JPWO2012137689A1 - Ｌ−システインの製造法 - Google Patents

Abstract

細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システイン等の化合物の製造法を提供する。Ｌ−システイン生産能を有し、且つ、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増強された腸内細菌科に属する細菌を、チオ硫酸を含有する培地で培養し、培地中に蓄積したＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を回収することによって、これらの化合物を製造する。

Description

本発明は、Ｌ−システイン又はその関連物質の製造法に関する。Ｌ−システイン及びその関連物質は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。

従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。

微生物のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、又はＬ−セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素の活性を増強することにより向上させることができる。例えば、Ｌ−システイン生産能を有する微生物として、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌（特許文献１）が知られている。また、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている（特許文献２〜４）。また、セリンによるフィードバック阻害が低減された３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡが知られており、エシェリヒア・コリのＬ−システイン生産に利用することが示唆されている（特許文献５、６）。

また、微生物のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン分解系を抑制することによっても向上させることができる。Ｌ−システイン分解系を抑制することによってＬ−システイン生産能が高められた微生物としては、シスタチオニン−β−リアーゼ（特許文献２）、トリプトファナーゼ（特許文献７）、またはＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼＢ（特許文献８）の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。

また、微生物のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン排出能を強化することによっても向上させることができる。例えば、Ｌ−システインの排出に関与するタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子（非特許文献１）、ｙｆｉＫ遺伝子（非特許文献９）、またはｙｅａＳ遺伝子（非特許文献１０）の発現を増強することにより、Ｌ−システイン生産能を高める技術が知られている。また、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ遺伝子座、ｅｍｒ遺伝子座、ａｃｒ遺伝子座、ｃｍｒ遺伝子座、ｍｅｘ遺伝子、ｂｍｒ遺伝子、若しくはｑａｃＡ遺伝子（特許文献１１）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ、若しくはｃｕｓＡ遺伝子（特許文献１２）の発現を増強することによりＬ−システイン生産能を高める技術が知られている。

Ｌ−システインは含硫アミノ酸であり、Ｌ−システインの生産には硫黄源の代謝が関与する。グルコースを炭素源とし、硫酸イオンまたはチオ硫酸イオンを硫黄源とした場合の、Ｌ−システインの生合成経路の概略および関与する遺伝子の例を図１に示す。

亜硫酸還元酵素は、硫酸イオン（Sulfate；ＳＯ_４ ^２−）を硫化物イオン（Sulfide；Ｓ^２−）に変換する硫酸還元経路（非特許文献２）において、最後の段階である亜硫酸イオン（Sulfite；ＳＯ_３ ^２−）を硫化物イオン（Sulfide；Ｓ^２−）に還元する反応を触媒する酵素である。硫酸還元経路により硫酸イオンから生成した硫化物イオンは、Ｏ−アセチルセリン（O-acetylserine；ＯＡＳ）と反応し、Ｌ−システインが生成する。すなわち、硫酸イオンを硫黄源として用いてＬ−システインを生産する場合、亜硫酸還元酵素はＬ−システイン生合成に関与する酵素の１つであると考えられる。エシェリヒア・コリの亜硫酸還元酵素は、ｃｙｓＪ遺伝子にコードされるαサブユニットおよびｃｙｓＩ遺伝子にコードされるβサブユニットを含むα_８β_４の複合体構造を有することが知られている。また、ｃｙｓＧ遺伝子は、亜硫酸還元酵素βサブユニットの補因子であるシロヘム（siroheme）の生合成酵素をコードする。ｃｙｓＪ遺伝子およびｃｙｓＩ遺伝子は同一オペロン内に存在するが、ｃｙｓＧ遺伝子はゲノム上の異なる箇所に存在する。ｃｙｓＪ遺伝子およびｃｙｓＩ遺伝子、並びに同遺伝子にコードされるタンパク質についての詳細は非特許文献３〜７に記載されている。また、ｃｙｓＧ遺伝子および同遺伝子にコードされるタンパク質についての詳細は非特許文献８〜１１に記載されている。

Ｌ−システイン生産におけるｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、またはｃｙｓＩ遺伝子の発現増強の有効性を示す直接的な知見は存在しないものの、Ｌ−システイン生産菌として、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が上昇したエシェリヒア・コリ（特許文献１３）が知られている。ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるタンパク質は、亜硫酸還元酵素をコードするｃｙｓＪ遺伝子およびｃｙｓＩ遺伝子を含むｃｙｓＪＩＨオペロンの発現を正に制御することから、当該エシェリヒア・コリにおいては、ｃｙｓＪ遺伝子およびｃｙｓＩ遺伝子の発現が増大している可能性がある。一方、ｃｙｓＧ遺伝子の発現は、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるタンパク質によっては制御されず、Ｌ−システイン生産においてｃｙｓＧ遺伝子の発現を増強した例は知られていない。

また、Ｌ−システイン以外のアミノ酸の生産において、ｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、またはｃｙｓＩ遺伝子の発現増強の有効性が示唆されている。例えば、Ｌ−スレオニンやＬ−リジンの生産（特許文献１４）、Ｌ−スレオニンの生産（特許文献１５）、およびＬ−メチオニンの生産（特許文献１６、１７）において、ｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、およびｃｙｓＩ遺伝子を含むｃｙｓ遺伝子群の発現の増強について言及されている。また、Ｌ−メチオニンの生産において、ｃｙｓＪ遺伝子およびｃｙｓＩ遺伝子を含むｃｙｓ遺伝子群の発現の増強について言及されている（特許文献１８〜２１）。また、Ｌ−メチオニンの生産において、ｃｙｓＪ遺伝子およびｃｙｓＩ遺伝子を含むｃｙｓＪＩＨオペロンの発現の増強について言及されている（特許文献２２）。また、ｃｙｓＧ遺伝子の発現を増強してＬ−アルギニン生産を高める技術が知られている（特許文献２３）。

一方、チオ硫酸の代謝は硫酸還元経路とは別の経路で行われており（図１）、亜硫酸還元酵素がチオ硫酸の代謝に関与するという知見はない。また、上記アミノ酸の生産に関する知見のいずれも、チオ硫酸を硫黄源として用いた際にｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、またはｃｙｓＩ遺伝子の発現増強が有効であることを示唆するものではない。以上の通り、チオ硫酸を硫黄源として用いた際のＬ−システイン等のアミノ酸生産と、ｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、またはｃｙｓＩ遺伝子との関連については知られていない。

特開２００２−２３３３８４号公報 特開平１１−１５５５７１号公報 米国特許出願公開第２００５０１１２７３１号 米国特許第６２１８１６８号 米国特許第５８５６１４８号 米国特許出願公開第２００５０００９１６２号 特開２００３−１６９６６８号公報 特開２００５−２４５３１１号公報 特開２００４−４９２３７号公報 欧州特許出願公開第１０１６７１０号 米国特許第５９７２６６３号 特開２００５−２８７３３３号公報 国際公開パンフレット第０１／２７３０７号 米国特許第７７５９０９４号 国際公開パンフレット第０３／００６６６６号 米国特許出願公開第２００９２９８１３６号 国際公開パンフレット第２００８／１２７２４０号 国際公開パンフレット第２００９／０４３３７２号 国際公開パンフレット第２００５／１０８５６１号 国際公開パンフレット第２００７／０７７０４１号 国際公開パンフレット第２００６／０８２２５４号 米国特許出願公開第２０１０００４７８７９号 米国特許出願公開第２００５００６９９９４号

Dassler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000) Frederich C., Neidhardら著 Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology 2nd edition Vol. 1. ASM Press 514-527 Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 264(27): 15796-15808 (1989) Li et al.; Gene 53(2-3): 227-234 (1987) Gaudu and Fontecave; European Journal of Biochemistry 226(2):459-463 (1994) Eschenbrenner et al.; Journal of Biological Chemistry 270 (35): 20550-20555 (1995) Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 264(26): 15726-15737 (1989) Peakman et al.; European Journal of Biochemistry 191(2): 315-323 (1990) Macdonald and Cole;Molecular and General Genetics 200(2): 328-334 (1985) Warren et al.; Biochemical Journal 265(3):725-729 (1990) Spencer et al.; FEBS Letters 335(1): 57-60 (1993)

本発明は、細菌のＬ−システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大するように細菌を改変することによって、チオ硫酸を硫黄源として用いる場合のＬ−システイン生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は以下のとおり例示できる。
[１]
Ｌ−システイン生産能を有し、且つ、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を、チオ硫酸を含有する培地で培養し、培地中に蓄積したＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を回収することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造方法。
[２]
前記亜硫酸還元に関与する遺伝子が、ｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、およびｃｙｓＩ遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、前記方法。
[３]
少なくともｃｙｓＧ遺伝子の発現が増大した、前記方法。
[４]
ｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、およびｃｙｓＩ遺伝子の発現が増大した、前記方法。
[５]
亜硫酸還元に関与する遺伝子のコピー数を高めること、又は、同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大した、前記方法。
[６]
前記細菌がパントエア属に属する細菌である、前記方法。
[７]
前記細菌がパントエア・アナナティスである、前記方法。
[８]
前記細菌がエシェリヒア属に属する細菌である、前記方法。
[９]
前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記方法。
[１０]
前記細菌が、さらに以下の性質（１）および（２）からなる群より選択される性質を有する、前記方法。
（１）Ｌ−システインの生合成系が強化されている。
（２）Ｌ−システインの排出系が強化されている。
[１１]
前記関連物質がＬ−シスチンまたはチアゾリジン誘導体である、前記方法。

グルコースを炭素源とし、硫酸イオンまたはチオ硫酸イオンを硫黄源とした場合の、Ｌ−システインの生合成経路の概略および関与する遺伝子の例を示す図。 野生型ｎｌｐＤ遺伝子プロモーターＰｎｌｐ０と下流に連結された遺伝子との連結部位の塩基配列（配列番号７３）および変異型ｎｌｐＤプロモーターＰｎｌｐ８と下流に連結された遺伝子との連結部位の塩基配列（配列番号７４）を示す図。 cysEX遺伝子断片作成の際の各プライマーの配置を示す図。 プラスミドpACYC-DESの構造を示す図。 P. ananatis SC17(0)におけるd0191遺伝子破壊の概略を示す図。

＜１＞本発明の方法に用いられる細菌
本発明の方法に用いられる細菌（以下、本発明の細菌ともいう）は、Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大するように改変された、腸内細菌科に属する細菌である。

本発明において、Ｌ−システインとは、フリー体のＬ−システインもしくはその塩、又はそれらの混合物であってもよい。塩としては、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。

本発明において、Ｌ−システイン生産能とは、細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。Ｌ−システイン生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地中または菌体内に蓄積することができる細菌を意味する。Ｌ−システイン生産能を有する細菌とは、好ましくは、０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．４ｇ／Ｌ以上の量のＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味する。

細菌が産生したＬ−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がＬ−シスチンに変換されることがある。また、Ｌ−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってＳ−スルホシステインが生成することがある（Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)）。さらに、細菌の細胞内で生成したＬ−システインは、細胞内に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある（特許第2992010号）。これらチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。

また、Ｌ−システインは、γ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン等の生合成の出発物質として用いられる。したがって、Ｌ−システイン生産能に加えて、これらＬ−システインを経由して生産される化合物を産生する能力を有する細菌を用いることによって、これらの化合物を製造することができる。

したがって、本発明において、Ｌ−システイン生産能とは、Ｌ−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体（例えばＳ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、ヘミチオケタール）、もしくは前記のようなＬ−システインを経由して生産される他の化合物（例えばγ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン）、又はこれらの混合物を培地中又は菌体内に蓄積する能力も含まれるものとする。なお、本発明において、Ｌ−シスチン、前記のようなＬ−システインの誘導体、及び前記のようなＬ−システインを経由して生産される他の化合物をまとめてＬ−システインの関連物質という。

