JPS5946226A - 新規なコリン含有リン脂質ａ及びその制癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新Ｂｔなコリン含有リン脂質へ及び該物質を
有効成分と１２で含有することを特徴とする制癌剤に関
するものである。

従来、癌化学療法剤として、アルキル化剤（ナイトロジ
エンマスタード類、エチレンイミン類。

スルホンｎ２エステル類）、代謝１，１１抗物質（葉酸
拮抗剤、プリン拮抗剤、ビ＋）　ミノン桔抗剤）　、　
（１ｒｆ物性核分裂毒（コルセミＩ・９．ビンブラスチ
ン等）、抗生物質（ザルコマイシン、カルテノフイリン
。

マイトアイシン等）、ホルモン類（副腎ステロイド、男
性ホルモン、安住ホルモンｌ　ｌｋ、　Ｕ　；ｌ’ルフ
イリン錯４　（マーフィリン、Ｃｏｔ）ｐ）　’ＥＦが
用いられている。しかしながら、その殆んどは、細１１
Ｆ１．毒型の物質であり、重大な副作用を呈するため、
低毒性で優れた制癌活性を有する制癌剤の開発が強く望
まれている。

本発明者らは、上記趣旨に鑑み、低毒性で制癌性を有す
る物質を動・植物、微生物界の広い生物範囲から探索を
行った結果、ニジマス（Ｓａ１ｍａ旦悼虚色ｒ−Ｌ、　
）の受精後１２〜１４日の＋ＩＥ中に含まれるコリン含
有リン脂質を分離し、該物質が文献未載の特異的な理化
学的性質を有する全く新しい物質であることを見出し、
更に該物質が、動物の１１；ｆｆ瘍細胞に対して分化誘
導活性を有することを新たに見出し、且つ著しく低毒性
で、優れた制癌活性を有することの新たな知見を得て、
本発明含完成するに至った。本発明の制癌剤の有効成分
は、人、家畜、犬、ねこ等の混血動物に対する優れた癌
化学療法剤となり得るものである。

以下に１本発明の新規なコリン官有リン脂質ＡＣ以下、
「リン脂質ＡＪと称する。）について説明する。

〔分離及びその構製法〕

ニジマスの受精後１２〜１４日の胚をホモジナイズし、
アセトン、エーテル及びクロロホルム−メタノールで順
次抽出する。３つの抽出物を混合ｌ２、減圧濃縮した後
、シリカケ゛ルカラムクロマトグラフイーに付し、クロ
ロホルム−ヘキサン−（０〜１００％）及びメタノール
−クロロホルムＣ０〜１００％）で展開した。活性区分
は、クロロホルム−メタノール（５ニア、Ｖ／Ｖ　）画
分に含まれる。該両分をクロロホノＶムーメタノールー
水（６２：　２５　：　４　、　ｖ／ｖ／ｖ　）溶媒を
用いてシリカゲルａｍクロマトグラフィーに付すと２つ
のスポットに分れる。この２つのスポットのウチ、Ｒｆ
（ｉＭが０．２５の両分を、メタノールを用いて高速液
１）物質の形状：無色油状物 ２）質覇゛分析：　ＦＤ−ＭＳ、ＳＩＭＳより分子毎・
Ｍ２Ｏ３（Ｍ＋Ｈ，８０６：Ｍ　　−ト　Ｎａ　　。

８２８）及び分子毎・ＭＳ　ｊｌ　（Ｍ十Ｈ。

８３２：Ｍ＋Ｎａ、８５４］　　を有する。

３）　　Ｕ、Ｖ、スペクトル： λ””　　：　２０５．．５ｎｍ（Ｅ’％２０９．５１
ｒｙ＋　ａ　ｘ　　　　　　　　　　　ＩＣ１ｌＣ１ｎ
２３０ｎ’％　１６８．２１ ｃｍ ２６８ｎｍ（Ｅｌ−６８，９） ４１　１．Ｒ，スーξクトル： にＳｒ　　　　−１゜ ｖｍ８ｘ　ｃｍ　　＊　　５４２５．５０１５．２９２
５゜２８６０、１７３８、１４７７． １２４７、　１１５３．　１０９２゜ １０６７、　９７０．７１２ ５）　　溶解（ＩＪＥ　：エーテル、メタノール、クロ
ロポルムに可溶、アセトン、水に不溶。

