JPH03220130A - 病原菌付着阻止剤及びそれを含有する飲食品等 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 」粟よＬ別月分１ 本発明は、病原菌、特に病原性大腸菌、う蝕原菌により
引き起こされる感染症を予防するために利用される病原
菌付着阻止剤及びそれを有効量含有する飲食品、飼料、
医薬品、化粧品等に関する。

″とその。　占 一般に病原菌は体内への進入−一標的細胞への付着−一
増殖−という過程をもって、感染症を引き起こす。

これに対して、現在用いられている治療法は、主に抗生
物質によるものである。これは、付着、増殖した病原菌
を死滅させることにより病原を根滅しようというもので
、病原菌の感染過程の最終段階に作用するものである。

この抗生物質による感染治療は発病後の生体に対する治
療法としては非常に有効であるが、抗生物質の性格上、
様々な副作用あるいはアレルギー症状を引き起こすなど
問題点も多い。

一方、生体は、これら病原菌の感染に対して、その感染
初期の段階において、防御機構を備えている。消化管内
においては分泌型１ｇＡを主とする免疫グロブリンによ
る防御機構かそれであり、これら免疫グロブリンは病原
菌の感染の初期段階、すなわち、病原菌の標的細胞への
付着を阻止することにより、生体を感染から守る。とこ
ろで、般に病原菌は標的細胞に付着する際、その標的細
胞上の特定の構造を受容体として認識することが知られ
ている。このことは、これら受容体または受容体と類似
した構造をもつもので、病原菌と結合能をもつものは、
病原菌の菌体表面の受容体結合部位に特異的に結合し、
病原菌の標的細胞上の受容体への結合を特異的に阻害す
るものと考えられる。この作用は、病原菌の感染を、そ
の初期段階で阻止するという意味で上述の免疫グロブリ
ンによる生体防御機構に類似している。すなわち、この
様な病原菌と特異的に結合し得る物質は、感染を未然に
防ぎ、しかも作用がおだやかで、副作用の少ない病原菌
付着阻止剤となり得ることか考えられる。

この様な物質として、に−カゼインおよび／またはその
プロテアーゼ分解物であるκ−カゼイングリコマクロペ
プチド（以下、ＧＭＰという）があり、特開昭６３−２
８４１３３号公報には、病原菌やウィルスによって引き
起こされる感染を防御するのに有効である旨が開示され
ている。また、特開昭６３−２３３９１１号公報には、
ＧＭＰが抗歯垢および抗う歯割として有効であることが
開示されている。一方、乳中の感染防御機能蛋白質とし
てラクトフェリン（以下、Ｌｆという）がある。Ｌｆの
作用は、その鉄キレート力にあり、病原菌がその増殖に
必要な鉄をＬｆがうばい取るために増殖が抑制されると
いわれている。しかしながら、一般にＬｆによる病原菌
増殖抑制効果は、−時的なものであり数時間後には、再
び菌か増殖しはじめるため、感染の予防および治療剤と
しての効力には不充分であると考えられていた。本発明
者らはＬｆの薬理作用について研究していたところ、Ｌ
ｆは、その鉄キレート力に由来する機能とは全く別のメ
カニズムによって、病原菌の歯、皮膚あるいは腸管細胞
への付着を阻止することを発見した。そして、このＬｆ
をκ−カゼインやＧＭＰと併用することによって、病原
菌付着阻止効果がさらに多数の菌種に及びまた相乗的に
増強されることを見出し、本発明をなすに至った。

が　”しようと　る 本発明は、病原菌、特に病原性大腸菌、う蝕原閑に起因
する感染症の防御効果を有し、しかも安全性の点でも何
ら問題のない新規な病原菌付着阻止剤を提供することを
課題とする。さらに、本発明はこのような新規な病原菌
付着阻止剤を有効量含有せしめた飲食品、飼料、医薬及
び化粧品等を提供することを課題とする。

ｉ　を”るための−゛ すなわち、本発明はＬｆまたはそのプロテアーゼ分解物
を有効成分とする病原菌付着阻止剤、およびに−カゼイ
ンまたはそのプロテアーゼ分解物をＬｆと併用させてな
る病原菌付着阻止剤に関する。

