JPS6119220B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はビフイドバクテリウム菌（以下ビフイ
ズス菌という）の生菌を含有する発酵乳製品の製
造法に関するものである。 ビフイズス菌は、母乳栄養児の腸内細菌叢のほ
とんどを占める細菌としてよく知られている。ビ
フイズス菌の生理的意義に関しては既に多数の研
究があり、(1)腐敗菌による腐敗の抑制作用、(2)毒
性アミンの産生阻止作用、(3)ホスフオプロテイン
ホスフアターゼの作用による人乳カゼインの消化
促進作用、(4)乳酸、酢酸、ギ酸等の産生にともな
う腸管内のPH低下による病源菌の生育抑制作用、
などが明らかにされている。このように乳児にと
つて有用なビフイズス菌が人工栄養児の場合は非
常に少なく、これが母乳栄養児とくらべて腸内疾
患にかかりやすい原因の一つと考えられている。
そこで、人工栄養児の腸管内細菌叢を母乳栄養児
なみに変えることを目的として、育児用調整粉乳
の母乳化や、ビフイズス菌を含有する育児用調整
粉乳等の乳製品を製造し投与することが試みられ
てきた。 しかしながら、牛乳等を培地として培養したビ
フイズス菌を投与しようとする後者の試みは次の
ような問題点に遭遇し、未だ実用化された例はな
い。すなわち、ビフイズス菌は、牛乳の加工に広
く用いられている乳酸菌と比較すると、(1)生育環
境として、通常厳格な嫌気条件を必要とする、(2)
栄養条件が複雑で、かつ厳格であることから、酵
母エキス等の生育促進物質を含有しない純粋な牛
乳培地では増殖しない。(3)耐酸性が低いため、発
酵乳のような低PH領域で長期間生存させることは
困難である、などの問題である。牛乳培地にビフ
イズス菌の生育促進物質を添加すれば好気的条件
でも培養できるが、製品の味や臭いが悪化するこ
とが多く、また生育促進物質は一般に高価で実用
的ではない。 本発明者らは、以上のようなビフイズス菌培養
上の問題点を解決するため種々研究を重ねた結
果、好気的条件下、還元剤も生育促進物質もまつ
たく含有していない純粋な牛乳培地で旺盛に増殖
するという、特異な性質を持つビフイズス菌が存
在することを知つたのである。本発明はこの知見
に基づくものであつて、上記の新たに見出された
ビフイズス菌を、全乳、脱脂乳、又はこれらの粉
乳からの還元乳等からなる牛乳培地に接種し培養
することを特徴とする、ビフイズス生菌を含有す
る発酵乳製品の製造法である。 上記本発明で用いるビフイズス菌は、 (1) 生育促進物質を全く含有しない純粋な牛乳培
地中で好気的条件下でよく増殖するので、培養
に当たつて嫌気培養法を採用する必要がなく、
培養が極めて容易である。 (2) 添加物による嗜好性の低下を回避することを
可能にし、培養物のその後の調味工程を容易に
する。 (3) 培養に余分な添加物を必要としないことは、
特に乳児用食品（又はそのための添加物）とし
て好ましい。 (4) 菌が本質的に耐酸素性を備え、かつ栄養要求
性も単純であるから、培養物（又はその加工
物）の保存中の生菌数の低下が少なく、また生
菌維持のための条件によつて飲食物等への加工
が制限されることが少ない。 このため、本発明によつて、従来公知のビフイ
ズス菌では不可能であつたような培養法による培
養が可能となり、また新しいビフイズス生菌含有
飲食物の製造が可能となつたのである。 このようにビフイズス菌を利用した飲食物等の
製造に新たな可能性を提供した新規なビフイズス
菌株は既に幾つか単離され、それぞれ有用性が確
認されつつあるが、その代表的な１例につき以下
詳述する。 このビフイズス菌（ビフイドバクテリウム・ビ
フイダムYIT−4002）は、健康な母乳栄養児の糞
便より採取したビフイズス菌を継代培養したもの
の中から見いだされたものであつて、以下に述べ
るような特性を有する。 主要菌学的性状 グラム陽性無芽胞桿菌（0.5×２〜３μ）
で、細胞内部にメチレンブルーに親和性を有す
る顆粒が存在する。顕微鏡で観察すると、細胞
の先端が分岐して、Ｙ字状、Ｖ字状、湾曲状の
多形性を示す。重層法で形成させたコロニー
は、円筒状、凸状、レンズ状を示し、プレート
底部に生じたコロニーは多形性を示す。嫌気
VL−Ｇ 液体培地で72時間培養後の酢酸／乳
酸の生成モル比は1.6±0.5であつた。また上記
培養液について乳酸の旋光度を検討したとこ
