JPH0920777A

JPH0920777A - 新規なプリンヌクレオシド誘導体、その製造方法及びその誘導体を有効成分とする酵素阻害剤

Info

Publication number: JPH0920777A
Application number: JP18773295A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Miyawaki; 正一宮脇; Eiji Kojima; 鋭士小島; Makoto Machida; 誠町田; Kunimutsu Murakami; 邦睦村上
Original assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd; Jujo Paper Co Ltd
Current assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd; Jujo Paper Co Ltd
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 1997-01-21

Abstract

(57)【要約】【目的】新規なプリンヌクレオシド誘導体、その製造
方法及び、それ誘導体を有効成分として含有してなる新
規な酵素阻害剤を提供することにある。【構成】下記化１で表されることを特徴とするプリン
ヌクレオシド誘導体。【化１】但し、化１中のR¹は水素原子、アミノ基、水酸基又はメ
トキシ基、R²及びR³は水素原子又はアミノ基、R⁴はメチ
ル基、イソプロピル基、イソブチル基、ベンジル基、2-
メチルチオエチル基、又は、下記化２に示されたアミノ
酸を形成し得るα位の置換基である。【化２】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な化合物に関し、
特に新規なプリンヌクレオシド誘導体、その製造法およ
びその誘導体を有効成分として含有してなる酵素阻害剤
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】酵素阻害剤の分野では、従来から、核酸
塩基の各官能基上に、糖あるいはその他の置換基を導入
した化合物の合成研究が行われてきた。例えば、Patneu
らによって1992年に報告されたWILLARDIINE （シチジン
アミノ酸誘導体）などの一群は、AMPA（カイニン酸アゴ
ニスト）として、脳神経化学や薬理学の分野で注目を集
めている[J. Neurosci.,12, 595 (1992)] 。

【０００３】また、プリン塩基の6 ，8 ，9 位に種々の
置換基を導入した一連の化合物に対して、細胞内情報伝
達の際に重要な役割を演じているリン酸化酵素である、
phosphatidylinositol-4- kinase阻害活性に関する研究
[R.C.Young, J. Med. Chem.,33, 2073 (1990)]もなされ
ている。従って、より高度な、或いは多種多様な酵素に
対して阻害作用を有する物質を、核酸塩基の誘導体から
得る可能性が残されていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする問題点】そこで、本発明者ら
は、プリンヌクレオシド塩基の9-位に置換する官能基を
種々検討したところ、アミノ酸から容易に誘導されるア
ミノアルコールのトシレートとのカップリング生成物が
優れた酵素阻害効果を有することを見出し、本発明に到
達した。

【０００５】従って、本発明の第一の目的は、酵素阻害
作用を有する新規なプリンヌクレオシド誘導体を提供す
ることにある。本発明の第二の目的は、酵素阻害作用を
有する新規なプリンヌクレオシド誘導体の製造方法を提
供することにある。本発明の第三の目的は、プリンヌク
レオシド誘導体を有効成分として含有してなる新規な酵
素阻害剤を提供することにある。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】本発明の上記の諸目的
は下記化８で表されることを特徴とするプリンヌクレオ
シド誘導体によって達成された。

【化８】但し、化８中のR¹は水素原子、アミノ基、水酸基又はメ
トキシ基、R²及びR³は水素原子又はアミノ基、R⁴はメチ
ル基、イソプロピル基、イソブチル基、ベンジル基、2-
メチルチオエチル基、又は、下記化９に示されたアミノ
酸を形成し得るα位の置換基である。

