JPH0654683A - グリホセート耐性５−エノールピルビル−３−ホスホシキメートシンセターゼ及びその製造方法 - Google Patents
グリホセート耐性５−エノールピルビル−３−ホスホシキメートシンセターゼ及びその製造方法Info
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- JPH0654683A JPH0654683A JP5121384A JP12138493A JPH0654683A JP H0654683 A JPH0654683 A JP H0654683A JP 5121384 A JP5121384 A JP 5121384A JP 12138493 A JP12138493 A JP 12138493A JP H0654683 A JPH0654683 A JP H0654683A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 グリホセート耐性５−エノールピルビル−３
−ホスホシキメートシンセターゼ及びその製造方法を提
供する。 【構成】 グリホセート耐性５−エノールピルビル−３
−ホスホシキメートシンセターゼの製造方法において、
該酵素を生産することができるサルモネラ（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）を適当な栄養培地に増殖せしめ、そして該細菌
の細胞からグリホセート耐性５−エノールピルビル−３
−ホスホシキメートシンセターゼを分離することを含ん
で成る方法。
−ホスホシキメートシンセターゼ及びその製造方法を提
供する。 【構成】 グリホセート耐性５−エノールピルビル−３
−ホスホシキメートシンセターゼの製造方法において、
該酵素を生産することができるサルモネラ（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）を適当な栄養培地に増殖せしめ、そして該細菌
の細胞からグリホセート耐性５−エノールピルビル−３
−ホスホシキメートシンセターゼを分離することを含ん
で成る方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】雑種ＤＮＡ技法は、強化された又
は独特の性質を有する広範囲の種類の新規化合物を製造
するための新しい機会を提供する。細胞の生命は、細胞
にエネルギーを与えそして細胞の生存に必須の成分を生
産する酵素反応の逐行能力に依存する。多くの細胞が相
対的に接近して共存する場合、ある細胞群を他の細胞群
に対して選択できることがしばしば有利である。この選
択方法は、雑種ＤＮＡ技法において形質転換体及び形質
導入体を選択する場合に広く使用される。
は独特の性質を有する広範囲の種類の新規化合物を製造
するための新しい機会を提供する。細胞の生命は、細胞
にエネルギーを与えそして細胞の生存に必須の成分を生
産する酵素反応の逐行能力に依存する。多くの細胞が相
対的に接近して共存する場合、ある細胞群を他の細胞群
に対して選択できることがしばしば有利である。この選
択方法は、雑種ＤＮＡ技法において形質転換体及び形質
導入体を選択する場合に広く使用される。
【０００２】多くの場合に、抗生物質耐性が、１又は複
数の構造遺伝子と共に細胞に導入するマーカーとして使
用されてきた。一群の細胞が好ましくない場合に、細胞
を選択することが有利な状況がそのほかに多く存在す
る。このような範疇に含まれる場合として、腫瘍細胞を
選択的に破壊することが望まれる発癌に係る多くの状
況、雑草に対して作物を選択することが望まれる除草剤
の使用の場合、及び宿主に対する影響を最小にしながら
侵入する微生物を破壊することが望まれる病原体に対す
る療法の場合を挙げることができる。
数の構造遺伝子と共に細胞に導入するマーカーとして使
用されてきた。一群の細胞が好ましくない場合に、細胞
を選択することが有利な状況がそのほかに多く存在す
る。このような範疇に含まれる場合として、腫瘍細胞を
選択的に破壊することが望まれる発癌に係る多くの状
況、雑草に対して作物を選択することが望まれる除草剤
の使用の場合、及び宿主に対する影響を最小にしながら
侵入する微生物を破壊することが望まれる病原体に対す
る療法の場合を挙げることができる。
【０００３】殺生物剤に対する強化された耐性を発現す
ることができる形でＤＮＡを導入する機会があれば、殺
生物剤又は制生物剤による多くの害作用に対して宿主を
保護しながらより多量の殺生物剤を使用することが可能
となる。殺生物剤に対して非感受性の酵素又は殺生物剤
を破壊することができる酵素の生産によって保護が行わ
れる前記のごとき状況においては、変異を受けた遺伝子
が多くの有用な性質を有する新しい生成物を提供する。
酵素は、特に診断測定における標識として、生成物の製
造のために、基質及び阻害剤の測定において、精製、並
びにその他のために使用され得る。酵素の特異性を変化
せしめることが可能であることにより、そうでなければ
その酵素が行うことができない反応を触媒することが可
能となり、酵素の活性が強化され、あるいは酵素の選択
性が強化される。
ることができる形でＤＮＡを導入する機会があれば、殺
生物剤又は制生物剤による多くの害作用に対して宿主を
保護しながらより多量の殺生物剤を使用することが可能
となる。殺生物剤に対して非感受性の酵素又は殺生物剤
を破壊することができる酵素の生産によって保護が行わ
れる前記のごとき状況においては、変異を受けた遺伝子
が多くの有用な性質を有する新しい生成物を提供する。
酵素は、特に診断測定における標識として、生成物の製
造のために、基質及び阻害剤の測定において、精製、並
びにその他のために使用され得る。酵素の特異性を変化
せしめることが可能であることにより、そうでなければ
その酵素が行うことができない反応を触媒することが可
能となり、酵素の活性が強化され、あるいは酵素の選択
性が強化される。
【０００４】
【従来の技術】ホランダー（Hollander ）及びアマーハ
イム（Amrheim ），Plant Physiol（1980）66：823
〜829 ；アマーハイム等、前記（1980）66：830 〜834
；及びスタインルケン（Steinruecken）及びアマーハ
イム（Amrheim ），Biochem Biophys Res. Comm.
(1980) 94 ；1207〜1212は、グリホセート（ｇｌｙｐｈ
ｏｓａｔｅ）の標的部位の生化学的特徴を報告してい
る。この部位は、芳香族アミノ酸の前駆体を生成するた
めの、植物及び動物に存在するシキミ酸経路の一段階と
して同定された。
イム（Amrheim ），Plant Physiol（1980）66：823
〜829 ；アマーハイム等、前記（1980）66：830 〜834
；及びスタインルケン（Steinruecken）及びアマーハ
イム（Amrheim ），Biochem Biophys Res. Comm.
(1980) 94 ；1207〜1212は、グリホセート（ｇｌｙｐｈ
ｏｓａｔｅ）の標的部位の生化学的特徴を報告してい
る。この部位は、芳香族アミノ酸の前駆体を生成するた
めの、植物及び動物に存在するシキミ酸経路の一段階と
して同定された。
【０００５】
【発明の概要】シキミ酸経路における酵素を発現するた
めに使用することができる新規なＤＮＡを用いての、グ
リホセートに対する細胞性宿主の保護において使用する
ことができる酵素の製造方法が提供される。
めに使用することができる新規なＤＮＡを用いての、グ
リホセートに対する細胞性宿主の保護において使用する
ことができる酵素の製造方法が提供される。
【０００６】
【具体的な説明】この発明に従えば、シキミ酸代謝経路
におけるグリホセート耐性酵素、特に、ホスホエノール
ピルビン酸及び５−ホスホシキミ酸の５−エノールピル
ビル−３−ホスホシキミ酸への転換を触媒する酵素を発
現するＤＮＡ配列が提供される。この酵素は５−エノー
ル−ピルビル−３−ホスホシキメート シンセターゼ
（ＥＣ：２，５，１，１９）（以後ＥＳ−３−Ｐ シン
セターゼと称する）である。この構造遺伝子は、グリホ
セート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）〔Ｎ−ホスホノメチル
グリシン（Ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ｇｌ
ｙｃｉｎｅ）〕に強い耐性を有する酵素を発現する。
におけるグリホセート耐性酵素、特に、ホスホエノール
ピルビン酸及び５−ホスホシキミ酸の５−エノールピル
ビル−３−ホスホシキミ酸への転換を触媒する酵素を発
現するＤＮＡ配列が提供される。この酵素は５−エノー
ル−ピルビル−３−ホスホシキメート シンセターゼ
（ＥＣ：２，５，１，１９）（以後ＥＳ−３−Ｐ シン
セターゼと称する）である。この構造遺伝子は、グリホ
セート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）〔Ｎ−ホスホノメチル
グリシン（Ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ｇｌ
ｙｃｉｎｅ）〕に強い耐性を有する酵素を発現する。
【０００７】この酵素は有意量のグリホセートの存在下
で活性であり、そしてこの構造遺伝子が発現し得るグリ
ホセート感受性細胞にグリホセート耐性を付与する。グ
リホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼの発現のため
の構造遺伝子配列を含有するＤＮＡ構成が提供され、こ
