JPH0259671A - 免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、免疫分析方法に係り、特に免疫反応に関与す
る物質を間接的に蛍光測光法によって測定する場合に適
用するに好適な免疫分析方法に関する。
る物質を間接的に蛍光測光法によって測定する場合に適
用するに好適な免疫分析方法に関する。
免疫学的手法を利用して生体試料中の微量物質を測定す
るために、以前は放射性同位元素を用いるラジオイムノ
アッセイ法が多く利用されていたが、最近では酵素やリ
ポソームを用いる測定法が多くなってきている。
るために、以前は放射性同位元素を用いるラジオイムノ
アッセイ法が多く利用されていたが、最近では酵素やリ
ポソームを用いる測定法が多くなってきている。
酵素免疫測定法は、例えば特開昭６２−５０６６２号に
示されている。この例では、ビーズ表面上に抗原−抗体
−酵素の複合物を生成させ、基質をこの複合物に接触さ
せて酵素反応によって現われる蛍光の強度を測定してい
る。
示されている。この例では、ビーズ表面上に抗原−抗体
−酵素の複合物を生成させ、基質をこの複合物に接触さ
せて酵素反応によって現われる蛍光の強度を測定してい
る。
一方、自動化学分析装置の分野では１分析装置の経時変
動が測定値に影響するので、この問題に対する解決方法
が考えられている。例えば米国塊許第４，０４３，７５
６号は被検試料の反応液をフローセル内に吸入して吸光
度測光を行っているが、被検試料を測定するに際して標
準試料の反応液および試薬ブランクを測定して検量線を
修正することにより、分析装置のドリフト変動を補正し
ている。
動が測定値に影響するので、この問題に対する解決方法
が考えられている。例えば米国塊許第４，０４３，７５
６号は被検試料の反応液をフローセル内に吸入して吸光
度測光を行っているが、被検試料を測定するに際して標
準試料の反応液および試薬ブランクを測定して検量線を
修正することにより、分析装置のドリフト変動を補正し
ている。
特開昭６２−５０６６２号は、反応液を測定するために
通常の蛍光光度計を用いており、自動化された反応系と
蛍光光度計を組み合わせた装置については言及していな
い。
通常の蛍光光度計を用いており、自動化された反応系と
蛍光光度計を組み合わせた装置については言及していな
い。
蛍光光度計を自動分析装置に組み込んで免疫分析装置を
構成しようとすると、検出系の安定性および測定結果の
信頼性が実用化にあたっての大きな要素となるＪ免疫側
室は、生体試料中の微量な抗原又は抗体の定量を行う必
要があるため、蛍光測光の光学系における性能異常は微
量分析を損う原因となる。また、試薬劣化も微量分析の
測定誤差を大きくする要因となる。
構成しようとすると、検出系の安定性および測定結果の
信頼性が実用化にあたっての大きな要素となるＪ免疫側
室は、生体試料中の微量な抗原又は抗体の定量を行う必
要があるため、蛍光測光の光学系における性能異常は微
量分析を損う原因となる。また、試薬劣化も微量分析の
測定誤差を大きくする要因となる。
米国特許筒４，０４３，７５６号は分析装置のドリフト
変動について教示しているが、光学系の性能低下や試薬
劣化に対しては配慮していない。この従来技術で用いる
標準試料は、被検試料中の対象成分と同種の成分を同じ
ように反応させた反応液を用いている。ところが免疫分
析の場合には、標準試料用として反応に供する物質の溶
液は、化学的に安定なものが得難い。
変動について教示しているが、光学系の性能低下や試薬
劣化に対しては配慮していない。この従来技術で用いる
標準試料は、被検試料中の対象成分と同種の成分を同じ
ように反応させた反応液を用いている。ところが免疫分
析の場合には、標準試料用として反応に供する物質の溶
液は、化学的に安定なものが得難い。
本発明の目的は、抗原又は抗体の測定に蛍光測光を適用
しても信頼性の高い測定結果が得られる免疫分析方法を
提供することにある。゛〔課題を解決するための手段〕 本発明では、反応系の反応容器内において被検試料の抗
原抗体反応複合物の生成量に応じた蛍光性物質を出現さ
せるようにし、反応容器中の反応液に基づく蛍光強度を
蛍光光度計で測定する。この場合法のステップを含む。
しても信頼性の高い測定結果が得られる免疫分析方法を
提供することにある。゛〔課題を解決するための手段〕 本発明では、反応系の反応容器内において被検試料の抗
原抗体反応複合物の生成量に応じた蛍光性物質を出現さ
せるようにし、反応容器中の反応液に基づく蛍光強度を
蛍光光度計で測定する。この場合法のステップを含む。
すなわち、蛍光標準試料を反応容器に加え、この反応容
器に収容されている標準試料の蛍光強度を測定すること
、および標準試料の蛍光強度測定値があらかじめ記憶さ
れている設定値より大きいときには分注装置による反応
容器列への被検試料の分注動作を続行せしめ、標準試料
の蛍光強度測定値が上記設定値より小さいときには上記
分注装置の分注動作を停止せしめること、を実行するよ
うにした。
器に収容されている標準試料の蛍光強度を測定すること
、および標準試料の蛍光強度測定値があらかじめ記憶さ
れている設定値より大きいときには分注装置による反応