【化９】

【０００７】本発明のプリンヌクレオシド誘導体におい
ては、各置換基は、R¹、R²、R³及びR⁴の種々の組み合わ
せの中から適宜選択することができる。本発明の化合物
の具体例としては、例えば(S)-9-(2- アミノプロピル)-
アデニン、(R)-9-(2- アミノプロピル)-アデニン、(S)-
9-(2- アミノ-3- メチルブチル)-アデニン、(S)-9-(2-
アミノ-4- メチルペンチル)-アデニン、(S)-9-(2- アミ
ノ-3- メチルペンチル)-アデニン、(S)-9-(2- アミノ-4
- メチルチオブチル)-アデニン、(S)-9-(2- アミノ-3-
フェニルプロピル)-アデニン、(S)-9-(2- アミノエチ
ル)-アデニン、(S)-9-(2- アミノ-3- ベンジルオキシプ
ロピル)-アデニン；

【０００８】(S)-9-(2- アミノ-3- ヒドロキシプロピ
ル)-アデニン、(S)-2,6-ジアミノ-9-(2-アミノプロピ
ル)-プリン、(S)-2,8-ジアミノ-9-(2-アミノプロピル)-
プリン、6-ヒドロキシ-9-(2-アミノプロピル)-プリン、
2-アミノ-6- ヒドロキシ-9-(2-アミノプロピル)-プリ
ン、6,8-ジアミノ-9-(2-アミノプロピル)-プリン、2-ア
ミノ-6- メトキシ-9-(2-アミノプロピル)-プリン、2-ア
ミノ-9-(2-アミノプロピル)-プリン、及び2,8-ジアミノ
-6- メトキシ-9-(2-アミノプロピル)-プリン等が挙げら
れる。特に、プリンホスホリラーゼに対して強力な酵素
阻害活性を有するものとしては、(S)-9-(2- アミノプロ
ピル)-アデニン、及び、(S)-9-(2- アミノ-3- フェニル
プロピル)-アデニンが挙げられる。

【０００９】本発明のプリンヌクレオシド誘導体は、以
下に示す如く、５つの反応工程によって製造される。本
発明の製造方法における第１工程は、原料化合物である
アミノ酸（化９）のカルボキシル基を還元剤により、下
記化１０で表される化合物に還元する工程である。

【化１０】但し、化１０中のR⁴は前記化８のものと同じである。

【００１０】ここで原料として使用されるアミノ酸は、
全ての動・植物に含まれるアミノ酸から適宜選択するこ
とができる。例えば、プロリン、フェニルアラニン、メ
チオニン、バリン、チロシン、スレオニン等、蛋白質や
ペプチドを構成するために共通する20種のＬ−α−アミ
ノ酸、及び、細菌等に含まれているＤ−α−アミノ酸等
を使用することも、また、蛋白質を構成するアミノ酸以
外の、ホモセリン、ドーパ等、代謝に重要なアミノ酸等
を使用することもできる。

【００１１】本工程における還元剤は、公知のものの中
から適宜選択することができるが、特に、水素化リチウ
ムアルミニウム（LiAlH₄）を使用することが好ましい。
LiAlH₄の使用量は、化９で表された化合物１モルに対し
て１．５〜２．０モルであることが好ましい。反応用溶
媒は、還元反応に適した溶媒であれば特に限定されるこ
とはないが、本発明においては、特に脱水テトラヒドロ
フランを使用することが好ましい。また、本工程におけ
る還元反応は、窒素雰囲気下で１時間加熱環流して行う
ことが好ましく、還元反応から得られた前記化１０で表
された生成物は、精製することなく次工程の原料として
反応に用いることができる。

【００１２】本発明の製造方法における第２工程は、得
られた化１０で表される化合物のアミノ基をベンゾイル
化することにより保護し、下記化１１で表される化合物
を得る工程である。

【化１１】但し、化１１中のR⁴は前記化８のものと同じである。

【００１３】ここで行うベンゾイル化反応は常法に従え
ばよく、例えば、エタノール溶媒中、窒素雰囲気下で１
時間加熱環流することによって行う。得られた生成物を
シリカゲルカラムクロマトグラフィー等で単離すること
により、次工程に用いられる化１１で表される化合物を
得ることができる。また、原料の無水安息香酸の使用量
は、化１０で表される化合物１モルに対して１．２〜
１．５モルであることが好ましい。尚、この工程で使用
されるアミノ基の保護基としては、アミノ酸に由来のも
の、例えば、ベンゾイル基、ジクロロアセチル基、トシ
ル基などが挙げられる。

