JPWO2010140685A1 - ヘテロ環化合物及び造血幹細胞の増幅剤 - Google Patents
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Abstract
Description
近年、造血や免疫機能の不全に由来する各種血液疾患、癌、免疫不全症、自己免疫疾患、先天性代謝異常症等多くの難治性疾患の根治的な治療手段として、自己あるいは同種の造血幹細胞移植が行われている。またごく最近では、脳梗塞や心筋梗塞及び閉塞性動脈硬化症等における治療手段として、造血幹細胞を含むCD34陽性細胞移植の有効性が報告されている(非特許文献2、3、4、5参照)。更に、造血幹細胞移植による神経や筋肉の再生という試みも進められている。その例としては、臍帯血由来のCD34陽性細胞をマウス脳梗塞モデルに移植し、血管新生を介して神経を再生したとする報告(非特許文献2)やCD34陽性細胞により筋損傷の修復が可能という報告(非特許文献5、特許文献1)が挙げられる。これらの中でも、骨髄移植は治療実績が多く、標準的な造血幹細胞移植治療法として最も確立されている。しかし骨髄移植のためには、骨髄を提供するドナーと移植を受けるレシピエントのヒト白血球抗原(HLA)の一致率が高くなければならず、ドナーからの骨髄の供給不足が問題になっている。また、ドナーは4日間程度の入院が必要であり、大量に骨髄を採取することに伴う痛み、発熱や出血もあり、ドナーへの負担は大きい。
(1)
式(I)
R5は、C2−14アリール基(該C2−14アリール基は、−V1(式中、−V1は−(CH2)m1M1NR8R9(式中、M1は−(C=O)−又は−(SO2)−を意味し、m1は0,1,2のいずれかの整数を表し、R8は水素原子又はC1−3アルキル基を意味し、m1=0の時R9は−(CH2)m2OR10(式中m2は1又は2の整数を表し、R10は水素原子、C1−3アルキル基又は−(CH2)m3T(式中m3は1又は2の整数を表し、Tは水酸基、C1−6アルコキシ基又はC1−6アルキル基を意味する。)を意味する。)、−(CH2)m4NR11R12(式中m4は1又は2の整数を表し、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子、−(CH2)m5Q(式中m5は1又は2の整数を表し、Qは、水酸基、C1−3アルコキシ基、−NR13R14(式中R13、R14はそれぞれ独立に水素原子、C1−3アルキル基を意味する。)を意味する。)を意味するか、又はR11及びR12が一緒になって−NR11R12として式(II)で表される置換基又は式(III)(式中R15は水素原子、C1−3アルキル基又はアミノ基の保護基を意味する。)で表される置換基を意味する。)を意味し、m1=1又は2の時、R9は上記に加えて水素原子でも良い。)を意味する。)、−V2(式中、−V2は−(CH2)m6NR16R17(式中m6は1又は2の整数を表し、R16,R17はそれぞれ独立に水素原子、C1−3アルキルカルボニル基又はC1−3アルキルスルホニル基を意味する。)を意味する。)、−V3(式中V3は、M2NR18(CH2)m7R19(式中、M2は−(C=O)−又は−(SO2)−を意味し、m7は、1または2の整数を意味し、R18は、水素原子又はC1−3アルキル基を意味し、R19はC2−9ヘテロシクリル基又はC2−14アリール基を意味する。)を意味する。)又は−V4(式中V4は−(C=O)−(ピペラジン−1,4−ジイル)−U(式中Uは、水素原子を除いたR9と同様な意味を表し、R9は前記と同じ意味を表す。)を意味する。)で置換されている。)を意味し、
R7は、C2−14アリール基(該C2−14アリール基は−V5(式中、V5は水素原子、水酸基、保護された水酸基、アミノ基、保護されたアミノ基、チオール基、保護されたチオール基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、カルバモイル基、スルファモイル基、スルホ基、ホルミル基、C1−3アルコキシ基(該C1−3アルコキシ基はハロゲン原子で任意に置換されている。)、C1−10アルキル基(該C1−10アルキル基はハロゲン原子で任意に置換されていてもよい。)、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−10アルキルカルボニルオキシ基、C1−10アルコキシカルボニル基、C1−10アルコキシ基、C1−10アルキルカルボニル基、C1−10アルキルカルボニルアミノ基、モノ若しくはジC1−10アルキルアミノ基、C1−10アルキルスルホニル基、C1−10アルキルアミノスルホニル基、C1−10アルキルアミノカルボニル基、C1−10アルキルスルホニルアミノ基又はC1−10チオアルキル基を意味する。)でそれぞれ独立に表される置換基で置換されている。)を意味し、
Ar1は、C2−14アリーレン基(該C2−14アリーレン基は−V6(式中、V6はV5と同様な意味を表し、V5は前記と同じ意味を表す。)でそれぞれ独立に表される置換基で置換されている。)を意味し、
Xは、OR20(式中、R20は水素原子、C1−10アルキル基又はC1−10アルキルカルボニル基(該C1−10アルキル基及びC1−10アルキルカルボニル基、は、−V7(式中、V7は、V5と同様な意味を表し、V5は前記と同じ意味を表す。)でそれぞれ独立に表される置換基で任意に置換されている。)を意味する。)を意味し、Y及びZは、それぞれ独立に酸素原子又は硫黄原子を意味する。]で表される化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物。
(2)
R1が水素原子又はC1−6アルキル基(該C1−6アルキル基は、ハロゲン原子で任意に置換されていてもよい。)であり、
R2,R3,R4及びR6が水素原子であり、
Ar1が式(IV)であり
(3)
R5がフェニル基(該フェニル基は下記式(V)から(XXII)
(4)
R7がフェニル基(該フェニル基は、メチル基、t−ブチル基、ハロゲン原子、メトキシ基、トリフルオロメチル基又はトリフルオロメトキシ基で置換されている。)である(3)記載の化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物。
(5)
R1がメチル基である(4)記載の化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物。
(6)
R5が下記式(V)で表される置換基で置換されているフェニル基である(5)記載の化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物。
(1)から(15)のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅剤。
(17)
(1)から(15)のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物の存在下、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を生体外で培養することを特徴とする造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(18)
増幅される造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞が、CD34陽性細胞である(17)に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(19)
増幅される造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞が、CD34陽性CD38陰性細胞である(17)に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(20)
増幅される造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞が、HPP−CFUコロニー形成細胞である(17)に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(21)
増幅される造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞が、SRCである(17)に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(22)
1種又は2種以上の血液細胞刺激因子の添加を伴う、(17)から(21)のいずれか1項に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(23)
血液細胞刺激因子が、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−11(IL−11)、flk2/flt3リガンド(FL)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、トロンボポエチン(TPO)及びエリスロポエチン(EPO)からなる群から選ばれる(22)に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(24)
血液細胞刺激因子が、幹細胞因子(SCF)及び/又はflk2/flt3リガンド(FL)である(23)に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(25)
造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の由来が骨髄、肝臓、脾臓、末梢血或いは臍帯血である、(17)から(24)のいずれか1項に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(26)
造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の由来が臍帯血である(25)に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(27)
幹細胞因子(SCF)及び/又はflk2/flt3リガンド(FL)との共存下で臍帯血由来の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を培養する(26)に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
(28)
(1)から(15)のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅用試薬又は試薬キット。
(29)
(1)から(15)のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容される塩又はそれらの溶媒和物の存在下、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を生体外で培養しながら当該細胞に遺伝子を導入する、又は遺伝子を導入した造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞に対し前記培養を行い増幅することを特徴とする形質転換された造血幹細胞の製造方法。
(30)
1種又は2種以上の血液細胞刺激因子の添加を伴う(29)に記載の形質転換された造血幹細胞の製造方法。
(31)
血液細胞刺激因子が、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−11(IL−11)、flk2/flt3リガンド(FL)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、トロンボポエチン(TPO)及びエリスロポエチン(EPO)からなる群から選ばれる(30)に記載の形質転換された造血幹細胞の製造方法。
