JPS62100286A - 微生物学的に製造されるｄ（−）−マンデレ−ト−デヒドロゲナ−ゼ及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＤ（−）−マンデレート−デヒドロゲナーゼ及
びその製法に関する。

発明を達成する手段 本発明の目的物は、次の反応： Ｏ０Ｈ Ｄ−配置 の触媒作用金する、従来記載されなかった酵素分８．鎖
の脂肪族及び芳香脂肪族基も包含される。

良好な活性で立体も異的にＤ（−）−マンデレートＶこ
還元される基質、蟻酸ベンゾイル（ダリオキシル酸フェ
ニル）が特に良好に採用される。

還元反応のための水素は補酵素ＮＡＤＨにコチンアミド
ーアデニンーゾヌクレオチド）から供与される。反応の
平衡は、Ｄ（−）−マンゲル酸の側にあり、従って（特
に補酵素の一定の再生下で連続的な反応の実施において
）高い収率で蟻酸ベンゾイルはＤ（−）−マンゲル酸に
変換され得る。

本発明に依り微生物学的に製造されるＤ　（−）　−マ
ンデレートープヒトロケ９ナーゼは、次の物理−化学的
特性を％徴とする： １）反応性： これはＮＡＤＨ（ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレ
オチド）の存在で蟻酸ベンゾイルと反応してＤ（−）−
マンデレートを形成し、かつＮＡＤ＋の存在でＤ（−）
−マンデレートと反応して蟻酸ベンゾイルを形成する ；２）基質特ｉ４性 これは特に良好に蟻酸ベンゾイル、史にその他の脂肪族
及び芳香脂ｖｉ族の２−ケト−カルボン酸も還元し、か
つ特に良好にＤ（−）−マンデレート、史にその他の脂
肪族及び芳香脂肪族のＤ−２−ヒドロキシカルボン酸も
酸化する； ６）　　最適ＰＪ（−（＋自−： 還元反応のための最適−４−佃は６．０±０．５であり
、酸化反応のための最適−一値は８．５である： ４）由−安定性： ４℃及びｐＨ５〜７．５における１週間の貯蔵後に残余
ｔｆ５注８５％を示す；５ ）最適温度： 最適温度は一値６．０で５５℃である；６）鴎度安定性
ニ ー値６．０で５０℃で１５分間処理して、残余活性は９
０％である； ７）活性： 比活性約２１００Ｕ／蛋白質〜會示す；８）阻害剤の影
！＃： Ｈｇ（Ｊ２　、ＣｕＳＯ４又はｐ−クロル安、ｖ台岐第
二水銀により強く阻害される； ９）分子量： 分子量は６００００±５０００　（ゲル濾過により測定
される）である； １０）サブユニットの分子量： サブユニットの分子量は３００００±６０００（５ＤＳ
−電気泳動により測定される）である；１１）　　　Ｋ
Ｍ　−イ０−（： ４７．０における基質、蟻酸ベンゾイルを得るための還
元反応のためのＫＭ−値は０．２２ミリモルであり、ｐ
’８−０における基質　Ｄ　（−ＩＩ　−マンデレート
ラ得るための酸化反応のためのＫＭ−組は０．５ミリモ
ルである； 本発明によるＤ（−）−マンデレート−デヒドロゲナー
ゼはラクトバチルス・クルバラス（Ｌａｃｚｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｃｕｒｖａｚｕｓ　　）　ＤＳＭ　　２Ｑ　
［］　１９から得ることができる。

従って本発明のもう１つの目的は、このＤ　（−）−マ
ンデレートープヒトロケ９ナーゼの収得法であり、これ
はラクトバチルス・クルバラスＤ６１Ｖ１２００１９＝
ｋ、炭素及び窒素給掠、チアミン及び無機塩を含有する
水性栄誉媒体中で、−（５，５〜６．５及び温度６０〜
６７℃で、嫌気性培養し細胞塊を分離し、かつ酵素を細
胞から単離することよりなる。

最後に、本発明の最後の目的は、本発明ＶこよルＤ　（
ｐＨ−マンデレート−デヒドロゲナーゼを蟻酸ベンゾイ
ルからＤ（−）−マンテ゛ル酸を製造するために使用す
ることである。

