JPWO2005089565A1 - ペプチド混合物の製造法 - Google Patents

Abstract

本発明は苦味の少ない風味良好な大豆ペプチド混合物を、苦味低減操作を必要とせず、簡便且つ低コストで生産できる実用的な製造法を目的とした。大豆蛋白溶液のｐＨをアルカリ性領域（ｐＨ８〜１０）に調整した後アルカリ性領域に５分〜300分間保持し、しかる後、酵素分解を行うことを特徴とする大豆ペプチド混合物の製造法。

Description

本発明は、低苦味ペプチド混合物を提供するものである。より詳しくは、大豆蛋白を酵素分解した後苦味低減操作を必要とせず、大豆蛋白を酵素分解するだけで低苦味のペプチド混合物を製造することが出来る方法に関する。

蛋白質を酵素等により低分子化して得られるペプチドは、蛋白質やアミノ酸と比べ消化吸収性が高く、効率的な窒素摂取源として知られている。また近年、大豆ペプチド等に筋肉増強作用、血中コレステロール低下作用、胆汁酸結合能等の有益な生理活性機能が報告され、食品素材として広く注目を浴びている。

ペプチドは、前述のように優れた機能を有するものの、蛋白質の低分子化をする際に発生する苦味が原因となり、食品素材としての利用が制限されていた。

ペプチドの苦味を低減させる方法としては、蛋白質の低分子化工程において苦味成分の発生を抑制する方法や、発生した苦味成分を分離除去する方法等が報告されている。具体的には、前者は分解酵素を工夫する方法（特許文献１、特許文献２）や基質蛋白質を限定する方法（特許文献３）などであり、後者は活性炭を用いる方法（特許文献４）、イオン交換樹脂を用いる方法、吸着剤処理をする方法（特許文献５、特許文献６）などである。
しかしながら、これらの方法では風味は改善されるものの、製造条件が制限されたり、苦味低減操作の為に歩留まりが低下する事により製造コストが上昇し、ペプチドの産業利用の問題となっていた。

特開２０００−８３６９５号公報 特開平５−１５３１４号公報 特開平５−３４４８４７号公報 特開平３−２７２６９４号公報 特開平４−１９０７９７号公報 特開平７−２６４９９３号公報

本発明は苦味の少ない風味良好な大豆ペプチド混合物を、苦味低減操作を必要とせず、簡便且つ低コストで生産できる実用的な製造法を目的とした。

本発明者らは前記目的を達成すべく鋭意研究するなかで、大豆蛋白溶液をアルカリ性領域に一定時間保持した後、酵素分解を行うと、苦味の少ないペプチドを効率よく製造できる事を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、大豆蛋白溶液のｐＨをアルカリ性領域（ｐＨ８〜１０）に調整した後アルカリ性領域に５分〜300分間保持し、しかる後、酵素分解を行うことを特徴とする大豆ペプチド混合物の製造法である。
酵素分解の程度は１５％TCA可溶率で５０％〜９８％が好ましい。
酵素分解に用いる酵素はアルカリ性プロテアーゼが好ましい。
酵素分解をアルカリ性域から酸性域にかけて行うことが好ましい。
酵素添加後のアルカリ（ｐＨ８〜１０）滞留時間が２、３秒〜３０分以下で酸性（ｐＨ５．０〜７．０）域滞留時間が１５分〜３００分が好ましい。
大豆蛋白溶液に糖類を大豆蛋白質あたり０．１〜６０％添加することが好ましい。

本発明の方法により風味に優れた低苦味大豆ペプチド混合物を、効率よく製造できるようになったものである。

本発明に用いる大豆蛋白は脱脂大豆などから公知の方法により製造して得られるものを使用することが出来る。脱脂大豆、脱脂大豆を水抽出して得られる豆乳、これを等電点沈殿して得られる酸沈殿蛋白、これを中和した分離大豆蛋白溶液、これを噴霧乾燥などした粉末状分離大豆蛋白などを用いることが出来る。また、脱脂大豆に加水してホエーを除いた濃縮大豆蛋白、脱脂大豆からアルコール沈殿させて得られるアルコール濃縮大豆蛋白も利用することができる。
本発明の大豆蛋白溶液は溶液或いは分散液であればよく、酵素分解することが出来る濃度範囲であればよい。通常溶液中の大豆蛋白濃度が１〜２０重量％程度とすることが出来る。

