JPWO2007125779A1 - 熱安定性に優れた真核型アマドリアーゼ、その遺伝子及び組換え体dna、並びに熱安定性に優れた真核型アマドリアーゼの製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
実際、コリネバクテリウム属細菌由来の原核型アマドリアーゼについては、数個のアミノ酸を置換することによって、当該原核型アマドリアーゼの熱安定性が向上することが示されており(例えば、非特許文献5参照)、他の原核型アマドリアーゼへの熱安定性の導入も可能なことであろう。
また、公知の真核型アマドリアーゼについて、アミノ酸の置換によって熱安定性を向上させたという報告は一例もなく、真核型アマドリアーゼの熱安定性に関する既存の情報を利用することはできない。実際に真核型アマドリアーゼタイプの熱安定性を高めるために配列中のどのアミノ酸を置換すればよいかは、鋭意具体的な研究を要することとなる。
(1)以下の(a)及び/又は(b)の特徴を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)pH8.0において50℃、30分間の熱処理で83%以上活性が残存する;
(b)配列番号1記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と75%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
(2)以下の(a)から(c)よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で1つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する、上記(1)記載の真核型アマドリアーゼ:
(a)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の184位のグリシン;
(b)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の272位のアスパラギン;
(c)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の388位のヒスチジン。
(3)以下の(a)及び(b)の特徴を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)50℃、30分間の熱処理で83%以上活性が残存する;
(b)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、及び/又は置換がなされたアミノ酸配列を有する。
(4)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列において、94位のアルギニン、184位のグリシン、265位のフェニルアラニン、272位のアスパラギン、302位のヒスチジン、若しくは388位のヒスチジンの位置で1つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する真核型アマドリアーゼ。
(5)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列において、以下の(a)から(f)よりなる群から選択される1つ又はそれ以上の改変若しくは変異の組み合わせからなる真核型アマドリアーゼ:
(a)94位のアルギニンがリジンに置換されている;
(b)184位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている;
(c)265位のフェニルアラニンがロイシンに置換されている;
(d)272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている;
(e)302位のヒスチジンがアルギニンに置換されている;
(f)388位のヒスチジンがチロシンに置換されている。
(6)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列において、272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、302位のヒスチジンがアルギニンに置換され、かつ、388位のヒスチジンがチロシンに置換されている真核型アマドリアーゼ。
(7)以下の(a)及び/又は(b)の特徴を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)pH8.0において50℃、30分間の熱処理で50%以上活性が残存する;
(b)配列表の配列番号2記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と75%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
(8)以下の(a)及び(b)の特徴を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)50℃、30分間の熱処理で50%以上活性が残存する;
(b)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、及び/又は置換がなされたアミノ酸配列を有する。
(9)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列において、184位のグリシン、272位のアスパラギン、若しくは388位のヒスチジンの位置で1つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する真核型アマドリアーゼ。
(10)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列において、以下の(a)から(c)よりなる群から選択される1つ又はそれ以上の改変若しくは変異の組み合わせからなる真核型アマドリアーゼ:
