JPS62502568A - ミモト−プの決定のための改良された方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ミモトーブの決定のための改良された方法本発明は特定の受容体のための配位子 分子に相当するモノマー分子の配列の検出または決定方法に関する。

このようにして決定されたモノマー分子の配列は下記に定義するように特定の配 位子のミモトープ（ｍｉｍｏ−ｔｏｐｅ）である。

この方法によって決定されたミモトーブは、自然の配位子分子と何らの明白な、 または直接的関係を有していないが、受容体と反応する能力を自然の配位子分子 と共有し、事実、このように決定されたミモトープは受容体との反応における特 定の、または付加的性質を取り入れるように修正することができる。

かかるミモトープは特定の疾患の治療または予防において自然の配位子の代りに 用いることができ、或いは特定の生物学的効果の仲介に用いることができる。

本明細書を通して用いられるように、下記する用語は以下に述べる意味を有する 。

受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）　：特定の配位子分子と特定的に結合する分子また は分子錯体。

これら受容体は、特定の配位子との結合によって最も興味のある生物学的機能を 仲介する。

受容体の例には、細胞の表面膜と関連する通常の受容体群が非限定的に含まれ、 またたとえば免疫学的に重要な、Ｂ−細胞（Ｂ−ｃｅｌｌ）、Ｔ−細胞（Ｔ−ｃ ｅｌｌ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏ−ｐｈａｇｅ）等の受容体が含まれる。

他の例は神経細胞におけるアセチルコリンの受容体であり、受容体分子がその配 位子のアセチルコリンと反応するときにノイロン（ｎｅｕ−ｒｏｎ）の長さに伝 達される神経動悸を生ずる。

エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）　：抗体として知られている受容体のサブクラス （ｓｕｂｃｌａｓｓ）との相互作用の領域によって描写される抗原分子の特定表 面。

カフマー（ｃａｔａｍｅｒ）　：小さい分子の縮合によって形成された、正確に 定義された鎖状配列のポリマー分子。

この用語は小分子の結合に異なるタイプの縮合反応が用いられた分子を含むこと に注意すべきである。

“カフマー”の接頭語として付された数字は、カフマーが示された数の小分子の 縮合によって形成されたことを意味し、たとえば８−カフマーは８個の小分子か らカフマーが形成されたことを意味する。

カフマーの例には、与えられたいずれのペプチドおよびオリゴサツカライドが含 まれる。

七ツマ−（ｍｏｎｏｍｅｒ）　：相互に縮合してカフマーを形成することができ る一連の小分子の組合せを云う。

この組合せには、非限定的な例として、たとえば通常の一組のし一アミノ酸、− 組のＤ−アミノ酸、−組の合成アミノ酸、−組のヌクレオチド、および一連のペ ントースおよびヘキソースが含まれる。

ペプチド：小分子がα−アミノ酸であり、ペプチド結合で相互に結合したカタマ ー。本明細書内においては、アミノ酸はＬ−光学異性体またはＤ−光学異性体で ある。

ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）　：少なくとも構成の一つにおいて、配位子分 子の結合表面に同等の分子トポロジーの表面領域を有し、擬態であるカタマ免疫 学的受容体に関しては、ミモトープは抗原のエピトープにｔ＝Ｓである。

相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）　：配位子分の反応性表面とその受容体 の相互組合せに関する。すなわち、受容体およびその配位子は相補性として記述 することができ、更に接触表面の特徴は相互に相補性である。

バラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）　：特定のエピトープと相補性の抗体の結合位 置。

配位子（ｌｉｇａｎｄ）分子：特定の受容体と結合する分子であり、その受容体 と結合したときには、特定の受容体と関連する生物学的機能を仲介する。

本発明の方法によって研究することができる受容体の例には、下記の受容体が非 限定的に含まれる。

ホルモン受容体：たとえばインシュリンおよび成長ホルモンの受容体；これら受 容体に結合する配位子のミモトープの決定は、糖尿病の症状を軽減するために糖 尿病患者が受けねばならぬ日々の注射を経口投与に置き換える改善をもたらすこ とができる。

また他の例は、血管収縮ホルモン受容体である。

かかる受容体に結合する配位子のミモトープの決定は血圧コントロールの薬剤の 開発をもたらす。

阿片剤（ｏｐｉａｔｅ）受容体：脳における阿片剤受容体に結合する配位子のミ モトープの決定は、モルフインおよび関連する薬剤の代りに、より中毒性の低い 薬剤の開発をもたらすことができる。

微生物受容体：微生物の生存に必須な特定の移送（ｔｒａ−ｎｓｐｏｒｔ）タン パク質または酵素のような受容体に結合する配位子のミモトープの決定は、新規 なりラスの抗生物質をもたらすことができる。特に価値があるのは、原生動物に 対する抗生物質および日常の使用によって抗生物質に抵抗性を有するバクテリア に対する抗生物質である。

酵　素：たとえば、神経の伝播者（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）を開裂することが できる酵素；異なる神経伝播者を開裂する酵素の作用を調整することができるミ モトープの決定は、神経の伝達の疾患の治療に用いることができる薬剤の開発を もたらす。および、 抗　体：たとえば、対象となる抗原のエピトープと結合する抗体分子上の配位子 結合位置。