本発明は、大豆蛋白溶液のｐＨをアルカリ性領域に調整した後、一定時間アルカリ領域に保持し、しかる後、酵素を作用させて蛋白を分解することが重要である。
保持時間は２、３分でも若干の効果を認めることが出来るが、５分以上３００分以下保持することが好ましく、１０分〜１８０分がより好ましく、２０分〜９０分がさらに好ましい。
アルカリ領域に長時間蛋白を保持するとアルカリ分解によりジペプチドやアミノ酸が生ずるからである。大豆蛋白溶液をアルカリ性領域に保持することにより球状蛋白といわれる大豆蛋白の立体構造をほぐして酵素分解を受けやすくするとともに、分解の態様を中性域や酸性域と異なる態様にするところに本発明の特徴の一つがある。
また、いくらアルカリ性領域に大豆蛋白溶液を調整しても直ちに大豆蛋白の立体構造が緩むものではないので、前記保持時間が適当である。アルカリ性の程度にもよるが保持時間は工業的に生産するには出来るだけ短いほうが生産効率が高いのでかかる範囲が適当である。また、アルカリ保持時間が長すぎると構造が変化がさらに進み、雑味やえぐみなどがでやすくなる。

このアルカリ性領域は大豆蛋白を分解するなど傷つけず、それでいて立体構造が緩んでルーズな構造になるｐＨ範囲と保持時間が必要である。かかるｐＨ範囲は７．５〜１０．０、好ましくは８．０〜９．５が適当である。ｐＨが中性に近いと大豆蛋白の立体構造が緩むのに時間がかかり、十分に緩まないからである。また、ｐＨが高過ぎると大豆蛋白の立体構造は変化するが、酵素分解すると悪風味が強く、食品用途として利用できるレベルではない。

尚、大豆蛋白溶液をアルカリ性領域に保持する温度は特に限定するものではなく、次の酵素による分解に適した温度とすることができる。通常、保持温度は５〜９８℃、好ましくは３０℃〜８０℃、より好ましくは４５℃〜７０℃が適当である。温度が高いほど大豆蛋白の立体構造が速く緩むが、あまり高いとアミノ酸が分解される恐れがある。また、酵素が大豆蛋白を加水分解する作用温度、至適温度が存在するので、少なくとも用いる酵素の作用温度範囲が好ましい。

また、大豆蛋白溶液に糖類を添加することができる。
本発明に用いる糖類に関しては、特に限定しないが、使用できる糖としては、単糖類としてプドウ糖、果糖、ガラクトース、二糖類としてショ糖、麦芽糖、乳糖から、スタキオース、ラフィノースなどのオリゴ糖、ソルビトールやトレハロースさらには、澱粉などの多糖類をアミラーゼで分解したコーンシロップや水飴、マルトースや麦芽糖を使用できるが、特にグルコースや果糖などの還元糖の含有率が高いものが望ましい。
添加する糖類は、大豆蛋白質あたり０．１から６０％、好ましくは５から２０％添加することが適当である。添加量が０．１％以下だと改善効果が少なく、６０％以上だと改善効果があるがその後、ハンドリングの問題、例えば粘度が上がるとか、粉末化しにくいなどの問題点があり、６０％以下、好ましくは、２０％以下が好適である。
糖類の添加時期は酵素分解前なら特に限定しないが、作業的にはアルカリ性領域に大豆蛋白溶液を調整する前に添加するほうが好適である。、アルカリ添加後に糖類を添加すると糖液の添加により反応温度が下がるとか、ｐHの微調整が必要となることがあるからである。
糖類を添加することにより、得られる大豆ペプチド混合物の風味がよりフラットとなり、苦みが消失する効果がある。

酵素分解に用いる酵素はアルカリ領域で作用するプロテアーゼであれば特に限定しないが、アルカリ性プロテアーゼが好ましく、特にアルカリプロテアーゼと中性プロテアーゼ或いは酸性プロテアーゼとの組み合わせがより好ましい。
本発明の特徴の一つは、後述するように大豆蛋白を酵素分解する過程でｐＨがアルカリ域から酸性域へ移行することである。酵素としての必要条件は、初期のアルカリ領域での立体構造の緩んだ大豆蛋白に作用することであり、蛋白が酵素分解されるに従ってｐＨが下がり酸性に移行するが、この過程でも酵素が作用して蛋白を分解することが好ましい。
従ってアルカリ性領域から酸性領域まで広い作用ｐＨ範囲を有するプロテアーゼが好ましい。
そこで、アルカリ領域に至適ｐＨを有するが、作用ｐＨは酸性域まで広いアルカリプロテアーゼが適当であり、アルカリプロテアーゼと中性或いは酸性プロテアーゼと組み合わせるとアルカリ領域から酸性領域まで蛋白を酵素分解することが出来好ましい。
アルカリ性プロテアーゼとしては例えば、ビオプラーゼ（ナガセケムテック(株)製）、サーモライシン（大和化成(株)製）、プロテアーゼＳ（天野エンザイム(株)）、アルカラーゼ（ノボエンザイム）などが好ましい。