(a)184位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている;
(b)272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている;
(c)388位のヒスチジンがチロシンに置換されている。
(11)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列において、184位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、かつ、388位のヒスチジンがチロシンに置換されている真核型アマドリアーゼ。
(12)上記(1)〜(11)のいずれか1に記載のアミノ酸配列をコードする真核型アマドリアーゼ遺伝子。
(13)上記(12)記載の真核型アマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
(14)上記(13)記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
(15)真核型アマドリアーゼを生成する方法であり、以下の段階を含む方法:
(a)上記(14)記載の宿主細胞を培養する段階;
(b)宿主細胞に含まれる真核型アマドリアーゼ遺伝子を発現させる段階;
(c)培養物から真核型アマドリアーゼを単離する段階。
(16)上記(1)〜(11)のいずれかに記載の真核型アマドリアーゼを含む、糖化タンパク質の測定において使用するためのキット。
(17)上記(1)〜(11)のいずれかに記載の真核型アマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定において使用するためのキット。
(18)下記の(a)から(f)の理化学的性質を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)作用及び基質特異性:酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒する;
(b)至適pH:pH6.0〜8.0;
(c)作用適温の範囲:20〜45℃;
(d)熱安定性:pH8.0において50℃、30分間の熱処理で83%以上の活性が残存;
(e)安定pHの範囲:pH6.0〜9.0;
(f)分子量:約52,000(SDS−PAGE)。
アマドリアーゼとは、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ2酢酸若しくはその誘導体(アマドリ化合物)を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。
アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
このようにして得られた真核型アマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、Coniochaeta属由来の真核型アマドリアーゼ遺伝子(特許文献5)の例などが挙げられる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは5−ブロモウラシル等を挙げることができる。
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異を真核型アマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは0.5〜12Mの上記薬剤濃度において、20〜80℃の反応温度下で10分間以上、好ましくは10〜180分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる(現代化学、p24〜30、1989年6月号)。
まず、得られた上記形質転換体がコロニーを形成したLB寒天培地から滅菌したビロード生地等で新しい寒天培地にレプリカを数枚とり、培養する。レプリカをとった寒天培地のコロニーが十分な大きさになったら、リゾチームなどの溶菌剤に浸した膜を培地に重ね、37℃で、1時間ほど静置し、溶菌させる。このとき溶菌した粗酵素液が膜に吸着する。
すなわち、Eupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは184位のグリシン、Pyrenochaeta属由来の真核型アマドリアーゼでは184位のグリシン、Arthrinium属由来の真核型アマドリアーゼでは184位のグリシン、Neocosmospora属由来の真核型アマドリアーゼでは184位のグリシン、Penicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは184位のセリン、Aspergillus属由来の真核型アマドリアーゼでは183位のグリシンである。
すなわち、Eupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは272位のアスパラギン、Pyrenochaeta属由来の真核型アマドリアーゼでは270位のアスパラギン、Arthrinium属由来の真核型アマドリアーゼでは272位のアスパラギン、Neocosmospora属由来の真核型アマドリアーゼでは272位のアスパラギン、Penicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは272位のアスパラギン、Aspergillus属由来の真核型アマドリアーゼでは272位のアスパラギンである。
すなわち、Eupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは388位のヒスチジン、Pyrenochaeta属由来の真核型アマドリアーゼでは386位のヒスチジン、Arthrinium属由来の真核型アマドリアーゼでは389位のヒスチジン、Neocosmospora属由来の真核型アマドリアーゼでは388位のヒスチジン、Penicillium属由来の真核型アマドリアーゼでは388位のヒスチジン、Aspergillus属由来の真核型アマドリアーゼでは388位のヒスチジンである。
