JP6798030B2

JP6798030B2 - 皮膚ケアおよび／または創傷治癒促進における松塊抽出物およびその有効成分の使用

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Publication number: JP6798030B2
Application number: JP2019533271A
Authority: JP
Inventors: リン，ハン−チン
Original assignee: Sinphar Tian Li Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sinphar Tian Li Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-09-06
Filing date: 2017-09-05
Publication date: 2020-12-09
Anticipated expiration: 2037-09-05
Also published as: WO2018045943A1; TW201811350A; JP2019529533A; CN107789373A; US20180064771A1; US11654169B2; KR20190064580A; KR102295786B1; TWI640317B; MY195806A

Description

本発明は、松塊（マツホド）（ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓ）抽出物および／またはその有効成分の使用に関し、特に、皮膚の保護および／または創傷治癒の促進における松塊抽出物および／またはその有効成分の使用に関する。松塊抽出物および／またはその有効成分は、コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を増強するのに有効であるため、それらは皮膚を保護し、および／または創傷治癒を促進することができる。

皮膚の水分量が減少すると、正常に剥がれない角質細胞が皮膚の表面に蓄積し、皮膚の光沢や弾力を失い、乾燥して荒れたように見える。しわなどの老化が始まることもある。したがって、皮膚の水分を効果的に高めることができれば、上記のような事態の発生を抑制することができる。

コラーゲンやヒアルロン酸が皮膚の水分量を高めることが確認されている。従って、現在市販されている多くのケア製品および健康食品はコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸を外から添加され、皮膚に栄養を与えること、皮膚を引き締めること、皮膚を補修すること、保湿すること、しわを滑らかにすること、皮膚老化を遅らせること、および皮膚老化を防止することの効果を宣伝する。また、コラーゲンは生体適合性が高く低免疫性で、体内で吸収および分解されるため、コラーゲンを外から加えて創傷治癒効果を訴える健康食品もある。

しかしながら、近年、世界中での人畜共通伝染病（口蹄疫、鳥インフルエンザ、狂牛病など）の発生は、動物性コラーゲンとヒアルロン酸の安全性を脅かしている。さらに外因性のコラーゲンやヒアルロン酸は、経口投与、経皮投与、注射などの投与方法にかかわらず、吸収率が低く、免疫応答が誘導される。上記の問題のため、外因性コラーゲンおよびヒアルロン酸の使用は、業界において議論の余地がある。そのため、内因性コラーゲンやヒアルロン酸の発現を増強する効果のある製剤や方法が積極的に開発されている。内因性コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を増強することによって、皮膚を保護するおよび／または創傷治癒を促進する効果を達成することができ、外因性コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸を補充することによって生じる安全性および利用可能性の問題を回避することができる。

本発明者らは、松塊抽出物および／またはその有効成分が、細胞内コラーゲン、細胞外コラーゲンおよび／または細胞外ヒアルロン酸の含量を効果的に高めることができることを見出した。すなわち、松塊抽出物および／またはその有効成分は、内因性コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の含量を効果的に高めることができ、したがって、松塊抽出物および／またはその有効成分は、皮膚を保護することおよび／または創傷治癒を促進することの少なくとも１つのために使用することができる。

したがって、本発明の１つの目的は、皮膚を保護することおよび／または創傷治癒を促進するための製剤の製造における松塊抽出物の使用を提供することである。好ましくは、松塊抽出物は、デヒドロパキム酸（ＤＰＡ）、パキム酸（ＰＡ）、デヒドロツムロース酸（ＤＴＡ）、ツムロース酸（ＴＡ）、ポリポレン酸Ｃ（ＰＡＣ）、３―エピ―デヒドロツムロース酸（ＥＤＴＡ）、デヒドロトラメテノール酸（ＤＴＡ）、トラメテノール酸（ＴＴＡ）、デヒドロエブリコ酸（ＤＥＡ）、エブリコ酸（ＥＡ）、ポリコ酸Ａ（ＰＡＡ）およびポリコ酸Ｂ（ＰＡＢ）の少なくとも１つを含む。より好ましくは、松塊抽出物は、松塊表皮抽出物であり、松塊表皮抽出物において、松塊表皮抽出物の総重量を基準として、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの総量が少なくとも４０重量％である。

