JPH0518377B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、固定化酵素膜を下地電極の検出端に
装着し、酵素の作用による物質変化を下地電極で
検知するようにした酵素電極に関し、更に詳述す
ると、酵素活性の寿命が長く、しかも酵素活性が
低下した場合に容易に再生することができる酵素
電極に関する。

従来の技術及び発明が解決しようとする問題点 酵素電極は、酵素を水不溶性膜状担体に固定化
し、酵素の繰り返し使用を可能とした固定化酵素
膜と、下地電極とを組み合わせたもので、臨床化
学分析、食品分析等の分野で実用化されているも
のである。

この場合、担体への酵素の固定化方法として
は、酵素を担体に物理的に封止する包括法や、物
理吸着させる方法よりも、担体表面に架橋用官能
基を導入し、この官能基と酵素蛋白の末端基とを
反応させることによつて固定化する共有結合法の
方が、酵素の脱落を防いで酵素の長期安定性を高
めるために好ましい。従つて、酵素電極の固定化
酵素膜としては、従来より膜状担体に酵素を共有
結合法によつて固定化したものが多用されてい
る。

上述したように、酵素電極は酵素を繰り返し使
用できるものであるが、それにも限界があり、実
際には電極の長期使用によつて酵素活性は低下し
てしまう。この場合、酵素活性の低下原因として
は、酵素の高次構造の安定性が次第に失なわれる
ことによる酵素の失活の他、担体からの酵素の脱
落、熱変化やPH変化による酵素の変性、活性阻害
物質との接触、蛋白質の付着、微生物等による酵
素の分解などの多くのものが考えられる。

また、このように酵素活性が低下した場合、酵
素膜を使い捨てにして新しいものと交換すること
が従来行なわれているが、このような方法を採用
した場合、酸素電極のランニングコストが高くつ
く上、交換用の酵素膜の保存が面倒であり、しか
も酵素膜を交換する際に酵素膜の不地電極への装
着状態が微妙に変り、電極特性が変化するという
問題が生じる。

このため、酵素活性の寿命が可及的に長く、し
かも酵素活性が低下した時に酵素膜を交換するこ
となく、酵素膜を再生して再使用することのでき
る酵素電極が望まれるが、従来酵素電極を再生す
ることについての有効な提案は何らなされていな
いのが実情であつた。

本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、酵
素活性が長時間安定である上、酵素活性が低下し
た場合に劣化した酵素膜を容易に再生することが
できる酵素電極を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段及び作用 即ち、本発明らは、上記目的を達成するため共
有結合法による酵素膜を用いた電極を再生するこ
とにつき種々検討を行ない、共有結合法による酵
素膜が下記(a)〜(c)の条件を満たせば、この酵素膜
が劣化した場合に電極の検出端を酵素液に浸漬す
るだけで、担体表面の架橋用官能基と酵素の末端
基とを反応させて酵素を担体に固定化することが
でき、酵素膜を再生できることに想到した。

(a) 担体表面の架橋用官能基そのものが離脱した
り、陰蔽されるようなことがあれば、再生は不
可能となる。従つて、担体に導入される官能基
は通常の酵素電極の使用条件で充分に安定して
いること。

(b) 担体上の架橋用官能基と酵素の末端基との反
応は特別の条件を必要とせず、水中或いは緩衝
液中において室温に近い温和な条件で進行する
こと。

(c) 電極を酵素液に浸漬した時、酵素蛋白分子が
担体の架橋用官能基部位に容易に到達するこ
と。

しかしながら、膜状担体に共有結合法によつて
酵素を固定化した通常の酵素膜は上記条件を充分
満足しないため、更に検討を行なつた結果、共有
結合法によつて酵素を固定化した微粉末多孔性ガ
ラスを酵素の蛋白分子が通過可能な分画分子量を
有する保持膜に担持させることにより、上記各条
件を満たし、しかも酵素が長時間安定な酵素膜が
得られること、従つてこの酵素膜を用いることに
より、酵素寿命が長く、しかも検出端を酵素液に
浸漬するだけで簡単に再生し得る電極が得られる
ことを知見し、本発明をなすに至つたものであ
る。

従つて、本発明は、固定化酸素膜を下地電極の
検出端に装着した酵素電極において、上記固定化
酵素膜として、共有結合法によつて酵素を固定化
した微粉末多孔性ガラス担体を該酵素の蛋白分子
が通過可能な分画分子量を有する保持膜に担持さ
せてなるものを用いたことを特徴とする酵素電極
を提供することを目的とする。

ここで、分画分子量とは、分離膜がどのくらい
の大きさの粒子を分離できるかを粒子の分子量で
示すものである。したがつて、酵素の蛋白分子が
通過可能な分画分子量を有する保持膜とは、分画
分子量が酵素の蛋白分子の分子量より大きい保持
膜、すなわち微粉末多孔性ガラス担体に固定化し
た酵素の蛋白分子が通過可能な保持膜を意味す
る。

