JPS6153035B2

JPS6153035B2 -

Info

Publication number: JPS6153035B2
Application number: JP11172978A
Authority: JP
Inventors: Shuichi Suzuki; Yukio Hirose; Mitsuhiro Hayashi
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1978-09-13
Filing date: 1978-09-13
Publication date: 1986-11-15
Also published as: JPS5539719A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は酵素を透過性塩化ビニル樹脂担体上に
固定化する方法に関する。近年酵素を固定化することが注目されている
が、その理由として高価な酵素を反復利用でき
る、酵素と生成物の分離が容易である、カラム等
による連続反応が可能となるなどが掲げられる。
これらの利点は、酵素の工業的利用の面から特に
重要である。従来酵素を固定化する方法は、酵素と担体とを共重結合させて固定化する。イオン交換基を有する担体に酵素をイオン結
合させて固定化する。２個以上の官能基を有する試薬によつて酵素
を架橋して固定化する。ポリアクリルアミドゲルのようなゲルの微細
格子中に酵素を包括して固定化する。活性炭、アルミナ等に物理的吸着させて固定
化する。などがあるが、上記の従来法は、いずれもすべて
の種類の酵素に適用できる方法ではなく、概して
これら固定化方法は高価である。共有結合法(i)、架橋法(iii)は、酵素内のアミノ
基、カルボキシル基などの官能基を直接担体と結
合させるため酵素の活性が著しく低下する場合が
多い。イオン結合法(ii)は、イオン結合のため結合
力が弱く脱離し易く、反応液のPH値により結合状
態が左右される。包括法(iv)は酵素コンホメーシヨン変化が起りに
くく酵素活性の低下が小さく、反応液のPH値によ
る格子状態の変化が起りにくく酵素の脱離が少な
いなどの利点を有する。しかしながら、包括法に
より得られる固定化酵素はゲル担体内部での反応
物、生成物の内部拡散速度が小さいため、反応時
間が長く、また、反応後の洗浄においても多量の
洗浄液を必要とするなどの欠点があり、例えば酵
素電極として用いるには測定所要時間が長くなり
不適当である。物理的吸着法(v)は、固定化操作が簡単である
が、結合力が弱いため酵素が脱離しやすい。例え
ば尿、血清などの生体中の被検物質を繰り返し測
定する場合、多量の試料液、緩衝液を使用するた
め、酵素が脱離し使用不可能となる。もし、多検
体の測定に際し、酵素の脱離が起りにくい方法が
開発されれば、吸着法は酵素の固定化操作が容易
であり、酵素の賦活が可能である点で大きな利点
を有する。すでに本発明者らは、耐食性等の優れた塩化ビ
ニル樹脂と酵素、微生物、オルガネラのうち一つ
または二つ以上とを溶媒に溶解し、得られた溶液
を膜状に形成し塩化ビニル樹脂を溶解しない溶媒
に浸漬して酵素、微生物、オルガネラの固定化膜
を製造した（特願昭52―99106）。すなわち内部拡
散速度を大きくするように改良した酵素、微生
物、オルガネラの固定化方法である。この方法に
おいては、酵素と塩化ビニル樹脂とを同時に溶解
できる有機溶媒が使用される。しかしながら酵素
は有機溶媒の種類により、失活が起こること、固
定化する酵素が耐有機溶媒性のある酵素に限定さ
れることがあり、広い範囲での使用ができない欠
点があつた。本発明者らはこの欠点を解消すべく鋭意検討を
重ねた結果、特定の方法により塩化ビニル樹脂の
担体を製造し、この担体を酵素を含む液に接触さ
せると多量の酵素が固定され、かつ十分な活性を