上記製剤は、化粧品、ケア製品または食品として提供され、その化粧品、ケア製品および食品は、コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を増強し、それによって皮膚を保護することができる。

化粧品、ケア製品および食品は、皮膚に栄養を与えること、皮膚を引き締めること、皮膚を補修すること、保湿すること、しわを滑らかにすること、皮膚老化を遅らせること、および皮膚老化を防止することのちの少なくとも１つに使用される。

この製剤は、コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を増強し、それによって創傷治癒を促進することができる薬剤として提供される。

本発明の別の目的は、皮膚の保護および／または創傷治癒促進のための製剤の製造における有効成分の使用を提供することであり、有効成分は、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの少なくとも１つから選択される。好ましくは有効成分はポリコ酸Ａおよび／またはポリコ酸Ｂである。より好ましくは、有効成分は抽出物の形態で提供され、特に真菌抽出物または植物抽出物の形態で提供される。

好ましくは、上記製剤は化粧品、ケア製品、食品または薬剤として提供される。この薬剤は、コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を増強するのに有効であるため、創傷治癒を促進することができる。化粧品、ケア製品および食品は、コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を高めるのに有効であるため、皮膚を保護することができ、したがって、皮膚に栄養を与えること、皮膚を引き締めること、皮膚を補修すること、保湿すること、しわを滑らかにすること、皮膚老化を遅らせること、および皮膚老化を防止することのうちの少なくとも１つに使用することができる。

本発明のさらに別の目的は、皮膚を保護するおよび／または創傷治癒を促進する方法であって、有効量の上記有効成分または松塊抽出物を必要とする対象に投与することを含む方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、皮膚を保護するおよび／または創傷治癒を促進するための組成物を提供することであり、上記有効成分または松塊抽出物の有効量を含有する化粧品、ケア製品、食品または医薬品である組成物を提供する。

請求項に係る発明の特徴を当業者が十分に理解できるように、本発明のために実施される詳細な技術およびいくつかの実施形態を以下の段落に記載する。

以下、本発明の実施形態の一部について説明する。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は様々な実施形態で実施することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されるものではない。また、本明細書に別段の記載がない限り、本発明の明細書に記載された「個数指定なし」、「この」、（特に請求項において）等の表現は、単数形および複数形の両方を含むものとする。本明細書において使用される用語「有効量」は、被験体に投与された場合に、被験体におけるコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を効果的に増強し得る化合物の量を指す。本明細書において使用される用語「主語」は、ヒトおよびヒト以外の動物を含む哺乳動物を指す。なお、本明細書で使用する単位「ｍｇ／ｋｇ体重」とは、体重ｋｇあたりの投与量をいう。

上述のように、皮膚の水分含量の減少は、皮膚老化の重要な因子である。コラーゲンは、ヒトの結合組織および細胞外マトリックスの両方において重要な糖タンパク質であり、ヒトの体における全タンパク質の２０％以上を占めることが知られている。コラーゲンの基本構造は三重らせんで、３本のポリペプチド鎖が互いに巻き合ってできている。三重らせん構造は皮膚の線維芽細胞で合成され、細胞外マトリックスに分泌されて固く成熟したコラーゲン線維を形成する。こういった構造により、コラーゲンは皮膚の弾力性を維持し、皮膚の水分含量を増加させ、創傷治癒を促進する。ヒアルロン酸は真皮に豊富に存在する。ヒアルロン酸はムコ多糖類であり、効果的な保湿剤であるため、皮膚の弾力性や水分量を維持し、しわを減らし、皮膚の老化を防ぐことができる。