のＤＮＡ構成は、その構成及び宿主の性質に応じて、種
々の方法で種々の宿主に導入することができ、そしてエ
ピゾーム要素として又は宿主染色体に一体化されて存在
することができよう。
で活性であり、そしてこの構造遺伝子が発現し得るグリ
ホセート感受性細胞にグリホセート耐性を付与する。グ
リホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼの発現のため
の構造遺伝子配列を含有するＤＮＡ構成が提供され、こ
のＤＮＡ構成は、その構成及び宿主の性質に応じて、種
々の方法で種々の宿主に導入することができ、そしてエ
ピゾーム要素として又は宿主染色体に一体化されて存在
することができよう。
【０００８】グリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセター
ゼを供する構造遺伝子は、グリホセート感受性宿主のａ
ｒｏＡ遺伝子における変異として得られる。宿主を、物
理的又は化学的な種々の方法で変異処理することがで
き、そして変異体がそのグリホセート耐性により選択さ
れる。さらに、変異体は、ａｒｏＡに同時形質導入（ｃ
ｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）することによりａｒｏＡ
栄養要求株を原栄養株に変えることによっても選択され
よう。
ゼを供する構造遺伝子は、グリホセート感受性宿主のａ
ｒｏＡ遺伝子における変異として得られる。宿主を、物
理的又は化学的な種々の方法で変異処理することがで
き、そして変異体がそのグリホセート耐性により選択さ
れる。さらに、変異体は、ａｒｏＡに同時形質導入（ｃ
ｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）することによりａｒｏＡ
栄養要求株を原栄養株に変えることによっても選択され
よう。
【０００９】変異処理されたグリホセート耐性宿主は、
再度変異処理され、そしてさらに高レベルのグリホセー
ト耐性において、さらに同時形質導入によりａｒｏＡ-
宿主をａｒｏＡ+ に変化せしめる可能性において選択さ
れる。次に、こうして得られたグリホセート耐性宿主は
ゲノムバンクを調製するのに使用され、この場合、損傷
を受けていない構造遺伝子は２５kb又はこれより小さい
断片上に得られるであろう。まず、ゲノムバンクを適当
な宿主に導入し、グリホセート耐性を選択し、エピゾー
ム要素からゲノム断片を切り取り、さらに遺伝子操作す
るために、ＥＳ−３−Ｐシンセターゼの無傷の構造遺伝
子を含有する約５．５kbより小さい断片を得る。
再度変異処理され、そしてさらに高レベルのグリホセー
ト耐性において、さらに同時形質導入によりａｒｏＡ-
宿主をａｒｏＡ+ に変化せしめる可能性において選択さ
れる。次に、こうして得られたグリホセート耐性宿主は
ゲノムバンクを調製するのに使用され、この場合、損傷
を受けていない構造遺伝子は２５kb又はこれより小さい
断片上に得られるであろう。まず、ゲノムバンクを適当
な宿主に導入し、グリホセート耐性を選択し、エピゾー
ム要素からゲノム断片を切り取り、さらに遺伝子操作す
るために、ＥＳ−３−Ｐシンセターゼの無傷の構造遺伝
子を含有する約５．５kbより小さい断片を得る。
【００１０】一たん断片を分離し、次にこの断片又は断
片の部分を、グリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセター
ゼを供する構造遺伝子を選択するためのプローブとして
使用することができる。問題の構造遺伝子は約５kbより
小さい断片、好ましくは約２kbより小さい断片上に存在
し、そしてａｒｏＡ構造遺伝子の少なくとも一部分、通
常は完全なａｒｏＡ構造遺伝子を含有するであろう。
片の部分を、グリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセター
ゼを供する構造遺伝子を選択するためのプローブとして
使用することができる。問題の構造遺伝子は約５kbより
小さい断片、好ましくは約２kbより小さい断片上に存在
し、そしてａｒｏＡ構造遺伝子の少なくとも一部分、通
常は完全なａｒｏＡ構造遺伝子を含有するであろう。
【００１１】断片は広範囲のａｒｏＡ変異を補完（ｃｏ
ｍｐｌｅｍｅｎｔ）し、原栄養株をａｒｏＡ栄養要求株
に変化せしめるであろう。ＤＮＡ配列は原核生物及び真
核生物のいずれからも得られよう。代表的な原核生物及
び真核生物には細菌、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ）及びエッセリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）、糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ）、並びに酵母、植物、藻類、例えば緑藻類及
び緑−青藻類等、特にグリホセート感受性細胞が含まれ
る。
ｍｐｌｅｍｅｎｔ）し、原栄養株をａｒｏＡ栄養要求株
に変化せしめるであろう。ＤＮＡ配列は原核生物及び真
核生物のいずれからも得られよう。代表的な原核生物及
び真核生物には細菌、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ）及びエッセリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）、糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ）、並びに酵母、植物、藻類、例えば緑藻類及
び緑−青藻類等、特にグリホセート感受性細胞が含まれ
る。
【００１２】グリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセター
ゼを発現する構造遺伝子を含有するＤＮＡ配列は、適当
な宿主細胞に導入するために種々の他のＤＮＡ配列に連
結される。相手方の配列は、宿主の種類、ＤＮＡ配列を
宿主に導入する方法、及びエピゾームとして維持するの
が好ましいか一体化するのが好ましいかにより異る。原
核性宿主のためには、ＤＮＡ配列を原核性宿主に導入す
るために使用される広範囲の種類のベクターが存在す
る。ＤＮＡ配列には広範囲の種類のプラスミド、例えば
ｐＢＲ３２２，ｐＡＣＹＣｌ８４，ｐＭＢ９，ｐＲＫ２
９０等、コスミド、例えばｐＶＫ１００が含まれ、又は
形質導入のため、ウイルス、例えばＰ２２等が使用され
る。
ゼを発現する構造遺伝子を含有するＤＮＡ配列は、適当
な宿主細胞に導入するために種々の他のＤＮＡ配列に連
結される。相手方の配列は、宿主の種類、ＤＮＡ配列を
宿主に導入する方法、及びエピゾームとして維持するの
が好ましいか一体化するのが好ましいかにより異る。原
核性宿主のためには、ＤＮＡ配列を原核性宿主に導入す
るために使用される広範囲の種類のベクターが存在す
る。ＤＮＡ配列には広範囲の種類のプラスミド、例えば
ｐＢＲ３２２，ｐＡＣＹＣｌ８４，ｐＭＢ９，ｐＲＫ２
９０等、コスミド、例えばｐＶＫ１００が含まれ、又は
形質導入のため、ウイルス、例えばＰ２２等が使用され
る。
【００１３】真核生物宿主のためには、ＤＮＡを宿主に
導入するために広範囲の種類の方法、例えばＣａ++沈澱
した裸ＤＮＡ、プラスミドもしくはミニ染色体（これら
のＤＮＡは複製することができ、そして構造遺伝子は宿
主中で発現される）を用いる形質転換、又は構造遺伝子
及びフランク領域としての宿主への直接挿入、例えばマ
イクロピペット挿入による導入（この場合ＤＮＡは宿主
ゲノムに一体化されるであろう）が用いられる。
導入するために広範囲の種類の方法、例えばＣａ++沈澱
した裸ＤＮＡ、プラスミドもしくはミニ染色体（これら
のＤＮＡは複製することができ、そして構造遺伝子は宿
主中で発現される）を用いる形質転換、又は構造遺伝子
及びフランク領域としての宿主への直接挿入、例えばマ
イクロピペット挿入による導入（この場合ＤＮＡは宿主
ゲノムに一体化されるであろう）が用いられる。
【００１４】これらの方法に代えて、エピゾーム要素、
例えば腫瘍誘発プラスミド、例えばＴi ，Ｒi もしくは
これらの断片、又はウイルス、例えばＣａＭＶ，ＴＭＶ
もしくはこれらの断片（これらは宿主に対して致命的で
なく、そして構造遺伝子は、構造遺伝子の発現が可能な
状態でエピゾーム要素中に存在する）を使用することが
できる。特に有利なのは、複製機能を有し、そして他の
機能例えば発癌性、ウイルス活性等を喪失した断片であ
る。
例えば腫瘍誘発プラスミド、例えばＴi ，Ｒi もしくは
これらの断片、又はウイルス、例えばＣａＭＶ，ＴＭＶ
もしくはこれらの断片（これらは宿主に対して致命的で
なく、そして構造遺伝子は、構造遺伝子の発現が可能な
状態でエピゾーム要素中に存在する）を使用することが
できる。特に有利なのは、複製機能を有し、そして他の
機能例えば発癌性、ウイルス活性等を喪失した断片であ
る。
【００１５】この発明の第一段階は、ＥＳ−３−Ｐシン
セターゼの機能を充足することができるグリホセート耐
性蛋白質を発現し得るＤＮＡ配列を開発することであ
る。グリホセート感受性であり、試験管内で増殖するこ
とが可能であり、そしてＥＳ−３−Ｐシンセターゼ構造
遺伝子を発現して所望の酵素を供する能力を有する適当
な宿主が使用される。最終的にグリホセート耐性を与え
られる宿主が変異処理される宿主と同じである必要はな
い。
セターゼの機能を充足することができるグリホセート耐
性蛋白質を発現し得るＤＮＡ配列を開発することであ
る。グリホセート感受性であり、試験管内で増殖するこ
とが可能であり、そしてＥＳ−３−Ｐシンセターゼ構造
