟骨形成マーカーを使用して分析を行った。我々の結果に基づいて、ゲスト分子の柔軟性によるMSC軟骨形成分化は、サフラニン-O染色により示された。Ｔ０ Ｈ０群を除く全てグループにおいて軟骨分化が認められた。ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ染色の結果に基づいて、正確な軟骨形成を遺伝子発現レベル及び免疫組織化学により測定した。β－ＣＤ ＰＰＺ及びＡｄ－ペプチドが囲まれたＭＳＣの局所的皮下注射により新生された組織は、すべての実験群から抽出された。軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質であるＡｇｇは、すべてのＡｄ－ＴＧＦ及び／またはＡｄ－ＨＡＶ群で相当合成及び発現された。特に、Ｔ５０ Ｈ５０群では、Ｔ１００ Ｈ０、Ｔ７５ Ｈ２５、Ｔ２５ Ｈ７５、及びＴ０ Ｈ１００群と比較し、最高のＡｇｇ特異的蛍光及び遺伝子発現が確認された（図２１のＢ及びＣ）。Ｔ５０及びＨ５０の遺伝子及びタンパク質発現の程度は、Ｔ１００ Ｈ０、Ｔ７５ Ｈ２５、及びＴ２５ Ｈ７５などの他の遺伝子群と比較して２倍で示された。Ａｄ－ペプチドが存在しない場合、Ａｇｇ発現は測定されなかった。軟骨の主要タンパク質であるＣｏｌ ＩＩは、軟骨生成評価の次のマーカーとして選択された。Ｃｏｌ ＩＩも特異的な蛍光及び遺伝子発現により観察された。Ｃｏｌ ＩＩは、Ｔ０ Ｈ０群と比較してβ－ＣＤ ＰＰＺ／Ａｄ－ペプチドが処理された群でうまく生成された（図２２のＡ）。Ｃｏｌ ＩＩ遺伝子及びタンパク質発現は、免疫組織分析及び遺伝子分析においてＡｇｇのようなパターンを示した（図２２のＢ及びＣ）。また、Ｃｏｌ ＩＩの最も高い発現もＴ５０ Ｈ５０群で示された。
骨形成(osteogenesis)は、軟骨形成を前駆物質として含む連続的な発達プロセスの一つである。具体的には、ラント関連転写因子2(Runx 2)及びosterixのような特定の刺激下で肥大性の軟骨細胞が骨細胞に分化するとしても、本願で使用されるAdペプチドは、軟骨細胞の骨形成の終結のための追加プロセスを防止しなければならない。軟骨形成過程における末端ＭＳＣの不正確な分化産物により、骨形成の抑制は重要である。一般に、Runx2は、骨形成に典型的で重要な転写因子である。すなわち、Runx2は、追加の骨形成が観察されるかどうかについての遺伝子分析マーカーとして選択された。さらに、骨形成の最終生成物であるカルシウム生成をVon kossa染色により確認した。その結果、カルシウム点は見られなかった(図２３のＡ)。さらに、Runx2遺伝子の発現は過剰に検出されなかった(図２３のＢ)。結局、実施例２のシステムによる骨形成は、ＴＧＦ－β１誘導ペプチドを用いても完全に遮断され、Ａｄ－ペプチドが組み込まれた群でのみ軟骨形成誘導のみが示された。