容器列への被検試料の分注動作を続行せしめ、標準試料
の蛍光強度測定値が上記設定値より小さいときには上記
分注装置の分注動作を停止せしめること、を実行するよ
うにした。
本発明を適用した免疫分析装置では、微量分析にとって
必要とされる測定信号の大きさの下限値があらかじめ設
定され記憶されている。蛍光標準試料には１例えば硫酸
キニーネのような化学的に安定な物質の溶液が用いられ
る。被検試料（−船検体）も標準試料も可動反応容器列
における対応する反応容器に分注される。被検試料用反
応容器には蛍光発現性試薬が加えられるけれども、蛍光
標準試料用反応容器には蛍光発現性試薬を加えずに標準
試料溶液自体から発せられる蛍光を測定する。これによ
り光学系の性能が一定している限り実質的に一定の蛍光
強度を繰り返し得ることができる。 被検試料の反応液
の測定に先立って標準試料の蛍光強度が測定され、この
測定値があらかじめ記憶されている設定値と比較される
。標準試料の蛍光強度の方が設定値よりも低いときには
。
必要とされる測定信号の大きさの下限値があらかじめ設
定され記憶されている。蛍光標準試料には１例えば硫酸
キニーネのような化学的に安定な物質の溶液が用いられ
る。被検試料（−船検体）も標準試料も可動反応容器列
における対応する反応容器に分注される。被検試料用反
応容器には蛍光発現性試薬が加えられるけれども、蛍光
標準試料用反応容器には蛍光発現性試薬を加えずに標準
試料溶液自体から発せられる蛍光を測定する。これによ
り光学系の性能が一定している限り実質的に一定の蛍光
強度を繰り返し得ることができる。 被検試料の反応液
の測定に先立って標準試料の蛍光強度が測定され、この
測定値があらかじめ記憶されている設定値と比較される
。標準試料の蛍光強度の方が設定値よりも低いときには
。
光学系が微量分析に必要な条件を満たしていない状態で
あることを意味するので、その後の被検試料の分注動作
を停止させ無駄な測定をやめさせる。
あることを意味するので、その後の被検試料の分注動作
を停止させ無駄な測定をやめさせる。
この場合、オペレータは光源および光電検出器をチエツ
クし、劣化している方を新しいものと交換することによ
り光学系に必要な機能を回復させる。
クし、劣化している方を新しいものと交換することによ
り光学系に必要な機能を回復させる。
標準試料の蛍光強度の方が設定値よりも高いときには、
光学系が満足し得る状態にあることを意味するので、そ
の後の被検試料に対する分注動作を続行させる。
光学系が満足し得る状態にあることを意味するので、そ
の後の被検試料に対する分注動作を続行させる。
本発明の望ましい実施例では、試薬ブランクの蛍光測定
値に対しあらかじめ上限値が設定され記憶されている。
値に対しあらかじめ上限値が設定され記憶されている。
複数の被検試料の分析動作の途中で測定される試薬ブラ
ンク値がその上限値よりも大きいときには、試薬劣化の
アラームが出される。
ンク値がその上限値よりも大きいときには、試薬劣化の
アラームが出される。
これに伴ってオペレータは、試薬を新しいものと交換す
ることができる。
ることができる。
本発明を適用した免疫分析装置の構成を第２図に示す。
第２図において、回転型円板状の反応ディスク１の円周
上に複数個の反応容器２を配列し、反応ディスク１を駆
動機構により間欠的に回転する。
上に複数個の反応容器２を配列し、反応ディスク１を駆
動機構により間欠的に回転する。
蛍光測光用の反応容器２は、透光性材料であるガラス又
はアクリル樹脂からなる。蛍光光度計１９の測光位置は
、反応恒温槽６の内部にある。
はアクリル樹脂からなる。蛍光光度計１９の測光位置は
、反応恒温槽６の内部にある。
光度計１９は、複数検知器を有する多波長同時測光形で
あり１反応容器２と相対し、反応ディスク１上の測光位
置２０にある反応容器が、光源ランプ２１からの光束２
２を通過するように構成されている。所定波長の励起光
は反応容器の上方又は底面から反応容器内の液に照射さ
れ、液から発光された蛍光は反応容器側面から取り出さ
れ所定波長が選択されて光電検出器である光電子増倍管
により検出される。このような光度計の光学系自体は周
知の構成である。
あり１反応容器２と相対し、反応ディスク１上の測光位
置２０にある反応容器が、光源ランプ２１からの光束２
２を通過するように構成されている。所定波長の励起光
は反応容器の上方又は底面から反応容器内の液に照射さ
れ、液から発光された蛍光は反応容器側面から取り出さ
れ所定波長が選択されて光電検出器である光電子増倍管
により検出される。このような光度計の光学系自体は周
知の構成である。
反応ディスク１の移送動作により、次々と反応容器が測
光位置２０に位置づけられ、光度計１９によって各試料
に基づく蛍光強度が測定される。
光位置２０に位置づけられ、光度計１９によって各試料
に基づく蛍光強度が測定される。
光度計１９の出力は、マルチプレクサにより現在必要な
測定波長の信号が選択され、Ａ／Ｄ変換器により中央処
理装置に取り込まれて、ＲＡＭに記憶される。
測定波長の信号が選択され、Ａ／Ｄ変換器により中央処
理装置に取り込まれて、ＲＡＭに記憶される。