本発明酵素電極においては、微粉末多孔性ガラ
ス担体表面に官能基を導入し、この担体表面に酵
素を固定化しているので、有効表面積が大きく、
酵素活性の寿命が非常に長い。また官能基が通常
の電極使用条件で安定あると共に、保持膜を酵素
の蛋白分子が通過し得るため、酵素活性が低下し
た場合、電極の検出端を酵素液に浸漬することに
より、酵素蛋白分子が保持膜を通過して担体の位
置に到達し、この担体に固定化され、酵素膜が容
易に再生されるものである。

以下、本発明につき更に詳しく説明する。

本発明の酵素電極は、上述したように、共有結
合法によつて酵素を固定化した微粉末多孔性ガラ
ス担体を該酵素の蛋白分子が通過可能な分画分子
量を有する保持膜に担持させた酵素膜を用いたも
のであり、この場合微粉末多孔性ガラス担体の性
状は特に制限されないが、例えばミクロ孔径が
450Å程度の多孔質ガラスを粒径３〜4μｍの微粉
末に調製したもの等を好適に使用し得る。なお、
本発明において共有結合法とは、担体表面に酵素
蛋白の末端基と温和な条件で反応する架橋用官能
基を導入し、この担体表面の官能基と酵素蛋白の
末端基との反応によつて酵素を担体に固定化する
方法を指し、例えば担体表面にアルキルアルデヒ
ド基を導入し、シツフ塩基反応により固定化する
方法や、カルボキシル基等を導入し、ペプチド結
合によつて固定化する方法などが挙げられる。

また、上記保持膜の材質、性状も特に限定され
ない。本発明において、保持膜は微粉末多孔性ガ
ラス担体を膜状に展開する目的を持つと共に、試
料液と直接接触する外膜としても機能するもので
あり、従つて保持膜としては測定時に基質が通過
し得ると共に、再生時に酵素蛋白分子が通過し得
るものであればいずれのものでも使用し得る。例
えば酵素としてグルコースオキシターゼを用いる
場合、保持膜としてはアセチルセルロース、再生
セルロース混合セルロース等からなるミクロ孔径
が１〜10μｍ程度の親水性過膜を好適に用いる
ことができる。なお、保持膜に微粉末多孔性ガラ
ス担体を保持させる方法に制限はない。また、微
粉末多孔性ガラス担体は保持膜表面に均一に膜状
に分散させることが好ましい。更に、保持膜のミ
クロ孔径を適宜選択することにより、電極感度を
調整することができる。

次に、実施例により本発明を具体的に示す。

実施例 第１図は本発明の一実施例に係るグルコース酵
素電極１を示すもので、図中２は酸素電極（下地
電極）、３は酸素電極２の検知極、４は酸素電極
２の先端部に配設されたガス透過膜、５は内部液
である。また、６は第２図に示すように、ミクロ
孔径が１〜10μｍ程度の親水性過膜（保持膜）
７表面に共有結合法によつてグルコースオキシタ
ーゼを固定化した微粉末多孔性ガラス担体８を担
持させてなる固定化酵素膜である。この酵素膜６
は、検知極３の先端面とほぼ同形状に形成されて
おり、検知極３先端面に対向した状態で、かつそ
の担体８担持側面がガス透過膜４に当接した状態
で酸素電極２先端部に配置されていると共に、こ
の酵素膜６を覆つてポリプロピレン製ネツト９が
酸素電極２に取り付けられ、これにより酵素膜６
がネツト９によつて酸素電極２先端部に挿着、固
定されている。

なお、上記酵素膜６は、具体的には下記方法で
製造した。

即ち、まずミクロ孔径が約450Åの多孔性ガラ
スをボールミルで粉砕した後、粒径３〜4μｍオ
ーダーのものを分級して採取し、これを担体８と
する。次いで、上記微粉末多孔性ガラス担体８を
純水中に懸濁させると共に、この懸濁液をアセチ
ルセルロース、再生セルロース、混合セルロース
等からなるミクロ孔径１〜10μｍ程度の親水性
過膜７に吸引過させ、膜７表面部の微細孔に微
粉末多孔性ガラス担体８を充填することにより、
膜７表面に微粉末多孔性ガラス担体８を膜状に均
一に分散し、担持させる。次に、微粉末多孔性ガ
ラス担体８を担持させた保持膜７をシランカツプ
リング剤であるγ−アミノプロピルトリエトキシ
シランで処理してこれにアルキルアミノ基を導入
した後、更にグルタルアルデヒドで処理してアル
キルアルデヒド基を導入する。更に、保持膜７を
常温においてグルコースオキシターゼを溶かした
PH7.0のリン酸緩衝液に浸漬することにより、架
橋用官能基と酵素末端のアミノ基とがシツフ塩基
生成反応を行ない、これによつて酵素が固定化さ
れ、酵素膜６が得られるものである。なお、この
場合微粉末多孔性ガラス担体８に上記と同様の方
法で予め酵素を固定化した後、この微粉末多孔性
ガラス担体８を同様の方法で過膜７に担持させ
るようにしても差支えない。