エピトープに対するミモトープの決定は、インミュノジエン（ｉｍｍｕｎｏｇｅ ｎ）が一つまたはそれ以上のミモトーブ、または診断薬、または自己免疫症の治 療に有効な化合物にもとづくワクチンの開発をもたらす。

本発明の方法によって研究することができる配位子の例には、非限定的に下記が 含まれる。

毒素（ｔｏｘｉｎ）および毒液（ｖｅｎｏｍ）　：たとえば体内において特定の 受容体と反応して特定の中毒症状を示す毒素分子の結合位置。

配位子の結合位置に対するミモトープの決定は、異型の抗蛇毒素の副作用のない 蛇および他の有毒動物における整咬の治療に用いることができる薬剤の開発をも たらす。

ビールスおよび他の微生物のカブシフト（ｃａｐｓｉｄ）分子：たとえば、体内 において細胞膜上の特定の受容体と反応してビールスを冒すことができ、特定の 細胞を感染させるビールス・カブジッド分子上の結合位置；この結合位置に対す るミモトープの決定はビールスによる細胞内浸入を防止し、それによる応答を防 止する薬剤の開発をもたらす。

本発明の第１の目的は、特定の受容体と選択的に結合してその生物学的機能を取 り結ぶ一つの、またはより短いモノマーの配列（カタマー）を検出または決定す ることにある。

これら力タマーは配位子のミモトーブである。この情報は極めて特定の診断また は治療薬の設計に非常に貴重である。

カタマーの形成のために相互に縮合することができる小分子の最も有用な群はα −アミ１．ノ酸の群である。

しかしながら、異なる選択された化学的な構成成分である他の分子もまた使用す ることができる。たとえば、ヌクレオチドまたはサツカライドの特定の連続的縮 合によって形成されたカタマーがある。

小分子の他の群は、β−アミノ酸のように非発生学的に記号を付されたアミノ酸 であり、カフマー内の特定の位置に付加結合を付加するのに有利に用いられる。

本発明の方法は、与えられた受容体が、受容体が指向する配位子に対してミモト ープであるカフマーと特定的に反応することの実現化にもとづく。

更に本発明は受容体と配位子が存在するときに、受容体とその配位子との間の反 応を検出する最近の免疫学の技術にもとづく。

オーストラリア特許第４５３３９／８５号明細書に、約８モノマーの全長にもと づくミモトープの輪郭をかくことが提案されている。これに対して本発明によれ ば、ミモトープの描写のための好ましい方法は、下記いずれかのモノマーのすべ ての結合により形成された（２または３モノマー長さ）より短いカフマーからの ミモトープであることが明らかになった。

（ｉ）同一である二組のモノマー；または（ｉｉ　）カフマーの中心モノマーが 、他の二つのモノマーに既知の空間的関係を与える特に選定されたモノマーの一 組から選択された三組のモノマー、カフマーの残りのモノマーは同一であること ができる二組のモノマーである。

更に本発明によって受容体への結合の検出の感度は、カフマー合成においてモノ マーが合成されたいくつかの例ではオーストラリア特許明細書第４５３３９／８ ５号明細書に開示されたように低下することが示された。

本発明によれば、受容体と短いミモトープとの間の反応が容易に検出されること が証明された。

これら短いミモトープは相互に結合したときには、受容体に対するより大きな親 和力で、または受容体に対するより大きな特異性で受容体と結合する。

この反応は、受容体と結合した短いミモトープが二つのモノマー分子長のような 短さであっても検出することができる。

各段階における最適の短いミモトープを決定し、次いで更に他の変形を試験する ことによって、強固に結合するミモトープの最終構造を決定することができる。

本発明によれば、対象とする特定の受容体に対して相補性のあるトポクラフィー 的に等価の配位子であるモノマーの配列を検出または決定する方法が提供される 。

そして従来技術は受容体の同一性、構造および配列またはその配位子に関して無 関係である。

本発明の方法は下記工程から成る。

１、夫々が下記一般式で表わされる複数のカフマーを合成する。

Ｄ、−Ｄ。

ここで、Ｄｌは第一のモノマーの組から選択された指定されたモノマーを表わす 。Ｄ２は前記第一のモノマーの組と同一または異なる第二のモノマーの組から選 択された指定されたモノマーを示す。

かかる複数のカフマーは、夫々の指定されたモノマーが夫々のモノマーの組のメ ンバーを含むように組織的に変化するカフマーから成る。

２、各カフマーを対象とする受容体と接触させる。そして、 ３、各カフマーと受容体の間の結合の存在または結合がないかを検出または決定 する。

本発明の方法はまた、更に下記の工程から成る。

ａ、夫々が下記の一般式で表わされる、更に複数のカフマーを合成する。

Ｄ３−Ｄ２−Ｄ、、または Ｄ２　ＤＩ　Ｄｌ ここで、ＤｌおよびＤ２は上記定義のとおりであり、好ましくは受容体に結合す るカフマーに対応するモノマーの結合を表わす。Ｄ３は第一または第二のモノマ ーの組と同一または異なる第三のモノマーの組から選択された指定されたモノマ ーを表わす。