試薬容器１２は特定の分析項目に対する第一試薬、第二
試薬等をグループとして配置する。試薬ディスク９及び
試料ディスク８を駆動軸１０の周りに回転し、試薬容器
１２及び試料容器１１を１ピツチまたは指定したピッチ
数だけ回転するように構成する。また試薬容器１２及び
試料容器１１をそれぞれ別個に分析対象に対応して取り
付け、取り外し可能にしてセットする。また試料容器１
１を試料恒温槽に、試薬容器１２を試薬保冷槽１３に別
個に配置して所定温度を保つ。
試薬等をグループとして配置する。試薬ディスク９及び
試料ディスク８を駆動軸１０の周りに回転し、試薬容器
１２及び試料容器１１を１ピツチまたは指定したピッチ
数だけ回転するように構成する。また試薬容器１２及び
試料容器１１をそれぞれ別個に分析対象に対応して取り
付け、取り外し可能にしてセットする。また試料容器１
１を試料恒温槽に、試薬容器１２を試薬保冷槽１３に別
個に配置して所定温度を保つ。
試薬容器１２の１つには、所定濃度となるように調製さ
れた硫酸キニーネ標準液が収容されている。試料あるい
は標準試料液又は試薬のそれぞれを試料容器１１又は試
薬容器１２から、反応容器２に分注する為にピペッティ
ング機構１４を設ける。そのピペッティング機構１４は
同幅アーム１４ａの先端にプローブ１５を設け、プロー
ブ１５により試料又は試薬を吸引し、プローブ１５を回
転移動させて試料および試薬分注位置１６にある反応容
器２に吐出する。その際、分注される試料容器１１又は
試薬容器１２を、ピペッティング機構１４のプローブ１
５の移動軌跡に配置するようにし、かつ駆動軸１０によ
り試料ディスク８又は試薬ディスク９を回転して移動軌
跡上に該当する容器が停止するようにする。
れた硫酸キニーネ標準液が収容されている。試料あるい
は標準試料液又は試薬のそれぞれを試料容器１１又は試
薬容器１２から、反応容器２に分注する為にピペッティ
ング機構１４を設ける。そのピペッティング機構１４は
同幅アーム１４ａの先端にプローブ１５を設け、プロー
ブ１５により試料又は試薬を吸引し、プローブ１５を回
転移動させて試料および試薬分注位置１６にある反応容
器２に吐出する。その際、分注される試料容器１１又は
試薬容器１２を、ピペッティング機構１４のプローブ１
５の移動軌跡に配置するようにし、かつ駆動軸１０によ
り試料ディスク８又は試薬ディスク９を回転して移動軌
跡上に該当する容器が停止するようにする。
試料ディスク８上の試料容器１１からピペッティング機
構１４により所定量の試料をプローブ１５で吸引し、反
応ディスク１上の指定された位置において反応容器２に
吐出する。吐出後、ピペッティング機構１４のプローブ
１５を洗浄装置１７で十分に洗浄し、試料液のキャリー
オーバによる汚染を防ぐ。反応容器内には、各分析項目
の種類に対応した抗体が表面にコーティングされたビー
ズが入れられている。試料と免疫試薬の反応によって抗
原抗体反応複合物が形成されたビーズは、反応容器に入
っている状態で洗浄装置２５によって洗浄される。
構１４により所定量の試料をプローブ１５で吸引し、反
応ディスク１上の指定された位置において反応容器２に
吐出する。吐出後、ピペッティング機構１４のプローブ
１５を洗浄装置１７で十分に洗浄し、試料液のキャリー
オーバによる汚染を防ぐ。反応容器内には、各分析項目
の種類に対応した抗体が表面にコーティングされたビー
ズが入れられている。試料と免疫試薬の反応によって抗
原抗体反応複合物が形成されたビーズは、反応容器に入
っている状態で洗浄装置２５によって洗浄される。
第２図に示した分析装置によって一般検体である血液試
料の分析動作を実行する前に、マイクロコンピュータお
よび記憶部を含む制御装置に、光学系の性能を判定する
ための下限値および試薬ブランクの上限値をキーボード
から入力し記憶させておく。
料の分析動作を実行する前に、マイクロコンピュータお
よび記憶部を含む制御装置に、光学系の性能を判定する
ための下限値および試薬ブランクの上限値をキーボード
から入力し記憶させておく。
説明の都合上、ここでは、血清試料中のＴ ａ （チロ
キシン）およびＴ Ｓ Ｈ（Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｎｇＨｏｒｕｍｏｎ）を測定する例を示す。
キシン）およびＴ Ｓ Ｈ（Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｎｇＨｏｒｕｍｏｎ）を測定する例を示す。
これらの分析項目の選択は、ＣＲＴ画面上で行う。各分
析項目用の抗体がコーティングされたビーズが入ってい
る反応容器２を、反応ディスクに取付ける。このとき、
標準試料甜定用反応容器および試薬ブランク用反応容器
にはビーズが入っていないものをセットする。反応ディ
スク上の反応容器の配列順序と分析項目、標準試料およ
び試薬ブランクとは対応づけて制御装置に記憶させてお
く。各分析項目に対応する検量線はあらかじめ求めてお
き、制御装置に記憶させておく。第３図にはＴａの検量
線例を示し、第４図にはＴＳＨの検量線例を示す。
析項目用の抗体がコーティングされたビーズが入ってい
る反応容器２を、反応ディスクに取付ける。このとき、