Ｌ−システイン生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−システイン生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えＤＮＡ技術を利用して、Ｌ−システイン生産能を有するように改変したものであってもよい。

本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)属など、腸内細菌科に属する細菌であって、Ｌ−システインを生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌、又はクレブシエラ属細菌を用いることが望ましい。

エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）、エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ ４７０７６）等が挙げられる。

これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター属の代表的な株としては、エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ １２２８７株が挙げられる。また、具体的には、欧州特許出願公開９５２２２１号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。

パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。

パントエア・アナナティスとしては、具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、ＳＣ１７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０９１）が挙げられる。ＡＪ１３３５５株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。ＳＣ１７株は、ＡＪ１３３５５株から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第６，５９６，５１７号）。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。また、パントエア・アナナティスＳＣ１７株は、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所 郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０９１が付与されている。尚、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５株として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。

なお、特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067）。よって、エンテロバクター属に属する細菌には、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験等により、パントエア・アグロメランス又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスには、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、又はパントエア・スチューアルティに再分類されているものがある。また、エルビニア属に属する細菌には、パントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属、パントエア属、及びエルビニア属等のいずれに属するものであってもよい。

以下、腸内細菌科に属する細菌にＬ−システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のＬ−システイン生産能を増強する方法について述べる。

細菌にＬ−システイン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−システインの生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、１９８６年５月３０日初版発行、第７７−１００頁参照）。ここで、Ｌ−システイン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又はそれ以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−システイン生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又はそれ以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−システイン生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−システインのアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−システイン生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

以下、腸内細菌科に属する細菌にＬ−システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のＬ−システイン生産能を増強する方法、及びＬ−システイン生産能を有する細菌について具体的に例示する。

＜Ｌ−システイン生産能の付与又は増強、及びＬ−システイン生産菌＞
細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システインの生合成系を強化することにより付与又は増強することができる。「Ｌ−システインの生合成系を強化する」とは、例えば、Ｌ−システインの生合成に関与する酵素の活性を増強することをいう。Ｌ−システインの生合成に関与する酵素としては、Ｌ−システイン生合成経路の酵素、およびＬ−システイン生合成経路の基質となる化合物、例えばＬ−セリン、の生成に関与する酵素が挙げられ、具体的には、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）や３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）が挙げられる。酵素活性の増強は、後述するように、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増強することや、目的の酵素の比活性を増強することにより達成できる。セリンアセチルトランスフェラーゼは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｃｙｓＥ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。また、３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、セリンによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡ遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。

エシェリヒア・コリに由来する、フィードバック阻害耐性の変異型ＳＡＴとして具体的には、２５６位のメチオニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型ＳＡＴ（特開平11-155571）、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型ＳＡＴ（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する変異型ＳＡＴ（WO97/15673、米国特許第6218168号）、野生型ＳＡＴの８９〜９６位に相当するアミノ酸配列において１又は複数の変異を含み、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型ＳＡＴ（米国特許公開第20050112731(A1)）、９５位及び９６位のＶａｌ残基及びＡｓｐ残基が、各々Ａｒｇ残基及びＰｒｏ残基に置換された変異型ＳＡＴ（変異型遺伝子名cysE5、米国特許公開第20050112731(A1)）、及び、１６７位のスレオニン残基がアラニン残基に置換された変異型ＳＡＴ（米国特許第6218168号、米国特許公開第20050112731(A1)）等が知られている。

ＳＡＴをコードする遺伝子としては、エシェリヒア・コリの遺伝子に限られず、ＳＡＴ活性を有するタンパク質をコードするものであれば、使用することができる。例えば、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のＳＡＴアイソザイムが知られており、これをコードする遺伝子を用いることもできる（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）。

また、セリンによるフィードバック阻害耐性の変異型ＰＧＤをコードする遺伝子としては、serA5遺伝子（米国特許第６,１８０,３７３号）が知られている。

また、細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システイン排出系を強化することによっても向上させることができる。Ｌ−システイン排出系は、Ｌ−システインの排出に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することにより強化することができる。Ｌ−システインの排出に関与するタンパク質としては、ｙｄｅＤ遺伝子にコードされるＹｄｅＤタンパク質、ｙｆｉＫ遺伝子にコードされるＹｆｉＫタンパク質、ｙｅａＳ遺伝子にコードされるＹｅａＳタンパク質が挙げられる。よって、ｙｄｅＤ遺伝子（Dassler et al., Mol. Microbiol.36. 1101-1112 (2000)）、ｙｆｉＫ遺伝子（特開２００４−４９２３７）、又はｙｅａＳ遺伝子（欧州特許出願公開第１０１６７１０号明細書）の発現を増強することにより、Ｌ−システイン生産能を高めることができる。また、ＹｅａＳタンパク質の２８位のスレオニン残基、１３７位のフェニルアラニン残基、および／または１８８位のロイシン残基に変異を導入することによっても、Ｌ−システイン排出系が強化されＬ−システイン生産能を高めることができる（欧州特許出願公開第2218729号明細書）。具体的には、ＹｅａＳタンパク質の２８位のスレオニン残基をアスパラギンに置換する変異、１３７位のフェニルアラニン残基をセリン、グルタミン、アラニン、ヒスチジン、システイン、及びグリシンのいずれかに置換する変異、および／または１８８位のロイシン残基をグルタミンに置換する変異が好ましい（欧州特許出願公開第2218729号明細書）。

また、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質の中には、Ｌ−システインの排出に関与するものがある。よって、それらをコードする遺伝子の発現を増強することによりＬ−システイン排出系を強化することができる。例えば、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるｍａｒ遺伝子座、ｅｍｒ遺伝子座、ａｃｒ遺伝子座、ｃｍｒ遺伝子座、ｍｅｘ遺伝子、ｂｍｒ遺伝子、若しくはｑａｃＡ遺伝子（米国特許第５９７２６６３号）、又はｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ、若しくはｃｕｓＡ遺伝子（特開２００５−２８７３３３号公報）の発現を上昇させることにより、Ｌ−システイン生産能を高めることができる。

また、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系を増強することによっても、Ｌ−システイン生産能を向上させることができる。硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群は、ｃｙｓＰＴＷＡＭ遺伝子クラスターによってコードされている（特開２００５−１３７３６９号公報、ＥＰ１５２８１０８号明細書）。

また、細菌のＬ−システイン生産能は、Ｌ−システインの分解に寄与するシステインデスルフヒドラーゼの活性を低下させることにより向上させることができる。エシェリヒア・コリでは、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質として、ｍｅｔＣ遺伝子にコードされるシスタチオニン−β−リアーゼ（特開平１１−１５５５７１号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)）、ｔｎａＡ遺伝子にコードされるトリプトファナーゼ（特開２００３−１６９６６８、Austin Newtonet. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218）、ｃｙｓＭ遺伝子にコードされるＯ−アセチルセリン スルフヒドリラーゼＢ（特開２００５−２４５３１１）、及び、ｍａｌＹ遺伝子にコードされるＭａｌＹ（特開２００５−２４５３１１）が知られている。また、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスのｄ０１９１遺伝子が知られている（特開２００９−２３２８４４）。酵素活性の低下は、後述する手法により達成できる。

Ｌ−システイン生産菌は、上記のようなＬ−システイン生産能が向上する性質を単独で有していてもよく、任意の組み合わせで有していてもよい。例えば、Ｌ−システイン生産菌は、Ｌ−システインの生合成系およびＬ−システインの排出系のいずれかが強化されているのが好ましく、その両方が強化されているのがより好ましい。

Ｌ−システイン生産菌としては、具体的には、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコードする複数種のｃｙｓＥアレルで形質転換されたエシェリヒア・コリ ＪＭ１５株（米国特許第６，２１８，１６８号）、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（米国特許第５，９７２，６６３号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ（特開平１１−１５５５７１号公報）、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株（ＷＯ０１／２７３０７）などのエシェリヒア属に属する株、ｙｄｅＤ遺伝子、変異型ｃｙｓＥ遺伝子および変異型ｓｅｒＡ５遺伝子を保持するプラスミドｐＡＣＹＣ−ＤＥＳ（特開２００５−１３７３６９（ＵＳ２００５０１２４０４９（Ａ１）、ＥＰ１５２８１０８（Ａ１）））を有するエシェリヒア・コリ等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳは、前記３遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４に挿入することによって得られたプラスミドであり、各遺伝子はＰｏｍｐＡプロモーターにより制御される。

Ｌ−システインを出発物質として生合成されるγ−グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、及びＳ−アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。

例えば、γ−グルタミルシステイン生産能は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性の増強及び／又はグルタチオン合成酵素活性の低下によって、増強することができる。また、グルタチオン生産能はγ−グルタミルシステイン合成酵素活性及び／又はグルタチオン合成酵素活性の増強によって、付与又は増強することができる。また、グルタチオンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素を用いることでもγ−グルタミルシステインやグルタチオンの生産能を増強させることができる。グルタチオンの生産についてはＬｉらの総説（Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 233-242）に詳しく記載されている。

Ｌ−メチオニン生産能は、Ｌ−スレオニン要求性またはノルロイシン耐性を付与することによって、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、Ｌ−スレオニンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペロン（thrABC）として存在し、例えば、thrBC部分を欠失させることによってＬ−ホモセリン以降の生合成能を失ったＬ−スレオニン要求株を取得することができる。ノルロイシン耐性株では、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化され、Ｌ−メチオニン生産能が付与又は増強される。E. coliにおいては、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼはmetK遺伝子にコードされている。また、Ｌ−メチオニン生産能は、メチオニンリプレッサーの欠損、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ−シンテース、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼIIなどのＬ−メチオニン生合成に関与する酵素の活性の増強によっても、付与又は増強することができる（特開2000-139471号）。E. coliにおいては、メチオニンリプレッサーはmetJ遺伝子に、ホモセリントランスサクシニラーゼはmetA遺伝子に、シスタチオニンγ−シンテースはmetB遺伝子に、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼIIはmetL遺伝子にそれぞれコードされている。また、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを用いることでもＬ−メチオニンの生産能を付与又は増強することができる（特開2000-139471号、US20090029424）。なお、Ｌ−メチオニンはＬ−システインを中間体として生合成されるため、Ｌ−システインの生産能の向上によりＬ−メチオニンの生産能も向上させることができる（特開2000-139471号、US20080311632）。よって、Ｌ−メチオニン生産能を付与又は増強するためには、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強させることも有効である。

Ｌ−メチオニン生産菌としては、具体的には、AJ11539 (NRRL B-12399)、AJ11540 (NRRL B-12400)、AJ11541 (NRRL B-12401)、AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有する218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) (ロシア特許第2215782号)等のE. coli株が挙げられる。

また、Ｌ−メチオニン生産菌としては、E. coli W3110由来のAJ13425 (FERM P-16808)（特開2000-139471号）を用いることもできる。AJ13425は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたＬ−スレオニン要求株である。AJ13425は、平成１０年５月１４日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、受託番号FERM P-16808が付与されている。

シスタチオニン、ホモシステインはＬ−メチオニン生合成経路の中間体であるため、これら物質の生産能を増強するためには、上記のＬ−メチオニンの生産能を増強させる方法を一部利用することが有効である。シスタチオニン生産能を増強させる具体的方法として、メチオニン要求性変異株を用いる方法（特願２００３−０１０６５４）や、発酵培地にシステイン（またはその生合成原料）及び／又はホモセリン（またはその生合成原料）を添加する方法（特開２００５−１６８４２２）が知られている。ホモシステインはシスタチオニンを前駆体とするため、ホモシステイン生産能を増強するためには、シスタチオニン生産能を増強させる上記方法も有効である。