(32)
造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の由来が骨髄、肝臓、脾臓、末梢血或いは臍帯血である、(29)から(31)のいずれか1項に記載の形質転換された造血幹細胞の製造方法。
(33)
(17)から(27)のいずれか1項に記載の方法により増幅された造血幹細胞。
(34)
(29)から(32)のいずれか1項に記載の方法により製造された、形質転換された造血幹細胞。
(35)
(17)から(27)のいずれか1項に記載の方法により増幅した造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞をヒトに移植し、疾患を治療する細胞治療用材料。
(36)
(29)から(32)のいずれか1項に記載の方法により製造された、形質転換された造血幹細胞をヒトに移植し、疾患を治療する細胞治療用材料。
(37)
(1)から(15)の何れか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する医薬。
(38)
治療される疾患が、白血病、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、遺伝性血液疾患、固形腫瘍、自己免疫疾患、免疫不全症、糖尿病、神経損傷、筋肉損傷、脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症のいずれかである(35)又は(36)に記載の細胞治療用材料若しくは(37)に記載の医薬。
に関するものである。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
その他、疾患遺伝子の発現を抑制するRNA遺伝子も治療用の遺伝子として有効であり、本発明の化合物を用いた遺伝子導入に利用可能である。その例としては、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA、デコイRNA、リボザイムなどが挙げられる。
本発明に使用する化合物中「n」はノルマルを「i」はイソを「s」はセカンダリーを「t」はターシャリーを「c」はシクロを「o」はオルトを「m」はメタを「p」はパラを意味し、「Ph」はフェニル、「Py」はピリジル、「Naphthyl」はナフチル、「Me」はメチル、「Et」はエチル、「Pr」はプロピル、「Bu」はブチルを意味する。
まず、置換基R1からR20及びV1からV7など本明細書に記載の各置換基における語句について説明する。
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
C1−6アルキル基としては、直鎖、分枝若しくはC3−6シクロアルキル基を含んでいてもよい。その具体例としては、上記の例示に加え、n−ブチル、i−ブチル、s−ブチル、t−ブチル、c−ブチル、1−メチル−c−プロピル、2−メチル−c−プロピル、n−ペンチル、1−メチル−n−ブチル、2−メチル−n−ブチル、3−メチル−n−ブチル、1,1−ジメチル−n−プロピル、1,2−ジメチル−n−プロピル、2,2−ジメチル−n−プロピル、1−エチル−n−プロピル、c−ペンチル、1−メチル−c−ブチル、2−メチル−c−ブチル、3−メチル−c−ブチル、1,2−ジメチル−c−プロピル、2,3−ジメチル−c−プロピル、1−エチル−c−プロピル、2−エチル−c−プロピル、n−ヘキシル、1−メチル−n−ペンチル、2−メチル−n−ペンチル、3−メチル−n−ペンチル、4−メチル−n−ペンチル、1,1−ジメチル−n−ブチル、1,2−ジメチル−n−ブチル、1,3−ジメチル−n−ブチル、2,2−ジメチル−n−ブチル、2,3−ジメチル−n−ブチル、3,3−ジメチル−n−ブチル、1−エチル−n−ブチル、2−エチル−n−ブチル、1,1,2−トリメチル−n−プロピル、1,2,2−トリメチル−n−プロピル、1−エチル−1−メチル−n−プロピル、1−エチル−2−メチル−n−プロピル、c−ヘキシル、1−メチル−c−ペンチル、2−メチル−c−ペンチル、3−メチル−c−ペンチル、1−エチル−c−ブチル、2−エチル−c−ブチル、3−エチル−c−ブチル、1,2−ジメチル−c−ブチル、1,3−ジメチル−c−ブチル、2,2−ジメチル−c−ブチル、2,3−ジメチル−c−ブチル、2,4−ジメチル−c−ブチル、3,3−ジメチル−c−ブチル、1−n−プロピル−c−プロピル、2−n−プロピル−c−プロピル、1−i−プロピル−c−プロピル、2−i−プロピル−c−プロピル、1,2,2−トリメチル−c−プロピル、1,2,3−トリメチル−c−プロピル、2,2,3−トリメチル−c−プロピル、1−エチル−2−メチル−c−プロピル、2−エチル−1−メチル−c−プロピル、2−エチル−2−メチル−c−プロピル、2−エチル−3−メチル−c−プロピル等が挙げられる。
C1−10アルコキシ基としては直鎖、分枝若しくはC3−10シクロアルコキシ基を含んでいてもよい。その具体例としては、上記の例示に加え、
1−メチル−1−エチル−n−ペンチルオキシ、1−ヘプチルオキシ、2−ヘプチルオキシ、1−エチル−1,2−ジメチル−n−プロピルオキシ、1−エチル−2,2−ジメチル−n−プロピルオキシ、1−オクチルオキシ、3−オクチルオキシ、4−メチル−3−n−ヘプチルオキシ、6−メチル−2−n−ヘプチルオキシ、2−プロピル−1−n−ヘプチルオキシ、2,4,4−トリメチル−1−n−ペンチルオキシ、1−ノニルオキシ、2−ノニルオキシ、2,6−ジメチル−4−n−ヘプチルオキシ、3−エチル−2,2−ジメチル−3−n−ペンチルオキシ、3,5,5−トリメチル−1−n−へキシルオキシ、1−デシルオキシ、2−デシルオキシ、4−デシルオキシ、3,7−ジメチル−1−n−オクチルオキシ、3,7−ジメチル−3−n−オクチルオキシ等が挙げられる。
C2−9ヘテロシクリル基としては、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子の中から自由に選ばれる1つ以上の原子と2つ乃至9つの炭素原子からなる単環又は縮環二環性の複素環基が挙げられ、具体的には、
R1の好ましい例としては水素原子、C1−6アルキル基(該C1−6アルキル基はハロゲン原子で置換されていてもよい)が挙げられ、より好ましい例としては、水素原子、C1−3アルキル基が挙げられ、特に好ましい例としてはメチル基が挙げられる。
R7の好ましい例としては、C2−14アリール基(該C2−14アリール基は、C1−10アルキル基(該C1−10アルキル基はハロゲン原子で置換されていてもよい。)、ハロゲン原子、C1−10アルコキシ基又はC1−3アルコキシ基(該C1−3アルコキシ基はハロゲン原子で任意に置換されている。)で任意に置換されていてもよい。)が挙げられ、より好ましい例としては、フェニル基(該フェニル基は、C1−10アルキル基(該C1−10アルキル基はハロゲン原子で置換されていてもよい。)、ハロゲン原子、C1−10アルコキシ基又はC1−3アルコキシ基(該C1−3アルコキシ基はハロゲン原子で任意に置換されている。)で任意に置換されていてもよい。)が挙げられる。
特に好ましい例としては、フェニル基(該フェニル基は、C1−6アルキル基、C1−3アルキル基(該C1−3アルキル基はハロゲン原子で任意に置換されている。)ハロゲン原子、C1−3アルコキシ基又はC1−3アルコキシ基(該C1−3アルコキシ基はハロゲン原子で任意に置換されている。)で任意に置換されていてもよい。)が挙げられる。
より具体的に特に好ましい例を挙げれば、フェニル基(該フェニル基はメチル基、t-ブチル基、ハロゲン原子、メトキシ基、トリフルオロメチル基又はトリフルオロメトキシ基で任意に置換されている。)が挙げられる。
Ar1の好ましい例としては下記式(IV)で表される構造が挙げられ
Ra、A及びQ’が以下に示す第1表に記載の組み合わせからなる化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物。なお第1−1表〜第1−4表における記号は以下の置換基を示す。
なお実施例中、LC/MSは液体クロマトグラフィー質量分析を、(v/v)は(体積/体積)を、THFはテトロヒドロフランを、DMSOはジメチルスルホキシドを意味する。また、LC/MSは以下の条件で測定した。
カラム:Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column
溶離液:0.1v/v%ギ酸水溶液/0.1v/v%ギ酸アセトニトリル溶液=(90/10→10/90)
溶離液流速:0.4ml/min.(固定)
AD13−06の合成
1)AD13−03の合成
4−シアノベンゼンスルホニルクロリド AD13−01 1.0g(5mmol)を塩化メチレン25mLに溶解させ、室温にて2−(2−アミノエトキシ)エタノール AD13−02 595μL(6mmol)及びトリエチルアミン832μL(6mmol)を加え、一晩攪拌した。反応溶液を水25mLで希釈した後、分配した。水層を塩化メチレン50mLで抽出した。有機層を併せ、1mol/L塩酸30mLで2回、水30mL及び飽和食塩水30mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル30g、ヘキサン:酢酸エチル=50:50〜0:100)で精製し、1.19g(4.4mmol、収率88%)のAD13−03を得た。
2)AD13−04の合成
AD13−03 920mg(3.4mmol)をエタノール17mLに溶解させ、28%アンモニア水3.4mLを加えた。アルゴン雰囲気下、ラネーニッケル1.7mLを加え、水素雰囲気下、室温にて20時間攪拌した。系中をアルゴン置換した後、セライトろ過した。残渣をエタノール100mLで洗浄後、ろ液と洗液を併せ、減圧下濃縮し、AD13−04を得た。
3)AD13−05の合成
AD13−04 750mg(2.73mmol)をテトラヒドロフラン(THF)10mLに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及びメチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC) 671mg(3.28mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液に1mol/L塩酸40mLを5分かけて加えた後、酢酸エチル50mLで2回抽出した。有機層を併せた後、飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル30g、塩化メチレン:メタノール=98:2〜95:5)で精製し、806mg(1.82mmol、収率67%)のAD13−05を得た。
4)AD13−06の合成
AD13−05 800mg(1.8mmol)をエタノール10mLに溶解させ、ヒドラジン一水和物2.5mLを加え、70℃にて15時間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、シリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル60g、塩化メチレン:メタノール=98:2〜90:10)にて精製した固体を酢酸エチル10mLで懸洗した後、減圧下乾燥し、453mg(1.0mmol、収率57%)のAD13−06を得た。
AD14−06の合成
1)AD14−02の合成
4−アミノメチル安息香酸 AD14−01 15g(100mmol)を水150mLに懸濁させ、炭酸カリウム30gを加えて、氷冷下、二炭酸ジ−tert−ブチル28mL(120mmol)を滴下した。40℃で3時間攪拌し、室温で一晩攪拌した。水50mL、クエン酸40gを加えて析出した結晶をろ取、水50mLで洗浄して減圧下乾燥し、29.71g(定量的)のAD14−02の粗生成物を得た。