ろ、旋光度−0.038、旋光性Ｌ（＋）76％＋
DL24％を示した。 カタラーゼ（−）、炭酸ガス産生（−）、シス
テインミルク凝固性（＋）、ゼラチン液化性
（−）、硝酸塩還元性（−）、インドール産生
（−）、硫化水素産性（−）である。 これらの分類学的性状は、ビフイドバクテリ
ウム属の定義を満足するものである。 至適増殖温度及びPH 至適温度は36〜38℃であり、25℃以下及び45
℃以上では増殖しない。 至適PHは６〜７で、PH5.0以下では増殖しな
い。 糖発酵性 グルコース、フラクトース、ラクトース、ガ
ラクトースの各種は陽性、アラビノース、キシ
ロース、サリシン、マンノース、マンニトー
ル、メレジトース、セロビオース、ソルピトー
ル、イヌリン、トレハロース、ラムノース、マ
ルトース、リボース、ソルボースの各糖は陰性
である。このような発酵パターンは、ビフイズ
ス菌の標準株（ビフイドバクテリウム・ビフイ
ダムE319、以下標準株という）のそれと完全
に一致した。 酸素感受性及び栄養要求性 乳固型分濃度12％の還元脱脂乳培地（生育促
進剤等の添加物を含まない）に酸素を飽和させ
（約6.5ppm）、初期菌数10⁷〜10⁸／ml、培養温
度37℃で好気培養を行なつた場合、24時間以内
に菌数10⁹／ml以上に達する。（同じ培養条件
で、通常のビフイズス菌はほとんど増殖しない
か、かえつて菌数が減少する。後述実施例２参
照。） 以上のように、YIT−4002は通常のビフイズス
菌が増殖しない好気的条件下の純粋牛乳培地でよ
く増殖すること以外は、ビフイドバクテリウム・
ビフイダムと全く符号した分類学的性状を示す。
このことから、本菌株はビフイドバクテリウム・
ビフイダムの変異株であることが確認された。
（同定基準はBargey’ｓ Manual−197−４年に
よる。なお本菌株は工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第3371号により寄託済であ
る。） 本発明を実施するに当たつては、使用するビフ
イズス菌が上述のような好ましい特性を備えてい
るので、嫌気培養法を採用する必要はなく、酪農
乳酸菌の培養条件と同様な条件の培養法を採用す
ることができる。したがつて、乳酸菌との混合培
養も可能である。従来ビフイズス菌の培養に際し
て必ず用いられてきた還元剤や生育促進剤は、本
発明の場合、必須のものではない。しかしなが
ら、培養物の利用上障害とならない場合に少量の
生育促進剤等を用いて菌の増殖を促進することは
なんら差支えない。 通常の培養条件では、培養18〜24時間で生菌数
が最高に達し、これと並行して酸が生成してPHが
低下する。更に培養を続けると菌数は減少し始め
るが、酸の生成はなおしばらく続いた後、飽和値
に達する。したがつて、培養物の用途との関連に
おいて適当な段階で培養を打切る。 培養物はそのまま、あるいは適宜甘味料や果
汁、水等と混合して、更には他の乳製品その他の
食品と混合して、ビフイズス生菌を含有する新し
い飲食物として利用できる。また、培養物を一旦
凍結乾燥又は噴霧乾燥し、ビフイズス生菌を含有
する乾燥粉末としてから利用することもできる。 以下実施例により本発明を説明する。なお各実
施例において、生菌数はRogosaの改変培地を用
いて重層法で測定した値であり、酸度は培養液５
mlを中和するに要した0.1Nカセイソーダのml数
である。また変異株とあるのは前記ビフイドバク
テリウム・ビフイダムYIT−4002をさす。 実施例 １ 変異株、及び標準株を含む代表的なビフイズス
菌３種による嫌気培養を行なつた。 種菌はRogosaの改変培地（寒天を除いた液体
培地１当りピルビン酸１ml、還元型グルタチオ
ン0.2ｇ添加）で培養後、無菌的に集菌、洗浄し
た菌体を1/100Ｍリン酸塩緩衝援（PH6.8）に懸濁
させたもの（OD660ｍμ＝1.5）である。 本培養の培地には12％還元脱脂乳を用い、滅菌
後、嫌気ジヤーの気相を窒素ガス95％、炭酸ガス
５％の混合ガスで置換して、嫌気状態とした。培
養開始時における培地中の溶存酸素量は0.1ppm
以下であつた。 培養の進行にともなう生菌数、酸度及びPHの変
化を第１図に示す、変異株は培養24時間で生菌数
6.5×10⁹／mlに達し、生菌数の増加と共に著量の
酸が生成し、PHが低下する。ところが比較例の場
合はごく僅かの増殖と酸生成しか認められず、純