特に、病原菌が皮膚および口から大腸に至る消化器官に
おいて感染する場合に病原菌の付着を有効に阻止する病
原菌付着阻止剤に関する。また、この祿な有効成分を含
有せしめた食品、飼料、医薬品、化粧品に関する。

本発明で用いるＬｆは、牛、羊、山羊およびヒトの乳等
の分泌液から単離して得られたものであり、また遺伝子
組換技術などによって生産されたものであってもよい。

Ｌｆの単離法としては、すでにいくつかの技術が開示さ
れており、例えば、特開昭６１−１４５０００号公報、
特開昭６１−２４６１９８号公報、特開昭６２−１９５
２３号公報、特開昭６３−１５２４００号公報、特開昭
６３−２５５３００号公報、特開昭６４−８６８３９号
公報などがある。工業的な実用性を考慮すれば、硫酸エ
ステル化した多糖類担体を利用する方法（特開昭６３−
２５５３００号公報）が最も好ましい。なお、Ｌｆには
鉄をキレートする機能があり、乳等の分泌液より単離さ
れたＬｆの一部は鉄と結合したものが含まれている。し
かし、本発明による病原菌付着阻止効果は、鉄の結合状
態には依存しないので、鉄の結合した形態であっても結
合していない形態であってもそのいずれでもよい。Ｌｆ
をプロテアーゼ処理する場合、特に制限はないが極端に
低分子化しない程度の限定分解を行なうべきである。低
分子化すると効果が弱くなる。そして、本発明ではＬｆ
またはそのプロテアーゼ分解物を単独で用いてもよいし
、また両者を併用してもよい。

に−カゼインは、牛、羊、山羊およびヒトの乳から単離
されたものあるいは遺伝子組換技術によって生産された
ものを用いることができる。乳から単離する方法として
は、公知の方法、例えばジットルの方法（Ｃ，Ａ、ジッ
トルおよびＪ、Ｈ，カスタージャーナルオブデイリーサ
イエンス４６　：　１１８３゜（１９６３））を用いる
ことができるがより実用的には、特開昭５９−９１８４
８号公報に開示された方法を用いることができる。に−
カゼインをプロテアーゼ処理する場合も特に制限はない
がペプシンあるいはキモトリプシン等によって限定分解
を行なうことが望ましい。より実用的には、乳にレンネ
ット処理を行ないチーズを製造した時に、副産物として
生じるホエーからＧＭＰを得る。その方法としては、公
知の方法、例えば、モアおよびセオのジャーナルオブフ
ードサイエンス５３，８０．（１９８８）に示された方
法、あるいは特開昭５１−９１３５８号公報、特開平１
−１６８６９３号公報に開示されている方法を用いるこ
とができる。さらには、レンネットカゼインホエーから
特開昭６３−２８４１９９号公報に開示された方法を用
いることも可能である。

このようにして得られたＬｆ、その分解物は単独で使用
してもよいし、これとに−カゼインまたはその分解物を
併用して使用することもできる。特にこれらを併用し、
混合して用いると多くの菌種に対し幅広く付着阻止効果
を奏するので好ましい。

経口的に投与する場合、標準的な服用量は成人−日一人
当り６〜３００ｍｇを一応のめやすとすることができる
。また外用的に投与する場合は、この程度乃至その数倍
量を使用することができる。さらに、食品や飼料中に混
合したり、あるいは医薬品や化粧品組成物として用いる
ことも可能である。これらＬｆやκ−カゼインは、天然
物であり、乳の一成分として古来より飲用されてきたも
のであるだけに、安全性に何ら問題はない。

次に本発明の病原菌付着阻止効果について試験例をあげ
て説明する。

〈試験例〉 １、病原性大腸菌のヒト小腸細胞（ＪＴＣ−１７）への
付着に対する阻止効果。

ヒト小腸細胞ＪＴＣ−１７（東京医科大学より分譲を受
けた）を、５％牛脂児血清を含むダルベツコ変法イーグ
ル培地（５％ＦＣ５／ＤＭＥＭ）にて２５ｃｄの底面積
をもつ培養フラスコに３７℃、Ｃ０２濃度５％で培養す
る。