【００１４】本発明の製造方法における第３工程は、得
られた化１１で表される化合物の一級アルコール性水酸
基をp-トルエンスルホニルで保護することにより、下記
化１２で表される化合物を得る工程である。

【化１２】但し、化１１中のR⁴は前記化８のものと同じであり、ま
たTsはパラトルエンスルホニル基を表す。

【００１５】ここで行うトシル化反応は常法に従えばよ
く、例えば、脱水ピリジン溶媒中、０℃で窒素雰囲気
下、化１０で表された化合物の一級アルコール性水酸基
をp-トルエンスルホニル化し、得られた生成物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー等で単離することによ
り、次工程に用いられる化１２で表された化合物を得る
ことができる。また、塩化p-トルエンスルホニルの使用
量は、化１１で表される化合物１モルに対して２．０〜
３．０モルであることが好ましい。

【００１６】本発明の製造方法における第４工程は、得
られた化１２で表される化合物とプリン塩基とのカップ
リングにより、下記化１３で表される化合物を得る工程
である。

【化１３】但し、化１２中のR¹、R²、R³、R⁴は前記化８のものと同
じである。

【００１７】ここで行うカップリング化反応は常法に従
えばよく、例えば、脱水ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）溶媒中、窒素雰囲気下で、プリン塩基と等モルの18
- クラウン-6及び２倍モルのＫ₂ＣＯ₃を加え、３０〜
６０分間室温で撹拌した後、化１２で表される化合物の
脱水ＤＭＦ溶液を滴下し、得られた混合溶液を８０℃で
一晩撹拌して化１３で表される化合物を得ることができ
る。

【００１８】得られた化１３で表される化合物は、ヌク
レオシドの単離精製に使用されている通常の方法を適宜
組み合わせて分離精製し、次工程の原料とすることがで
きる。ここで行う分離精製方法は、溶媒を留去した後、
エタノール等の適当な溶媒から結晶化、または凍結乾燥
により、遊離酸型を得るものであり、必要に応じて塩型
として得ることもできる外、イオン交換樹脂などのイオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭などの吸着カ
ラムクロマトグラフィーなどにより精製することもでき
る。

【００１９】本発明の製造方法における第５工程は、得
られた化１３で表される化合物をアンモニア性アルカリ
中、または、水酸化ナトリウム中で、若しくは、水素化
ジイソブチルアルミニウムなどの還元剤を用いて、ベン
ゾイル基を脱保護することにより、前記化８に記載され
た新規プリンヌクレオシド誘導体を得る最終工程であ
る。

【００２０】本発明のプリンヌクレオシド誘導体は、生
化学及び生物学実験のみならず、医学基礎実験及び臨床
実験における酵素阻害剤として使用することができる。
従って、その形態は用途に応じて適宜選択すれば良い。
安定性の観点からは、阻害剤の形態は塩であることが好
ましく、例えば、塩酸塩又は硫酸塩などの酸付加塩、ナ
トリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩などのアルカ
リ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、及
び、アンモニウム塩などの、薬理学的に許容される任意
の塩が挙げられる。

【００２１】

【発明の効果】本発明の、核酸塩基の誘導体から得られ
たプリンアミノ酸誘導体は、低濃度で酵素阻害活性を示
し、特に、プリンホスホリラーゼ、ホスファチジルイノ
シトール−４−キナーゼ、及びアデニル酸シクラーゼ等
の酵素に対して、いずれにも顕著な阻害効果が見られる
ので、生化学及び生物学実験のみならず、医学基礎実験
及び臨床実験に用いる酵素阻害剤として極めて有効であ
る。

