JPH0144196B2

JPH0144196B2 -

Info

Publication number: JPH0144196B2
Application number: JP57157102A
Authority: JP
Inventors: Kyoshi Isono; Kenichi Asahi
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1982-09-09
Filing date: 1982-09-09
Publication date: 1989-09-26
Also published as: JPS5946226A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なコリン含有リン脂質Ａ及び該
物質を有効成分として含有することを特徴とする
制癌剤に関するものである。従来、癌化学療法剤として、アルキル化剤（ナ
イトロジエンマスタード類、エチレンイミン類、
スルホン酸エステル類）、代謝桔抗物質（葉酸桔
抗剤、プリン桔抗剤、ピリミジン桔抗剤）、植物
性核分裂毒（コルセミド、ビンブラスチン等）、
抗生物質（ザルコマイシン、カルチノフイリン、
マイトマイシン等）、ホルモン類（副腎ステロイ
ド、男性ホルモン、女性ホルモン）及びポルフイ
リン錯塩（マーフイリン、copp）等が用いられ
ている。しかしながら、その殆んどは、細胞毒型
の物質であり、重大な副作用を呈するため、低毒
性で優れた制癌活性を有する制癌剤の開発が強く
望まれている。本発明者らは、上記趣旨に鑑み、低毒性で制癌
性を有する物質を動・植物、微生物界の広い生物
範囲から探索を行つた結果、ニジマス（Salma
gairdneri）の受精後12〜14日の胚中に含まれる
コリン含有リン脂質を分離し、該物質が文献未載
の特異的な理化学性質を有する全く新しい物質で
あることを見出し、更に該物質が、動物の腫瘍細
胞に対して分化誘導活性を有することを新たに見
出し、且つ著しく低毒性で、優れた制癌活性を有
することの新たな知見を得て、本発明を完成する
に至つた。本発明の制癌剤の有効成分は、人、家
畜、犬、ねこ等の混血動物に対する優れた癌化学
療法剤となり得るものである。以下に、本発明の新規コリン含有リン脂質Ａ
（以下、「リン脂質Ａ」と称する。）について説明
する。〔分離及びその精製法〕ニジマスの受精後12〜14日の胚をホモジナイズ
し、アセトン、エーテル及びクロロホルム−メタ
ノールで順次抽出する。３つの抽出物を混合し、
減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラ
フイーに付し、クロロホルム−ヘキサン（０〜
100％）及びメタノール−クロロホルム（０〜100
％）で展開した。活性区分は、クロロホルム−メ
タノール（３：７、ｖ／ｖ）画分に含まれる。該
画分をクロロホルム−メタノール−水（62：25：
４、ｖ／ｖ／ｖ）溶媒を用いてシリカゲル薄層ク
ロマトグラフイーに付すと２つのスポットに分れ
る。この２つのスポツトのうち、Rf値が0.25の画
分を、メタノールを用いて高速液体クロマトグラ
フイーに付して精製すると本発明のリン脂質Ａが
得られる。かくして得られるリン脂質Ａの理化学的性質
は、次のとおりである。〔リン脂質Ａの理化学的性質〕 (1) 物質の形状：無色油状物 (2) 質量分析：FD−MS、SIMSより分子量
M805（Ｍ＋Ｈ、806：Ｍ＋Na、828）及び分子
量M831（Ｍ＋Ｈ、832：Ｍ＋Na、854）を有す
る。 (3) U.V.スペクトル： λ^neat _nax； 205.5nｍ（Ｅ１％１cm209.5） 230nｍ（Ｅ１％１cm168.2） 268nｍ（Ｅ１％１cm68.9） (4) I.R.スペクトル： ν^KBr _naxcm^-1；3425、3015、2925、2860、1738、
1477、1247、1153、1092、1067、970、712 (5) 溶解性：エーテル、メタノール、クロロホル
ムに可溶、アセトン、水に不溶。 (6) 試薬に対する反応：ドラーゲンドルフ試薬陽性デイトマー−レスター試薬陽性 KMnO₄ 陽性 H₂SO₄ 陽性ニンヒドリン試薬陰性アンスロン試薬陰性上記理化学的性質を検討すると、リン脂質Ａ
は、ドラーゲンドルフ試薬及びデイトマー−レス
ター試薬に対して陽性も示すので、コリン及びリ
ン酸をその分子内に有すること、ニンヒドリン試
薬及びアンスロン試薬に対して陰性であるので、
アミノ酸及び糖を含有しないこと、U.V.スペク
トルにより、230nｍ及び268nｍの極大値は共役
二重結合を有すること、I.R.スペクトルより、
1738cm^-1及び970cm^-1が、それぞれエステル結合
及びコリンを含有すること、及びスフインゴミエ
リン（Sphingomyelin）のアミド結合が見出され
ないこと、及び後述のホスホリパーゼA₁、ホス
ホリパーゼA₂の加水分解により脂肪酸が見出さ
れることから、本発明の物質は、脂肪酸がエステ
ル結合したコリン含有リン脂質であることが妥当
と結論された。エステル部分の脂肪酸組成を決定するため、次
の方法により処理した。リン脂質Ａをメタノール中0.5N−CH₃ONaで