細胞がフラスコの底面−面に増殖したら、培養をやめ常
法どうりトリプシン（２０００７ｍｌ）含有、リン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）　１ｍｌにて細胞をはがし取り
、１１０００ｒｐで５分間遠心分離することで細胞を集
めた。上清を吸い出し、新たに５％ＦＣ８／ＤＭＥＭ８
ｍｌに細胞を懸濁した。この細胞懸濁波谷１ｍｌを１０
ｍ１ポリスチレンチユーブ（ファルコン社２０９５）に
入れ３７℃３日間培養した。

病原性大腸菌旧０４０７株、Ｐｂ１７６株（都立衛生研
より分譲を受けた）をそれぞれ１白金耳取り、普通ブイ
ヨン培地４ｍｌに３７℃で一夜培養した。培養後、３０
００ｒｐｍ　１０分間遠心分離することにより集菌し、
これをｐＨ８に調整したＰＢＳで３回洗浄した。その後
、大腸菌をｐＨ８に調整したＰＢ３１ｍｌに懸濁し、フ
ルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）　（シ
グマ社）１ｍｇを加えよく溶解し４℃で３時間ゆっくり
攪拌しながら反応させ、大腸菌をＦＴＴＣにてラベルし
た。

ラベルを終えた大腸菌は、３００Ｏｒｐｍ　１０分間の
遠心分離にて集菌し、ＰＢＳにて３回洗浄した後、３ｍ
ｌのＰＢＳに懸濁した。

この様にして調製した、ＦＩＴＣでラベルした大腸菌懸
濁液４００μｌに、目的のサンプルＰＢＳ溶液２００μ
ｍを混合し、３７℃で１時間インキュベートシた。

一方、３Ｆ１間の培養を終えたＪＴＣ１７細胞を１１０
０Ｏｒｐで５分間遠心分離し」二清の培地を除き、さら
にＰＢＳで３回洗浄し、これに上述の大腸菌とサンフル
とを混合し、インキュベートした溶波谷６００μｍを加
え３７°Ｃで３０分間インキュベートした。インキュベ
ート終了後、７５０ｒｐｍ　５分間遠心分離し、細胞だ
けを沈殿させ、細胞に付着せす上清に残った大腸菌を吸
い出した。さらに、ＰＢＳにて細胞を２回洗浄した。Ｐ
ＢＳで洗浄した細胞に２００Ｕトリプシン／ＰＢ３９０
０μｍを加え、激しく攪拌した。これに０１％５ＤＳ１
００μＬ、　１ｍｌの脱イオン水を加え激しく攪拌し、
３０分間静置することにより細胞を溶解した。

この溶液を蛍光分光光度計（日立フルオレッセンススペ
クトロメーターＦ−３０００）にて励起波長４９０ｎｍ
、蛍光波長５２０ｎｍで相対蛍光強度を測定し、蛍光ラ
ベルした大腸菌のＪＴＣ１７＃ＴＩ胞への付着を評価し
た。第１表には、サンプルを添加しない時（ブランク）
の相対蛍光強度を付着率１００％、蛍光ラベルした大腸
菌のポリスチレンチューブへの非特異的な吸着（ポリス
チレンチューブ内に検体と同じ濃度の蛍光ラベルした大
腸菌を入れ、検体と同じ条件で測定した相対蛍光強度）
を付着率Ｏ％ととし、各サンプルを添加した際の付着率
を示している。

実験は、すべて３連で行った。

第１表 なお、表中の記号は次のことを示す（第２表及び第３表
でも同様である。） ｂＬｆ・ウシラクトフェリン、ｈＬｆ：ヒ］・ラフ１〜
フエリン、ｇＬｆヤギラクトフェリン、ｗＬｆ：水牛ラ
クトフェリン、ｂκ−カゼイン・ウシκ−カゼイン、１
１にカヤイン。ヒトκ−カゼイン、ｇに一カセイン：ヤ
ギκ−カゼイン、Ｗ−にカゼイン：水牛−にカゼインｂ
ＧＭＰ：ｒンシグリコマクロベフ゛チド、ｈＧＭＰ・ヒ
トグリコマクロペプチド、ｇＧＭＰ：ヤギグリコマクロ
ベフチド、ｗＧ！ＪＰ：水牛グリコマクロペプチド。