2)AD14−03の合成
AD14−02 1.0g(4.0mmol)を塩化メチレン(ペプチド合成用)20mLに懸濁させ、室温にてカルボニルビスイミダゾール(CDI) 800mg(5.0mmol)を加え40分攪拌した後、2−ピコリルアミン1.0mL(10mmol)を加え、さらに一晩攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及び塩化メチレン30mLを加え分配した。有機層を飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を塩化メチレン5mL及びメタノール5mLに溶解した後、シリカゲル3gを加え、減圧下濃縮した。得られたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=100:0〜10:1)にて精製し、1.16g(3.4mmol、収率85%)のAD14−03を得た。
3)AD14−05の合成
AD14−03 1.16g(3.4mmol)を1,4−ジオキサン20mLに溶解させ、室温にて4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、17時間攪拌した後、減圧下濃縮し、AD14−04を得た。得られたAD14−04に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及びテトラヒドロフラン(THF)20mLを加えた後、メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC) 690mg(3.4mmol)を加え、室温にて18時間攪拌した。析出した結晶をろ取し、水50mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、850mg(2.1mmol、収率62%)のAD14−05を得た。
4)AD14−06の合成
AD14−05 730mg(1.8mmol)をエタノール15mLに溶解させ、ヒドラジン一水和物2.0mLを加え、80℃にて一晩攪拌した。析出した結晶をろ取し、エタノール40mLで洗浄した後、減圧下乾燥した。得られた結晶を水10mLで懸洗した後、減圧下乾燥し、545mg(1.3mmol、収率72%)のAD14−06を得た。
AD15−04の合成
1)AD15−01の合成
AD14−02 1.0g(4.0mmol)を塩化メチレン(ペプチド合成用)20mLに懸濁させ、室温にてカルボニルビスイミダゾール(CDI) 800mg(5.0mmol)を加え40分攪拌した後、フルフリルアミン920μL(10mmol)を加え、さらに一晩攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及び塩化メチレン30mLを加え分配した。有機層を飽和食塩水20mLで洗浄後無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を塩化メチレン5mL及びメタノール5mLに溶解した後、シリカゲル3gを加え、減圧下濃縮した。得られたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=100:0〜10:1)にて精製し、1.05g(3.2mmol、収率80%)の AD15−01を得た。
2)AD15−03の合成
AD15−01 1.05g(3.2mmol)を1,4−ジオキサン20mLに溶解させ、室温にて4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、17時間攪拌した後、減圧下濃縮し、AD15−02を得た。得られたAD15−02に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及びテトラヒドロフラン(THF)20mLを加えた後、メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC) 650mg(3.2mmol)を加え、室温にて18時間攪拌した。析出した結晶をろ取し、水50mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、960mg(2.4mmol、収率75%)のAD15−03 を得た。
3)AD15−04の合成
AD15−03 840mg(2.1mmol)をエタノール15mLに溶解させ、ヒドラジン一水和物2.0mLを加え、80℃にて二晩攪拌した。析出した結晶をろ取し、エタノール40mLで洗浄した後、減圧下乾燥した。得られた結晶を水10mLで懸洗した後、減圧下乾燥し、644mg(1.6mmol、収率76%)のAD15−04を得た。
AD16−04の合成
1)AD16−01の合成
AD14−02 1.0g(4.0mmol)を塩化メチレン(ペプチド合成用)20 mLに懸濁させ、室温にてカルボニルビスイミダゾール(CDI) 800mg(5.0mmol)を加え40分攪拌した後、テトラヒドロフルフリルアミン1.0mL(10mmol)を加え、さらに一晩攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及び塩化メチレン30mLを加え分配した。有機層を飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を塩化メチレン5mL及びメタノール5mLに溶解した後、シリカゲル3gを加え、減圧下濃縮した。得られたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=100:0〜10:1)にて精製し、1.09g(3.3mmol、収率86%)のAD16−01を得た。
2)AD16−03の合成
AD16−01 1.0g(3.0mmol)を1,4−ジオキサン20mLに溶解させ、室温にて4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、17時間攪拌した後、減圧下濃縮し、AD16−02を得た。得られたAD16−02に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及びテトラヒドロフラン(THF)20mLを加えた後、メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC) 610mg(3.0mmol)を加え、室温にて18時間攪拌した。析出した結晶をろ取し、水50mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、807mg(2.0mmol、収率67%)のAD16−03を得た。
3)AD16−04の合成
AD16−03 680mg(1.7mmol)をエタノール15mLに溶解させ、ヒドラジン一水和物2.0mLを加え、80℃にて二晩攪拌した。析出した結晶をろ取し、エタノール40mLで洗浄した後、減圧下乾燥した。得られた結晶を水10mLで懸洗した後、減圧下乾燥し、425mg(1.1mmol、収率65%)のAD16−04を得た。
AD17−04の合成
1)AD17−01の合成
AD14−02 2.0g(8.0mmol)を塩化メチレン40mLに懸濁させ、室温にてカルボニルビスイミダゾール(CDI)1.6g(10mmol)を加え1時間攪拌した。反応溶液に2−アミノエタノール1.8mL(30mmol)を加え、さらに一晩攪拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液40mL、水20mL及び塩化メチレン200mLを加え分配した。有機層を2mol/L塩酸40mL、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液40mL、飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。さらに、分配した水層から、酢酸エチル200mLで抽出し同様の洗浄、乾燥操作後、濃縮した。得られた残渣を合わせて塩化メチレン5mL及びメタノール5mLに溶解した後、シリカゲル3gを加え、減圧下濃縮した。得られた残渣をそれぞれ、シリカゲル5gにまぶした後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、塩化メチレン:メタノール=1:0〜10:1)にて精製し、計1.67g(5.7mmol、収率71%)のAD17−01を得た。
2)AD17−03の合成
AD17−01 1.67g(5.67mmol)を1,4−ジオキサン20mLに溶解させ、室温にて4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、一晩攪拌した後、減圧下濃縮し、AD17−02を塩酸塩として得た。
これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50mL、テトラヒドロフラン(THF)50mL及びメチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)1.16g(5.67mmol)を加え、室温にて24時間攪拌した。反応溶液に水100mLを加え、析出した結晶をろ取し、水50mLで洗浄後、減圧下乾燥し、1.37g(3.8mmol、2工程収率67%)のAD17−03を得た。
3)AD17−04の合成
AD17−031.35g(3.7mmol)をエタノール30mLに溶解させ、室温にてヒドラジン一水和物4mL(80mmol)を加え、80℃にて一晩攪拌した。反応溶液を氷冷後析出した結晶をろ取し、エタノール40mLで洗浄した。得られた結晶を水20mLにて懸洗した後、減圧下乾燥した。本反応及び後処理を3回繰り返し(計4回)、1.11g(3.1mmol、収率84%)のAD17−04を得た。
AD20−04の合成
1)AD20−01の合成
AD14−02 1.0g(4.0mmol)を塩化メチレン(ペプチド合成用)20mLに懸濁させ、室温にてカルボニルビスイミダゾール(CDI)800mg(5.0mmol)を加え40分攪拌した後、1−[2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチル]ピペラジン1.6mL(10mmol)を加え、さらに一晩攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及び塩化メチレン30mLを加え分配した。有機層を飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を塩化メチレン5mL及びメタノール5mLに溶解した後、シリカゲル3gを加え、減圧下濃縮した。得られたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=100:0〜10:1)にて精製し、947mg(2.3 mmol、収率58%)のAD20−01を得た。
2)AD−20−03の合成
AD20−01 940mg(2.31mmol)を1,4−ジオキサン20mLに溶解させ、室温にて4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、19 時間攪拌した後、減圧下濃縮してAD20−02を得た。得られたAD20−02に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及びテトラヒドロフラン(THF)20mLを加えた後、メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)460mg(2.31mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。水50mLを加え析出した結晶をろ取し、水20mLで洗浄した後、減圧下乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、塩化メチレン:メタノール=100:0〜10:1)にて精製し、352mg(0.74mmol、収率32%)のAD20−03を得た。