また、Ｌ−メチオニンを出発物質として生合成されるＳ−アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン生産能は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を強化することや（ＥＰ０６４７７１２、ＥＰ１４５７５６９）、ｍｄｆＡ遺伝子にコードされる排出因子ＭｄｆＡを強化すること（ＵＳ７４１０７８９）で付与又は増強することができる。

以下、ＳＡＴ等の酵素活性を増大させる手法、およびシステインデスルフヒドラーゼ等の酵素活性を低下させる手法について例示する。

＜酵素活性を増大させる手法＞
本発明において、「酵素活性が増大する」とは、目的の酵素活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。酵素活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に増大する。また、「酵素活性が増大する」とは、もともと目的の酵素活性を有する菌株において同酵素活性を増大させることだけでなく、もともと目的の酵素活性が存在しない菌株に同酵素活性を付与することを含む。また、結果として目的の酵素活性が増大する限り、細菌が本来有する同酵素を弱化または欠損させた上で、好適な酵素を導入してもよい。

酵素活性が増大するような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。なお、本発明において、「遺伝子の発現の増強」は「遺伝子の発現の増大」と同義である。

遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。

遺伝子のコピー数の増加は、染色体に目的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復ＤＮＡ配列（repetitive DNA）や、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピート等が挙げられるが、これらに限定されない。また、染色体上に存在する目的の酵素をコードする遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、染色体上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。このような遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはインテグレーションベクターを用いて達成することが出来る。また、米国特許第５，５９５，８８９号に開示されるように、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させることも可能である。トランスポゾンとしては、例えば、Ｍｕ、Ｔｎ１０、Ｔｎ５が利用できる。染色体に遺伝子が導入されたことは、遺伝子の一部をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認できる。

また、遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主細菌に導入することによっても達成できる。例えば、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクターと連結して目的遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主細菌を形質転換することにより、目的遺伝子のコピー数を増加させることができる。ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＳＴＶ２９（いずれもタカラバイオ社より入手可）、ｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）、ｐＰＲＯＫ系ベクター（クロンテック社）、ｐＫＫ２３３‐２（クロンテック社製）、ｐＥＴ系ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０等が挙げられる。

また、遺伝子の発現の増強は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびＰＬプロモーター等を用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。

また、遺伝子の発現の増強は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のＳＤ配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」または「発現調節配列」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（ＷＯ２００５／０１０１７５）により行うことができる。

また、遺伝子の発現の増強は、目的の遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、目的の遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。レギュレーターとしては、例えばＬｙｓＲファミリーなどに属するものが挙げられ、データベースEcoCyc（http://ecocyc.org/）等を利用して見出すことができる。目的の遺伝子の転写量の増大や目的のタンパク質の量の増大を指標として、レギュレーターの改変を行えばよい。

上記のような遺伝子の発現を増強させる手法は、単独で用いてもよく、任意に組み合わせて用いてもよい。

また、酵素活性が増大するような改変は、例えば、目的の酵素の比活性を増強することによっても達成できる。比活性が増強された酵素は、例えば、種々の細菌を探索し取得することができる。また、在来の酵素に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。

形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２株について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C. H.,Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)）も応用できる。

目的の酵素活性が増大したことは、同酵素活性を測定することにより確認できる。

目的の遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。

目的のタンパク質の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。

＜酵素活性を低下させる手法＞
本発明において、「酵素の活性が低下する」とは、目的の酵素活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。酵素活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば非改変株と比較して７５％以下、５０％以下、２５％以下、又は１０％以下に低下していることが好ましく、活性が完全に消失しているのが特に好ましい。なお、酵素によっては、活性を完全に消失させないのが好ましい場合もある。

酵素活性が低下するような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやＳＤ配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、アンチセンスＲＮＡを発現させることによっても達成できる。

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部を欠失させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。酵素活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性等のマーカー遺伝子やＬ−システイン生産に有用な遺伝子が挙げられる。

染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。

また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、紫外線照射、または、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。

酵素活性が低下したことは、同酵素活性を測定することにより確認できる。システインデスルフヒドラーゼ活性は、特開２００２−２３３３８４公報に記載された手法により測定することができる。

目的の遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。

目的のタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。

＜亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現の増強＞
本発明の細菌は、亜硫酸還元に関与する１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されている。本発明の細菌は、上述したようなＬ−システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大するように改変を行った後に、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強することによっても得ることができる。

亜硫酸還元に関与する遺伝子としては、亜硫酸還元酵素をコードする遺伝子が挙げられる。本発明において、亜硫酸還元酵素とは、亜硫酸還元活性を有するタンパク質をいう。本発明において、亜硫酸還元活性とは、亜硫酸イオン（Sulfite；ＳＯ_３ ^２−）を硫化物イオン（Sulfide；Ｓ^２−）に還元する反応を触媒する活性をいう。亜硫酸還元酵素をコードする遺伝子としては、ｃｙｓＪ遺伝子およびｃｙｓＩ遺伝子が挙げられる。なお、エシェリヒア・コリの亜硫酸還元酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性の亜硫酸還元酵素（EC 1.8.1.2）であり、ｃｙｓＪ遺伝子にコードされるαサブユニットおよびｃｙｓＩ遺伝子にコードされるβサブユニットを含むα_８β_４の複合体構造を有する。よって、亜硫酸還元活性を有するとは、遺伝子にコードされるタンパク質が単独で亜硫酸還元活性を示す場合だけでなく、当該タンパク質がサブユニットして組み込まれた酵素複合体が亜硫酸還元活性を示す場合を含む。

また、亜硫酸還元に関与する遺伝子としては、亜硫酸還元酵素の補因子の生合成に関与する遺伝子が挙げられる。亜硫酸還元酵素の補因子としては、補欠分子族として用いられるシロヘム（siroheme）や、補酵素として用いられるＮＡＤＰＨやフラビンが挙げられる。これらの中では、シロヘムが好ましい。シロヘムの生合成に関与する遺伝子としては、シロヘム合成酵素をコードするｃｙｓＧ遺伝子が挙げられる。ｃｙｓＧ遺伝子にコードされるタンパク質は、中間体であるウロポルフィリノーゲンIII（Uroporphyrinogen III；Uro’gen III）からシロヘムへの変換を触媒する活性を有する。

なお、ｃｙｓＪ遺伝子、ｃｙｓＩ遺伝子、およびｃｙｓＧ遺伝子がコードするタンパク質をそれぞれＣｙｓＪタンパク質、ＣｙｓＩタンパク質、およびＣｙｓＧタンパク質ともいう。

エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｃｙｓＪ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2888121〜2889920位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｃｙｓＪ遺伝子は、ECK2759、JW2734と同義である。また、エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のＣｙｓＪタンパク質は、GenBank accession NP_417244 (version NP_417244.1 GI:16130671、locus_tag=”b2764”)として登録されている。

また、エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｃｙｓＩ遺伝子は、同ゲノム配列中、2886409〜2888121位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｃｙｓＩ遺伝子は、ECK2758、JW2733と同義である。また、エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のＣｙｓＩタンパク質は、GenBank accession NP_417243 (version NP_417243.1 GI:16130670、locus_tag=”b2763”)として登録されている。

また、エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｃｙｓＧ遺伝子は、同ゲノム配列中、3495850〜3497223位の配列に相当する。エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のｃｙｓＧ遺伝子は、ECK3356、JW3331と同義である。また、エシェリヒア・コリ Ｋ１２ ＭＧ１６５５株のＣｙｓＧタンパク質は、GenBank accession NP_417827 (version NP_417827.1 GI:16131246、locus_tag=”b3368”)として登録されている。

前記ＭＧ１６５５株のｃｙｓＪ遺伝子、ｃｙｓＩ遺伝子、およびｃｙｓＧ遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号６１、６５、６９に示す。また、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６２、６６、７０に示す。また、パントエア・アナナティスＳＣ１７株のｃｙｓＪ遺伝子、ｃｙｓＩ遺伝子、およびｃｙｓＧ遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号６３、６７、７１に示す。また、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６４、６８、７２に示す。

細菌が属する属、種、又は菌株によって、ｃｙｓＪ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、発現が増大するｃｙｓＪ遺伝子は、亜硫酸還元活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号６１または６３に示す塩基配列のバリアントであってもよい。ｃｙｓＪ遺伝子のバリアントは、例えば配列番号６１または６３の塩基配列を参考にして、ＢＬＡＳＴ等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、ｃｙｓＪ遺伝子のバリアントは、同遺伝子のホモログ、例えば腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、例えば配列番号６１または６３の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで増幅可能な遺伝子を含む。

ｃｙｓＪ遺伝子は、亜硫酸還元活性を有するタンパク質をコードする限り、上記のようなＣｙｓＪタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号６２または６４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記のようなＣｙｓＪタンパク質のアミノ酸配列全体、例えば配列番号６２または６４に示すアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、亜硫酸還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。

また、ｃｙｓＪ遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば配列番号６１または６３に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、亜硫酸還元活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

上述の通り、プローブは、遺伝子の一部に対する相補配列であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。

同様に、細菌が属する属、種、又は菌株によって、ｃｙｓＩ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、発現が増大するｃｙｓＩ遺伝子は、亜硫酸還元活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号６５または６７に示す塩基配列のバリアントであってもよい。バリアントは、上述したｃｙｓＪ遺伝子およびＣｙｓＪタンパク質についてのバリアントの記載に準ずる。

同様に、細菌が属する属、種、又は菌株によって、ｃｙｓＧ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、発現が増大するｃｙｓＧ遺伝子は、ウロポルフィリノーゲンIII（Uro’gen III）からシロヘムへの変換を触媒する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号６９または７１に示す塩基配列のバリアントであってもよい。バリアントは、上述したｃｙｓＪ遺伝子およびＣｙｓＪタンパク質についてのバリアントの記載に準ずる。

なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼや３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ等の酵素、およびＹｄｅＤタンパク質等のトランスポーターを含む任意のタンパク質、並びにそれらをコードする遺伝子にも同様に適用される。

「亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大する」とは、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現量が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現量は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に増大する。また、「亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大する」とは、もともと亜硫酸還元に関与する遺伝子が発現している菌株において発現量を増大させることだけでなく、もともと亜硫酸還元に関与する遺伝子が発現していない菌株において、亜硫酸還元に関与する遺伝子を発現させることを含む。すなわち、例えば、亜硫酸還元に関与する遺伝子を保持しない菌株に亜硫酸還元に関与する遺伝子を導入し、亜硫酸還元に関与する遺伝子を発現させることを含む。また、結果として亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大する限り、細菌が本来有する亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現を弱化または欠損させた上で、好適な亜硫酸還元酵素を導入してもよい。

本発明の細菌は、少なくともシロヘム合成酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変されているのが好ましい。また、本発明の細菌は、シロヘム合成酵素をコードする遺伝子の発現が増大し、且つ、亜硫酸還元酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変されているのが好ましい。

亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大するような改変は、上述の＜酵素活性を増大させる手法＞において例示した遺伝子の発現を増強する手法により達成できる。

なお、上述したように、遺伝子の発現が増大するような改変は、目的の遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅することによっても達成される。亜硫酸還元酵素をコードする遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターとしては、ｃｙｓＢ遺伝子にコードされるタンパク質（ＣｙｓＢ）が挙げられる。ＣｙｓＢは、亜硫酸還元酵素をコードするｃｙｓＪ遺伝子およびｃｙｓＩ遺伝子を含むｃｙｓＪＩＨオペロンの発現を正に制御することが知られており、よって、ｃｙｓＢ遺伝子の発現を増強することによっても、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現を増強することができる。