上記実施例の酵素電極１においては、微粉末多
孔性ガラス担体８の表面に官能基を導入し、この
微粉末多孔性ガラス担体８表面に酵素を固定化し
ているので、酵素活性の寿命が非常に長い。ま
た、官能基が酸、アルカリ、100℃程度の高温に
対して安定で、従つて通常の使用条件では極めて
安定であると共に、保持膜７をグルコースオキシ
ターゼ酵素蛋白分子が通過し得るため、酵素膜６
の酵素活性が低下した場合、酵素電極１の先端部
をグルコースオキシターゼ酵素液に常温で浸漬す
ることにより、酵素蛋白分子が保持膜７を通過し
て保持膜７上面の微粉末多孔性ガラス担体８の位
置に到達し、この微粉末多孔性ガラス担体８に固
定化されて酵素膜が容易に再生される。しかも、
酵素膜６を検知極３の先端面とほぼ同形状に形成
し、検知極３の先端面に対向して配設したので、
極めて良好に再生が行なわれるものである。

なお、上記実施例においては保持膜７としてミ
クロ孔径１〜10μｍ程度の過膜を用いたが、こ
れは再生する際にグルコースオキシターゼ酵素蛋
白分子の微粉末多孔性ガラス担体８への到達を可
能ならしめるためである。しかし、通常測定時
は、この保持膜７の機能は基質であるグルコース
を通過させることにあるので、それ以外の蛋白等
の巨大分子は通過しない方が酵素膜６を保護する
上で好ましい。そこで、この酵素膜６の外部にミ
クロ孔径が0.01μｍ程度のガード膜を通常取り付
けておいて、電極１の再生操作を行なう時だけこ
のガード膜を取り外すようにすることも可能であ
る。

次に、上記酵素電極１の直線応答性、再生可能
性、活性寿命をそれぞれ調べた。

(1) 直線応答性 ミクロ孔径が0.015μｍ及び12.0μｍの２種類
の過膜７を用いて電極１をそれぞれ作成し、
直線応答性を調べた。結果を第３図（ミクロ孔
径0.015μｍの場合）及び第４図（ミクロ孔径
12.0μｍの場合）に示す。

(2) 再生可能性 電極１を0.1N Hcl水溶液、0.1N NaOH水
溶液及び約90℃の水にそれぞれ１時間浸漬して
酵素膜６をそれぞれ劣化させる。次に、劣化し
て100ppm、200ppmのグルコース標準液に対し
て殆ど出力を示さなくなつた電極１の先端部を
0.01モルのりん酸系緩衝液（PH7.0）50ml中に
グルコースオキシターゼ（140ユニツト／mg）
を10mg溶かした溶液中に常温で浸漬し、溶液を
１時間撹拌して再生した後、電極を純水でよく
洗浄し、再び100ppm、200ppmのグルコース標
準液に浸漬して出力を調べた。

結果を第５図（HCl溶液に浸漬した場合）、
第６図（NaOH溶液に浸漬した場合）及び第
７図（熱水に浸漬した場合）に示す。図中ａは
劣化前、ｂは劣化後、ｃは再生後の出力を表わ
し、各図における矢印は出力が劣化前の状態ａ
から劣化後の状態ｂに低下し、さらに再生後の
状態ｃに上昇したことを示すが、再生後の出力
は劣化前の出力とほぼ同じレベルであり、電極
１が良好に再生されていることが認められる。

なお、再生した電極１の出力の経時安定性を
調べたところ１ケ月以上安定であることが確認
され、上記再生操作が実用的に有効であること
が確認された。

(3) 活性寿命 上記電極１を常温において常時、約300ppm
濃度のグルコース溶液中に浸漬して保持し、随
時100ppm、200ppmのグルコース標準液を用い
てその出力を調べたところ、第８図に示すよう
に１年に亘つて酵素活性は殆ど低下せず、本発
明酵素膜の活性寿命が極めて長いことが認めら
れた。

発明の効果 以上説明したように、本発明の酵素電極は、酵
素活性の寿命が長く、しかも酵素活性が低下した
場合に容易に再生することができるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例に係る酵素電極を示
す部分断面図、第２図は同例の酵素膜を示す断面
図、第３図及び第４図はそれぞれ本発明電極の直
線応答性を示すグラフ、第５図、第６図及び第７
図はそれぞれ本発明電極を再生処理した結果を示
すグラフ、第８図は本発明電極の出力の経時変化
を示すグラフである。 １……酵素電極、２……酸素電極（下地電極）、
６……固定化酵素膜、７……保持膜、８……微粉
末多孔性ガラス担体。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 固定化酵素膜を下地電極の検出端に装着した
   酵素電極において、上記固定化酵素膜として、共
   有結合法によつて酵素を固定化した微粉末多孔性
   ガラス担体を該酵素の蛋白分子が通過可能な分画
   分子量を有する保持膜に担持させてなるものを用
   いたことを特徴とする酵素電極。