大豆蛋白は酸性蛋白であるため、酵素分解を受けると大豆蛋白溶液は直ちにｐＨが低下し始める。塩などを入れて緩衝系にするかｐＨをアルカリ性領域に保つようにしない限り本発明の大豆蛋白溶液はアルカリ性領域から中性域を通過して酸性領域に移行する。このように、本発明において、酵素分解をアルカリ性域から酸性域にかけて行うことが適当である。
大豆蛋白の立体構造はアルカリ性領域では緩んでルーズな構造になりやすく、同じ蛋白分解酵素でも加水分解を受ける部位は中性の状態や酸性のときの状態とは異なると考えられる。即ち、本発明の大豆蛋白を分解する酵素は同じでも、大豆蛋白がアルカリ性領域から酸性領域に移行するに従って大豆蛋白の立体構造がルーズなものからリジッドなものに変化し、加水分解の態様が変化するため、通常中性域や酸性域で酵素分解する態様とは異なる。この結果得られる酵素分解された大豆ペプチド混合物は、すっきりとして雑味が少なく、苦味を感じにくいものとなるのである。
より詳しく考察すると、アルカリ性領域では構造が緩んでいくが、保持時間が長すぎると逆に蛋白質内部に含有する雑味や嫌味成分が溶出してきて風味上、好ましくない。雑味が発生しない程度に蛋白構造を緩ませてから酵素分解すれば、その後、酵素分解によりｐHが低下しても悪風味が発生しないが、蛋白の構造を緩ませる時間が短いと、苦味のみが先行した風味になり、蛋白の構造を緩ませる時間がながすぎると悪風味が出やすくなり、好ましくない。

酵素添加後のアルカリ領域での滞留時間は２，３秒から３０分が好ましい。特にｐH調整しなければ酵素添加後、２、３秒でｐHは中性から酸性領域に低下するが、酵素添加後、アルカリを添加しながらｐHを低下を緩めることができる。この場合は上限は３０分程度が好ましくこれ以上、アルカリ領域に滞留する時間を延長すると、塩味が誘発し好ましくない。また、中性から酸性領域での滞留時間は３０分以上３００分以下が好ましい。１５％TCA（トリクロロ酢酸）可溶率で占めされる必要な分解時間を選るためには最低１５分以上必要であり、分解時間は３００分以下が好ましい。３００分以上分解すると逆に遊離アミノ酸が多くなり、調味料的な味となるので好ましくない。
なお、滞留時間に関して、塩や酸やアルカリ添加によりアルカリ域滞留時間や酸性域滞留時間を調整できる。

このように本発明の特徴は大豆蛋白を一旦アルカリ性領域に保持し、立体構造が緩んだ状態で酵素を作用させて分解することにあり、分解の程度は特に限定しない。目的のペプチド混合物に応じて加水分解の程度を調節することが出来る。例えば酵素活性、添加量、作用温度、作用時間などを調整すれば加水分解の程度を分解度として30〜100％、好ましくは70〜100％とすることが出来る（尚、蛋白質の分解度は、試料中の１５％トリクロロ酢酸可溶成分が、全蛋白質中に占める割合である。）
平均分子量は２００〜１５，０００、好ましくは３００〜５０００まで調整することが出来る。実際の生産を考慮すると長時間の酵素分解は腐敗の恐れがあるので数時間以内の短い時間が好ましい。温度も腐敗しやすい37℃より高い温度が好ましい。通常、平均分子量３００〜５０００程度の低分子のペプチド混合物は苦味が生ずるものを本発明の方法を用いることにより苦味を感じないペプチド混合物とすることが出来る。

前述のように、本発明の特徴は、酵素分解をアルカリ性域から酸性域にかけて行うことにある。
酵素添加後のアルカリ性（ｐＨ８〜１０）域での滞留時間が２、３秒〜３０分で酸性（ｐＨ５．０〜７．０）域での滞留時間が１５分〜３００分であることが好ましい。
前述のように、大豆蛋白の立体構造がアルカリ性領域では緩んでルーズな構造になりやすく、この状態で加水分解され、ｐＨが下がって酸性になると加水分解されて分子量も小さくなった加水分解物は最初から中性あるいは酸性で酵素分解されるよりは加水分解されやすいと考えられる。
得られる酵素分解された大豆ペプチド混合物は、すっきりとして雑味が少なく、苦味を感じにくいものとなるのも、これらが関与していると考えられる。

