JPH02178284A - ホリニン酸の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＮ５−ホルミル−（６Ｒ，５）−５，６，７，
８−テトラヒドロ葉酸（５−ＣＩＯ−（６Ｒ，５）−Ｔ
ＩＩＦ　、略してホニリン酸と呼ぶ）を分離し、Ｎ５−
ホルミル−（６Ｓ）−５，６，７゜８−テトラヒドロ葉
酸（５−ＣＨＯ−（６Ｓ）−ＴＨＦ、生化学的に活性な
シトロボルム−因子（＝リューコストツクーシトロボル
ムに関する増殖因子）〕を単離する方法に関する。

ホリニン酸は２個の不斉中心を有する。その際葉酸、す
なわちト（プテロイル）−Ｌ−グルタミン酸からホリニ
ン酸を合成することに基づきグルタミン酸−残基中に含
有する光学的に活性なＣ−原子はＬ−型で存在する。一
方プテロイルー残基の５．６−位にある二重結合を水素
化することによって生じる光学的に活性なＣ−原子ば６
−位にラセミ性の（６Ｒ，Ｓ）型で存在する。したがっ
て合成ホリニン酸（＝ロイコボリン）は２個のジアステ
レオマーの１：１−混合物から成る。

自然に存在するものの中で、たとえば肝臓中にホリニン
酸が（６Ｓ）−型で５−ＣＩ（０−（６Ｓ＞−ＴＨＦと
してのみ存在する。５−ＣＩＩＯ−（６Ｒ，５）−ＴＩ
ＩＦ　（ホリニン酸）をそのカルシウム塩（ロイコボリ
ンカルシウム）の形で巨大赤芽球性葉酸欠乏−貧血の処
置用薬剤として、癌治療（ロイコボリン救済）に於ける
葉酸−拮抗剤、特にアミノプテリン、メトトレキセート
及びフルオルウラシルの相容性の増強用及び自己免疫疾
患、たとえば乾宿及びリュウマチ性関節炎の処置の増強
用解毒剤として並びに特定の駆虫剤。

たとえば化学療法に於けるトリメトプリム−スルファメ
トキサゾールの相容性の増強用解毒剤として使用する。

５−ＣＨＯ−（６Ｒ，５）−ＴＩ印の投与後、このジア
ステレオマー混合物の（６Ｓ）一部分を急速に５−Ｍｅ
−（６Ｓ）　−ＴＩＩＦに変え、一方（６Ｒ）一部分は
物質代謝せず、徐々に尿によって排泄される：　Ｊ、Ａ
、ストロ−（Ｓｔｒａｗ）等、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　４４．３１１４　３１１９（１９
８４）。

Ｆ、Ｍ、シロトナク（Ｓｉｒｏｔｎａｋ）等、生化学的
薬物学堕、　２９９３−９７（１９７９）には、Ｌ１２
１０の培養でメトトレキセートによる細胞増殖阻害の抑
制にホリニン酸の自然に存在しないジアステレオマー（
５−ＣＨＯ−（６Ｒ）−ＴＨＦ）は１００倍、そして化
学的に合成されたジアステレオマー混合物（５−ＣＩＩ
Ｏ−（６Ｒ，５）−ＴＨＦ）は２倍自然に存在するジア
ステレオマー（５−ＣＨＯ−（６Ｓ）　−ＴＨＦ　）に
比して有効性が少ないことが記載されている。

Ｃ，テンプル（Ｔｅｍｐｌｅ）等、癌治療リポート卵。

１１１７−９（１９８１）は、この試験管内で測定され
た結果を生体内で確認し、天然ジアステレオマーはメト
トレキセートの毒性の減少に関してジアステレオマーの
混合物〔ロイコボリン〕に比して２倍以上有効であるこ
とが分った。

この著者は自然に存在しないジアステレオマーの可能な
有害作用さえも推定している。

すなわち５−ＣＩＩＯ−（６Ｒ）−ＴＩＩＦはいくつか
の、Ｃ１−転移の原因となっている酵素及び同時にテト
ラヒドロホラートの生化学的作用を阻害する：Ｒ，Ｐ、
リーニイ（Ｌｅａｎｙ）等、旧ｏｃｈｅｔａ、ＢｉｏＨ
Ｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｓｍｕｎ、　　５６．４８４（１９７３
）；　Ｇ、に、スミス（Ｓｗｉ　ｔｈ）等、生化学、　
２０．４０３４（１９８１）、　したがって（６Ｒ，Ｓ
）−テトラヒドロホラートの代りに（６Ｓ）　−テトラ
ヒドロホラートの使用は２倍の有効性と共に質的な治療
上の利点も示さねばならなかった。

