JPH07199075A - 走査型レーザ顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】Ｉｎｄｏ−１観察と、可視光による透過観察を
同時に行え、測光側では試料から反射してくる可視光の
影響のない正確な測光が可能で、透過観察側では、可視
光にのみ対応させた安価な検出系を持つ走査型レーザ顕
微鏡装置を得ることにある。 【構成】概略少なくとも351nm と515nm のレーザビーム
を出射し試料10に照射するレーザ光源手段01〜09と、試
料10により反射されるレーザビームを分離し、各々を測
光用光路上に配置された複数のフォトマルチプライヤ2
0,26 に導く測光分離手段04〜09、集光レンズ16、ダイ
クロイックミラー17、吸収フィルター18、共焦点ピンホ
ール19、反射ミラー22、吸収フィルター24、共焦点ピン
ホール25からなるものと、フォトマルチプライヤ26への
透過観察用可視光の入射を防ぐダイクロイックフィルタ
ー23とで構成され、透過観察光学系及び透過検出系を具
備したもの。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は複数の蛍光観察光学系と
検光検出系と透過観察光学系及び透過検出系を具備した
走査型レーザ顕微鏡装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、一般の走査型レーザ顕微鏡で、試
料に照射されたレーザの反射光を利用した、蛍光観察
と、前記レーザで、試料を透過した透過光を利用した透
過観察の両方を行うものは、特開昭６１−２１９９１９
号公報に示されている。

【０００３】図７はその公報の従来例を示す図で、レー
ザ発振器３０から出射されたレーザビーム３１は、ビー
ムスプリッタ３２を透過して、対物レンズ３９の瞳位置
と共役な位置に設けられたガルバノメータミラー３３，
３４、瞳伝送レンズ３５，３６を通り、さらに、瞳投影
レンズ３７、結像レンズ３８、対物レンズ３９を通り、
試料４０上でレーザスポットとなる。このレーザスポッ
トはガルバノメータミラー３３，３４によりＸ−Ｙ２次
元に走査される。

【０００４】そこで、蛍光観察等に用いる反射光を検出
する場合は、対物レンズ３９、結像レンズ３８、瞳投影
レンズ３７、ガルバノメータミラー３３，３４を戻り、
ビームスプリッタ３２で反射され、集光レンズ４１を通
り、その後方の検出器４２により検出される。

【０００５】また、透過光を検出する場合はコンデンサ
レンズ４３を通り、検出器４４により検出される。

【０００６】なお、６０は焦点遮光板、６１はピンホー
ル、６２は偏光板、６３はバリアフィルター、６４はミ
ラー、６５は光源、６６はプリズム、６７は接眼レン
ズ、６９は光源、７０は透過照明用ビームスプリッタ
ー、７１はバリアフィルター、７２は偏光板である。

【０００７】また、複数の波長のレーザを同時発振さ
せ、複数の波長による像を検出する従来の技術としてＷ
Ｏ９２／０２８３９１（1992年2 月20日に国際公開され
た文献）に示されているものがあり、図８はこれを説明
するための図で、複数波長を同時に発振するレーザ発振
器４５からのレーザビームは試料４０に照射されて反射
光となり、反射光はダイクロイックミラー４８で長波長
側と短波長側に分け、２つのフォトマルチプライヤ４
６，４７で検出している。

【０００８】４９は励起フィルターユニットで、レーザ
発振器４５から出射した複数波長のうち、必要とする波
長を選択的に透過させる特性を有するバンドパスフィル
ター５０が入っている。ダイクロッイックミラー４８で
反射されたレーザ光は試料５１に照射され、試料５１か
らの蛍光は、ダイクロッイックミラー４８を透過してミ
ラー５２で反射される。ミラー５２で反射された蛍光
は、ダイクロッイックミラー５３で短波長と長波長に分
光され、ダイクロッイックミラー５３で反射した短波長
はフィルター５４を透過してフォトマルチプライヤ４７
に入射し、透過した長波長はフィルター５５を透過して
フォトマルチプライヤ４６に入射する。例えば、試料５
１から発生した蛍光の波長が５００ｎｍ〜５４０ｎｍ、
５８５ｎｍ〜６５０ｎｍとすると、５００ｎｍ〜５４０
ｎｍの蛍光はダイクロッイックミラー５３で反射し、フ
ィルター５４で余分な光が除かれ、フォトマルチプライ
ヤ４７に入射する。一方、５８５ｎｍ〜６５０ｎｍの蛍
光は、ダイクロッイックミラー５３を透過し、フィルタ
ー５５で余分な光が取り除かれ、フォトマルチプライヤ
４６に入射する。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】近年、蛍光観察と透過
観察を、同時に行い、細胞等の全体像に、蛍光像を重ね
て観察する要求が高まっている。特に、色素Ｉｎｄｏ−
１を使用したカルシウムイオンＣａ²⁺濃度測定（以下Ｉ
ｎｄｏ−１観察と称する）と、透過観察を同時に行う
等、複数波長を測光し、透過観察も同時にできる蛍光顕
微鏡装置が望まれている。

