JPH0645621B2

JPH0645621B2 - ホリニン酸の分離方法

Info

Publication number: JPH0645621B2
Application number: JP1290140A
Authority: JP
Inventors: ハンス・ルードルフ・ミユーレル; マルテイン・ウルマン; ヨーゼフ・コンティ; ギユンテル・ミユルーデル
Original assignee: エプロバ・アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 1988-11-11
Filing date: 1989-11-09
Publication date: 1994-06-15
Anticipated expiration: 2009-06-15
Also published as: ZA897284B; DE58907088D1; PT92232B; PT92232A; AU4392489A; JPH02178284A; IE63929B1; FI91157C; HUT51648A; NZ231193A; ES2061804T3; CN1029956C; CN1042541A; NO894499D0; FI91157B; CH676981A5; KR920005744B1; NO894499L; IE893623L; KR900007420A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はN5-ホルミル-(6R,S)-5,6,7,8-テトラヒドロ葉
酸(5-CHO-(6R,S)-THF、略してホニリン酸と呼ぶ）を分
離し、N5-ホルミル-(6S)-5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸〔5
-CHO-(6S)-THF、生化学的に活性なシトロボトム-因子
（＝リューコストック-シトロボルムに関する増殖因
子）〕を単離する方法に関する。

ホリニン酸は２個の不斉中心を有する。その際葉酸、す
なわちN-（プテロイル）-L-グルタミン酸からホリニン
酸を合成することに基づきグルタミン酸-残基中に含有
する光学的に活性なC-原子はL-型で存在する。一方プテ
ロイル-残基の5,6-位にある二重結合を水素化すること
によって生じる光学的に活性なC-原子は6-位にセラミ性
の(6R,S)-型で存在する。したがって合成ホリニン酸
（＝ロイコボリン）は２個のジアステレオマーの１：１
-混合物から成る。

自然に存在するものの中で、たとえば肝臓中にホリニン
酸が(6S)-型で5-CHO-(6S)-THFとしてのみ存在する。5-C
HO-(6R,S)-THF（ホリニン酸）をそのカルシウム塩（ロ
イコボリンカルシウム）の形で巨大赤芽球性葉酸欠乏-
貧血の処置用薬剤として、癌治療（ロイコボリン救済）
に於ける葉酸拮抗剤、特にアミノプテリン、メトトレキ
セート及びフルオルウラシルの相容性の増強用及び自己
免疫疾患、たとえば乾癬及びリュウマチ性関節炎の処理
の増強用解毒剤として並びに特定の駆虫剤，たとえば化
学療法に於けるトリメトプリム-スルファメトキサゾー
ルの相容性の増強用解毒剤として使用する。

5-CHO-(6R,S)-THFの投与後、このジアステレオマー混合
物の(6S)-部分を急速に5-Me-(6S)-THFに変え、一方(6R)
-部分は物質代謝せず、徐々に尿によって排泄される：
J.A.ストロー(Straw)等、癌研究(Cancer Research)44,3
114-3119(1984)。

F.M.シロトナク(Sirotnak)等、生化学的薬物学28,2993-
97(1979)には、L1210の培養でメトトレキセートによる
細胞増殖阻害の抑制にホリニン酸の自然に存在しないジ
アステレオマー〔5-CHO-(6R)-THF〕は100倍、そして化
学的に合成されたジアステレオマー混合物〔5-CHO-(6R,
S)-THF〕は２倍自然に存在するジアステレオマー〔5-CH
O-(6S)-THF〕に比して有効性が少ないことが記載されて
いる。

Ｃ．テンプル(Temple)等、癌治療リポート65,1117-9(19
81)は、この試験管内で測定された結果を生体内で確認
し、天然ジアステレオマーはメトトレキセートの毒性の
減少に関してジアステレオマーの混合物〔ロイコボリ
ン〕に比して２倍以上有効であることが分った。

この著者は自然に存在しないジアステレオマーの可能な
有害作用さえも推定している。

すなわち5-CHO-(6R)-THFはいくつかの、C₁-転移の原因
となっている酵素及び同時にテトラヒドロホラートの生
化学的作用を阻害する： R.P.リーニィ(Leany)等、Biochem.BioHYs.Res.Commun.5
6、484(1973)；G.K.スミス(Smith)等、生化学，20,4034
(1981)。したがって(6R,S)-テトラヒドロホラートの代
りに(6S)-テトラヒドロホラートの使用は２倍の有効性
と共に質的な治療上の利点も示さねばならなかった。