標準試料甜定用反応容器および試薬ブランク用反応容器
にはビーズが入っていないものをセットする。反応ディ
スク上の反応容器の配列順序と分析項目、標準試料およ
び試薬ブランクとは対応づけて制御装置に記憶させてお
く。各分析項目に対応する検量線はあらかじめ求めてお
き、制御装置に記憶させておく。第３図にはＴａの検量
線例を示し、第４図にはＴＳＨの検量線例を示す。
次に第１図を参照して、第２図に示した分析装置の動作
を説明する。
を説明する。
ステップ１０１において分析装置のスタートキーをオペ
レータが押すことによって分析動作を開始させる。まず
、分析装置はピペッティング機構１４を動作し、蛍光標
準試料である硫酸キニーネの入った試薬容器１２から第
１番目の反応容器に所定量の硫酸キニーネ溶液を分注す
る（ステップ１０２）。その後続く反応容器２の・列に
対応する試料容器１１から一般検体を分注する動作を始
める（ステップ１０３）。
レータが押すことによって分析動作を開始させる。まず
、分析装置はピペッティング機構１４を動作し、蛍光標
準試料である硫酸キニーネの入った試薬容器１２から第
１番目の反応容器に所定量の硫酸キニーネ溶液を分注す
る（ステップ１０２）。その後続く反応容器２の・列に
対応する試料容器１１から一般検体を分注する動作を始
める（ステップ１０３）。
硫酸キニーネの入った反応容器には基質を含む蛍光発現
性試薬も免疫反応開始試薬も添加されない。この標準試
料の入った反応容器が測光位置２０に到達すると、蛍光
光度計１９によって測光される（ステップ１０４）。測
光時の励起波長は３８０ｎｍであり、蛍光波長は４６０
ｎｍである。
性試薬も免疫反応開始試薬も添加されない。この標準試
料の入った反応容器が測光位置２０に到達すると、蛍光
光度計１９によって測光される（ステップ１０４）。測
光時の励起波長は３８０ｎｍであり、蛍光波長は４６０
ｎｍである。
これらの波長は、いずれの分析項目に対しても同じもの
が適用される。
が適用される。
ステップ１０５においては、標準試料の蛍光強度測定値
があらかじめ定められている設定値より大きいか小さい
かが判定される。標準試料から発せられる蛍光の測定値
が設定値より小さいときには、ステップ１０６に進む。
があらかじめ定められている設定値より大きいか小さい
かが判定される。標準試料から発せられる蛍光の測定値
が設定値より小さいときには、ステップ１０６に進む。
このとき制御装置はピペッティング機構１４および反応
ディスク１を含む各機構部に動作停止の指令を出すので
、分析装置の分析動作が停止され（ステップ１０７）、
同時にＣＲＴ画面には光学系が微量分析に適合しないこ
とを示すアラームが表示される（ステップ１０８）。こ
の場合、分析装置の動作は一旦終了する（ステップ１０
９）。オペレータは、アラーム表示を見て蛍光光度計を
チエツクし、劣化している光源ランプ又は光電検出器を
新しいものと交換して、分析装置の性能を回復させる。
ディスク１を含む各機構部に動作停止の指令を出すので
、分析装置の分析動作が停止され（ステップ１０７）、
同時にＣＲＴ画面には光学系が微量分析に適合しないこ
とを示すアラームが表示される（ステップ１０８）。こ
の場合、分析装置の動作は一旦終了する（ステップ１０
９）。オペレータは、アラーム表示を見て蛍光光度計を
チエツクし、劣化している光源ランプ又は光電検出器を
新しいものと交換して、分析装置の性能を回復させる。
ステップ１０５における判定結果が、設定値よりも標準
試料の蛍光強度の方が大きいのであれば、ピペッティン
グ機構１４により一般検体の分注動作が続行される（ス
テップ１１０）。ブランク測定用反応容器に対しては試
料が分注されないが、蛍光発現性試薬液は一般検体に対
するのと同じ量だけ添加される。一般検体用反応容器に
は、試料容器１１から５０μＱの試料液が分注され、続
いて免疫反応用試薬液２００μαが分注される（ステッ
プ１１１）。免疫反応用試薬としては、例えば酵素で標
識された各分析項目用の抗体を含んだ溶液が用いられる
。
試料の蛍光強度の方が大きいのであれば、ピペッティン
グ機構１４により一般検体の分注動作が続行される（ス
テップ１１０）。ブランク測定用反応容器に対しては試
料が分注されないが、蛍光発現性試薬液は一般検体に対
するのと同じ量だけ添加される。一般検体用反応容器に
は、試料容器１１から５０μＱの試料液が分注され、続
いて免疫反応用試薬液２００μαが分注される（ステッ
プ１１１）。免疫反応用試薬としては、例えば酵素で標
識された各分析項目用の抗体を含んだ溶液が用いられる
。
反応ディスク１上の反応容器２では、３７℃に保温され
た条件下で抗原抗体反応が進行し、ビーズ上に抗原抗体
反応複合物が生成される。この反応容器は反応開始から
３０分後に洗浄装置２５の位置に到達し、ここで未反応
物質を含む液が排出され、５００μＱの洗浄液を加えて
洗浄し、この洗浄後の液も排出される（ステップ１１２
）。洗浄液によるビーズの洗浄は３回繰り返される６一
方、反応容器の列には、一定間隔毎に標準試料用反応容
器および試薬ブランク用反応容器が配置されているので
、ピペッティング機構１４はそれぞれ対応する反応容器
