JPS58224689A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は触媒等として用すられる固定化酵素ｆ関する
。

近年、生体反応の触媒である酵素を用いる工業が発展し
つつある。酵素を触媒として用いる反応は、従来、化学
工業等で行なわれている酵素を用いない反応に比べ、常
温、常圧というような緩やかな条件であって４速やかに
進行する。また、酵素は反応特異性にすぐれているので
、酵素ヲ用いた反応では副反応がほとんど起こらない。

したがって、酵素は省エネルギー、省資源に大きく寄与
することができる。酵素がこのような種々の利点を持つ
ことから、薬品工業９食品工業、洗剤工業へとその利用
分野は広がっている。また、特定の基質にしか触媒作用
を示さないという酵素の基質特異性を生かし、特定の物
質を検知するバイオセンサに酵素を用いることも試みら
れている。

ところで、酵素は元来生体内の触媒であるため水溶性で
あって、従来では、酵素反応は酵素を水に溶解させた状
態で行なわれていた。そのため、反応終了後に反応溶液
中の酵素を回収し、これを再利用することは技術的に非
常に困難であった。

酵素は高価であるので、１反応ごとに反応廃液とともに
酵素を捨てることは非常に不経済である。

また、反応生成物中に酵素が混入し、反応生成物の純度
が低下することが多かった。

そこで、何らかの手段を用いて酵素を水不溶化する等し
て固定化し、酵素の回収、再利用あるいは連続利用する
ことが考え出された。酵素を固定化すれば、反応生成物
中に酵素が混入すること本ない。現在まで、酵素を固定
化して固定化酵素を得る方法が多数提案されている。し
かしいずれも問題があった。このことを次に説明する。

酵素を固定化する方法は、一般に、架橋法、包括法およ
び担体結合法の三つの方法に大別することができる。も
つとも普通の場合について述べれば、架橋法は酵素を２
個もしくはそれ以上の官能基を有する架橋剤と反応させ
て酵素を水不溶性とする方法、包括法は酵素をゲルの格
子に包み込んだり、半透性のポリマーの皮膜によって被
覆する方法、担体結合法は水不溶性の担体に酵素を結合
させる方法である。架橋法では比較釣機しい条件で酵素
の固定化反応が行なわれるため、反応中に酵素の失活、
変性が起りやすい。したがって、この方法によって得ら
れる固定化酵素は活性が弱い場合が多い。包括法によっ
て得られる固定化酵素は、酵素がゲルや半透膜性のポリ
マーによって包まれているので、基質あるいは反応生成
物が高分子物質の場合では触媒として使廟することがで
きない。担体結合法は、担体と酵素の結合様式によって
さらにイオン結合法、物理的吸着法および共有結合法の
三つに細分される。イオン結合法や物理的吸着法により
得られる固定化酵素は、酵素の担体に対する結合が弱く
、酵素が担体から脱落する恐れが多い。共有結合法では
、これまで述べた他の方法にあるような問題が生じる恐
れは少ない。

しかし、担体結合法の他の二つの方法と共通する問題が
あった。すなわち、担体結合法では、一つの担体に対す
る酵素固定量に限界があり、従来では、一般に、多量の
酵素を担体に固定するため、比表面積の大きい微粒子状
の担体を用いるようにしていた。そのため−この方法で
得られる固定化酵素が非常に小さいものとなって取り扱
いが困難となり、固定化酵素を使用するときの条件や反
応に用いる装置が複雑な本のになっていた。取り扱いが
容易となるよう、板状等の微粒子状でない金属体を担体
とする固定化酵素も考え出されてはいる。しかし、酵素
が少量しか固定されないため、基質に対する反応性が悪
く、安定性も悪い。

発明者らは担体結合法中の共有結合法に着目して研究を
重ねた。その結果、担体として多孔質金属が用いられ、
架橋剤によって担体に酵素が固定されている固定化酵素
であれば、反応性や安定性がよく、しかも取り扱いの藺
草な固定化酵素が容易に得られることを見いだし、こと
にこの発明を完成した。