このような結果から、本発明においてβ－ＣＤ ＰＰＺと比率が調節されたＡｄ－ＴＧＦ及びＡｄ－ＨＡＶのコンジュゲートのＭＳＣ分化活性に関する模式図を図１２に記載した。
〔実施例３：β－ＣＤ ＰＰＺがＡｄ－ＩＬ２とホスト－ゲスト相互作用で結合したコンジュゲート〕
（１）β-CD PPZ, the host moleculeの合成
実施例１の(１)及び(２)に記載したことと同様の方法でβ－ＣＤ ＰＰＺを製造した。
（２）Ad-PEG-MeAcの合成
実施例１の(３)に記載したことと同様の方法でＡｄ－ＰＥＧ－ＭｅＡｃを製造した。
（３）Ad-IL2の合成
１）方法1(click chemistryを用いた方法)
調製したＡｄ－ＰＥＧ－ＭｅＡＣ(0.09mg、0.00007mmol)をｐＨ１０．０に調整した水溶液に溶解した。TCEP(0.2mg、0.0007mmol)及びrhIL-2(1mg)を前記水溶液に同時に添加した。反応溶液をＮ２雰囲気下で１０分間パージした。そして室温で２時間反応を行った。反応後、透析及び凍結乾燥により精製を行った。反応模式図を図２６に示す。
２）方法2(EDC chemistryを用いた方法)
調製したＡｄ－ＰＥＧ－ＭｅＡＣ(0.09mg、0.00007mmol)をEDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)(0.28 mg, 0.0015 mmol)と共に水溶性溶解した。ｒｈＩＬ－２（１ｍｇ）をＡｄ－ＰＥＧ－ＮＨ２＋ＥＤＣの水溶性溶液に溶解した。反応溶液をＮ２雰囲気下で１０分間パージした。そして室温で２４時間反応を行った。反応後、透析及び凍結乾燥により精製を行った。反応模式図を図２７に示す。
（４）β-CD PPZ/Ad-IL2の特性分析
ポリアクリルアミドゲルに分子量により張られるｌａｄｄｅｒ、ＩＬ－２、そしてＡｄ－ＩＬ２を、電気泳動を通じて下げた結果、ＩＬ－２に比べてＡｄ－ＩＬ２の分子量が高いことが確認できた。
＜実験例７：実施例３コンジュゲートの癌細胞成長阻止活性＞
（１）実験方法
B16 melanoma cell line 5.0×105 cellsの量をB6 mouseに注入した(0 day, n=5)。がん組織の大きさが１００mm3以上になると、β－ＣＤ ＰＰＺ＋Ａｄ－ＩＬ２複合体とＰＢＳ単独を準備してそれぞれのマウスのがん組織に直接注射投与した。合計１２日間マウス癌組織サイズを測定して平均値を算出した。
（２）実験結果
対照群であるＰＢＳ注射投与グループでは、がん組織のサイズが制御できないほど大きくなることを確認し、実験期間中にＰＢＳグループの計５匹のうち２匹はがん組織が過度に肥大して死亡した。それに比べてβ－ＣＤ ＰＰＺ＋Ａｄ－ＩＬ２複合体を注射投与したグループでは全てのラットが生存し、がん組織の大きさも対照群に比べてかなりよく抑制されている結果が確認できた。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (14)