遺伝子を発現して所望の酵素を供する能力を有する適当
な宿主が使用される。最終的にグリホセート耐性を与え
られる宿主が変異処理される宿主と同じである必要はな
い。
【００１６】すでに述べたように、グリホセート耐性は
安定なエピゾーム要素を有する結果として、又は組替え
によるグリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼコー
ド構造遺伝子の一体化により与えられる。原核生物及び
真核生物のいずれもが変異のために使用することがで
き、宿主はそのグリホセート耐性、選択の容易さ、増殖
効率、及び最終宿主において使用するための変異を受け
た構造遺伝子の有用性を基礎にして選ばれる。
安定なエピゾーム要素を有する結果として、又は組替え
によるグリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼコー
ド構造遺伝子の一体化により与えられる。原核生物及び
真核生物のいずれもが変異のために使用することがで
き、宿主はそのグリホセート耐性、選択の容易さ、増殖
効率、及び最終宿主において使用するための変異を受け
た構造遺伝子の有用性を基礎にして選ばれる。
【００１７】変異処理は、物理的方法及び化学的方法を
含む多くの常用技法に従って便利に行うことができる。
化学変異剤にはメタンスルホン酸エチル、ジアゾ試薬、
例えばＮ−ニトロソ、Ｎ−メチルグリシン、プソラレン
等が含まれる。物理的変異源には紫外線、Ｘ線等が含ま
れる。植物細胞はグリホセート感受性であるため、グリ
ホセート耐性の選択により選択を行うことができる。グ
リホセート耐性は細胞内での多くの異るタイプの変化の
結果であり、そして、変異によりグリホセート耐性酵素
を得ることを確実にするためには変異をａｒｏＡ遺伝子
中に生じさせなければならない。このことはａｒｏＡ栄
養要求株への同時形質導入を用い、そしてグリホセート
耐性及びａｒｏＡ+ を選択することにより達成すること
ができる。同時形質導入は、宿主のゲノムを他の宿主
（この中でウイルスはテンペレートである）へ移送する
ことができる種々のウイルス（ファージを含む）を用い
て達成することができる。
含む多くの常用技法に従って便利に行うことができる。
化学変異剤にはメタンスルホン酸エチル、ジアゾ試薬、
例えばＮ−ニトロソ、Ｎ−メチルグリシン、プソラレン
等が含まれる。物理的変異源には紫外線、Ｘ線等が含ま
れる。植物細胞はグリホセート感受性であるため、グリ
ホセート耐性の選択により選択を行うことができる。グ
リホセート耐性は細胞内での多くの異るタイプの変化の
結果であり、そして、変異によりグリホセート耐性酵素
を得ることを確実にするためには変異をａｒｏＡ遺伝子
中に生じさせなければならない。このことはａｒｏＡ栄
養要求株への同時形質導入を用い、そしてグリホセート
耐性及びａｒｏＡ+ を選択することにより達成すること
ができる。同時形質導入は、宿主のゲノムを他の宿主
（この中でウイルスはテンペレートである）へ移送する
ことができる種々のウイルス（ファージを含む）を用い
て達成することができる。
【００１８】このようにして、第２の宿主に形質導入
し、適当な溶解物を用い、そしてグリホセート耐性とａ
ｒｏＡ原栄養性を有する形質導入された宿主を選択す
る。こうして得られた変性された細胞を再度変異処理
し、あるいは移転を反復し、そしてだんだん強化される
グリホセート耐性について選択しながらさらに多くの変
異を反復する。好ましくは、宿主は、栄養培地中約０．
５mg／ml以上のグリホセート、好ましくは約１mg／ml以
上のグリホセート、さらに好ましくは１．５mg／ml以上
のグリホセートの存在下、栄養培地中芳香族アミノ酸の
存在を伴わないで増殖することが可能であるべきであ
る。
し、適当な溶解物を用い、そしてグリホセート耐性とａ
ｒｏＡ原栄養性を有する形質導入された宿主を選択す
る。こうして得られた変性された細胞を再度変異処理
し、あるいは移転を反復し、そしてだんだん強化される
グリホセート耐性について選択しながらさらに多くの変
異を反復する。好ましくは、宿主は、栄養培地中約０．
５mg／ml以上のグリホセート、好ましくは約１mg／ml以
上のグリホセート、さらに好ましくは１．５mg／ml以上
のグリホセートの存在下、栄養培地中芳香族アミノ酸の
存在を伴わないで増殖することが可能であるべきであ
る。
【００１９】所望のレベルのグリホセート耐性が達成さ
れた時、変異したａｒｏＡ座を分離し、そしてクローニ
ングする。制限酵素の選択に依存して部分分解又は完全
分解を用いる。この方法に代えて、ａｒｏＡ補完を用い
てサブクローニングすることによってゲノムライブラリ
ーからの遺伝子をまず分離することができる。次にこの
遺伝子を上記の方法によって変異処理し、又は試験管内
変異処理し、１個又は複数個のコードンを変化せしめ
る。次に、変異した遺伝子を切り出し、そして遺伝子断
片を分離する。
れた時、変異したａｒｏＡ座を分離し、そしてクローニ
ングする。制限酵素の選択に依存して部分分解又は完全
分解を用いる。この方法に代えて、ａｒｏＡ補完を用い
てサブクローニングすることによってゲノムライブラリ
ーからの遺伝子をまず分離することができる。次にこの
遺伝子を上記の方法によって変異処理し、又は試験管内
変異処理し、１個又は複数個のコードンを変化せしめ
る。次に、変異した遺伝子を切り出し、そして遺伝子断
片を分離する。
【００２０】次に、得られた断片を、適当なクローニン
グベクターを用いてクローニングする。クローニングは
適当な単細胞微生物、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
のごとき細菌中で行うことができる。完全分解又は部分
分解によりおよそ所望の大きさの断片を供するコスミド
を用いるのが好ましい。例えば、コスミドｐＶＫ１００
をＢｇｌIIにより部分分解し、そしてグリホセート耐性
細胞のゲノムのＳａｕ３Ａ分解により得られる断片に連
結する。パッケージングによって所望の大きさの断片の
みがパッケージされ、そして宿主生物に形質導入される
ことが保証されるであろう。
グベクターを用いてクローニングする。クローニングは
適当な単細胞微生物、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
のごとき細菌中で行うことができる。完全分解又は部分
分解によりおよそ所望の大きさの断片を供するコスミド
を用いるのが好ましい。例えば、コスミドｐＶＫ１００
をＢｇｌIIにより部分分解し、そしてグリホセート耐性
細胞のゲノムのＳａｕ３Ａ分解により得られる断片に連
結する。パッケージングによって所望の大きさの断片の
みがパッケージされ、そして宿主生物に形質導入される
ことが保証されるであろう。
【００２１】宿主生物は、グリホセート耐性及び／又は
ａｒｏＡ+ について選択する。受容株は、形質導入体の
選択を可能にする適当な遺伝形質を有するように変形す
ることができる。微生物においては、所望により移動性
プラスミドを用いながら、形質導入体を他の微生物と接
合せしめるために用いることができる。次に、種々の技
法を用いてグリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼ
の構造遺伝子を含有する断片の大きさを減少せしめるこ
とができる。例えば、コスミドベクターを分離し、種々
の制限エンド又クレアーゼ、例えばＢｇｌII，Ｈｉｎｄ
III 等により開裂し、そして得られた断片を適当なベク
ター、便利には前に使用したコスミドベクターにクロー
ニングする。約５．５kb未満、通常約５kb未満、便利に
は２kb未満の断片をクローニングし、そしてａｒｏＡ補
完及びグリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼを得
ることができる。
ａｒｏＡ+ について選択する。受容株は、形質導入体の
選択を可能にする適当な遺伝形質を有するように変形す
ることができる。微生物においては、所望により移動性
プラスミドを用いながら、形質導入体を他の微生物と接
合せしめるために用いることができる。次に、種々の技
法を用いてグリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼ
の構造遺伝子を含有する断片の大きさを減少せしめるこ
とができる。例えば、コスミドベクターを分離し、種々
の制限エンド又クレアーゼ、例えばＢｇｌII，Ｈｉｎｄ
III 等により開裂し、そして得られた断片を適当なベク
ター、便利には前に使用したコスミドベクターにクロー
ニングする。約５．５kb未満、通常約５kb未満、便利に
は２kb未満の断片をクローニングし、そしてａｒｏＡ補
完及びグリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼを得
ることができる。
【００２２】酵素は、便利な採取源の任意のもの、すな
わち原核生物又は真核生物のいずれかから得ることがで
きる。分泌が行われない場合、公知の方法に従って細胞
を溶解し、そしてＥＳ−３−Ｐシンセターゼを分離する
ことによって酵素を分離することができる。有用な方法
にはクロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティーク
ロマトグラフィー等が含まれる。便利にはＮ−ホスホノ
メチルグリシンを、適当な官能基例えばエルボキシル基
を介して不溶性支持体に接合せしめ、そしてＥＳ−３−
Ｐシンセターゼを分離するための充填剤として使用す
る。精製された酵素は広範囲の用途に使用することがで
きる。