ｂ、更に複数のカフマーと上記工程２および３を実行する。

上記工程ａおよびｂの手順は、更にモノマーをカフマーに組織的に付加し、延長 されたカフマーについて上記工程すにおけると同様な方法で試験することで繰り 返すことができる。

他の重要な観点からすれば、本発明の方法は下記工程から成る。

Ａ、夫々が下記一般式を有する複数の付加カフマーを合成する。

Ｄｚ　５ｒ−ＤＩ ここでり、およびＤ２は上記定義のとおりであり、Ｓ、はモノマーＤ１およびＤ ２の相対的配置を変更することができるスペーサ分子である。

Ｂ、上記した工程２および３を複数の付加力タマーについて実施する。

上記したスペーサ分子“ＳＰ″は、また上記した“延長された”カフマーのすべ ての可能な位置に組織的に導入し、上記工程Ｂにおけると同様な方法で試験する ことができる。

更に他の観点からすれば、本発明の方法は、更に上記したいずれかのカフマーに おけるモノマーを、その光学的異性体で個々に、またはモノマーの組合せで組織 的に置きかえる工程および上記工程２および３を再び実行する工程から成る。

更に別の観点においては、本発明の方法は更に対象とする受容体と結合する上記 したいずれがのカフマーにおけるモノマーを、個々に、またはモノマーの組合せ で、モノマーの夫々の組から選択された他のモノマーで組織的に置き変える工程 および再び上記工程２および３を実行する工程から成る。

明らかなように、本発明の方法は配位子の性質に関する情報を予め必要とせず、 特に配位子を形成するモノマーの配列の予備知識を要求しない。

事実、本発明の実施においては、受容体が指向する配位子の起源または特質を知 ることを必要としない。

更に、本発明は特定の受容体の配位子の性質について仮定を必要としない。

本発明の方法は連続的配位子と同様に非連続的なミモトープを確認することがで きる。

本発明の方法の特性の故に、ミモトープが配位子を形成するモノマーと同−絹の メンバーから成るものであっても、または同−組のメンバーから成らないもので あっても良い。

本発明の実施において、合成されることが要求される複数のカフマーは、既知の いずれかのカフマー合成法によって合成することができる。モノマーがアミノ酸 である場合の好ましい方法は、オーストラリア特許明細書第２５４２９／８４号 に記載された固相技術を使用する方法であり、この方法では夫々のカフマーがポ リエチレン担体上で合成される。

受容体が抗体である場合に、受容体と結合することができる配位子に対するミモ トーブの決定に通用した場合について、本発明の一つの態様を下記に詳述する。

この説明においては、配位子は通常、抗体に対するエピトープとされている。

好ましくは、本発明の方法は、対象とする抗体に対して合成された複数のカフマ ーのスクリーニングによって行なわれる。理想的には、抗体は通常のいずれかの 方法によって合成することができるモノクロナル抗体である。

ヒトおよび動物のポリクロナル抗血清は、もしも望ましい特性を有するモノクロ ナル抗体の供給源が入手不可能の場合には使用することができる。しかしながら 、観察された反応が一つ以上のモノクロナル抗体の反応なので得られたデータの 解析が複雑になる。

の当業者に良く知られている技術、たとえば、等電集東法（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔ ｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ）　ＨＰ　Ｌ　Ｃ−クロマトグラフィーまたは親和性 （ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィーを用いて抗体の変化を低下させること が必要である。

最近の指摘によれば、モノマーがα−アミノ酸の組の場合には通常約６個の七ツ マ−の長さであるカフマーによってエピトープが模されることが示唆される。

しかしながら、本発明は６個のモノマーから形成された配列に限定されないこと が理解されるべきである。

６カタマーがエピトープのミモトーブである能力は、指示されたモノマーを有す る夫々の位置に依存しない。

成る位置では多くのミモトープは受容体と結合する単一の指示されたモノマーに 限定されないことが見出された。

Ａ、？　支のカフマー０合 上述したように、本発明の実施に好ましい方法は、カフマーを固体担体上で合成 することである。

この場合には、複数のカフマーは下記一般式を有する。

Ｙ−Ｄ２−ＤＩ−ＬＫ−（固体担体） ここで“ＬＫ”はモノマーを固体担体に縮合するために好適な末端基となる結合 分子（ｔｉｎｋｅｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を表わす。“ＤＩ”および′Ｄ２°は 既知のモノマーの組から選択されたモノマーによって占められた指定された位置 を示す。しかしながら、これらはカフマーの間で組織的に変化することができる 。

Ｄ、として指定された位置に用いたモノマーの組は、Ｄ２として指定された位置 に用いたモノマーの組と同一である必要がないことに注目すべきである。

−ｉ弐における“Ｙ”はカフマーの末端基であり、たとえば水素原子またはアセ チル基であるが、これに限定されない。

”Ｙ”はまた、カフマーに結合して指定されたアミノ末端位置におけるペプチド 結合の分子環境の特定の特性を保持するの分子であっても良い。

もしも土がり７位置に結合するモノマーの組におけ」の合計の異なるカフマーが 合成される。

この態様においては、担体棒が製造され、この結果、適切な結合分子の結合によ ってモノマーがこの担体棒に結合される。

Ｄ＋位置における結合のために、夫々の担体棒が保護されたアミノ酸のような単 一のモノマーのみを含む反応混合物で処理される。この位置に１個のモノマーが １個の担体棒に夫々結合される。