処理して加水分解し、遊離の脂肪酸を得た後ジア
ゾメタンでエステル化し、これをGC−MSで分
析した。この結果、C₁₅H₃₁COOCH₃、
C₁₇H₃₃COOCH₃（二重結合１個）、C₂₁H_X
COOCH₃（二重結合数未定）に相当する脂肪酸エ
ステルが同定された。次に、これらの脂肪酸の位置を決定するため、
次の方法により処理した。リン脂質Ａを、ホスホ
リパーゼA₁活性（選択的に１位のエステル結合
を加水分解する。）を有するリゾープス・デレマ
ー・リパーゼ（Rhizopus delemar lipase）によ
り加水分解し、ジアゾメタンでエステル化した
後、GC−MSで分析した結果、C₁₅H₃₁COOCH₃、
C₁₇H₃₅COOCH₃に相当する脂肪酸エステルが同
定された。次に、これらの脂肪酸の位置を決定す
るため、まずホスホリパーゼA₂（選択的に２位の
エステル結合を加水分解する。）により加水分解
し、ジアゾメタンでエステル化した後、GC−
MSで分析した結果C₂₁H₃₁COOCH₃（二重結合６
個）に相当する脂肪酸が同定された。次に、リン
脂質Ａの分子種を分析するため、次の方式により
処理した。リン脂質ＡをホスホリパーゼＣ（選択
的にコリンのリン酸エステル結合を加水分解す
る。）で処理し、得られたジグリセライドをトリ
メチルシリル化した後、GC−MSで分析した。
この結果とFD−MS、ホスホリパーゼA₁、A₂処
理の結果から、リン脂質Ａには主成分として、
C₁₅H₃₁COOH（１位）C₂₁H₃₁COOH（２位）、少量
成分としてC₁₇H₃₃COOH（１位）、C₂₁H₃₁COOH
（２位）に相当する脂肪酸が結合していることが
分つた。（なお、現在の段階では、二重結合の位
置は決定されていない。）次に、本発明の制癌剤について説明する。本発明の制癌剤は、前記のリン脂質Ａを有効成
分として含有することを特徴とするものである。
リン脂質Ａは、ニジマスの胚のような動物中に本
来存在するものより単離された物質であり、癌細
胞から正常細胞への分化誘導作用を示すことから
毒性の心配が全くない。本発明の制癌剤は、経口及び非経口投与のいず
れも使用可能であり、経口投与する場合は、軟・
硬カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤と
して投与され、非経口投与する場合は、水溶性懸
濁液、油性製剤などの皮下或いは静脈注射剤、点
滴及び固体状又は懸濁粘稠液状として持続的な粘
膜吸収が維持できるように坐薬のような剤型で投
与され得る。本発明の有効成分の製剤化は、界面活性剤、賦
形剤、滑沢剤、佐剤、及び必要に応じて腸溶性製
剤とするために医薬的に許容し得る皮膜形成物
質、コーテイング助剤等を用いて適宜行うことが
でき、その具体例を挙げれば、次のとおりであ
る。本発明の組成物の崩壊、溶出を良好ならしめる
ために、界面活性剤、例えばアルコール、エステ
ル類、ポリエチレングリコール誘導体、ソルビタ
ンの脂肪酸エステル類、硫酸化脂肪アルコール類
等の１種又は２種以上を添加することができる。また、賦形剤として、例えば蔗糖、乳糖、デン
プン、結晶セルロース、マンニツト、軽質無水珪
酸、アルミン酸マグネシウム、メタ珪酸アルミン
酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、炭酸カ
ルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カル
シウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム
等の１種又は２種以上を組合せて添加することが
できる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシ
ウム、タルク、硬化油等を１種又は２種以上添加
することができ、また矯味剤及び矯臭剤として、
食塩、サツカリン、糖、マンニツト、オレンジ油
カンゾウエキス、クエン酸、ブドウ糖、メントー
ル、ユーカリ油、リンゴ酸等の甘味剤、香料、着
色料、保存料等を含有させてもよい。懸濁剤、潤滑剤の如き佐剤としては、例えばコ
コナツト油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、乳
酸カルシウム、ベニバナ油、大豆リン脂質等を含
有させることができる。また皮膜形成物質としては、セルロース、糖類
等の炭水化物誘導体として酢酸フタル酸セルロー
ス（CAP）、またアクリル酸系共重合体、二塩基
酸モノエステル類等のポリビニル誘導体としてア
クリル酸メチル・メタアクリル酸共重合体、メタ
アクリル酸メチル・メタアクリル酸共重合体が挙
げられる。また、上記皮膜形成物質をコーテイングするに
際し、通常使用されるコーテイング助剤、例えば
可塑性の他、コーテイング操作時の薬剤相互の付
着防止のための各種添加剤を添加することによつ
て皮膜形成剤の性質を改良したり、コーテイング
操作をより容易ならしめることができる。なお、
有効成分を皮膜形成物質を用いてマイクロカプセ
ル化してから賦形剤等と混合した剤型としても良
い。特に代表的な剤型における配合比は下記の通り
である。