わち原核生物又は真核生物のいずれかから得ることがで
きる。分泌が行われない場合、公知の方法に従って細胞
を溶解し、そしてＥＳ−３−Ｐシンセターゼを分離する
ことによって酵素を分離することができる。有用な方法
にはクロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティーク
ロマトグラフィー等が含まれる。便利にはＮ−ホスホノ
メチルグリシンを、適当な官能基例えばエルボキシル基
を介して不溶性支持体に接合せしめ、そしてＥＳ−３−
Ｐシンセターゼを分離するための充填剤として使用す
る。精製された酵素は広範囲の用途に使用することがで
きる。
【００２３】この酵素は、ホスホエノールピルベート、
３−ホスホシキミ酸、及びグリホセートの測定において
直接使用することができる。このほかに、米国特許第
３，８１７，８３７号、第３，６５４，０９０号及び第
３，８５０，７５２号に記載されている様に、この酵素
は、問題の分析対象、例えばハプテン又は抗原に接合せ
しめることにより診断測定における標識として使用する
ことができる。接合方法及び分析対象の濃度の測定方法
は前記の特許に詳細に記載されており、そしてこれらの
開示の適切な部分を引用によりこの明細書に組み入れ
る。
３−ホスホシキミ酸、及びグリホセートの測定において
直接使用することができる。このほかに、米国特許第
３，８１７，８３７号、第３，６５４，０９０号及び第
３，８５０，７５２号に記載されている様に、この酵素
は、問題の分析対象、例えばハプテン又は抗原に接合せ
しめることにより診断測定における標識として使用する
ことができる。接合方法及び分析対象の濃度の測定方法
は前記の特許に詳細に記載されており、そしてこれらの
開示の適切な部分を引用によりこの明細書に組み入れ
る。
【００２４】グリホセート耐性ＥＳ−３−Ｐシンセター
ゼをコードするＤＮＡ配列は種々の用途に使用される。
ＤＮＡ配列は、野性型ＥＳ−３−Ｐシンセターゼ又は変
異されたＥＳ−３−Ｐシンセターゼを分離するためのプ
ローブとして使用される。これに代えて、ＤＮＡ配列
は、組換えにより宿主中に一体化し、グリホセート耐性
を有する宿主により製造を行うために使用することがで
きる。
ゼをコードするＤＮＡ配列は種々の用途に使用される。
ＤＮＡ配列は、野性型ＥＳ−３−Ｐシンセターゼ又は変
異されたＥＳ−３−Ｐシンセターゼを分離するためのプ
ローブとして使用される。これに代えて、ＤＮＡ配列
は、組換えにより宿主中に一体化し、グリホセート耐性
を有する宿主により製造を行うために使用することがで
きる。
【００２５】植物細胞を用いる場合、マイクロピペット
注入により構造遺伝子を植物細胞核に導入し、組換によ
り宿主ゲノムに一体化することができる。この方法に代
えて、構造遺伝子をテンペレートウイルスに導入し、こ
のテンペレートウイルスを用いて構造遺伝子を植物宿主
に導入することができる。構造遺伝子を、植物宿主によ
って認識されない制御信号を用する分離源から得た場
合、発現のために適当な制御信号を導入する必要があ
る。
注入により構造遺伝子を植物細胞核に導入し、組換によ
り宿主ゲノムに一体化することができる。この方法に代
えて、構造遺伝子をテンペレートウイルスに導入し、こ
のテンペレートウイルスを用いて構造遺伝子を植物宿主
に導入することができる。構造遺伝子を、植物宿主によ
って認識されない制御信号を用する分離源から得た場
合、発現のために適当な制御信号を導入する必要があ
る。
【００２６】ウイルス又はプラスミド、例えば癌誘発プ
ラスミドを用い、そしてそれがすでにマップされている
場合には、プロモーターから下流にあり、そしてプロモ
ータから適切な距離にある制限部位を構造遺伝子の挿入
のために使用することができる。ＤＮＡ配列がまだ決定
されていない場合、種々の時間にわたってエクソヌクレ
アーゼ、例えばＢａｌ３１を用いて切断し、又は制限処
理することができる。ウイルス及びプラスミドを植物に
導入する方法は、文献に詳細に記載されている。〔マッ
ケ（Matzke）及びチルトン（Chilton), J.of Molecular
and Applied Genetics(1981)1:39 〜49。〕グリホセー
ト耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼをもって植物を変性す
ることにより、グリホセートを、作物が比較的影響を受
けないようにしながら雑草を実質上完全に又は完全に除
去し得る濃度において、除草剤として使用することがで
きる。このようにして、肥料がより効果的に利用され、
そして雑草の存在により生ずる不都合な効果が回避され
る点において、実質的な経済性が達成される。
ラスミドを用い、そしてそれがすでにマップされている
場合には、プロモーターから下流にあり、そしてプロモ
ータから適切な距離にある制限部位を構造遺伝子の挿入
のために使用することができる。ＤＮＡ配列がまだ決定
されていない場合、種々の時間にわたってエクソヌクレ
アーゼ、例えばＢａｌ３１を用いて切断し、又は制限処
理することができる。ウイルス及びプラスミドを植物に
導入する方法は、文献に詳細に記載されている。〔マッ
ケ（Matzke）及びチルトン（Chilton), J.of Molecular
and Applied Genetics(1981)1:39 〜49。〕グリホセー
ト耐性ＥＳ−３−Ｐシンセターゼをもって植物を変性す
ることにより、グリホセートを、作物が比較的影響を受
けないようにしながら雑草を実質上完全に又は完全に除
去し得る濃度において、除草剤として使用することがで
きる。このようにして、肥料がより効果的に利用され、
そして雑草の存在により生ずる不都合な効果が回避され
る点において、実質的な経済性が達成される。
【００２７】グリホセート耐性変異ＥＳ−３−Ｐシンセ
ターゼは、宿主からの野性型酵素よりも少なくとも１０
倍大きいＫd を有する。３−ホスホシキミ酸についての
Ｋmの約１〜１０倍の濃度における２８℃での比活性
は、変異したシンセターゼの場合、原核からの酵素に比
べて約２倍以上である。３−ホスホシキメートの濃度が
１０×Ｋm であり、そしてグリホセートの濃度が５×１
０-5Ｍである場合、変異したシンセターゼの阻害は、原
株からのシンセターゼの阻害の半分未満好ましくは４分
の１未満である。
ターゼは、宿主からの野性型酵素よりも少なくとも１０
倍大きいＫd を有する。３−ホスホシキミ酸についての
Ｋmの約１〜１０倍の濃度における２８℃での比活性
は、変異したシンセターゼの場合、原核からの酵素に比
べて約２倍以上である。３−ホスホシキメートの濃度が
１０×Ｋm であり、そしてグリホセートの濃度が５×１
０-5Ｍである場合、変異したシンセターゼの阻害は、原
株からのシンセターゼの阻害の半分未満好ましくは４分
の１未満である。
【００２８】次に例によりこの発明をさらに詳細に説明
する。但しこれによりこの発明の範囲を限定するもので
はない。
する。但しこれによりこの発明の範囲を限定するもので
はない。
【００２９】
【実験】材料及び方法 培地及び細菌々株 使用した細菌々株を表１及び表２に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】（ａ）ニシオカ等、Genetics(1967)56:341
-351。 （ｂ）Gollub等、J.Biol.Chem.(1967)242:5323-5328 。 （ｃ）Bachmann, E. coli Genetic Stock Center,Dep
t. of Human Genetics 、エール大学、ニューヘーブ
ン、コネクチカット。 （ｄ）Enquist,L.& N.Sternberg,Meth.Enzymol.,1979,2
81-298(Academ.Pr.,NY)。 （ｅ）この研究において調製。
-351。 （ｂ）Gollub等、J.Biol.Chem.(1967)242:5323-5328 。 （ｃ）Bachmann, E. coli Genetic Stock Center,Dep
t. of Human Genetics 、エール大学、ニューヘーブ
ン、コネクチカット。 （ｄ）Enquist,L.& N.Sternberg,Meth.Enzymol.,1979,2
81-298(Academ.Pr.,NY)。 （ｅ）この研究において調製。
【００３３】グリホセート耐性の選択及び試験 オートクレーブ殺菌した後のＭ９培地にグリホセートを
加えた。選択実験のために市販のグリホセート溶液を使
用した。種々の量のグリホセートを補給したＭ９液体培
地中又は固体培地上に細菌懸濁液をプレートすることに
より耐性変異株を分離した。変異株によって達成された
耐性レベルを３種類の試験によって記録した。この試験
は、非選択培地〜選択培地上の小コロニーをつまようじ
で採取するスポット試験、選択培地上に細胞をストリー
クして単コロニーを得るストリーク試験、及びグリホセ
ートを補給した液体培地での増殖速度を測定するための
増殖曲線である。
加えた。選択実験のために市販のグリホセート溶液を使
用した。種々の量のグリホセートを補給したＭ９液体培
地中又は固体培地上に細菌懸濁液をプレートすることに
より耐性変異株を分離した。変異株によって達成された
耐性レベルを３種類の試験によって記録した。この試験
は、非選択培地〜選択培地上の小コロニーをつまようじ
で採取するスポット試験、選択培地上に細胞をストリー
クして単コロニーを得るストリーク試験、及びグリホセ
ートを補給した液体培地での増殖速度を測定するための
増殖曲線である。
【００３４】ＤＮＡ形質転換及びパッケージされたコス