本発明による酵素の収得のために、先ず乳酸桿菌科（Ｆ
ａｍｉｌｉｅ　Ｌａｃｚｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ　）
（ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　）、
ロイコストノック（Ｌｅｕｅｏｓｚｏｎｏｃ　）及びベ
ジオコツカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　）　）の４５
株を用いてスクリーニングを行なった。この株をこのス
クリーニングのために６ｏｏｍｔ−規すで、ＤＳＭ−カ
タログ中のそれぞれの株に対して推失される条件下で通
例はＤＳＭ−培地宛１１　（ＭＢ２−培地）中で６０又
は３７℃で培養した。

２０時間の培養体に、細胞塊を遠心分に［（１００００
Ｕｌ）Ｍで２０分間）により収得し７、燐酸カリウム緩
衝液（０，１モルｙ　ｐ’　７−５　）中に懸濁させ（
細菌湿潤塊１ｇ当り緩衝液４祷）、次いで常法で実験呈
用振盪器中で砕解させた。

不浴の細＠成分及びガラス玉を遠心分離（１２０００ｔ
ＪｐＭで２分間）により分離し、かつ上置液（粗抽出′
ｅ、）を＃ｆ、累活性について試験した。醇累の検識の
ために光度測定試験を利用した。そのつどの試験成分は
次のもの全含有した： 燐酸カリウム緩衝液（０，１モル；４７．０）１九ＮＡ
ＤＨ（最終襄度０．２ミリモル）２０μｌ坑酸ベンゾイ
ル（最終濃度２ミリモル）２０μｌ及び粗抽出液（ｉ！
ｉ、白質１〜２０μｇ）限定閂。

ＮＡＤＨの吸光減少を５４０　ｎｍで測定した。

得られる値から、蟻酸ベンゾイル無しで試飄が行なわれ
た場合に得られた。零値を差し引いた。

酵素活性は国際単位で挙けられ、この際単位（ト））は
１分間当りのＮＡＤＨ１μモルの減少を意味する。

試験した微生物の７種は、蟻酸ベンゾイルのＤ（−）−
マンデレートへの還元の際に明らかなＮＡＤＨ−依存の
活性を有することが明らかであった。粗抽出液の酵素活
性が衣１にまとめられている。

酵素の立体特異性の測定のために、粗抽出液を用いてＤ
（−）−もしくはＬ（＋）−マンデレートの酸化金ＮＡ
Ｄ＋の存在で次の試験成分で試みた：燐酸カリウム緩衝
液（０，１モル；ｐＨ８，０）　　　　　１　ｒｎｂＮ
ＡＤ”　（試験中２．５ミリモル）　　　　　　　　２
０μ１Ｄ（−）−もしくはＬ（＋）−マンゲルν（試験
中９．５ミリモル）２０μ！ 及び粗抽出液（蛋白質５〜５０μｙ）試験中、限定−°
。

菌株、ラクトバチルス・クルバラスＤＳＭ　２００１９
はスクリーニングにおいて最も宣い活性を示し、従って
本発明による酵素の収得のために選択した。

不発明によるＤ　（ｐＨ−マンデレート−デヒドロゲナ
ーゼの収得のために、ラクトバチルス・クルバラスＤＳ
Ｍ　２００１９金次の培地中で培養するニ ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　２０９酵母抽
出物　　　　　　　　　　　　　　５９憚準ペプトン（
ＴＪｎｉｖｅｒｓａｌｐｅｐｚｏｎ）　　　　１Ｑ　９
肉エキス　　　　　　　　　　　　　　５ｙクエン酸水
累ニアンモニウム　　　　　２ｇ酢酸ナトリウム　　　
　　　　　　　　５ソ硫酸マグネシウム　　　　　　　
　　ｏ、１ｇ硫酸マンガン　　　　　　　　　　　０．
０５　ｇ燐酸水素二カリウム　　　　　　　　　２ｙ蒸
留水　　　　　　　　　　　　　　　　１１この溶液の
一一値全６．５に調整し、次いで１２１℃（２バール）
で１５分間滅画才る。微生物を嫌気的に培養する；これ
には、培地ＶＣ窒素がスを被層させれば十分である。１
（１−規模で培地に６０゛Ｃの培養温度の達成後に２４
時間経過した前培養液３０〇九を接種する。Ｄ　（−）
−マンデレートープヒトロケ９ナーゼの活性はほんの短
かい時間で最高値を達成し、より艮い培養では活性は次
いで再ひ低下する。