なお、培地の初発pHは、pH7〜9に調整するのが適当である。
また、培養は、20〜42℃の培養温度、好ましくは37℃前後の培養温度で4〜24時間、さらに好ましくは37℃前後の培養温度で4〜8時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
なお、熱安定性の優れた真核型アマドリアーゼは、タンパク質の構造自体が高度に安定化しており、したがって、例えば、タンパク質のプロテアーゼに対する耐性能も向上している。
アマドリアーゼによるHbA1c測定の際、HbA1cをプロテアーゼで分解させた後、アマドリアーゼを作用させるわけだが、その際、プロテアーゼ耐性能が高いアマドリアーゼを用いることは、非常に有用である。なぜなら本測定系においてプロテアーゼは、HbA1cだけではなくアマドリアーゼに対しても作用してしまい、HbA1cの測定値に悪影響を及ぼしてしまうからである。プロテアーゼ耐性能を有するアマドリアーゼを用いることで、プロテアーゼによるアマドリアーゼの分解が防がれ、分離操作が不要かつ、より正確な測定が可能になる。また、これまで不可能だった高濃度でのプロテアーゼ処理も可能となり、測定値の精度が向上させることが可能になる。また、プロテアーゼ反応の短時間化を図ることができ、HbA1cの迅速測定にもつなげることができる。
また、本発明の「プロテアーゼ耐性能を有する」とは、真核型アマドリアーゼについて、pH8.0において37℃、30分間、50mUのプロテアーゼ処理した後の残存活性比がプロテアーゼ処理前の活性に対して40%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは80%以上残存していることをいう。例えば、プロテアーゼ耐性能測定方法は、アマドリアーゼ活性が約0.05U/mlとなるように、0.1M リン酸緩衝液(pH8.0)でアマドリアーゼ酵素液若しくは粗酵素液を希釈し、各サンプルに50mUの中性プロテアーゼ(Roche社製)を加えた後、37℃で30分間加温し、中性プロテアーゼ処理前と処理後のサンプル中に含まれる酵素活性を測定し、残存活性比を求めることでプロテアーゼ耐性能を評価できる。
本発明における真核型アマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
フルクトシルバリン等の糖化アミノ酸、及びフルクトシルバリルヒスチジン等の糖化ペプチドは、阪上らの方法に基づき合成、精製した(特開2001−95598号公報参照)。
(1)試薬1:POD−4−AA溶液
1.0kUのパーオキシダーゼ(キッコーマン社製)、100mgの4−アミノアンチピリン(東京化成社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に溶解し、1Lに定容する。
(2)試薬2:TOOS溶液
500mgのTOOS(同仁化学社製)をイオン交換水に溶解し、100mlに定容する。
(3)試薬3:基質溶液(150mM;終濃度 5mM)
フルクトシルバリン417mgをイオン交換水に溶解して10mlに定容する。
2.7mlの試薬1,100μlの試薬2、及び100μlの酵素液を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、試薬3を100μl加えて良く混ぜた後、分光光度計(U−2000A、日立社製)により、555nmにおける吸光度を測定する。測定値は、555nmにおける1分後から3分後の1分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。これをあらかじめ作製しておいた過酸化水素の標準溶液を試薬3の代わりに、また酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、37℃、1分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を計算し、この数値を酵素液中の活性単位とした。
真核型アマドリアーゼ粗酵素液、または真核型アマドリアーゼ精製標品を約0.1U/mlとなるように、10% キシリトールを含む0.1M リン酸緩衝液(pH8.0)で希釈し、50℃にて30分間加温した。加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、残存(酵素)活性(%)を求めることで安定性を評価した。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
Coniochaeta属由来真核型アマドリアーゼ(配列番号1)遺伝子の組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223−3−CFP)株(特許文献5、FERM BP−8132:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地中央第6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2002年8月1日付けで寄託)を、LB−amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicilin]100mlに接種して、37℃で20時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を7,000rpmで、5分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりQIAGEN tip−100(キアゲン社製)を用いて組換え体プラスミドpKK223−3−CFPを抽出して精製し、組換え体プラスミドpKK223−3−CFP DNAを100μg得た。
