JPH0367050B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な化合物OC−１及び該物質を
有効成分として含有することを特徴とする制癌剤
に関するものである。 従来、癌化学治療法剤として、アルキル化剤
（ナイトロジエンマスタード類、エチレンイミン
類、スルホン酸エステル類）、代謝拮抗物質（葉
酸拮抗剤、プリン拮抗剤、ピリミジン拮抗剤）、
植物性核分裂毒（コルセミド、ビンブラスチン
等）、抗生物質剤（ザルコマイシン、カルチノフ
イリン、マイトマシン等）、ホルモン類（副賢ス
テロイド、男性ホルモン、女性ホルモン）及びポ
ルフイリン錯塩（マーフイリン、copp）等が用
いられている。しかしながら、その殆んどは、細
胞毒型の物質であり、重大な副作用を呈するた
め、低毒性で優れた制癌活性を有する制癌剤の開
発が強く望まれている。 本発明者らは、上記趣旨に鑑み、低毒性で制癌
性を有する物質を動・植物、微生物界の広い生物
範囲から探索を行つた結果、ミミズ
（OIigochaeta）から活性物質を単離し、該物質
が文献未載の特異的な理化学的性質を有する全く
新しい物質であることを見出し、更に該物質が、
動物の腫傷細胞にに対して分化誘導活性を有する
ことを新たに見出し、且つ著しく低毒性で、優れ
た制癌活性を有することの新たな知見を得て、本
発明を完成するに至つた。本発明の制癌剤の有効
成分は、人、家畜、犬、ねこ等の温血動物に対す
る優れた癌化学治療法剤となり得るものである。 以下に、本発明の新規化合物OC−１について
説明する。 〔化合物OC−１の分離と精製〕 ミミズ（約１Kg）をアセトン、エーテル、クロ
ロホルム−メタノール（２：１）混合溶媒，テト
ラヒドロフラン、水（各１）で順次抽出、溶媒
を加え、撹拌後、５℃にて24時間放置後、過を
行つた。各々の抽出液について、後述の活性測定
法によると、アセトン、クロロホルム−メタノー
ル（２：１）混合溶媒の抽出液に強い活性が見出
された。両抽出液を、減圧下濃縮し、シリカゲル
カラムクロマトグラフイーを行つた。展開溶媒と
しては、ヘキサン100％に、クロロホルムを、又
クロロホルム100％にメタノールを各々10％間隔
で加えていつた。各画分の分化誘導活性を調べた
ところ次の結果が得られた（第１表）。

【表】 これらの画分のうち、フレンド白血病細胞
（B8）に対し強い活性を示したCHCl₃−MeOH
（60：40）溶出画分を調製用シリカゲル薄層クロ
マトグラフイー（メルク社製、0.5mm厚）で精製
した。展開溶媒としては、ベンゼン−酢酸エチル
−メタノール（１：５：10）を用いた。活性物質
のRf値は、0.1であつた。又中性アルミナ薄層ク
ロマトグロフイー（メルク社製0.2mm 厚）、展開
溶媒クロロホルム−メタノール−水（65：25：
２）では、活性物質のRf値は、0.7であつた。調
製用シリカゲル薄層クロマトグラフイーにより精
製された活性物質を、更に逆相高速液体クロマト
グラフイー（ヌクレオシル5C18、カラム径：８
×300mm、展開溶媒：メタノール〔１％ジエチル
アミン＋ギ酸PH7.8〕（70：30）、流速：１ml／分）
で精製し、６mgの精製物質を得た。なお、活性区
分の検出は、RIとUV（215nｍ）によつた。 かくして得られる化合物OC−１の理化学的性
質は次のとおりである。 (1) IRスペクトル：ν^KBr _nax（cm^-1） 3450、2925、1709、1660、1450、750 (2) UVスペクトル： 310nｍに弱い吸収がある。 (3) 試薬に対する反応： I₂，KMnO₄，ニンヒドリンに対し陽性
FeCl₃，デイトマー（Dittmer）に対し陰性 次に本発明の制癌剤について説明する。 本発明の制癌剤は、前記化合物OC−１を有効
成分として含有することを特徴とするものであ