に標準試料液又は蛍光発現性試薬を分注する（ステップ
１１３）。
た条件下で抗原抗体反応が進行し、ビーズ上に抗原抗体
反応複合物が生成される。この反応容器は反応開始から
３０分後に洗浄装置２５の位置に到達し、ここで未反応
物質を含む液が排出され、５００μＱの洗浄液を加えて
洗浄し、この洗浄後の液も排出される（ステップ１１２
）。洗浄液によるビーズの洗浄は３回繰り返される６一
方、反応容器の列には、一定間隔毎に標準試料用反応容
器および試薬ブランク用反応容器が配置されているので
、ピペッティング機構１４はそれぞれ対応する反応容器
に標準試料液又は蛍光発現性試薬を分注する（ステップ
１１３）。
ステップ１１２で洗浄された一般検体用反応容器には、
蛍光発現性試薬がピペッティング機構１４によって分注
される。蛍光発現性試薬としては、基質５０μＱおよび
緩衝液２００μＱが加えられ（ステップ１１４）、３７
℃で３０分間酵素反応が進行される。この例では、４−
メチルウンベリフェリルリン酸塩（４−ｍｅｔｈｙｌｕ
ｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を基
質として用い、酵素としてアルカリフォスファターゼを
用いて酵素反応をさせる。この反応により蛍光物質であ
る４−メチルウンベリフェロンが生成される。
蛍光発現性試薬がピペッティング機構１４によって分注
される。蛍光発現性試薬としては、基質５０μＱおよび
緩衝液２００μＱが加えられ（ステップ１１４）、３７
℃で３０分間酵素反応が進行される。この例では、４−
メチルウンベリフェリルリン酸塩（４−ｍｅｔｈｙｌｕ
ｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を基
質として用い、酵素としてアルカリフォスファターゼを
用いて酵素反応をさせる。この反応により蛍光物質であ
る４−メチルウンベリフェロンが生成される。
ステップ１１５では、測光位置２ｏに位置づけられる反
応容器が標準試料用であるかどうがが判断され、ステッ
プ１１６では、同様に試薬ブランク用反応容器であるか
どうかが判断される。一般検体の反応液に対しては、ス
テップ１１４から１５分後に蛍光強度が測定される（ス
テップ１１７）。
応容器が標準試料用であるかどうがが判断され、ステッ
プ１１６では、同様に試薬ブランク用反応容器であるか
どうかが判断される。一般検体の反応液に対しては、ス
テップ１１４から１５分後に蛍光強度が測定される（ス
テップ１１７）。
反応液中に４−メチルウンベリフェロンが生成される量
は、ビーズ上の抗原抗体反応複合物の量に依存する。
は、ビーズ上の抗原抗体反応複合物の量に依存する。
標準試料用反応容器が測光値１２０に到達したときには
、ステップ１１５からステップ１２２へと進み、硫酸キ
ニーネ溶液に基づく蛍光強度が測定される。この標準試
料測定値に基づく、あらかじめ記憶されている検量線に
対する補正係数が演算され（ステップ１２３）、検量線
の補正（ステップ１２４）に利用される。
、ステップ１１５からステップ１２２へと進み、硫酸キ
ニーネ溶液に基づく蛍光強度が測定される。この標準試
料測定値に基づく、あらかじめ記憶されている検量線に
対する補正係数が演算され（ステップ１２３）、検量線
の補正（ステップ１２４）に利用される。
試薬ブランク用反応容器が測光値＠２０に到達したとき
には、ステップ１１６からステップ１１８へと進み抗原
抗体反応複合物に影響゛されない試薬ブランクの蛍光強
度が測定され、その蛍光強度があらかじめ記憶されてい
る許容値より大きいかどうかが判断される（ステップ１
１９）。試薬ブランク測定値が許容値より大きい場合に
は、蛍光発現性試薬が劣化している旨のアラームがＣＲ
Ｔ＠面に表示される（ステップ１２０）。また、このア
ラームは、ステップ１２６で分析結果を出力する際にも
プリンタからプリントアウトされる。
には、ステップ１１６からステップ１１８へと進み抗原
抗体反応複合物に影響゛されない試薬ブランクの蛍光強
度が測定され、その蛍光強度があらかじめ記憶されてい
る許容値より大きいかどうかが判断される（ステップ１
１９）。試薬ブランク測定値が許容値より大きい場合に
は、蛍光発現性試薬が劣化している旨のアラームがＣＲ
Ｔ＠面に表示される（ステップ１２０）。また、このア
ラームは、ステップ１２６で分析結果を出力する際にも
プリンタからプリントアウトされる。
試薬ブランク測定値が許容値より小さい場合には、後続
して蛍光測光される一般検体の反応液に基づく蛍光強度
測定値が試薬ブランク値によって補正され（ステップ１
２１）、検量線と比較する際に利用される。ステップ１
１９において試薬ブランク値が許容値より大きいときで
も分析装置を停止させずに一般検体の分析動作を続行し
てもよい。ただし、オペレータは、アラーム表示に従っ
て基質溶液を交換する必要がある。
して蛍光測光される一般検体の反応液に基づく蛍光強度
測定値が試薬ブランク値によって補正され（ステップ１
２１）、検量線と比較する際に利用される。ステップ１
１９において試薬ブランク値が許容値より大きいときで
も分析装置を停止させずに一般検体の分析動作を続行し
てもよい。ただし、オペレータは、アラーム表示に従っ