3)AD20−04の合成
AD20−03 850mg(1.8mmol)をエタノール15mLに溶解させ、ヒドラジン一水和物2.0mLを加え、80℃にて三晩攪拌した。減圧下濃縮し、まぶしたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール:アンモニア水=10:1:0〜10:2:0.2)にて精製し、585mg(1.2mmol、収率68%)のAD20−04を得た。
AD21−04の合成
1)AD21−01の合成
AD14−02 1.0g(4.0mmol)を塩化メチレン(ペプチド合成用)20mLに懸濁させ、室温にてカルボニルビスイミダゾール(CDI)800mg(5.0mmol)を加え40分攪拌した後、N−(2−アミノエチル)モルホリン1.3mL(10mmol)を加え、さらに一晩攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及び塩化メチレン30mLを加え分配した。有機層を飽和食塩水20mLで洗浄後無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を塩化メチレン5mL及びメタノール5mLに溶解した後、シリカゲル3gを加え、減圧下濃縮した。得られたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=100:0〜10:1)にて精製し、1.05g(2.9mmol、収率73%)のAD21−01を得た。
2)AD21−03の合成
AD21−01 1.0g(2.75mmol)を1,4−ジオキサン20mLに溶解させ、室温にて4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、19時間攪拌した後、減圧下濃縮し、AD21−02を得た。得られたAD21−02に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及びテトラヒドロフラン(THF)20mLを加えた後、メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)560mg(2.0mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。水50mLを加え析出した結晶をろ取し、水50mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、843mg(2.0mmol、収率73%)のAD21−03を得た。
3)AD21−04の合成
AD21−03 827mg(1.9mmol)をエタノール15mLに溶解させ、ヒドラジン一水和物2.0mLを加え、80℃にて二晩攪拌した。析出した結晶をろ取し、エタノール40mLで洗浄した後、減圧下乾燥した。得られた結晶を水20mLで懸洗した後、減圧下乾燥し、429mg(1.0mmol、収率53%)のAD21−04を得た。
AD22−04の合成
1)AD22−01の合成
N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)エチレンジアミン600mg(4.0mmol)をDMF50mLに溶かし、別途合成したAD14−02 1.0g(4.0mmol)及び4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウム クロライド(DMT−MM) 1.25g(4.0mmol)を加え、室温にて16時間攪拌した後、減圧下濃縮した。得られた残渣をメタノール5mLに溶解した後、シリカゲル5gを加え、減圧下濃縮した。得られたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、塩化メチレン:メタノール=100:0〜2:1)にて精製し、732mg(1.9mmol、収率48%)のAD22−01を得た。
2)AD22−03の合成
AD22−01 630mg(1.6mmol)にトリフルオロ酢酸15mLを加え、室温にて1時間攪拌した後、減圧下濃縮した。得られた残渣をメタノール5mLに溶解した後、シリカゲル3gを加え、減圧下濃縮した。まぶしたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=1:1)にて精製し、565mgのAD22−02を得た。得られたAD22−02をDMF20mLに溶解させ、別途合成したAD18−03 573mg(2.0mmol)及び4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウム クロライド(DMT−MM) 628mg(2.0mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を塩化メチレン50mL及びメタノール50mLに溶解した後、シリカゲル5gを加え、減圧下濃縮した。まぶしたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、塩化メチレン:メタノール=1:0〜5:1)にて精製し、595mg(1.1mmol、2段階収率69%)のAD22−03を得た。
3)AD22−04の合成
AD22−03 360mg(0.7mmol)にトリフルオロ酢酸3mLを加え、室温にて2時間攪拌した後、減圧下濃縮した。得られた残渣をメタノール10mLに溶解した後、シリカゲル1gを加え、減圧下濃縮した。まぶしたシリカゲルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=1:1)にて精製し、243mg(0.5mmol、収率74%)のAD22−04を得た。
AD23−04の合成
1)AD23−01の合成
AD18−04 5.0g(17.5mmol)に塩化チオニル50mLを加え、1時間加熱還流した。反応溶液を減圧下濃縮した。本酸クロリドはそのまま次の反応に使用した。tert−ブチル 4−(2−アミノエチル)テトラヒドロ−1(2H)−ピラジンカルボン酸エステル3.4g(15mmol)を塩化メチレン100mLに溶解させ、水100mL、炭酸水素ナトリウム2g及び合成した酸クロリドを加え、室温にて1日攪拌した。反応溶液に塩化メチレン100mLを加えた後、分配し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した。得られた残渣をシリカゲル10gにまぶした後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル125g、塩化メチレン:メタノール=1:0〜5:1)にて精製し、4.24g(8.5mmol、収率49%)のAD23−01を得た。
2)AD23−02の合成
AD23−01 4.24g(8.5mmol)をメタノール100mLに溶解させ、アルゴン雰囲気下、10%パラジウム炭素(50%wet)2.0gを加えた後、水素雰囲気下にて一晩攪拌した。反応系中をアルゴン置換した後、ろ過し、残渣をメタノールで洗浄後、ろ液及び洗液を併せ減圧下濃縮した。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、塩化メチレン:メタノール=1:0〜20:1)にて精製し、2.71g(7.5mmol、収率88%)のAD23−02を得た。
3)AD23−03の合成
AD23−02 をテトラヒドロフラン(THF)50mLに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50mL及びメチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)1.84g(9mmol)を加え、一晩攪拌した。反応溶液に水100mLを加え、析出した結晶をろ取した。得られた結晶を水100mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、3.02g(5.7mmol、76%)のAD23−03を得た。
4)AD23−04の合成
AD23−03 1g(1.9mmol)をエタノール20mLに溶解させ、室温にてヒドラジン一水和物2mLを加え、70℃にて20時間攪拌した。氷冷し、析出した結晶をろ過し、エタノール20mL、水30mLで洗浄後、減圧下乾燥し、540mg(1.0mmol、収率53%)のAD23−04を得た。
AD24−01の合成
参考合成例9で合成したAD23−04 597mg(1.1mmol)にトリフルオロ酢酸10mLを加え、室温にて1時間攪拌した。反応溶液をアルゴンガスでバブリングした後、減圧下濃縮した。残渣をメタノール10mLで3回共沸した。得られた残渣をシリカゲル3gにまぶした後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=1:1)にて精製した後、塩化メチレン20mLにて懸洗し、減圧下乾燥することによって、450mg(1.0mmol、収率91%)のAD24−01を得た。
AD25−08の合成
1)AD25−02の合成
ジエチレングリコールモノメチルエーテル(AD25−01)11.8g(100mmol)を塩化メチレン100mLに溶解させ、室温にてピリジン20mL(250mmol)及びp−トルエンスルホニルクロリド24g(125mmol)を加え、3時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレン300mLで希釈した後、水200mL及び飽和食塩水200mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル300g、ヘキサン:酢酸エチル=3:1〜2:1)にて精製し、22.8g(82.8mmol、収率83%)のAD25−02を得た。
2)AD25−03の合成
AD25−02 22.8g(82.8mmol)をDMF150mLに溶解させた後、アジ化ナトリウム6.5gを加え、50℃にて23時間攪拌した。反応溶液を放冷した後、水300mL及び酢酸エチル150mLを加え、分配した。水層を酢酸エチル150mLで2回抽出した後、有機層を併せ、水100mLで3回及び飽和食塩水100mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮し、9.33g(64mmol、収率78%)のAD25−03を得た。
3)AD25−04の合成
AD25−03 1.0g(6.9mmol)をテトラヒドロフラン(THF)60mLに溶解させ、水0.5mL及びトリフェニルホスフィンポリスチレン9g(10mmol)を加え、2.5時間加熱還流した。反応溶液を放冷した後、レジンをろ過した。レジンを酢酸エチル100mLで洗浄後、ろ液と洗液を併せ、減圧下濃縮し、896mgの AD25−04を得た。
4)AD25−05の合成
AD25−04 896mgを塩化メチレン35mLに溶解させ、別途合成したAD14−02 2.08g(8.28mmol)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI)1.59g(8.28mmol)を加え、室温にて5時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレン70mLで希釈した後、1mol/L塩酸20mL、水20mL、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL、水20mL及び飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル100g、ヘキサン:酢酸エチル=50:50〜0:100)で精製し、1.33g(3.8mmol、2工程収率55%)のAD25−05を得た。