６）試薬に対する反応： ドラーゲンドルフ試桑　　１傷　性 ディトマーーレスター試粱　陽　性 にＭｎＯ４陽性 Ｈ２ＳＯ４陽　　性 ニンヒドリン試薬　　　　陰　性 アンスロン試薬　　　　　陰　性 上記理化学的性質を検討すると、リン脂質Ａは、ドラー
ゲンドルフ試薬及びディトマー−レス°ター試薬に対し
て陽性を示すので、コリン及びリン酸をその分子内に有
すること、ニンヒドリン試薬及びアンスロン試薬に対し
て陰性であるので、アミン酸及び糖を含有【７ないこと
、　　Ｕ、Ｖ、スペクトルにより、２５０ｎｍ及び２６
８　ｎｍの極大値は共は二重結合を有すること、　　１
．Ｒ，スペクトルより、１７３８ｃｍ−’及び９７０７
７Ｆ＋−’が、それぞれエステル結合及びコリンを含有
すること、及びスフィンゴミエリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍ
ｙｅｌｉｎ　）のアミド結合が見出されないこと、及び
後述のボスホリ・や−ゼＡ１、ボスホリ・９−ゼへ２の
加水分解により脂肪酸が見出されることから１本発明の
物質は、脂肪酸がエステル結合したコリン含有リン脂質
であることが妥当と結論さ瓦た。

エステル部分のｌｉ：４肪酸組成を決定するため１代理
して加水分解１−１遊離の脂肪酸を得た後ジアゾメタン
でエステル化し、これをＧ　Ｃ−’Ｍ　Ｓで分ＪｆＴ　
した。この結果、Ｃ１５Ｈ３、Ｃ００ＣＨ３、Ｃ，７Ｈ
３３ＣＯＯＣＨ３’　（二重結合１個）、　ｃ２ｉＨｘ
ＣＯＯＣＨ３（二重結合数未定）に相当する脂肪酸エス
テルが同定された。

次に、これらの脂肪酸の位置を決・定するため、次の方
法により処理したＭ質Ａを、ホスホリ・ぐ−ゼＡ、活性
（選択的に１位のエステル結合を加水分解する。）を有
するリゾーブス・デレマー・すｉｅ−ゼ（Ｒｈ１ｚｏｐ
ｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ　目ｐａｓｅ　）により加水分解
し、ジアゾメタンでエステル化した後、ＧＣＭＳで分析
した結果、Ｃ１５Ｈ３１ＣＯＯＣＨ５、Ｃ４７Ｈ３５Ｃ
ＯＯＣＨ６に相当する脂肪酸エステルが同定された。次
に、これらの脂肪酸の位置を決定するため、まずホスホ
リパーゼＡ２（選択的に２位のエステル結合を加水分解
する。）によυ加水分解し、ジアゾメタンでエステル化
した後、ＧＣ−ＭＳで分質ＡをホスホリパーゼＣ（選択
的にコリンのリン酸エステル結合を加水分解する。）で
処理し、得られたノグリ七ライドをトリメチルシリル化
した後、ＧＣ−ＭＳで分析した。この結果とＦＤ　−Ｍ
Ｓ　。

ＳＩＭＳ、ホスホリ／４’−ゼＡ１、Ａ２　処理の舶来
から、リン １ｔＡＫは主成分として、Ｃ１５Ｈ３１ＣＯＯＨ（７位
）とが分った。（なお、現在の段階では、二重結合の位
置は決定さ才１ていない。） は、ニジマスの胚のような動物Ｊ中に本来存在するもの
より単離された物質であり、Ｐ１３緒＋、１）１から正
常細胞への分化誘導作用を示すことから毒性の心配が全
くない。