【００２２】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に詳述する
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
又、特に断らない限り、以下に記載する「部」及び
「％」は、それぞれ「重量部」及び「重量％」を意味す
る。

【００２３】実施例１．１） (S)-2- アミノプロパノールの合成ＬｉＡｌＨ₄６．０ｇ（１５６ミリモル）を５００ミリ
リットルの三つ口丸底フラスコに入れ、脱水テトラヒド
ロフラン（最大水分含量が０．００５％）２５０ミリリ
ットルを加え、１５分間オイルバス中で加熱還流した
後、Ｌ−アラニン８．９ｇ（１００ミリモル) を約０．
２ｇずつ加え、次いで更に１時間の還流を行った。

【００２４】薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により
反応が完了していることを確認した後加熱をやめ、２．
８ｇ／１１ミリリットルの水酸化カリウム水溶液をゆっ
くりと滴下した。滴下終了後、さらに２５分間還流し、
直ちに吸引濾過した。得られた濾液を、３０℃で減圧濃
縮して真空乾燥した後、薄黄色でオイル状の (S)−２−
アミノプロパノールを得た。収率は８０％であった。
尚、その移動率（Ｒ_f値）は０．４５ (ｎ−ブタノー
ル：酢酸：水＝６：２：２）であった。

【００２５】２）(S)-N-ベンジル-2- アミノプロパノー
ルの合成得られた (S)−２−アミノプロパノール０．７５ｇ（１
０ミリモル）を２５ミリリットルのナス型フラスコに入
れ、エタノール５０ミリリットル、及び、無水安息香酸
２．３ｇ（１０ミリモル）を加えて1 時間加熱還流し
た。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって反応が
完了していることを確認した後、得られた反応液を、３
０℃で減圧濃縮して分取ＴＬＣ（酢酸エチル: ｎ−ヘキ
サン＝１：１）により精製し、薄黄色でオイル状の(S)-
N-ベンジル−２−アミノプロパノールを得た。収率は６
０％であった。尚、そのＲ_f値は０．３５（CH₂Cl₂:CH₃
OH＝９８：２）であった。

【００２６】３）(S)-N-ベンジル-O- トシル-2- アミノ
プロパノールの合成得られた(S)-N-ベンジル−２−アミノプロパノール０．
３６ｇ（２．０ミリモル) を５０ミリリットルの三つ口
丸底フラスコに入れ、脱水ピリジン（最大水分含量が
０．００５％）５ミリリットルを加え、０℃でしばらく
撹拌した。次いで、塩化p-トルエンスルホニル０．８ｇ
（４．５ミリモル）を含有する１０ミリリットルの脱水
ピリジン溶液を滴下した後、０℃で４時間撹拌した。

【００２７】薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によっ
て反応が完了していることを確認した後、氷水に加え次
いで酢酸エチルで抽出した。ピリジンを1N-HClで抽出除
去した後、３０℃で減圧濃縮して分取ＴＬＣ（酢酸エチ
ル：ｎ−ヘキサン＝１：３）により精製し、白色結晶で
(S)-N-ベンジル-O- トシル−２−アミノプロパノールを
得た。収率は５５％であった。尚、そのＲ_f値は０．３
２（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：３）であった。

【００２８】４） (S)-9-(N-ベンジル-2- アミノプロピ
ル)-アデニンの合成アデニン６０ｍｇ（０．４４ミリモル）、K₂CO₃０．１
２ｇ（０．８８ミリモル）、１１５ｍｇ（０．４４ミリ
モル）の１８−クラウン−６、及び、脱水N,N-ジメチル
ホルムアミド（最大水分含量が０．００５％）１０ミリ
リットルを５０ミリリットルの三つ口丸底フラスコに加
え、窒素雰囲気下の室温で1 時間撹拌した。次いで、５
ミリリットルの脱水ＤＭＦ溶液に、N-ベンジル−Ｏ−ト
シル−２−アミノプロパノール０．１６ｇ（０．４４ミ
リモル）を溶解した液室温で滴下した後、80℃で一晩撹
拌した。