以上のようにして得られた大豆ペプチド混合物は、用途によりそのまま或いは濃縮して使用できるが、通常殺菌して噴霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用できる。

以下、本発明を実施例に従い説明するが、本発明の範囲はこれらに限定させるものではない。また、実施例中の酵素添加量は、分離大豆蛋白質溶液の固形分に対する比率で示した。

実験例１（アルカリ性領域におけるたん白構造の変化）
脱脂大豆から蛋白質を水抽出した豆乳を、塩酸にてpH４．５に調整した。沈降した蛋白を遠心分離して分離大豆蛋白質を得た。この分離大豆蛋白質を１０％となるように水で希釈し、水酸化ナトリウムにてpH７．２に調整後、直接蒸気吹き込み殺菌装置にて１５０℃で３０秒間処理した液を１０％になるように調整し、水酸化ナトリウムでｐHを表１の各ｐHに調整し、５０℃で保持しながら時間経過に伴い蛋白溶液を適当に希釈し、２６０nmの吸収スペクトル値を測定した。

（表１） 各調整ｐHでの保持時間と吸光度２６０nmの変化

以上の結果よりアルカリ域で大豆蛋白の立体構造が変化して疎水域などに存在していたアミノ酸が露出したりして吸光度の変化をもたらしたものと推察する。即ち、大豆蛋白の立体構造が緩んで疎水性域が露出したものと推察する。

実施例１ （ｐH９．０で保持時間３０分で４時間分解）
脱脂大豆から蛋白質を水抽出した豆乳を、塩酸にてpH４．５に調整した。沈降した蛋白を遠心分離して分離大豆蛋白質を得た。この分離大豆蛋白質を１０％となるように水で希釈し、水酸化ナトリウムにてpH７．２に調整後、直接蒸気吹き込み殺菌装置にて１５０℃で３０秒間処理し、蛋白質を再溶解させて分離大豆蛋白質溶液を得た。

この分離大豆蛋白質溶液を５０℃に温調し、水酸化ナトリウムを用いてpH９．０に調整し３０分保持した後、エンドプロテアーゼを含有する蛋白質分解酵素（「ビオプラーゼＳＰ−１５ＦＧ」使用、ナガセケムテック(株)製、以下の例において同じ。）１．８％を添加すると、５分程度でｐH７．５まで低下した。その後引き続き、５０℃で４時間加水分解した時の最終ｐHは６．０であった。分解後、直接蒸気吹き込み加熱装置にて１５０℃で９秒処理して殺菌した後、噴霧乾燥して、大豆ペプチド混合物の１５％TCA分解率は、８８．０％であった。

比較例１（ｐＨをアルカリ側に調整しない例）５時間分解
実施例１と同様の方法で得た分離大豆蛋白質溶液（pH７．２）を５０℃に温調後、エンドプロテアーゼを含有する蛋白質分解酵素１．８％を作用させと５分程度でｐH６．５まで低下した。さらに５０℃で５時間加水分解した。この時のｐHは６．０であった。分解後、直接蒸気吹き込み加熱装置にて１５０℃で９秒処理して殺菌した後、噴霧乾燥して、大豆ペプチド混合物（分解度１５％TCA分解率８１．８％を得た。

比較例２（アルカリ領域での保持のない例）
実施例１と同様の方法で得た分離大豆蛋白質溶液（pH７．２）を５０℃に温調し、３０分保持した後、エンドプロテアーゼを含有する蛋白質分解酵素１．８％を作用させ、添加５分後のｐHは７．５であった。さらに５０℃で５時間加水分解した。この時のｐHは６．０であった。
分解後、直接蒸気吹き込み加熱装置にて１５０℃で９秒処理して殺菌した後、噴霧乾燥して、大豆ペプチド混合物、１５％TCA分解度が８１．３を得た。

実施例２（アルカリ性領域での保持時間の短い例）ｐH９．０で保持時間３分
実施例１と同様の方法で得た分離大豆蛋白質溶液を５０℃に温調し、水酸化ナトリウムを用いてpH９．０に調整し３分間保持した後、エンドプロテアーゼを含有する蛋白質分解酵素１．８％を作用させ、添加５分後のｐHは７．５であった。さらに５０℃で４時間加水分解した。この時のｐHは、６．０であった。分解後、直接蒸気吹き込み加熱装置にて１５０℃で９秒処理して殺菌した後、噴霧乾燥して、大豆ペプチド混合物１５％TCA分解度８３．８％を得た