本発明の制癌剤け、経口及び非柱口投与のいずれも使用
可能であり、経口投与する場合は、軟・硬カシセル剤又
は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤として投与され、非経口
投与する場合は、水溶性懸濁液、油性製剤などの皮下或
いは静脈注射剤、点滴剤及び固体状又は懸濁粘稠液状と
して持続的な粘膜吸収が維持できるように生薬のような
剤型で投与され得る・ 本発明の有効成分の製剤化は、界面活性剤、賦形削、ｍ
沢剤、佐剤、及び必要に応じて腸溶性製剤とするために
医薬的に許容し得る皮膜形成物質、コーティング助剤等
を用いて適宜行うことができ、その具体例を挙げれば、
次のとおりである。

本発明の組成物の崩壊、溶出を良好ならしめるために、
界面活性剤、例えばアルコール、エステル類、ポリエチ
レングリコール訪導体、ソルビタンの脂肪酸エステル類
、硫酸化脂肪アルコール類等の１釉又は２種以上を添加
することができる。

捷だ、賦形剤として、例えば蔗糖、乳糖、デン’　”　
、結晶セルロース、マンニソ）、軽１ｔ１珪酸、アルミ
ン酸マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、
合成珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナト
リウム、リン酸水素カルシウム、カルｄ？キシメチルセ
ルロースカルシウム等の１種又は２種以上を組合せて添
加することができる。

滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、硬化油等を１種又は２種以上添加することができ
、また矯味剤及び矯臭剤として、食塩、サッカリン、糖
、マンニット、オレンノ油カンゾウエキス、クエン酸、
ブドウ糖、メントール、ユーカリ油、リンゴ酸等の甘味
剤、香料、着色料、保存料等を含有きせてもよい。

懸濁剤、湿潤剤の如き佐剤としては、例えばココナツト
油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、乳酸カルシウム、
ベニバナ油、大豆リン脂質等を含有させることができる
。

また皮膜形成物質としては、セルロース、糖類等の炭水
化物訪導体として酢酸フタル駐セルロース（ＣＡ　ｐ　
）、またアクリル酸系共重合体、二基Ｍｌｉ２モノエス
テル類等のポリビニル訪専体としてアクリル酸メチルｅ
メタアクリル酸共重合体、メタアクリル酸メチル・メタ
アクリル酸共重合体が挙げられる。

また、上記皮膜形成物質をコーティングするに際しぐ！
５通常使用されるコーティング助剤、例えば可塑剤の他
、コーティング操作時の薬剤相互の付着防止のための各
′！！Ｊ添加剤を添加することによって皮膜形成剤の性
質を改良したシ、コーティング操作をより容易ならしめ
ることができる。なお、有効成分を皮膜形成物質を用い
てマイクロカプセル化してから籠形削等と混合した剤型
としても良い。

特に代表的な剤型における配合比は下記の通りである。

特に好ましい範囲 有効成分　　０．１〜９０重量％　０．３〜１５重量％
賦形剤１０〜９９．８１８５〜９９．４１滑沢剤　　０
〜５０１Ｏ〜２０ 界面活性剤　　　　０〜５０　ｌ　　Ｏ〜２０皮膜形成
物質　　　０．１〜５０’０．３〜２０　Ｉ特ＶＣ好ま
しい賦形剤は、乳糖、結晶セルローズ、カルがキシメチ
ルセルロースカルシウムである。

また、投与量は、対象腫瘍を有効に治療するに十分な量
であシ、腫瘍の症状、投与経路、剤型などによって左右
されるが、一般に、経口投与の場合、大人では１目当り
、約０　、０１〜１００１１７９／ｋｇ体重（小人では
、０　、０１〜６０　ｔｖ）／ｋｇ体Ｎ）の範囲で、そ
の上限は好ましくは約５０ｍ９７ｋｇ体重、更に好まし
くは約１０　ｒｎｇ　／　ｋ１体重程度であり、非経口
投与の場合、その上限は約１Ｑ　ｒｎｙ　／　ｋｇ体重
程度であり、好ましく　Ｆｉ５　Ｉｊ１９／ｋ１体■、
更に好ましについて述べる。