５０００１−規模では、準備培養物として１０１−ｉ分
を使用することができる。仄いでこの培養物からｍ困湿
潤塊約２５ｉｅが得られる。

培＊経過中に低下する一一値を培％物中で磯アンモニア
を用いて５．５に保持する。この生物塊（Ｂｉｏｍａｓ
ｓ　）は−２０℃で著しい活性損失なしに数ケ月間中間
貯蔵され得る。

本発明によるＤ　（−）−マンデレートーデヒ）ｅ　。

ケゞナーゼは常法、例えば超音波処理又は湿式粉砕によ
る細胞の砕解及び不浴性の細胞フラグメントの分離によ
り粗抽出物の形で得ることができる。細胞フラグメント
は例えば１０に９−成分においてポリエチレングリコー
ル（分子量６０００）１０％（Ｗ／Ｗ）　、ｐＨ阻Ｏの
ための燐酸塩稜＠欣８チ（Ｗ／Ｗ）及び粗抽出液５０［
］０紅よりなる水ａ２−相−系における第１の泡体−欣
体−分配工程により分離される。この時上相は土量のＤ
（−）−マンデレートープヒトロケ９ナーゼを含有する
。

次いでこの上相に第２の液体−准捧一分配工程を行なう
。このために酵素含有の上相（３８９０ｍｅ　）に、敲
終＆量７７８０ｍｇに対して、町６．１のための燐酸塩
凌筒准８襲（ｗ／ｖ）及び塩化ナトリウム０．６モルケ
混台し、かつ１時間撹拌する。

この時Ｄ（−）−マンデレート−デヒドロゲナーゼは生
成するポリエチレングリコール／塩１ト系の下相に存在
する。

ところでそれ以上の精製のためにこの塩含有の下相ｔａ
析歳過（ｄｉａｆｉｌｚｒｊ、ｅｒｔ；　）　（、、か
つＤＥＡＥ−イオン交換−クロマトグラフィーにかける
ことができる。

本発明を次の実施例につぎ詳説する： 実施例 例１：微生物の培養 ラクトバチルス・クルバラスＤＳＭ　２００１９を前記
の培地１０Ｊ中で培養した。この培地のＰＪｐＨ−値を
６．５に調整し、次いで１５分間１２１℃（２バール）
で滅菌した。培地を窒素がスで被層し、培＊泥度６０℃
に加熱し、かつ２４時間経過した準備培養物３００１ｕ
を接種した。培養時間に依る酵素活性の経過ゲ、捕々の
時間Ｖこついて試料を収り出すことによってｍｈし、か
つ細胞の砕順により粗抽出物中に含有されるＤ（−）　
−？ンデレートーデヒドロケ８ナーゼの活性ケ測足した
。口￥素の活性は約１５時間の培＊俊にｗ制に達し、よ
り畏時間の培養で再ひ明らかに低下した。２０時間の培
養後、遠心分離（１００００ＵｐＭで２０分間）により
細菌湿潤塊５０ｇが得らねた。

例２：酵素の単陥及び精製 ５００１Ｍ−培養物からの細陥湿潤塊２０００ソをｐＨ
７，５のための燐酸塩緩衝液１００ミリモル中に２−メ
ルカプトエタノール０．１容に％の添加下で懸１＠させ
て最終谷蓋５０００ｆｆ１７１を有する４０血箪チの細
胞懸濁准にした。懸濁液の一一値を検査し、布筒性カリ
浴液で７．５にｖ！４整した。細胞内容物を４℃に冷却
した＠１＠液からがラス玉ミル（製造者：バツハオフエ
ン社（Ｆａ、。

Ｂａｃｈｏｆｅｎ　）　；　Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ　Ｔｙ
ｐ　ＫＤＬ　）　　を用いて遊離させた。このために６
００Ｉｕ入り粉砕容器に０．２５〜０．５關の大きさの
ガラス出金、嵩容量ｓｉｏｍｇが生じるように充填した
。細胞砕解は撹拌軸回転数３０００　ＵｐＭ及び流速５
７１′／時で行なわれた。恕濁准の加熱を充分に回避す
るために、冷却ジャケット及び回転軸受けを経過中−２
０℃のエチレングリコール浴液で冷却した。３回の工程
後に９０％以上の砕解度が達成された。＠濁液のｐｉ］
−値は布筒性カリ耐液で７゜０に調整した。