【表】物質
特に好ましい賦形剤は、乳糖、結晶セルロー
ズ、カルボキシメチルセルロースカルシウムであ
る。また、投与量は、対象腫瘍を有効に治療するに
十分な量であり、腫瘍の症状、投与経路、剤型な
どによつて左右されるが、一般に、経口投与の場
合、大人では１日当り、約0.01〜100mg／Kg体重
（小人では、0.01〜60mg／Kg体重）の範囲で、そ
の上限は好ましくは約50mg／Kg体重、更に好まし
くは約10mg／体重程度であり、非経口投与の場
合、その上限は約10mg／Kg体重程度であり、好ま
しくは５mg／Kg体重、更に好ましくは２mg／Kg体
重が適当である。次に、リン脂質Ａの制癌活性を確認した制癌性
試験について述べる。〔1〕フレンド白血病細胞（mouse erythroid
leukemia cell、B8細胞）に対する試験 GIBCO製HAMのＦ−12培地に、15％の牛
胎児血清及び60mg／のカナマイシンも加えた
ものに、2.5×10⁴cell／mlとなるようにB8細胞
を接種し、これに所定量の被験化合物を加える
（最終容量５ml）。 7.5％CO₂中、37℃７日間培養した後、オル
キン（Orkin）のベンジジン染色法により染色
し、染色された細胞数、すなわち、赤血球への
分化によりヘモグロビンを生成するようになつ
た細胞数を測定し、分化誘導率を求める。分化誘導率（％）染色された細胞数／全細胞数×100 〔2〕マウス骨髄性白血病細胞（mouse myeloid
leukemia cell、Ｍ／）に対する試験 GIBCO製イーグルMEM倍地に、10％の馬
血清及び60mg／のカナマイシンを加えたもの
に、5.0×10⁴cell／mlとなるようにＭ／細胞を
接種し、これに所定量の被験化合物を加える
（最終容量５ml）。 7.5％CO₂中、37℃７日間培養した後、貧食
細胞、あるいは顆粒球への分化により誘導され
たリゾチーム活性を調べる。なお、リゾチーム
活性の１単位（unit）とは、ミクロコツカスリ
ソデイクテイカス（Micrococcus
lysodeikticus）菌体の懸濁液を基質として、
リゾチームを用させ、PH6.24、温度25℃で測定
し、450ｍμの波長の吸光度を毎分0.001減少さ
せるようなリゾチームの量をいう。〔3〕マウス奇形腫細胞（mouse
teratocarcinoma）に対する試験テトラーマ細胞をマウスの腹腔から腹腔へ移
植後、１ケ月経過したものを用いた。テラトー
マ細胞は、腹腔中では初期胚に似た胚様体
（embroid body）という細胞塊として存在し、
それらをトリプシン処理などを行うことなく用
いた。採取した腹水中で自然沈下させて得られ
る胚様体をダルベコー変法培地、あるいはハン
クス液で３度洗浄後、10％牛胎児血清を含む培
地に接種し、所定量の被験化合物を加え、37℃
でCO₂7.5〜８％を含む水蒸気を飽和して、空
気中で１週間培養する。遠心分離（2000r.p.
m.10分）して得た胚様体を0.86％NaCl溶液で
洗浄後、ナフトールAS−MXホスフエートと
ジアゾ試薬（Fast Violet Ｂ Salt）を加えて
１時間室温で放置する。これを遠心分離
（2000r.p.m.、10分）して胚様体を分離し、エ
タノールを加えて１時間室温で放置する（未分
化の細胞は、赤く着色する）。これを、535nｍの吸収を測定し、アルカリ
ホスフアターゼ活性（分化誘導の程度）を求め
る。ヘキサメチレンビスアセトアミド（HMBA）