上記組換え体プラスミドpKK223−3−CFP DNA100μgのうち、20μgを用いて、XL1−RED(STRATAGENE社製)(増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすい)をD.M.Morrisonの方法(Method in Enzymology,68,326〜331,1979)に従って形質転換し、約5,000株の形質転換株を得た。
全コロニーからプラスミドDNAを回収するためにQIAGEN sol I(キアゲン社製)を寒天培地上に加え、スプレッダーでQIAGEN sol Iとともにコロニーを掻き集め、ピペットマンで溶液を回収し、以降は通常のプラスミド回収の方法で、改変操作を加えた組換え体プラスミドpKK223−3−CFP DNAを100μg得た。前記の被改変組換え体プラスミドpKK223−3−CFP DNA20μgを用いてD.M.Morrisonの方法(Method in Enzymology,68,326〜331,1979)に従って大腸菌JM109株を形質転換し、約1,000株の改変を受けたプラスミドを保有する形質転換株を得た。
まず、得られた上記形質転換体の全てを、ビロード生地を用いて新しいLB−amp寒天培地にレプリカした。レプリカプレート上のコロニーをHybond−N+(Amersham社製)に転写し、10mg/ml Lysozyme(Sigma社製)液に浸した。このHybond−N+を48℃で1時間処理した後、2mM フルクトシルバリン、1mg/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン社製)、1mg/ml 4−アミノアンチピリン(東京化成社製)、10mg/ml TOOS(同仁化学社製)を含む0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に浸したところ、少数の強い発色を示す株が認められた。
この強い発色に相当するコロニーをマスタープレート上より選択し、2mlのLB−amp培地で液体培養することにより、プラスミドにコードされる改変真核型アマドリアーゼを生産させた。
培養後、得られた各菌体を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。超音波破砕し、12,000rpmで5分間の遠心分離の後、上清を回収した。この粗酵素液を用いて、上記の(熱安定性測定方法)に従い、残存活性(%)(処理後の活性/未処理の活性)を算出した。
得られた2株をLB−amp培地2ml中、37℃で18時間振盪培養し、この培養液からGFX Micro Plasmid Prep Kit(Amersham社製)を用いてプラスミドを単離した。該プラスミドをそれぞれpKK223−3−CFP−T1、pKK223−3−CFP−T2と命名し、各プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000(ベックマン・コールター社製)を用いて決定した。
その結果、pKK223−3−CFP−T1中には、配列番号1記載のアミノ酸配列の302番目のヒスチジンがアルギニンに、もうひとつのpKK223−3−CFP−T2には、配列番号1記載のアミノ酸配列の388番目のヒスチジンがチロシンに置換する変異が導入されていることが明らかとなった。
組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T1及びpKK223−3−CFP−T2を、制限酵素AatII及びSacIで2重消化した。上記pKK223−3−CFP−T1DNAから約1kbDNA断片を、上記pKK223−3−CFP−T2DNAから約5kbDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分取し、常法により精製した。さらに、両DNA断片をT4DNAリガーゼで連結し、大腸菌JM109株を形質転換して、組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T3を得た。
このようにして調製した酵素液について上記の(熱安定性測定方法)の方法により、アマドリアーゼの残存する酵素活性を測定した。結果を表1に示す。
表1において、pKK223−3−CFPは、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP)株由来の野性型真核型アマドリアーゼを示し、他の3種類の酵素は本発明の真核型アマドリアーゼを示す。この表1から明らかなように、本発明で得られた真核型アマドリアーゼは、優れた熱安定性を有することが判る。
上記(4)で取得した改変された真核型アマドリアーゼ生産株である大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T3)株から上記(1)に記載の方法によりプラスミドDNAを調製した。さらに、上記(2)の方法より変異を導入し、続いて上記(3)の方法を用い、本実施例5では、先に得た改変された真核型アマドリアーゼを比較対照として選択を行った。pH8.0における50℃、30分の熱処理による残存活性率が高く、さらに改変された真核型アマドリアーゼを生産する大腸菌を4株取得した。このようにして得られた大腸菌4株を用いて、LB−amp培地2ml中で、37℃、18時間の振盪培養を行った。
この培養液からGFX Micro Plasmid Prep Kit(Amersham社製)を用いてプラスミドを単離した。該プラスミドをそれぞれpKK223−3−CFP−T4、pKK223−3−CFP−T5、pKK223−3−CFP−T6、及びpKK223−3−CFP−T7と命名し、各プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000(ベックマン・コールター社製)を用いて決定した。
このようにして調製した酵素液について上記(熱安定性測定方法)の方法により、残存する酵素活性を測定した。結果を表2に示す。
上記のようにして得られた本発明の真核型アマドリアーゼを生産する形質転換体、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7)をLB−amp培地10Lに植菌し、ジャーファーメンターを用いて、通気量1L/min、攪拌速度600rpmの条件で、30℃の培養温度で24時間攪拌培養した。