  1. 複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びホスト分子としてベータ-シクロデキストリン(β-cyclodextrin; β-CD)が置換された感温性ポリホスファゼン;及び
    ゲスト分子として、アダマンチン(adamantine)、アゾベンゼン(azobenzene)、コレステロール(cholesterol)、tert-ブチル(tert-butyl)、シクロヘキシルエステル(cyclohexyl ester)、及びナフチル(naphthyl)からなる群から選択される一つ以上の分子または官能基が直接またはリンカーを介して連結された生理活性物質を含む、ヒドロゲル複合体であって、
    前記ベータ-シクロデキストリンにゲスト分子がホスト-ゲスト相互作用(host-guest interaction)により包接(inclusion)され、全体または一部のベータ-シクロデキストリンでコンジュゲートを形成する、ヒドロゲル包接複合体。
  2. 前記感温性ポリホスファゼンは、複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンを（５５～８０）：（５～２５）：（５～２０）のモル比で含む、請求項１に記載のヒドロゲル包接複合体。
  3. 前記生理活性物質は、タンパク質、ペプチド、ワクチン、遺伝子、ホルモン、抗がん剤、新生血管抑制剤、糖類、ポリオール類、糖含有ポリオール類、ポリマー含有ポリオール類、糖含有アミノ酸及び糖含有イオン類からなる群から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１に記載のヒドロゲル包接複合体。
  4. 前記タンパク質は、エキセンジン-4(exendin-4)、エリスロポエチン(erythropoietin、EPO)、インターフェロン-アルファ、インターフェロン-ベータ、インターフェロン-ガンマ、成長ホルモン(ヒト、豚、牛など)、成長ホルモン放出因子(growth hormone releasing factor)、神経成長因子(nerve growth factor、NGF)、G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor)、GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor)、M-CSF (macrophage-colony stimulating factor)、血液凝固因子(blood clotting factor)、インスリン、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone)、線維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor, FGF)、表皮成長因子(epidermal growth factor, EGF)、血小板由来成長因子(platelet-derived growth factor, PDGF), インスリン様成長因子(insulin-like growth factor, IGF)、血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、変換成長因子(transforming growth factor-beta, TGF- β)、神経成長因子(nerve growth factor)、脳神経成長因子(brain-derived neurotrophic factor、BDNF)、ニューロトロフィン-3(neurotrophin-3、NT-3)、ニューロトロフィン-4/5(neurotrophin- 4/5)、プロラクチン、ルリベリン(luliberin)、黄体形成ホルモン放出ホルモン(luteinizing hormone releasing hormone, LHRH)、LHRHアゴニスト(agonists)、LHRHアンタゴニスト(antagonists)、成長ホルモン放出抑制因子(somatostatin)、グルカゴン、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-11(IL-11)、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン(urogastrone)、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン(enkephalins)、エンドルフィン(endorphins)、アンジオテンシン(angiotensins)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(thyrotropin releasing hormone、TRH)、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor, TNF)、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)、ヘパリン分解酵素(heparinase)、骨形成タンパク質(bone morphogenic protein、BMP)、hANP(human atrial natriuretic peptide)、グルカゴン様ペプチド(glucagon-like peptide、GLP-1)、レニン(renin)、ブラジキニン(0bradykinin)、バシトラシン(bacitracins)、ポリミキシン(polymyxins)、コリスチン(colistins)、チロシジン(tyrocidine)、グラミシジン(gramicidins)、シクロスポリン(cyclosporins)、ニューロテンシン(neurotensin)、タキキニン(tachykinin)、ニューロペプチドY(neuropeptide Y, NPY)、ペプチドYY(peptide YY, PYY)、血管作動性腸管ポリペプチド(vasoactive intestinal polypeptide. VIP)及び下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチド(pituitray adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)からなる群から選択される、請求項３に記載のヒドロゲル包接複合体。