Ｄ２位置における結合のために、保護されたアミノ酸のような単一のモノマーを 含む反応混合物によって、夫々の担体棒が処理される。ＤＩ位置に特定のモノマ ーを有する１個の棒の夫々が、Ｄ２位置に結合した異なるモノマーを存する。

このようにして、モノマーの組のすべての結合が±・ｉ担体棒において行なわれ る。

望ましい末端基“Ｙ”が次いで適当な化学技術を用いて結合される。

複数のカフマーの合成の後に、適切な技術を用いてカフマーから側鎖保護基が除 去され、担体棒に結合したカフマーが洗浄される。

本発明の好ましい態様によれば、データの解析を助けるために複数のカフマーの 一組以上を合成することが好ましいことが見出された。

すなわち、上記一般式 ％式％） のカフマーの合成と同様に、下記一般式を有するカフマーの追加の組が合成され る。

Ｙ　Ｄ２　Ｓｐ　Ｄ＋　ＬＫ−（固体担体）ここで、“Ｓ、”は指定された位置 においてモノマーの相対的配置を特定の幾何学的構成に制限するスペーサ分子で ある。

スペーサ分子は、指定された位置Ｄ１およびＤ２におけるモノマー間の相対的幾 何学的構成により大きな柔軟性を与えるように意図的に選択することもできる。

スペーサ分子の組のメンバーは一つ以上のモノマーの縮合によって形成すること ができることに注目すべきである。

スペーサ分子の非限定的な例には、グリシン（はぼ直鎖延長）、β−アラニン（ たわみ性の増加）、プロリン（強制わん曲）、グリシルプロリン（延長わん曲、 或いはタンパク質構造用語において逆わん曲として知られている）および０−ア ミノ安息香酸（平坦わん曲）が含まれる。

これら力タマーの組からの結果の分析によって、ミモトーブにおけるモノマー間 の好ましい立体的関係を下記の適切な実施例に示されるように推論することがで きる。

Ｂ、複数のカフマーの試験 上記Ａにおけるようにして合成された複数のカフマーが次いで対象とする特定の 抗体と接触せしめられる。

抗体と各カフマーとの間の反応が、次いで通常の方法、たとえば放射線免疫学的 測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＲＩＡ））によって検出される。

しかしながら、好ましい検出方法は良く知られた酵素−結合イミュノソルベント ・アッセイ　（ｅｕｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓ ｓａｙ（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）　）を用いる方法である。

各アッセイの終りに、たとえば８Ｍ尿素溶液、０．１％２−メルカプトエタノー ルおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液、次いでリン酸塩緩衝食塩液で数 回洗浄することによって抗体がカフマーから除去される。

このようにして、複数のカフマーを多くの他の抗体との試験に用いることができ る。

Ｃ，データの解析 カフマーの組の抗体による試験において、成る種のカフマーは抗体と検出可能な 結合を示すことが見出された。

かかる反応性カフマーはモノマーの組のメンバーの有用な組合せを認めるもので ある。

これら七ツマ−の組合せは短いミモトープであり、延長したときに、より大きな 親和力で抗体と結合することができ、或いは特異性を変化させる。

データの解析は、著明な応答の決定を助ける、いくつかの制御ペプチドを合成中 に含めることによって著しく容易になる。更にデータの解析は、下記のようない くつかの方法によって行なわれる。

１、モノマーのかかる反応性組合せの夫々順序を変えてパラトープに結合するミ モトープを含むカフマーのリストをつくり出す。このリストにおいて、夫々のカ フマーは可能なミモトーブとして考慮される。

２、モノマーの反応性組合せのリストから候補を選定し、更にモノマーの既知の 反応性組合せが一定に保持され、更にモノマーが両端に組織的に付加されたカフ マーの組を合成する。

従って、上記実施例においては、かかるカフマーの適切な組は、下記式のカフマ ーを含む。

Ｙ　Ｄ：＋　Ａｚ　Ａｚ　ＬＫ　（同体担体）、およびＹ−Ａ２−Ａ、−Ｄ：＋ −ＬＫ−（固体担体）ここでＡ１およびＡ２は上記結果からのモノマーの反応性 組合せを構成し、Ｄ３はモノマーの組のメンバーが夫々組織的に変化する新しく 指定された位置である。

３、複数のカフマーの異なる組からの結果を組合せて結果を解析し、モノマーの 単一の配列、または対象とする抗体に結合する、かかる配列の小メンバーを推論 する。

このデータの解析は、モノマーの反応性組合せが相互に隣接する場合およびモノ マーの反応性組合せがそれらの間に特定の幾何学的構成を有する場合が知られて いるので、可能である。