したがって従来使用されるジアステレオマーのｌ：ｌ−
混合物を自然に存在する有効物質（５−ｃｕｏ−（６Ｓ
）　−ＴＨＦ　）に代えることが必要となる。

５−ＣＨＯ−（６Ｒ，５）−ＴＨＦの分離及び５−ＣＩ
ＩＯ−（６Ｓ）−ＴＨＰの不斉合成に数倍の努力が払わ
れている。

Ｄ、コスリヒ（Ｃｏｓｕｌｉｃｈ）等、Ｊ、　Ａｍｅｒ
、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ。

７４、４２１５−１６（１９５２）、米国特許第２．６
８８．０１８号明細書（３１，０８，１９５４）では、
たとえば水性溶液から５−ＣＩＩＯ−（６Ｒ，５）−Ｔ
ＩＩＦのアルカリ土類塩、たとえばカルシウム−又はス
トロンチウム塩の分別結晶による分離を行うことが試み
られている（Ｊ、Ｃ，ホンテシラーキャンプ（Ｆｏｎｔ
ｅｃｉｌｌａ−Ｃａｍｐｓ等、Ｊ、　Ａａ＋ｅｒ。

Ｃｈｅｎ＋、　Ｓｏｃ、　１０１．６１１４（１９７９
）も参照）。

しかし口、コスリヒ等に開示された条件下で所望される
分離は、実際に行うことができない。たとえば５−ＣＨ
Ｏ−（６Ｒ，５）−Ｔ）ＩＰのカルシウム塩を水からｐ
Ｈ７−８で結晶化した場合、常に再び６Ｒ，Ｓ−型が得
られる。たとえばこれはキラルＨＰＬＣ−カラムのクロ
マトグラフィー分析によって並びに旋光度によって定量
的に検出することができる。その際５−ＣＨＯ−（６Ｒ
，５）−ＴＩＩＰの粗製又は純粋なカルシウム−塩を結
晶化に使用するかどうかは重要でなく、常に（６Ｒ，Ｓ
）−型を保持する。５−ＣｔｌＯ−（６Ｒ，５）−ＴＩ
Ｐのアルカリ土類塩−過飽和水性溶液に純正な５−ＣＩ
ＩＯ−（６５）−ＴＨＦのアルカリ土類塩を結晶種とし
て加えた場合、（６Ｓ）−型の分離及び増加を達成する
こともできない。

ジアステレオマ一対の分離をクロマトグラフィーによっ
ても実施する：Ｊ、　Ｆｅｅｎｅｙ（フェネイ）等、生
化学創、１８３７（１９８１）。更に（６Ｓ）−異性体
をジヒドロホラート・リダクターゼ（Ｒｅｄｕｋｔａｓ
ｅ）の存在下にジヒドロホラートの立体特異的還元によ
って製造する：Ｌ６リース（Ｒｅｅｓ）等、テトラヘド
ロｙ４２．１１７（１９８６）。

し、リース（Ｒｅｅｓ）等、Ｊ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｓ
ｏｃ、、　ＣｈｅＩｌｌ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　１９Ｂ７．４７０．　　ヨーロッパ特
許公開第０２６６０４２号明細書には、５−ＣＨＯ−（
６Ｓ）−ＴＨＦ及び５−ＣＨＯ−（６Ｒ）−Ｔ旺が少量
で製造することができる（６Ｒ，５）−ＴＨＦの分離法
が記載されている。この方法は（６Ｒ，５）−ＴＨＦと
（−）−メチルークロルホルミアートとを反応させてジ
アステレオマー５−　（−）−メチルオキシカルボニル
−テトラヒドロ葉酸となし、これをｎ−ブタノールでく
り返し処理して分離し、得られたジアステレオマーを臭
化水素の飽和溶液と共にギ酸と酢酸とから成る混合物中
で加熱し、この際加水分解後５−ホルミル−（６Ｓ）−
及び（６Ｒ）−Ｔ肝を形成し、最後にこれをカルシウム
塩として単離することにある。

この方法は煩雑かつ困難であり、キラル試剤の製造に高
毒性ホスゲンが必要である。更に原料（６Ｒ，５）−Ｔ
ＩＩＰは極めて不安定である。キラル補助基をＨＢｒで
＾ｃｏｌｌ中で〉５０°Ｃで離脱した場合、グルタミン
酸の一部を離脱し、困難にしか分離されない副生成物を
生じる。この様な方法に従って製造された（６Ｓ）−ホ
リニン酸は高価なので、（１？、Ｓ）−テトラヒドロホ
ラートの代りにほとんど使用されない。