ハーブＦＵ―ＬＩＮＧはツガサルノコシカケ科の菌類である松塊（Ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ．）Ｗｏｌｆ）の乾燥菌核を指す。松塊（Ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓ（ＦＵ―ＬＩＮＧ））真菌はしばしばマツの根に寄生する。松塊（Ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓ（ＦＵ―ＬＩＮＧ））の外層は淡褐色（松塊表皮部）であり、松塊（Ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓ（ＦＵ―ＬＩＮＧ））の内層は桃色または白色（松塊肉部）である。伝統的漢方薬古典によれば、松塊は鎮静、利尿、栄養補給、免疫増強、老化遅延などに使用される。現代の医学研究はまた、松塊が抗炎症、抗腫瘍、免疫系調節、血糖降下、栄養分吸収促進などの機能を有することを確認している。本発明者らは、松塊抽出物が、細胞におけるコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸（すなわち、内因性コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の含量の増大）の発現を効果的に促進し得ることを見出した。したがって、松塊抽出物は、皮膚を保護し、創傷治癒を促進するために使用することができる。

したがって、本発明は、皮膚を保護するおよび／または創傷治癒を促進するための製剤の製造における松塊抽出物の使用を含み、皮膚を保護するおよび／または創傷治癒を促進するために松塊抽出物を必要とする対象に投与する方法を含む皮膚を保護するおよび／または創傷治癒を促進するための松塊抽出物の使用を提供し、および松塊抽出物を含む組成物を提供する。

本発明によれば、松塊抽出物は、粗抽出物であってもよいし、以下の工程を含む作業により提供される抽出物であってもよい。工程（ａ）松塊（原料等）を第１の極性溶媒で抽出して粗抽出物を得る。工程（ｂ）粗抽出物を乾燥して粗抽出物粉末を得る。工程（ｃ）粗抽出粉末を第２の極性溶媒で抽出し、松塊抽出物を得る。第１の極性溶媒と第２の極性溶媒とは、同一または異なるものであり、それぞれ、水、エタノールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明のいくつかの態様において、同じまたは異なるエタノール濃度を有する水性エタノール溶液を、第１の極性溶媒および第２の極性溶媒として使用した。

工程（ａ）において、原料は「松塊表皮」および／または松塊肉であり得る。第１の極性溶媒と原料との量の比は、任意に調整することができる。一般的に、第１の極性溶媒に材料を均一に分散させることができれば、第１の極性溶媒の使用量に特に制限はない。例えば、工程（ａ）において、第１の極性溶媒および原料は、約８：１〜約１６：１（第１の極性溶媒：原料）の範囲の体積比で使用することができる。本発明の一実施形態では、工程（ａ）の抽出は、松塊表皮（原料として）およびエタノール水溶液（第１の極性溶媒として）を用いて、原料に対するエタノール水溶液の体積比が８：１で行われた。本発明の別の態様において、工程（ａ）の抽出は、松塊表皮および肉（原料として）およびエタノール水溶液（第１の極性溶媒として）を用いて、原料に対するエタノール水溶液の体積比が８：１であるようにして行った。

工程（ａ）では、第１の極性溶媒の採用に応じて、適当な時間抽出を行うことができる。第１の極性溶媒としてエタノール水溶液を用い、エタノール水溶液：松塊の体積比が８：１の場合、抽出時間は通常１時間以上、好ましくは２時間以上、より好ましくは３時間以上である。工程（ａ）は、必要に応じて、煎じ込み、冷却、濾過、真空濃縮、および樹脂カラムクロマトグラフィーなどの他の操作を伴うことができる。任意に、松塊は、工程（ａ）を実施する前に、第１の極性溶媒に一定時間予め浸漬することができる。例えば、松塊は、エタノール水溶液が第１の極性溶媒として供される場合、約１２時間、第１の極性溶媒に予め浸漬され得る。