て基質溶液を交換する必要がある。
ステップ１２５では、標準試薬の測定値および試薬ブラ
ンク測定値を用いて補正された検量線から、一般検体の
測定値に対応する成分濃度が計算され、ステップ１２６
で各検体の分析値が出力される。この例では、検量線を
作成した時に測光した標準試料の測定値と、被検試料の
測光の直前で測光した標準試料の測定値との比の値を用
いて検量線自体を補正しているが、これとは別に、被検
試料の測定値をまず補正係数で補正してから当初の検量
線に適合させて分析酸をの濃度を算出してもよい。すべ
ての被検試料の分析動作が終了すれば、分析装置の各機
構部の動作が停止する（ステップ１２７）。
ンク測定値を用いて補正された検量線から、一般検体の
測定値に対応する成分濃度が計算され、ステップ１２６
で各検体の分析値が出力される。この例では、検量線を
作成した時に測光した標準試料の測定値と、被検試料の
測光の直前で測光した標準試料の測定値との比の値を用
いて検量線自体を補正しているが、これとは別に、被検
試料の測定値をまず補正係数で補正してから当初の検量
線に適合させて分析酸をの濃度を算出してもよい。すべ
ての被検試料の分析動作が終了すれば、分析装置の各機
構部の動作が停止する（ステップ１２７）。
実験例
同一のコントロール血清を２０個の反応容器に分注し、
第１図に示すフローに従ってＴ４およびＴＳＨを測定し
た。測定結果を表１に示す。各被検試料の生データをＡ
で示し、その補正後の値をＢで示す。表１の実験時の標
準試料である硫酸キニーネ溶液の測光値は１７０．３
であり、検量線作成時の硫酸キニーネ溶液の測光値は
１６５．４であった６従って補正係数は、 １６５．４
／１７０．３である。
第１図に示すフローに従ってＴ４およびＴＳＨを測定し
た。測定結果を表１に示す。各被検試料の生データをＡ
で示し、その補正後の値をＢで示す。表１の実験時の標
準試料である硫酸キニーネ溶液の測光値は１７０．３
であり、検量線作成時の硫酸キニーネ溶液の測光値は
１６５．４であった６従って補正係数は、 １６５．４
／１７０．３である。
表
示すが、このときの標準試料の測光値は１７５．６であ
った。検量線作成時の硫酸キニーネ溶液の測光値は１６
５．４ であるから、今回の補正係数は１６５．４／１
７５．６である。
った。検量線作成時の硫酸キニーネ溶液の測光値は１６
５．４ であるから、今回の補正係数は１６５．４／１
７５．６である。
表 ２
表１の測定後、同じコントロール血清を１０個の反応容
器に分注し、前回と同様に分析測定した。
器に分注し、前回と同様に分析測定した。
このときの各被検試料の生データをＡ′で示し、その補
正後の値をＢ′で示す。測定結果を表２にＴ４の場合、
表１に基づく補正値の平均値Ｂは３９１．４ であり、
表２に基づく補正値の平均値Ｂ′は３９１．９ であ
った。このことがら同一ランでなくても分析装置のドリ
フｉ−の影響を除くことができ、再現性の良い測定を行
ない得ることがわかった。
正後の値をＢ′で示す。測定結果を表２にＴ４の場合、
表１に基づく補正値の平均値Ｂは３９１．４ であり、
表２に基づく補正値の平均値Ｂ′は３９１．９ であ
った。このことがら同一ランでなくても分析装置のドリ
フｉ−の影響を除くことができ、再現性の良い測定を行
ない得ることがわかった。
次に本発明の第２の実施例について説明する。
免疫分析装置としては第２図の実施例と同じものを用い
た。標１■試料としてローダミンＢ溶液を使用した。標
準試料液の槽は試薬ディスク９に設置した。第１図に示
したのと同様のフローで分析装置を動作させ、Ｔ４およ
びＴ Ｓ Ｈを測定した。ローダミンＢ溶液には蛍光発
現性試薬を一切加えずにローダミンＢ自体による蛍光強
度を測定した。
た。標１■試料としてローダミンＢ溶液を使用した。標
準試料液の槽は試薬ディスク９に設置した。第１図に示
したのと同様のフローで分析装置を動作させ、Ｔ４およ
びＴ Ｓ Ｈを測定した。ローダミンＢ溶液には蛍光発
現性試薬を一切加えずにローダミンＢ自体による蛍光強
度を測定した。
この場合の標準試料に対する励起波長は５５０ｎｍであ
り、蛍光波長は５９０ｎｍである。
り、蛍光波長は５９０ｎｍである。
この第２の実施例についても先の実施例と同様に測定の
再現性を調べた。同じコントロール血：ｉ’？１０個ず
つについて時間を違えて２回測定した。
再現性を調べた。同じコントロール血：ｉ’？１０個ず
つについて時間を違えて２回測定した。
検量線作成時のローダミンＢ標準試料の蛍光強度は４５
１．７ であったが、第１回目のコン１−ロール血清測
定時の標準試料の蛍光強度は４３８．２であり、第２回
目の測定時の標準試料の蛍光強度は４２０．８ であっ
た。標準試料測定値および試薬ブランク測定値を用いて
補正すると、第１回目の測定値の平均が３８２．１ で
あり、第２回目の測定値の平均が３８２．７ となっ
た。標準試料としてローダミンＢを用いても、ドリフト
の影響を除くことができ、バッチ間の差も排除できる。
１．７ であったが、第１回目のコン１−ロール血清測
定時の標準試料の蛍光強度は４３８．２であり、第２回
目の測定時の標準試料の蛍光強度は４２０．８ であっ