したがって今日まで（６Ｓ）−テトラヒドロホラートの
有用な製造方法は知られていない。

したがって以前として簡単に、工業的に使用できる、５
−ＣＩＩＯ−（６Ｓ）−Ｔ旺の製造方法を見い出すこと
が課題である。

今や驚くべきことに本発明者は、（６Ｒ，Ｓ）−ホリニ
ン酸（５−ＣＩＩＯ−（６Ｒ，Ｓ）　−ＴＨＦ　）の塩
の水性溶液から無機又は有機酸の水溶性アルカリ−、ア
ンモニウム−又はアルカリ土類塩の添加後対応するホリ
ニン酸塩を析出させ、これが極めて主に自然に存在しな
いジアステレオマー（６Ｒ）−ホリニン酸塩〔５−ＣＨ
Ｏ−（６Ｒ）　−ＴＩＩＦ　）から成ることを見い出し
た。これは濾過によって分離することができる。主に所
望される、自然に存在する（６Ｓ）・−ホリニン酸塩を
含有する濾液から水と混和しうる有機溶剤、たとえばエ
タノール又はアセトン及び（又は）水溶性アルカリ土類
塩の添加によ、って（６Ｓ）−ホリニン酸塩を単離する
ことができる。次いでこれから（６Ｒ）　−ホリニン酸
塩の残部を再結晶によって除くことができる。

゛アンモニウム塩”とはこの場合及び以下に於て非置換
又は１ないし４回置換されたアンモニウム塩を意味し、
専らピロリジニウム−、ピペリジニウム−及びモルホリ
ニウム−塩である。Ｗ換基として特にＣ−原子数１〜４
のアルキル−又はヒドロキシアルキル基又はベンジル基
が挙げられる。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸塩のアルカリ土類塩の分離は
、この処理によれば中性ｐｌ＋でしか作用しない。アル
カリ性媒体（ｐＨ＞８）からＰＣＴ／ヨーロッパ特許出
願８８／’００３４１（ＷＯ８８１０８８４４として１
９８８年１１月１７日に公開）中に記載された方法と同
様に先ず主に（６Ｓ）　−ホリニン酸アルカリ土類塩を
析出させる。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸アルカリ塩を分離する場合、
アルカリハロゲニドの添加後はぼ中性で及びアルカリ性
媒体から最初に（６Ｒ）−ホリニン酸が析出する。

ジアステレオマーの分離すべき混合物のカチオン及び有
機又は低級有機酸のアルカリ−、アンモニウム−又はア
ルカリ土類塩のカチオンは一致する必要はないし、一般
に合目的的でない。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸塩のアルカリ土類塩の溶液少
量にほぼ中性ｐＨで水溶性アルカリハロゲニド、たとえ
ばヨウ化ナトリウムを加えた場合、先ず対応する（６Ｒ
）−ホリニン酸アルカリ土類塩が析出する。

（６Ｒ，Ｓ）−ホニリン酸アルカリ塩の溶液にほぼ中性
ｐＨで水溶性アルカリ土類塩を加えた場合、同様なこと
が生じる。先ず対応する（６Ｒ）−ホリニン酸アルカリ
土類塩が析出する。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸アルカリ塩の溶液に無機酸の
可溶性アルカリ塩を加えた場合、往々にして有機溶剤、
たとえばメタノール、エタノール、イソプロパツール又
はアセトンの添加直後先ず対応する（６Ｒ）−ホリニン
酸アルカリ塩が析出する。

母液から（数種の）有機溶剤の添加によって、（６Ｓ）
−ホリニン酸アルカリ塩を析出させることができる。し
かし母液から水溶性アルカリ土類塩の添加によって対応
する（６Ｓ）−ホリニン酸アルカリ土類塩を析出させる
ことができる。その際溶液のｐＨが８に上昇するのは不
都合ではない。

無機又は有機酸の水溶性アルカリ−又はアンモニウム塩
の必要量は、比較的高い、これは使用される（６Ｒ，Ｓ
）−ホリニン酸塩の重量に対してほぼ０．５〜１０倍、
好ましくは１〜５倍の重量である。

水溶性アルカリ土類塩を極めて僅かな量で必要とする。

一連の試験によって求められうる最適の条件を維持した
場合、（６Ｒ）−ホリニン酸塩が光学的に実質上純粋な
形でかつ高収率で析出する。この様な条件下で母液は夫
々はんの僅かな（６Ｒ）−ホリニン酸塩しか含有しない
。したがって引き続きたとえば有ａ溶剤又はアルカリ土
類塩の添加によって析出する（６Ｓ）−ホリニン酸塩は
、７０ないし約９５％の（６Ｓ）−割合を有する。この
様な（６Ｓ）−型で著しく富んだホリニン酸塩から、付
随する（６Ｒ）−ホリニン酸塩を再結晶によって完全に
除くことができる。