したがって従来使用されるジアステレオマーの１：１-
混合物を自然に存在する有効物質〔5-CHO-(6S)-THF〕に
代えることが必要となる。

5-CHO-(6R,S)-THFの分離及び5-CHO-(6S)-THFの不斉合成
に数倍の努力が払われている。

Ｄ．コスリヒ(Cosulich)等、J.Amer.Chem.Soc.74、4215-
16(1952),米国特許第2,688,018号明細書(31.08.1954)で
は、たとえば水性溶液から5-CHO-(6R,S)-THFのアルカリ
土類塩、たとえばカルシウム-又はストロンチウム塩の
分別結晶による分離を行うことが試みられている〔J.C.
ホンテシラーキャンプ（Fontecilla-Camps等、J.Amer.C
hem.Soc.101,6114(1979)も参照〕。

しかしＤ．コスリヒ等に開示された条件下で所望される
分離は、実際に行うことができない。たとえば5-COH-(6
R,S)-THFのカルシウム塩を水からpH７−８で結晶化した
場合、常に再び6R,S-型が得られる。たとえばこれはキ
ラルHPLC-カラムのクロマトグラフィー分析によって並
びに旋光度によって定量的に検出することができる。そ
の際5-CHO-(6R,S)-THFの粗製又は純粋なカルシウム-塩
を結晶化に使用するかどうかは重要でなく、常に(6R,S)
-型を保持する。5-CHO-(6R,S)-THFのアルカリ土類塩-過
飽和水性溶液に純正な5-CHO-(6S)-THFのアルカリ土類塩
を結晶種として加えた場合、(6S)-型の分離及び増加を
達成することもできない。

ジアステレオマー対の分離をクロマトグラフィーによっ
ても実施する：J.Feeney（フェネィ）等、生化学20、183
7(1981)。更に(6S)-異性体をジヒドロホラート・リダク
ターゼ(Reduktase)の存在下にジヒドロホラートの立体
特異的還元によって製造する：Ｌ．リース(Rees)等、テ
トラヘドロン42、117(1986)。

Ｌ．リース(Rees)等、J.Chem.Soc.,Chem.Commun.1987,4
70,ヨーロッパ特許公開第0266042号明細書には、5-CHO-
(6S)-THF及び5-CHO-(6R)-THFが少量で製造することがで
きる(6R,S)-THFの分離法が記載されている。この方法は
(6R,S)-THFと(-)-メチル-クロルホルミアートとを反応
させてジアステレオマー5-(-)-メチルオキシカルボニル
-テトラヒドロ葉酸となし、これをn-ブタノールでくり
返し処理して分離し、得られたジアステレオマーを臭化
水素の飽和溶液と共にギ酸と酢酸とから成る混合物中で
加熱し、この際加水分解後5-ホルミル-(6S)-及び(6R)-T
HFを形成し、最後にこれをカルシウム塩として単離する
ことにある。

この方法は煩雑かつ困難であり、キラル試剤の製造に高
毒性ホスゲンが必要である。更に原料(6R,S)-THFは極め
て不安定である。キラル補助基をHBrでAcOH中で＞50℃
で離脱した場合、グルタミン酸の一部を離脱し、困難に
しか分離されない副生成物を生じる。この様な方法に従
って製造された(6S)-ホリニン酸は高価なので、(R,S)-
テトラヒドロホラートの代りにほとんど使用されない。

したがって今日まで(6S)-テトラヒドロホラートの有用
な製造方法は知られていない。

したがって以前として簡単に、工業的に使用できる、5-
CHO-(6S)-THFの製造方法を見い出すことが課題である。

今や驚くべきことに本発明者は、(6R,S)-ホリニン酸〔5
-CHO-(6R,S)-THF〕の塩の水性溶液から無機又は有機酸
の水溶性アルカリ-、アンモニウム-又はアルカリ土類塩
の添加後対応するホリニン酸塩を析出させ、これが極め
て主に自然に存在しないジアステレオマー(6R)-ホリニ
ン酸塩〔5-CHO-(6R)-THF〕から成ることを見い出した。
これは濾過によって分離することができる。主に所望さ
れる、自然に存在する(6S)-ホリニン酸塩を含有する濾
液から水と混和しうる有機溶剤、たとえばエタノール又
はアセトン及び（又は）水溶性アルカリ土類塩の添加に
よって(6S)-ホリコン酸塩を単離することができる。次
いでこれから(6R)-ホリニン酸塩の残部を再結晶によっ
て除くことができる。