このようにして、これらデータは、抗体に結合したとき、ミモトーブの構成を予 知すると解釈される。

この解決法は、複数のカフマーの試験に用いた抗体がモノクロナル抗体である場 合に最も有利である。

上記２．に示された操作が、ミモトープの付加的延長によっても、もはや結合の 増加が達成されなくなるまで繰り返される。

理想的には、ミモトープの配列はオーストラリア特許明細書第２５４２８／８４ 号に記述されたように、更に延長することによって最適に結合されたミモトープ を得るために、ミモトーブの置換ネットを規則的に合成し、試験することにより チェックされるべきである。

Ｄ０選択されたカフマーの合成 選択されたカフマーは、Ａ、においで用いた方法と類似の方法を用いて合成する ことができる。

選択されたカタマーが合成された後に、対象とする抗体と反応せしめられる。

抗体と最も強固に結合するカタマーを選択することは容易である。

ミモトープと抗体との結合は、最も強固に結合するミモトープの配列にもとづく 複数のカタマーの合成によって更に促進される。

この複数のカタマーは、ミモトープのすべての位置に組織的にスペーサ分子（’ Ｓｐ　）を加入することから成り、カタマーの夫々のモノマーをその光学的異性 体によって組織的に置換することによって達成される。

抗体による、このカタマーの組の試験はモノマーの相対的配置および抗体との結 合に要求されるモノマーの立体化学について極めて貴重な情報を与える。

下記実施例１，２．３および４においては、ミモトープが異なるモノクロナル抗 体が提起された抗原について決定された。

特に触れない限り、定義されたモノマーの組は通常のし一α−酸の組である。結 合分子の−ＬＫ−は３−アミノーＮ゛（６−アミノヘキシル）−プロパンアミド であり、末端基−Ｙはアセチル成分である。

下記実施例５においては、ミモトープはモノクロナル抗体を生じたヒトの絨毛性 ゴナドトロピン（ｃｈｏｒｉ−ｏｌｉｃ　ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ）の抗原 性決定因子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）にツイテ決定すレタ 。

結合分子−ＬＫ−は上記実施例において用いたものと同一である。末端基Ｙ−は β−アラニル−β−アラニンまたはβ−アラニンのいずれかである。定義された モノマーの組が通常のα−アミノ酸のＤ−光学異性体を含むように延長された。

下記実施例６においては、ビールスの受容体位置についてミモトープが決定され た。結合分子−ＬＫ−は上記実施例と同じであり、末端基Ｙ−はβ−アラニル− β−アラニンまたはβ−アラニンのいずれかである。モノマーの定義された組が 実施例５について記述されたように延長された。

大庭五土 通常の技術を用いて、マフコラクジラ（ｓｐｅｒｕｍ　ｗｈａｌｅ）・ミオグロ ビンに対してモノクロナル抗体が提示された。

このモノクロナル抗体が下記一般式を有するカタマーの組に対して試験された。

Ｙ　Ｄｚ　Ｄ＋　ＬＫ−、（固体担体）三対の反応性モノマーが結合されて、は ぼ等しい応答を有し、かつ他のモノマー対よりも著しく高いカタマーが得られた 。

配列はＥ−Ｆ、ＥＬおよびＥ−Ｈであった。

更に、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニンＣＦ）、ヒスチジン（Ｈ）および ロイシン（Ｌ）のモノマーの組から形成された４−カタマーからなる全てがカタ マーの組が合成された。

下記のカタマーは他のカタマーよりも著しく結合性に冨むことが見出された。

この短いミモトープの小さい群は今や更に延長するための候補となった。

去施±１ 通常の技術を用いてマツコラクジラ・ミオグロビンに対してモノクロナル抗体が 提示された。このモノクロナル抗体が下記一般式を有するカタマーの組に対して 試験された。

Ｙ　Ｄｚ　Ｄ＋　ＬＫ　（固体担体） 反応性モノマーの三対が結合され、はぼ等しい応答を有し、かつ他のモノマー対 よりも著しく高いカタマーが得られた。

配列はＥ−Ｆ、Ｅ−ＬおよびＥ−Ｈであった。

更に六つのカタマーの組がＥ−Ｆ、Ｅ−ＬおよびＥ−Ｈの対を出発点として用い て合成された。たとえばＥ−Ｆの対を用いたとき、各組におけるカタマーは下記 一般式を有する。

Ｙ−Ｅ−Ｆ−ＬＫ−（固体担体）、またはＹ　Ｅ　ＳＰ　Ｆ　ＬＫ　（固体担体 ）ここでＳＰはβ−アラニン、グリシンおよびＬ−プロリンの組からなるスペー サ分子である。更にグルタミン酸およびフェニルアラニンの両者のＤ−光学異性 体がＬ−光学異性体の代りに組織的に置換された。

最高の応答を与えたカタマーは、Ｄ−グルタミン酸−Ｌ−プロリン−Ｌ−フェニ ルアラニン−Ｌ−グルタミン酸−り−ロイシン、およびＤ−グルタミン酸−Ｌ− プロリン−Ｄ−ヒスチジンの組から成るカタマーであった・ これらの結果は、モノマーＦおよびＨはＥに隣接しないことがより良い位置であ り、更にＥおよびＬは隣接することが最も良い位置であることを示した。