しかしく６Ｓ）−ホリニン酸塩の含有率がほぼ６０％又
はそれ以下でしかない場合、再結晶によって（６Ｒ，Ｓ
）−型のラセミ体が再び形成され、過剰の（６Ｓ）−型
は溶解する。

この方法は簡単であり、最適な処理法でも極めて効果的
である。

本発明の対象は、（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸の塩の水性
溶液に無機又は有機酸の水溶性アルカリ−、アンモニウ
ム−又はアルカリ土類塩を加え、析出する（６Ｒ）−ホ
リニン酸塩を濾去し、濾液から（６Ｓ）　−ホリニン酸
塩を単離することを特徴とする、（６Ｒ９Ｓ）−ホリニ
ン酸塩の分離方法である。

（６Ｓ）−ホリニン酸塩の単離は、（６Ｓ）−ホリニン
酸塩を濾液から水と混和しうる有機溶剤及び（又は）好
ましくは水溶性アルカリ土類塩の添加によって析出させ
、濾過し、場合により再結晶することによって行われる
。

出発化合物として特に適する（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸
の塩は、ナトリウム−、カリウム−、カルシウム−、マ
グネシウム−、ストロンチウム−又はバリウム−塩であ
る。ナトリウム−１特にカルシウム−及びマグネシウム
−塩が好ましい。というのはこれを分離、単離及び精製
を行った後にそのまま薬剤として使用するからである。

対応する塩を基体とする無機又は有機酸は強酸であるの
が好ましい、この場合有機酸はＣ−原子１〜４個を含有
するのが好ましい。

無機酸として次のものが挙げられる：ヨウ化水素酸、臭
化水素酸、塩化水素酸、硝酸及び有機酸として次のもの
が挙げられる：ギ酸、乳酸、クエン酸、メタンスルホン
酸。

水溶性アルカリ−、アンモニウム−又はアルカリ土類塩
としてハロゲン化物、特にヨウ化物及び臭化物が極めて
適する。詳しくは次のものが好ましい：ヨウ化ナトリウ
ム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化カリウム
、臭化カリウム、塩化カリウム、ヨウ化アンモニウム、
臭化アンモニウム、塩化アンモニウム、ヨウ化カルシウ
ム、臭化カルシウム、塩化カルシウム、臭化マグネシウ
ム、塩化マグネシウム、臭化ストロンチウム、塩化スト
ロンチウム、ヨウ化バリウム、臭化バリウム、塩化バリ
ウム。

水溶性アルカリ土類塩、好ましくはヨウ化カルシウム、
臭化カルシウム、塩化カルシウム、臭化マグネシウム又
は塩化マグネシウムを（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸アルカ
リ塩の溶液に添加するのが有利である。

しかし本発明による分離は、他の水溶性アルカリ−、ア
ンモニウム−及びアルカリ土類塩、たとえば亜硝酸ナト
リウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸アンモニウム、ギ酸ナ
トリウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸
カルシウム又はエタンスルホン酸ナトリウムの添加によ
っても行われる。

（６Ｓ）−ホリニン酸塩を単離するための、水と混和し
うる有機溶剤として、低級アルコール、たとえばメタノ
ール、エタノール、ｎ−プロパツール、イソプロパツー
ル、グリコールエーテル、たとえば２−メトキシエタノ
ール、２−エトキシエタノール、２−ブチルオキシエタ
ノール、１−メトキシ−２−プロパツール、１．２−ジ
メトキシエタン、１．２−ジェトキシエタン、更にジオ
キサン、テトラヒドロフラン、低級ケトン、たとえばア
セトン、メチルエチルケトン、メトキシアセトン、１．
３−ジメトキシアセトン並びにアセトニトリルが適する
。低級アルコール又はケトン、特にメタノール、エタノ
ール、イソプロパツール及びアセトンが好ましい。

対応する（６Ｓ）−ホリニン酸塩を析出するための水溶
性アルカリ土類塩としてアルカリ土類金属のハロゲン化
物、たとえば塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化
カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、塩
化ストロンチウム、臭化ストロンチウム又はハロゲン化
バリウムが適する。

この目的に塩化カルシウム及び−マグネシウムが好まし
い。

したがって本発明は、（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸のアル
カリ−又はアルカリ土類塩として好ましくはナトリウム
−、カルシウム−又はマグネシウム塩、無機酸の水溶性
塩として好ましくはハロゲン化ナトリウム、−カリウム
又は−アンモニウム、特にヨウ化ナトリウム、臭化ナト
リウム、塩化すＩ・リウム、ヨウ化カリウム、臭化カリ
ウム、塩化カリウム、ヨウ化アンモニウム、臭化アンモ
ニウム及び（又は）塩化アンモニウム及び対応する（６
３）　−ホリニン酸を析出するための有機溶剤として好
ましくは低級アルコール又は低級ケトン及び（又は）水
溶性アルカリ土類塩としてハロゲン化カルシウム又は−
マグネシウムを使用することを特徴とする。