有する酵素の固定化物が得られることを見出し、
かかる知見に基づいて本発明を達成した。すなわち本発明は、塩化ビニル樹脂を一種また
は二種以上の溶媒(A)に溶解して該樹脂濃度２〜25
重量％の溶液とし、該溶液を塩化ビニル樹脂の貧
溶媒で且つ溶媒(A)の良溶媒となる一種または二種
以上の溶媒(B)中に浸漬して得られた担体を、酵素
を含む液と接触させることを特徴とする酵素の固
定化物の製法である。（塩化ビニル樹脂担体の製造法）次に本発明を詳述するに、塩化ビニル樹脂の担
体は以下のようにして製造される。先ず塩化ビニル樹脂をジメチルホルムアミドな
どの溶媒(A)に溶解し、これを所望の担体形状に形
成した後溶媒(B)への浸漬処理を行なう。本発明の上記塩化ビニル樹脂（PVR）として
は、ポリ塩化ビニル（PVC）、塩化ビニル共重合
体、これらと他の樹脂とのブレンド物があり、塩
化ビニル共重合体としては、例えば、塩化ビニル
と酢酸ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、アク
リル酸、アクリロニトリルなどとの二元または三
元以上の共重合体である。溶媒(A)は、PVRを溶解できる溶剤であつて、
ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセト
アミド（DMA）、ｎ―メチルピロリドン（ｎ―
MP）、ヘキサメチルホスフオアミド（HMPA）、
テトラヒドロフラン（THF）、アセトンとベンゼ
ンの混合溶媒などがある。PVR溶液の濃度とし
ては１〜30重量％のものが用いられる。酵素の固
定膜が優れた吸着活性を発揮して機能するために
はPVRの重合度が約1000において６〜12重量％
が好ましい。溶媒(B)は、後述の例の通り、PVRの貧溶媒で
あり、かつ、溶媒(A)の良溶媒となるものである。次に、かくして得たPVR溶液を基材上に流涎
し、あるいは空気中に噴霧して膜状、粒子状等所
望の担体形状に形成し、これらをさらに、次のい
ずれかの方法により処理する。 (i) 前記膜状、微粒子状等に形成後の溶液が肉眼
で観察して白化状態となつたのちに、PVR樹
脂には貧溶媒であるが前記溶媒(A)には良溶媒で
ある溶媒(B)中に浸漬して固定化して得られた膜
状物、粒状物等を担体とし酵素等の含有等に浸
漬する。 (ii) 前記溶液を担体形状に形成後直ちに乃至白化
する前に、アルコール系溶媒を含有する。
PVRの貧溶媒であるが前記溶媒(A)には良溶媒
である溶媒(B)中に浸漬して固定し得られた担体
を酵素等の含有液に浸漬する。また、(i)において、浸漬用の溶媒(B)としては
水、アルコール系溶媒、エーテル系溶媒などがあ
り、好ましくは水が用いられる。また、溶媒(B)に
浸漬するに際しては、浸漬に用いるものと同一ま
たは異種の溶媒(B)の蒸気雰囲気、特に、蒸気の分
圧が50mmHg以上の蒸気雰囲気に担体形状に形成
した溶液を接触せしめて該蒸気を吸収させたのち
溶媒(B)への浸漬を行なうのが、酵素等の吸着量の
安定性を得るために好ましい。また、(ii)においては、ゲル状の担体が得られ、
(i)に較べて、酵素固定量が格段に大きいので好ま
しい。アルコール系溶媒としては、メチルアルコー
ル、エチルアルコール、ｎ―プロピルアルコー
ル、iso―プロピルアルコール、ｎ―ブチルアル
コール、sec―ブチルアルコール、tert―ブチル
アルコールなどの一価アルコール類、エチレング
リコール、ジエチレングリコール、グリセリンな
どの多価アルコール類、エチレングリコールモノ
メチルエーテル、エチレングリコールモノエチル
エーテルなどのグリコールモノエーテル類などが
用いられる。浸漬する溶媒としてはこれらアルコ
ール系溶媒単独またはアルコール系溶媒を50重量
％以上含有して塩化ビニル樹脂不溶の混合溶媒で