5)AD25−06の合成
AD25−05 1.33g(3.8mmol)を1,4−ジオキサン10mLに溶解させた後、4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、AD25−06を得た。
6)AD25−07の合成
AD25−06 をテトラヒドロフラン(THF)18mLに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液72mL及びメチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)1.13g(5.5mmol)を加え、一晩攪拌した。反応溶液に水100mLを加え、析出した結晶をろ取した。得られた結晶を水100mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、1.28g(3.06mmol、2工程収率81%)のAD25−07を得た。
7)AD25−08の合成
AD25−07 420mg(1mmol)をエタノール5mLに溶解させ、室温にてヒドラジン一水和物1mLを加え、70℃にて15時間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、水20mLを加えた。析出した結晶をろ過し、水30mLで洗浄後、減圧下乾燥し、316mg(0.75mmol、収率75%)のAD25−08を得た。
AD26−08の合成
1)AD26−02の合成
ジエチレングリコールモノブチルエーテル(AD26−01)3.4g(20mmol)を塩化メチレン20mLに溶解させ、室温にてピリジン4mL(50mmol)及びp−トルエンスルホニルクロリド4.8g(25mmol)を加え、3時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレン100mLで希釈した後、水50mL及び飽和食塩水50mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル300g、ヘキサン:酢酸エチル=3:1〜2:1)にて精製し、3.61g(11.4mmol、収率57%)のAD26−02を得た。
2)AD26−03の合成
AD26−02 3.6g(11.4mmol)をDMF23mLに溶解させた後、アジ化ナトリウム890mg(13.7mmol)を加え、50℃にて1日攪拌した。反応溶液を放冷した後、水56mL及びジエチルエーテル50mLを加え、分配した。水層をジエチルエーテル50mLで2回抽出した後、有機層を併せ、水30mLで3回及び飽和食塩水30mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮し、2.05g(10.9mmol、収率96%)のAD26−03を得た。
3)AD26−04の合成
AD26−03 1.3g(6.9mmol)をテトラヒドロフラン(THF)50mLに溶解させ、水0.5mL及びトリフェニルホスフィンポリスチレン9g(10mmol)を加え、2.5時間加熱還流した。反応溶液を放冷した後、レジンをろ過した。レジンを酢酸エチル100mLで洗浄後、ろ液と洗液を併せ、減圧下濃縮し、1.52gのAD26−04を得た。
4)AD26−05の合成
AD26−04 1.52gを塩化メチレン35mLに溶解させ、別途合成したAD14−02 2.08g(8.28mmol)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI)1.59g(8.28mmol)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応溶液塩化メチレン70mLで希釈した後、1mol/L塩酸20mL、水20mL、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL、水20mL及び飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル100g、ヘキサン:酢酸エチル=60:40〜10:90)で精製し、1.93g(4.9mmol、2工程収率71%)のAD26−05を得た。
5)AD26−06の合成
AD26−05 1.93g(4.9mmol)を1,4−ジオキサン10mLに溶解させた後、4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、AD26−06を得た。
6)AD26−07の合成
AD26−06 をテトラヒドロフラン(THF)24mLに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液96mL及びメチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)1.47g(7.2mmol)を加え、一晩攪拌した。反応溶液に水100mLを加え、析出した結晶をろ取した。得られた結晶を水100mLで洗浄した。得られた結晶を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50mLで懸洗し、ろ過した後、結晶を水200mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、2.13g(4.8mmol、2工程収率94%)のAD26−07を得た。
7)AD26−08の合成
AD26−07 462mg(1.0mmol)をエタノール5mLに溶解させ、室温にてヒドラジン一水和物2mLを加え、70℃にて15時間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、水20mLを加えた。析出した結晶をろ過し、水40mLで洗浄後、減圧下乾燥し、400mg(0.87mmol、収率87%)のAD26−08を得た。
AD27−08の合成
1)AD27−02の合成
ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル(AD27−01)4.0g(20mmol)を塩化メチレン20mLに溶解させ、室温にてピリジン4mL(50mmol)及びp−トルエンスルホニルクロリド4.8g(25mmol)を加え、3時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレン100mLで希釈した後、水50mL及び飽和食塩水50mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル150g、ヘキサン:酢酸エチル=9:1〜2:1)にて精製し、4.91g(14.2mmol、収率71%)のAD27−02を得た。
2)AD27−03の合成
AD27−02 4.9g(14.2mmol)をDMF28mLに溶解させた後、アジ化ナトリウム1.1g(17mmol)を加え、50℃にて1日攪拌した。反応溶液を放冷した後、水56mL及びジエチルエーテル50mLを加え、分配した。水層をジエチルエーテル50mLで2回抽出した後、有機層を併せ、水30mLで3回及び飽和食塩水30mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮し、2.92g(13.5mmol、収率96%)のAD27−03を得た。
3)AD27−04の合成
AD27−03 1.5g(6.9mmol)をテトラヒドロフラン(THF)50mLに溶解させ、水0.5mL及びトリフェニルホスフィンポリスチレン9g(10mmol)を加え、2.5時間加熱還流した。反応溶液を放冷した後、レジンをろ過した。レジンを酢酸エチル100mLで洗浄後、ろ液と洗液を併せ、減圧下濃縮し、1.94gのAD27−04を得た。
4)AD27−05の合成
AD27−04 1.94gを塩化メチレン35mLに溶解させ、別途合成したAD14−02 2.08g(8.28mmol)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI)1.59g(8.28mmol)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレン70mLで希釈した後、1mol/L塩酸20mL、水20mL、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL、水20mL及び飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル100g、ヘキサン:酢酸エチル=60:40〜10:90)で精製し、2.16g(5.1mmol、2工程収率74%)のAD27−05を得た。
5)AD27−06の合成
AD27−05 2.16g(5.1mmol)を1,4−ジオキサン10mLに溶解させた後、4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、AD27−06を得た。
6)AD27−07の合成
AD27−06をテトラヒドロフラン(THF)25mLに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mL及びメチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)1.56g(7.7mmol)を加え、一晩攪拌した。反応溶液に水100mLを加え、析出した結晶をろ取した。得られた結晶を水100mLで洗浄した。得られた結晶を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50mLで懸洗し、ろ過した後、結晶を水200mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、1.91g(3.9mmol、2工程収率76%)のAD27−07を得た。
7)AD27−08の合成
AD27−07 490mg(1.0mmol)をエタノール5mLに溶解させ、室温にてヒドラジン一水和物2mLを加え、70℃にて15時間攪拌した。反応溶液を室温まで放冷した後、水20mLを加えた。析出した結晶をろ過し、水40mLで洗浄後、減圧下乾燥し、400mg(0.86mmol、収率86%)のAD27−08を得た。
AD28−05の合成
1)AD28−01の合成
AD14−02 6.0g(22.8mmol)を塩化メチレン120mLに懸濁させ、室温にてカルボニルジイミダゾール4.8g(30mmol)を加えた。反応溶液を同温度で1時間攪拌した後、2−(2−アミノエトキシ)エタノール6.0mL(60mmol)を加え、さらに1時間攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液200mL及び酢酸エチル400mLを加え分配した後、有機層を飽和食塩水200mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル150g、塩化メチレン:メタノール=1:0〜9:1)にて精製し、7.9g(20.3mmol、収率89%)のAD28−01を得た。
2)AD28−04の合成
AD28−01 1.0g(2.96mmol)を1,4−ジオキサン20mLに溶解させ、室温にて4M塩酸/1,4−ジオキサン20mLを加え、2時間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、AD28−02を得た。得られたAD28−02を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及びテトラヒドロフラン(THF)5mLに溶解させ、モノメチルイソフタル酸エステルと塩化チオニルから合成したAD28−03をテトラヒドロフラン(THF)15mLに溶解させ加えた。一晩攪拌し、減圧下濃縮した。氷冷し析出した結晶をろ取した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、塩化メチレン:メタノール=1:0〜10:1)にて精製し、557mg(1.4mmol、収率47%、2ステップ)のAD28−04を得た。