工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られた第２の極性溶媒と粗抽出粉の量の比率を任意に調整することができる。一般に、粗抽出粉末を第２の極性溶媒中に均一に分散させることができれば、第２の極性溶媒の使用量に特に制限はない。例えば、工程（ｃ）において、第２の極性溶媒および松塊の粗抽出粉末は、約８：１〜約１６：１（第１の極性溶媒：松塊の粗抽出物粉末）の範囲の体積比で用いることができる。本発明の１つの態様において、工程（ｃ）の抽出は、第２の極性溶媒としてエタノール水溶液を用い、松塊の粗抽出粉末に対するエタノール水溶液の体積比が８：１で行われた。

本発明に用いられる松塊抽出物は、工程（ｃ）で得られた液体抽出物を乾燥することにより得られる乾燥物である。可能な限り高い抽出効率を達成するために、工程（ｂ）に先立って、同じまたは異なる第１の極性溶媒を用いて松塊の抽出を任意に繰り返し、こうして得られた液体抽出物を組み合わせて、工程（ｂ）で使用するための粗抽出物を提供することができる。また、工程（ｂ）、工程（ｃ）、および上述した他の任意の作業のサイクルを繰り返すことができる。

以下の実施例に示すように、本発明によれば、松塊抽出物から、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピーデヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａ、ポリコ酸Ｂなどの成分を精製して単離することができる。

本発明者らはさらに、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの全てが、細胞を効果的に促進してコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸（すなわち、内因性コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の含量の増大）を発現させ、従ってそれらを保護することができることを見出した。従って、本発明は、皮膚の保護および／または創傷治癒の促進における有効成分の使用にも関し、ここで、有効成分は、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの少なくとも１つから選択される。上記使用は皮膚を保護しかつ／または創傷治癒を促進するための製剤の製造における有効成分の使用と、皮膚を保護するおよび／または創傷治療を促進する方法であり、必要な対象に有効成分および有効成分を含む組成物を投与することとを含む。好ましくは、本発明に従って採用される有効成分は抽出物の形で提供される。より好ましくは、有効成分は、真菌抽出物または植物抽出物の形態で提供される。

本発明によれば、製剤または組成物は、化粧品、ケア製品、食品または薬剤として提供される。製剤または組成物が化粧品またはケア製品として提供される場合、所望の目的に応じて、化粧品またはケア製品は、特に限定されない任意の適切な形態で提供され得る。例えば、化粧品またはケア製品は、乳剤、クリーム、ゲル（例えば、ヒドロゲル）、ペースト（例えば、分散ペースト、軟膏）、スプレーまたは外用溶液（例えば、洗浄液、懸濁液）の形態で提供することができるが、これに限定されるものではない。あるいは、本発明の製剤または組成物は、健康食品、美容飲料などの嚥下または飲用の食品に製造することができる。さらに、本発明の製剤または組成物は、皮下投与のための注射の形態で提供することもできる。

同様に、製剤または組成物が薬剤として提供される場合、所望の目的に応じて、薬剤は、特に限定されない任意の適切な形態で提供され得る。例えば、薬剤は、皮膚を保護しおよび／または創傷治癒を促進するために、経口または非経口（例えば、経皮、皮下または静脈内）経路によって必要な対象に投与することができるが、投与はそれによって制限されるものではない。形態および目的に応じて、適切な担体が選択され、薬剤を提供するために使用され得、ここで、担体は、賦形剤、希釈剤、助剤、安定剤、吸収遅延剤、崩壊剤、ハイドロトロープ剤、乳化剤、酸化防止剤、接着剤、結合剤、粘着付与剤、分散剤、懸濁剤、潤滑剤、および／または吸湿剤などを含む。

経口投与用の剤形として、医薬は、有効成分の所望の効果に悪影響を及ぼさない任意の薬学的に許容される担体を含むことができる（すなわち、松塊抽出物、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの少なくとも１つ）。例えば、薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたはその類似物、セルロース、デンプン、糖ベントナイト、およびそれらの組み合わせであり得る。薬剤は、錠剤（例えば糖衣錠）、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、流エキス剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、チンキ剤などの形態のような、経口投与に適した任意の形態で提供することができる。