る。化合物OC−１は、ミミズのような動物中に
本来存在するものより単離された物質であり、癌
細胞から正常細胞への分化誘導作用を示すことか
ら毒性の心配が全くない。 本発明の制癌剤は、経口及び非経口投与のいず
れも使用可能であり、経口投与する場合は、軟・
硬カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤と
して投与され、非経口投与する場合は、水溶性懸
濁液、油性製剤などの皮下或いは静脈注射剤、点
滴剤及び固体状又は懸濁粘稠液状として持続的な
粘膜吸収が維持できるように坐薬のような剤型で
投与され得る。 本発明の有効成分の製剤化は、界面活性剤、賦
形剤、滑沢剤、佐剤、及び必要に応じて腸溶性製
剤とするために医薬的に許容し得る皮膜形成物
質、コーテイング助剤等を用いて適宜を行うこと
ができ、その具体例を挙げれば、次のとおりであ
る。 本発明の組成物の崩壊、溶出を良好ならしめる
ために、界面活性剤、例えばアルコール、エステ
ル類、ポリエチレングリコール誘導体、ソルビタ
ンの脂肪酸エステル類、硫酸化脂肪アルコール類
等の１種又は２種以上を添加することができる。 また、賦形剤として、例えば糖〓、乳糖、デン
プン、結晶セルロース、マンニツト、軽質無水珪
酸、アルミン酸マグネシウム、メタ珪酸アルミン
酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、炭酸カ
ルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カル
シウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム
等の１種又は２種以上を組合せて添加することが
できる。 滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシ
ウム、タルク、硬化油等を１種又は２種以上添加
することができ、また矯味剤及び矯臭剤として、
食塩、サツカリン、糖、マンニツト、オレンジ油
カンゾウエキス、クエン酸、ブドウ糖、メントー
ル、ユーカリ油、リンゴ酸等の甘味剤、香料、着
色料、保存料等を含有させてもよい。 懸濁剤、湿潤剤の如き佐剤としては、例えばコ
コナツト油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、乳
酸カルシウム、ベニバナ油、大豆リン脂質等を含
有させることができる。 また皮膜形成物質としては、セルロース、糖類
等の炭水化物誘導体として酢酸フタル酸セルロー
ス（CAP）、またアクリル酸系共重合体、二塩基
酸モノエステル類等のポリビニル誘導体としてア
クリル酸メチル・メタアクリル酸共重合体、メタ
アクリル酸メチル・メタアクリル酸共重合体が挙
げられる。 また、上記皮膜形成物質をコーテイングするに
際し、通常使用されるコーテイング助剤、例えば
可塑剤の他、コーテイング操作時の薬剤相互の付
着防止のための各種添加剤を添加することによつ
て皮膜形成剤の性質を改良したり、コーテイング
操作をより容易ならしめることができる。なお、
有効成分を皮膜形成物質を用いてマイクロカプセ
ル化してから賦形剤等と混合した剤型としても良
い。 特に代表的な剤型における配合比は下記の通り
である。

【表】 特に好ましい賦形剤は、乳糖、結晶セルロー
ズ、カルボキシメチルセルロースカルシウムであ
る。 また、投与量は、対象腫瘍を有効に治療するに
十分な量であり、腫瘍の症状、投与経路、剤型な
どによつて左右されるが、一般に、経口投与の場
合、大人では１日当り、約0.01〜100mg／Kg体重
（小人では、0.01〜60mg／Kg体重）の範囲で、そ
の上限は好ましくは約50mg／Kg体重、更に好まし
くは約10mg／Kg体重程度であり、非経口投与の場
合は、その上限は約10mg／Kg体重程度であり、好