【００１０】ここで、色素Ｉｎｄｏ−１を使用したＣａ
²⁺濃度測定の概要について説明する。すなわち、３５１
nmの励起光で、４０５nmと４８０nmの中心波長の蛍光を
得て、それらを測光し、その比によりカルシウム濃度を
求めるものである。例えば、４０５nmの比率が高いとカ
ルシウム濃度が低く、４８０nmの比率が高いとカルシウ
ム濃度が高いことになる。

【００１１】しかし、図７の従来の技術では、複数波長
の測光、観察ができない。また一度に複数波長のレーザ
を発振できないので、透過観察を励起光に用いた短波長
域の紫外線で行うことになり、その場合透過検出系及び
透過光学系を短波長光対応としなければならず高価とな
る。

【００１２】また、図８の従来の技術では透過検出系が
ないので、透過観察ができない。

【００１３】本発明の目的は、前記不具合を解消し、２
波長が正確に測光されたＩｎｄｏ−１観察と可視光によ
る透過観察を同時に行うことができる走査型レーザ顕微
鏡装置を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、請求項１に対応する発明は、少なくとも３５１ｎｍ
と５１５ｎｍの波長のレーザビームを出射し試料に照射
するレーザ光源手段と、前記試料により反射されるレー
ザビームを分離し、各々を測光用光路上に配置された複
数のフォトマルチプライヤに導く測光分離手段と、前記
フォトマルチプライヤへの透過観察用可視光の入射を防
ぐ光学手段と、を備え、透過観察光学系及び透過検出系
を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡装置で
ある。

【００１５】前記目的を達成するため、請求項２に対応
する発明は、前記光学手段は、中心波長４８０ｎｍの蛍
光のみを通過するダイクロイックフィルターである請求
項１記載の走査型レーザ顕微鏡装置である。

【００１６】前記目的を達成するため、請求項３に対応
する発明は、前記光学手段は、中心波長４０５ｎｍの蛍
光と５１５ｎｍの可視光を反射により取り出すダイクロ
イックミラーと、こダイクロイックミラーにより取り出
した中心波長４０５ｎｍの蛍光のみを透過させるダイク
ロイックフィルターとからなる請求項１記載の走査型レ
ーザ顕微鏡装置である。

【００１７】

【作用】請求項１に対応する発明によれば、３５１ｎｍ
と５１５ｎｍの波長のレーザビームを試料に照射し、試
料からくる蛍光が測光分離手段により分離され、この分
離された蛍光がそれぞれフォトマルチプライヤにより検
出され、かつフォトマルチプライヤへの透過観察用可視
光の入射が光学手段により防がれるので、２波長が正確
に測光されたＩｎｄｏ−１観察と可視光による透過観察
を同時に行うことができる。