〔１〕フレンド白血病細胞（ｍｏｕｓｅ　ｅｒｙｔｈ’
ｒｏｉｄＩｅｕｋｅｒｎｌａ　ｃｅｌｌ　、　Ｂ　８細
胞）に対する試験Ｇ１８ＣＯ製）ＩＡＭのＦ−１２培地
に、１５゛チの牛胎児血清及び６０７ＩＩノ／ｌのカナ
マイシンを加えたものに、２　、５Ｘ１０ｃｅｌｌ／ｍ
ｔ　となるように８８細胞を接種し、これに所定量の被
験化合物を加える。（最終容景５ｒｎｔ）。

７．５％ＣＯ２中、３７℃７日間培養した後、オルキン
（０ｒｋｉｎ　）のベンツジン染色法により染色し、染
色された細胞数、すなわち、赤血球への分化によりヘモ
グロピ／を生成するようになった細胞数を測定し、分化
誘導率を求める。

〔２〕マウス骨髄性白血病細胞（ｍｏｕｓｅ　ｍｙｅｌ
ｏＩｄｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌｌ　、　Ｍ　／　）に
対する試験ＧＩ８ＣＯ製イーグルＭＥＭ培地に、１０％
の馬血清及び６ｏｍｇ７ｔのカナマイシンを加えたもの
に、５　、　ＯＸ　１０　ｃｅｌｌ／　＋ｎｔとなるよ
うにＭ／細胞ｆ：接沖し、これに所定量の被験化合物を
加える（最終容量°５ｉｌｌｔ）。

７．５チＣＯ２中、３７℃７日間培善した後、１′・１
食細胞、あるいは顆粒球への分化により誘導されたリゾ
チーム活性を調べる。なお、リゾチーム活性の１単位（
ｕｎｉｔ　）　　とは、ミクロ二ツカスリソデイクテイ
カス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃ
ｕｓ　）　菌体の懸濁液を基質として、リゾチームを作
用させ、ｐＨ６，２４、温度２５℃で６（１ｊ定し１．
４５０ｍμ　の波長の吸光度を毎分０．００１減少させ
るようなりゾチームの開・をいう。

〔３〕マウス奇形腫ｍ胞（ｍｏｕｓｅ　ｔｅｒａｔｏｃ
ａｒｃｒｎｏｍａ　）に対する試験 テラトーマ細胞をマウスの腹腔から腹腔へ移植後、１ケ
月経過したものを用りだ。テラ）　−マ細胞は、１１（
腔中で（性？力１用胚に似た胚様体（ｅｍｂｒｏｉｄ　
ｂｏｄｙ　）　　という細胞塊とシテ存在シ。

それらをトリグシン処理などを行うことなく用いた。採
取１−た゛腹水中で自然沈下させて得られる胚様体をダ
ルベコ−変法培地、あるいは・・ンクス液で５度洗浄後
、１０チ十胎児血清を含む培地に接種し７、所定量の被
験化合物を加え、５７℃でＣＯ２７，５〜８％を営む水
蒸気を飽和【７て、ψ気中で１１１．’４　ｌ！ｆｊ培
イトナイト遠心分離（２ｒｌｌｌ［１ｒ、ｐ、ｍ・　１
０分）【−てイ１ｔた胚様体を０．８６係ＮａＣ，ｔ　
溶液で洗浄後、ナフトールＡ　Ｓ−ＭＸホスフェートと
ソアゾ試４％　（Ｆａｓｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　Ｂ　５ａｌ
ｔ）を加えて１時間室温で放置する。これを遠心分離（
２００Ｄ　ｒ、ｐ、ｍ、、　１０分＋シテ胚様体＆分離
Ｌ−、エタノールを加えて１時間室温でｌ々置する（未
分化の細胞は、赤く着色する）。