本発明を次の例によって説明する。

例１ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムの分離及び（６Ｒ
）−ホリニン酸カルシウム及び（６Ｓ）−ホリニン酸カ
ルシウムの単離。

純粋な（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム５０ｇを水
５００ｄ中に溶解し、ヨウ化ナトリウム１００ｇを加え
る。溶液のｐＨを７．０に調整する。次いで溶液を撹拌
下に１°Ｃに冷却する。溶液のｐＨは約７．７に上昇す
る。１５−２０時間後、析出した生成物を濾過し。

水性濃ヨウ化ナトリウム溶液で、次いでエタノールで洗
滌する。

（６Ｒ）−含有率９８．１％を有する（６Ｒ）−ホリニ
ン酸カルシウムが得られる（ＩＩＰＬｃによってキラル
カラム（レゾルポジルーＢＳ＾−７）の使用下に測定）
。塩化カルシウムの存在下に水から再結晶した後、（６
Ｒ）−含打率１００％を有する純粋（６Ｒ）−ホリニン
酸カルシウムが得られる。

比旋光度〔α］　ｏ　ｔ０＝　＋４３．７°（無水Ｃａ
−塩に対して） 水中での溶解度：２０°Ｃで：　２０ｇ／１００　ｙｒ
ｌ濾液にエタノールを加え、撹拌下３℃に冷却する。約
１５−２０時間後、析出した生成物を濾過し、エタノー
ルで洗滌する。８４％（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウム
及び１６％（６Ｒ）−ホリニン酸カルシウムを含有する
ホリニン酸カルシウムが得られる。

塩化カルシウムの存在下に水から再結晶して、それから
（６Ｓ）−含有率９７．６％を有する（６Ｓ）−ホリニ
ン酸カルシウムが得られる。更に再結晶した後に（６Ｓ
）−含有率は２９９．５％である。

比旋光度：　（α）　ｏ　”＝　　１５’ｃ　（無水Ｃ
ａ−塩に対して） 例２ （６Ｒ，Ｓ）−ホニリン酸の分離及び（６Ｒ）−ホリニ
ン酸ナトリウム及び（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムの
単離。

（６Ｒ，Ｓ）−ホニリン酸２５ｇを水７０ｇ１中に懸濁
し、２Ｎ苛性ソーダ溶液４９ｄの添加により溶解する。

この溶液に塩化ナトリウム４０ｇ及びヨウ化ナトリウム
１４０ｇを加える。ゼリー状析出物が生じる。これを２
〜３時間後濾過し、メタノールで洗滌する。

（６Ｒ）−含有率９９％を有する光学的に純粋な（６Ｒ
）−ホリニン酸ナトリウムが得られる。

母液に塩化カルシウム２５ｇを加え、ｐＨ８，５に調整
する。その後徐々に（６Ｓ）−含有率７８％を有する（
６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムが析出する。この粗製（
６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムを３０−３５°Ｃで水に
溶解し、活性炭及び濾過助剤（商品名ゾルカホロク（Ｓ
ｏｌｋａｆｌｏｃ））を加え、濾過し、１０％の濃度に
蒸発し、５〜１°Ｃで結晶化する。（６Ｓ）−含有率は
ぼ９８％を有する（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムが得
られる。

例３ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸の分離及び（６Ｒ）−ホリニ
ン酸ナトリウム及び（６Ｓ）−ホリニン酸マグネシウム
の単離。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸２５ｇを水７５ｍ！中に懸濁
し、５Ｎ水性酸化ナトリウムの添加によって溶解する。

弱アルカリ性溶液に撹拌下に臭化ナトリウム７５ｇを、
その後メタノール２００Ｉｎｌを加える。２週間後徐々
に（６Ｒ）−ホリニン酸ナトリウムが晶出する。

この生成物を濾過し、メタノールで洗滌し、乾燥する。

（６Ｒ）−含有率９８％を有する光学的に実質上純粋な
（６Ｒ）−ホリニン酸ナトリウムが得られる。

比旋光度〔α）　Ｄ　７’＝＋３９．５’　　（無水Ｎ
ａ−塩に対して、Ｃ−水中で１％） 母液からメタノールを除き、ｐｌ＋９．８に調整し、塩
化マグネシウム２５ｇを加え、徐々に撹拌する。