【００２９】薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によっ
て反応が完了していることを確認した後、ガラス管蒸留
装置により溶媒を留去し、分取ＴＬＣ（CH₂Cl₂:CH₃OH＝
９：１）により部分精製した。この粗目的物質を逆相HP
LC(CH₃CN:H2O＝３：７）により分離・精製し、白色結晶
の (S)-9-(N-ベンジル-2- アミノプロピル)-アデニンを
得た。収率は５０％であった。尚、そのＲ_f値は０．４
８ (CH₂Cl₂:CH₃OH＝９：１）、及び、質量スペクトルの
親イオン（ＭＡＳＳ）は２９７（Ｍ⁺¹）であった。

【００３０】得られた化１２で表される化合物（C₁₅H₁₆
N₆O₁・(1/2)H₂O）の元素分析の結果は下記表１に示した
通りである。

【表１】

【００３１】５）(S)-9-(2- アミノプロピル)-アデニン
の合成得られた(S)-9-（N-ベンジル−２−アミノプロピル）−
アデニン５０ｍｇ（０．１７ミリモル）を、ｐＨ１０に
調整した濃アンモニア水５ミリリットルに加えて一晩撹
拌した。反応の終了をシリカゲル薄層クロマトグラフィ
ー（ＴＬＣ）によって確認した後、溶媒を留去して分取
用ＴＬＣにより分離・精製し、(S)-9-(2- アミノプロピ
ル)-アデニンを得た。収率は８４％であった。そのＲ_f
値は０．１０（CH₂Cl₂:CH₃OH＝９：１）と０．８５ (ｎ
−ブタノール：酢酸：水＝６：２：２）、及び質量スペ
クトルの親イオン（MASS）は１９３（Ｍ⁺¹）であった。
尚、１）〜５）の全工程の総収率は１１％であった。

【００３２】実施例２〜９．実施例１で原料として用い
られたL-アラニンを、表２に示される同量の各アミノ酸
に代えたこと以外は、実施例１と全く同様の方法で同表
に示されたプリンアミノ酸誘導体を合成した。

【００３３】

【表２】

【００３４】実施例１０．実施例９で、合成された(S)-
9-(2- アミノ-3- ベンジルオキシプロピル)-アデニンを
パラジウム−炭素中、水素雰囲気下で還元して、(S)-9-
（2-アミノ-3- ヒドロキシプロピル)-アデニンを合成し
た。

【００３５】実施例１１〜１８．実施例１で原料として
用いられたL-アラニンを、表２に示される同量の各アミ
ノ酸に代えたこと以外は、実施例１と全く同様の方法で
同表に示されたプリンアミノ酸誘導体を合成した。

【００３６】以上の各実施例により得られた各誘導体の
収率、質量スペクトル及びプリンホスホリラーゼ阻害活
性試験結果は表３に示した通りである。尚、プリンホス
ホリラーゼに対する阻害活性試験方法は以下の通りであ
る。

【００３７】１）酵素溶液の調整大腸菌ＪＡ３００を３７℃で半日間培養した後、４℃、
６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して集菌した。次
いで、ｐＨ７．０、５０ミリモルのリン酸カリウム緩衝
液を用いて菌体ペレットを懸濁させ、４℃、６，０００
ｒｐｍで１５分間遠心分離して菌体を洗浄した。洗浄し
た菌体０．１ｇに対して０．５ミリリットルの５０ミリ
モルリン酸カリウム緩衝液を用いて前記洗浄された菌体
を懸濁し、超音波処理することにより菌体を破砕した。
菌体破砕液を４℃、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心
分離し、上澄みをとって、これを酵素溶液とした。