皮下または静脈内投与に適した注射剤または点滴剤の形態に関しては、薬剤は、等張溶液、塩緩衝生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水またはクエン酸緩衝生理食塩水）、ハイドロトロープ剤、乳化剤、５％糖溶液、および静脈内投与、乳化静脈内注入、注射用粉末、注射用懸濁液、または注射用粉末懸濁液等として薬剤を提供するための他の担体のような１つまたはそれ以上の成分を含むことができる。あるいは、薬剤は、注射前固体として調製され得る。注射前固体は、他の溶液または懸濁液に可溶な形態で、または乳化可能な形態で提供することができる。所望の注射は、必要な対象に投与される前に、前注射固体を他の溶液または懸濁液に溶解するか、またはそれを乳化することによって提供される。

必要に応じて、本発明に従って提供される製剤または組成物は、製剤または組成物の嗜好性および視覚認識を高めるための香味剤、トナー、または着色剤、および／または製剤または組成物の安定性および保存性を改善するための緩衝剤、保存剤、防腐剤、抗菌剤、または抗真菌剤などの適切な量の添加剤をさらに含むことができる。さらに、製剤または組成物は、任意に、１つまたはそれ以上の他の有効成分（例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン、マンデル酸、アルブチンなど。）をさらに含むか、または１つまたはそれ以上の他の有効成分を含む化粧品または薬剤と組み合わせて使用して、製剤または組成物の効果をさらに高めるか、または他の有効成分が本発明の製剤または組成物の所望の効果に悪影響を及ぼさない限り、このようにして提供される製剤または組成物の適用の柔軟性および適応性を高めることができる。

被験者の必要性、年齢、体重、健康状態に応じて、本発明に従って提供される製剤または組成物は、１日に１回、１日に複数回、または数日に１回など、様々な投与頻度で投与することができる。

本発明はまた、有効量の有効成分（すなわち、松塊抽出物、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの少なくとも１つ）を必要とする被験体に投与することを含む、皮膚を保護する方法および創傷治癒を促進する方法の少なくとも１つを提供する。本発明の皮膚の保護および創傷治癒の促進の少なくとも１つの方法において、関連する治療における有効成分の種類、投与経路、投与形態、適切な投与量および使用は全て上記の説明のとおりである。

以下、本発明を具体例を用いて詳細に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。

例
［調製例］
Ａ. 松塊抽出物の調製

Ａ―１．松塊（ハーブＦＵ―ＬＩＮＧとも呼ばれる；生息地：中国雲南省）を洗浄し、皮を剥いて（以下「松塊表皮」という）、残りは肉（以下「松塊肉」という）。

Ａ―２．Ａ―１から得た松塊表皮を７５％エタノール水溶液（Ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓｅｐｉｄｅｒｍｉｓ：７５％エタノール水溶液＝１：８容量）に室温で１２時間浸漬した後、３時間煮沸して液体抽出物を得た。上記の抽出手順を３回繰り返した。３回の抽出から得た液体抽出物を合わせ、濾過して不溶物を除去し、粗抽出液を得た。粗抽出液に含まれる溶媒を真空濃縮により除去し、濃縮溶液を得た。濃縮溶液を噴霧乾燥機で乾燥し、粗抽出粉末を得た。

Ａ―３．Ａ―２から得た粗抽出粉末を９５％エタノール水溶液（粗抽出粉末：９５％エタノール水溶液＝１：８容量）で３時間抽出し、得られた抽出液をシリカゲルの固定相カラムで溶出して松塊表皮抽出物を得た。

Ａ―４．Ａ―３から得た松塊表皮抽出物の成分を、ダイオードアレイＵＶ検出と質量分析計を組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ）により、それぞれ２４３ｎｍと２１０ｎｍの波長で測定し、抽出物に含まれる各成分の含量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。その結果を表１に示す。