得られた培養液10Lを7,000rpm、10分間遠心分離して集菌し、バッファーA(10mM リン酸バッファー、1mM EDTA、5% グリセロール、0.5mM PMSF、pH8)500mlに懸濁後、フレンチプレスにより破砕した。
破砕液は9,000rpmで15分間遠心し、上清に硫酸アンモニウムを40%飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。4℃で一晩放置後、遠心(9,000rpm、4℃、15分)し、上清を回収した。
Eupenicillium属由来真核型アマドリアーゼ(配列番号2)遺伝子の組換え体プラスミド(puc−EFP)(特許文献5、FERM BP−8131)のDNAを鋳型として、リン酸化した配列番号3、4のプライマー、Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
反応液の一部を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、約1,300bpのDNAが特異的に増幅されていることを確認した。
PCRで増幅したEupenicillium属由来の真核型アマドリアーゼ遺伝子を、制限酵素HpaIで切断したpUTE100K’ベクター(特開平6−292584号公報)と連結し、大腸菌JM109株を形質転換して、組換え体プラスミドpUTE100K’−EFPを得た。
そこで、大腸菌JM109株(pUTE100K’−EFP)株を、LB−amp培地100mlに接種して、37℃の培養温度で、20時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を7,000rpmで5分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。
この菌体よりQIAGEN tip−100(キアゲン社製)を用いて組換え体プラスミドpUTE100K’−EFPを抽出して精製し、組換え体プラスミドpUTE100K’−EFPのDNAを100μg得た。
配列番号2記載のアミノ酸配列の184位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている変異、272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている変異、388位のヒスチジンがチロシンに置換されている変異を導入することにした。
まず、配列番号2記載のアミノ酸配列の184位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている変異を導入するため、配列番号5、6のDNA配列よりなるプライマーを、常法により合成した。次に、上記(7)で得た組換え体プラスミドpUTE100K’−EFPのDNAを鋳型として、配列番号5、6のプライマー、Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用い、上記(7)と同様の条件でPCR反応を行った。
こうして得られた上記DNA断片をリガーゼで連結し、大腸菌JM109株を形質転換して、組換え体プラスミドpUTE100K’−EFP−T1を得た。
配列番号5 5’ GCTGGTACCTTTCAGCAACCTCTGTTCG 3’ (順方向プライマー)
配列番号6 5’ AAAGGTACCAGCATCTCCAAAGCCAAACTTG 3’ (逆方向プライマー)
(G184Dの導入用。下線部は、制限酵素KpnIの認識配列を示す)
配列番号7 5’ TCTTTTTCGAACCCGACGAGTATGGGGTG 3’ (順方向プライマー)
配列番号8 5’ TCGGGTTCGAAAAAGAACCCATATTCACC 3’ (逆方向プライマー)
(N272Dの導入用。下線部は、制限酵素NspVの認識配列を示す)
配列番号9 5’ ACATCGGGAAATACGTAGTTGAGCTTTTAG 3’ (順方向プライマー)
配列番号10 5’ CTAAAAGCTCAACTACGTATTTCCCGATGT 3’ (逆方向プライマー)
(H388Yの導入用。下線部は、制限酵素SnaBIの認識配列を示す)
このようにして調製した酵素液について上記(熱安定性測定方法)に示した方法により、残存するアマドリアーゼの酵素活性を測定した。結果を表3に示す。
これに対して、大腸菌JM109(pUTE100K’−EFP−T1)株、大腸菌JM109(pUTE100K’−EFP−T2)株によって生産される改変後の真核型アマドリアーゼでは、改変前の真核型アマドリアーゼよりも、pH8.0、50℃、30分間の熱処理における残存酵素活性がそれぞれ7.4%、11.9%に向上していた。また、大腸菌JM109(pUTE100K’−EFP−T3)株、大腸菌JM109(pUTE100K’−EFP−T4)株、及び大腸菌JM109(pUTE100K’−EFP−T5)株によって生産される改変後の真核型アマドリアーゼでは、改変前の真核型アマドリアーゼよりも、pH8.0、50℃、30分間の熱処理における残存酵素活性がそれぞれ49.7%、54.8%、78.9%とさらに顕著に向上していた。
本発明で得られた真核型アマドリアーゼは、優れた熱安定性を有することが判った。
pKK223−3−CFP−T7は、配列番号1記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列の272番目のアスパラギンをアスパラギン酸に、302番目のヒスチジンをアルギニンに、388番目のヒスチジンをチロシンに置換する変異を含んでいる。これに、さらに94番目のアルギニンをリジンに、184番目のグリシンをアスパラギン酸に、265番目のフェニルアラニンをロイシンに置換するような変異を加えていくことによって、最終的に6重変異体を作製することにした。