あつてもよい。殊に、メチルアルコール、エチルアルコールを
用いた場合には、固定化酵素活性の大きい固定化
物が得られ、また、使用可能な酵素の範囲が広い
ので、実用上、一層好適である。なお、(ii)において白化する前とは、PVRと溶
媒(A)の溶液が目視できる白濁を生じて不透明とな
るまでの期間である。なえお、PVRと溶媒(A)の溶液には、担体の膨
潤の度合の調整すなわち後述の担体の含水率の調
節、孔径の調整等のために、ポリエチレングリコ
ール等のPVRに対し非溶媒性の化合物を添加す
ることができる。次にβ―グルクロニダーゼにより得た知見によ
れば当酵素を含む液と当該担体との接触におい
て、酵素等を含む溶液の濃度は１〜200mg／dlが
用いられ、好ましくは20〜100mg／dlである。濃
度が100mg／dlと超えると、固定化物の固定化酵
素の活性が低下する傾向が認められる。浸漬処理は、酵素の一種または二種以上をPH緩
衝溶液中に溶解して、浸漬液を調製し、この溶液
と本発明の前記工程で得た透過性担体を接触させ
て得る。得られる固定化物、例えば膜状固定化物
は100回以上の繰返し使用も可能であることか
ら、酵素等も担体の内部に浸透していることが推
定される。以上のようにして得られる酵素固定化物のう
ち、グルコースオキシダーゼ固定化膜の調製につ
いて更に述べる。β―Ｄ―グルコースはグルコー
スオキシダーゼの存在下で該酵素により酸化され
Ｄ―グルクロノラクトンと過酸化水素を生成す
る。グルコース濃度は、上記の酸素消費量また
は、過酸化水素の生成量から求めることが可能で
ある。本発明者らは、酸素消費量からグルコース
濃度を求めるセンサーの製造を考慮し、グルコー
スオキシダーゼ固定化膜を作成した。一般的に当
該PVRは、浸漬時間を長く、浸漬酵素溶液濃度
を高く、そしてPVR量を多くするほど吸着酵素
量が多くなる。グルコースセンサー用酵素固定化
膜は、酵素の膜透過性及び透過速度を考慮すれば
薄い程良いが、酵素吸着量及びセンサー膜の強度
を併わせて考慮し検討した結果20μｍ〜200μ
ｍ、より好ましくは40μｍ程度である。浸漬酵素溶液の酵素濃度が高い程透過性PVR
樹脂への酵素の吸着速度は大きいが、膜に吸着す
る酵素量が限定されるため浸漬酵素溶液濃度は、
個々の酵素及び固定化操作において好ましい条件
を有する。上記グルコースオキシダーゼ
（GOD）固定化膜では用いる溶液のGOD濃度２〜
100mg／dl、好ましくは20mg／dl以上、浸漬時間
５分〜24時間、好ましくは１時間の浸漬条件であ
る。勿論、本発明は上記浸漬条件に制約されるも
のではない。得られる酵素固定化物は冷暗所に保存する。以上本発明の固定化方法の効果とするところ
は、次の点に総括される。１固定化酵素の製造時間が短い。２固定化酵素の活性が大きい。３ PVRを酵素溶液に浸漬するだけの操作で容
易に固定化できる。失活後さらに酵素等を吸着
させることができる。４固定化された酵素は、イオン濃度、PH、温度
の変化に対し、脱離および変性しにくく安定で
ある。５固定化するのに、広い範囲の酵素に適用でき
る。本発明は、工業的酵素反応において酵素固定化
物などの形態として利用するほか、酵素法による
臨床分析、酵素電極などの分野で利用できる。次に実施例によつて本発明を更に具体的に説明
するが、本発明は、その要旨を超えない限り以下
の実施例に制約されるものではない。なお、実施
例において割合を示す部は重量による。実施例１ PVC（重合度1000）８部、DMF溶媒92部より
均一な溶液を調製し、この溶液の一部を20×20cm
のカラス板上に流涎し、直ちにメタノール浴中へ
ガラス板ごと浸漬した。30分後、膜をガラス板よ
り取り直径2.9cm、厚み40μｍのPVC膜をグルコ
ースオキシダーゼ（シグマ社製）溶液（0.1Mリ
ン酸塩バツフア―PH5.6）の20mg／dl4ml中に１時