遺伝子の発現が増大したことは、例えば、上述したように、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子の転写量が増大したことを確認することで、あるいは、ウェスタンブロットによりタンパク質の量が増大したことを確認することで、確認することができる。また、亜硫酸還元に関与する遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定することにより、遺伝子の発現が増大したことを確認してもよい。亜硫酸還元酵素の活性は、公知の手法（Covbs J. et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 18604-18609.）により測定することができる。また、シロヘム合成酵素の活性は、公知の手法（Spencer JB. et al., FEBS Lett. 1993 Nov 29;335(1):57-60.）により測定することができる。

＜２＞本発明のＬ−システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を、チオ硫酸を含有する培地中で培養し、該培地からＬ−システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。Ｌ−システインの関連物質としては、先述したＬ−シスチン、Ｓ−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に対応するヘミチオケタール、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン等が挙げられる。

培地としては、チオ硫酸を含有する限り、炭素源、窒素源、硫黄源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。

窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。

硫黄源としては、チオ硫酸のみが培地に含有されていてもよく、チオ硫酸に加えてそれ以外の硫黄化合物が培地に含有されていてもよい。チオ硫酸以外の硫黄化合物としては、硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、硫化物等の無機硫黄化合物が挙げられる。培地に含まれるチオ硫酸とそれ以外の硫黄化合物の重量比は、特に制限されないが、例えば、通常、チオ硫酸：それ以外の硫黄源＝５：９５〜１００：０であり、２０：８０〜１００：０であるのが好ましく、５０：５０〜１００：０であるのがより好ましく、８０：２０〜１００：０であるのが特に好ましい。

培地におけるチオ硫酸の含有量は、例えば、通常０．１ｇ／Ｌ以上であり、０．３ｇ／Ｌ以上であるのが好ましい。チオ硫酸の含有量の上限は特に制限されないが、例えば、１００ｇ／Ｌ以下であってもよく、１０ｇ／Ｌ以下であってもよい。チオ硫酸は、フリー体であってもよく、チオ硫酸塩であってもよく、それらの任意の混合物であってもよい。チオ硫酸塩としては、特に制限されず、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。

チオ硫酸は、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間においてのみ培地に含有されていてもよい。例えば、本発明の方法が、Ｌ−システイン生産菌を増殖させる段階と、Ｌ−システインを生産蓄積させる段階を含む場合、少なくともＬ−システインを生産蓄積させる段階においてチオ硫酸を培地に含有させればよく、Ｌ−システイン生産菌を増殖させる段階においては、チオ硫酸を培地に含有させてもよく、含有させなくてもよい。また、Ｌ−システインを生産蓄積させる段階においても、チオ硫酸は、その全期間において培地に含有されていてもよく、その一部の期間においてのみ培地に含有されていてもよい。例えば、チオ硫酸の含有量は、Ｌ−システインを生産蓄積させる段階の全期間において前記の範囲である必要はなく、同段階の初期に含有量が前記の範囲となるようにチオ硫酸を培地に含有させ、培養時間の経過に伴いチオ硫酸含有量が減少してもよい。また、チオ硫酸を連続的あるいは間欠的に追加添加してもよい。なお、チオ硫酸以外の培地成分についても、培養期間中に濃度が変動してもよく、追加添加されてもよい。

有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

培養は好気的条件下で３０〜９０時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。

培養物からのＬ−システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物の採取は、イオン交換樹脂法（Nagai,H.et al.:Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646)、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。

また、本発明において採取されるＬ−システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物は、目的とする化合物以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物等を含んでいてもよい。

上記のようにして得られるＬ−システインは、Ｌ−システイン誘導体の製造に用いることができる。システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が挙げられる。

また、Ｌ−システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とＬ−システインとの間の反応平衡をＬ−システイン側に移動させることによって、Ｌ−システインを製造することができる。また、培地にＳ−スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスレイトール等の還元剤を用いて還元することによってＬ−システインに変換することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例において、システインはＬ−システインを意味する。

（実施例１）cysG遺伝子またはcysGJI遺伝子を過剰発現するE. coliによるチオ硫酸を硫黄源としたシステイン生産
（１）亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現プラスミドの構築
亜硫酸還元に関与する遺伝子として、P. ananatis SC17株のcysG遺伝子、P. ananatis SC17株のcysGJI遺伝子、E. coli MG1655株のcysG遺伝子、およびE. coli MG1655株のcysGJI遺伝子を用いた。これらの遺伝子をそれぞれ発現ベクターにクローニングし、それぞれの遺伝子の発現プラスミドを構築した。手順を（１−１）〜（１−７）に示す。

（１−１）発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、pMIV-5JS（特開2008-99668）を基に構築したpMIV-Pnlp23-terを用いた。当該ベクターは、強力なプロモーターであるnlp23プロモーター（Pnlp23）とrrnBターミネーターを有し、Pnlp23とrrnBターミネーターの間にはSalIとXbaI部位が存在する。目的の遺伝子をSalI（もしくはXhoI）とXbaIをデザインしたプライマーを用いて増幅し、Pnlp23とrrnBターミネーターの間に挿入することで、目的の遺伝子の発現プラスミドを構築することができる。なお、「Pnlp23」は、E.coli K12株由来の野生型nlpD遺伝子のプロモーターである「Pnlp0」を基に、発現強度を調節するために構築された変異型プロモーターである。

また、発現ベクターとしては、pMIV-5JS（特開2008-99668）を基に構築したpMIV-Pnlp8-YeaS7を用いた。当該ベクターは、強力なプロモーターであるnlp8プロモーター（Pnlp8）とrrnBターミネーターを有し、さらに、E.coli K12株由来のyeaS遺伝子がSalIとXbaI部位を介してPnlp8とrrnBターミネーターの間にクローニングされている。目的の遺伝子をSalI（もしくはXhoI）とXbaIをデザインしたプライマーを用いて増幅し、当該ベクターに組み込むことで、当該ベクター上のyeaS遺伝子断片が目的の遺伝子断片に置換された発現プラスミドを構築することができる。なお、「Pnlp8」は、E.coli K12株由来の野生型nlpD遺伝子のプロモーターである「Pnlp0」を基に、発現強度を調節するために構築された変異型プロモーターである。

これらの発現ベクターの構築の詳細を以下に示す。

まず、E. coli MG1655株の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーP1（agctgagtcgacccccagga aaaattggttaataac：配列番号１３）、及びプライマーP2（agctgagcatgcttccaactgcgctaatgacgc：配列番号１４）をプライマーとして用いたPCRによって、nlpD遺伝子のプロモーター領域（以下、野生型nlpD遺伝子プロモーターを「Pnlp0」と記載する。）約300bpを含むDNA断片を取得した。これらプライマーの5'末端には、制限酵素SalI及びPaeIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。得られた断片をSalI及びPaeIで処理し、プラスミドpMIV-5JS（特開2008-99668）のSalI−PaeIサイトに挿入し、プラスミドpMIV-Pnlp0を取得した。このプラスミドに挿入されたPnlp0プロモーターを含むPaeI-SalI断片の塩基配列は配列番号１に示したとおりである。

次に、MG1655株の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーP3（agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc：配列番号１５）、及びプライマーP4（agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc：配列番号１６）をプライマーとして用いたPCRによって、rrnB遺伝子のターミネーター領域約300bpを含むDNA断片を取得した。これらプライマーの5'末端には、制限酵素XbaI及びBamHIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、59℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。得られた断片をXbaI及びBamHIで処理し、pMIV-Pnlp0のXbaI−BamHIサイトに挿入し、プラスミドpMIV-Pnlp0-terを取得した。

続いてMG1655株の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーP5（agctgagtcg acgtgttcgc tgaatacggg gt：配列番号１７）、及びプライマーP6（agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc：配列番号１８）をプライマーとして用いたPCRによって、yeaS遺伝子を含む約700bpのDNA断片を取得した。これらプライマーの5'末端には、制限酵素SalI及びXbaIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。得られた断片をSalI及びXbaIで処理し、pMIV-Pnlp0-terのSalI−XbaIサイトに挿入しプラスミドpMIV-Pnlp0-YeaS3を取得した。こうして、pMIV-5JSベクター上に、nlpDプロモーター、yeaS遺伝子、及びrrnBターミネーターが、この順に繋がったyeaSの発現ユニットが構築された。

nlpDプロモーターの-10領域を改変することでより強力なプロモーターとするため、以下の手法で-10領域のランダム化を行った。nlpDプロモーター領域（図２）には、プロモーターとして機能すると推定される２箇所の領域が存在し、それぞれ図中ではpnlp1、pnlp2と示してある。プラスミドpMIV-Pnlp0をテンプレートとして、プライマーP1及びプライマーP7（atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatna ngtcactgg（“n”はa,t,g,cのいずれでも良いことを意味する）：配列番号１９）を用いたPCRによって、nlpDプロモーターの３'末端側に含まれる-10領域(-10(Pnlp1)；図２)をランダム化したDNA断片を取得した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。

同様に、プラスミドpMIV-Pnlp0をテンプレートとして、プライマーP2及びプライマーP8（tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg（“n”はa,t,g,cのいずれでも良いことを意味する）：配列番号２０）をプライマーとして用いたPCRによって、nlpDプロモーターの５'末端側に含まれる-10領域（-10(Pnlp2)；図２）をランダム化したDNA断片を取得した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。

得られた３'末端側と５'末端側の断片を、プライマーP7とP8にデザインされたBglIIサイトによってつなぎ合わせ、2箇所の-10領域がランダム化されたnlpDプロモーター全長を含む断片を構築した。この断片をテンプレートとして、プライマーP1及びプライマーP2をプライマーとして用いたPCRによって、変異型nlpDプロモーター全長を含むDNA断片を取得した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を12サイクル、最後に72℃ 5分。

得られた変異型Pnlpを含むDNA断片を、プライマーの5'末端にデザインされている制限酵素SalI及びPaeIで処理し、同じくSalI及びPaeIで処理したプラスミドpMIV-Pnlp0-YeaS3に挿入することで、プラスミド上の野生型nlpDプロモーター部位（Pnlp0）を変異型Pnlpと置き換えた。その中から図２に示すプロモーター配列（Pnlp8）を持つものを選び、pMIV-Pnlp8-YeaS7とした。このプラスミドに挿入されたPnlp8プロモーターのPaeI−SalI断片の塩基配列は配列番号２１に示したとおりである。

同様に、変異型Pnlpを含むDNA断片をSalI及びPaeIで処理したプラスミドpMIV-Pnlp0-terに挿入することでプラスミド上のnlpDプロモーター部位（Pnlp0の部分）を変異型Pnlpと置き換えた。その中の一つをpMIV-Pnlp23-terとした。このプラスミドに挿入されたPnlp23プロモーターのPaeI−SalI断片の塩基配列は配列番号２に示したとおりである。

（１−２）E. coli MG1655株のcysG遺伝子の過剰発現プラスミドの構築
E. coli MG1655株（ATCC No.47076）の染色体DNAを鋳型として、プライマーSalI-cysG（Ec）Fw（ACGCGTCGACATGGATCATTTGCCTATATT：配列番号８）、プライマーXbaI-cysG（Ec）Rv（GCTCTAGATTAATGGTTGGAGAACCAGTTC：配列番号９）をプライマーとして用いたPCRによって、cysG遺伝子断片を増幅した。これらのプライマーの5'末端には制限酵素SalIとXbaIのサイトがデザインされている。PCRは、PrimeStarポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、（94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温）のPCRサイクルで行った。得られた断片をSalI及びXbaIで処理し、同制限酵素で処理したpMIV-Pnlp23-terに挿入し、E. coli MG1655株のcysG遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp23-cysG（Ec）を取得した。