ミドＤＮＡの形質導入 ＤＮＡ形質転換はマンデル（Mandel）及びヒガ（Higa),
J.Mol.Biol.(1970)53:159 〜162 に従って行った。受容
能を有する細胞は−７０℃にて１５％グリセリン中に貯
蔵した。パッケージされたコスミドＤＮＡの形質導入の
ための細胞は、０．４％のマルトースを補給した１mlの
ＬＢ液体培地中で対数増殖期後期まで増殖せしめた。細
胞をペレットにし、そして０．１mlの１０mM ＭｇＳＯ
4 に再懸濁し、これに２０〜１００μｌのパッケージさ
れたコスミドの懸濁液を加えた。３７℃にて２０分間に
わたって細胞にファージ粒子を吸着せしめた。形質導入
体を、３７℃にて通気しながら２mlのＬＢ液体培地中で
１時間発現せしめ、そして次に選択培地上にプレートし
た。いずれのタイプのパッケージ抽出物を用いても常に
２×１０5 ／μｇの挿入ＤＮＡのコスミドが得られた。
バイオテク標品は１０8 ファージ／μｇの連結されたも
とのラムダＤＮＡにおいて評価されたが、この発明の抽
出物は１０7 において評価された。
ミドＤＮＡの形質導入 ＤＮＡ形質転換はマンデル（Mandel）及びヒガ（Higa),
J.Mol.Biol.(1970)53:159 〜162 に従って行った。受容
能を有する細胞は−７０℃にて１５％グリセリン中に貯
蔵した。パッケージされたコスミドＤＮＡの形質導入の
ための細胞は、０．４％のマルトースを補給した１mlの
ＬＢ液体培地中で対数増殖期後期まで増殖せしめた。細
胞をペレットにし、そして０．１mlの１０mM ＭｇＳＯ
4 に再懸濁し、これに２０〜１００μｌのパッケージさ
れたコスミドの懸濁液を加えた。３７℃にて２０分間に
わたって細胞にファージ粒子を吸着せしめた。形質導入
体を、３７℃にて通気しながら２mlのＬＢ液体培地中で
１時間発現せしめ、そして次に選択培地上にプレートし
た。いずれのタイプのパッケージ抽出物を用いても常に
２×１０5 ／μｇの挿入ＤＮＡのコスミドが得られた。
バイオテク標品は１０8 ファージ／μｇの連結されたも
とのラムダＤＮＡにおいて評価されたが、この発明の抽
出物は１０7 において評価された。
【００３５】酵素の調製及びＥＳ−３−Ｐシンセターゼ
の測定 Ｓ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
ＣＴ７株及びＳＴＫ１株を、Ｍ９液体培地中で、３７℃
にて２４時間通気を行いながら増殖せしめた。４αにて
遠心分離することにより細胞を集め、Ｍ９塩を用いて２
回洗浄し、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．２）
再懸濁し、そしてフレンチプレスを用いて２０，０００
psi において破砕した。
の測定 Ｓ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
ＣＴ７株及びＳＴＫ１株を、Ｍ９液体培地中で、３７℃
にて２４時間通気を行いながら増殖せしめた。４αにて
遠心分離することにより細胞を集め、Ｍ９塩を用いて２
回洗浄し、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．２）
再懸濁し、そしてフレンチプレスを用いて２０，０００
psi において破砕した。
【００３６】ホモジネートを１６，０００×ｇにて４０
分間遠心分離し、そして上澄液を２％硫酸プロタミン
（３５ｇの蛋白質当り２％硫酸プロタミン１．０ml）に
より処理した。１８，０００×ｇにて３５分間遠心分離
することにより沈澱を取り出し、再懸濁し、そして酵素
測定のために使用した。酵素の活性を、無機燐酸の遊離
速度を測定することにより測定した〔ハイノネン（Hein
onen）及びラティ（Lahti),Anal.Biochem.(1981)113:31
3 〜317 〕。
分間遠心分離し、そして上澄液を２％硫酸プロタミン
（３５ｇの蛋白質当り２％硫酸プロタミン１．０ml）に
より処理した。１８，０００×ｇにて３５分間遠心分離
することにより沈澱を取り出し、再懸濁し、そして酵素
測定のために使用した。酵素の活性を、無機燐酸の遊離
速度を測定することにより測定した〔ハイノネン（Hein
onen）及びラティ（Lahti),Anal.Biochem.(1981)113:31
3 〜317 〕。
【００３７】典型的な測定混合物には１５０μモルのマ
レイン酸緩衝剤（pH５．６）、２．８８μモルのホスホ
エノールピルベート、４．０８μモルの３−ホスホシキ
メート、及び酵素分画を含有せしめ全量を１．５mlとし
た。測定混合物を３７℃にて５分間プレーインキュベー
ションした後に酵素を加えることにより反応を開始し
た。一定の時間間隔でアリコートを採取し、そしてすぐ
に燐酸分析用試薬と混合した。試薬（１．２５ＮＨ2 Ｓ
Ｏ4 ）の低pHにより酵素活性を停止せしめた。
レイン酸緩衝剤（pH５．６）、２．８８μモルのホスホ
エノールピルベート、４．０８μモルの３−ホスホシキ
メート、及び酵素分画を含有せしめ全量を１．５mlとし
た。測定混合物を３７℃にて５分間プレーインキュベー
ションした後に酵素を加えることにより反応を開始し
た。一定の時間間隔でアリコートを採取し、そしてすぐ
に燐酸分析用試薬と混合した。試薬（１．２５ＮＨ2 Ｓ
Ｏ4 ）の低pHにより酵素活性を停止せしめた。
【００３８】結果 ａｒｏ Ａ座に位置するグリホセート耐性変異株の分離 Ｓ． ティフィムリウムＴＡ８３１株は、２００μｇ／
mlより多くのグリホセートを含有する固体Ｍ９培地上で
コロニーを形成しなかった。最初の選択のために、グリ
ホセート耐性株をスクリーニングするために３５０μｇ
／mlの濃度を選んだ。自然変異はプレートした細胞当り
５×１０-8の頻度で生じた。試験した１０個の独立した
変異株のいずれにおいても、グリホセート耐性とａｒｏ
Ａとの同時形質導入は生じなかった。
mlより多くのグリホセートを含有する固体Ｍ９培地上で
コロニーを形成しなかった。最初の選択のために、グリ
ホセート耐性株をスクリーニングするために３５０μｇ
／mlの濃度を選んだ。自然変異はプレートした細胞当り
５×１０-8の頻度で生じた。試験した１０個の独立した
変異株のいずれにおいても、グリホセート耐性とａｒｏ
Ａとの同時形質導入は生じなかった。
【００３９】ａｒｏＡ変異株を見出す機会を改良するた
めに、化学的変異処理、及び濃縮段階を用いた。この濃
縮段階においては、同時形質導入により、３５．０μｇ
／mlのグリホセート上でａｒｏＡに位置するグリホセー
ト耐性変異株を選択した。Ｓ．ティフィムリウムＴＡ８
３１株をメタンスルホン酸エチルにより変異処理した
後、グリホセート耐性株の頻度はプレートした細胞当り
１×１０-4であった。別個の変異処理実験により得られ
た１０，０００個ずつの変異株から成る２群をＰ２２の
混合溶解物を調製するのに使用した。
めに、化学的変異処理、及び濃縮段階を用いた。この濃
縮段階においては、同時形質導入により、３５．０μｇ
／mlのグリホセート上でａｒｏＡに位置するグリホセー
ト耐性変異株を選択した。Ｓ．ティフィムリウムＴＡ８
３１株をメタンスルホン酸エチルにより変異処理した
後、グリホセート耐性株の頻度はプレートした細胞当り
１×１０-4であった。別個の変異処理実験により得られ
た１０，０００個ずつの変異株から成る２群をＰ２２の
混合溶解物を調製するのに使用した。
【００４０】次にこれをＳ．ティフィムリウムＡ１株に
形質導入するのに使用した。細胞をＭ９培地及びＭ９＋
グリホセート培地上にプレートした。グリホセート平板
培地上に生じたコロニーの数はＭ９のみの培地上に生じ
たコロニーの数の１００分の１であった。変異処理しな
いＴＡ８３１からのファージ溶解物を用いた場合、コロ
ニーは生じなかった（＜１０-3）。グリホセート耐性変
異株を試験し、そしてすべてをａｒｏＡと共に同時形質
導入した。
形質導入するのに使用した。細胞をＭ９培地及びＭ９＋
グリホセート培地上にプレートした。グリホセート平板
培地上に生じたコロニーの数はＭ９のみの培地上に生じ
たコロニーの数の１００分の１であった。変異処理しな
いＴＡ８３１からのファージ溶解物を用いた場合、コロ
ニーは生じなかった（＜１０-3）。グリホセート耐性変
異株を試験し、そしてすべてをａｒｏＡと共に同時形質
導入した。
【００４１】これらの結果は、グリホセート耐性を供す
る全変異の約１％がａｒｏＡ中又はその近傍に存在する
ことを示唆した。変異株の１つを選んでさらに特色付
け、これをＣＴＦ３株と称した。スポット試験におい
て、この株は３５０μｇ／mlのグリホセートに耐性を有
していた。グリホセートに対するさらに高レベルの耐性
を得るためＣＴＦ３株に対して第２サイクルの変異処理
を行った。１０個の培養物をメタンスルホン酸エチルで
処理し、そして１mg／mlのグリホセート上にプレートし
た。耐性コロニーがプレートした細胞当り１０-6の頻度
で生じた。
る全変異の約１％がａｒｏＡ中又はその近傍に存在する
ことを示唆した。変異株の１つを選んでさらに特色付
け、これをＣＴＦ３株と称した。スポット試験におい
て、この株は３５０μｇ／mlのグリホセートに耐性を有
していた。グリホセートに対するさらに高レベルの耐性
を得るためＣＴＦ３株に対して第２サイクルの変異処理
を行った。１０個の培養物をメタンスルホン酸エチルで
処理し、そして１mg／mlのグリホセート上にプレートし
た。耐性コロニーがプレートした細胞当り１０-6の頻度
で生じた。
【００４２】各変異処理群につき１０，０００個ずつの
変異株を再度プールし、各プールから溶解物を調製し、
そしてＡ１株に形質導入するのに使用した。形質導入体
をＭ９培地上、及び１mg／mlのグリホセートを補給した