間浸漬した。得られた膜として100μｇ／cm²（PVC）、固定
化酵素活性120units／ｇ（PVC）、酵素の寿命が
２カ月以上であつた。この膜を酵素電極の先端に装着し、グルコース
の測定を行なつた。50mg／dl以下のグルコース溶
液の濃度範囲で反応初速度と濃度の関係は直線的
であり、応答時間は15秒以内で測定可能であつ
た。このことは膜の拡散速度が早いことと併せ、
被測定溶液（グルコース溶液）の濃度が各サンプ
ル毎に異つても、各サンプルの測定時間を一定に
できるので、この酵素固定膜は、実用上測定時間
についての細かい操作要領についての配慮を不要
にできることが明らかである。なお、この測定に
おいて、グルコースの測定下限の濃度は0.1mg／
dlであつた。また、比較のためセルロース膜（厚
み100μｍ）を同様に浸漬して得た膜を酸素電極
の先端に装着した場合には、グルコースの測定下
限の濃度は約２mg／dlであり、グルコース溶液の
濃度がほぼ10mg／dlより大きいと、反応初速度と
濃度の関係が直線的でなくなつてしまうことが認
められた。また100個以上繰り返し測定可能であ
つた。なお、固定化酵素活性の測定法は
WORTHINGTON MANUAL1.1.3.4により行な
つた。なお、1Uは１分間に１μmolの基質の変化
を触媒作用により行なわせ得る酵素量とする。また、蛋白吸着量は担体に固定された酵素量を
表わし、測定はミクロキルダー法とローリー改良
法を併用した。以下の実験も同様の定義による。実施例２グルコースオキシダーゼの代りにアルブミンを
用い実施例１を同様にして膜を得た。吸着アルブ
ミン蛋白量は114μｇ／cm²であつた。実施例３グルコースオキシダーゼの代りにβ―グルクロ
ニダーゼを用い実施例１と同様にしてPVC膜を
得た。得られた膜の活性1.5mU／cm²（PVC）、吸
着量80〜100μｇ／cm²であつた。実施例４グルコースオキシダーゼ溶液にカタラーゼを加
え混合溶液として実施例１と同様に浸漬して二種
の複合酵素固定化膜を得た。この膜は比色法で測
定した結果、１mg／dl〜200mg／dlのグルコース
0.5mlを測定するのに十分な活性を保持してい
た。実施例５ PVC（重合度1000）７部とDMF溶媒93部とを
良く撹拌し、均一な液を調製した。この溶液の一
部を15cm×15cmのガラス板上に流涎し、揮発温度
30℃、揮発時間10分送風下で揮発し、水温40℃の
水槽中へガラス板ごと浸漬した。１分後膜をガラ
ス板より取り乾燥して試料に供した。得られた膜
は膜厚70μ、平均孔径1.0μ、透水量25c.c.／
min／cm²（差圧0.5Kg／cm²）であつた。得られた
膜6.6cm²をβ―グルクロニダーゼ（Ｐ―Ｌバイオ
ケミカル社製）溶液（0.1M酢酸ナトリウムバツ
フアー、PH4.5）の100mg／dl4ml中に１時間浸漬
した。得られた膜は、蛋白吸着量として約20μ
ｇ／cm²（PVC）、固定化酵素活性が0.39mU／cm²
（PVC）であつた。実施例６膜調製の際にPVC濃度を、それぞれ４，６，
８，10，12，15部（対応するDMFはそれぞれ
96，94，92，90，88，85部）に変化させ実施例１
と同様に膜を得た。得られたそれぞれの膜を100
mg／dlのβ―グルクロニダーゼ溶液（0.1M酢酸
ソーダバツフアーPH4.5）４mlに室温で１時間浸
漬した。得られた酵素膜の活性は、それぞれ、
0.90，0.98，1.50，0.64，0.34，0.25mU／cm²であ
つた。参考例１数種類の透過性膜について実施例５と同様にし
て酵素吸着量を比較した。用いた膜の厚みは100
μｍである。なお、セルロース膜は、耐食性が乏しく、本発
明により得られる透過性膜のようなくり返し使用
には耐え難いものと認められた。得られた膜の活性はそれぞれ下記のとおりであ
る。