すなわち、この発明は、多孔質金属を担体とし、架橋剤
によって酵素を固定させてなる固定化酵素をその要旨と
する。以下に、この発明の詳細な説明する。

担体となる多孔質金属としては白金やジルコニウム等か
らなる本のが用いられるが、金属の種類は特に限定され
るものではない。しかし、この発明にかかる固定化酵素
をノ（イオセンｌ’）電極、！：して用いる場合等では
白金等の導電性７３監よい本の２！ＩＸよく、また、酸
化されにくい金属の方７５工耐久性を考える上で好まし
い。多孔質金属の孔径は２００〜１０００λとなってい
るのが好ましい。多孔質金属の形は板状、薄片状等特に
限定されるものではない。しかし、取扱い性を考えると
、あまり細め）〈ない方がよい。多孔質金属は比表面積
めＩ大きいので、微粒子状でなくても多数の酵素分子を
固定化することができる。

架橋剤は多孔質金属と酵素をつなぐものであって、グル
タルアルデヒドやグルタルアルデヒドとＴ−アミノプロ
ピルエトキシシランの組合せ等があげられる。固定化酵
素が２種類以上の架橋剤を含む場合がある。多孔質金属
に酵素を物理的あるいは化学的に吸着させることはでき
るが、吸着させるだけでは両者の結合が弱い。そこで、
この発明では、酵素をより強固に多孔質金属に結合させ
るため、酵素と多孔質金属を架橋剤で結合させるように
しているのである。

酵素の種類は、特に限定されない。たとえば酸化還元酵
素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素。

異性化酵素または合成酵素等があげられる。これらのう
ちの少なくと４１種が選ばれる。

この発明にかかる固定化酵素は、たとえば、つぎのよう
にして作ることができる。多孔質金属の板状体等を酵素
溶液中に浸す等して、多孔質金属の孔中に酵素を物理的
あるいは化学的に吸着させた後、酵素と多孔質金属とを
架橋剤で結合させる。

あるいは、多孔質金属に架橋剤を結合させたのち、架橋
剤と酵素を結合させるようにしても工い。

この発明にかかる固定化酵素はこのように構成されるも
のであって、多孔質金属を担体としているので、微粒子
状でなくでも岸位重量轟りの固定酵素量を多くすること
ができる。したがって、取り扱いが簡単でしか本、反応
性の高い固定化酵素を容易に得ることができる。このよ
うな反応性の高イ固定化酵素をバイオセンサに用いるよ
うにすると、応答速度が速く、感度のすぐれたものとな
る。また、酵素が架橋剤により多孔質金属に強く結合さ
れているので、酵素が脱離する恐れがほとんどない。さ
らに、この発明にかかる固定化酵素は活性が長期にわた
って安定である。

つぎに、実施例および比較例について説明する。

〔実施例１〕 実施例１の固定化酵素を次のよ）うにして作った。

５Ｘ５ｍｍ、厚み７０μ（μ？７Ｋ）の白金板を２５係
アンモニア水溶液中に浸して５〜６時間加熱した。

加熱後、白金板をアンモニア水溶液から取シ出し多孔性
白金板を１０憾の硫酸水溶液中に浸して電極とし、対極
として白金を用いて＋１．２ｖの電圧を印加した。つぎ
に、多孔性白金板を水洗した後、２係のＴ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランに浸し、７５℃で約４時間還流
を行なった。得られたアミノアルキル化白金を１１０℃
で３０分乾燥させたのち、冷ｌ係グルタルアルデヒド水
溶液に約３０分浸し、つぎに水洗した。０．０１　Ｍの
酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）２０ｍｌにグルコースオキシ
ダーゼ４０１！ｖを加えて酵素溶液をつくり、先にグル
タルアルデヒド処理した多孔性白金板をこの酵素溶液に
浸して約１時間攪拌を行なった。このあと、５℃で風乾
してグルコースオキシダーゼ固定化白金板を得た。

得うれたグルコースオキシダーゼ固定化白金板１ を一方の電極とし、５Ｘ５ｍｍ、厚み７０μの白金板を
対極として、両者をｐＨ７，５のリン酸緩衝液中に入れ
た。対極に対して＋０．７ｖの電圧を印加した状態でリ
ン酸緩衝液にグルコースを添加し、様々なグルコース濃
度で応答時間および出力電流変化を測定した。ただし、
応答時間は、室温におけるグルコース添加前の定常状態
から添加後の定常状態に達するまでの時間であシ、出力
電流変化は両定常状態間の電流差である。