“アンモニウム塩”とはこの場合及び以下に於て非置換
又は１ないし４回置換されたアンモニウム塩を意味し、
専らピロリジニウム-、ピペリジニウム-及びモルホリニ
ウム-塩である。置換基として特にC-原子数１〜４のア
ルキル-又はヒドロキシアルキル基又はベンジル基が挙
げられる。

(6R,S)-ホリニン酸塩のアルカリ土類塩の分離は、この
処理によれば中性pHでしか作用しない。アルカリ性媒体
（pH＞８）からPCT／ヨーロッパ特許出願88/00341(WO 8
8/08844として1988年11月17日に公開）中に記載された
方法と同様に先ず主に(6S)-ホリニン酸アルカリ土類塩
を析出させる。

(6R,S)-ホリニン酸アルカリ塩を分離する場合、アルカ
リハロゲニドの添加後ほぼ中性で及びアルカリ性媒体か
ら最初に(6R)-ホリニン酸が析出する。

ジアステレオマーの分離すべき混合物のカチオン及び有
機又は低級有機酸のアルカリ-、アンモニウム-又はアル
カリ土類塩のカチオンは一致する必要はないし、一般に
合目的的でない。

(6R,S)-ホリニン酸塩のアルカリ土類塩の溶液少量にほ
ぼ中性pHで水溶性アルカリハロゲニド、たとえばヨウ化
ナトリウムを加えた場合、先ず対応する(6R)-ホリニン
酸アルカリ土類塩が析出する。

(6R,S)-ホリニン酸アルカリ塩の溶液にほぼ中性pHで水
溶性アルカリ土類塩を加えた場合、同様なことが生じ
る。先ず対応する(6R)-ホリニン酸アルカリ土類塩が析
出する。

(6R,S)-ホニリン酸アルカリ塩の溶液に無機酸の可溶性
アルカリ塩を加えた場合、往々にして有機溶剤、たとえ
ばメタノール、エタノール、イソプロパノール又はアセ
トンの添加直後先ず対応する(6R)-ホリニン酸アルカリ
塩が析出する。

母液から（数種の）有機溶剤の添加によって、(6S)-ホ
リニン酸アルカリ塩を析出させることができる。しかし
母液から水溶性アルカリ土類塩の添加によって対応する
(6S)-ホリニン酸アルカリ土類塩を析出させることがで
きる。その際溶液のpHが８に上昇するのは不都合ではな
い。

無機又は有機酸の水溶性アルカリ-又はアンモニウム塩
の必要量は、比較的高い。これは使用される(6R,S)-ホ
リニン酸塩の重量に対してほぼ0.5〜10倍、好ましくは
１〜５倍の重量である。水溶性アルカリ土類塩を極めて
僅かな量で必要とする。

一連の試験によって求められうる最適の条件を維持した
場合、(6R)-ホリニン酸塩が光学的に実質上純粋な形で
かつ高収率で析出する。この様な条件下で母液は夫々ほ
んの僅かな(6R)-ホリニン酸塩しか含有しない。したが
って引き続きたとえば有機溶剤又はアルカリ土類塩の添
加によって析出する(6S)-ホリニン酸塩は、70ないし約9
5％の(6S)-割合を有する。この様な(6S)-型で著しく富
んだホリニン酸塩から、付随する(6R)-ホリニン酸塩を
再結晶によって完全に除くことができる。しかし(6S)-
ホリニン酸塩の含有率がほぼ60％又はそれ以下でしかな
い場合、再結晶によって(6R,S)-型のラセミ体が再び形
成され、過剰の(6S)-型は溶解する。

この方法は簡単であり、最適な処理法でも極めて効果的
である。

本発明の対象は、(6R,S)-ホリニン酸の塩の水性溶液に
無機又は有機酸の水溶性アルカリ-、アンモニウム-又は
アルカリ土類塩を加え、析出する(6R)-ホリニン酸塩を
濾去し、濾液から(6S)-ホリニン酸塩を単離することを
特徴とする、(6R,S)-ホリニン酸塩の分離方法である。