Ｍ９培地上で選択した。ａｒｏＡ+ についての選択にお
いてプレートした細胞当たり１０-5の形質導入体が生じ
た。ａｒｏＡ+ 、グリホセート耐性細胞についての選択
において、１０-8の頻度の形質導入が生じた。試験した
２０個の形質導入体の内１５個において、ａｒｏＡと共
にグリホセート耐性の同時形質導入が生じた。
変異株を再度プールし、各プールから溶解物を調製し、
そしてＡ１株に形質導入するのに使用した。形質導入体
をＭ９培地上、及び１mg／mlのグリホセートを補給した
Ｍ９培地上で選択した。ａｒｏＡ+ についての選択にお
いてプレートした細胞当たり１０-5の形質導入体が生じ
た。ａｒｏＡ+ 、グリホセート耐性細胞についての選択
において、１０-8の頻度の形質導入が生じた。試験した
２０個の形質導入体の内１５個において、ａｒｏＡと共
にグリホセート耐性の同時形質導入が生じた。
【００４３】これらの結果から、ＣＴＦ３株の変異処理
により得られた変異の約１×１０-3がａｒｏＡ中又はそ
の近傍に位置することが演繹される。これらの変異株に
より発現される表現型をＰｍｇr と称する。１５の別々
の変異株の間で耐性レベルの有意差はなかった。２mg／
mlのグリホセートを含有するＭ９培地上にストリークし
た場合すべての株が４８時間でコロニーを形成した。さ
らに特徴付けるために変異株ＣＴ７を選んだ。この菌株
中のＰｍｇr は、ａｒｏＡ１，ａｒｏＡ１２６及びａｒ
ｏＡ２４８と共に９７〜９９％の倍率で同時形質導入さ
れた。
により得られた変異の約１×１０-3がａｒｏＡ中又はそ
の近傍に位置することが演繹される。これらの変異株に
より発現される表現型をＰｍｇr と称する。１５の別々
の変異株の間で耐性レベルの有意差はなかった。２mg／
mlのグリホセートを含有するＭ９培地上にストリークし
た場合すべての株が４８時間でコロニーを形成した。さ
らに特徴付けるために変異株ＣＴ７を選んだ。この菌株
中のＰｍｇr は、ａｒｏＡ１，ａｒｏＡ１２６及びａｒ
ｏＡ２４８と共に９７〜９９％の倍率で同時形質導入さ
れた。
【００４４】グリホセート耐性の機構 ａｒｏ Ａ座における変異に介在されるグリホセートに対
する耐性は、５−エノールピルビル−５−ホスホシキメ
ート シンセターゼの過剰生産又は酵素の構造変化を導
く制御の変化により生ずると考えられる。これら２つの
仮説の間の区別をするために、それぞれ野性型及び変異
株であるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＳＴＫ１
株、及びＣＴ７株に由来する酵素標品を試験管内で測定
した。
する耐性は、５−エノールピルビル−５−ホスホシキメ
ート シンセターゼの過剰生産又は酵素の構造変化を導
く制御の変化により生ずると考えられる。これら２つの
仮説の間の区別をするために、それぞれ野性型及び変異
株であるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＳＴＫ１
株、及びＣＴ７株に由来する酵素標品を試験管内で測定
した。
【００４５】野性株及びグリホセート耐性変異株からの
５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート シンセ
ターゼ活性は、３−ホスホシキメートについてはＫm が
異なり、グリホセートについてはＫd が異なり、そして
３−ホスホシキメートが高濃度の場合には比活性が異な
った。これらの結果を表３に要約する。
５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート シンセ
ターゼ活性は、３−ホスホシキメートについてはＫm が
異なり、グリホセートについてはＫd が異なり、そして
３−ホスホシキメートが高濃度の場合には比活性が異な
った。これらの結果を表３に要約する。
【００４６】
【表３】
【００４７】前記の測定は最少培地に増殖した細胞から
得られた酵素標品について行った。グリホセート耐性変
異株の酵素がグリホセートにより誘導されたストレスの
間に異る制御を受けるか否かを決定するために、ＳＴＫ
１（野性型）及びＣＴ７（変異株）を、それぞれ７０μ
ｇ／ml及び１０００μｇ／mlのグリホセートを補給した
最少培地において増殖せしめた。
得られた酵素標品について行った。グリホセート耐性変
異株の酵素がグリホセートにより誘導されたストレスの
間に異る制御を受けるか否かを決定するために、ＳＴＫ
１（野性型）及びＣＴ７（変異株）を、それぞれ７０μ
ｇ／ml及び１０００μｇ／mlのグリホセートを補給した
最少培地において増殖せしめた。
【００４８】これらの条件は約２０〜３０％の増殖阻害
をもたらした。グリホセートの存在下で増殖した細胞か
らの標品の比活性はグリホセートの非存在下で増殖した
細胞からの標品の比活性に比べて１０％高かった。この
活性の増加はＳＴＫ１及びＣＴ７のいずれによっても示
され、グリホセート耐性変異株においては、グリホセー
トに応答して酵素が過剰生産されることが一般的に言え
る。
をもたらした。グリホセートの存在下で増殖した細胞か
らの標品の比活性はグリホセートの非存在下で増殖した
細胞からの標品の比活性に比べて１０％高かった。この
活性の増加はＳＴＫ１及びＣＴ７のいずれによっても示
され、グリホセート耐性変異株においては、グリホセー
トに応答して酵素が過剰生産されることが一般的に言え
る。
【００４９】野性型及び変異ａｒｏＡ座を有するＳ．テ
ィフィムリウム及びＥ．コリの増殖速度を検討した。最
少培地において、ａｒｏＡ−Ｐｍｇr 対立遺伝子のみを
有するいずれの属の株も野性型対立遺伝子、又は野性型
及びＰｍｇr 対立遺伝子を有する同系統よりも１５％低
い増殖速度を示した。１００μｇ／mlのグリホセートに
おいて、野性型Ｅ．コリは４０％阻害された増殖速度を
示した。１mg／mlのグリホセートにおいて増殖は観察さ
れなかった。ｐＰＭＧ１を有するａｒｏＡＥ．コリＬＣ
３株（次に記載する）は２０００μｇ／mlのグリホセー
トにおいて有意な阻害を受けなかった。
ィフィムリウム及びＥ．コリの増殖速度を検討した。最
少培地において、ａｒｏＡ−Ｐｍｇr 対立遺伝子のみを
有するいずれの属の株も野性型対立遺伝子、又は野性型
及びＰｍｇr 対立遺伝子を有する同系統よりも１５％低
い増殖速度を示した。１００μｇ／mlのグリホセートに
おいて、野性型Ｅ．コリは４０％阻害された増殖速度を
示した。１mg／mlのグリホセートにおいて増殖は観察さ
れなかった。ｐＰＭＧ１を有するａｒｏＡＥ．コリＬＣ
３株（次に記載する）は２０００μｇ／mlのグリホセー
トにおいて有意な阻害を受けなかった。
【００５０】ａｒｏＡ及びａｒｏＡ・Ｐｍｇr 座のクロ
ーニング ＣＴ７株からの染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
Ｓａｕ３Ａにより部分分解した。低コピー数２３kbコス
ミドベクターであるｐＶＫ１００〔ナウフ（Knauf ）及
びネスター（Nester),Plasmid(1982)8:45 〜54〕をＢｇ
ｌIIを用いて部分分解し、ＢｇｌII断片上にあるｃｏｓ
部位の切り出しを防止した。同量のベクター及び挿入Ｄ
ＮＡを混合し、連結し、そして「方法」の欄に記載した
ようにラムダカプシドにパッケージした。
ーニング ＣＴ７株からの染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
Ｓａｕ３Ａにより部分分解した。低コピー数２３kbコス
ミドベクターであるｐＶＫ１００〔ナウフ（Knauf ）及
びネスター（Nester),Plasmid(1982)8:45 〜54〕をＢｇ
ｌIIを用いて部分分解し、ＢｇｌII断片上にあるｃｏｓ
部位の切り出しを防止した。同量のベクター及び挿入Ｄ
ＮＡを混合し、連結し、そして「方法」の欄に記載した
ようにラムダカプシドにパッケージした。
【００５１】バンクからの無作為形質導入体の解析によ
り、これらの６０％が、ベクターｐＶＫ１００及び平均
２０〜２５kbの染色体性挿入部から成ると予想された大
きさ（４５kb）のコスミドＤＮＡを含むことが明らかに
なった。ａｒｏＡ−Ｐｍｇr遺伝子を分離するために
Ｅ．コリａｒｏＡ株を補完した。サルモネラＤＮＡの存
在のためバンクからＥ．コリのｈｓｄＲ+ 株への形質導
入は生じなかった。ａｒｏＡであり且つｈｓｄＲである
３株のＥ．コリを構成した。
り、これらの６０％が、ベクターｐＶＫ１００及び平均
２０〜２５kbの染色体性挿入部から成ると予想された大
きさ（４５kb）のコスミドＤＮＡを含むことが明らかに
なった。ａｒｏＡ−Ｐｍｇr遺伝子を分離するために
Ｅ．コリａｒｏＡ株を補完した。サルモネラＤＮＡの存
在のためバンクからＥ．コリのｈｓｄＲ+ 株への形質導
入は生じなかった。ａｒｏＡであり且つｈｓｄＲである
３株のＥ．コリを構成した。
【００５２】この目的のために、ｚｊｊ２０２：：Ｔｎ
１０がｈｓｄＲ+ に連結されているＳＫ４７２株を使用
した。ｚｊｊ２０２：：Ｔｎ１０をＷＡ８０２株に形質
導入し、そしてテトラサイクリン耐性について選択する
ことにより、セリン要求性制限欠損組換体ｚｊｊ２０
２：：Ｔｎ１０をｈｓｄＲ２対立遺伝子に連結した。こ
れを３種のａｒｏＡ変異株に形質導入しそしてＴｎ１０
について選択した。ＪＦ６８，ＡＢ１３２１及びＡＢ２
８２９から誘導されたこれら３つの新株をそれぞれＬＣ
1 ，ＬＣ2 及びＬＣ3 と称する。
１０がｈｓｄＲ+ に連結されているＳＫ４７２株を使用
した。ｚｊｊ２０２：：Ｔｎ１０をＷＡ８０２株に形質
導入し、そしてテトラサイクリン耐性について選択する