Ａ―５．Ａ―１から得た松塊表皮および肉を組み合わせて、上記Ａ―２およびＡ―３の抽出を繰り返し、松塊抽出物を得た。その後、得られた抽出物の成分をＡ―４の分析法により測定した。その結果、松塊抽出物はデヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａ、ポリコ酸Ｂなどを含むことが分かった。

Ｂ．松塊抽出物中の有効成分の調製
Ｂ―１．Ａ―５から得た松塊抽出物をメタノール（松塊抽出物：メタノール＝１：５００容量）に均一に分散させて混合物を得た。その後、混合物を濾過して不溶物を除去した。残りの濾液を、それぞれ、２４３ｎｍおよび２１０ｎｍの波長で分取高速液体クロマトグラフィー（メタノール／水混液の移動相）によって精製し、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの一部を回収した。回収した部分を真空濃縮してメタノールを除去し、それぞれデヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂを得た。

Ｂ―２．Ｂ―１から得たデヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂは、ダイオードアレイＵＶ検出および質量分析計と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ）により、それぞれ２４３ｎｍおよび２１０ｎｍの波長で検出され、結果、全成分の純度は９８％より高かった。

Ｃ．細胞培養
正常初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣから購入）を線維芽細胞増殖培地で培養した。このようにして得られた細胞を以下の実験に用いた。

実施例１：細胞のコラーゲンおよびヒアルロン酸発現能力に対する松塊抽出物の効果
［調製例Ｃ］から提供された正常初代ヒト皮膚線維芽細胞を４グループに分け、それぞれ以下の培地で４８時間培養した。
１．グループＩ：線維芽細胞増殖培地；
２．グループＩＩ：［調製例Ａ―３］から得た松塊表皮抽出物０．００５μｇ／ｍｌを含む線維芽細胞増殖培地；
３．グループＩＩＩ：［調製例Ａ―３］から得た松塊表皮抽出物０．０５μｇ／ｍｌを含む線維芽細胞増殖培地；
４．グループＩＶ：［調製例Ａ―３］から得た松塊表皮抽出物０．５μｇ／ｍｌを含む線維芽細胞増殖培地。

その後、各群の細胞培地を回収し、濃縮した。次いで、コラーゲンの細胞内含量、細胞培地中のコラーゲン含量（すなわち、コラーゲンの細胞外含量）および細胞培地中のヒアルロン酸含量を測定し、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により分析した。最後に、対照群（すなわち、グループＩの培地で培養されている細胞）の結果を１００％として、他の群のコラーゲンとヒアルロン酸の相対含量（パーセントで表示）を計算するための基礎として用いた。その結果を表２に示す。

表２に示されるように、対照群と比較して、本発明の松塊抽出物（すなわち、グループＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの培地で培養されている細胞）で処理される細胞は、コラーゲンの細胞内含量、細胞培地中のコラーゲンの含量（すなわち、コラーゲンの細胞外含量）および細胞培地中のヒアルロン酸の含量が有意に増加した。上記の結果は、本発明の松塊抽出物が、線維芽細胞におけるコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を効果的に増強すること（すなわち、内因性コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の含量の増大）ができ、従って、皮膚の保護または創傷治癒の促進の少なくとも１つのために使用することができることを示す。