【００１８】請求項２に対応する発明によれば、中心波
長４８０ｎｍの蛍光と５１５ｎｍの可視光の分離が確実
にでき、正確な測光ができる。

【００１９】請求項３に対応する発明によれば、中心波
長４０５ｎｍの蛍光と５１５ｎｍの可視光の分離がより
確実にでき、より正確な測光ができる。

【００２０】

【実施例】以下、本発明の実施例について図面を参照し
て説明する。図１は、本発明の走査型レーザ顕微鏡装置
の第１実施例の光学系を示す図である。本実施例は、概
略少なくとも３５１ｎｍと５１５ｎｍの波長のレーザビ
ームを出射し試料１０に照射するレーザ光源手段、例え
ばマルチラインアルゴンレーザ光源０１、ビームエクス
パンダ０２、レーザラインフィルター０３、ダイクロイ
ックミラー０４、ガルバノメータスキャナ０５，０６、
瞳投影レンズ０７、プリズム０８、対物レンズ０９から
なるものと、試料１０により反射されるレーザビームを
分離し、各々を測光用光路上に配置された複数のフォト
マルチプライヤ２０，２６に導く測光分離手段、例えば
対物レンズ０９、プリズム０８、瞳投影レンズ０７、ガ
ルバノメータスキャナ０５，０６、ダイクロイックミラ
ー０４、集光レンズ１６、ダイクロイックミラー１７、
吸収フィルター１８、共焦点ピンホール１９、反射ミラ
ー２２、吸収フィルター２４、共焦点ピンホール２５か
らなるものと、フォトマルチプライヤ２６への透過観察
用可視光の入射を防ぐ光学手段、例えばダイクロイック
フィルター２３とで構成され、透過観察光学系及び透過
検出系を具備したものである。

【００２１】マルチラインアルゴンレーザ光源０１から
発振された波長の中で、Ｉｎｄｏ−１観察用の３５１ｎ
ｍと、透過観察用の５１５ｎｍの２つのレーザビーム
を、同時に、試料１０に照射させ、得られた蛍光の中心
波長４０５ｎｍと４８０ｎｍは測光用ダイクロイックミ
ラー０４により分離され、かつ各フォトマルチプライヤ
２０，２６へ導かれて検出する。

【００２２】また、試料１０を透過した５１５ｎｍのレ
ーザビームは、透過観察光学系により、透過検出部１４
へ導かれる。さらに、試料１０に反射し、測光用光路に
きた５１５ｎｍのレーザビームは、ダイクロイックフィ
ルター２３により５１５ｎｍの可視光の入射が防がれ、
フォトマルチプライヤ２６には入射されず、カットされ
る。

【００２３】以上のような構成で２波長が正確に測光さ
れたＩｎｄｏ−１観察と、可視光による透過観察を同時
に行うことができる、走査型レーザ顕微鏡装置となる。

【００２４】以下、本実施例について、図２〜図４を詳
細に説明する。図１のマルチラインアルゴンレーザ光源
０１から３５１ｎｍ、３６４ｎｍ、４８８ｎｍ、５１５
ｎｍの波長のレーザビームがそれぞれ同時に発振され
る。

【００２５】この各レーザビームは、ビームエクスパン
ダ０２により、所定径に拡大され、レーザラインフィル
ター０３により、３５１ｎｍと５１５ｎｍの波長のレー
ザビームが得られる。この場合、レーザラインフィルタ
ー０３の透過特性は、図２に示すようになっており、３
６４ｎｍと４８８ｎｍがカットされ、３５１ｎｍと５１
５ｎｍの波長のレーザビームが得られる。

【００２６】レーザラインフィルター０３により得られ
たレーザビームは、図３に示す透過、反射の特性をもつ
ダイクロイックミラー０４により図の下方に反射され、
ガルバノメータスキャナ０５，０６に入射され、ここで
Ｘ，Ｙ方向に偏向される。ガルバノメータスキャナ０
５，０６で偏向されたレーザビームは、瞳投影レンズ０
７、接眼観察光路へ導くプリズム０８、対物レンズ０９
を通り、試料１０に照射される。

【００２７】試料１０を透過した可視光の５１５ｎｍの
レーザビームは、コンデンサレンズ１１、反射ミラー１
２、コレクタレンズ１３を通り、透過検出部１４で検出
され、第３のフレームメモリ１５に蓄積される。

【００２８】また、試料１０に照射され、蛍光発光した
４０５ｎｍと４８０ｎｍの中心波長の蛍光及び、試料１
０を透過せずに一部反射してきた５１５ｎｍの可視光
は、対物レンズ０９、瞳投影レンズ０７を通り、ガルバ
ノメータスキャナ０６，０５を反射する。

【００２９】そして、前述した、図３の特性を持つダイ
クロイックミラー０４により、４０５ｎｍと４８０ｎｍ
の中心波長の蛍光は透過する。また、ダイクロイックミ
ラー０４は、可視光の５１５ｎｍを反射させる特性を有
しているが、反射率が１００％をものを製造すること
は、困難であり、現実には反射率が１００％でない。従
って、試料１０より反射してきた５１５ｎｍの可視光の
一部もダイクロイックミラー０４を透過する。