まず、F265Lの変異を導入するため、配列番号11、12のDNA配列よりなるプライマーを常法により合成した。次に、上記(5)で得た組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7を鋳型、配列番号11、12のプライマー、Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用い、上記(7)と同様の条件でPCR反応を行った。
配列番号12 5’ AGGTTCGAAGAAGAAGCCAAGTTCGCC 3’ (逆方向プライマー)
(F265Lの導入用。下線部は、NspVの認識配列を示す)
組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T8及びpKK223−3−CFP−T5を制限酵素KpnI及びSnaBIで2重消化し、pKK223−3−CFP−T8DNAから約500bpDNA断片を、pKK223−3−CFP−T5DNAから約5.5kbDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分取し、常法により精製したのち、T4DNAリガーゼで連結し、大腸菌JM109を形質転換して、組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T9を得た。
なお、pKK223−3−CFP−T9プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000(ベックマン・コールター社製)を用いて決定した結果、G184D、F265L、N272D、H302R、H388Yの各置換に相当する変異が導入されていることが明らかとなった。
組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T9及びpKK223−3−CFP−T4を制限酵素BglIIで消化し、pKK223−3−CFP−T9DNAから約900bpDNA断片を、pKK223−3−CFP−T4DNAから約5.0kbDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分取し、常法により精製したのち、T4DNAリガーゼで連結し、大腸菌JM109を形質転換して、組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T10を得た。なお、pKK223−3−CFP−T10プラスミド中の真核型アマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000(ベックマン・コールター社製)を用いて決定した結果、R94K、G184D、F265L、N272D、H302R、H388Yの各置換に相当する変異が導入されていることが明らかとなった。
こうして作製されたプラスミドpKK223−3−CFP−T10は、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地中央第6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2007年3月16日付けで受託番号FERM BP−10800として寄託されている。
実施例9までに取得した組換え体プラスミドを保持する大腸菌、JM109(pKK223−3−CFP−T7)、JM109(pKK223−3−CFP−T10)を、JM109(pKK223−3−CFP)とともに、LB−amp培地で37℃,20時間培養し、各菌体を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄後、超音波破砕して15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
アマドリアーゼ活性が約0.05U/mlとなるように、0.1M リン酸緩衝液(pH8.0)で粗酵素液を希釈し、各サンプルに50mUの中性プロテアーゼ(Roche社製)を加えた後、37℃で30分間加温した。各サンプルについて、プロテアーゼ処理前と処理後のサンプル中に含まれる酵素活性を測定し、残存活性比を求めることでプロテアーゼ耐性能を評価した。結果を表5に示す。表5において、JM109(pKK223−3−CFP)は改変前の真核型アマドリアーゼを示し、JM109(pKK223−CFP−T7)、JM109(pKK223−3−CFP−T10)の酵素は本発明の真核型アマドリアーゼを示す。この表5から明らかなように、本発明で得られた真核型アマドリアーゼは、プロテアーゼに対する耐性能も著しく向上しており、優れた安定性を有していることが判る。
Claims (18)
- 以下の(a)及び/又は(b)の特徴を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)pH8.0において50℃、30分間の熱処理で83%以上活性が残存する;
(b)配列番号1記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と75%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。 - 以下の(a)から(c)よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で1つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する、請求項1記載の真核型アマドリアーゼ:
(a)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の184位のグリシン;
(b)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の272位のアスパラギン;
(c)配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の388位のヒスチジン。 - 以下の(a)及び(b)の特徴を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)50℃、30分間の熱処理で83%以上活性が残存する;