実施例２：松塊抽出物の有効成分が細胞のコラーゲンおよびヒアルロン酸発現能力に及ぼす影響
（２―１）コラーゲンの細胞内発現
［調製例Ｃ］から提供された正常初代ヒト皮膚線維芽細胞を３７群に分け、それぞれ以下の培地で４８時間培養した。
１．グループ１：線維芽細胞増殖培地
２. グループ２―１〜グループ２―３：［調製例Ｂ］から得たパキム酸（ＰＡ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
３．グループ３―１〜グループ３―３：［調製例Ｂ］から得たデヒドロパキム酸（ＤＰＡ）を、それぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
４．グループ４―１〜グループ４―３：［調製例Ｂ］から得たツムロース酸（ＴＡ）を、それぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
５．グループ５―１〜グループ５―３：［調製例Ｂ］から得たデヒドロツムロース酸（ＤＴＡ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
６．グループ６―１〜グループ６―３：［調製例Ｂ］から得たポリポレン酸Ｃ（ＰＡＣ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
７．グループ７―１〜グループ７―３：［調製例Ｂ］から得た３―エピ―デヒドロツムロース酸（ＥＤＴＡ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
８．グループ８―１〜グループ８―３：［調製例Ｂ］から得たデヒドロトラメテノール酸（ＤＴＴＡ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
９．グループ９―１〜グループ９―３：［調製例Ｂ］から得たトラメテノール酸（ＴＴＡ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
１０．グループ１０―１〜グループ１０―３：［調製例Ｂ］から得たポリコ酸Ａ（ＰＡＡ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
１１．グループ１１―１〜グループ１１―３：［調製例Ｂ］から得たデヒドロエブリコ酸（ＤＥＡ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
１２．グループ１２―１〜グループ１２―３：［調製例Ｂ］から得たポリコ酸Ｂ（ＰＡＢ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地；
１３．グループ１３―１〜グループ１３―３：［調製例Ｂ］から得たエブリコ酸（ＥＡ）をそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭおよび１μＭの濃度で含む線維芽細胞増殖培地。

その後、各群の細胞培地を回収し、濃縮した。次いで、コラーゲンの細胞内含量を測定し、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により分析した。最後に、対照群（すなわち、グループ１の培地で培養されている細胞）の結果を１００％として、他の群のコラーゲンの相対含量（パーセントで表示）を計算するための基礎として用いた。その結果を表３に示す。

表３に示されるように、対照群と比較して、パキム酸、デヒドロパキム酸、ツムロース酸、デヒドロツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、デヒドロトラメテノール酸またはポリコ酸Ａで処理された細胞は、コラーゲンの細胞内含量が有意に増加した。上記の結果は、パキム酸、デヒドロパキム酸、ツムロース酸、デヒドロツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、デヒドロトラメテノール酸、およびポリコ酸Ａが、線維芽細胞におけるコラーゲンの発現を効果的に増強すること（すなわち、内因性コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の含量の増大）ができ、したがって、皮膚の保護および創傷治癒の促進の少なくとも１つのために使用することができることを示す。

（２―２）コラーゲンの細胞外発現
コラーゲンの細胞外発現に対する本発明の有効成分の効果を理解するために、実施例（２―１）から得た各群の濃縮細胞培地を測定し、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）によって分析した。各群の培地中のコラーゲン含量（すなわち、コラーゲンの細胞外含量）を測定した。最後に、対照群（すなわち、グループ１の培地で培養されている細胞）の結果を１００％とし、他の群のコラーゲンの相対含量（パーセントで表示）を計算するための基礎として用いた。その結果を表４に示す。

表４に示すように、対照群と比較して、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂで処理した細胞は、コラーゲンの細胞外含量が有意に増加した。上記の結果は、本発明の有効成分が、線維芽細胞におけるコラーゲンの発現を効果的に増強することができ、従って、皮膚の保護および創傷治癒の促進の少なくとも１つのために使用することができることを示す。

（２―３）ヒアルロン酸の細胞外発現
ヒアルロン酸の細胞外発現に対する本発明の有効成分の効果を理解するために、実施例（２―１）から得た各群の濃縮細胞培地を、ウェスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定し、分析した。各群の培地中のヒアルロン酸含量（すなわちヒアルロン酸の細胞外含量）を測定した。最後に、対照群（すなわち、グループ１の培地で培養されている細胞）の結果を１００％として、他の群のヒアルロン酸の相対含量（パーセントで表示）を計算するための基礎として用いた。その結果を表５に示す。