いずれの試料でも病原性大腸菌のヒト小腸細胞（ＪＴＣ
−１７）への付着は防止されるが、特にｂＬｆはその効
果が優れており、またｂＬｆとｂＧＭＰまたはｂκ−カ
ゼインとを併用したときには著しい付着防止効果を示す
。

２、う歯原閑のポリスチレンチューブへの付着に対する
阻止効果 ３種のストレプトコッカスミュータンス（ＡＴＣＣ−２
７６０７，２５１７５，２７３５１）を１白金耳取り、
プレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地４ｍｌ
で、−夜培養した。−後後、３０００ｒｐｍ　１０分間
遠心することにより集菌し、上清の培地を吸い出す。さ
らに、これをＰＢＳで３回洗浄し、これをＯＤ６．。＝
０．８となるようにＰＢＳに懸濁した。この菌懸濁液と
サンプル溶液を当因混合し、ｌ　Ｏｍｌのポリスチレン
チューブ（ファルコン社２０９５）に入れ、よく攪拌し
、３７℃　３時間インキュベートした。インキュベート
終了後、ＯＤ、、。を測定し、次式から付着率を求めた
。

χ：サンプルの０Ｄ６６゜ 実験は、すべて２連で行い、結果を第２表に示した。

いずれの試料でもう歯原菌のポリスチレンチューブへの
付着は、阻止されるが、特にＬｆにおいてはその由来に
かかわらず高い阻止効果を示し、またＬｆとＧＭＰまた
はκ−カゼインと併用するとその効果はいちじるしく高
まった。

第２表 ３、無菌マウスを用いた大腸菌付着防止作用無菌マウス
ＩＣＲ２０匹を５匹ずつ４群に分け、各群に以下の試料
を毎日０．２ｍｌずつ経口投与した。

Ａ群　ＰＢＳ　０．２ｍ１ ８群　ｂＬｆ　１ｍｇ１０．２ｍｌ　ＰＢＳＣｕｂＧＭ
Ｐ　１ｍｇ１０．２ｍｌ　Ｐ２Ｓ５群　ｂＬｆ　Ｏ，５
ｍｇ＋ｂＧＭＰ　０．５ｍｇ７０．２ｍＩ　ＰＢＳなお
、各試料は、０，２２μｍのフィルターで濾過除菌して
から用いた。一方、病原性大腸菌Ｐｂ１７６株を普通ブ
イヨン培地で培養後、集菌し、ＰＢＳで３回洗浄した。

各試料投与後１週間目の各マウスに１０’ＣＦＵ１０．
２ｍｌの菌液を経口投与し、さらに１週間各試料を投与
し続けた。その後マウスを無菌的に解剖し腸管を摘出し
た。この腸管をホモゲナイズし、その１ｍｌを寒天ゲル
平板に接種し菌数を数えた。

１！ｌ−４，３ｘｌＯ”ＣＦＵ ＢＩＴ　　７．０Ｘ１０” Ｃ群　３．９Ｘ　１０’ Ｄｎ￥　　２．５Ｘ１０” このように、Ｂ、ＤｆｆＴでは、Ａ群に比へ有意に菌数
が低く、さらに従来公知のＣ群に比へても菌数か低く、
病原性大腸菌の付着が顕著に阻止された。

特にウシラクトフェリンとＧＭＰとを共存させたＤ群で
は低い値を示した。

４、ラットを用いたう歯厚菌付着阻止効果３凋齢ウィス
ターラットに下表のシヨ糖強化食を与え飼育した。

全小麦粉 ショ糖 脱脂粉乳 アルファルファの葉の粗粉 肝全体 ｇ ６ｇ ８ｇ ｇ ｇ ビール酵母 食塩 ｇ ｇ ラットは５匹ずつ５群に分け、各群には以下の試料を飲
料水として給水ボトルに入れて飼育した。