実施例３（アルカリ性範囲での保持時間の長い例） ｐH９．０で保持時間１８０分
実施例１と同様の方法で得た分離大豆蛋白質溶液を５０℃に温調し、水酸化ナトリウムを用いてpH９．０に調整し１８０分間保持した後、エンドプロテアーゼを含有する蛋白質分解酵素１．８％を作用させた時のｐHは７．６であった。さらに、５０℃で４時間加水分解した時のｐHは６．１であった。分解後、直接蒸気吹き込み加熱装置にて１５０℃で９秒処理して殺菌した後、噴霧乾燥して、大豆ペプチド混合物１５％TCA分解度８３．２％を得た。

実施例４（アルカリ性範囲での保持時間の長い例）（ｐH９．０で保持時間３００分）
実施例１と同様の方法で得た分離大豆蛋白質溶液を５０℃に温調し、水酸化ナトリウムを用いてpH９．０に調整し３００分間保持した後、エンドプロテアーゼを含有する蛋白質分解酵素１．８％を作用させた時のｐHは７．６であった。さらに、５０℃で４時間加水分解した時のｐHは６．１であった。分解後、直接蒸気吹き込み加熱装置にて１５０℃で９秒処理して殺菌した後、噴霧乾燥して、大豆ペプチド混合物１５％TCA分解度８１．０％を得た。

実験例２
前述の実施例及び比較例で得たペプチド混合物を５％水溶液とし、１０人のパネラーにより風味評価を行った。
風味評価基準は１（全く苦みなし）、２（殆ど苦み無し）、３（僅かに苦みがある）、４（苦みかある）、５（苦みが強い）の５段階とし、各パネラーが与えた評価の平均値を算出した。後味の強さに関しては、３（強く舌に残る）、２（舌に残る）、１（舌にわずかに残る程度）で評価し、評価の平均値を算出した。

（表２）

以上のように、コントロールである比較例１、２に比べて、大豆蛋白質のｐＨをアルカリ性領域に調整し保持後、酵素分解を行った実施例１は、後味がすっきりして、苦味がほとんど感じず風味が良好であることが確認された。
また次記表３に示すように、実施例１は比較例１、２に比較して効率的に高分解物を得られる事が確認された。
表３に実施例１、２と比較例１、２の分解反応時間と分解度を示す。なお、分解度は全蛋白質中の１５％TCA可溶成分の割合とした。

（表３）

以上のように、コントロールである比較例１、２に比べて、大豆蛋白質のｐＨをアルカリ性領域に調整し保持後、酵素分解を行った実施例１は、風味に優れたペプチド混合物を短時間の分解反応で効率よく高分解物を得る事ができ、生産性にも優れていることが確認された。

実施例５
実施例１と同様にして調整した大豆蛋白質に対して糖類を０．０５％、１０％、７０％添加となるようにブドウ糖を添加し水酸化ナトリウムを添加してｐH９．０に調整後、実施例１と同様な方法で酵素分解し風味を評価した。

比較例３
実施例１と同様にして得られた大豆ペプチドに対して０．０５％、１０％、７０％添加となるようにブドウ糖を添加して実施例５と風味の比較を行った。

ブドウ糖０．０５％の場合、実施例５は、比較例３と比較して風味の変化がなかった。
ブドウ糖１０％の場合、実施例５は比較例３と比較してより風味がフラットとなり、苦みが消失していた。
ブドウ糖７０％の場合、実施例５は、比較例３と比較して風味がフラットとなり苦みを感じなかったが、温度が下がると粘度が上昇し、固まってしまった。

以上説明したように、本発明の方法により風味に優れた低苦味大豆ペプチド混合物を、効率よく製造できるようになったものである。

Claims (6)

1. 大豆蛋白溶液のｐＨをアルカリ性領域（ｐＨ８〜１０）に調整した後アルカリ性領域に５分〜300分間保持し、しかる後、酵素分解を行うことを特徴とする大豆ペプチド混合物の製造法。
2. 酵素分解の程度が１５％TCA可溶率で５０％〜９８％である請求項１の製造法。
3. 酵素分解に用いる酵素がアルカリ性プロテアーゼである請求項１の製造法。
4. 酵素分解をアルカリ性域から酸性域にかけて行う請求項１の製造法。
5. 酵素添加後のアルカリ（ｐＨ８〜１０）滞留時間が２、３秒〜３０分以下で酸性（ｐＨ５．０〜７．０）域滞留時間が１５分〜３００分である請求項１の製造法。
6. 大豆蛋白溶液に糖類を大豆蛋白質あたり０．１〜６０％添加する請求項１の製造法。