最高の結合を与えたカタマーにおける光学異性体は、より強く結合するミモトー プに対して下記したような、構造を示唆した。

マツコラクジラ・ミオグロビン分子は予期されたミモトープに類似する領域を有 することに注目すべきである。

明らかなように、この予知されたミモトーブは更に延期するための候補となった 。

下記する構造は、マツコラクジラ・ミオグロビン（実施例２参照）に対してモノ クロナル抗体に結合したアミノＭＦ、Ｅ、ＬおよびＨの間の立体的相互関係の二 次元的表現である。

これは説明のみであることに注目すべきであり、説明されたカフマーが平面的で あると解釈されるべきではないことに注目されるべきである。

更に、ＦとＥ、ＬとＨを連結する結合がペプチド結合の距離よりもより大きいこ とを意味する。

この構造をミオグロビンのＸ−線結晶学構造と比較したとき、−Ｆ−Ｌ−Ｅ−Ｌ −の配列が１３５〜１３８の位置に現われ、かつ位置１３６においてグルタミン 酸に極めて類似する二つのヒスチジン残基（位置８１および８２）が存在するこ とに注目することは著しく興味あることである。

これはモノクロナル抗体のエピトープの主張された構造に対する著しい信用を与 える。

大見椹主 鵞口庶ビールスに対して提示されたモノクロナル抗血清に対するミモトープが下 記配列に描写された。

Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｇ　−Ｈ−Ｓ 一連のカフマーが合成され、β−アラニン残基がモノマー間に組織的導入された 。

配列Ｗ　−Ｑ　−Ｍ−β−Ｇ−）Ｉ−３がベースの配列よりも著しくより大きい 応答を与えた。ここでβはβ−アラニンを示す。

更に抗体への優れた結合が下記配列によって達成されたことが見出された。

Ｗ−Ｑ−Ｍ−β−β−Ｈ−Ｈ −３Ｗ−Ｑ−β−β−β−Ｈ−３ このことは、出発ミモトープにおけるグリシンが二つの反応性成分Ｗ　−Ｑ　− ＭおよびＨ−３の間のスペーサであることを示唆している。すなわち、ミモトー プが二つの部分から構成され、更にこれらの部分の相互の結合は抗体と強固に反 応し得るミモトープにとって必要ではないことが明白である。

カフマーの更に他の組が合成され、ここでは出発ミモトープにおけるし一光学異 性体千ノマーをＤ−光学異性体で組織的に置き換えた。抗体による試験結果は、 最も強い結合のためには、各成分中のモノマーは同一の光学異性体を有すべきで あり、Ｗ−Ｑ−Ｍ成分における七ツマ−はＤ−光学異性体であり、一方、Ｈ−３ 成分における七ツマ−はＬ−光学異性体であることが好ましいことを示した。

かかる結果は、抗体に対するエピトープは、二つの隣接する反対方向に平行な鎖 から構成され、ここで鎖の方向はＭ−Ｑ−Ｗであり、第２の鎖はＨ−３であるこ とを意味すると解釈される。

この予告はモノクロナル抗体に対する他のミモトープは Ｇ−Ｈ−３−β−Ｇ　Ｗ　Ｑ　Ｍ であろうとの示唆を導く。

この配列は合成され、より強く結合する下記のカタＷ−Ｑ−Ｍ−β−Ｇ−Ｈ−３ と同等の結合で抗体と反応することが見出された。

従って、二つの成分Ｗ−Ｑ−ＭおよびＨ−３が相互に結合する方法は、これらの 相対的位置が同一に保たれる限り、抗体との結合能力と無関係である。

潜在的インミュノジエンとして最高のミモトープは、構造上の可動性を最少にす るためにこれらの成分が両サイドから共に結合したミモトープである。

実施開↓ 鵞口蒼ビールスに対するモノクロナル抗体（ＳＯ９３−７）が下記一般式を有す るカフマーにより試験された。

ｙ　０２　ＤＩ　ＬＫ　（固体担体） ジペプチドＱ−Ｆが他のいずれのジペプチドよりもモノクロナル抗体と著しくよ り強固に反応したことが見出された。

更に下記一般式を有するカフマーの組が合成された。

Ｙ−Ｑ−Ｆ−Ｄ！−ＬＫ−（固体担体）、およびＹ−Ｄ：＋　Ｑ−Ｆ　ＬＫ　（ 固体担体）これら力タマーの組が抗血清と反応したとき、下記力タマーがいずれ の他のカフマーよりもモノクロナル抗体と著しく良好に反応したことが見出され た。

短いミモトープのこの小さい群は、更に延長するための候補となった。

災施烈ｌ モノクロナル抗体（Ｓ２１８−４）を通常の技術を用いてヒトの絨毛性ゴナドト ロピンに対してとり上げた。

これを下記一般式のカフマーを用いて試験した。

Ｙ　＋　−Ｄ　ｚ　−Ｄ　＋　Ｌ　Ｋ　−（固体担体）ここでＹ、−はβ−アラ ニル−β−アラニンである。

モノクロナル抗体に最も強く結合した、指定された位置におけるジペプチドはＦ −Ａであることが見出された。

更に下記一般式〇カフマーの組を合成した。

ＹＺ−Ｄ：ｌ−３Ｐ−Ｆ−Ａ−ＬＫ−（固体担体）および ＹＩ　Ｆ　Ａ　Ｓｐ　Ｄ：＋　ＬＫ　（固体担体）ここで、ＳＰは組〔なし、β −アラニン〕の成分であるスペーサであり、￥２−は末端基のβ−アラニルであ る。

