JPS63173592A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 」」Ｕ！ソ肋１１Ｌ 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法に関
する。Ｌ−スレオニンは輸液などの医薬あるいは医薬原
料として使用される必須アミノ酸の一つである。

従来の技術及び発明力鵡決しようとしている、　占従来
し−スレオニンの糖からの直接発酵法に使用される菌株
は、ブレビバクテリウム属（特公昭４５−２６７０８他
）、コリネバクテリウム属（、特公昭４７−３４９５６
他）、エシェリヒア属（特公昭４５−２６７０９他）、
セラチア属（特開昭５２−７４８８他）プロテウス属（
特開昭６０−１８０５９７他）、プロビデンシア属（特
開昭６１−２１６６９８他）などが知られている。

またバチルス（ＢａｃｉＡ’１ｕｓ）属に属する微生物
を使用してＬ−スレオニンを得る方法は、Ｌ−スレオニ
ン生合成の前駆物質であるし一ホモセリンを培地中に添
加してこれよりＬ−スレオニンを蓄積変換させる方法（
日本農芸化学会誌３９巻（・６５年）　Ｉ）２１６〜２
２１）は知られているものの、バチルス属に属する微生
物を用いて、糖類培地中で直接発酵によりＬ−スレオニ
ンを得ることは全く知られていなかった。

これらの従来方法によるＬ−スレオニンの生成蓄積濃度
は満足すべきものではなく、また発酵技術としても困難
な点が多かった。また発酵技術の比較的容易なバチルス
属の微生物を用いる場合では、先に述べた通り高価な前
駆物質を原料とせねばならず安価な糖類により直接発酵
による方法が望まれていた。

４　点を解　するための　　および　用本発明者らは鋭
意検討の結果、バチルス属に属シン、Ｌ−バリン、Ｌ−
リジン、Ｌ−メチオニンのうち少なくともいずれか一つ
をアミノ酸要求性として持つ菌株を用いてＬ−スレオニ
ンを糖がらの直接発酵により蓄積する菌株を見い出し本
発明に達した。

本発明において使用する微生物は具体的には例えば以下
のものがあげられる。

バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ＃ｕｓ　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）ＯＭＴ−３０１２（ＦＥＲＭ　　Ｐ−’
？／／５）（Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン要求性
）バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ＃ｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＯＭＴ−３０１３（ＦＥＲＭ　　　Ｐ−’？Ｉ
／６）ＯＭＴ−３０１４（ＦＥＲＭ　　ｐ−Ｃ１１Ｉ７
）（Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ
−メチオニン要求性） これらの変異株の変異誘導方法は、紫外線照射またはＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンにて
処理する通常の方法が迂応される。

変異株の選別は、栄養培地（例えばＮｕｔｒｉｅｎｔａ
ｇａｒ　ｐｌａｔｅ　）で生育後、ＬＬアラニン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−リジン
、Ｌ−メチオニンの全種を添加した最小培地（例えば５
ｐｉｚｉｚｅｎ　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ　）及び上記ア
ミノ酸のうち一種類ずつを除いた５種のアミノ酸を添加
した最小培地にレプリカを行い、目的のアミノ酸を含ま
ない最小培地では生育できないコロニーより採取するこ
とにより行うことができる。

また２つ以上のアミノ酸要求性の付与は、１回の変異操
作によって得られた場合もあるが、これらの菌株の中に
は数回の操り返しによって得られた菌株もある。

親株としては例えばバチルス　ズブチリスＡＴ、ＣＣ−
６０５１、バチルス　ズブチリス　ＡＴＣＣ−２３８５
７などが使用できる。

また本発明においては、前記以外のアミノ酸、ビタミン
、核酸などの栄養要求性を付与した変異株を親株として
用いるとさらに好結果が得られる場合が多い。さらには
抗生物質などの薬剤耐性、α−アミノ−β−ヒドロキシ
吉草酸などのアナログ耐性をもつ菌株も使用できる。

本発明の変異株の各アミノ酸に対する生育度は第２表に
示すとおりであり、その実験は以下のようにして行なっ
た。

各菌株を栄養寒天培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ａｇａｒ　
）で培養後第１表に示す最小培地で洗浄し、その懸濁液
を第２表に記載した量の各アミノ酸を添加したノ酸無添
加の最小培地で培養した時の生育度を１００とした相対
値である。