3)AD28−05の合成
AD28−04 557mg(1.0mmol)をエタノール15mLに溶解させ、室温にてヒドラジン一水和物2mLを加え、80℃にて15時間攪拌した。反応溶液を室温まで放冷した後、減圧下濃縮し、水20mLを加えた。析出した結晶をろ過し、水10mLで洗浄後、減圧下乾燥し、399mg(1.0mmol、定量的)のAD28−05を得た。
AD29−02の合成
1)AD29−01の合成
AD28−02(2.96mmol)を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL及びテトラヒドロフラン(THF)20mLに溶解させ、テレフタル酸モノメチルクロリド590mg(2.96mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液に水50mLを加え、減圧下濃縮した。塩化メチレン100mLを加えて析出した結晶をろ取した。結晶を水50mLで洗浄して、620mg(1.5mmol、収率51%)のAD29−01を得た。
2)AD29−02の合成
AD29−01 557mg(1.0mmol)をエタノール15mLに溶解させ、室温にてヒドラジン一水和物2mLを加え、80℃にて15時間攪拌した。反応溶液を室温まで放冷した後、析出した結晶をろ取し、エタノール40mL、水20mLで洗浄後、減圧下乾燥し、394mg(1.0mmol、定量的)のAD29−02を得た。
AD30−04の合成
1)AD30−03の合成
5−メトキシカルボニル−2−ピリジンカルボン酸(AD30−01) (KeyOrganics社)1.0g(5.5mmol)に塩化チオニル10mLを加え、外温110℃にて1時間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、AD30−02を得た。AD28−02(4.44mmol)をテトラヒドロフラン(THF)15mLに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液75mL及びAD30−02を加えた後、室温にて2日間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、水50mL及び酢酸エチル100mLを加え分配した後、水層を酢酸エチル50mLで2回抽出した。有機層を併せ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50mL、水50mL及び飽和食塩水50mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮し、997mg(2.48mmol、収率45%)の AD30−03を得た。
2)AD30−04の合成
AD30−03 870mg(2.2mmol)をエタノール15mLに懸濁させ、室温にてヒドラジン一水和物2.5mLを加え、70℃にて一晩攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、水20mLを加えた。析出した結晶をろ過し、水20mLで洗浄後、減圧下乾燥し、531mg(1.32mmol、収率60%)のAD30−04 を得た。
AD31−02の合成
1)AD31−01の合成
AD28−02(2.96mmol)を塩化メチレン15mLに懸濁させ、室温にてジイソプロピルエチルアミン1mL(6mmol)、6−メトキシカルボニル−2−ピリジンカルボン酸536mg(3.0mmol)、ジメチルアミノピリジン370mg(4.5mmol)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI)863mg(4.5mmol)を加え、同温度で攪拌した。反応溶液を塩化メチレン100mLで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mL、水20mL及び飽和食塩水20mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、塩化メチレン:メタノール=99:1〜90:10)にて精製し、487mg(1.21mmol、収率41%)のAD31−01を得た。
2)AD31−02の合成
AD31−01 430mg(1.07mmol)をエタノール10mLに懸濁させ、室温にてヒドラジン一水和物2.0mLを加え、70℃にて一晩攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、水5mLを加えた。析出した結晶をろ過し、水20mLで洗浄後、減圧下乾燥し、379mg(0.95mmol、収率61%)のAD31−02を得た。
AD09−05の合成
1)AD09−02の合成
1−(N−Boc−アミノメチル)−4−(アミノメチル)ベンゼン4g(16.8mmol)を塩化メチレン80mLに溶解して、氷冷下、トリエチルアミン5.6mL(40mmol)、無水酢酸1.9mL(20mmol)を加えて室温で1時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレン100mLで希釈し、水100mL、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mL及び飽和食塩水100mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮し、AD09−02を得た。
2)AD09−03の合成
AD09−02を1,4−ジオキサン50mLに溶解させ、室温にて4M塩酸/1,4−ジオキサン50mLを加え、2時間攪拌した。析出した結晶をろ取し、ジオキサン50mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、4.31g(19.2mmol、定量的)のAD09−03を得た。
3)AD09−04の合成
AD09−03 1.3g(6.0mmol)を塩化メチレン50mLに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50mL及びメチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)1g(4.9mmol)を加え、室温にて2時間した。析出した結晶をろ取し、塩化メチレン100mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、1.35g(3.8mmol、収率63%)のAD09−04を得た。
4)AD09−05の合成
AD09−04 1.35g(3.8mmol)をエタノール26mLに溶解させ、ヒドラジン一水和物3.8mLを加え、70℃にて一晩攪拌した。析出した結晶をろ取し、エタノール30mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、1.21g(3.4mmol、収率90%)のAD09−05を得た。
AD10−02の合成
1)AD10−01の合成
AD28−02 3.72g(15.6mmol)を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mL及びテトラヒドロフラン(THF)100mLに溶解させ、メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)3.3g(16mmol)を加えた。30分攪拌し、水200mLを加えて、析出した結晶をろ取し、水150mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、4.76g(11.7mmol、収率75%)のAD10−01を得た。
2)AD10−02の合成
AD10−01 4.76g(11.7mmol)をエタノール100mLに溶解させ、室温にてヒドラジン一水和物 11 mL を加え、80 ℃にて15 時間攪拌した。反応溶液を室温まで放冷した後、減圧下濃縮し、水100mLを加えた。析出した結晶をろ過し、水50mLで洗浄後、減圧下乾燥し、4.02g(9.9mmol、収率84%)のAD10−02を得た。
AD11−07の合成
1)AD11−03の合成
4−ブロモメチルフェニル酢酸(AD11−01)4.37g(19mmol)に7Mアンモニア/メタノール90mLを加え、室温にて1時間攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、1mol/L水酸化ナトリウム60mLを加えた。混合物を減圧下濃縮した後、1,4−ジオキサン30mL及び水30mLに溶解させ、氷冷下、1mol/L水酸化ナトリウム25mL及び二炭酸ジ−tert−ブチル4.4mLを加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、10%クエン酸水溶液42mLをゆっくり加え、pH3に調整した。混合溶液を塩化メチレン200mLで3回抽出した後、有機層を併せ、飽和食塩水100mLで洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル100g、塩化メチレン:メタノール=98:2)で精製し、2.42g(9.1mmol、収率48%)のAD11−03を得た。
2)AD11−04の合成
AD11−03 1.86g(7.0mmol)を塩化メチレン18mLに溶解させ、室温にてカルボニルビスイミダゾール(CDI)1.25g(7.7mmol)を加え、同温度で1時間攪拌した。反応溶液に28%アンモニア水3.5mLを加え、同温度にてさらに一晩攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、メタノール30mLを加え、もう一度減圧下濃縮した。残渣に水30mLを加え、懸洗した後、減圧下乾燥し、1.76g(6.7mmol、収率95%)のAD11−04を得た。
3)AD11−05の合成
AD11−04 1.72g(6.5mmol)に4M塩酸/1,4−ジオキサン60mLを加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、酢酸エチル‐ヘキサンで懸洗した後、減圧下乾燥し、1.73gのAD11−05を得た。
4)AD11−06の合成
AD11−05 1.32g(6.6mmol)をテトラヒドロフラン(THF)30mLに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液120mL及びメチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)2.02g(9.9mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液に氷冷下、1mol/L塩酸100mLを加え、pH2に調整した後、析出した結晶をろ取した。結晶を水200mLで洗浄後、減圧下乾燥した。得られた固体をショートパスカラムクロマトグラフィー(シリカゲル20g、塩化メチレン:メタノール=9:1)に通し、2.37gのAD11−05を粗精製物として得た。得られた粗精製物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mLで懸洗し、1.64g(4.9mmol、収率75%)のAD11−06を得た。
5)AD11−07の合成
AD11−06 1.58g(4.75mmol)をエタノール25mLに溶解させ、ヒドラジン一水和物5mLを加え、80℃にて一晩攪拌した後、ヒドラジン一水和物5mLを追加し同温度でさらに一晩攪拌した。さらにヒドラジン一水和物5mLをもう一度追加し同温度で一晩攪拌した(ヒドラジン一水和物 計15mL)。反応溶液を室温まで放冷した後、析出した結晶をろ取し、エタノール20mLで洗浄後、減圧下乾燥し、1.47g(4.42mmol、収率93%)のAD11−07を得た。