（１−３）E. coli MG1655株のcysJI遺伝子のクローニング
E. coli MG1655株の染色体DNAを鋳型として、プライマーSalI-cysJ（Ec）Fw（ACGCGTCGACATGACGACACAGGTCCCACC：配列番号１０）、プライマーXbaI-cysI（Ec）Rv（GCTCTAGATTAATCCCACAAATCACGCGCC：配列番号１１）をプライマーとして用いたPCRによって、cysJI遺伝子断片を増幅した。これらのプライマーの5'末端には制限酵素SalIとXbaIのサイトがデザインされている。PCRは、PrimeStarポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、（94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温）のPCRサイクルで行った。得られた断片をSalI及びXbaIで処理し、同制限酵素で処理したMIV-Pnlp23-terに挿入し、E. coli MG1655株のcysJI遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp23-cysJI（Ec）を取得した。

（１−４）E. coli MG1655株のcysG遺伝子およびcysJI遺伝子の共発現プラスミドの構築
MG1655株の染色体DNAを鋳型として、プライマーSalI-cysG（Ec）Fw（配列番号８）、cysG-JI（Ec)Rv(CAACGCGGAAGGTGGGACCTGTGTCGTCATGCGTCGTTATGTTCCAGTTTAATGGTTGGAGAACCAGTTCAGTTTATC：配列番号１２）をプライマーとして用いてPCRを行った。PCRは、PrimeStarポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、（94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温）のPCRサイクルで行った。このPCRにより、cysG遺伝子の下流にcysJ遺伝子の開始コドンを含む18 bpの配列が付加された遺伝子断片を取得した。得られた断片より塩、ポリメラーゼ、およびプライマーを除去したものを次のPCRのプライマーとして用いた。

（１−３）で構築したpMIV-Pnlp23-cysJI（Ec）のプラスミドDNAを鋳型として、上述の遺伝子断片とプライマーXbaI-cysI（Ec）Rv（配列番号１１）をプライマーとして用いてPCRを行った。PCRは、PrimeStar GXLポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、（98℃ 10秒の後、98℃ 10秒、58℃ 15秒、68℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温）のPCRサイクルで行った。このPCRによりcysG遺伝子配列の下流にcysJI遺伝子配列が接続された遺伝子断片を取得した。プライマーの5'末端には、SalIとXbaIサイトがそれぞれデザインされている。得られた断片をSalI及びXbaIで処理し、同制限酵素で処理したpMIV-Pnlp23-terに挿入し、E. coli MG1655株のcysGJI遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp23-cysGJI（Ec）を取得した。

（１−５）P. ananatis SC17株のcysG遺伝子の過剰発現プラスミドの構築
P. ananatis SC17株（FERM BP-11091）の染色体DNAを鋳型として、プライマーCysG Fw（XhoI）（ACGCCTCGAGATGGATTATTTGCCTCTTTT：配列番号3）、プライマーCysG Rv（XbaI）（GCTCTAGATCAAGCCAGATTGACAACGG：配列番号4）をプライマーとして用いたPCRによって、cysG遺伝子断片を増幅した。PCRは、PrimeStarポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、PCRサイクル（94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温）のPCRサイクルで行った。P. ananatisの染色体DNA上のcysG遺伝子の開始コドンはGTGであるが、プライマーの開始コドン付着部の配列をGTGからATGに換えることにより、PCRによって得られたDNA断片に含まれるcysG遺伝子の開始コドンをATGに改変した。また、これらのプライマーの5'末端には、XhoIとXbaIサイトがそれぞれデザインされている。P. ananatisのcysG遺伝子のORF内には、SalIの制限酵素サイトが存在するため、SalIの代用としてXhoIを用いた。得られた断片をXhoI及びXbaIで処理し、SalI及びXbaIで処理したpMIV-Pnlp8-YeaS7に挿入し、P. ananatis SC17株のcysG遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp8-cysG（Pa）を取得した。pMIV-Pnlp8-cysG（Pa）は、pMIV-Pnlp8-YeaS7上のyeaS遺伝子断片がP. ananatis SC17株のcysG遺伝子断片に置換された構造を有する。

同様に、得られた断片をXhoI及びXbaIで処理し、SalI及びXbaIで処理したpMIV-Pnlp23-terに挿入し、P. ananatis SC17株のcysG遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp23-cysG（Pa）を取得した。

（１−６）P. ananatis SC17株のcysJI遺伝子のクローニング
P. ananatis SC17株の染色体DNAを鋳型として、プライマーCysJ Fw（SalI）（ACGCGTCGACATGACGACTCAGGCACCAGG：配列番号５）、プライマーCysI Rv（XbaI）（GCTCTAGATCATTTTGCCTCCTGCCAGA：配列番号６）をプライマーとして用いたPCRによって、cysJI遺伝子断片を増幅した。これらのプライマーの5'末端には制限酵素SalIとXbaIのサイトがデザインされている。PCRは、PrimeStarポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、（94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温）のPCRサイクルで行った。得られた断片をSalI及びXbaIで処理し、同制限酵素で処理したpMIV-Pnlp23-terに挿入し、P. ananatis SC17株のcysJI遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp23-cysJI（Pa）を取得した。

（１−７）P. ananatis SC17株のcysG遺伝子およびcysJI遺伝子の共発現プラスミドの構築
P. ananatis SC17株の染色体DNAを鋳型として、プライマーCysG Fw（XhoI）（配列番号３）、プライマーCysG-JI Rv（CTGGTGCCTGAGTCGTCATCGTTTTTCCTCTCAAGCCAGATTGACAACGGCGGACTCGCG：配列番号７）をプライマーとして用いてPCRを行った。PCRは、PrimeStarポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、（94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温）のPCRサイクルで行った。このPCRにより、cysG遺伝子の下流にcysJ遺伝子の開始コドンを含む11 bpの配列が付加された遺伝子断片を取得した。得られた断片より塩、ポリメラーゼ、およびプライマーを除去したものを次のPCRのプライマーとして用いた。

（１−６）で構築したpMIV-Pnlp23-cysJI（Pa）のプラスミドDNAを鋳型として、上述の遺伝子断片とプライマーCysI Rv（XbaI）（配列番号６）をプライマーとして用いてPCRを行った。PCRは、PrimeStar GXLポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、（98℃ 10秒の後、98℃ 10秒、58℃ 15秒、68℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温）のPCRサイクルで行った。このPCRによりcysG遺伝子配列の下流にcysJI遺伝子配列が接続された遺伝子断片を取得した。P. ananatisの染色体DNA上のcysG遺伝子の開始コドンはGTGであるが、プライマーの開始コドン付着部の配列をGTGからATGに換えることにより、PCRによって得られたDNA断片に含まれるcysG遺伝子の開始コドンをATGに改変した。また、プライマーの5'末端には、XhoIとXbaIサイトがそれぞれデザインされている。P. ananatisのcysG遺伝子のORF内には、SalIの制限酵素サイトが存在するため、SalIの代用としてXhoIを用いた。得られた断片をXhoI及びXbaIで処理し、SalI及びXbaIで処理したpMIV-Pnlp23-terに挿入し、P. ananatis SC17株のcysGJI遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp23-cysGJI（Pa）を取得した。

（２）E. coliシステイン生産菌の構築
E. coliシステイン生産菌として、ydeD遺伝子、cysEX遺伝子、およびserA5遺伝子を有するプラスミドpACYC-DESを保持し、cysM遺伝子が染色体に導入されたMG1655int-4M/pACYC-DES株を構築した。構築手順を（２−１）〜（２−２）に示す。

（２−１）ydeD遺伝子、cysEX遺伝子、およびserA5遺伝子を有するプラスミドpACYC-DESの構築
ydeD遺伝子、cysEX遺伝子、およびserA5遺伝子をプラスミドpACYC184にクローニングし、プラスミドpACYC-DESを構築した。ydeD遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与する膜貫通型タンパク質をコードする遺伝子であり、システイン産生に有用であることが報告されている（米国特許第5,972,663号）。cysEX遺伝子は、cysEの変異型遺伝子であり、システインによるフィードバック阻害が解除された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコードする（米国特許第6,218,168号）。serA5遺伝子は、serAの変異型遺伝子であり、エシェリヒア・コリ由来の野生型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼのＣ末端のチロシン残基を欠損し、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）をコードする（米国特許第6,180,373号）。構築手順を以下に示す。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、プライマーydeD299F（agctgagtcg acatgtcgcg aaaagatggg gtg：配列番号２２）及びプライマーydeD299R（agctgatcta gagtttgttc tggccccgac atc：配列番号２３）を用いたＰＣＲにより、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のydeD遺伝子断片を増幅した。

さらに、図３に示すようにして、cysEX遺伝子断片を作製した。具体的には、まず、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、プライマーcysEF（agctgagtcg acatgtcgtg tgaagaactg gaa：配列番号２４）及びプライマーcysEX-1（atcaccgccg cttcaccaac g：配列番号２５）を用いたＰＣＲにより、cysEX遺伝子の上流側断片を増幅した。次に、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、プライマーcysEX-2（cgttggtgaa gcggcggtga t：配列番号２６）及びプライマーcysER（agctgatcta gaatagatga ttacatcgca tcc：配列番号２７）を用いたＰＣＲにより、cysEX遺伝子の下流側断片を増幅した。これら２種のＰＣＲ産物は、電気泳動により分離し、ゲルから溶出させた。次いで、これら２種のＰＣＲ産物を用いて再度ＰＣＲを行うことで、これら２種のＰＣＲ産物は重複部分で互いにアニールし、cysEX遺伝子全長を含むＤＮＡ断片が生成した。

さらに、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、プライマーserA5F（agctgagtcg acatggcaaa ggtatcgctg gag：配列番号２８）及びプライマーserA5R（agctgatcta gattacagca gacgggcgcg aatgg：配列番号２９）を用いたＰＣＲにより、serA5遺伝子断片を増幅した。

さらに、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、プライマーPrOMPAF（agctgagtcg accgcctcgt tatcatccaa aatc：配列番号３０）及びプライマーPrOMPAR（agctgagcat gcactaattt tccttgcgga ggc：配列番号３１）を用いたＰＣＲにより、プロモーターPompA断片を増幅した。

プライマーPrOMPAF、並びに遺伝子断片増幅用のプライマーydeD299F、cysEF、およびserA5Fの５’末端には、SalIサイトがデザインされている。増幅されたPompA断片、及び増幅された各遺伝子断片をSalIで処理し、ライゲーションすることで、PompA下流に各遺伝子が接続された３種のＤＮＡ断片を取得した。

また、プライマーPrOMPARの５’末端には、PaeIサイトがデザインされている。また、遺伝子断片増幅用のプライマーydeD299R、cysER、およびserA5Rの５’末端には、ベクターへの組み込み用の制限サイトがデザインされている。これら制限サイトを利用して、PompA下流に各遺伝子が接続された３種のＤＮＡ断片をプラスミドpACYC184に導入した。こうして得られたプラスミドをpACYC-DESと命名した。pACYC-DESの構造を図４に示す。

（２−２）E. coli MG1655株へのO−アセチル−L−セリン−スルフヒドリラーゼ-B（cysM）遺伝子の導入
E. coli MG1655株の染色体に、O−アセチル−L−セリン−スルフヒドリラーゼ-B（cysM）遺伝子を導入し、MG1655int-4M株を構築した。さらに、MG1655int-4M株にプラスミドpACYC-DESを導入して、MG1655int-4M/pACYC-DES株を構築した。なお、E. coli MG1655株に導入するcysM遺伝子の発現には、P. ananatis SC17株由来の野生型nlpD遺伝子のプロモーターである「Pnlp4」を用いた。構築手順を以下に示す。