(6S)-ホリニン酸塩の単離は、(6S)-ホリニン酸塩を濾液
から水と混和しうる有機溶剤及び（又は）好ましくは水
溶性アルカリ土類塩の添加によって析出させ、濾過し、
場合により再結晶することによって行われる。

出発化合物として特に適する(6R,S)-ホリニン酸塩の塩
は，ナトリウム-、カリウム-、カルシウム-、マグネシ
ウム-、ストロンチウム-又はバリウム-塩である。ナト
リウム-、特にカルシウム-及びマグネシウム-塩が好ま
しい。というのはこれを分離、単離及び精製を行った後
にそのまま薬剤として使用するからである。

対応する塩を基体とする無機又は有機酸は強酸であるの
が好ましい。この場合有機酸はC-原子１〜４個を含有す
るのが好ましい。

無機酸として次のものが挙げられる：ヨウ化水素酸、臭
化水素酸、塩化水素酸、硝酸及び有機酸として次のもの
が挙げられる：ギ酸、乳酸、クエン酸、メタンスルホン
酸。

水溶性アルカリ-、アンモニウム-又はアルカリ土類塩と
してハロゲン化物、特にヨウ化物及び臭化物が極めて適
する。詳しくは次のものが好ましい：ヨウ化ナトリウ
ム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化カリウ
ム、臭化カリウム、塩化カリウム、ヨウ化アンモニウ
ム、臭化アンモニウム、塩化アンモニウム、ヨウ化カル
シウム、臭化カルシウム、塩化カルシウム、臭化マグネ
シウム、塩化マグネシウム、臭化ストロンチウム、塩化
ストロンチウム、ヨウ化バリウム、臭化バリウム、塩化
バリウム。

水溶性アルカリ土類塩、好ましくはヨウ化カルシウム、
臭化カルシウム、塩化カルシウム、臭化マグネシウム又
は塩化マグネシウムを(6R,S)-ホリニン酸アルカリ塩の
溶液に添加するのが有利である。

しかし本発明による分離は、他の水溶性アルカリ-、ア
ンモニウム-及びアルカリ土類塩、たとえば亜硝酸ナト
リウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸アンモニウム、ギ酸ナ
トリウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸
カルシウム又はエタンスルホン酸ナトリウムの添加によ
っても行われる。

(6S)-ホリニン酸塩を単離するための、水と混和しうる
有機溶剤として、低級アルコール、たとえばメタノー
ル、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、
グリコールエーテル、たとえば2-メトキシエタノール、
2-エトキシエタノール、2-ブチルオキシエタノール、1-
メトキシ-2-プロパノール、1,2-ジメトキシエタン、1,2
-ジエトキシエタン、更にジオキサン、テトラヒドロフ
ラン、低級ケトン、たとえばアセトン、メチルエチルケ
トン、メトキシアセトン、1,3-ジメトキシアセトン並び
にアセトニトリルが適する。低級アルコール又はケト
ン、特にメタノール、エタノール、イソプロパノール及
びアセトンが好ましい。

対応する(6S)-ホリニン酸塩を析出するための水溶性ア
ルカリ土類塩としてアルカリ土類金属のハロゲン化物、
たとえば塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カリ
シウム，塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、塩化ス
トロンチウム、臭化ストロンチウム又はハロゲン化バリ
ウムが適する。この目的に塩化カルシウム及び-マグネ
シウムが好ましい。

したがって本発明は、(6R,S)-ホリニン酸のアルカリ-又
はアルカリ土類塩として好ましくはナトリウム-、カル
シウム-又はマグネシウム塩、無機酸の水溶性塩として
好ましくはハロゲン化ナトリウム、-カリウム又は-アン
モニウム、特にヨウ化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩
化ナトリウム、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、塩化カ
リウム、ヨウ化アンモニウム、臭化アンモニウム及び
（又は）塩化アンモニウム及び対応する(6S)-ホリニン
酸を析出するための有機溶剤として好ましくは低級アル
コール又は低級ケトン及び（又は）水溶性アルカリ土類
塩としてハロゲン化カルシウム又は-マグネシウムを使
用することを特徴とする。