５ｍＭを加えた場合（アルカリホスフアターゼ
活性を全く示さない。）を「＋＋」とし、
HMBAを加えない場合（アルカリホスフアタ
ーゼ活性を極めて強く示す。）を「−−」とし、
分化誘導の程度を次の段階で示した。＋＋：アルカリホスフアターゼ活性を全く示さな
い＋：アルカリホスフアターゼ活性をほとんど示
さない。 ±：アルカリホスフアターゼ活性を若干示す −：アルカリホスフアターゼ活性を強く示す −−：アルカリホスフアターゼ活性を極めて強く
示す。なお、後述の試験例では、分化誘導作用をもつ
て、制癌活性を示した。以下に、本発明を製造例、製剤例及び試験例に
よつて具体的に説明する。製造例（リン脂質Ａの分離・精製）ニジマスの受精後12〜14日の胚1.2Kgをホモジ
ナイズし、該ホモジネートを、アセトン、エーテ
ル、及びクロロホルム−メタノール（２：1v／
ｖ）で順次抽出した。得られた３つの抽出液を混
合し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフイー（Kieselgel 60、メルク社製）に付した
後、クロロホルム−ヘキサン（０〜100％）及び
メタノールクロロホルム（０〜100％）で展開し
た。リン脂質Ａの活性区分は、クロロホルム−メ
タノール（３：7v／ｖ）の画分に含まれる。該
画画分を集めて、クロロホルム−メタノール−水
（65：25：４、ｖ／ｖ／ｖ）溶媒を用いてシリカ
ゲル薄膜クロマトグラフイー（Kieselgel 60F−
254、メルク社製）に付すと２つのスポツトに分
れる。この２つのスポツトのうちRf値が0.25の画
分を集め、メタノールを用いて、高速液体クロマ
トグラフイー（Nucleosil 5C₁₈日立製）で繰返し
精製して、25.2mgのリン脂質Ａを得た。製剤例１（注射・点滴剤）リン脂質A10mgを含有するように粉末ぶどう糖
５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し、密封し
た上、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封入して
冷暗所に保存する。使用前にエタノールに溶解
し、0.85％生理的食塩水100mlを添加して静脈内
注射剤とし、１日、10〜100mlを症状に応じて静
脈内注射又は点滴で投与する。製剤例（注射・点滴）リン脂質A2mgを用いて、製剤例１と同様の方
法により軽症用静脈内注射剤とし、１日、10〜
100mlを症状に応じて静脈内注射又は点滴で投与
する。製剤例３（腸溶性カプセル剤）リン脂質A5ｇ、乳糖2.46ｇ及びヒドロキシプ
ロピルセルロース0.04ｇを各々とり、よく混合し
た後、常法に従つて粒状に成形し、これをよく乾
燥して篩別してビン、ヒートシール包装などに適
した顆粒剤を製造する。次に、酢酸フタル酸セル
ロース0.5ｇ及びヒドロキシプロピルセルロース
フタレート0.5ｇを溶解して被覆基材となし、前
記顆粒を浮遊流動させつつこの基材を被覆して腸
溶性の顆粒剤とする。この組成物をカプセルに充
填して腸溶性カプセル製剤100個を製造する。試験例リン脂質Ａを用い、前記試験法〔１〕、〔２〕及
び〔３〕より、フレンド白血病細胞の分化誘導
率、マウス骨髄性白血病細胞の分化誘導によるリ
ゾチーム活性及びマウス奇形腫細胞の分化誘導程
度を調べたところ、それぞれ、第１表、第２表及
び第３表に示す結果が得られた。