まず、適切な強さのプロモーターでcysM遺伝子を発現させるため、以下の手順で新たなプロモーターPnlp4を取得した。

まず、P. ananatis SC17株のゲノムをテンプレートに、PCRによりnlpD遺伝子のプロモーター領域約180bpを含むDNA断片を取得した。なお、このようにして増幅されたP. ananatis SC17株由来の野生型nlpD遺伝子のプロモーターを「Pnlp4」と称する。使用したプライマーはP9（agctgaaagc ttgcatgcac gcgtggcgat ctggcctgac tgc：配列番号３２）およびプライマーP10(agctgagtcg accccgtggt ggcaaccttt aaaaaactg：配列番号３３)であり、これらプライマーの5'末端には制限酵素SalI及びPaeIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 5分の後、94℃ 20秒、59℃ 20秒、72℃ 20秒を27サイクル後、最後に72℃ 5分。得られたDNA断片をSalI及びPaeIで処理し、同じくSalI及びPaeIで処理したpMIV-Pnlp0-terに挿入し、pMIV-Pnlp0-terのPnlp0がPnlp4に置換されたプラスミドpMIV-Pnlp4-terを取得した。pMIV-Pnlp4-terに挿入されたPnlp4のPaeI-SalI断片の塩基配列は配列番号３４に示したとおりである。

（２−２）で取得したプラスミドpMIV-Pnlp4-terに、E. coli MG1655株よりクローニングしたcysM遺伝子を組み込んだ。具体的には、E. coli MG1655株のゲノムをテンプレートに、プライマーP11（agctgagtcg acgtgagtacattagaacaa acaat：配列番号３７）とプライマーP12（agctgatcta gaagtctccg atgctattaa tcc：配列番号３８）をプライマーに用いたPCR（95℃ 5分の後、98℃ 5秒、50℃ 10秒、72℃ 60秒を30サイクル後、最後に72℃ 2分）を行って、cysM遺伝子断片を増幅した。こうして得られたDNA断片をSalI、XbaIで処理し、同酵素で処理したpMIV-Pnlp4-terに挿入し、E. coli MG1655株のcysM遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp4-CysMを作製した。E. coli MG1655株のcysM遺伝子の塩基配列を配列番号３５に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号３６に示す。

pMIV-Pnlp4-CysMは、pMIV-5JSに由来するMuファージのアタッチメントサイトを備えている。よって、pMIV-Pnlp4-CysMを、Mu transposase遺伝子を有するヘルパープラスミドpMH10（Zimenkov D. et al., Biotechnologiya (in Russian), 6, 1-22 (2004)）とホストの細胞内で共存させることにより、Muファージのアタッチメントサイトに挟まれる形でpMIV-Pnlp4-CysM上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むPnlp4-CysM-rrnB terminatorのカセットを、ホストの染色体上に挿入することができる。さらに、pMIV-Pnlp4-CysMプラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子は、2つのλファージのアタッチメントサイト（λattRとλattL）間に挟まれており、後述の方法により切り出し除去することができる。

まず、ヘルパープラスミドpMH10をMG1655株にエレクトロポレーションにより導入し、20mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にて30℃で一晩培養することによりpMH10が導入された株を選択した。得られた形質転換株を30℃で培養し、この株に、さらにpMIV-Pnlp4-CysMをエレクトロポレーションにより導入した。このpMH10とpMIV-Pnlp4-CysMの両方で形質転換された株に、42℃、20分間の条件でヒートショックを与えた後、20mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地にて39℃で培養し、クロラムフェニコール耐性株のコロニーを選択した。このようにして得られた約50クローンのクロラムフェニコール耐性株を、それぞれLB寒天培地で39℃、48時間培養することで、pMH10及びpMIV-Pnlp4-CysMを脱落させた。次に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むカセットが染色体上に挿入されたことによりクロラムフェニコール耐性を示し、かつ、両プラスミドが脱落した結果カナマイシン及びアンピシリン感受性を示す株を取得した。さらに、この株の染色体DNAを鋳型として、プライマーP1とプライマーP6をプライマーとして用いたPCRにより、得られた株の染色体上に目的のカセットが挿入されていることを確認した。こうして作製された株をMG1655int-4M（CmR）と命名した。

MG1655int-4M（CmR）株に導入されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を、ラムダファージ由来の切り出しシステムによって除去した。具体的には、ラムダファージのInt-Xis遺伝子を搭載したpMW-Int-Xis2（WO2005/010175）でMG1655int-4M（CmR）株を形質転換し、得られた形質転換株からクロラムフェニコール感受性を示すMG1655int-4M株を取得した。

次いで、MG1655int-4MにプラスミドpACYC-DESを導入して、MG1655int-4M/pACYC-DES株を得た。

（３）cysG遺伝子またはcysGJI遺伝子を過剰発現するE. coliによるチオ硫酸を硫黄源としたシステイン生産
上記で得られたE. coliのシステイン生産菌MG1655int-4M/pACYC-DESにcysG遺伝子の過剰発現プラスミドであるpMIV-Pnlp23-cysG（Ec）、pMIV-Pnlp8-cysG（Pa）、cysG、cysJI共発現プラスミドであるpMIV-Pnlp23-cysGJI（Ec）、pMIV-Pnlp23-cysGJI（Pa）及びコントロールとしてpMIV-5JSを導入した菌株を構築した。これらの菌株によりシステイン生産培養を行い、システインの生産量を比較した。システイン生産培養には、炭素源としてグルコース、硫黄源としてチオ硫酸を含む下記組成のシステイン生産培地を用いた。
〔システイン生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
NH_４Cl 12.1g/L
KH_２PO_４ 1.5g/L
MgSO_４・7H_２O 1g/L
チアミン塩酸塩 0.1mg/L
成分２：
FeSO_４・7H_２O 1.7mg/L
Na_２MoO_４・2H_２O 0.15mg/L
CoCl_２・6H_２O 0.7mg/L
MnCl・4H_２O 1.6mg/L
ZnSO_４・7H_２O 0.3mg/L
CuSO_４・5H_２O 0.25mg/L
成分３：
トリプトン 0.6g/L
イーストエクストラクト 0.3g/L
NaCl 0.6g/L
成分４：
炭酸カルシウム 20g/L
成分５：
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物 135mg/L
成分６：
チオ硫酸ナトリウム 0.6g/L
成分７：
ピリドキシン塩酸塩 2mg/L
成分８：
グルコース 20g/L

各成分について、各々10倍（成分１）、1000倍（成分２）、100／6倍（成分３）、100倍（成分５）、1750/3倍（成分６）、1000倍（成分７）、20倍（成分８）のストック溶液を作製しておき、使用時に混合し滅菌水で規定の量までメスアップして最終濃度となるように調製した。滅菌は、110℃、30分のオートクレーブ（成分１、２、３、５、８）、180℃、5時間以上の乾熱滅菌（成分４）、及びフィルター滅菌（成分６、７）により行った。システイン生産培養は以下の手順で行った。各生産菌をLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った後、10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml張りこんだ生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製した。37℃にて振とう培養を行い、培地中のグルコースが完全に消費された時点で培養を終了した（21時間〜24時間）。培地中に生産されたシステインの定量は、Gaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。プラスミドを保持させるため、全培養工程でクロラムフェニコール（25mg/L）を添加した。各株とも4連で実験を行い、蓄積したシステインの濃度（g/L）について平均値と標準偏差を表１に示した。

亜硫酸還元酵素の補因子であるシロヘムの合成酵素をコードするcysG遺伝子の発現を強化することにより、また、cysG遺伝子に加えて亜硫酸還元酵素のサブユニットをコードするcysJI遺伝子の発現を強化することにより、E. coliにおいて、チオ硫酸を硫黄源として用いた際のシステインの発酵生産を向上させることができると明らかになった。

（実施例２）cysG遺伝子またはcysGJI遺伝子を過剰発現するP. ananatisによるチオ硫酸を硫黄源としたシステイン生産

（１）P. ananatisシステイン生産菌の構築
P. ananatisシステイン生産菌として、cysE5遺伝子、yeaS遺伝子、serA348遺伝子、およびcysM遺伝子が染色体に導入され、cysPTWA遺伝子の発現が増強され、d0191遺伝子を欠損したEYPSint-1MΔd0191（S）株を構築した。構築手順を（１−１）〜（１−５）に示す。

（１−１）P. ananatis SC17株へのcysE5遺伝子およびyeaS遺伝子の導入
P. ananatis SC17株の染色体にcysE5遺伝子およびyeaS遺伝子を導入し、EY19(s)株を構築した。cysE5遺伝子は、cysEの変異型遺伝子であり、E. coliの野生型セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）の95位のVal残基がArg残基に、96位のAsp残基がPro残基に置換され、システインによるフィードバック阻害が解除された変異型ＳＡＴをコードする（米国特許公開第20050112731(A1)）。yeaS遺伝子は、システイン排出系をコードする遺伝子である。構築手順を以下に示す。

まず、プラスミドpMW-Pomp-cysE5（WO2005007841）からPaeI、SacIでPomp-cysE5カセット部分を切り出し、pMIV-5JSの同じ制限サイトに挿入し、プラスミドpMIV-Pomp-CysE5を構築した。pMW-Pomp-cysE5は、ompC遺伝子のプロモーターに連結された変異型SATをコードする遺伝子cysE5をプラスミドpMW118に挿入して得られたプラスミドである。プラスミドpACYC184（GenBank/EMBL accession number X06403、ニッポンジーンから購入可能）から、XbaI、Eco88Iでテトラサイクリン耐性遺伝子を切り出し、同遺伝子断片をKlenow fragmentで処理した後、pMIV-Pomp-CysE5のPvuIサイトに挿入し、プラスミドpMT-Pomp-CysE5を構築した。続いて、実施例１の（１−１）で構築したプラスミドpMIV-Pnlp8-YeaS7をHindIIIで消化し、Klenow fragmentで平滑末端化した後、NcoIで消化して、Pnlp8-YeaS-rrnBターミネーターのカセットとクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む断片を切り出した。この断片を、同じくpMIV-5JSに由来するpMT-Pomp-CysE5のSmaI、NcoI切断断片と繋ぎ合わせ、プラスミドpMT-EY2を構築した。pMT-EY2は、Pnlp8-YeaS-rrnBターミネーターカセットとPomp-CysE5カセットを一つのプラスミド上に有する。

pMT-EY2は、pMIV-5JSに由来するMuファージのアタッチメントサイトを備えている。よって、pMT-EY2を、Mu transposase遺伝子を有するヘルパープラスミドpMH10（Zimenkov D. et al., Biotechnologiya (in Russian), 6, 1-22 (2004)）とホストの細胞内で共存させることにより、Muファージのアタッチメントサイトに挟まれる形でpMT-EY2プラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むPompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB terminatorのカセットを、ホストの染色体上に挿入することができる。さらに、pMT-EY2プラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子は、2つのλファージのアタッチメントサイト（λattRとλattL）間に挟まれており、後述の方法により切り出し除去することができる。

まず、ヘルパープラスミドpMH10をP. ananatis SC17株にエレクトロポレーションにより導入し、20mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にて30℃で一晩培養することによりpMH10が導入された形質転換株を選択した。得られた形質転換株を30℃で培養し、この株に、さらにpMT-E2をエレクトロポレーションにより導入した。このpMH10とpMT-EY2の両方で形質転換された株に、42℃、20分間の条件でヒートショックを与えた後、20mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地にて39℃で培養し、クロラムフェニコール耐性株のコロニーを選択した。このようにして得られた約50クローンのクロラムフェニコール耐性株を、それぞれLB寒天培地で39℃、48時間培養することで、pMH10及びpMT-EY2を脱落させた。次に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むPompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB terminatorのカセットが染色体上に挿入されたことによりクロラムフェニコール耐性を示し、かつ、両プラスミドが脱落した結果カナマイシン及びアンピシリン感受性を示す株を取得した。さらに、この株の染色体DNAを鋳型として、プライマーP1とプライマーP6をプライマーとして用いたPCRにより、得られた株の染色体上に目的のカセットが挿入されていることを確認した。このようにして得られた全クローンをそれぞれEY01〜EY50と命名した。EY01〜EY50株のシステイン生産培養を行い、最も多くシステインを生産したクローンであるEY19株を選抜した。