しばらくの後に（６Ｓ）−ホリニン酸マグネシウムが徐
々に晶出する。約１００時間抜濾過し、エタノールで洗
滌し、乾燥する。（６Ｓ）−含有率８５％。塩化マグネ
シウムの存在下に再結晶して光学的に純粋な（６Ｓ）−
ホリニン酸マグネシウムが得られる。

例４ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸ナトリウムの分離及び２つの
ジアステレオマーの単離。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸２５ｇを水７５ｄ中に５Ｎ水
性水酸化ナトリウムの添加によって溶解し、２０°Ｃで
ヨウ化ナトリウム１４０ｇを加え、撹拌下５°Ｃに冷却
する。

一晩放置後、析出した（６Ｒ）−ホリニン酸ナトリウム
を濾過し、アセトンで洗滌する。得られた生成物は（６
Ｒ）−割合８２．９％を有する。

−緒にされた母液にアセトン６００ｍｆ！を加え、０℃
で撹拌する。生じた析出物を濾過する。これは主として
（６Ｓ）−割合７１％を有する（６Ｓ）−ホリニン酸ナ
トリウムから成る。

例５ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムをほぼ中性媒体中
でヨウ化アンモニウムの添加によって分離。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム５０ｇ及びヨウ化
アンモニウム１００ｇを水５００ｄ中に３６℃に溶解す
る。

溶液はｐＨ７，７，を存する。徐々に撹拌下に室温に冷
却し、一定の撹拌下に更に５°Ｃに、次いでＯ−２°Ｃ
に冷却し、この溶液に結晶種として純粋な（６Ｒ）　−
ホリニン酸カルシウム数ｍｇを添加し、その後結晶が開
始する。

その際晶出された、主として（６Ｒ）−ホリニン酸カル
シウムから成る生成物を濾過し、エタノールで洗浄し、
乾燥する。（６Ｒ）−ホリニン酸塩含有率：９８％。

濾液を洗滌−溶液と一緒にし、撹拌下に付加的に１２エ
タノールを加える。

徐々に析出する、主に（６Ｓ）−ホニリン酸カルシウム
から成る分画を濾過し、エタノールで洗滌し、乾燥する
。（６Ｓ）−ホニリン酸塩含有率は９６％である。

得られた粗製（６Ｒ）−ホリニン酸カルシウム及び（６
Ｓ）−ホリニン酸カルシウムを夫々少量の水から活性炭
及び濾過助剤の添加下に際結晶する。それによって（６
Ｒ）−又は（６Ｓ）−ホリニン酸塩の含有率は９９．５
−９９．７％に増加する。

例６ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムをほぼ中性媒体中
で臭化ナトリウムの添加によって分離し、次いで（６Ｓ
）−ホリニン酸カルシウムをＣａＣ１□の添加によって
単離。

水５００１１１ｉ！中に（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カル
シウム５０ｇに臭化ナトリウム７５ｇを加える。溶液の
ｐ旧よ７．４である。撹拌下に３５°Ｃから１−３°Ｃ
に冷却し、その後徐々に結晶化が開始する。

結晶を濾過し、メタノールで洗滌する。得られた（６Ｒ
）−ホリニン酸カルシウムから成る結晶は、（６Ｒ）−
含有率９３％を有する。濾液に塩化カルシウム１００ｇ
を加え、その後（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムが析出
する。これを濾過し、エタノールで洗滌する。得られた
（６Ｓ）−ホリニン酸Ｃａは（６Ｓ）−含有率８４％を
有する。塩化カルシウムの存在下に少量の水から際結晶
して、良好な収率で（６Ｓ）−含有率９９．６％を有す
る純粋（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムが得られる。

例７ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムをほぼ中性媒体中
で臭化アンモニウムの添加によって分離する。

水５００ｄ中の（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム５
０ｇに臭化アンモニウム７０ｇを加える。溶液のｐｉ（
は６．５である。得られた溶液を撹拌下でＯ″Ｃに冷却
し、純正な（６Ｒ）−ホリニン酸Ｃａを結晶種として加
える。

徐々に結晶化が開始する。上澄液のＣａ−（６Ｓ）−含
有率はもはや増加しない、すなわち（６Ｒ）−ホリニン
酸Ｃａのそれ以上の量が全く析出しなくなってから、濾
過し、メタノール及びエタノールで洗滌する。

得られた（６Ｒ）−ホリニン酸Ｃａは（６Ｒ）−含有率
９３．８％を有する。濾液に塩化カルシウム１００ｇを
加え、ｐＨ７に調整する。その後徐々に（６Ｓ）−ホリ
ニン酸Ｃａが析出する。得られた生成物を濾過し、エタ
ノールで洗滌する。（６Ｓ）−ホリニン酸Ｃａの含有率
は９８．７％である。塩化カルシウムの存在下に再結晶
して、これから純粋な（６Ｓ）−ホリニン酸Ｃａが得ら
れる。