下記に記載の化合物(参考合成例21から27)は、WO2004/108683又はUS2006094694に従って合成した。
メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)の合成
ジメチル チオフェン−2,5−ジカルボキシレート150g(749mmol)のトルエン溶液1350mLを130℃で共沸させ、150mL留去した。内温を70℃まで冷却し、2.5M水酸化カリウム/メタノール溶液を300mL加え、40分撹拌した。室温まで冷却し、析出した固体を酢酸エチルでろ過、洗浄し、減圧下乾燥することで、5−(メトキシカルボニル)−チオフェン−2−カルボン酸カリウムを160g得た。得られた5−(メトキシカルボニル)−チオフェン−2−カルボン酸カリウム100g(446mmol)の1,2−ジクロロエタン溶液700mLにN,N−ジメチルホルムアミド1.73mLを加えた後、90℃まで加熱し、塩化チオニル68.9g(119mmol)を滴下した。1時間還流させた後、室温まで冷却し、生じた固体を1,2−ジクロロエタン300mLを用いてろ別した。得られたろ液を濃縮乾固することで、メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)を90.4g(収率99%)得た。
形状:淡紫固体
AD18−03の合成
カルバジン酸tert−ブチル(AD18−01)5g(38mmol)を塩化メチレン100mLに溶解してトリエチルアミン7mL(50mmol)を加えた。反応溶液に氷冷下、メチル 5−(クロロカルボニル)チオフェン−2−カルボキシレート(TEC)5g(24.5mmol)を加え、室温にて1時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレン250mLで希釈し、2mol/L塩酸100mL、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mL及び飽和食塩水100mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後、減圧下濃縮し、AD18−02を得た。得られたAD18−02をメタノール100mLに溶解して、2mol/L水酸化ナトリウム水溶液100mLを加えて50℃で4時間攪拌した。減圧下濃縮し、氷冷してクエン酸20gを加えて析出した結晶をろ取し、水50mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、5.96g(21mmol、2段階収率55%)のAD18−03を得た。
AD18−04の合成
4−アミノメチル安息香酸17.23g(114mmol)の水175mL懸濁溶液に、室温にて水酸化ナトリウム13.7g(342mmol)を少しずつ加えた後、クロロギ酸ベンジル17.7mL(125mmol)を20分かけて滴下した。反応溶液を1日攪拌した後、2mol/L塩酸175mLを30分かけて滴下し、pH1に調整した。析出した結晶をろ取し、水150mLで洗浄した後、減圧下乾燥し、38.8g(定量的)のAD18−04を得た。
TCA1−13の合成
反応容器に参考合成例1で合成したAD13−06 66mg(0.15mmol)、参考合成例21で合成したBC−1 43mg(0.15mmol)及びDMSO0.5mLを入れ、外温100℃にて19時間加熱攪拌した。反応溶液を室温まで放冷した後、水5mLを加えた。析出した固体をろ取し、さらに水20mLでかけ洗いした後、減圧下乾燥し、94mg(0.132mmol、収率88%)のTCA1−13を得た。
形状:淡黄色固体
LC/MS(ESI+) m/z; 711, 713 [M+1]
LC/MS(ESI-) m/z; 709, 711 [M-1]
保持時間3.47(分)
合成例2から72は、合成例1と同様な方法で合成した。合成した化合物の形状及びLC/MSの観測ピーク、保持時間を第2−1表から第2−6表に示す。
次に、本発明化合物による造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅活性について以下試験した。なお、CO2インキュベーターにおけるCO2の濃度(%)は、雰囲気中のCO2の体積%で示した。
Lonza社より購入したヒト臍帯血のCD34陽性細胞を、24ウエルプレート(コーニング社製)にプレーティングした(10000細胞/1mL/ウエル)。用いた培地は、StemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)に、100ng/mLのSCF(和光純薬工業社製)を添加したものであり、さらに、ジメチルスルホキシド中に溶解したNo.1からNo.72のいずれかの化合物を最終濃度1或いは3μg/mLとなるように0.1%(v/v)添加した。この際、陽性対照としては最終濃度10ng/mLのTPO(PeproTech社製)を用いた。
化合物無添加時のCD34陽性細胞数を1としたときの、1或いは3μg/mLの化合物添加時の増幅率を示した結果を第3−1表と第3−2表に示す。なお、第3−1表と第3−2表中の増幅率は、化合物添加時の増幅率が6倍以上をA、増幅率4倍以上6倍未満をB、増幅率2倍以上4倍未満をCとして表す。また、化合物無添加時のCD34陽性CD38陰性細胞数を1としたときの、1或いは3μg/mLの化合物添加時の増幅率を示した結果を第4−1表と第4−2表に示す。なお、第4−1表と第4−2表中の増幅率は、化合物添加時の増幅率が10倍以上をA、増幅率5倍以上10倍未満をB、増幅率3倍以上5倍未満をCとして表す。更に表3において、陽性対照であるTPOに比べて2倍以上の増幅率を示した化合物については○印を記載した。
試験例1と同様に購入したヒト臍帯血のCD34陽性細胞を、24ウエルプレート(コーニング社製)にプレーティングした(10000細胞/1mL/ウエル)。用いた培地は、StemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)に、最終濃度100ng/mLのSCF(和光純薬工業社製)を添加したものであり、さらに、最終濃度10ng/mLのTPO(PeproTech社製)、最終濃度100ng/mLのFlt−3リガンド(FL、和光純薬工業社製)或いは最終濃度3μg/mLのNo.60の化合物を組み合わせて添加した。
化合物無添加時のCD34陽性CD38陰性細胞数を1としたときの、3μg/mLの化合物並びに各種サイトカイン添加時の増幅率を示した結果を第1図に示す。
本発明化合物であるNo.60及びNo.61の化合物の造血前駆細胞に関する作用を、血球コロニー形成法により測定した。最終濃度3μg/mLのNo.60或いはNo.61の化合物を添加し試験例1と同様に培養して調製した細胞培養液を、メソカルトGF H4435培地(Stem Cell Technologies社製)とともに3.5cmシャーレに500個細胞/シャーレとなる様に添加し、12日間、CO2インキュベーター(5%CO2、37℃)内で培養した。定法に従って、1シャーレあたりのHPP−CFCコロニー数を顕微鏡にて測定した。試験は3回以上行い、その平均値をHPP−CFCコロニー数として評価した。
その結果を第5表に示す。
試験例1と同様の方法にて、最終濃度100ng/mLSCF(Peprotech社製)及び最終濃度100ng/mLのFlt−3(和光純薬工業社製)を添加したStemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)に、更に最終濃度20ng/mLのTPO(Peprotech社製)又は最終濃度3μg/mLの化合物No.60を添加した条件でヒト臍帯血のCD34陽性細胞を1週間培養した。当該培養細胞を、致死量以下の放射線照射(2.5Gy)した7乃至8週齢NOD/SCIDマウスに尾静脈内注射にて初期のCD34陽性細胞数で換算して4×104個/匹あたりで5匹以上に移植した。移植後8週目に当該マウスを屠殺し、左右の大腿骨から骨髄細胞を採取した。引き続き、骨髄細胞をヒトCD45抗体(APC、ベクトンディッキンソン社製)にて染色した。染色された細胞を、2%(v/v)FBS含有PBS(−)溶液で洗浄した後、ヨウ化プロピジウム(シグマアルドリッチジャパン社製)を最終濃度5μg/mLになるように加えて染色した。染色された細胞をフローサイトメトリーにて解析して、マウス骨髄細胞中に含まれるヒトCD45陽性細胞率を算出した。その結果、本発明化合物は優れたSRC増幅作用を有し、造血幹細胞の増幅活性を有することが確認された。
培養していないヒト臍帯血のCD34陽性細胞を移植した際のマウス骨髄におけるヒトCD45陽性細胞率を1としたときの、3μg/mLのNo.60の化合物を添加して培養したCD34陽性細胞を移植した際のヒトCD45陽性細胞率を第2図に示す。
以下の成分を含有する顆粒剤を製造する
成分
式(I)で表される化合物 10mg
乳糖 700mg
コーンスターチ 274mg
HPC−L 16mg
──────────────────
計 1000mg
式(I)で表される化合物と乳糖を60メッシュのふるいに通す。コーンスターチを120メッシュのふるいに通す。これらをV型混合機にて混合する。混合末に低粘度ヒドロキシプロピルセルロース(HPC−L)水溶液を添加し、練合、造粒(押し出し造粒 孔径0.5〜1mm)した後、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい(12/60メッシュ)で篩過し顆粒剤を得る。
以下の成分を含有するカプセル充填用散剤を製造する。
成分
式(I)で表される化合物 10mg
乳糖 79mg
コーンスターチ 10mg
ステアリン酸マグネシウム 1mg
──────────────────
計 100mg
式(I)で表される化合物と乳糖を60メッシュのふるいに通す。コーンスターチを120メッシュのふるいに通す。これらとステアリン酸マグネシウムをV型混合機にて混合する。10倍散100mgを5号硬ゼラチンカプセルに充填する。
以下の成分を含有するカプセル充填用顆粒剤を製造する。
成分
式(I)で表される化合物 15mg
乳糖 90mg
コーンスターチ 42mg
HPC−L 3mg
──────────────────
計 150mg
式(I)で表される化合物と乳糖を60メッシュのふるいに通す。コーンスターチを120メッシュのふるいに通す。これらをV型混合機にて混合する。混合末に低粘度ヒドロキシプロピルセルロース(HPC−L)水溶液を添加し、練合、造粒した後、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい(12/60メッシュ)で篩過し整粒し、その150mgを4号硬ゼラチンカプセルに充填する。
以下の成分を含有する錠剤を製造する。
成分
式(I)で表される化合物 10mg
乳糖 90mg
微結晶セルロース 30mg
ステアリン酸マグネシウム 5mg
CMC−Na 15mg
──────────────────
計 150mg
式(I)で表される化合物と乳糖と微結晶セルロース、CMC−Na(カルボキシメチルセルロース ナトリウム塩)を60メッシュのふるいに通し、混合する。混合末にステアリン酸マグネシウムを添加し、製剤用混合末を得る。本混合末を直打し150mgの錠剤を得る。
静脈用製剤は次のように製造する。
式(I)で表される化合物 100mg
飽和脂肪酸グリセリド 1000mL
上記成分の溶液は通常、1分間に1mLの速度で患者に静脈内投与される。
なお、2009年6月4日に出願された日本特許出願2009−135495号の、明細書、特許請求の範囲、要約書及び図面の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (38)