次に、EY19株に導入されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を、ラムダファージ由来の切り出しシステムによって除去した。具体的には、ラムダファージのInt-Xis遺伝子を搭載したpMW-Int-Xis2（WO2005/010175）でEY19株を形質転換し、得られた形質転換株からクロラムフェニコール感受性を示すEY19(s)株を取得した。

なお、システイン生産培養は以下に挙げる培地、培養方法によって行うことができる。
［システイン生産培地］（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
(NH_４)₂SO₄ 15g/L
KH_２PO_４ 1.5g/L
MgSO_４・7H_２O 1g/L
チアミン塩酸塩 0.1mg/L
成分２：
FeSO_４・7H_２O 1.7mg/L
Na_２MoO_４・2H_２O 0.15mg/L
CoCl_２・6H_２O 0.7mg/L
MnCl・4H２O 1.6mg/L
ZnSO_４・7H_２O 0.3mg/L
CuSO_４・5H_２O 0.25mg/L
成分３：
トリプトン 0.6g/L
イーストエクストラクト 0.3g/L
NaCl 0.6g/L
成分４：
炭酸カルシウム 20g/L
成分５：
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物 135mg/L
成分６：
チオ硫酸ナトリウム 4g/L
成分７：
ピリドキシン塩酸塩 2mg/L
成分８：
グルコース 40g/L

各成分について、各々10倍（成分１）、1000倍（成分２）、100／6倍（成分３）、100倍（成分５）、1750/3倍（成分６）、1000倍（成分７）、20倍（成分８）のストック溶液を作製しておき、使用時に混合し滅菌水で規定の量までメスアップして最終濃度となるように調製する。滅菌は、110℃、30分のオートクレーブ（成分１、２、３、５、８）、180℃、5時間以上の乾熱滅菌（成分４）、及びフィルター滅菌（成分６、７）により行う。システイン生産培養は以下の手順で行うことができる。各生産菌をLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った後、10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml張りこんだ生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製する。32℃にて振とう培養を行い、培地中のグルコースが完全に消費された時点で培養を終了する（21時間〜24時間）。培地中に生産されたシステイン関連化合物の定量は、Gaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行う。

（１−２）EY19(s)株のcysPTWA遺伝子発現強化株の作製
次に、EY19(s)株の染色体上のcysPTWA遺伝子クラスターの上流に存在するプロモーターを先述の強力なプロモーターPnlp8に置換し、cysPTWA遺伝子の発現が増強されたEYP197(s)株を構築した。cysPTWA遺伝子は、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質をコードする遺伝子である。構築手順を以下に示す。

まず、pMIVPnlp8-YeaS7をテンプレートに、プライマーP1及びプライマーP2を用いたPCRによって、nlp8プロモーター領域約300bpを含むDNA断片を取得した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、59℃ 20秒、72℃ 15秒を20サイクル、最後に72℃ 5分。

増幅されたnlp8プロモーターを含むDNA断片をKlenowフラグメントで処理し、XbaIで切断後にKlenowフラグメントで処理されたプラスミドpMW118-(λattＬ−KmR-λattR)（WO2006/093322A2）に挿入し、プラスミドpMW-Km-Pnlp8を取得した。pMW-Km-Pnlp8をテンプレートに使用し、プライマーP13（tccgctcacg atttttttca tcgctggtaa ggtcatttat cccccaggaa aaattggtta：配列番号３９）、及びプライマーP14（tttcacaccg ctcaaccgca gggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg：配列番号４０）を用いたPCRによって、Km-Pnlp8カセットを含む約1.6kbのDNA断片を増幅した。このときのPCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、54℃ 20秒、72℃ 90秒を30サイクル、最後に72℃ 5分。両プライマー上には、λ依存インテグレーション（「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645））によって目的の断片を挿入するための染色体上のターゲットとなる配列（この場合はcysPTWAのプロモーター近傍の配列）がデザインされている。そのため、取得されたDNA断片を目的の菌株にλ依存インテグレーションによって挿入することで、染色体上のcysPTWA遺伝子の直前にKm-Pnlp8が挿入され、nlp8プロモーターにcysPTWA遺伝子が連結された構造が形成される。cysPTWA遺伝子クラスターの塩基配列を配列番号４１に、cysP、cysT、cysWの各遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４２〜４４に示す。cysA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４５、４６に示す。なお、cysT遺伝子は、cysU遺伝子と同義である。

λ依存インテグレーションのホスト菌株としてはP. ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER株を用いた。P. ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER株は、λ依存インテグレーションを効率よく行うためのホスト菌株であり、λファージのRed遺伝子産物に耐性なP. ananatis菌株であるSC17(0)株に、λファージのgam、bet、及びexoの各遺伝子（以下、「λRed遺伝子」）を発現するヘルパープラスミドRSF-Red-TERが導入された菌株である(WO2008/075483)。SC17(0)株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。また、RSF-Red-TERプラスミドの構築方法はWO2008/075483に詳細に記載されている。

上記SC17(0)/RSF-Red-TER株を、λRed遺伝子発現誘導のためIPTGを添加した条件で培養し、エレクトロポレーション用の細胞を調製した。これらの細胞に、上述のKm-Pnlp8カセットを含むDNA断片をエレクトロポレーションにて導入し、カナマイシン耐性を指標として、λ依存インテグレーションによりcysPTWA遺伝子上流にnlp8プロモーターが挿入された組み換え株を取得した。取得された株の染色体DNAをテンプレートに、プライマーP15（ctttgtccct ttagtgaagg：配列番号４７）、プライマーP16（agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac：配列番号４８）をプライマーとして用いたPCRにより、目的のKm-Pnlp8-cysPTWAの構造が形成されていることを確認し、この株をSC17(0)-Pnlp8-PTWA株と命名した。

次に、SC17(0)-Pnlp8-PTWA株の染色体DNAを精製し、この染色体DNA 10μgをエレクトロポレーション法によりEY19(s)株に導入し、カナマイシン耐性株を取得した。得られた株の染色体DNAを鋳型として、プライマーP15、プライマーP16をプライマーとして用いたPCRによる増幅を行い、EY19(s)株の染色体にKm-Pnlp8-cysPTWAの構造が導入されたことを確認した。こうして取得された株をEYP197株と命名した。さらに上述のpMT-Int-Xis2を用いてカナマイシン耐性遺伝子を染色体上から除去し、カナマイシン感受性となった株をEYP197(s)株と命名した。

（１−３）EYP197(s)株への変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA348）の導入
EYP197(s)株の染色体にserA348遺伝子を導入し、EYPS1976(s)株を構築した。serA348遺伝子は、serAの変異型遺伝子であり、パントエア・アナナティス由来の野生型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼの348位のアスパラギン残基がアラニンに置換され、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除された変異型３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ(N348A)をコードする（J. Biol. Chem. 1996; 271(38):23235-8）。構築手順を以下に示す。

パントエア・アナナティス由来の野生型serA遺伝子の塩基配列を配列番号４９に、同遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列番号５０に示す。上記変異(N348A)が導入されたserA遺伝子の３'側DNA断片を得るため、SC17株染色体DNAをテンプレートに、プライマーP17（agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa：配列番号５１）及びプライマーP18（gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc：配列番号５２）をプライマーに用いたPCR（95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 60秒を25サイクル、最後に72℃ 5分）を行った。同様に、上記変異(N348A)が導入された５'側DNA断片を得るため、SC17株染色体DNAをテンプレートに、プライマーP19（agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg：配列番号５３）、及びプライマーP20（aaaaccgccc gggcgttctc ac：配列番号５４）をプライマーに用いたPCR（95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 20秒を20サイクル、最後に72℃ 5分）を行った。得られた両PCR断片を制限酵素SmaIにより処理した後、DNAライゲースによるライゲーションにより連結し、目的の変異（N348A）を含む変異型serA遺伝子全長のDNA断片を得た。このDNA断片をテンプレートとし、プライマーP17とプライマーP19をプライマーに用いてPCR（95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 75秒を15サイクル、最後に72℃ 5分）を行った。プライマーP17およびプライマーP19の5'末端には、SalIとXbaIサイトがそれぞれデザインされている。得られた断片をSalI及びXbaIで処理した後、同じくSalI及びXbaIで処理したpMIV-Pnlp8-terに挿入し、serA348遺伝子がクローニングされたpMIV-Pnlp8-serA348を作製した。

構築されたpMIV-Pnlp8-serA348にはpMIV-5JSに由来するMuファージのアタッチメントサイトが搭載されている。よって、上述したように、Mu transposase遺伝子を有するヘルパープラスミドpMH10を用いることで、Muファージのアタッチメントサイトに挟まれる形でpMIV-Pnlp8-serA348上に存在するクロラムフェニコール耐性マーカーを含むPnlp8-serA348-rrnB terminatorのカセットを、ホストの染色体上に挿入することができる。

SC17(0)株にpMIV-Pnlp8-serA348およびpMH10を導入し、（１−１）でPompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB terminatorのカセットを導入した場合と同様の手順で、染色体にPnlp8-serA348-rrnB terminatorのカセットが挿入された株を取得した。得られた株の染色体上に目的のカセットが挿入されていることは、プライマーP1およびプライマーP19を用いたPCRにより確認した。このようにして得られた５０クローンについて、細胞抽出液中の３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性を測定し、最も活性の高かった菌株を選抜し、SC17int-serA348株と命名した。次に、SC17int-serA348株の染色体DNA 10μgをエレクトロポレーションによりEYP197(s)株に導入し、クロラムフェニコール耐性株を取得し、プライマーP1およびプライマーP19を用いたPCRにより、EYP197(s)株の染色体にクロラムフェニコール耐性遺伝子と共にPnlp8-serA348の構造が導入されたことを確認した。こうして取得された株をEYPS1976株と命名した。さらに、先述のpMT-Int-Xis2を用いたマーカー除去の方法により、クロラムフェニコール耐性遺伝子を染色体上から除去し、クロラムフェニコール感受性となった株をEYPS1976(s)株と命名した。

（１−４）EYPS1976(s)株へのO−アセチル−L−セリン−スルフヒドリラーゼ-B（cysM）遺伝子の導入
EYPS1976(s)株の染色体に、O−アセチル−L−セリン−スルフヒドリラーゼ-B（cysM）遺伝子を導入し、EYPSint-1M (s)株を構築した。構築手順を以下に示す。