本発明を次の例によって説明する。

例１ (6R,S)-ホリニン酸カルシウムの分離及び(6R)-ホリニン
酸カルシウム及び(6S)-ホリニン酸カルシウムの単離。

純粋な(6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇを水500ｍ中
に溶解し、ヨウ化ナトリウム100ｇを加える。溶液のpH
を7.0に調整する。次いで溶液を攪拌下に１℃に冷却す
る。溶液のpHは約7.7に上昇する。15-20時間後、析出し
た生成物を濾過し，水性濃ヨウ化ナトリウム溶液で、次
いでエタノールで洗滌する。

(6R)-含有率98.1％を有する(6R)-ホリニン酸カルシウム
が得られる〔HPLCによってキラルカラム（レゾルボシル
-BSA-7）の使用下に測定〕。塩化カルシウムの存在下に
水から再結晶した後、(6R)-の含有率100％を有する純粋
(6R)-ホリニン酸カルシウムが得られる。

比旋光度〔α〕_Ｄ ^２０＝＋43.7°（無水Ca-塩に対し
て）水中での溶解度：20℃で：20ｇ／100ｍ濾液にエタノールを加え、攪拌下３℃に冷却する。約15
-20時間後、析出した生成物を濾過し、エタノールで洗
滌する。84％(6S)-ホリニン酸カルシウム及び16％(6R)-
ホリニン酸カルシウムを含有するホリニン酸カルシウム
が得られる。

塩化カルシウムの存在下に水から再結晶して、それから
(6S)-含有率97.6％を有する(6S)-ホリニン酸カルシウム
が得られる。更に再結晶した後に(6S)-含有率は99.5
％である。

比旋光度：〔α〕_Ｄ ^２０＝-15℃（無水Ca-塩に対して）例２ (6R,S)-ホリニン酸の分離及び(6R)-ホリニン酸ナトリウ
ム及び(6S)-ホリニン酸カルシウムの単離。

(6R,S)-ホリニン酸25ｇを水70ｍ中に懸濁し、２Ｎ苛
性ソーダ溶液49ｍの添加により溶解する。この溶液に
塩化ナトリウム40ｇ及びヨウ化ナトリウム140ｇを加え
る。ゼリー状析出物が生じる。これを２〜３時間後濾過
し、メタノールで洗滌する。

(6R)-含有率99％を有する光学的に純粋な(6R)-ホリニン
酸ナトリウムが得られる。

母液に塩化カルシウム25ｇを加え、pH8.5に調整する。
その後徐々に(6S)-含有率78％を有する(6S)-ホリニン酸
カルシウムが析出する。この粗製(6S)-ホリニン酸カル
シウムを30-35℃で水に溶解し、活性炭及び濾過助剤
（商品名ゾルカホロク(Solkafloc)）を加え、濾過し、1
0％の濃度に蒸発し，５〜１℃で結晶化する。(6S)-含有
率ほぼ98％を有する(6S)-ホリニン酸カルシウムが得ら
れる。

例３ (6R,S)-ホリニン酸の分離及び(6R)-ホリニン酸ナトリウ
ム及び(6S)-ホリニン酸マグネシウムの単離。

(6R,S)-ホリニン酸25ｇを水75ｍ中に懸濁し、５Ｎ水
性酸化ナトリウムの添加によって溶解する。弱アルカリ
性溶液に攪拌下に臭化ナトリウム75ｇを、その後メタノ
ール200ｍを加える。２週間後徐々に(6R)-ホリニン酸
ナトリウムが晶出する。この生成物を濾過し、メタノー
ルで洗滌し、乾燥する。

(6R)-含有率98％を有する光学的に実質上純粋な(6R)-ホ
リニン酸ナトリウムが得られる。

比旋光度：〔α〕_Ｄ ^２４＝+39.5°（無水Na-塩に対し
て、C-水中で１％）母液からメタノールを除き、pH9.8に調整し、塩化マグ
ネシウム25ｇを加え、徐々に攪拌する。しばらくの後に
(6S)-ホリニン酸マグネシウムが徐々に晶出する。約100
時間後濾過し、エタノールで洗滌し、乾燥する。(6S)-
含有率85％。塩化マグネシウムの存在下に再結晶して光
学的に純粋な(6S)-ホリニン酸マグネシウムが得られ
る。