ことにより、セリン要求性制限欠損組換体ｚｊｊ２０
２：：Ｔｎ１０をｈｓｄＲ２対立遺伝子に連結した。こ
れを３種のａｒｏＡ変異株に形質導入しそしてＴｎ１０
について選択した。ＪＦ６８，ＡＢ１３２１及びＡＢ２
８２９から誘導されたこれら３つの新株をそれぞれＬＣ
1 ，ＬＣ2 及びＬＣ3 と称する。
【００５３】ＬＣ3 が最も低いａｒｏＡ復帰率を有して
いたのでこれをその後の実験に使用した。サルモネラＣ
Ｔ７ＤＮＡバンクをＬＣ3 株に形質導入した後、最小培
地に増殖するカナマイシン耐性形質導入体５００個を選
択した。２個のａｒｏＡ+ クローンを見出した。グリホ
セート耐性について試験した場合、これらはＣＴ７株と
同等に耐性であることが見出された。プラスミドＤＮＡ
をこれらのクローンから分離した。これらはいずれも４
５kbコスミドを含有しており、このコスミドは制限エン
ドヌクレアーゼによる予備的な解析によれば同様である
ことが見出された。さらに特徴ずけるため２つのプラス
ミドの内の１つ（ｐＰＭＧ１）を選んだ。
いたのでこれをその後の実験に使用した。サルモネラＣ
Ｔ７ＤＮＡバンクをＬＣ3 株に形質導入した後、最小培
地に増殖するカナマイシン耐性形質導入体５００個を選
択した。２個のａｒｏＡ+ クローンを見出した。グリホ
セート耐性について試験した場合、これらはＣＴ７株と
同等に耐性であることが見出された。プラスミドＤＮＡ
をこれらのクローンから分離した。これらはいずれも４
５kbコスミドを含有しており、このコスミドは制限エン
ドヌクレアーゼによる予備的な解析によれば同様である
ことが見出された。さらに特徴ずけるため２つのプラス
ミドの内の１つ（ｐＰＭＧ１）を選んだ。
【００５４】形質転換により適当なＥ．コリ株に導入し
た場合、ｐＰＭＧ１はすべてのａｒｏＡ変異を補完した
（表１参照）。さらに、ｐＰＭＧ１は、これが導入され
たすべての菌株にグリホセート耐性を供した。接合によ
り、移動要素としてｐＲＫ２０１３〔ディッタ（Ditta
）等、PNAS USA(1980)77:7347 〜7351〕を用いて、ｐ
ＰＭＧ１をＳ．ティフィムリウムＡ１株、Ａ１２４株及
びＡ１４８株に導入した。ｐＰＭＧ１はこれらの菌にａ
ｒｏＡ+ Ｐｍｇr 表現型を付与した。ａｒｏＡ +Ｅ．コ
リ形質転換体の酵素的性質により表現型応答が確認され
た。
た場合、ｐＰＭＧ１はすべてのａｒｏＡ変異を補完した
（表１参照）。さらに、ｐＰＭＧ１は、これが導入され
たすべての菌株にグリホセート耐性を供した。接合によ
り、移動要素としてｐＲＫ２０１３〔ディッタ（Ditta
）等、PNAS USA(1980)77:7347 〜7351〕を用いて、ｐ
ＰＭＧ１をＳ．ティフィムリウムＡ１株、Ａ１２４株及
びＡ１４８株に導入した。ｐＰＭＧ１はこれらの菌にａ
ｒｏＡ+ Ｐｍｇr 表現型を付与した。ａｒｏＡ +Ｅ．コ
リ形質転換体の酵素的性質により表現型応答が確認され
た。
【００５５】これらの菌株におけるＥＳ−３−Ｐシンセ
ターゼ活性がＣＴ７株におけるそれと区別できないから
である。ａｒｏＡ−Ｐｍｇr 遺伝子がクローニングされ
たと結論された。野性型ａｒｏＡ対立遺伝子も同様の方
法によりクローニングした。ＳＴＫ１ＤＮＡのバンクか
ら２つのコスミドを分離した。これらは約１０kbの共通
の領域を担持していた。これらをｐＡＲＯＡ１及びｐＡ
ＲＯＡ２と称する。
ターゼ活性がＣＴ７株におけるそれと区別できないから
である。ａｒｏＡ−Ｐｍｇr 遺伝子がクローニングされ
たと結論された。野性型ａｒｏＡ対立遺伝子も同様の方
法によりクローニングした。ＳＴＫ１ＤＮＡのバンクか
ら２つのコスミドを分離した。これらは約１０kbの共通
の領域を担持していた。これらをｐＡＲＯＡ１及びｐＡ
ＲＯＡ２と称する。
【００５６】ａｒｏＡ−Ｐｍｇr 遺伝子をサブクローニ
ングするためにプラスミドｐＰＭＧ１を制限エンドヌク
レアーゼＢｇｌIIにより分解した。大きさがそれぞれ１
０kb，９．６kb及び１．６kbである３種の挿入断片を見
出した。プラスミドｐＰＭＧ１をＢｇｌIIにより完全に
分解し、試験管内で連結し、そしてＤＮＡをＬＣ２株に
形質転換し、ａｒｏＡの補完に関して選択した。クロー
ンをスクリーニングし、そしてベクターｐＶＫ１００に
関してそれぞれ異なる方向に配向している１０kbＢｇｌ
II断片を含有するプラスミドを同定した。プラスミドｐ
ＰＭＧ５及びｐＰＭＧ６はａｒｏＡＥ．コリ株を補完
し、そして高レベルのグリホセート耐性を供した。
ングするためにプラスミドｐＰＭＧ１を制限エンドヌク
レアーゼＢｇｌIIにより分解した。大きさがそれぞれ１
０kb，９．６kb及び１．６kbである３種の挿入断片を見
出した。プラスミドｐＰＭＧ１をＢｇｌIIにより完全に
分解し、試験管内で連結し、そしてＤＮＡをＬＣ２株に
形質転換し、ａｒｏＡの補完に関して選択した。クロー
ンをスクリーニングし、そしてベクターｐＶＫ１００に
関してそれぞれ異なる方向に配向している１０kbＢｇｌ
II断片を含有するプラスミドを同定した。プラスミドｐ
ＰＭＧ５及びｐＰＭＧ６はａｒｏＡＥ．コリ株を補完
し、そして高レベルのグリホセート耐性を供した。
【００５７】プラスミドｐＰＭＧ５をＢｇｌII及びＨｉ
ｎｄIII により分解し、そして試験管内で連結すること
によりさらにクローニングを行った。ＬＣ２株を形質転
換し、ａｒｏＡ+ 及びカナマイシン耐性のコロニーを選
択した。これらのクローンに含まれるプラスミドの分析
により、ａｒｏＡＥ．コリ株を補完し、高レベルのグリ
ホセート耐性（約２mg／ml）を供する５．５kbのＢｇｌ
II／ＨｉｎｄIII サルモネラＤＮＡ断片が示された。こ
のプラスミドをｐＰＭＧIIと称する。電気泳動ゲルによ
り、プラスミドｐＰＭＧ１，ｐＰＭＧ５及びｐＰＭＧI
I、並びにｐＡＲＯＡ１（野性型サルモネラ ａｒｏＡ
+ 対立遺伝子を含有するプラスミド）はいずれも５．５
kbＢｇｌII／ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を含有することが
示された。
ｎｄIII により分解し、そして試験管内で連結すること
によりさらにクローニングを行った。ＬＣ２株を形質転
換し、ａｒｏＡ+ 及びカナマイシン耐性のコロニーを選
択した。これらのクローンに含まれるプラスミドの分析
により、ａｒｏＡＥ．コリ株を補完し、高レベルのグリ
ホセート耐性（約２mg／ml）を供する５．５kbのＢｇｌ
II／ＨｉｎｄIII サルモネラＤＮＡ断片が示された。こ
のプラスミドをｐＰＭＧIIと称する。電気泳動ゲルによ
り、プラスミドｐＰＭＧ１，ｐＰＭＧ５及びｐＰＭＧI
I、並びにｐＡＲＯＡ１（野性型サルモネラ ａｒｏＡ
+ 対立遺伝子を含有するプラスミド）はいずれも５．５
kbＢｇｌII／ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を含有することが
示された。
【００５８】この発明に従えば、感受性宿主に除草剤耐
性を付与することにより宿主細胞の保護を強化すること
ができる。さらに、酵素が関与する種々の場合に使用す
ることができる変異した酵素を生産することができ、こ
れらの場合として、種々の化合物を測定するために標識
として使用する場合、及び酵素触媒反応を阻害する汚染
物を含まない酵素を用いて生成物を製造する場合を挙げ
ることができる。
性を付与することにより宿主細胞の保護を強化すること
ができる。さらに、酵素が関与する種々の場合に使用す
ることができる変異した酵素を生産することができ、こ
れらの場合として、種々の化合物を測定するために標識
として使用する場合、及び酵素触媒反応を阻害する汚染
物を含まない酵素を用いて生成物を製造する場合を挙げ
ることができる。
【００５９】さらに、ＥＳ−３−Ｐシンセターゼを発現
する野性型遺伝子及び変異した遺伝子を探知するために
使用することができるＤＮＡ配列が提供される。さら
に、選択性を変えるために酵素を変異せしめる方法及び
このような酵素を発現する遺伝子を得る方法が提供され
る。以上、この発明を具体的に説明したが、多くの変法
を実施することが可能であることは言うまでもない。
する野性型遺伝子及び変異した遺伝子を探知するために
使用することができるＤＮＡ配列が提供される。さら
に、選択性を変えるために酵素を変異せしめる方法及び
このような酵素を発現する遺伝子を得る方法が提供され
る。以上、この発明を具体的に説明したが、多くの変法
を実施することが可能であることは言うまでもない。
【００６０】なお、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００
（ｐＰＭＧ１）株が１９８２年１２月１４日にＡＴＣＣ
に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９２５６が付与されて
いる。この寄託菌は本発明で使用したプラスミドｐＰＭ
Ｇ１を含有し、このプラスミドは常法に従って取り出
し、この本発明で使用する菌に形質転換することができ
る。
（ｐＰＭＧ１）株が１９８２年１２月１４日にＡＴＣＣ
に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９２５６が付与されて
いる。この寄託菌は本発明で使用したプラスミドｐＰＭ
Ｇ１を含有し、このプラスミドは常法に従って取り出
し、この本発明で使用する菌に形質転換することができ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:42）
Claims (3)
- 【請求項１】 グリホセート耐性５−エノールピルビル
−３−ホスホシキメート シンセターゼ。 - 【請求項２】グリホセート耐性５−エノールピルビル−