全系１０Ｋｇ中にポリエチレングリコール（分子、ｔ６
０００）１０％（ｗ／ｗ）　、ｐＨ３，Ｑのための燐酸
塩緩衝液８％（Ｗ／Ｗ）及び均質化された懸濁ａｓｏｏ
ｏＩ＋１７１１ｖ含有する水ｇ、２−相−系ヲ製造した
。分配平衡の調整のために２−相一系を１時間撹拌し、
次いで遠心分離で分離した。上相（３８９０１１）は全
ての存在するＤ（−）−マンデレートーデヒドロデナー
セ゛の９０％以上を含有した。下相は細胞砕片及びこの
条件下で抽出された異蛋白質を含有し、廃棄された。

上相に、最終容黛７７８　ＯＮに対して、ｐｉｐＨ６，
１のための燐酸塩緩衝液８チ（ｗ／ｖ）及び塩化ナトリ
ウム０．３モルを混合し、１時間撹拌した。

生成するポリエチレングリコール／塩鹸散−系は沈降容
器中で約１時間で児全に分離できた。

塩含有の下相（３６２０ｍｔ：　）は全ての存在するＤ
（−）−マンデレート−デヒドロゲナーゼの約８６％金
言性した。

分離した下相は中空繊維−系（製造者：ロミコン（）？
ｏｍｉｃｏｎ　）　；　ＰＭ　１０　、＋　１．８　ｆ
ｌ”　）　ｆ用いて濃縮し、かつｐＨ６，５のための燐
酸カリウム緩衝液５ミリモルの添加により最終良度５ミ
リモルまで透析論、過した。

磁動し、透析濾過した醇素俗液をＤＢＡＥ−セファセル
（５ｅｐｈａｃｅｌｌ　）を充填したカラム（５ｃｒｎ
Ｘ１４ｃｍ）にボンダで送った。イオン交換体は先ず、
μｍ６．５のための燐酸カリウム緩衝液５ミリモル及び
２−メルカプトエタノール０．１谷麓チを含有する緩衝
液に対して平衡させた。カラムは引続き出発緩伽液で後
洗浄し、次いで酵素を出発緩簀欣中のＯ〜０．５モルの
直線勾配は度の塩化す）　ＩＪウム（２ｘ８００ｆｆｉ
ｌで俗離させた。Ｄ　（−）−マレプレート−デヒドロ
ゲナーゼは塩化ナトリウム約０．１モルで陪１１ｆｌＩ
させた。活性的部分を限外継過によって改組し、これに
グリセリン５０亜、ｈｉ−’％を混合し、−２０′Ｇで
貯蔵した。精製工程の結果は第２表に総括されている。

精製された酵素は比活性約２１００Ｕ／蛋白質ｍ？を有
する。

例３：酵素的に触媒される変換の反応速度の一一値への
依存性： Ｄ　（−）−マンデレート−デヒドロゲナーゼの存在で
蟻酸ベンゾイルのＤ（−）−マンデレートへの還元の反
応速度は反応溶液の一一値に依存して検査された。試験
成分（３，００Ｕ　）は矢の組成を有した：　ＮＡＤＨ
０，２５ｍＭ　ｔ　蟻酸ベンゾイル１−５ｍＭ　Ｐ酸素
の限定擬；種々の組成の緩衝液０．１　Ｍ　；及び種々
の一一値。酵素は−５，５及び状６．５の間の一一最適
値を有する。−一値は反応混合物中で測定した。

Ｄ　（−）−マンデレートーテヒドロデナーゼによって
触媒される蟻酸ベンゾイルへのＤ（−）−マンデレート
の脱水累化の反応速度は、同様にＰＩｉ　−値に依存し
て検査された。試騒成分（３，００ｍｔ）は次の組成に
！した：　ＮＡＤ”　４．５　ｍＭ　、　Ｄ　（−）−
マンデレート２　ｍＭ　、　　酵素限定量、異なった組
成の緩（２）敵０．ＩＭＯ脱水水化反応は−８，５で最
適値金示す。