  5. 前記ペプチドは、コラーゲン１由来のGFOGER及びDGEA; laminin由来のYIGSR, SIKVAV, IKVAV, IKLLI, LRGDN,及びSINNNR; laminin γ1由来のLRE, PDGSR, GTFALRGDNGQ, CFALRGDNP, NPWHSIYITRFG, TWYKIAFQRNRK, KAFDITYVRLKF,及びLGTIPG; Fibronectin由来のGRGDS, PKRGDL, NGRAHA, GACRGDCLGA (cyclic), IDAPS, REDV, PHSRN, KQAGDV, LDV, WQPPRARI, SPPRRARV, LIGRKK, IWKHKGRDVILKKDVRFYC, KLDAPT,及びPRARI; Vitronectin由来のCKKQRFRHRNRKG; Osteopotin由来のKRSR, FHRRIKA, CGGNGEPRGDTYRAY, SVVYGLR,及びELVTDFPTDLPAT; Elastin由来のVPGIG及びVGVAPG; Collagen 4由来のMNYYSNS及びCNYYSNS; Thrombospondin由来のCSVTCG, GRGDAC, FQGVLQNVRFVF, AELDVP,及びVALDEP; Nidogen-1由来のGFRGDGQ及びSIGFRGDGQTC; N-cadherin由来のHAV;及びTGF-β1由来のFLPASGL, PWPLPYL, WGLLDLT, PAERLRS, RNLDGWS, NLSSSWI, TLPSNTH, MSAFPFL, SRLGQYI, PFGPLPP, TIASTLH, PRAPADV,及びESPLKRQからなる群から選択される、請求項３に記載のヒドロゲル包接複合体。
  6. 前記ゲスト分子と生理活性物質は、分子量200～5,000Daのポリエチレングリコール(polyethylene glycol; PEG)、ポリエーテルイミド(polyetherimide; PEI)、ポリプロピレングリコール(polypropylene glycol; PPG)、またはポリグリシン(polyglycine), (polyhistidine)及びポリ(RADA)からなる群から選択されるポリペプチドであるリンカー(linker)を介して連結される、請求項１に記載のヒドロゲル包接複合体。
  7. 複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン;及び
    ゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子または官能基が直接またはリンカーを介して連結された幹細胞-分化調節因子；を有効成分として含む幹細胞分化調節用ヒドロゲル組成物。
  8. ベータ-シクロデキストリンにゲスト分子がホスト－ゲスト相互作用により包接されてコンジュゲートを形成することにより複合体を形成する、請求項７に記載の幹細胞分化調節用ヒドロゲル組成物。
  9. 複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン;及びゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子または官能基が直接またはリンカーを介して連結された幹細胞-分化調節因子；は独立的に提供されるか、またはベータ-シクロデキストリンにゲスト分子がホスト-ゲスト相互作用により包接されてコンジュゲートを形成することにより形成された複合体の形態で提供される、請求項７に記載の幹細胞分化調節用ヒドロゲル組成物。
  10. 幹細胞-分化調節因子の種類、比率、及びその両方を調節することにより幹細胞が特定の状態に分化するように調節する、請求項７に記載の幹細胞分化調節用ヒドロゲル組成物。
  11. 前記幹細胞-分化調節因子は、RGD(arginine-lysine-aspartic acid)を含むペプチドである、請求項７に記載の幹細胞分化調節用ヒドロゲル組成物。
  12. 前記幹細胞-分化調節因子は、ＣＥＳＰＬＫＲＱを含むペプチド及びＣＬＲＡＨＡＶＤＩＮを含むペプチドである、請求項７に記載の幹細胞分化調節用ヒドロゲル組成物。
  13. 複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼン;及び
    ゲスト分子として、アダマンチン、アゾベンゼン、コレステロール、tert-ブチル、シクロヘキシルエステル、及びナフチルからなる群から選択される一つ以上の分子または官能基が直接またはリンカーを介して連結されたIL-2；を有効成分として含む、癌細胞増殖または転移抑制用ヒドロゲル組成物。
  14. 複数の疎水性アミノ酸、親水性高分子、及びベータ-シクロデキストリンが置換された感温性ポリホスファゼンであって、
    前記ベータ-シクロデキストリンは、Ｃ １－６ アルキレンジアミン、ポリ(Ｃ １－６ アルキレンジアミン)、ｎ－アミノ－ｎ－オキソアルカン酸(ここで、ｎは２～６の整数)、チオール、カルボキシレート、Ｃ ２－６ ヒドロキシアルキルｍ－アミノ－ｍ－オキソアルカン酸(このとき、ｍは２～６の整数)、シアノ－アミノ－Ｃ １－４ アルキルチオ－Ｃ １－６ アルカンをリンカーでその６番炭素上のヒドロキシル基を介してポリホスファゼン主鎖に結合した、感温性ポリホスファゼン。
JP2021576096A 2019-06-19 2020-05-19 ベータ－シクロデキストリンを通じたホスト－ゲスト相互作用により感温性ポリホスファゼンに結合した生理活性物質を含むヒドロゲル包接複合体及びその使用 Active JP7373702B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0073071 2019-06-19
KR1020190073071A KR102286453B1 (ko) 2019-06-19 2019-06-19 베타-사이클로덱스트린을 통한 호스트-게스트 상호작용에 의해 온도감응성 폴리포스파젠에 결합된 생리활성 물질을 포함하는 하이드로젤 포접 복합체 및 이의 용도
PCT/KR2020/006548 WO2020256287A2 (ko) 2019-06-19 2020-05-19 베타-사이클로덱스트린을 통한 호스트-게스트 상호작용에 의해 온도감응성 폴리포스파젠에 결합된 생리활성 물질을 포함하는 하이드로젤 포접 복합체 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022538821A JP2022538821A (ja) 2022-09-06
JP7373702B2 true JP7373702B2 (ja) 2023-11-06