【表】実施例７実施例１と同様にして得た40μｍのPVC膜を
β―グルクロニダーゼ0.1Mリン酸塩バツフアー
溶液に１時間浸漬する際に、β―グルクロニダー
ゼの濃度と固定化酵素の固定量との関係を検討し
たところ、下表の結果を得た。

【表】実施例８ PVC（重合度（1000）８部、DMF溶媒92部よ
り均一な溶液を調製し、この溶液を、羽根スター
ラーで撹拌（1000rmp）されている大過剰のメタ
ノール溶液に滴下（10ml／min）することにより
直径約１mmの粒状のPVC固定物を得た。得られ
た固定物１ｇを100mg／dlβ―グルクロニダーゼ
溶液（0.1M酢酸ナトリウムバツフアーPH4.5）５
mlに１時間浸漬した。得られた酵素固定化物の活
性は7mU／ｇ（担体wet）得られた固形物の含水
率は72wt％であり、この固定物を一度乾燥する
と水中に再浸漬してもとの状態（含水状態）に復
帰することはなかつた。含水率とは、湿潤した固定物の単位重量当りに
含まれる水の重量で表わす。実施例９ PVC（重合度1000）７部とDMF溶媒93部とを
よく撹拌し均一な液を調製した。この溶液の一部
を恒温室中の15cm×15cmのガラス板上に流涎し、
直ちに水温40℃の水槽中へガラス板ごと浸漬し
た。１分間後膜をガラス板より取り乾燥して試料
に供した。得られた膜は膜厚150μ、平均孔径3.0
μ、透過量10c.c.／min／cm²（差圧0.5Kg／cm²）で
あつた。得られた膜の6.6cm²を100mg／dlのβ―グ
ルクロニダーゼ溶液（0.1M酢酸バツフアーPH
4.5）４ml中に１時間浸漬した。得られた酵素固
定化膜の酵素活性は0.025mU／cm²（PVC）であつ
た。参考例２実施例１と同様の方法によつて得られたグルコ
ースオキシダーゼの固定膜（蛋白固定量100μ
ｇ／cm²）の8.5cm²について、NaCl水溶液10c.c.に浸
漬（25℃、24時間）した場合の膜の固定化酵素活
性に対するNaCl濃度の影響を図―１に示す。横
軸はNaCl濃度（mol／）を示し、縦軸は、
NaCl水溶液に浸漬前の固定化酵素活性に対す
る、浸漬後の固定化酵素活性の百分率である。
（●印）比較のために、グルコースオキシダーゼのみ２
mgをNaCl水溶液10c.c.に添加した場合を対比し
た。（〇印）

【図面の簡単な説明】

図１は膜の固定化酵素活性に対するNaCl濃度
の影響を示す。●印、〇印は、それぞれ、酵素を
本発明により膜に固定した場合と酵素を固定する
ことなくNaCl溶液中に添加した場合である。

Claims

【特許請求の範囲】１塩化ビニル樹脂を一種または二種以上の溶媒
(A)に溶解して該樹脂濃度２〜25重量％の溶液と
し、該溶液を塩化ビニル樹脂の貧溶媒で且つ溶媒
(A)の良溶媒となる一種または二種以上の溶媒(B)中
に浸漬して得られた担体を、酵素を含む液と接触
させることを特徴とする酵素の固定化物の製法。２溶媒(B)がアルコール系溶媒であり、溶媒(B)中
への浸漬は、前記溶液を所望担体形状に形成後直
ちに乃至溶液が白化する前の期間に行なう特許請
求の範囲第１項記載の製法。３溶媒(B)がアルコール系溶媒または水であり、
溶媒(B)中への浸漬は、前記所望形状に形成後白化
したのちに行なう特許請求の範囲第１項記載の製
法。４溶媒(B)中への浸漬は、塩化ビニル樹脂の貧溶
媒の蒸気を分圧５mmHg以上含む雰囲気に、前記
所望形状に形成した溶液を接触させ、貧溶媒を前
記所望形状に形成した溶液中に吸収させた後に行
なう特許請求の範囲第１項記載の製法。