た。標準試料測定値および試薬ブランク測定値を用いて
補正すると、第１回目の測定値の平均が３８２．１ で
あり、第２回目の測定値の平均が３８２．７ となっ
た。標準試料としてローダミンＢを用いても、ドリフト
の影響を除くことができ、バッチ間の差も排除できる。
次に５１本発明の第３の実施例について説明する。
免疫分析装置としては、第２図の実施例と同じものを用
いた。この実施例では、標準試料として水を採用した。
いた。この実施例では、標準試料として水を採用した。
第１図と同様のフローで分析装置を動作させ、Ｔ４およ
びＴ Ｓ Ｈを４Ｉｑ定した。この例でも蛍光発現性試
薬を一切加えず、水内体の蛍光強度を測定した。標塾試
料としての水に対する励起波長は３８０ｎｍであり、蛍
光波長は４７０ｎｍを用いた。
びＴ Ｓ Ｈを４Ｉｑ定した。この例でも蛍光発現性試
薬を一切加えず、水内体の蛍光強度を測定した。標塾試
料としての水に対する励起波長は３８０ｎｍであり、蛍
光波長は４７０ｎｍを用いた。
この第３の実施例についても測定の再現性を調べた。同
じコントロール血清について１０個ずつ時間を違えて２
回測定した。検量線作成時の水標準試料の蛍光強度は９
５．５６ であった。コン１−ロール血清測定の際の水
標準試料の蛍光強度は、第１回目が９３．２４ であり
、第２回目が９１．７３であった。これらの値によって
Ｔ番およびＴＳＨの測定値を補正すると、Ｔ４の場合は
、第１回目の平均値が３９３．０ であり、第２回目の
平均値が３９１．０ であった。またＴ Ｓ Ｉ−Ｉの
場合は、第１回目の平均値が２８９．７ であり、第２
回目の平均値が２８９．６であった。
じコントロール血清について１０個ずつ時間を違えて２
回測定した。検量線作成時の水標準試料の蛍光強度は９
５．５６ であった。コン１−ロール血清測定の際の水
標準試料の蛍光強度は、第１回目が９３．２４ であり
、第２回目が９１．７３であった。これらの値によって
Ｔ番およびＴＳＨの測定値を補正すると、Ｔ４の場合は
、第１回目の平均値が３９３．０ であり、第２回目の
平均値が３９１．０ であった。またＴ Ｓ Ｉ−Ｉの
場合は、第１回目の平均値が２８９．７ であり、第２
回目の平均値が２８９．６であった。
次に、本発明の第４の実施例について説明する。
この第４の実施例では、蛍光発現性試薬として基質を用
いずに、抗体感作したリポソームを使用した。ここでは
、測定項目がＴＳＨの例を説明する。
いずに、抗体感作したリポソームを使用した。ここでは
、測定項目がＴＳＨの例を説明する。
第２図と同様の分析装置を用い、試薬ディスク９には硫
酸キニーネ標準試料および蛍光マーカとしてＦＩＴＣの
封入されたリポソームの分散液をセットした。リポソー
ムの表面には抗Ｔ Ｓ Ｉ−１抗体が結合されている。
酸キニーネ標準試料および蛍光マーカとしてＦＩＴＣの
封入されたリポソームの分散液をセットした。リポソー
ムの表面には抗Ｔ Ｓ Ｉ−１抗体が結合されている。
第５図に示すように、反応容器２内に入れられたビーズ
５０の表面には、抗ＴＳＨ抗体が結合されている。試料
ディスク８には１０個のコントロール血清をセットした
。あらかじめ作成した検量線の例を第６図に示す。
５０の表面には、抗ＴＳＨ抗体が結合されている。試料
ディスク８には１０個のコントロール血清をセットした
。あらかじめ作成した検量線の例を第６図に示す。
分析装置の動作は、第１図のステップ１０１からステッ
プ１１３までが同じである。硫酸キニネ標準試料に対す
るステップ１０５の判定は、設定値より大であった。反
応容器２にコントロール血清が添加されると、この血清
試料中の抗原５３（ＴＳＨ）がビーズ５ｏ上の抗体と結
合され、抗原抗体反応複合物５４が生成される。次いで
、抗体感作リポソーム５５を含む試薬が添加される。
プ１１３までが同じである。硫酸キニネ標準試料に対す
るステップ１０５の判定は、設定値より大であった。反
応容器２にコントロール血清が添加されると、この血清
試料中の抗原５３（ＴＳＨ）がビーズ５ｏ上の抗体と結
合され、抗原抗体反応複合物５４が生成される。次いで
、抗体感作リポソーム５５を含む試薬が添加される。
免疫反応開始から３０分後に、洗浄装置２５によって反
応容器内の未反応の試薬および試料が除去され、洗浄後
反応容器に界面活性剤を含む！１衝液が５００μＱ添加
される。これによりリポソーム５５の膜が破壊されて封
入されていたＦＩＴＣが外部に流出する。このような反
応液を含む反応容器が測光位置２０に位置づけられ、蛍
光測光される。
応容器内の未反応の試薬および試料が除去され、洗浄後
反応容器に界面活性剤を含む！１衝液が５００μＱ添加
される。これによりリポソーム５５の膜が破壊されて封
入されていたＦＩＴＣが外部に流出する。このような反
応液を含む反応容器が測光位置２０に位置づけられ、蛍
光測光される。
標僧試料による補正および試薬ブランクの補正は、第１
図のフローと同様である。標準試料の蛍光測光に基づく
検量線の補正係数は、１６５．４／１７５．４’ｔ’あ
った。Ｔ Ｓ Ｈを分析した１０個の測定値の平均蛍光
強度は２７０．２ であったが、補正後の値は２５４．
８ となった。
図のフローと同様である。標準試料の蛍光測光に基づく