Ａ群　脱イオン水 Ｂ群　１％ｂＬｆ Ｃ群　１％ｂκ−カゼイン Ｄ群　１％ｂＧＭＰ Ｅ群　０５％ｂＬｆ　　＋　　０．５％ｂＧ績Ｐ１週間
後、Ｓ、　ｇｌＢｔａｎｃｅを口腔内に接種し、さらに
３ケ月間飼育を継続した。その後、歯を顎ごと摘出し、
実体顕微鏡下で虫歯の発生状態を観察し、虫歯の程度を
調べた。全く発生していないもの０点〜歯全体に広がっ
ているもの１０点の範囲で各群の得点を合計した。結果
を第３表に示す。

第　　３　　表 で傷をつけ、各群のマウスに下記の試料を塗り付げた。

Ａ群　脱イオン水 Ｂ群　１％ｂＬｆ Ｃ群　１％ｂＬｆｌ−リブシン分解物 り群　１％ｂＧＭＰ Ｅ群　０．５％ｂＬｆ　　＋　　０．５％ｂＧＭＰこれ
らの結果からみて、従来公知のＤ群に比べてＢ群、Ｃ群
及びＥ群は虫歯の発生を同様に有効に予防することがで
きた。特にｂＬｆとｂＧＭＰとを併用したＥｉｌではそ
の効果が著しく優れていた。

５　マウスを用いた皮膚への大腸菌付着阻止無菌マウス
ＩＣＨの背中の体毛を約２ｃｍそり落とし、アルコール
綿で消毒した。このマウスを４匹ずつ５群に分けた。体
毛をそった部分の中心に注射針塗り付けた直後に病原性
大腸菌器０４０７株を１０’ＣＦＵずつ塗り付けた。１
時間後、ＰＢＳにて傷口を洗い１週間そのまま無菌的に
飼育した。その後皮膚を１　ｃｍ’角に切り取り、ホモ
ゲナイズした。この液１ｍｌを寒天培地を入れたシャー
レに接種し、３７℃１夜培養後菌数を測定した。結果を
下記に示す。

Ａ群　１．８Ｘ１０’　ＣＦＵ Ｂ群　５．２Ｘ　１０’　　” Ｃ群　４．４Ｘ１０’　　／／ Ｄ群　２．５ＸＩＱ’　　ｔｔ Ｅ群　６．３ＸＩＱ”　　ｔｔ Ｂ群、６群は、従来公知のＤ群と同様に付着していた菌
数が有意に少なく、また特にラクトフェリンとＧＭＰと
を併用したＥ群では、その効果が著しかった。

次に、本発明を実施例を挙げて説明する。

〈実施例１〉 下記配合のＬｆおよびＧＭＰ配合飲料を製造した。

溶液　Ａ しｆ 脱イオン水 ００ｇ ０ｋｇ クエン酸ナトリウム　８００ｇ ＧＭＰ　　　　　　　　　　６００　ｇビタミンＢ＊　
　　　　　１．１　ｇ ”　　Ｂａ　　　　　　２．２ｇ ｔｔｃ　　　　　　　５．５ｇ 葉酸　　　０．４ｇ 香料　　　１００ｇ １１５濃縮果汁　　　　　１　ｋｇ 水　　　　　　　　　　　　５０　ｋｇ溶溶液色Ｂを別
々にプレート殺菌機にて９３℃３分間保持して殺菌後、
冷却（５〜１０℃）し、殺菌済タンク中に貯蔵した。次
いでこの混合液を殺菌満紙容器に無菌的に充填し、大腸
菌付着阻止用飲料を製造した。

溶液　Ｂ ショ糖 クエン酸 ８　　ｇ ００　ｇ 〈実施例２〉 虫歯予防用チューインガムの配合例 ソルビトール ガム基質 グリセロール Ｌｆ ＧＭＰ 調味料 着色料 炭酸水素ナトリウム 計 ８ ３ ０１５ ０．５ ００ 〈実施例３〉 虫歯予防用歯磨配合例（％） りん酸水素カルシ＋）Ａ・２水和物 グリセリン ソルビトール Ｌｆ 例１ ４５．０ １Ｏ００ ２５，０ ２，０ （％） ＧＭＰ カルボキシメチルセル口 −ス・ナトリウム カラギーナン ビーガム サッカリンナトリウム ラウリル硫酸ナトリウム ビタミンＥ酢酸塩 香料 水 ０．５ ０．３ ０．２ ０．２ １．２ ０．１ １．０ 残 １．０ ０．５ ０．３ ０．２ ０．２ １．２ ０．１ １．０ 残 例２ ４５．０ １０．０ ２５．０ １．０ 〈実施例４〉 ニキビ予防用ローション配合例 例１ クエン酸　　　　　　　　　　０．１ スルホ石炭酸亜鉛　　　　　０．２ グリセリン　　　　　　　５．０ ポリオキシエチレン（２０モル）１．Ｏオレイルアルコ
ールエーテル （％） 例２ ０．１ Ｏ１２ ５，０ １，０ 例３ ０．１ ０．２ ５、Ｏ １，０ エチルアルコール 香料・防腐剤 Ｌｆ ＭＰ 水 ２０．０ 適量 ５ ５ 残余 ２０．０ 適量 ０．８ ０．２ 残余 ２０．０ 適量 １．０ 残余 本ローションは顔面に１日１〜３回塗布して使用する。