Family

ID=74040245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021576096A Active JP7373702B2 (ja) 2019-06-19 2020-05-19 ベータ－シクロデキストリンを通じたホスト－ゲスト相互作用により感温性ポリホスファゼンに結合した生理活性物質を含むヒドロゲル包接複合体及びその使用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210009763A1 (ja)
EP (1) EP3988580A4 (ja)
JP (1) JP7373702B2 (ja)
KR (1) KR102286453B1 (ja)
CN (1) CN114269391A (ja)
WO (1) WO2020256287A2 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114933732B (zh) * 2022-04-11 2023-01-31 四川大学 一种具备主动被动结构的复合超隔热气凝胶及其制备方法
CN114773629B (zh) * 2022-05-20 2024-04-12 昆明理工大学 用于创伤性脑损伤的可注射光固化止血水凝胶的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004523502A (ja) 2000-12-19 2004-08-05 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 包接複合体を含有する組成物
US20090047348A1 (en) 2007-06-14 2009-02-19 Korea Institute Of Science And Technology Poly(organophosphazene) hydrogels for drug delivery, preparation method thereof and use thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6171610B1 (en) * 1998-04-24 2001-01-09 University Of Massachusetts Guided development and support of hydrogel-cell compositions
KR100517643B1 (ko) 2003-07-25 2005-09-28 한국과학기술연구원 온도 감응성 폴리포스파젠계 고분자, 이의 제조방법 및이를 이용한 주입형 온도 감응성 폴리포스파젠 하이드로젤
US20070202076A1 (en) * 2004-09-23 2007-08-30 Triche Timothy J Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutics
KR20080110473A (ko) * 2007-06-14 2008-12-18 한국과학기술연구원 화학적 가교 결합을 가지는 포스파젠계 고분자 하이드로젤,그의 제조방법 및 그의 용도
KR101232261B1 (ko) * 2010-01-22 2013-02-15 한국과학기술연구원 폴리포스파젠계 생체 재료 조성물
KR101622851B1 (ko) 2014-11-27 2016-05-20 서울대학교산학협력단 pH 응답성 사이클로덱스트린 유도체, 이의 제조방법 및 상기 사이클로덱스트린 유도체와 약물의 pH 응답성 결합체
KR101783308B1 (ko) * 2016-04-01 2017-09-29 아주대학교산학협력단 감마-사이클로덱스트린을 함유한 생체주입형 조직접착성 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004523502A (ja) 2000-12-19 2004-08-05 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 包接複合体を含有する組成物
US20090047348A1 (en) 2007-06-14 2009-02-19 Korea Institute Of Science And Technology Poly(organophosphazene) hydrogels for drug delivery, preparation method thereof and use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIAN, Z. et al，Synthesis and Assembly of Novel Poly(organophosphazene) Structures Based on Noncovalent "Host-Guest" Inclusion Complexation，Macromolecules，2014年，Vol.47，pp.1065-1072
ZHANG, J. T. et al，Preparation and Characterization of Novel Temperature Sensitive Poly(N-isopropylacrylamide-co-acryloyl beta-cyclodextrin) Hydrogels with Fast Shrinking Kinetics，Macromol. Chem. Phys.，2004年，Vol.205，pp.107-113