【表】＊比較例

【表】ゾン

【表】＊比較例
上記試験例の結果から明らかなように、リン脂
質Ａは癌細胞に対して、正常細胞への分化誘導作
用を示すことから、毒性の少ない優れた制癌活性
を示すことが立証された。

【図面の簡単な説明】

添付図面はリン脂質Ａの赤外線吸収スペクトル
を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有するコリン含有リン
脂質Ａ。 (1) 物質の形状：無色油状物 (2) 質量分析：FD−MS、SIMSより分子量
M805（Ｍ＋Ｈ、806：Ｍ＋Na、828）及び分子
量M831（Ｍ＋Ｈ、832：Ｍ＋Na、854）を有す
る。 (3) U.V.スペクトル： λ^neat _nax； 205.5nｍ（Ｅ１％１cm209.5）、 230nｍ（Ｅ１％１cm168.2）、 268nｍ（Ｅ１％１cm68.9） (4) I.R.スペクトル： ν^KBr _naxcm^-1；3425、3015、2925、2860、1738、
1477、1247、1153、1092、1067、970、712 (5) 溶解性：エーテル、メタノール、クロロホル
ムに可溶、アセトン、水に不溶。 (6) 試薬に対する反応：ドラーゲンドルフ試薬陽性デイトマー−レスター試薬陽性 KMnO₄ 陽性 H₂SO₄ 陽性ニンヒドリン試薬陰性アンスロン試薬陰性２下記の理化学的性質を有するコリン含有リン
脂質Ａを有効成分として含有することを特徴とす
る制癌剤。 (1) 物質の形状：無色油状物 (2) 質量分析：FD−MS、SIMSより分子量
M805（Ｍ＋Ｈ、806：Ｍ＋Na、828）及び分子
量M831（Ｍ＋Ｈ、832：Ｍ＋Na、854）を有す
る。 (3) U.V.スペクトル：λ^neat _nax； 205.5nｍ（Ｅ１％１cm209.5）、 230nｍ（Ｅ１％１cm168.2） 268nｍ（Ｅ１％１cm68.9） (4) I.R.スペクトル： ν^KBr _naxcm^-1；3425、3015、2925、2860、1738、
1477、1247、1153、1092、1067、970、712 (5) 溶解性：エーテル、メタノール、クロロホル
ムに可溶、アセトン、水に不溶。 (6) 試薬に対する反応：ドラーゲンドルフ試薬陽性デイトマー−レスター試薬陽性 KMnO₄ 陽性 H₂SO₄ 陽性ニンヒドリン試薬陰性アンスロン試薬陰性３非経口投与形態による特許請求の範囲第２項
記載の制癌剤。４経口投与形態による特許請求の範囲第２項記
載の制癌剤。