例４　：　ｐＨ−僅に依るＤ（−）−マンデレート−デ
ヒドロゲナーゼの貯蔵安定性。

Ｄ（−）−マンデレート−デヒドロゲナーゼを異なった
組成の緩衝液０．１Ｍ中で蛋白負濃度５　ｍｇ７　ｍｌ
で１週間４℃で培養した。次いで残余活性を、例３で記
載した様に、ｐＨ６のための燐酸塩緩衝液０．１　Ｍの
使用下で測定した。この際ｐＨ５〜７．５の範囲で良好
な一一安定性が明らかになった。１週間後になお活性の
８５チが立柱可能であり、緩衝液中ｐｉｐＨ６，５でむ
しろ９８％であった。

例５：Ｄ（−）−マンデレート−デヒドロゲナーゼの温
度安定性 精製したＤ（−）−マンデレートーヂヒドロデナーゼ（
ＤＥＡＥ−セファセル−ピーク２１２２Ｕ／Ｉｎ９）を
、ウシ血清アルブミン５Ｔｎ４／／ＩＵｔ含有するｐｉ
ｐＨ６，０のための燐酸塩緩衝液０．１Ｍの存在で徨々
のｍ度で培養し、かつ一定の時間について残余活性を測
定した。温度５０’Ｃで残余活性は１５分間恢になお約
９０％であった。より簡い己度では酵素は急速に不活化
された。

例６：酵素活性への温度の影響 Ｄ　（−）−マンデレートへの蟻酸ベンゾイルの還元の
反応速度は反応温度に依り測定された。最高の反応速度
は５５℃で達成された。標準測定温度６０℃では反応速
度は最高値の約８５％であった。反応速度は５５℃以上
で＃累の同時の変性に依り著しく減退した。

例７：Ｄ（−）−マンデレート−デヒドロゲナーゼの分
子量の測定及び構成単位の測定 天然酵素の分子量はスペローゼ（５ｕｐｅｒｏｓｅ　）
１２のゲル式６過により測定された。Ｐ″ＰＬＯ−系に
連結されたカラム（１，０ｃｍｘ３０礪）を流速０．４
ｍｂ１分で作動し、この際試料としてＤＥＡＥ−セファ
セルで精製したｕ索ｉｏｏμｌｌｙ用いた。

標ｒ８１４蛋白寅として、チトクロームＣ１ペプシン、
卵アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）　；バ
チルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　
）からのＤ−２−ヒドロキシイソカプロエートーデヒド
ロデナーゼ、Ｌ−２−ヒドロキシイソカプロエートーデ
ヒドロデナーゼ、アルドラーゼ、Ｌ−アラニン−デヒド
ロゲナーゼ及びＬ−ロイシンーデヒドロデナーゼ及びフ
ェリチンが使用された。Ｄ（−）−マンデレート−デヒ
ドロゲナーゼの分子量は６００００±５０００ドルトン
である。酵素のサブユニット（Ｕｎｔ；ｅｒｅｉｎｈｅ
ｉｚｅｎ　）の大きさ及び数はドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ　）の存在でのｒルミ気泳動により測定するこ
とができる。サブユニットの分子量は３００００±５０
００ドルトンである。従ってＤ　（−）−マンデレート
−デヒドロゲナーゼは２つの同一のサブユニットから成
る。較正臼１ｉｌｌｌ！！を得るためにヘモグロビン、
β−ラクトグロブリン、キモトリプシノケ９ン、ペプシ
ン、卵アルブミン及びＢＳＡが使用される。

例８：Ｄ（−）−マンデレート−デヒドロゲナーゼの酵
素活性−＼の櫨々の試薬及び金属イオンの影響 Ｄ　（−）−マンデレートへの蟻酸ベンゾイルの還元の
反応速度は種々の試薬及び金属イオンの存在で測定され
た。この目的のためにｎＩＸは先ずそれぞれの阻害剤も
しくは金属塩と共に２０℃で５分間恒温保持し、次いで
残留する容量活性全標準条件下で測定した。Ｄ（−）−
マンデレートープヒトロケ９ナーゼはＨｇＣノ２　、Ｃ
ｕＳＯ４又はｐ−クロル安息香酸第二水銀０．１　ミリ
モルの存在ニより著しく阻害さね、一方その他の試薬の
存在は１ミリモルですら大きな影響はない。完全な結果
を戎６に示す。