３−ホスホシキメートシンセターゼを生産することがで
きるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）又はエッセリ
シア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物を適当な栄
養培地に増殖せしめ、そして該細菌の細胞からグリホセ
ート耐性５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート
シンセターゼを分離することを含んで成る該シンセタ
ーゼの製造方法。 - 【請求項３】 選択し得る性質を有する変異した酵素の
取得方法において、該酵素を発現する構造遺伝子を有す
る細胞性宿主を試験管内変異せしめ、そして前記選択し
得る性質を有する変異株を選択し；該変異株のゲノムを
切断することによって所望の範囲の大きさの断片を生成
せしめ；該断片を栄養要求宿主にクローニングし、すな
わち変異した構造遺伝子をして該宿主を原栄養株に形質
転換し、そして前記選択し得る性質を有する原栄養性宿
主を選択し；そして前記選択し得る性質を有する前記変
異した酵素を発現する変異した構造遺伝子を有するＤＮ
Ａ配列を分離する；ことを含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/455,634 US4535060A (en) | 1983-01-05 | 1983-01-05 | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use |
| US455634 | 1983-01-05 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58234436A Division JPH069506B2 (ja) | 1983-01-05 | 1983-12-14 | グリホセート耐性５―エノールピルビル・３―ホスホシキメートシンセターゼを含有する細胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0654683A true JPH0654683A (ja) | 1994-03-01 |
| JPH0872B2 JPH0872B2 (ja) | 1996-01-10 |
Family
ID=23809640
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58234436A Expired - Lifetime JPH069506B2 (ja) | 1983-01-05 | 1983-12-14 | グリホセート耐性５―エノールピルビル・３―ホスホシキメートシンセターゼを含有する細胞 |
| JP5121384A Expired - Lifetime JPH0872B2 (ja) | 1983-01-05 | 1993-05-24 | グリホセート耐性５−エノールピルビル−３−ホスホシキメートシンセターゼ及びその製造方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58234436A Expired - Lifetime JPH069506B2 (ja) | 1983-01-05 | 1983-12-14 | グリホセート耐性５―エノールピルビル・３―ホスホシキメートシンセターゼを含有する細胞 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4535060A (ja) |
| EP (2) | EP0115673B1 (ja) |
| JP (2) | JPH069506B2 (ja) |
| AT (2) | ATE61630T1 (ja) |
| CA (1) | CA1222710A (ja) |
| DE (2) | DE3382210D1 (ja) |
Families Citing this family (500)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4535060A (en) * | 1983-01-05 | 1985-08-13 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use |
| US5094945A (en) * | 1983-01-05 | 1992-03-10 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use |
| DE3484215D1 (de) * | 1983-01-17 | 1991-04-11 | Monsanto Co | Chimaerische gene geeignet zur expression in pflanzenzellen. |
| LU84795A1 (fr) * | 1983-05-09 | 1985-03-21 | Labofina Sa | Genes conferant la resistance de la levure a des herbicides |
| US4757011A (en) * | 1983-09-30 | 1988-07-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Herbicide resistant tobacco |
| JPS60176593A (ja) * | 1984-02-22 | 1985-09-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
| US5304732A (en) | 1984-03-06 | 1994-04-19 | Mgi Pharma, Inc. | Herbicide resistance in plants |
| US6211439B1 (en) | 1984-08-10 | 2001-04-03 | Mgi Pharma, Inc | Herbicide resistance in plants |
| US5420034A (en) * | 1986-07-31 | 1995-05-30 | Calgene, Inc. | Seed-specific transcriptional regulation |
| AU590597B2 (en) * | 1985-08-07 | 1989-11-09 | Monsanto Technology Llc | Glyphosate-resistant plants |
| US4940835A (en) * | 1985-10-29 | 1990-07-10 | Monsanto Company | Glyphosate-resistant plants |
| US4658084A (en) * | 1985-11-14 | 1987-04-14 | University Of Guelph | Hybridization using cytoplasmic male sterility and herbicide tolerance from nuclear genes |
| US4658085A (en) * | 1985-11-14 | 1987-04-14 | University Of Guelph | Hybridization using cytoplasmic male sterility, cytoplasmic herbicide tolerance, and herbicide tolerance from nuclear genes |
| US4795855A (en) * | 1985-11-14 | 1989-01-03 | Joanne Fillatti | Transformation and foreign gene expression with woody species |
| ES2018274T5 (es) * | 1986-03-11 | 1996-12-16 | Plant Genetic Systems Nv | Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica. |
| US5107065A (en) * | 1986-03-28 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells |
| US5565347A (en) * | 1986-06-10 | 1996-10-15 | Calgene, Inc. | Transformation and foreign gene expression with plant species |
| US5276268A (en) * | 1986-08-23 | 1994-01-04 | Hoechst Aktiengesellschaft | Phosphinothricin-resistance gene, and its use |
| US5013659A (en) * | 1987-07-27 | 1991-05-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase |
| US4971908A (en) * | 1987-05-26 | 1990-11-20 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
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