例４ (6R,S)-ホリニン酸ナトリウムの分離及び２つのジアス
テレオマーの単離。

(6R,S)-ホリニ酸25ｇを水75ｍ中に５Ｎ水性水酸化ナ
トリウムの添加によって溶解し、20℃でヨウ化ナトリウ
ム140ｇを加え、攪拌下５℃に冷却する。

一晩放置後、析出した(6R)-ホリニン酸ナトリウムを濾
過し、アセトンで洗滌する。得られた生成物は(6R)-割
合82.9％を有する。

一緒にされた母液にアセトン600ｍを加え、０℃で攪
拌する。生じた析出物を濾過する。これは主として(6S)
-割合71％を有する(6S)-ホリニン酸ナトリウムから成
る。

例５ (6R,S)-ホリニン酸カルシウムをほぼ中性媒体中でヨウ
化アンモニウムの添加によって分離。

(6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇ及びヨウ化アンモニ
ウム100ｇを水500ｍ中に36℃に溶解する。溶液はpH7.
7.を有する。徐々に攪拌下に室温に冷却し、一定の攪拌
下に更に５℃に、次いで０−２℃に冷却し、この溶液に
結晶種として純粋な(6R)-ホリニン酸カルシウム数mgを
添加し、その後結晶が開始する。

その際晶出された、主として(6R)-ホリニン酸カルシウ
ムから成る生成物を濾過し、エタノールで洗浄し、乾燥
する。(6R)-ホリニン酸塩含有率：98％。

濾液を洗滌-溶液と一緒にし、攪拌下に付加的に１エ
タノールを加える。

徐々に析出する、主に(6S)-ホニリン酸カルシウムから
成る分画を濾過し、エタノールで洗滌し、乾燥する。(6
S)-ホニリン酸塩含有率は96％である。

得られた粗製(6R)-ホリニン酸カルシウム及び(6S)-ホリ
ニン酸カルシウムを夫々少量の水から活性炭及び濾過助
剤の添加下に際結晶する。それによって(6R)-又は(6S)-
ホリニン酸塩の含有率は99.5-99.7％に増加する。

例６ (6R,S)-ホリニン酸カルシウムをほぼ中性媒体中で臭化
ナトリウムの添加によって分離し、次いで(6S)-ホリニ
ン酸カルシウムをCaCl₂の添加によって単離。

水500ｍ中に(6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇに臭化
ナトリウム75ｇを加える。溶液のpHは7.4である。攪拌
下に35℃から１−３℃に冷却し、その後徐々に結晶化が
開始する。

結晶を濾過し、メタノールで洗滌する。得られた(6R)-
ホリニン酸カルシウムから成る結晶は、(6R)-含有率93
％を有する。濾液に塩化カルシウム100ｇを加え、その
後(6S)-ホリニン酸カルシウムが析出する。これを濾過
し、エタノールで洗滌する。得られた(6S)-ホリニン酸C
aは(6S)-含有率84％を有する。塩化カルシウムの存在下
に少量の水から際結晶して、良好な収率で(6S)-含有率9
9.6％を有する純粋(6S)-ホリニン酸カルシウムが得られ
る。

例７ (6R,S)-ホリニン酸カルシウムをほぼ中性媒体中で臭化
アンモニウムの添加によって分離する。

水500ｍ中の(6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇに臭化
アンモニウム70ｇを加える。溶液のpHは6.5である。得
られた溶液を攪拌下で０℃に冷却し、純正な(6R)-ホリ
ニン酸Caを結晶種として加える。徐々に結晶化が開始す
る。上澄液のCa-(6S)-含有率はもはや増加しない、すな
わち(6R)-ホリニン酸Caのそれ以上の量が全く析出しな
くなってから、濾過し、メタノール及びエタノールで洗
滌する。

得られた(6R)-ホリニン酸Caは(6R)-含有率93.8％を有す
る。濾液に塩化カルシウム100ｇを加え、pH７に調整す
る。その後徐々に(6S)-ホリニン酸Caが析出する。得ら
れた生成物を濾過し、エタノールで洗滌する。(6S)-ホ
リニン酸Caの含有率は98.7％である。塩化カルシウムの
存在下い再結晶して、これから純粋な(6S)-ホリニン酸C
aが得られる。

例８ (6R,S)-ホリニン酸カルシウムをヨウ化カリウムの添加
によって分離。

(6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇに水500ｍ及びヨウ
化カリウム110ｇを加え、55℃で溶解する。得られた溶
液（pH7.1）を攪拌下で徐々に０℃に冷却し、純正の(6
R)-ホリニン酸Caを結晶種として加える。一晩放置後、
析出した結晶を濾過し、少量のヨウ化カリウム溶液で、
次いでエタノールで洗滌する。得られた(6R)-ホリニン
酸Caは十分に純粋である。(6R)-ジアステレオマーの含
有率は99.1％である。