第３　ｆｆ　：　　Ｄ（−’ｌ−マンデレートーデヒド
ロｒナーゼの阻害（−二未試験） ｌΣ加なし　　　　　　　　　　１００　　　１００　
　１００ＭｇＣ１ｚ　　　　　　　　　　　　　　９９
　　　　８９　　　８１ＣｒＣ１２９５９０ ＣｕＳＯ４６，４６，１− ＣｏＳＯ４９７９１− ｃｄｃ１２　　　　　　　　　　　　９３　　　　８２
に２Ｃｒ２０，９９ ＦｅＣ１３９１− ＺｎＣ１２９４８８ ＮｉＣ１２９５９１６８ Ｎａ　２１ｖｉＯ０４９０８８７３ ＨｇＣ１２０００ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　９４　　　　９
３　　　８７ＩＴＲＡＴ １．１０フエナントロリン　　　９６　　　　９６　　
　　−２．２−ジピリジル　　　　　　１００　　　　
９９　　　８６ヨードアセトアミド　　　　　　９８　
　　　９６　　　　９１ＫＣＮ　　　　　　　　　　　
　　　　８４　　　　８１　　　　７１ｐ−クロル安、
隊査酸第二水銀　　　６２−メルカプトエタノール　　
　９６　　　　９３　　　９０例９：反応速度と基質濃
度の依存性 Ｄ　（−）−マンデレートへの蟻酸ベンゾイルの還元の
ための反応速度の補酵素ＮＡＤＨの濃度への依存性は次
の試験成分で検査されたニー７．０のための燐酸塩緩ｇ
ｆｉ液０．１モル；蟻酸ベンゾイル６ミリ トグラフィーにより濃度増加された製剤、表２参照）限
定菫；試験成分中のＮＡＤＨ−濃度は０、０１〜０．３
　０　ミリモルの範囲で変えられた。

最適反応速度は０．２５ミリモルで達成されることが示
された。ＫＭ　−　伽は０．　０　３　６ミリモルであ
る。

蟻酸ベンゾイル−誕度に依存するＤ　（ｐＨ−マンデレ
ートへの蟻酸ベンゾイルの還元を次の試験成分で検査し
た： ＦＪ（　７．０のための燐酸塩緩衝液０．１モル；ＮＡ
ＤＨ　Ｏ．２　５　ミ！７モル及び酵素限定量。蟻酸ベ
ンゾイル−＃度は０．０２ミリモル〜８ミリモルの範囲
で変えられた。最適反応速度は１．５ミリモルで達成さ
れることが示された。ＫＭ−値は０、２２ミリモルであ
る。

種々の２−ケトカルボン酸の還元をケト酸濃度と関連し
て検査した。このために次の試験成分を使用したニ ー７、０のための燐酸塩緩衝液０．１モル、酵素（　Ｄ
ＩＥＡＥ−セルロースークはマトグ２フィーにより濃度
増加した製剤、第２表参照）限定量と共にＮＡＤＩ（　
０．２　５ミリモル。２−ケト酸濃度はそのつど０．０
５〜９ミリモルの範囲で変え、かつ反応の際に使用され
るＮＡＤＨによる吸光の減少を３　４　０　ｎｍで測定
した。初反応速度はミノ・エリスーメンテ／一式（　Ｍ
ｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ−Ｇｌｅｉｅｈｕｎｇ
　）により評価した。測定された運動定数”ｍａｘ及び
ＫＭは第４表にまとめた。

Ｄ　（−）マンプレートの脱水素化のための反応速度の
ＮＡＤ”−濃度への依存性を次の試験成分で検査した： ｐ）４８．５のためのトリス／　Ｈ（Ｊ−緩衝液０．１
モル、Ｄ（−）−マンデレート２ミリモル、酵素限定量
。ＮＡＤ　”−濃度’！ｋ　０．０５ミリモル〜６ミリ
モルの範囲で変え、反応の際に生成するＮＡＤＨによる
吸光の増大を３４０　ｎｍで測定した。最適変換は６ミ
リモルの濃度で達成されることが明らかになった。ＮＡ
Ｄ＋に対するＫＭ−値は０．２０ミリモルである。

Ｄ（−）−マンデレートの脱水素化のための反応速度の
Ｄ　（−）−マンデレート−震度への依存性を次の試験
成分で検査したニ ー８．０のための燐酸塩緩＠液０．１モル、ＮＡＤ”６
ミリモル及び酵素限定蓋。Ｄ（−）−マンデレートの濃
度を０．１〜２０ミリモルの範囲で変えた。