指定された位置Ｄ３において用いたモノマーの組を、通常のα−アミノ酸および 普通ではないアミノ酸、すなわちα−アミノ酪酸、Ｔ−アミノＩＭ！、゛Ｌ−ノ ルクロイシン（ｎｏｒｃｌｅｕｃｉｎｅ）　、サルコシン、オルニチン、Ｌ−ノ ルバリン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、β−アラニンのし−およびＤ−光学異性 体の両方を含むように延長した。

かかるカタマーの組がモノクロナル抗体と反応したとき、最も強く反応したカタ マーは下記であることが見出された。

ここでＰ、およびＡ、は夫々プロリンおよびアラニンのＤ−光学異性体である。

更に下記一般式〇カタマーの組を合成した。

Ｙｚ　Ｄａ　ＳＰ　ＰＤ　Ｆ　Ａ　ＬＫ　（固体担体）ＹＩ　Ｐｏ　Ｆ　Ａ　Ｓ ｒ　Ｄ４−ＬＫ　（固体担体）ＹＩ　Ｄ４　ＳＰ　ＡＤ　Ｆ　Ａ　ＬＫ　（固体 担体）および ＹＩ　Ａｎ　Ｆ　Ａ　Ｓｒ　Ｄｉ　ＬＫ　（固体担体）ここで延長されたモノマ ーの組を指定位置Ｄ４に用いた。

これらカタマーの組がモノクロナル抗体と反応したとき、最も強く反応したカタ マーは下記であることが見出された。

ＹＩ−Ｐｎ　Ｆ　Ａ　Ｄ。

ここでり。はアスパラギン酸のＤ−光学異性体を示す。

更に下記一般式〇カタマーの組を合成した。

Ｙｔ−Ｄｓ−３Ｐ−ＰＤ−Ｆ−Ａ−Ｄｏ−ＬＫ−（固体担体）および ＹＩ　ＰＤ　Ｆ　Ａ　Ｄｏ　Ｓｒ　Ｄ５　ＬＫ　（固体担体）ここで延長された モノマーの組を指定位置り、に用いた。

これらカタマーの組がモノクロナル抗体と反応したとき、最も強く抗体と反応し たカタマーは下記であることが見出された。

ＹＩ・−Ｒ８−β−Ｐｏ−Ｆ−Ａ−Ｄ。

ここでβはβ−アラニンを示し、スペーサとしてカタマーの合成中に含まれてい る。

モノクロナル抗体をヒトの絨毛性ゴナドトロピンで前処理すると、抗体がカタマ ーβ−Ｒ，−β−ＰＤ−Ｆ−Ａ−Ｄｐと反応する能力が除去されるが、このこと はミモトープの特異性を明らかにしている。

災施斑立 この実施例は本発明を、抗体を産生した抗原ではない受容体に対するミモトープ の検出に用いた場合を説明する。

この実施例では、ピリオン（ｖｉｒｉｏｎ）が結合する受容体のミモトープを検 出した。

この場合には、カタマーへの結合の検出のためのシステムを修正する必要があっ た。この実施例では、合成されたカタマーをインフルエンザ・ビールス粒（菌株 Ａ−５ｈｅａｒｗａｔｅｒ／１／７２）と反応せしめた。反応の後にカタマーを 洗浄して結合していないビールス粒を除去した。結合したビールス粒の存在は、 インフルエンザ・ビールス（Ａ／Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ／１／７２）のへマグル チニン（ｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）に対して生じたポリクロナル抗体（Ｓ２ ２７−１）との反応によって検出された。

結合したビールスと反応した抗体はＥＬＩＳＡによる通常の方法で検出された。

下記一般式〇カタマーの組を合成した。

Ｙ、−Ｄ２−Ｄ、−ＬＫ−（固体担体）ここで端末基Ｙ、はβ−アラニル−β− アラニンである。

指定された位置ＤＩおよびＤ２に用いたモノマーの組は通常のα−アミノ酸のＤ −およびＬ−光学異性体である。

カタマーがインフルエンザ・ビールス菌株Ａ　／５ｈｅａｒ−ｈａｔｅｒ／１／ ７２のサスペンションと反応したとき、ビールス粒が指定された位置におけるジ ペプチドに結合した。

Ｎ−ＩＩ、および Ｍ、−ＩＤ ここで接尾語“Ｄ”は示されたアミノ酸のＤ−光学異性体を示す。

カタマーから結合したビールスを除去した後に、結合したビールスの検出に用い たと同一濃度でポリクロナル抗体５２２７−１をカタマーと反応させ、見出した ピークがポリクロナル抗体の結合よりもビールスの結合に起因することを確認し た。