例８ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムをヨウ化カリウム
の添加によって分離。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム５０ｇに水５００
Ｉｄ及びヨウ化カリウム１１０ｇを加え、５５℃で溶解
する。

得られた溶液（ｐＨ７，１）を撹拌下で徐々に０°Ｃに
冷却し、純正の（６Ｒ）−ホリニン酸Ｃａを結晶種とし
て加える。−晩放置後、析出した結晶を濾過し、少量の
ヨウ化カリウム溶液で、次いでエタノールで洗滌する。

得られた（６Ｒ）−ホリニン酸Ｃａは十分に純粋である
。（６Ｒ）−ジアステレオマーの含有率は９９．１％で
ある。

濾液に６０°Ｃで塩化カルシウム１００ｇを水５０−中
で加え、少量の水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ７
，３に調整し、徐々に１５°Ｃに冷却し、この際（６Ｓ
）　−ホリニン酸カルシウムが晶出する。

３日後結晶を濾過し、冷たい塩化カルシウム−溶液で、
次いでエタノールで洗滌する。高収率で得られた粗製（
６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムは（６Ｓ）　−含有率９
７．３％を有する。

例９ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムを塩化ナトリウム
の添加によって分離。

純粋な（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム５０ｇを６
０°Ｃで水３２０ｄ中に溶解し、塩化ナトリウム３５ｇ
を加え、撹拌下で徐々にＯ″Ｃに冷却し、その際純正の
（６Ｒ）−ホリニン酸カルシウムを結晶種として添加す
る。徐々に析出する結晶を濾過する。（６Ｒ）　−含有
率８２．５％を有する粗製（６Ｒ）−ホリニン酸Ｃａか
ら成る。

濾液から塩化カルシウム及びエタノールの添加後に（６
Ｓ）−ホリニン酸Ｃａが得られる。

同一方法で処理するが、添加される塩化ナトリウムの量
を半分の１７．５ｇにした場合、（６Ｒ）−割合はんの
僅かな６７％を有する粗製（６Ｒ）−ホリニン酸Ｃａが
得られる。塩化ナトリウム約３５ｇを添加するが、（６
Ｒ）−ホリニン酸Ｃａの代りに（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン
酸Ｃａを結晶種として使用した場合、はぼ同一の結果が
得られる。

例１０ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム５０ｇを水５００
ｆｆｉｅ中で塩化アンモニウム３５ｇの添加によって例
７と同様に分離。

（６Ｒ）−含有率９２．７％を有する（６Ｒ）−ホリニ
ン酸Ｃａが得られ、母液に塩化カルシウム１００ｇの添
加後（６Ｓ）−含有率９７％を有する（６Ｓ）−ホリニ
ン酸Ｃａが得られる。

例１１ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム５０ｇを水５００
ｄ中で臭化テトラメチルアンモニウム１００ｇの添加に
よって例７と同様に分離。

（６Ｒ）−含有率８９．１％を有する（６Ｒ）−ホリニ
ン酸Ｃａ及び（６Ｓ）−含有率９７．４％を有する（６
Ｓ）−ホリニン酸Ｃａが得られる。

例１２ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム５０ｇを水４００
ｍｆｌ中で水１００ａｄ！中の臭化水素ジェタノールア
ミン約１２５ｇの添加によって分離。

例７と同様に実施された分離で次の化合物が得られる： （６Ｒ）−含有率９９．１％を有する（６Ｒ）−ホリニ
ン酸Ｃａ及び（６Ｓ）−含有率８０％を有する（６Ｓ）
−ホリニン酸Ｃａ。

例１３ ５．１０−メテニル−テトラヒドロ葉酸（５，１Ｏ−Ｃ
Ｈ−（６Ｒ，５）−ＴＨＦ＝無水ロイコボリン〕からそ
の場で得られる（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムを
臭化アンモニウム又は塩化アンモニウムで分離。

水酸化カルシウム１２．６ｇを水９００ｄ中で９０℃で
溶解する。溶液に撹拌下で数分以内に無水ロイコボリン
−ヒドロプロミド（（５，１Ｏ−Ｃ１１−（６Ｒ，Ｓ）
　−ＴＩＩＰ　）Ｂｒ（＋）・ＨＢｒ）１１０ｇを、同
時に２５％水性アンモニアを加え１反応溶液のｐ）ｌを
常に６に保つ、得られた溶液を更に３−４時間還流煮沸
し、その際（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸Ｃａ　（５−Ｃ）
１０−ＴＨＦ）が生じる。反応溶液を活性炭及び濾過助
剤を用いて処理して澄明化し、臭化アンモニア１００ｇ
を加え、ｐ１１７に調整し、冷却し、純正の（６Ｒ）−
ホリニン酸Ｃａを結晶種として加え、その後徐々に存在
する（６Ｒ）−ホリニン酸Ｃａの大部分が析出する。結
晶を濾過し、洗滌する。（６Ｒ）−含有率９８．３％を
有する。