Also Published As

Publication number Publication date
EP3988580A2 (en) 2022-04-27
CN114269391A (zh) 2022-04-01
WO2020256287A3 (ko) 2021-02-11
KR102286453B1 (ko) 2021-08-09
JP2022538821A (ja) 2022-09-06
US20210009763A1 (en) 2021-01-14
EP3988580A4 (en) 2023-12-06
WO2020256287A2 (ko) 2020-12-24
KR20200144884A (ko) 2020-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Advances in biodegradable and injectable hydrogels for biomedical applications
KR100968591B1 (ko) 약물전달용 폴리포스파젠계 하이드로젤, 그의 제조방법 및그의 용도
Chun et al. The use of injectable, thermosensitive poly (organophosphazene)–RGD conjugates for the enhancement of mesenchymal stem cell osteogenic differentiation
KR100687281B1 (ko) 생리 활성 물질이 결합된 조직 재생용 주입형 온도 감응성플루로닉 유도체 하이드로겔 및 이의 제조 방법
CN110603268B (zh) 将利用棓酚基改性的透明质酸衍生物用作底物的水凝胶及其用途
KR101209266B1 (ko) 생분해성 및 온도 감응성 폴리포스파젠계 자성 고분자, 그의 제조 방법 및 용도
Moon et al. Temperature-responsive compounds as in situ gelling biomedical materials
CN102573944B (zh) 原位成型水凝胶及其生物医学用途
EP2773696B1 (en) Self-assembled composite ultrasmall peptide-polymer hydrogels
KR101480363B1 (ko) 분해 속도 조절이 가능한 이온기를 가지는 포스파젠계 고분자, 그의 제조방법 및 그의 용도
KR100784485B1 (ko) 생분해성 온도 감응성 폴리포스파젠계 하이드로젤, 그의제조방법 및 그의 용도
KR100746962B1 (ko) 온도 감응성 포스파젠계 고분자-생리 활성 물질 복합체,그의 제조방법 및 그의 용도
US20100098762A1 (en) Thermosensitive Pluronic Derivative Hydrogels With High Biodegradability And Biocompatibility For Tissue Regeneration And Preparation Method Thereof
JP7373702B2 (ja) ベータ－シクロデキストリンを通じたホスト－ゲスト相互作用により感温性ポリホスファゼンに結合した生理活性物質を含むヒドロゲル包接複合体及びその使用
KR20080110473A (ko) 화학적 가교 결합을 가지는 포스파젠계 고분자 하이드로젤,그의 제조방법 및 그의 용도
Kim et al. Temperature responsive chemical crosslinkable UV pretreated hydrogel for application to injectable tissue regeneration system via differentiations of encapsulated hMSCs
Hong et al. 3D hydrogel stem cell niche controlled by host-guest interaction affects stem cell fate and survival rate
Mao et al. Bio-orthogonal click reaction-enabled highly specific in situ cellularization of tissue engineering scaffolds
KR101040561B1 (ko) 효소촉발형 생체주입형 하이드로젤과 그 생의학적 용도
JP7401135B2 (ja) 可逆的ゾル－ゲル転移特性が変化された感温性ヒドロゲル組成物及びその用途
KR101232261B1 (ko) 폴리포스파젠계 생체 재료 조성물
Sinha et al. Synthesis and biocompatibility of a biodegradable and functionalizable thermo-sensitive hydrogel
KR101775479B1 (ko) 생리활성 온도 감응형 중합체 및 이의 3 차원 세포배양 및 조직공학으로의 용도
Gao Chitosan and Hyaluronic Acid-based Double Crosslinked Hydrogels for Stem Cell Delivery and Cartilage Regeneration
Li Development of Multi-functional Stem Cell Delivery Systems for Cardiac Therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211220

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20211220

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230117

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230417

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230725

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230824

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20230922

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230922

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20230922

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7373702

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150