表５に示すように、対照群と比較して、デヒドロパキム酸、パキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、ポリポレン酸Ｃ、３―エピ―デヒドロツムロース酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａまたはポリコ酸Ｂで処理した細胞は、ヒアルロン酸の細胞内含量が有意に増加した。パキム酸、デヒドロパキム酸、ツムロース酸、デヒドロツムロース酸または３―エピ―デヒドロツムロース酸で処理した細胞中のヒアルロン酸含量は、より有意に増加した。上記の結果は、本発明の有効成分が、線維芽細胞におけるヒアルロン酸の発現を効果的に増強することができ、従って、皮膚を保護するために使用することができることを示す。

上記の例に示されるように、本発明の松塊抽出物および／またはその有効成分は、実際に、細胞におけるコラーゲンおよびヒアルロン酸の発現を増強することができ（すなわち、内因性コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の含量を増強する能力を有すること）、したがって、皮膚の保護（皮膚に栄養を与える、皮膚を引き締める、皮膚を補修する、保湿する、しわを滑らかにする、皮膚の老化を遅らせる、皮膚の老化を防ぐなど）および創傷治癒の促進の少なくとも１つに用いられる。

Claims

松塊抽出物がパキム酸（ＰＡ）を含まない松塊表皮抽出物であり、
有効量の前記松塊抽出物を有するコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を増強するための製剤。
松塊抽出物が、デヒドロパキム酸（ＤＰＡ）、デヒドロツムロース酸（ＤＴＡ）、ツムロース酸（ＴＡ）、ポリポレン酸Ｃ（ＰＡＣ）、３―エピ―デヒドロツムロース酸（ＥＤＴＡ）、デヒドロトラメテノール酸（ＤＴＴＡ）、トラメテノール酸（ＴＴＡ）、デヒドロエブリコ酸（ＤＥＡ）、エブリコ酸（ＥＡ）、ポリコ酸Ａ（ＰＡＡ）およびポリコ酸Ｂ（ＰＡＢ）の少なくとも１つを含む請求項１に記載の製剤。
前記松塊表皮抽出物において、松塊表皮抽出物の総重量を基準として、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの総量が少なくとも４０重量％である請求項１に記載の製剤。
化粧品、ケア製品または食品として提供される請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
前記化粧品、ケア製品および食品は、皮膚に栄養を与えること、皮膚を引き締めること、皮膚を補修すること、保湿すること、しわを滑らかにすること、皮膚の老化を遅らせること、および皮膚の老化を防ぐことのうちの少なくとも１つに使用されることを特徴とする請求項４に記載の製剤。
前記製剤が薬剤として提供され、創傷治癒を促進するために使用される請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
有効成分を有効量含むコラーゲンおよび／またはヒアルロン酸の発現を増強するために用いられる製剤であって、前記有効成分がデヒドロパキム酸、デヒドロツムロース酸、ツムロース酸、３―エピ―デヒドロツムロース酸、デヒドロトラメテノール酸、トラメテノール酸、デヒドロエブリコ酸、エブリコ酸、ポリコ酸Ａおよびポリコ酸Ｂの少なくとも１つである製剤。
前記有効成分が、ポリコ酸Ａおよび／またはポリコ酸Ｂであることを特徴とする請求項７に記載の製剤。
前記有効成分が抽出物の形態で提供される請求項７または８に記載の製剤。
前記有効成分が、真菌抽出物または植物抽出物の形態で提供される請求項７〜９に記載の製剤。
前記製剤が化粧品、ケア製品または食品として提供される請求項７〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
化粧品、ケア製品および食品が、皮膚に栄養を与えること、皮膚を引き締めること、皮膚を補修すること、保湿すること、しわを滑らかにすること、皮膚の老化を遅らせること、および皮膚の老化を防ぐことのうちの少なくとも１つに使用される請求項１１に記載の製剤。
前記製剤が薬剤として提供され、創傷治癒を促進するために使用される請求項７〜１０のいずれか一項に記載の製剤。