濾液に水１００ｇ中の塩化カルシウム２００ｇを加え、
ｐＨ７に調整し、純正の（６Ｓ）−ホリニン１ｌｃａを
結晶種として加え、その後存在する（６Ｓ）−ホリニン
酸Ｃａ大部分が晶出する。結晶を濾過する。（６Ｓ）−
含有率９２％を有する。

前記例中無水ロイコボリンプロミド−ヒドロプロミドを
当量の無水ロイコボリンクロリド−ヒドロクロリドに及
び臭化アンモニアを同量の塩化アンモニアに代えること
もできる。その際同様な結果が得られる。

前述の例と同様な方法で、次の同様な分離を実施する： 例１４ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸マグネシウムをその混合物の
形でほぼ中性媒体中で臭化アンモニウムの添加によって
分離する。

例１５ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸ストロンチウムをヨウ化ナト
リウムの添′加によって分離し、（６Ｒ）−ホリニン酸
Ｓｒを、次いで（６Ｓ）−ホリニン酸Ｓｒを２−メトキ
シエタノール及び塩化ストロンチウムの添加によって析
出させる。

例１６ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸バリウムを分離し、（６Ｒ）
−ホリニン酸Ｂａ及び（６Ｓ）−ホリニン酸Ｂａを先ず
ヨウ化バリウムの添加し、その後１，２−ジメトキシー
エタンの添加によって単離する。

例１７ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸ナトリウムを臭化マグネシウ
ムの添加によって分離し、（６Ｒ）−ホリニン酸マグネ
シウムを分離し、塩化カルシウムを濾液に加え、（６Ｓ
）−ホリニン酸カルシウムを単離する。

例１Ｂ Ｃ６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムを臭化マグネシウ
ムの添加によって分離し、析出した（６Ｒ）−ホリニン
酸塩を分離し、塩化カルシウムを濾液に添加し、その際
析出した（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムを単離する。

例１９ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸Ｃａをテトラエチルアンモニ
ウムプロミドの添加によって分離する。

例２０ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸Ｃａをテトラブチルアンモニ
ウムプロミドの添加によって分離する。

例２１ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸Ｃａをトリエチルアミン−ヒ
ドロクロリドの添加によって分離する。

例２２ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸Ｍｇをジェタノールアミン−
ヒドロクロリドの添加によって分離する。

例２３ （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸Ｃａをベンジルアミン−ヒド
ロクロリドの添加によって分離する。

例２４ （６Ｒ，Ｓ）− ホリニン酸Ｃａをモルホリン− ヒドロプ ロミドの添加によって分離する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸の塩の水性溶液に無機又
   は有機酸の水溶性アルカリ−、アンモニウム−又はアル
   カリ土類−塩を加え、析出する（６Ｒ）−ホリニン酸塩
   を濾去し、濾液から（６Ｓ）−ホリニン酸塩を単離する
   ことを特徴とする、（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸塩の分離
   方法。 ２）（６Ｓ）−ホリニン酸塩を濾液から水と混和しうる
   有機溶剤及び（又は）好ましくは水溶性アルカリ土類塩
   の添加によって析出させ、濾過し、場合により再結晶す
   る請求項１記載の方法。 ３）（６Ｒ）−ホリニン酸のアルカリ塩の分離をほぼ中
   性ｐＨで実施する請求項１記載の方法。 ４）（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸のアルカリ−又はアルカ
   リ土類塩としてナトリウム−又は特にカルシウム−又は
   マグネシウム−塩を使用する請求項１記載の方法。 ５）無機酸の水溶性アルカリ−又はアンモニウム−塩と
   してハロゲン化ナトリウム、−カリウム又は−アンモニ
   ウム、特にヨウ化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナ
   トリウム、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、塩化カリウ
   ム、ヨウ化アンモニウム、臭化アンモニウム及び（又は
   ）塩化アンモニウムを使用する請求項１記載の方法。 ６）有機溶剤として低級アルコール又は低級ケトンを使
   用する請求項１又は２記載の方法。 ７）（６Ｓ）−ホリニン酸塩を析出するための水溶性ア
   ルカリ土類塩としてハロゲン化カルシウム又は−マグネ
   シウムを使用する請求項１，２又は６のいずれかに記載
   した方法。