【００３８】２）酵素活性測定本発明で得られた各阻害剤（実施例１〜１８）を０，１
０，５０，１００，５００マイクロモルとなるように、
上記酵素溶液にそれぞれを加え、更にこの混合溶液に、
基質として１００ミリモルのプリンヌクレオシド溶液３
００マイクロリットルを加えて、全液量が２ミリリット
ルとなるようにした。５０℃で１５分間反応させ、１Ｎ
−ＮａＯＨを０．５ミリリットル加えることによって反
応を停止させた。反応液をＨＰＬＣにかけ、生成した塩
基量を測定した。

【００３９】阻害剤を含まない反応液における塩基生成
量をコントロールとし、各誘導体のＩＣ₅₀（生成量を５
０％阻害する阻害剤の量を表わす指標）を測定した結果
は、表３に示した通りである。尚、本発明の酵素量は、
標準タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
用い、BIO- RAD社製のプロテインアッセイキットにより
測定した。また、１ユニットは１分間に塩基１マイクロ
モルを生じる酵素量とした。

【００４０】

【表３】

【００４１】また、Young らの方法[J. Med. Chem.,33,
2073 (1990)] に従って、ホスファチジルイノシトール
−４−キナーゼ阻害活性を測定したところ、実施例１，
７，１０で得られた誘導体では、Young らの9-シクロペ
ンチルアデニンと同等の阻害活性がみられた。

【００４２】更に、Weinryb らの方法[Biochim. Biophy
s. Acta, 334, 218 (1974)] に従って、アデニル酸シク
ラーゼ阻害活性を測定したところ、Ｍｇ²⁺を１２ミリモ
ル含有する条件において、実施例１、７及び１８で得ら
れた誘導体の場合では、アデニル酸シクラーゼに対する
阻害度であるＩＣ₅₀がそれぞれ0.02μＭ, 0.05μＭ,0.0
3μＭであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｄ 473/32 Ｃ０７Ｄ 473/32 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 (72)発明者村上邦睦山口県岩国市飯田町２−８−１日本製紙株式会社岩国技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記化１で表されることを特徴とするプ
リンヌクレオシド誘導体。【化１】但し、化１中のR¹は水素原子、アミノ基、水酸基又はメ
トキシ基、R²及びR³は水素原子又はアミノ基、R⁴はメチ
ル基、イソプロピル基、イソブチル基、ベンジル基、2-
メチルチオエチル基、又は、下記化２に示されたアミノ
酸を形成し得るα位の置換基である。【化２】
【請求項２】下記の５工程からなることを特徴とす
る、請求項１に記載されたプリンヌクレオシド誘導体の
製造方法。第１工程；下記化３で表される、アミノ酸のカルボキシ
ル基を還元してアミノアルコールを得る工程。【化３】但し、化３中のR⁴はアミノ酸を形成し得る置換基であ
る。第２工程；得られたアミノアルコールに含有されるアミ
ノ基をベンゾイル基により保護する、下記化４で表され
る工程。【化４】第３工程；得られた化合物のアルコール性水酸基をパラ
トルエンスルホニル化する、下記化５で表される工程。【化５】但し、Tsはパラトルエンスルホニル基を表す。第４工程；得られた化合物のパラトルエンスルホニル基
にプリン塩基をカップリングさせる、下記化６で表され
る工程。【化６】但し、化６中のR¹は水素原子、アミノ基、水酸基又はメ
トキシ基、R²及びR³は水素原子又はアミノ基、R⁴はメチ
ル基、イソプロピル基、イソブチル基、ベンジル基、2-
メチルチオエチル基、又は、前記化３に示された原料ア
ミノ酸を形成し得るα位の置換基である。第５工程；得られた化合物をアルカリ中で処理してベン
ゾイル基を脱保護させる、下記化７で表される工程。【化７】
【請求項３】請求項１に記載されたプリンヌクレチオ
シド誘導体、及び／又は、その塩を有効成分として含有
してなる酵素阻害剤。