濾液に60℃で塩化カルシウム100ｇを水50ｍ中で加
え，少量の水酸化ナトリウムの添加によってpH7.3に調
整し、徐々に15℃に冷却し、この際(6S)-ホリニン酸カ
ルシウムが晶出する。

３日後結晶を濾過し，冷たい塩化カルシウム-溶液で、
次いでエタノールで洗滌する。高収率で得られた粗製(6
S)-ホリニン酸カルシウムは(6S)-含有率97.3％を有す
る。

例９ (6R,S)-ホリニン酸カルシウムを塩化ナトリウムの添加
によって分離。

純粋な(6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇを60℃で水320
ｍ中に溶解し、塩化ナトリウム35ｇを加え、攪拌下で
徐々に０℃に冷却し、その際純正の(6R)-ホリニン酸カ
ルシウムを結晶種として添加する。徐々に析出する結晶
を濾過する。(6R)-含有率82.5％を有する粗製(6R)-ホリ
ニン酸Caから成る。

濾液から塩化カルシウム及びエタノールの添加後に(6S)
-ホリニン酸Caが得られる。

同一方法で処理するが、添加される塩化ナトリウムの量
を半分の17.5ｇにした場合、(6R)-割合ほんの僅かな67
％を有する粗製(6R)-ホリニン酸Caが得られる。塩化ナ
トリウム約35ｇを添加するが、(6R)-ホリニン酸Caの代
りに(6R,S)-ホリニン酸Caを結晶種として使用した場
合、ほぼ同一の結果が得られる。

例10 (6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇを水500ｍ中で塩化
アンモニウム35ｇの添加によって例７と同様に分離。

(6R)-含有率92.7％を有する(6R)-ホリニン酸Caが得ら
れ、母液に塩化カルシウム100ｇの添加後(6S)-含有率97
％を有する(6S)-ホリニン酸Caが得られる。

例11 (6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇを水500ｍ中で臭化
テトラメチルアンモニウム100ｇの添加によって例７と
同様に分離。

(6R)-含有率89.1％を有する(6R)-ホリニン酸Ca及び(6S)
-含有率97.4％を有する(6S)-ホリニン酸Caが得られる。

例12 (6R,S)-ホリニン酸カルシウム50ｇを水400ｍ中の水10
0ｍ中の臭化水素ジエタノールアミン約125ｇの添加に
よって分離。

例７と同様に実施された分離で次の化合物が得られる： (6R)-含有率99.1％を有する(6R)-ホリニン酸Ca及び(6S)
-含有率80％を有する(6S)-ホリニン酸Ca。

例13 5,10-メテニル-テトラヒドロ葉酸〔5,10-CH-(6R,S)-THF
＝無水ロイコボリン〕からその場で得られる(6R,S)-ホ
リニン酸カルシウムを臭化アンモニウム又は塩化アンモ
ニウムで分離。

水酸化カルシウム12.6ｇを水900ｍ中で90℃で溶解す
る。溶液に攪拌下で数分以内に無水ロイコボリン-ヒド
ロブロミド（〔5,10-CH-(6R,S)-THF〕Br⁽⁺⁾・HBr)110ｇ
を、同時に25％水性アンモニアを加え，反応溶液のpHを
常に６に保つ。得られた溶液を更に３−４時間還流煮沸
し、その際(6R,S)-ホリニン酸Ca(5-CHO-THF)が生じる。
反応溶液を活性炭及び濾過助剤を用いて処理して澄明化
し、臭化アンモニウム100ｇを加え、pH７に調整し、冷
却し、純正の(6R)-ホリニン酸Caを結晶種として加え、
その後徐々に存在する(6R)-ホリニン酸Caの大部分が析
出する。結晶を濾過し、洗滌する。(6R)-含有率98.3％
を有する。

濾液に水100ｇ中の塩化カルシウム200ｇを加え、pH７に
調整し、純正の(6S)-ホリニン酸Caを結晶種として加
え、その後存在する(6S)-ホリニン酸Ca大部分が晶出す
る。結晶を濾過する。(6S)-含有率92％を有する。