(b)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、及び/又は置換がなされたアミノ酸配列を有する。 - 配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列において、94位のアルギニン、184位のグリシン、265位のフェニルアラニン、272位のアスパラギン、302位のヒスチジン、若しくは388位のヒスチジンの位置で1つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する真核型アマドリアーゼ。
- 配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列において、以下の(a)から(f)よりなる群から選択される1つ又はそれ以上の改変若しくは変異の組み合わせからなる真核型アマドリアーゼ:
(a)94位のアルギニンがリジンに置換されている;
(b)184位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている;
(c)265位のフェニルアラニンがロイシンに置換されている;
(d)272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている;
(e)302位のヒスチジンがアルギニンに置換されている;
(f)388位のヒスチジンがチロシンに置換されている。 - 配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列において、272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、302位のヒスチジンがアルギニンに置換され、かつ、388位のヒスチジンがチロシンに置換されている真核型アマドリアーゼ。
- 以下の(a)及び/又は(b)の特徴を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)pH8.0において50℃、30分間の熱処理で50%以上活性が残存する;
(b)配列表の配列番号2記載の真核型アマドリアーゼのアミノ酸配列と75%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。 - 以下の(a)及び(b)の特徴を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)50℃、30分間の熱処理で50%以上活性が残存する;
(b)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、及び/又は置換がなされたアミノ酸配列を有する。 - 配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列において、184位のグリシン、272位のアスパラギン、若しくは388位のヒスチジンの位置で1つ又はそれ以上のアミノ酸の改変若しくは変異を有する真核型アマドリアーゼ。
- 配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列において、以下の(a)から(c)よりなる群から選択される1つ又はそれ以上の改変若しくは変異の組み合わせからなる真核型アマドリアーゼ:
(a)184位のグリシンがアスパラギン酸に置換されている;
(b)272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されている;
(c)388位のヒスチジンがチロシンに置換されている。 - 配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列において、184位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、272位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、かつ、388位のヒスチジンがチロシンに置換されている真核型アマドリアーゼ。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載のアミノ酸配列をコードする真核型アマドリアーゼ遺伝子。
- 請求項12記載の真核型アマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項13記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
- 真核型アマドリアーゼを生成する方法であり、以下の段階を含む方法:
(a)請求項14記載の宿主細胞を培養する段階;
(b)宿主細胞に含まれる真核型アマドリアーゼ遺伝子を発現させる段階;
(c)培養物から真核型アマドリアーゼを単離する段階。 - 請求項1〜11のいずれか一項記載の真核型アマドリアーゼを含む、糖化タンパク質の測定において使用するためのキット。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載の真核型アマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定において使用するためのキット。
- 下記の(a)から(f)の理化学的性質を有する真核型アマドリアーゼ:
(a)作用及び基質特異性:酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒する;
(b)至適pH:pH6.0〜8.0;
(c)作用適温の範囲:20〜45℃;
(d)熱安定性:pH8.0において50℃、30分間の熱処理で83%以上の活性が残存;
(e)安定pHの範囲:pH6.0〜9.0;
(f)分子量:約52,000(SDS−PAGE)。
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