検量線の補正係数は、１６５．４／１７５．４’ｔ’あ
った。Ｔ Ｓ Ｈを分析した１０個の測定値の平均蛍光
強度は２７０．２ であったが、補正後の値は２５４．
８ となった。
以上説明したように本発明によれば、信頼性の高い測定
結果が得られる。
結果が得られる。
第１図は本発明の一実施例を説明するための動作フロー
図、第２図は本発明の一実施例を実行する免疫分析装置
の概略平面図、第３図はＴ４の検量線例を示す図、第４
図はＴＳＨの検量線例を示す図、第５図は本発明の第４
の実施例における反応を説明するための模式図、第６図
は本発明の第４の実施例で使用されたＴＳＨの検量線例
を示す図である。 ２・・・反応容器、１１・・・試料容器、１２・・・試
薬容器、１４・・・ピペッティング機構、２０・・・測
光位置、２５・・・洗浄装置、５０・・・ビーズ、５５
・・・リポソーム。 躬３凹 Ｔ４ 濃度 （潟／ムノ 本６目 ＴＳＨ（メ”Ｕ／ｍｉ）
図、第２図は本発明の一実施例を実行する免疫分析装置
の概略平面図、第３図はＴ４の検量線例を示す図、第４
図はＴＳＨの検量線例を示す図、第５図は本発明の第４
の実施例における反応を説明するための模式図、第６図
は本発明の第４の実施例で使用されたＴＳＨの検量線例
を示す図である。 ２・・・反応容器、１１・・・試料容器、１２・・・試
薬容器、１４・・・ピペッティング機構、２０・・・測
光位置、２５・・・洗浄装置、５０・・・ビーズ、５５
・・・リポソーム。 躬３凹 Ｔ４ 濃度 （潟／ムノ 本６目 ＴＳＨ（メ”Ｕ／ｍｉ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、反応容器内において被検試料の抗原抗体反応複合物
の生成量に応じた蛍光性物質を出現させ得る反応系を用
い、上記反応容器中の反応液の蛍光強度を蛍光光度計で
測定する免疫分析方法において、蛍光標準試料を反応容
器に加え、この反応容器に収容されている標準試料の蛍
光強度を測定すること、および上記標準試料の蛍光強度
測定値があらかじめ記憶されている設定値より大きいと
きには分注装置による反応容器列への被検試料の分注動
作を続行せしめ、上記標準試料の蛍光強度測定値が上記
設定値より小さいときには上記分注装置の分注動作を停
止せしめること、を含むことを特徴とする免疫分析方法
。 ２、特許請求の範囲第１項記載の方法において、被検試
料が収容されている反応容器に蛍光発現性試薬を加えて
生じた蛍光性物質に基づく蛍光強度を測定し、被検試料
に基づく第１の蛍光測定値を得ること、複数の被検試料
の分析動作の途中で蛍光標準試料を反応容器に加えて蛍
光強度を測定し、標準試料に基づく第２の蛍光測定値を
得ること、および上記第２の蛍光測定値に基づいて上記
第１の蛍光測定値を補正するか又はあらかじめ求めてあ
る検量線を補正することによつて対応する被検試料中の
成分濃度を算出すること、を含むことを特徴とする免疫
分析方法。 ３、特許請求の範囲第２項記載の方法において、上記蛍
光標準試料は化学的に安定な物質からなり、上記蛍光標
準試料は上記蛍光発現性試薬が加えられることなく蛍光
強度を測定されることを特徴とする免疫分析方法。 ４、特許請求の範囲第１項記載の方法において、複数の
被検試料の分析動作の途中で反応容器に試薬のみを加え
て蛍光強度を測定し試薬ブランクの蛍光測定値を得るこ
と、および上記試薬ブランクの蛍光測定値があらかじめ
設定されている許容値より大きいときには試薬劣化のア
ラームを出すことを特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (4)
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| JP63210741A JP2656564B2 (ja) | 1988-08-26 | 1988-08-26 | 免疫分析方法 |
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| EP89115739A EP0355849B1 (en) | 1988-08-26 | 1989-08-25 | Method and apparatus for automatic measurement of fluorescence |
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Publications (2)
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| JP2656564B2 JP2656564B2 (ja) | 1997-09-24 |
Family
ID=16594346
Family Applications (1)
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| JP (1) | JP2656564B2 (ja) |
| DE (1) | DE68916132T2 (ja) |
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