【００３０】そして、瞳伝送レンズ１６を通り、図４に
示す、反射透過特性を持つ、ダイクロイックミラー１７
により中心波長４０５ｎｍの光は反射され、吸収フィル
ター１８を通り、さらに共焦点ピンホール１９を通り、
第１のフォトマルチプライヤ２０により４０５ｎｍの蛍
光は測光され、かつ第１のフレームメモリ１の２１によ
り蓄積される。

【００３１】一方、ダイクロイックミラー１７を透過し
た４８０ｎｍの蛍光及び５１５ｎｍの可視光は、反射ミ
ラー２２で反射され、ダイクロイックフィルター２３に
入射され、ここで４８０ｎｍの蛍光が透過し、５１５ｎ
ｍの可視光がカットされる。そして、ダイクロイックフ
ィルター２３を透過した４８０ｎｍの蛍光は、吸収フィ
ルター２４、共焦点ピンホール２５を順次通り、フォト
マルチプライヤ２６により４８０ｎｍの蛍光は測光さ
れ、第２のフレームメモリ２７に蓄積される。

【００３２】前述したように、Ｉｎｄｏ−１観察は、３
５１ｎｍの励起光で、発光する蛍光４０５ｎｍと４８０
ｎｍの強度比により、カルシウムイオン濃度を測定する
方法である。

【００３３】このため、以上述べた実施例の走査型レー
ザ顕微鏡装置ではＩｎｄｏ−１観察に必要な、３５１ｎ
ｍのレーザビーム及び透過観察に用いる５１５ｎｍのレ
ーザビームを同時に得られ、蛍光の４０５ｎｍと４８０
ｎｍの光をフレームメモリ２１とフレームメモリ２７に
蓄積でき、また、５１５ｎｍの透過光は、フレームメモ
リ１５に蓄積でき、フレームメモリ１の２１とフレーム
メモリ２の２７の測光強度比分布を疑似化し、モニタ表
示したものに、フレームメモリ１５の透過像を重ねるこ
とにより、Ｉｎｄｏ−１観察と透過観察を同時に行え
る。その時、また、測光系では、試料１０より反射して
くる５１５ｎｍの反射光をダイクロイックフィルタ２３
によりカットされるので、フォトマルチプライヤ２６
に、測光の邪魔をする５１５ｎｍが入射しないので、正
確な測光が可能となる。

【００３４】また、透過観察系においては、透過検出部
１４の波長が可視光の５１５ｎｍであるので、透過光学
系に収差補正、透過率等において、紫外線域に対応した
光学系を用いる必要がなく、安価な透過光学系が得られ
る。

【００３５】次に、図５を参照して本発明の走査型レー
ザ顕微鏡装置の第２実施例について説明する。

【００３６】第２実施例は、前述の第１実施例の測光系
を以下のように変更したものであり、これ以外の構成
は、第１実施例と同一である。すなわち、マルチライン
アルゴンレーザ光源０１から、対物レンズ０９を通り、
透過検出を行う経路１１，１２，１３，１４，１５と、
蛍光が試料１０より発光し、瞳伝送レンズにはいるまで
は、図１と同じ構成なので説明は省略する。試料１０よ
り発せられた中心波長４０５ｎｍと４８０ｎｍの蛍光及
び、５１５ｎｍの可視光は、瞳伝送レンズ１６を通る。

【００３７】そして、図６に示す透過、反射特性を持つ
ダイクロイックミラー２８により、４０５ｎｍの蛍光と
５１５ｎｍの可視光は反射される。この反射された蛍光
と可視光は、４０５ｎｍを透過し５１５ｎｍをカットす
る特性を持つダイクロイックフィルター２９により４０
５ｎｍの蛍光のみ透過し、吸収フィルター１８を通り、
さらに、共焦点ピンホール２０を通り、フォトマルチプ
ライヤ２０により、４０５ｎｍの蛍光が測光され、フレ
ームメモリ２１により蓄積される。