- 式(I)
R5は、C2−14アリール基(該C2−14アリール基は、−V1(式中、−V1は−(CH2)m1M1NR8R9(式中、M1は−(C=O)−又は−(SO2)−を意味し、m1は0,1,2のいずれかの整数を表し、R8は水素原子又はC1−3アルキル基を意味し、m1=0の時R9は−(CH2)m2OR10(式中m2は1又は2の整数を表し、R10は水素原子、C1−3アルキル基又は−(CH2)m3T(式中m3は1又は2の整数を表し、Tは水酸基、C1−6アルコキシ基又はC1−6アルキル基を意味する。)を意味する。)、−(CH2)m4NR11R12(式中m4は1又は2の整数を表し、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子、−(CH2)m5Q(式中m5は1又は2の整数を表し、Qは、水酸基、C1−3アルコキシ基、−NR13R14(式中R13、R14はそれぞれ独立に水素原子、C1−3アルキル基を意味する。)を意味する。)を意味するか、又はR11及びR12が一緒になって−NR11R12として式(II)で表される置換基又は式(III)(式中R15は水素原子、C1−3アルキル基又はアミノ基の保護基を意味する。)で表される置換基を意味する。)を意味し、m1=1又は2の時、R9は上記に加えて水素原子でも良い。)を意味する。)、−V2(式中、−V2は−(CH2)m6NR16R17(式中m6は1又は2の整数を表し、R16,R17はそれぞれ独立に水素原子、C1−3アルキルカルボニル基又はC1−3アルキルスルホニル基を意味する。)を意味する。)、−V3(式中V3は、M2NR18(CH2)m7R19(式中、M2は−(C=O)−又は−(SO2)−を意味し、m7は、1または2の整数を意味し、R18は、水素原子又はC1−3アルキル基を意味し、R19はC2−9ヘテロシクリル基又はC2−14アリール基を意味する。)を意味する。)又は−V4(式中V4は−(C=O)−(ピペラジンー1,4−ジイル)−U(式中Uは、水素原子を除いたR9と同様な意味を表し、R9は前記と同じ意味を表す。)を意味する。)で置換されている。)を意味し、
R7は、C2−14アリール基(該C2−14アリール基は−V5(式中、V5は水素原子、水酸基、保護された水酸基、アミノ基、保護されたアミノ基、チオール基、保護されたチオール基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、カルバモイル基、スルファモイル基、スルホ基、ホルミル基、C1−3アルコキシ基(該C1−3アルコキシ基はハロゲン原子で任意に置換されている。)、C1−10アルキル基(該C1−10アルキル基はハロゲン原子で任意に置換されていてもよい。)、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−10アルキルカルボニルオキシ基、C1−10アルコキシカルボニル基、C1−10アルコキシ基、C1−10アルキルカルボニル基、C1−10アルキルカルボニルアミノ基、モノ若しくはジC1−10アルキルアミノ基、C1−10アルキルスルホニル基、C1−10アルキルアミノスルホニル基、C1−10アルキルアミノカルボニル基、C1−10アルキルスルホニルアミノ基又はC1−10チオアルキル基を意味する。)でそれぞれ独立に表される置換基で置換されている。)を意味し、
Ar1は、C2−14アリーレン基(該C2−14アリーレン基は−V6(式中、V6はV5と同様な意味を表し、V5は前記と同じ意味を表す。)でそれぞれ独立に表される置換基で置換されている。)を意味し、
Xは、OR20(式中、R20は水素原子、C1−10アルキル基又はC1−10アルキルカルボニル基(該C1−10アルキル基及びC1−10アルキルカルボニル基、は、−V7(式中、V7は、V5と同様な意味を表し、V5は前記と同じ意味を表す。)でそれぞれ独立に表される置換基で任意に置換されている。)を意味する。)を意味し、Y及びZは、それぞれ独立に酸素原子又は硫黄原子を意味する。]で表される化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物。 - R1が水素原子又はC1−6アルキル基(該C1−6アルキル基は、ハロゲン原子で任意に置換されていてもよい。)であり、
R2,R3,R4及びR6が水素原子であり、
Ar1が式(IV)であり
- R7がフェニル基(該フェニル基は、メチル基、t−ブチル基、ハロゲン原子、メトキシ基、トリフルオロメチル基又はトリフルオロメトキシ基で置換されている。)である請求項3記載の化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物。
- R1がメチル基である請求項4記載の化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物。
- 請求項1から15のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅剤。
- 請求項1から15のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物の存在下、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を生体外で培養することを特徴とする造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 増幅される造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞が、CD34陽性細胞である請求項17に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 増幅される造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞が、CD34陽性CD38陰性細胞である請求項17に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 増幅される造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞が、HPP−CFUコロニー形成細胞である請求項17に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 増幅される造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞が、SRCである請求項17に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 1種又は2種以上の血液細胞刺激因子の添加を伴う、請求項17から21のいずれか1項に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 血液細胞刺激因子が、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−11(IL−11)、flk2/flt3リガンド(FL)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、トロンボポエチン(TPO)及びエリスロポエチン(EPO)からなる群から選ばれる請求項22に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 血液細胞刺激因子が、幹細胞因子(SCF)及び/又はflk2/flt3リガンド(FL)である請求項23に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の由来が骨髄、肝臓、脾臓、末梢血或いは臍帯血である、請求項17から24のいずれか1項に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の由来が臍帯血である請求項25に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 幹細胞因子(SCF)及び/又はflk2/flt3リガンド(FL)との共存下で臍帯血由来の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を培養する請求項26に記載の造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅方法。
- 請求項1から15のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の増幅用試薬又は試薬キット。
- 請求項1から15のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体若しくはその医薬的に許容される塩又はそれらの溶媒和物の存在下、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を生体外で培養しながら当該細胞に遺伝子を導入する、又は遺伝子を導入した造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞に対し前記培養を行い増幅することを特徴とする形質転換された造血幹細胞の製造方法。
- 1種又は2種以上の血液細胞刺激因子の添加を伴う請求項29に記載の形質転換された造血幹細胞の製造方法。
- 血液細胞刺激因子が、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−11(IL−11)、flk2/flt3リガンド(FL)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、トロンボポエチン(TPO)及びエリスロポエチン(EPO)からなる群から選ばれる請求項30に記載の形質転換された造血幹細胞の製造方法。
- 造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞の由来が骨髄、肝臓、脾臓、末梢血或いは臍帯血である、請求項29から31のいずれか1項に記載の形質転換された造血幹細胞の製造方法。
- 請求項17から27のいずれか1項に記載の方法により増幅された造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞。
- 請求項29から32のいずれか1項に記載の方法により製造された、形質転換された造血幹細胞。
- 請求項17から27のいずれか1項に記載の方法により増幅した造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞をヒトに移植し、疾患を治療する細胞治療用材料。
- 請求項29から32のいずれか1項に記載の方法により製造された、形質転換された造血幹細胞をヒトに移植し、疾患を治療する細胞治療用材料。
- 請求項1乃至15の何れか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体、プロドラッグ若しくはその医薬的に許容され得る塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する医薬。
- 治療される疾患が、白血病、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、遺伝性血液疾患、固形腫瘍、自己免疫疾患、免疫不全症、糖尿病、神経損傷、筋肉損傷、脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症のいずれかである請求項35又は36に記載の細胞治療用材料若しくは請求項37に記載の医薬。
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