これを、５３５ｎｍ　　の吸収を測定し、アルカリホス
ファターゼ活性Ｃ分化誘導の程度）を求める。

ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）５ｍＭ　
を加えた場合ｆアルカリホスファターゼ活性を全く示さ
ない。）を「十−ト」とＩ７％ＨＭＢＡを加えない場合
（アルカリホスファターゼ活性を極めて強く示す。）を
「−一」とし、分化誘導の程度を次の段階で示した。

＋−１−：アルカリホスファターゼ活性を全く示さない
十二アルカリホスファターゼ活性を１・丘とんど示さ々
い士：アルカリホスファターゼ活性を若干示す一：アル
カリホスファターゼ活性を強く示す一一二アルカリホス
ファターゼ活性を極めて強く示すなお、後述の試験例で
は、分化誘導作用をもって、制癌活性を示した。

以下に、本発明を製造例、製剤例及び試験例によって具
体的に説明する。

製造９１γｌＪン脂質への分離・精製）ニジマスの受精
後１２〜１４日の胚１．２ｋｇをホモジナイズ１７、該
ホモゾネートを、アセトン、エーテル、及ヒクロロホル
ムーメタノール（２：１　ｖ／ｖ　）で順次抽出した。

得られた３つの抽出液を混合し、減圧濃縮し、シリカケ
゛ルカラムクロマトグラフイー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　
６０、メルク社製１４／（：付した後、クロロホルム−
ヘキサンＣＯ〜１００％）メタノール（３：　７　ｖ／
ｖ　１の画分Ｖこ含−まれる。該両分を集めて、クロロ
ホルム−メタノール−水（６５：　２５　：　４　、　
ｖ／ｖ／ｖ　ｌ溶媒を用いてシリカケ゛ノシ洟４層りＣ
１？トゲラフイー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６　［Ｉ　Ｆ
　−２５４、メルク社ｆ＜　ｌ　ＶＣ付すと２つのスポ
ットに分れる。この２つのスポットのうちＲｆ　値が０
．２５の両分を集め、メタノールを用いて、高得た。

製剤例１（注射・点滴剤） リン １１冨實Ａ　１０　”！を含有するように粉末ぶどう糖
５２を加えてバイアルに無菌的に分配し、密封した十、
窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封入して冷暗所に保存
する。使用前にエタノールに溶解し。

０．８５％生理的食塩水Ｉ　Ｄ　Ｏｒｎｅを添加して静
脈内ｔにＩＩＩｒＩりと（７，１日、１０〜１００ＴＩ
Ｉｔを症状に応じて静脈内注射又は点滴で投与する。

より軽症用静脈内注射剤とし、１日、１０〜１ｏ。

ＩＩにを症状に応じて静脈内注射父にｔ点滴で投与する
。

製Ａ１１例３（腸Ｗｉ件カプセル剤） ％’肖Ａ５２．乳糖２．４６９及びヒドロキシゾロピル
セルロース０．０４２を各々とり、、１：＜混合した後
、常法に従って粒状に成形し、これをよく乾燥して篩別
してビン、ヒートンール包装などに適し、た顆粒剤を製
造する０次に、酢酸フタル酸セルロース０．５ｆ及びヒ
ドロキンプロピルセルロースフタレ−）０．５Ｆを溶解
ｌ−で被覆基材となし、前記顆粒を浮遊流動させつつこ
の基材を被覆して腸溶性の顆粒剤とする。この組成物を
カプセルに充填して腸溶性カプセル製剤１００個を製造
する。

〔３〕より、フレンド白血病口１１胞の分化誘導率、マ
ウス骨髄性白血病細１掴の分化誘導によるリゾチーム活
性及びマウス奇形腫細胞の分化誘導程度を調べたところ
、それぞれ、第１表、第２表及び第３表に示す結果が（
！ｔられた。

第１表 本比較例 第２表 ］　　　　４　　　　　　　６　　１ ツ ＤＥＸ＊＊’　　　　２　　１　　　４９　　’　　＋
＊　　　１　／Ｉｆ　／　１１１ｅは、　２２　ｕｎ　
ｉ　ｔ％＋＋ｅＫ相当する。