前記例中無水ロイコボリンブロミド-ヒドロブロミドを
当量の無水ロイコボリンクロリド-ヒドロクロリドに及
び臭化アンモニアを同量の塩化アンモニアに代えること
もできる。その際同様な結果が得られる。

前述の例と同様な方法で、次の同様な分離を実施する：例14 (6R,S)-ホリニン酸マグネシウムをその混合物の形でほ
ぼ中性媒体中で臭化アンモニウムの添加によって分離す
る。

例15 (6R,S)-ホリニン酸ストロンチウムをヨウ化ナトリウム
の添加によって分離し、(6R)-ホリニン酸Srを、次いで
(6S)-ホリニン酸Srを2-メトキシエタノール及び塩化ス
トロンチウムの添加によって析出させる。

例16 (6R,S)-ホリニン酸バリウムを分離し、(6R)-ホリニン酸
Ba及び(6S)-ホリニン酸Baを先ずヨウ化バリウムの添加
し、その後1,2-ジメトキシ-エタンの添加によって単離
する。

例17 (6R,S)-ホリニン酸ナトリウムを臭化マグネシウムの添
加によって分離し、(6R)-ホリニン酸マグネシウムを分
離し，塩化カルシウムを濾液に加え、(6S)-ホリニン酸
カルシウムを単離する。

例18 (6R,S)-ホリニン酸カルシウムを臭化マグネシウムの添
加によって分離し、析出した(6R)-ホリニン酸塩を分離
し、塩化カルシウムを濾液に添加し、その際析出した(6
S)-ホリニン酸カルシウムを単離する。

例19 (6R,S)-ホリニン酸Caをテトラエチルアンモニウムブロ
ミドの添加によって分離する。

例20 (6R,S)-ホリニン酸Caをテトラブチルアンモニウムブロ
ミドの添加によって分離する。

例21 (6R,S)-ホリニン酸Caをトリエチルアミン-ヒドロクロリ
ドの添加によって分離する。

例22 (6R,S)-ホリニン酸Mgをジエタノールアミン-ヒドロクロ
リドの添加によって分離する。

例23 (6R,S)-ホリニン酸Caをベンジルアミン-ヒドロクロリド
の添加によって分離する。

例24 (6R,S)-ホリニン酸Caをモルホリン-ヒドロブロミドの添
加によって分離する。

以上本発明について詳述したが、以下に本発明の実施態
様について記載する。

(1)特許請求の範囲第１項に記載した方法において、(6
R,S)-ホリニン酸のアルカリ-又はアルカリ土類塩として
ナトリウム-又は特にカルシウム-又はマグネシウム-塩
を使用する。

(2)特許請求の範囲第１項及び第２項に記載した方法に
おいて、有機溶剤として低級アルコール又は低級ケトン
を使用する。

(3)特許請求の範囲第１項及び第２項並びに上記第２項
の記載した方法において、(6R,S)-ホリニン酸塩を析出
するための水溶性アルカリ土類塩としてハロゲン化カル
シウム又は-マグネシウムを使用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ギユンテル・ミユルーデルドイツ連邦共和国、テンゲン‐ビユスリンゲン、フオル・ヘギン（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】(6R,S)-ホリニン酸の塩の水性溶液に無機
又は有機酸の水溶性アルカリ-、アンモニウム-又はアル
カリ土類-塩を加え、析出する(6R)-ホリニン酸塩を濾去
し、濾液から(6S)-ホリニン酸塩を単離することを特徴
とする、(6R,S)-ホリニン酸塩の分離方法。
【請求項２】(6S)-ホリニン酸塩を濾液から水と混和し
うる有機溶剤及び（又は）好ましくは水溶性アルカリ土
類塩の添加によって析出させ、濾過し、場合により再結
晶する請求項１記載の方法。
【請求項３】(6R)-ホリニン酸のアルカリ塩の分離をほ
ぼ中性pHで実施する請求項１記載の方法。
【請求項４】無機酸の水溶性アルカリ-又はアンモニウ
ム-塩としてハロゲン化ナトリウム、-カリウム又は-ア
ンモニウム、特にヨウ化ナトリウム，臭化ナトリウム、
塩化ナトリウム、ヨウ化カリウム，臭化カリウム、塩化
カリウム、ヨウ化アンモニウム、臭化アンモニウム及び
（又は）塩化アンモニウムを使用する請求項１記載の方
法。