反応の際に生成するＮＡＤＨの吸光を３４０　ｎｍで測
定した。最適変換は６ミリモルの震度で達成されること
が判明した。Ｄ（−）−マンデレートの対するＫＭ−値
は０．５ミリモルである。

Ｄ−２−ヒドロキシカルボン酸の脱水素化の反応速度と
櫨々のＤ−２−ヒドロキシカルボン酸の濃度との関連性
金欠の試験成分で検査した。

ｐｉｐＨ８，０のための燐酸塩酸ＶｊＢ液０．１モル、
ＮＡＤ”６ミリモル及び酵素限定量。２−ヒドロキシ酸
の濃度を０．２５〜６００ミリモルの範囲で変えた。キ
ラールのＤ−２−ヒドロキシ酸が使えなかった場合は、
ラセミ体を使用（−だ。反応の際に生成するＮＡＤＨの
吸光は３４０　ｎｍで測定した。

初反応速度はミバエリス−メンテンにより評１曲され、
運動定数ＶｍａＸ及びＫＭが測定した。測定された運動
定数は第５表にまとめた。

例１０：Ｄ（−）−マンゲル酸の連続製造連続的操業に
おけるキラールのヒドロキシ酸の合成は、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）に結合された分子量増大されたＮ
ＡＤＨの使用下で酵素膜反応器中で可能である。ＰＥＧ
　−ＮＡＤＨは西ドイツ国特許第２８４１４１４号明細
書に依り製造される。変性された袖酵累及び使用される
酔累ホルミエートーデヒドロｒナーゼ（袖＃累−再生の
ため）及びＤ（−）−マンデレートープヒトロケゞす〜
ゼは限外濾過膜ＹＭ５を通って反応器（ＣＥＣＪ、アミ
コン（Ａｍ１ｃｏｎ　）社）中に保留され、一方反応浴
液の低分子取分（未反応の基質、生成物、緩衝液〉は溶
液から連続して除去される（滞留時間２時間）。限外濾
過物が反応器を退出するのと同じ程度で、緩衡准（蟻酸
ナトリウム０．１モル、＃７．０）中の蟻酸ベンゾイル
５０ミリモル全貯蔵器から俊供給することによって、反
応器谷閂を一定に保つ。

反応器容菫は１０彪であり、これは詳細には仄のものを
含有した： 蟻酸ナトリウム浴液（ｐ）ｉ　７．０）　　　　　　　
３０［３ミリモルトリスーＨＣヱ（ｐＨ７，０）　　　
　　　　　　　　１００ミリモルＰＥ（）２ｏｏｏｏ−
ＮＡＤＨＯ，２ミリモルホルミエートーデヒドロｒナー
ゼ〔クロナー（Ｋｒｏｎｅｒ　）４茗、Ｊ、　Ｃｈｅｍ
＋’１ｅｅｈｎｏｌ。

Ｂｉｏｚｅｅｈｎｏｌ、　３２巻、１６０〜１３７頁に
依る製剤〕　　　　　　　　　　　　　　　　２Ｕ／紅
マンデレートーデヒドログナーゼ（ＤＥＡＥ−セルロー
スークフマトグラフイーによる製剤；第２表参照）　　
　　　　　　　　　　　　２Ｕ／ｄ蟻酸ベンゾイル　　
　　　　　　　　　　　　５０ミリモル生成物浜液の旋
光度α金偏光測定する（−光計２４１、パーキン−ニル
マー社（ＦｉｒｍａＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　）　、
’　２７℃で４３６　ｎｍ　（Ｈｇ）で測定〕ことによ
って変換度を測定した。次いで生成物濃度は、市販のＤ
（−）−マンデレート（シグマ社ＣＦ’ｘｒｍａ　Ｓｉ
ｇｍａ　）　Ｍ　２５００　）で氷引きをした較正曲蛛
から測定され得る。