粋な脱脂乳培地では嫌気条件下でもほとんど増殖
しえないことがわかる。 実施例 ２ 実施例１の場合と同じ種菌と培地を用いて好気
培養を行なつた。培地は滅菌後30分間酸素ガスを
通じて酸素を飽和させた（溶存酸素量6.5ppm）。 培養経過を第２図に示す。変異株は前記嫌気培
養の場合と同様の増殖を示し、培養24時間後に
5.0×10⁹／mlに達した。これに対して、比較例の
場合はほとんど増殖せず、培養開始後直ちに生菌
数が減少し始める例もあつた。 実施例 ３ 本例では、変異株による発酵乳製造のため培養
条件の検討を行なつた。 (i) スターターの添加量と増殖との関係 スターターは８％還元脱脂乳で20時間培養
後、低温で３日間保存したものを用いた。還元
脱脂乳培地に、スターターを１〜10％の範囲で
種々変化させて添加し、好気培養を行なつた。
スターターの添加量が３％迄は、添加量に比例
して酸産生量の増加が認められたが、それ以上
の添加量ではほとんど差異を認めなかつた。こ
の添加量についてはパイロツト試験においても
検討し、１〜２％の添加量で充分なことが確認
された。（従来の報告によると、スターターは
通常５〜10％添加されており、このような大量
のスターターを調製するためには、スターター
調製のためのスターターが必要になる。） (ii) 培養温度と増殖との関係 16％還元脱脂乳を調製し、滅菌後除菌空気を
吸引させながら37℃に冷却して前記のスタータ
ーを2.0％接種し、30、34、40および43℃で培
養を行なつた。 増殖は37℃がもつともすぐれ、次いで34℃と
40℃が良好であり、30℃と43℃では著しく抑制
された。 (iii) 生菌数の維持とPHとの関係 12％の還元脱脂乳に変異株を接種し、培養液
のPHが5.0、4.6、4.3、4.1にそれぞれ達する迄
培養した４試料を急冷して５℃で保存し、生菌
数の変化を測定した。その結果を第１表に示
す。（数値は１ml当りの生菌数）

【表】 保存による生菌数の低下は培養液のPHによつて
異なり、PH4.3以下では保存が進むにつれて急
激な低下を示す。 しかし、PH4.6以上であればあまり著しい低
下はない。 以上の実験はすべて還元脱脂乳を用いて行なつ
たが、全乳や脱脂乳、あるいはそれらの混合乳を
用いても同様の結果が得られた。 実施例 ４ （発酵乳飲料製造例） 脱脂粉乳160ｇを水道水で溶解して１と
し、100℃で30分間加熱殺菌する。冷却後、あ
らかじめ純粋培養しておいた変異株スターター
を２％添加し、37℃で16時間培養する。培養液
525mlと、砂糖35ｇ、ソルビトール35ｇを含む
シロツプ475mlとを混合し、香料を添加してか
ら均質化して製品とする。製品の酸度3.5、PH
4.7、生菌数2.9×10⁹／mlであつた。 全乳に脱脂粉乳を加えて無脂乳固型分濃度が
16％になるよう調整したものを加熱滅菌し、ラ
クトバチルス・アシドフイルスのスターターを
５％、変異株のスターターを１％、それぞれ添
加した後、37℃で20時間培養する。得られた培
養液525mlを、グルコース20ｇ、果糖35ｇを含
むシロツプ472mlと混合し、香料を添加後均質
化して製品とする。製品の酸度3.3、PH4.8、生
菌数：変異株1.9×10⁹／ml、アシドフイルス
菌、5.0×10⁸／mlであつた。 脱脂粉乳100ｇと全脂紛乳60ｇを水道水に溶
解して１とし、滅菌後、変異株スターターを
３％接種し、37℃で12時間培養する。培養液
525mlを、果汁（温州ミカン、リンゴ）100ｇ、
砂糖40ｇ、ソルビトール35ｇを含むシロツプと
混合し、香料を加えて均質化し製品とする。製
品の酸度4.0、PH4.6、生菌数1.5×10⁹／mlであ
つた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はビフイズス菌の培養中の生
菌数、酸度及びPHの変化を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生育促進物質を含有しない純粋牛乳培地で好
   気的条件下に増殖可能なビフイドバクテリウム菌
   変異株を牛乳培地に接種し培養することを特徴と
   するビフイドバクテリウム菌生菌を含有する発酵
   乳製品の製造法。 ２ ビフイドバクテリウム菌変異株がビフイドバ
   クテリウム・ビフイダムYIT−4002である特許請
   求の範囲第１項記載の製造法。