（以下余白） 第１表　最小培地組成 に２Ｉ−ＩＩ）０４１４ｇ／１ Ｋｌ（２ＰＯ４６ｇ／１ （Ｎｌ（４）２８０４　　　　　　　　　　　　　２　
ｇ／　ｌクエン酸ナトリウム・２Ｉ−Ｉ２０１ｇ／１ｈ
ｌｙ　ＳＯ４・７Ｈ２０Ｑ　２　ｆｉ／１グルコース　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｆｉ／１ア
デニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０１ｎ
Ｉｉ／ｌＬ−フェニルアラニン　　　　　　　　　　　
　５０ｍ９／ＩＬ−）−リプトファン　　　　　　　　
　　　　　５０ｔｔｕｐ／ＩＬ−アルギニン　　　　　
　　　　　　　　　５０■／ｌＬ　−−ｆ−０シン５０
！ｎｇ／ｉＪ （以下余白） 第２表　各菌株のアミノ酸に対する生育度本発明におい
て、培養法については特に制限はなく、これらの微生物
を培養する培地は炭素源、窒素源、無機イオン及び更に
必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培
地である。

炭素源としてはグルコース、シュクロース及びこれらを
含有する炭水化物、酢酸などの有機酸、エタノールなど
のアルコール類が使用できる。窒素源としてはアンモニ
ア水、アンモニアガス、アンモニア塩類などが使用でき
る。無機イオンとしてはカリイオン、リン酸イオン、マ
グネシウムイオンなどが必要に応じて添加される。さら
に生育に必要な有機微量栄養素が必要に応じて添加され
る。培養は好気的な条件が好ましく、ＰＨは６ないし８
に、温度は２５〜４５°Ｃで良好な結果が得られる。

以下に実施例を示す。

なおし−スレオニンの蓄積量については、ストｅｃａｌ
ｉｓ、　ＡＴＣＣ８０４３）を用いた微生物定量法「ジ
ャーナル轡オブ・バイオロジカル書ケミストリイｖＯ１
１６０，３５頁、（１９４５）〕ニヨリ調ヘタ。

即ち、グルコース、無機塩類、ビタミン、核酸塩基、ス
レオニン以外の各種アミノ酸を含む基本培２０　ＮａＯ
Ｈにてブロムチモールブルーとニュトラルレッドの混合
指示薬を用いて滴定し、生成酸量を測定した。以上の方
法で標準曲線を作製し、試料中のスレオニンを分析した
。

実施例 第３表に示した組成の培地に第４表に示す各菌株に対し
てアミノ酸を添加した培地を１００＋＋＋ｌずつ５００
ｍ１容坂ロフラスコに分注し、オートクレーブどう培養
した。培地中には第５表に示す量のＬ　−スレオニンが
蓄債していた。

（以下余白） 第３表 Ｋ　２Ｉ−ＩＰｏ　４５９／ｌ ＫＨｚＰｏ　４５ｇ／１ Ｍｇ５０４　・７Ｈ２００，２９／１ （ＮＨ４）　２　ＳＯａ　　　　　　　　　　　２　ｇ
／ｌＬ−フエ勾しアラニン　　　　　　　　　　　　　
５０ｍ９／ＩＬ−トリプトファン　　　　　　　　　　
　　　　　５０■／１Ｌ−７７しｒニン　　　　　　　
　　　　　　　　　　５ｏｒｎｇ／ｌＬ−チロシン　　
　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｐ／７アデニン
　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｙ／１／４１
′／ ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　２ｏｏｑ／
１（以下余白） 培養終了後、バチルス　ズブチリス　ＯＭＴ−３０１２
の培養液２１を遠心分離して菌体残造を除去し、上澄液
を強酸性イオン交換樹脂レバチットＳ−１００のカラム
に流し１０％７ンモニア水で溶離した。

別し、得られた湿体を乾燥して２．８１のＬ−スレオニ
ン結晶を得た。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシ
   ン、Ｌ−バリン、Ｌ−リジン及びＬ−メチオニンの少く
   ともいずれか一つのアミノ酸を栄養要求性として有する
   、バチルス属に属する微生物を、該菌株が資化しうる炭
   素源、窒素源、無機物及びその他の栄養源を含有する培
   地に培養して、培地中にＬ−スレオニンを生成蓄積させ
   、培養物からＬ−スレオニンを単離採取するＬ−スレオ
   ニンの製造方法。
2. （２）、微生物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシンを同時
   に栄養要求性として有する特許請求の範囲第（１）項記
   載の微生物。
3. （３）、微生物が、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン
   を同時に栄養要求性として有する特許請求の範囲第（１
   ）項記載の微生物。
4. （４）、微生物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−リジン、Ｌ−メ
   チオニンを同時に栄養要求性として有する特許請求の範
   囲第（１）項記載の微生物。
5. （５）、微生物が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、
   Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニンを同時に栄養要求性として
   有する特許請求の範囲第（１）項記載の微生物。