〈実施例５〉 動物用飼料配合例 脱粉 ＰＣ 脂肪 グルコース ビタミン・ミネラル Ｌｆ ＭＰ ５９．０ｇ １４．３ｇ １７．２ｇ ５．０ｇ ２．５ｇ １．０ｇ １．０ｇ 計 ００ｇ 〈実施例６〉 医薬用カプセル剤 乳糖 微結晶セルロース Ｌｆ ＭＰ 計 ０ｇ ５ｇ ５ｇ ０ｇ ００ｇ 上記の配合を行ない、よく混合した後に４００ｍｇずつ
カプセルに入れた。本カプセルは１日１〜３回程度を目
安に投与される。

〈実施例７〉 医薬用錠剤 Ｌｆ５０ｍｇ、　ＧＮＰ５０ｍｇおよび微結晶セルロー
ス１００ｍｇを含む錠剤を常法に従って調製し、シロ・
ツブゼラチン沈降性炭酸カルシウムで糖衣をほどこした
。本錠剤は１日１〜３錠を目安にして投与される。

〈発明の効果〉 本発明のＬｆまたはＬｆ部分分解物を有効成分とする病
原菌付着阻止剤は、従来病原菌付着阻止効果があるとし
て知られているκ−カゼインまたはκ−カゼイン分解物
と同様にいずれも歯、皮膚および腸管における病原菌の
付着を阻止することができる。特に、Ｌｆおよび／また
はその部分分解物とκ−カゼインおよび／またはその部
分分解物とを併用させることによって著しい阻止効果を
もたらした。また、本発明の病原菌付着阻止剤としての
有効成分はその安全性も確認されており、さらに牛乳よ
り大量に入手し得るのでコストの面からも実用性が高い
。

さらに、本発明でＬｆまたはその部分分解物を飲食品、
飼料、医薬品、化粧品に添加することによって毒性のな
い病原菌付着阻止効果を有する飲食品、飼料、医薬品、
化粧品を安定的かつ安価に供給することができ、虫歯予
防、にきび等皮膚炎症、食中毒を未然に防止することが
可能になる。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ラクトフェリンまたはそのプロテアーゼ分解物を
   有効成分とする病原菌付着阻止剤。
2. （２）ラクトフェリンまたはそのプロテアーゼ分解物と
   κ−カゼインまたはそのプロテアーゼ分解物とを併用す
   ることを特徴とする病原菌付着阻止剤。
3. （３）ラクトフェリン及びκ−カゼインは、牛、水牛、
   山羊またはヒト由来であることを特徴とする請求項（１
   ）または（２）に記載の病原菌付着阻止剤。
4. （４）κ−カゼインのプロテアーゼ分解物がκ−カゼイ
   ングリコマイクロペプチドであることを特徴とする請求
   項（２）に記載の病原菌付着阻止剤。
5. （５）請求項（１）〜（４）に記載されるいずれかの病
   原菌付着阻止剤を有効量含有する飲食品。
6. （６）請求項（１）〜（４）に記載されるいずれかの病
   原菌付着阻止剤を有効量含有する飼料。
7. （７）請求項（１）〜（４）に記載されるいずれかの病
   原菌付着阻止剤を有効量含有する医薬。
8. （８）請求項（１）〜（４）に記載されるいずれかの病
   原菌付着阻止剤を有効量含有する化粧品。