本本　比較（９１Ｊ　Ｉ　Ｐｏ５ｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔ
ｒｏｌ　　ｌデキサメタシン 第３表 上記試験例の結果から明らかなように気質Ａは癌細胞に
対して、正常細胞への分化誘導作用を示すことから、１
１１件の少ない優れた制癌活性を示すことが立証された
。

特許出願人　理化学研究所

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有するコリン含有リン脂質
   へ〇 １）物質の形状：　無色油状物 ２）質１を分析　：　　ＦＤ−ＭＳ、ＳＩＭＳより分子
   量ｔＡ　８０５　（Ｍ＋Ｈ１８０６：Ｍ＋Ｎａ、８２８
   ）及び分子量Ｍ８３１　（Ｍ＋Ｈ。 ８３２　：Ｍ＋Ｎａ、８５４　）を有する。 ５１Ｕ、Ｖ、スペクトル： λ０ｅ”　　：　２０５．５ｎｍ（Ｅ”２０９−５１、
   ｍａｘ　　　　　　　　　１ｃｍ ２３０ｎｍ　　（ＥＩＦ、、、　１６８−２）−２６８
   ｒｍ　　　（Ｅ　’％　６８．９）　ｃｍ ４）１．Ｒ，ス４クトル： に８ｒ””：　５４２５．　３０１５．　２９２５゜ν
   ｍａｘ ２８６０、１７３Ｂ、　　１４７７． １２４７、１１５３、１０９２． １０６７、９７０．　７１２ ５１　　溶）ＸＩ：エーテル、メタノール、クロロホル
   ムに可溶、アセト７％水に不溶。 ６）試薬に対する反応ニ ド′ラーケ１ンドルフ試林　　　　　　　陽　性ディト
   マーーレスター試薬陽性 にＭｎＯ４陽性 Ｈ２ＳＯ４陽性 ニンヒドリン試薬　　　　　　陰　性 アンスロン試薬　　　　　陰性 （２）　　下記の理化学的性質を有するコリン含有リン
   脂質Ａを有効成分として含有することを４￥徴とする制
   癌剤。 １）物′肖の形状：　無色油状物 ２）質量分析：　　ＦＤ−ＭＳ、ＳＩＭＳより分子Ｋ・
   Ｍ２Ｏ３（Ｍ十Ｈ，８０６：Ｍ＋Ｎａ、８２Ｂ）及び分
   子量Ｍ８３１　（Ｍ＋）ｌ、８５２：Ｍ十Ｎａ。 ８５４）を有する。 、ｎｅａｔ。 ３）　　Ｕ、Ｖ、スペクトル、仏ａｘ　　’１チ ２０５．５ｎｍ（Ｅ　　　２ｒ１９．５１゜ｃｍ ２３０　ｎｒｎ　（Ｅ　に１６８−２１２６８ｎｍ　　
   （Ｅ’％ １ｎｎ　　６　Ｂ　−９） ４１　１、Ｒ，スペクト７．： にＢｒ−１。 ν　　ｃｍ　　　＊　　３４２５、３０１５．　２９２
   ５゜ａｘ ２８６０％　１７５８％　１４７７゜ １２４７、１１５３．　１１１９２゜ １０６７、９７０、７１２ ５）　溶解性：エーテル、メタノール、り゛ロロボルム
   に可溶、アセトン、水に不溶、 ６）　試薬に対する反応： ヒラーケ゛ンドルフ試薬　　　陽性 ディトマー−レスター試＃　　　　賜　性ＫＭｎＯ４ｐ
   捗　　４Ｅ Ｈ２ＳＯ４陽性 二／ヒト・リン試薬　　　陰性 アンスロン試薬　　　　陰性 （３）　　Ｊト経ロ投与形態による特許請求の範囲第２
   項記載の制癌剤。 （４）経口投与形態による特許請求の範囲第２頃記４＜
   の制癌剤。