第６表は、実際に１００チまでの変換率が達成できるこ
とを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の物理−化学的特性： １）反応性： これはＮＡＤＨ（ニコチンアミド−アデニ ン−ジヌクレオチド）の存在で蟻酸ベンゾ イルと反応してＤ（−）−マンデレートを形成し、かつ
   ＮＡＤ＾＋の存在でＤ（−）−マンデレートと反応して
   蟻酸ベンゾイルを形成する； ２）基質特異性： これは特に良好に蟻酸ベンゾイル、更に その他の脂肪族及び芳香脂肪族の２−ケト −カルボン酸も還元し、かつ特に良好にＤ （−）−マンデレート、更にその他の脂肪族及び芳香脂
   肪族のＤ−２−ヒドロキシカルボ ン酸も酸化する； ３）最適ｐＨ−値： 還元反応のための最適ｐＨ−値は６．０± ０．５であり、酸化反応のための最適ｐＨ−値は８．５
   である； ４）ｐＨ−安定性： ４℃及びｐＨ５〜７．５における１週間の貯蔵後に残余
   活性８５％を示す； ５）最適温度： 最適温度はｐＨ値６．０で５５℃である； ６）温度安定性： ｐＨ値６．０で５０℃で１５分間処理して、残余活性は
   ９０％である； ７）活性： 比活性約２１００Ｕ／蛋白質ｍｇを示す； ８）阻害剤の影響： ＨｇＣｌ＿２、ＣｕＳＯ＿４又はｐ−クロル安息香酸第
   二水銀により強く阻害される； ９）分子量： 分子量は６００００±５０００（ゲル濾 過により測定される）である； １０）サブユニツトの分子量： サブユニツトの分子量は３００００± ３０００（ＳＤＳ−電気泳動により測定される）である
   ； １１）Ｋ＿Ｍ−値： ｐＨ７．０における基質、蟻酸ベンゾイルを得るための
   還元反応のためのＫ＿Ｍ−値は ０．２２ミリモルであり、ｐＨ８．０における基質Ｄ（
   −）−マンデレートを得るための酸化反応のためのＫ＿
   Ｍ−値は０．５ミリモルである；を特徴とする微生物学
   的に製造されたＤ（−）−マンデレート−デヒドロゲナ
   ーゼ。 ２、次の物理−化学的特性： １）反応性： これはＮＡＤＨ（ニコチンアミド−アデニ ン−ジヌクレオチド）の存在で蟻酸ベンゾ イルと反応してＤ（−）−マンデレートを形成し、かつ
   ＮＡＤ＾＋の存在でＤ（−）−マンデレートと反応して
   蟻酸ベンゾイルを形成する； ２）基質特異性： これは特に良好に蟻酸ベンゾイル、更に その他の脂肪族及び芳香脂肪族の２−ケト −カルボン酸も還元し、かつ特に良好にＤ （−）−マンデレート、更にその他の脂肪族及び芳香脂
   肪族のＤ−２−ヒドロキシカルボ ン酸も酸化する； ３）最適ｐＨ−値： 還元反応のための最適ｐＨ−値は６．０± ０．５であり、酸化反応のための最適ｐＨ−値は８．５
   である； ４）ｐＨ−安定性： ４℃及びｐＨ５〜７．５における１週間の貯蔵後に残余
   活性８５％を示す； ５）最適温度： 最適温度はｐＨ値６．０で５５℃である； ６）温度安定性： ｐＨ値６．０で５０℃で１５分間処理して、残余活性は
   ９０％である； ７）活性： 比活性約２１００Ｕ／蛋白質ｍｇを示す； ８）阻害剤の影響： ＨｇＣｌ＿２、ＣｕＳＯ＿４又はｐ−クロル安息香酸第
   二水銀により強く阻害される； ９）分子量： 分子量は６００００±５０００（ゲル濾 過により測定される）である；　 １０）サブユニツトの分子量： サブユニツトの分子量は３００００± ３０００（ＳＤＳ−電気泳動により測定される）である
   ； １１）　Ｋ＿Ｍ−値： ｐＨ７．０における基質、蟻酸ベンゾイルを得るための
   還元反応のためのＫ＿Ｍ−値は ０．２２ミリモルであり、ｐＨ８．０における基質Ｄ（
   −）−マンデレートを得るための酸化反応のためのＫ＿
   Ｍ−値は０．５ミリモルである；を特徴とする微生物学
   的に製造されるＤ（−）−マンデレート−デヒドロゲナ
   ーゼを収得するために、ラクトバチルス・クルバツスＤ
   ＳＭ２００１９を、炭素及び窒素給源、チアミン及び無
   機塩を含有する水性栄養媒体中で、ｐＨ５．５〜６．５
   及び温度３０〜３７℃で、嫌気性培養し、細胞塊を分離
   し、かつ酵素を細胞から単離することを特徴とするＤ（
   −）−マンデレート−デヒドロゲナーゼの製法。