まず、実施例１の（２−２）で構築したプラスミドpMIV-Pnlp4-terをテンプレートとして、プライマーP9（agctgaaagc ttgcatgcac gcgtggcgat ctggcctgac tgc：配列番号３２）及びプライマーP21（agctgagtcg acnnngtggt ggcaaccttt aaaaaactg（“n”はa,t,g,cのいずれでも良いことを意味する）：配列番号５５）をプライマーに用いたPCR（95℃ 5分の後、94℃ 20秒、59℃ 20秒、72℃ 20秒を27サイクル後、最後に72℃ 5分）によって、nlpDプロモーターの５'末端側に含まれる-7〜-9領域をランダム化したDNA断片を取得した。-7〜-9領域とは、nlpDプロモーターの転写開始点から5'側に7塩基から9塩基目の位置を意味する。得られた断片をSalI及びPaeIで処理し、同酵素で処理したpMIV-Pnlp0-terに挿入し、pMIV-Pnlp0-terのPnlp0が変異型Pnlpに置換されたプラスミドを取得した。その中の１つをpMIV-Pnlp1-terとした。このプラスミドに挿入されたPnlp1プロモーターのPaeI-SalI断片の塩基配列は配列番号５６に示したとおりである。

pMIV-Pnlp1-terに、E. coli MG1655株よりクローニングしたcysM遺伝子を組み込んだ。具体的には、E. coli MG1655株のゲノムをテンプレートに、プライマーP22（agctgagtcg acgtgagtacattagaacaa acaat：配列番号５７）とプライマーP23（agctgatcta gaagtctccg atgctattaa tcc：配列番号５８）をプライマーに用いたPCR（95℃ 5分の後、98℃ 5秒、50℃ 10秒、72℃ 60秒を30サイクル後、最後に72℃ 2分）を行って、cysM遺伝子断片を増幅した。こうして得られたDNA断片をSalI、XbaIで処理し、同酵素で処理したpMIV-Pnlp1-terに挿入し、E. coli MG1655株のcysM遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp1-CysMを作製した。E. coli MG1655株のcysM遺伝子の塩基配列を配列番号３５に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号３６に示す。

上記のように構築されたpMIV-Pnlp1-CysMを使用して、先述のヘルパープラスミドpMH10を用いた方法により、P. ananatis SC17株の染色体上にcysM遺伝子を含むカセットが挿入された株を取得し、SC17int-1Mと命名した。SC17int-1Mから染色体DNAを抽出した。この染色体DNA10μgをエレクトロポレーションによりEYP1976(s)株に導入し、クロラムフェニコール耐性株を取得し、EYPSint-1Mと命名した。さらに、先述のpMT-Int-Xis2を用いたマーカー除去の方法によりクロラムフェニコール耐性遺伝子を染色体上から除去し、クロラムフェニコール感受性となった株をEYPSint-1M (s)株と命名した。

（１−５）EYPSint-1M (s)株のシステイン分解系遺伝子d0191欠損株の作製
EYPSint-1M (s)株において、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするd0191遺伝子を欠損させ、EYPSint-1MΔd0191 (s)株を構築した。構築手順を以下に示す。

d0191遺伝子の欠失は（１−２）に記載のλ依存インテグレーションによって行った。概略を図５に示す。d0191遺伝子の両端の相同配列でカナマイシン耐性遺伝子を挟んだ構造を有するDNA断片（遺伝子破壊用ＰＣＲ断片；図５）をPCRによって取得した。プライマーとして、プライマーDd0191-FW（CCGTGTCTGAAGCCTATTTTGCCCGCCTGCTGGGCTTGCCTTTTATTGCCTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA：配列番号５９）、およびプライマーDd0191-RV（CTAGCCCAGTTCGCGCTGCCAGGGCGTAATATCGCCAATGTGCTCGGCAACGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA：配列番号６０）を使用し、鋳型にプラスミドpMW118-(λattL-Kmr-λattR)を使用した。PCRは、LA-Taqポリメラーゼ（Takara社）を用い、プロトコールに記載の標準的な反応液組成で、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 2分30秒からなるサイクルを30サイクル繰り返すことによって行った。得られたDNA断片をP. ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER株にエレクトロポレーションで導入し、カナマイシン耐性株を取得した。得られたカナマイシン耐性株は、前記DNA断片の両端に存在するd0191遺伝子領域の相同配列により、d0191遺伝子がカナマイシン耐性カセットで置換された、d0191遺伝子破壊株であることが確認された（SC17(0) d0191::Kmr株；図５）。

SC17(0) d0191::Kmr株から染色体DNAを抽出した。この染色体DNA10μgをエレクトロポレーションによりEYPSint-1M (s)株に導入し、カナマイシン耐性株を取得し、EYPSint-1MΔd0191と命名した。さらに、先述のpMT-Int-Xis2を用いたマーカー除去の方法によりカナマイシン耐性遺伝子を染色体上から除去し、カナマイシン感受性となった株をEYPSint-1MΔd0191 (s)株と命名した。同株をP. ananatisシステイン生産菌として以降の実験に用いた。

（２）cysG遺伝子またはcysGJI遺伝子を過剰発現するP. ananatisによるチオ硫酸を硫黄源としたシステイン生産
上記で得られたP. ananatisのシステイン生産菌EYPSint-1MΔd0191(s)株に、実施例１で得られたcysG遺伝子の過剰発現プラスミドであるpMIV-Pnlp23-cysG（Pa）、pMIV-Pnlp23-cysG（Ec）、cysG、cysJI共発現プラスミドであるpMIV-Pnlp23-cysGJI（Pa）、pMIV-Pnlp23-cysGJI（Ec）、及びコントロールとしてpMIV-5JSを導入した菌株を構築した。これらの菌株によりシステイン生産培養を行い、システインの生産量を比較した。システイン生産培養には、炭素源としてグルコース、硫黄源としてチオ硫酸を含む下記組成のシステイン生産培地を用いた。
〔システイン生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
NH_４Cl 12.1g/L
KH_２PO_４ 1.5g/L
MgSO_４・7H_２O 1g/L
チアミン塩酸塩 0.1mg/L
成分２：
FeSO_４・7H_２O 1.7mg/L
Na_２MoO_４・2H_２O 0.15mg/L
CoCl_２・6H_２O 0.7mg/L
MnCl・4H_２O 1.6mg/L
ZnSO_４・7H_２O 0.3mg/L
CuSO_４・5H_２O 0.25mg/L
成分３：
トリプトン 0.6g/L
イーストエクストラクト 0.3g/L
NaCl 0.6g/L
成分４：
炭酸カルシウム 20g/L
成分５：
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物 135mg/L
成分６：
チオ硫酸ナトリウム 0.6g/L
成分７：
ピリドキシン塩酸塩 2mg/L
成分８：
グルコース 20g/L

各成分について、各々10倍（成分１）、1000倍（成分２）、100／6倍（成分３）、100倍（成分５）、1750/3倍（成分６）、1000倍（成分７）、20倍（成分８）のストック溶液を作製しておき、使用時に混合し滅菌水で規定の量までメスアップして最終濃度となるように調製した。滅菌は、110℃、30分のオートクレーブ（成分１、２、３、５、８）、180℃、5時間以上の乾熱滅菌（成分４）、及びフィルター滅菌（成分６、７）により行った。システイン生産培養は以下の手順で行った。各生産菌をLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った後、10マイクロリッターサイズの植菌用ループ（NUNC社ブルーループ）でプレート上約7cm分の菌体を掻き取り、大試験管（内径23mm、長さ20cm）に2ml張りこんだ生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製した。32℃にて振とう培養を行い、培地中のグルコースが完全に消費された時点で培養を終了した（21時間〜24時間）。培地中に生産されたシステインの定量は、Gaitonde, M.K.（Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33.）に記載の方法で行った。プラスミドを保持させるため、全培養工程でクロラムフェニコール（25mg/L）を添加した。各株とも4連で実験を行い、蓄積したシステインの濃度（g/L）を表２に示した。

亜硫酸還元酵素の補因子であるシロヘムの合成酵素をコードするcysG遺伝子の発現を強化することにより、また、cysG遺伝子に加えて亜硫酸還元酵素のサブユニットをコードするcysJI遺伝子の発現を強化することにより、P. ananatisにおいて、チオ硫酸を硫黄源として用いた際のシステインの発酵生産を向上させることができると明らかになった。

本発明により、チオ硫酸を硫黄源として用いる場合の細菌のＬ−システイン生産能を向上させることができる。また、本発明によれば、チオ硫酸を硫黄源として用いる場合に、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。

配列表の説明
配列番号１：Pnlp0の塩基配列
配列番号２：Pnlp23の塩基配列
配列番号３，４：P. ananatisのcysG遺伝子増幅用プライマー
配列番号５，６：P. ananatisのcysJI遺伝子増幅用プライマー
配列番号７：P. ananatisのcysGJI遺伝子増幅用プライマー
配列番号８，９：E.coliのcysG遺伝子増幅用プライマー
配列番号１０，１１：E.coliのcysJI遺伝子増幅用プライマー
配列番号１２：E.coliのcysGJI遺伝子増幅用プライマー
配列番号１３〜２０：プライマーＰ１〜Ｐ８
配列番号２１：Pnlp8の塩基配列
配列番号２２，２３：E.coliのydeD遺伝子増幅用プライマー
配列番号２４〜２７：cysEX遺伝子増幅用プライマー
配列番号２８，２９：serA5遺伝子増幅用プライマー
配列番号３０，３１：プロモーターPompA増幅用プライマー
配列番号３２，３３：プライマーＰ９、Ｐ１０
配列番号３４：Pnlp4の塩基配列
配列番号３５：E.coliのcysM遺伝子の塩基配列
配列番号３６：E.coliのCysMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３７〜４０：プライマーＰ１１〜Ｐ１４
配列番号４１：E.coliのcysPTWA遺伝子クラスターの塩基配列
配列番号４２：E.coliのCysPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３：E.coliのCysTタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４４：E.coliのCysWタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５：E.coliのcysA遺伝子の塩基配列
配列番号４６：E.coliのCysAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７，４８：プライマーＰ１５、Ｐ１６
配列番号４９：P. ananatisのserA遺伝子の塩基配列
配列番号５０：P. ananatisのSerAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５１〜５５：プライマーＰ１７〜Ｐ２１
配列番号５６：Pnlp1の塩基配列
配列番号５７，５８：プライマーＰ２２、Ｐ２３
配列番号５９，６０：P. ananatisのd0191遺伝子増幅用プライマー
配列番号６１：E.coliのcysJ遺伝子の塩基配列
配列番号６２：E.coliのCysJタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６３：P. ananatisのcysJ遺伝子の塩基配列
配列番号６４：P. ananatisのCysJタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６５：E.coliのcysI遺伝子の塩基配列
配列番号６６：E.coliのCysIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６７：P. ananatisのcysI遺伝子の塩基配列
配列番号６８：P. ananatisのCysIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６９：E.coliのcysG遺伝子の塩基配列
配列番号７０：E.coliのCysGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７１：P. ananatisのcysG遺伝子の塩基配列
配列番号７２：P. ananatisのCysGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７３：下流の遺伝子との連結部位を含むPnlp0の塩基配列
配列番号７４：下流の遺伝子との連結部位を含むPnlp8の塩基配列

Claims (11)

1. Ｌ−システイン生産能を有し、且つ、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を、チオ硫酸を含有する培地で培養し、培地中に蓄積したＬ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を回収することを特徴とする、Ｌ−システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造方法。
2. 前記亜硫酸還元に関与する遺伝子が、ｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、およびｃｙｓＩ遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、請求項１記載の方法。
3. 少なくともｃｙｓＧ遺伝子の発現が増大した、請求項２に記載の方法。
4. ｃｙｓＧ遺伝子、ｃｙｓＪ遺伝子、およびｃｙｓＩ遺伝子の発現が増大した、請求項３に記載の方法。
5. 亜硫酸還元に関与する遺伝子のコピー数を高めること、又は、同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、亜硫酸還元に関与する遺伝子の発現が増大した、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記細菌がパントエア属に属する細菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項６に記載の方法。
8. 前記細菌がエシェリヒア属に属する細菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項８に記載の方法。
10. 前記細菌が、さらに以下の性質（１）および（２）からなる群より選択される性質を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
    （１）Ｌ−システインの生合成系が強化されている。
    （２）Ｌ−システインの排出系が強化されている。
11. 前記関連物質がＬ−シスチンまたはチアゾリジン誘導体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

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