更に下記一般式〇カタマーを合成した。

ＹＩ　Ｄ３　ＳＰ　ＡＤ　Ｋ　ＬＫ−（固体担体）ＹＩ　ＡＤ　Ｋ　５ｒ−Ｄ： ｌ　ＬＫ　（固体担体）ここでＹ、−はβ−アラニン末端基を表わし、ＳＰはス ペーサ（なし、β−アラニン）の組の成分を示す。

指定された位置Ｄ３に用いたモノマーの組は実施例５において述べた延長用の組 である。

かかるカタマーの組がインフルエンザ・ビールス菌株Ａ／５ｈｅａｒｈａｔｅｒ ／１／７２と反応したとき、ピリオンが最も強く下記のカタマーに結合した。

Ｙ＋　Ａｏ　Ｋ−Ｋｎ この実施例は、本発明が受容体分子および配位子のミモトープの決定に一般に適 用できることを明らかにするものである。

この方法の実施はカタマーの組の結合の存在を検出する能力によってのみ制限さ れる。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．対象とする特定の受容体に対して補足性がある配位子にトポグラフィ的に同 等であるモノマーの配列を検出または決定する方法であり、該方法は下記の工程 から成る。 １．夫々が下記一般式を有する複数のカタマーを合成する。 Ｄ２−Ｄ１ ここでＤ１は第一のモノマーの組から選ばれた指定されたモノマーを表わし、Ｄ ２は上記第一のモノマーの組と同一または異なる第二のモノマーの組から選択さ れた指定されたモノマーを表わし、前記複数のカタマーは夫々の指定されたモノ マーが夫々のモノマーの組の成分を含むように組織的に変化するカタマーからな る。 ２．夫々上記カタマーを対象とする受容体と接解させる。そして ３．夫々のカタマーと上記受容体の間の結合の存在の有無を検出または決定する 。 ２．更に下記の工程から成る請求の範囲第１項記載のモノマーの配列を検出また は決定する方法。 ａ．夫々が下記の一般式を有する複数のカタマーを更に合成する。 Ｄ２−Ｄ１−Ｄ３ ここでＤＩおよびＤ２は請求の範囲第１項において定義したとおりであり、Ｄ３ は第１または第２のモノマーの組と同一または異なる第３のモノマーの組から選 ばれた指定されたモノマーを表わす。そして ｂ．請求の範囲第１項において規定した工程２および工程３を更に上記複数のカ タマーについて行なう。 ３．更にモノマーをカタマーに組織的に付加して工程ａおよびｂが繰り返される 請求の範囲第２項記載のモノマーの配列を検出または決定する方法。 ４．更に下記の工程から成る請求の範囲第１項、第２項、第３項のいずれかに記 載のモノマーの配列を検出または決定する方法。 Ａ．夫々が下記一般式で表わされる追加の複数のカタマーを合成する。 Ｄ２−Ｓｐ−Ｄｌ ここでＤ１およびＤ２は請求の範囲第１項で定義されたとおりであり、Ｓｐはモ ノマーＤ１およびＤ２の相対的配置を変更することができるスペーサ分子てある 。そして、 Ｂ．請求の範囲第１項において定義したような工程２および３を上記追加の複数 のカタマーについて行なう。 ５．請求の範囲第２項または第３項において定義したような更に複数のカタマー の全ての可能な位置に請求の範囲第４項において定義したようなスペーサ分子Ｓ ｐを組織的に導入され、工程ａおよびｂが繰り返される請求の範囲第２項または 第３項記載のモノマーの配列を検出または決定する方法。 ６．更に、上記したカタマーのいずれかにおいて、モノマーをその光学的異性体 によって、単独、またはモノマーとの組合せで組織的に置換する工程および再び 請求の範囲第１項において定義した工程２および３を行なう工程から成る請求の 範囲第１項、第２項、第３項、第４項および第５項のいずれかに記載のモノマー の配列を検出または決定する方法。 ７．対象とする受容体と結合するカタマーのいずれかにおいて、モノマーを個々 に、またはモノマーの組合せで、モノマーの夫々の組から選ばれた他のモノマー で組織的に更に置き換え、そして再び請求の範囲第１項に定義した工程２および ３の工程を行なうことから成る請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第 ５項および第６項のいずれかに記載のモノマーの配列を検出または決定する方法 。 ８．前記複数のカタマーの夫々が固体担体上で合成され、かつ下記一般式を有す る請求の範囲第１項記載のモノマーの配列を検出または決定する方法。 Ｙ−Ｄ２−Ｄ１−ＬＫ一（固体担体） ここでＤ１およびＤ２は請求の範囲第１項で定義されたとおりであり、ＬＫは結 合分子を表わし、Ｙはカタマーの末端分子である。 ９．前記複数の追加カタマーの夫々が固体担体上で合成され、下記一般式を有す る請求の範囲第４項記載のモノマーの配列を検出または決定する方法。 Ｙ−Ｄ２−Ｓｐ−Ｄ１−ＬＫ−（固体担体）ここでＤ１およびＤ２は請求の範囲 第１項で定義されたとおりであり、Ｓｐは請求の範囲第４項で定義されたとおり であり、ＬＫおよびＹは請求の範囲第８項で定義されたとおりである。