ましくは50mg／Kg体重、更に好ましくは２mg／Kg
体重が適当である。 次に化合物OC−１の制癌活性を確認した制癌
性試験について述べる。 〔1〕 フレンド白血病細胞（mouse erythroid
leukemia cell，B8細胞）に対する試験GIBCO
製HAMのＦ−12培地に、15％の牛胎児血清及
び60mg／のカナマイシンを加えたものに、25
×10⁴cell／となるようにB8細胞を接触し、こ
れに所定量の被験化合物を加える（最終容量５
ml）。 7.5％CO₂中、37℃７日間培養した後、オル
キン（Orkin）のベンジジン染色法により染色
し、染色された細胞数、すなわち、赤血球への
文化によりヘモグロビンを生成するようになつ
た細胞数を測定し、分化誘導率を求める。 分化誘導率（％）＝染色された細胞数／全細胞数×100 〔2〕 マウス骨髄性白血病細胞（mouse myeloid
leukemia cell，M1）に対する試験GIBCO製
イーグルHAM培地に、10％の馬血清及び60
mg／のカナマイシンを加えたものに、5.0×
10⁴cell／mlとなるようにM1細胞を接触し、こ
れに所定量の被験化合物を加える（最終容量５
ml）。 7.5％CO₂中、37℃７日間培養した後、貧食
細胞、あるいは顆粒球への分化により誘導され
たリゾチーム活性を調べる。なお、リゾチーム
活性の１単位（unit）とは、ミクロコツカス・
リソデイクデイカス（Micrococcus
lysodeikticus）菌体の懸濁液を基質として、
リゾチームを作用させ、PH6.24、温度25℃で測
定し、450ｍμの波長の吸光度を毎分0.001減少
させるようなリゾチームの量をいう。 〔3〕 マウス奇形腫瘍胞（mouse teratocar
cinoma）に対する試験 テラトーマ細胞をマウスの腹腔から腹腔へ移
植後、１ケ月経過したものを用いた。テラトー
マ細胞は、腹腔中では初期胚に似た胚様体
（embroid body）という細胞塊として存在し、
それらをトリプシン処理などを行うことなく用
いた。採取した腹水中で自然落下させて得らる
れる胚様体をダルベコー変法培地、あるいはハ
ンクス液で３度洗浄後、10％牛胎児血清を含む
培地に接種し、所定量の被験化合物を加え、37
℃でCO₂7.5〜８％を含む水蒸気を飽和して、
空気中で１週間培養する。遠心分離（2000r.p.
m.10分）して得た胚様体を0.86％NaCl溶液で
洗浄後、ナフトールAS−MXホスフエートと
ジアゾ試薬 （Fast Violet Ｂ alt）を加えて１時間室
温で放置する。これを遠心分離（2000r.p.m.、
10分）して胚様体を分離して、エトノールを加
えて１時間室温で放置する。 （未分化の細胞は、赤く着色する）。 これを、535nｍの吸収を測定し、アルカリ
ホスフアターゼ活性（分化誘導の程度）を求め
る。 ヘキサメチレンビスアセトアミド（HMBA）
5mMを加えた場合（アルカリホスフアターゼ
活性を全く示さない。）を「＋＋」とし、
HMBAを加えない場合（アルカリホスフアタ
ーゼ活性を極めて強く示す。）を「−−」とし、
分化誘導の程度を次の段階で示した。 ＋＋：アルカリホスフアターゼ活性を全く示さな
い。 ＋ ：アルカリホスフアターゼ活性をほとんど示
さない。 ± ：アルカリホスフアターゼ活性を若干示す。 − ：アルカリホスフアターゼ活性を強く示す。 −−：アルカリホスフアターゼ活性を極めて強く
示す。 なお、後述の試験例では、分化誘導作用をもつ
て、制癌活性を示した。 以下に、本発明を製剤例及び試験例によつて具
体的に説明する。 製剤例 １ （注射・点滴剤） 化合物CO−１、10mgを含有するように粉末ぶ
どう糖５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し、