比較例１として白金に固定化されたのと同量のグルコー
スオキシダーゼを用い、これをｐＨ７，５のリン酸緩衝
液に加えた。陰極および陽極に前記と同様の白金板を使
用し、前記と同じ条件で応答時間および出力電流変化を
測定した。

実施例１および比較例１の応答時間（秒）を第１表に、
出力電流変化（１０−’Ａ）を第２表にそれぞれ示す。

第　　１　　表 （室温） 第　　２　　表（１０’Ａ） 実施例１は比較例１に比べて、応答時間がはやく、かつ
出力電流変化が大きい。したがって、この発明にかかる
固定化酵素はバイオセンサに用いるのに適しており、こ
れを用いるようにすると一バイオセンナが感度の高いも
のとなる。

実施例１の固定化酵素を作製後２週間乾燥状態で放置し
たあと、前記と同様にして応答時間および出力電流変化
を測定した。応答時間は各濃度とも作製時とほとんど変
わらず、出力電流変化は各濃度と本わずか１２〜１５チ
しか減少しなかった。

このようなことから本、この発明にかかる固定化酵素は
バイオセンサに用いるのに適していることがわかる。

〔実施例２〕 実施例２の固定化酵素を次のようにして作った。

２０Ｘ２０ｍｍ、厚み５０μの白金板を、実施例１を作
るときと同様、アンモニア水で処理して多孔性白金板を
作った。多孔性白金板を風乾したのち、１．５　＃　／
　ｍｌのインベルターゼ−ｐＨ５，０酢酸緩衝液中に浸
し、約ｌθ時間回転攪拌を行なった。

つぎに、酵素溶液から白金板を取り出し、これを冷１憾
グルタルア、ルデヒド溶液中に３０分間浸した後、５℃
で乾燥させて固定化標品（インベルターゼ固定化白金）
を得た。固定化収率は９３憾であった。この固定化標品
を２　Ｘ　２　ｍｍの大きさに切ってサッカａ−スの分
解反応を行ない、酵素活性の経時変化を調べた。分解反
応は温度４０℃。

ｐＨ５，０の酢酸緩衝液中で行なった。

実施例２で固定化されたと同量のインベルターゼを多孔
性白金板にイオン結合させたものを比較例２とし、実施
例２と同じ条件で酵素活性の経時変化を調べた。実施例
２および比較例２の酵素活性の検証は生成物であるグル
コース、フルクトースｔ−Ｄ、Ｎ、Ｓ法（ジニトロサリ
チル酸法）で測定することにより行なった。酵素活性は
固定化酵素作製時の酵素活性を１００とする比活性であ
られし、反応終了後は固定化酵素をｐＨ５，０の酢酸緩
衛液中で保存するようにした。

実施例２および比較例２の酵素活性の経時変化を第３表
に示す。

第　　３　　表 第３表かられかるように、実施例２の固定化酵素は比較
例２に比べ酵素活性が安定している〇特許出願人　松下
電工株式会社 代理人　弁理士　松　　本　　武　　彦手続補正書く自
発） １、事件の表示 ■ｅｆ口５７り［牛￥ＭＨ１０７７６４号３、補正をす
る者 事件との関係　　　　特許出願人 住　　所　　　　大阪府門真市大字門真１０４８番地名
　称（５８３）松下電工株式会社 代表者　　イ懐□小林　郁 ４、代理人 な　　　し ７、補正の内容 （１）明細書第２頁第１４行に「低下することが多かっ
た。」とあるを「低下することも欠点の一つである。」
と訂正する。

（２）明細書第８頁第５行に「γ−アミノプロピルトリ
エトキシシランに」とあるを「γ−アミノプロピルトリ
エトキシシラン水溶液に」と訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （υ　多孔質金属を担体とし、架橋剤によって酵素を固
   定させてなる固定化酵素。 （２）　　多孔質金属が孔径２００−１０（ｌλのもの
   である特許請求の範囲第１ｆＡ記載の固定化酵素。