【００３８】一方、前記ダイクロイックミラー２８を透
過した４８０ｎｍの蛍光は、反射ミラー２２で反射さ
れ、吸収フィルタ２４を通り、さらに共焦点ピンホール
２５を通り、フォトマルチプライヤ２６により、４８０
ｎｍの蛍光が、測光され、フレームメモリ２７により蓄
積される。

【００３９】以上の述べたように、第１実施例では、５
１５ｎｍの可視光を、４８０ｎｍの蛍光と、図１のダイ
クロイックフィルタ２３で分離しているのに対し、第２
実施例では、図５のダイクロイックミラー２８で、４０
５ｎｍの蛍光と、５１５ｎｍの可視光を反射により取り
出し、４０５ｎｍと、５１５ｎｍをダイクロイックフィ
ルター２９で分離しているので、可視光と測光用蛍光の
分離波長幅が第１実施例の４８０ｎｍの蛍光と５１５ｎ
ｍの可視光の分離波長幅より広いため、より確実な、分
離ができ、より正確な測光ができる。

【００４０】もちろん、第１実施例で述べた効果は同様
に得られることはいうまでもない。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、Ｉｎｄｏ−１観察と、
可視光による透過観察を同時に行え、測光側では試料か
ら反射してくる可視光の影響のない正確な測光が可能
で、透過観察側では、可視光にのみ対応させた安価な検
出系を持つ走査型レーザ顕微鏡装置を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の走査型レーザ顕微鏡装置の第１実施例
の概略構成を示す図。

【図２】図１のレーザラインフィルタの透過特性を示す
図。

【図３】図１のダイクロイックミラーの透過、反射特性
を示す図。

【図４】図１のダイクロイックミラーの透過、反射特性
を示す図。

【図５】本発明の走査型レーザ顕微鏡装置の第２実施例
の概略構成を示す図。

【図６】図５のダイクロイックミラーの透過、反射特性
を示す図。

【図７】従来の技術を説明するための図。

【図８】従来の技術を説明するための図。

【符号の説明】 ０１…マルチラインアルゴンレーザ光源、０２…ビーム
エクスパンダ、０３…レーザラインフィルタ、０４…ダ
イクロイックミラー、０５，０６…ガルバノメータスキ
ャナ、０７…瞳投影レンズ、０８…接瞳観察光路へ導く
プリズム、０９…対物レンズ、１０…試料、１１…コン
デンサレンズ、１２…反射ミラー、１３…コレタクレン
ズ、１４…透過検出部、１５…フレームメモリ３、１６
…集光レンズ、１７…ダイクロイックミラー、１８…吸
収フィルター、１９…共焦点ピンホール、２０…フォト
マルチプライヤ、２１…フレームメモリ１、２２…反射
ミラー、２６…ダイクロイックフィルター、２４…吸収
フィルター、２５…共焦点ピンホール、２６…フォトマ
ルチプライヤ、２７…フレームメモリ２、２８…ダイク
ロイックミラー、２９…ダイクロイックフィルター、３
０…レーザ発振器、３１…レーザビーム、３２…ビーム
スプリッタ、３３，３４…ガルバノメータミラー、３
５，３６…瞳伝送レンズ、３７…瞳投影レンズ、３８…
結像レンズ、３９…対物レンズ、４０…試料、４１…集
光レンズ、４２…検出器、４３…コンデンサレンズ、４
４…検出器、４５…レーザ発振器、４６，４７…フォト
マルチプライヤ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも３５１ｎｍと５１５ｎｍの波
   長のレーザビームを出射し試料に照射するレーザ光源手
   段と、 前記試料により反射されるレーザビームを分離し、各々
   を測光用光路上に配置された複数のフォトマルチプライ
   ヤに導く測光分離手段と、 前記フォトマルチプライヤへの透過観察用可視光の入射
   を防ぐ光学手段と、を備え、透過観察光学系及び透過検
   出系を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡装
   置。
2. 【請求項２】 前記光学手段は、中心波長４８０ｎｍの
   蛍光のみを通過するダイクロイックフィルターである請
   求項１記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
3. 【請求項３】 前記光学手段は、中心波長４０５ｎｍの
   蛍光と５１５ｎｍの可視光を反射により取り出すダイク
   ロイックミラーと、こダイクロイックミラーにより取り
   出した４０５ｎｍの蛍光のみを透過させるダイクロイッ
   クフィルターとからなる請求項１記載の走査型レーザ顕
   微鏡装置。