密封した上、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封
入して冷暗所に保存する。使用前にエタノールに
溶解し、0.85％生理的食塩水100mlを添加して静
脈内注射剤として、１日、10〜100mlを症状に応
じて静脈内注射又は点滴で投与する。 製剤例 ２ （注射・点滴剤） 化合物OC−１、２mgを用いて、製剤例１と同
様の方法により軽症用静脈内注射剤とし、１日、
10〜100mlを症状に応じて静脈内注射又は点滴で
投与する。 製剤例 ３ （腸溶性カプセル剤） 化合物OC−１（５ｇ）、乳糖2.46ｇ及びヒドロ
キシプロピルセルロース0.04ｇを各々とり、よく
混合した後、常法に従つて粒状に成形し、これを
よく乾燥して篩別してビン、ヒートシール包装な
どに適した顆粒剤を製造する。次に、酢酸フタル
酸セルロース0.5ｇ及びヒドロキシプロピルセル
ロースフタレート0.5ｇを溶解して被覆基材とな
し、前記顆粒を浮遊流動させつつこの基材を被覆
して腸溶性の顆粒剤とする。この組成物をカプセ
ルに充填して腸溶性カプセル製剤100個を製造す
る。 試験例 化合物OC−１を用い、前記試験法によりフレ
ンド白血病（B8）細胞の文化誘導によるリゾチ
ーム活性を調べた。 その結果、精製された本物質は、約30μｇ／ml
以上の濃度で、B8細胞に対し、ポジテイブ・コ
ントロールの1.5％DMSO（ジメチルスルホキシ
ド）と同等、あるいはそれ以上の強い活性を示し
た。この結果を第２表に示す。

【表】 このように本発明の化合物OC−１は癌細胞に
対して、正常細胞への分化誘導作用を示すことか
ら、毒性の少ない優れた制癌活性を示すことが立
証された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ミミズから単離される、下記の理化学的性質
   及び生理活性を有する化合物OC−１。 (1) IRスペクトル：ν^KBr _nax（cm^-1） 3450、2925、1709、1660、1450、750 (2) UVスペクトル： 310nｍに弱い吸収がある。 (3) 試薬に対する反応： I₂，KMnO₄，ニンヒドリンに対し陽性
   FeCl₃，デイトラマー（Dittmer）に対し陰性 (4) 下記の細胞に対して分化誘導活性を有する。 ELC（フレンド白血病細胞） MLC（マウス骨髄性白血病細胞） Ter（マウス奇形腫細胞） (5) Rf値：（薄層クロマトグラフイー） シリカゲル（メルク社製、0.5mm厚）： ベンゼン−酢酸エチル−メタノール （１：５：10） Rf0.1 中性アルミナ（メルク社製、0.2mm厚）： クロロホルム−メタノール−水 （65：25：２） Rf0.7 ２ ミミズから単離される、下記の理化学的性質
   及び生理活性を有する化合物OC−１を有効成分
   として含有することを特徴とする制癌剤。 (1) IRスペクトル：ν^KBr _nax（cm^-1） 3450、2925、1709、1660、1450、750 (2) UVスペクトル： 310nｍに弱い吸収がある。 (3) 試薬に対する反応： I₂，KMnO₄，ニンヒドリンに対し陽性
   FeCl₃，デイトラマー（Dittmer）に対し陰性 (4) 下記の細胞に対して分化誘導活性を有する。 ELC（フレンド白血病細胞） MLC（マウス骨髄性白血病細胞） Ter（マウス奇形腫細胞） (5) Rf値：（薄層クロマトグラフイー） シリカゲル（メルク社製、0.5mm厚）： ベンゼン−酢酸エチル−メタノール （１：５：10） Rf0.1 中性アルミナ（メルク社製、0.2mm厚）： クロロホルム−メタノール−水 （65：25：２） Rf0.7 ３ 非経口投与形態による特許請求の範囲第２項
   記載の制癌剤。 ４ 経口投与形態による特許請求の範囲第２項記
   載の制癌剤。