-
Inflammatorische Prozesse bilden bekanntermaßen die Ursache für viele Erkrankungen
(z. B. Arthritis, Ateriosklerose, Allergien, Schmerz). Sie werden in zunehmendem Maße
auch mit Altern und neurodegenerativen Veränderungen in Verbindung gebracht. Daher
bemüht man sich weiter intensiv um die Aufklärung der genetischen und biochemischen
Grundlagen der in Inflammationen involvierten Bestandteile regulatorischer Kaskaden, die
als Targets für spezifisch angreifende antiinflammatorische Wirkstoffe und damit als Mittel
zur Bekämpfung von Krankheiten geeignet sind. 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen
(HSD) sowie Isoenzyme der Cyclooxygenasen, wie z. B. Cyclooxygenase-I (Cox-1) und
Cyclooxygenase-II (Cox-2), wurden als Schlüsselenzyme der Inflammationskaskade
erkannt. 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (HSD) vermittelt den Abbau körpereigener,
antiinflammatorisch und immunsuppressiv wirksamer Glucocorticoide (Penning, T. M.:
Inhibition of 5β-Dihydrocortisone reduction in rat liver cytosol: a rapid spectrophotometric screen
for nonsteroidal antiinflammatory drug potency. J. Pharm. Sci. 74, 651-654, 1985).
Inhibitoren dieses Enzyms sind von Interesse, da sie den Cortisolabbau verzögern und damit
Entzündungen hemmen. Die Cyclooxygenasen I und II katalysieren die Umwandlung von
Arachidonsäure zu Prostaglandinen, die starke Entzündungsmediatoren sind. Die
verschiedenen Gewebe zeichnen sich durch die Anwesenheit von Isoenzymen der Cyclooxygenasen
aus. So enthalten auch Hirnzellen Cyclooxygenase-II, deren Beteiligung an der Entstehung
der gefürchteten Alzheimerschen Erkrankung und am Parkinson-Syndrom diskutiert wird
(P. L. McGeer: Cyclooxygenase-Inhibitors. Drugs and Aging 2000, 17, 1-1; P. Teismann, B.
Ferger: Inhibition of Cyclooxygenase Isoenzymes Cox-1 and Cox-2 Provide
Neuroprotection in the MPTP-mouse model of Parkinson's disease. Synapse 39, 167-174, 2001; L. J.
Craffort: Clinical experience with specific Cox-2-inhibitors in Arthritis. Current Pharmacol.
Design 6, 1725-1736, 2000; P. Needleman, P. T. Manning: Osteoarthritis and cartilage 7,
367-370, 1999).
-
Es sind bereits Inhibitoren von HSD sowie von Cox-1 und Cox-2 bekannt und zu
therapeutischen und anderen Anwendungen gebracht worden. Ihr Anwendungsbereich betrifft
sowohl die Behandlung akuter Erkrankungen als auch die Prävention entzündlicher Prozesse
und die Gesundheitspflege. Die bereits in der Anwendung befindlichen HSD- und COX-
Inhibitoren zeichnen sich durch eine Reihe von Nachteilen aus, wie ungenügende
Wirksamkeit, unvorteilhafte pharmakologische Eigenschaften und insbesondere starke
Nebenwirkungen. Daher besteht die Aufgabe, nach neuen wirksamen Inhibitoren der HSD, COX-
1 und COX-2 zu suchen, die diese Nebenwirkungen nicht aufweisen bzw. als
Leitstrukturen für die Entwicklung neuer antiinflammatorischer Mittel, Gesundheitspflegemittel und
Kosmetika geeignet sind.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst,
daß pilzliche Lanostane, wie sie in Fruchtkörpern oder Myzelien von Poria cocos,
Daedalea quercina, Polyporus betulinus, Hypholoma fasciculare, Hebeloma senesens und
Ganoderma lucidum vorkommen und die duch den Fachmann bekannte Extraktions- und
Isolierungsverfahren gewonnen werden, als Einzelsubstanzen oder als Gemische als
Inhibitoren der 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (HSD) sowie der Cyclooxygenasen-I (Cox-
1) und -II (Cox-2) und für die Herstellung von Arzneimitteln, Gesundheitspflegemitteln und
Kosmetika eingesetzt werden.
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Aus Skerotien des Ascomyceten Poria cocos (Wolfiporia cocos) wurden bereits Lanostane
der allgemeinen Formeln I und II isoliert und strukturell aufgeklärt (T. Tai et al.
Phytochmistry 40, 225-231, 1995). Ebenso sind die Quercininsäuren aus dem Basidiomyceten
Daedalea quercina, die Fasciculole und Fasciculinsäuren aus Hypholoma fasciculare, die
Hebelomasäuren aus Hebeloma senescens, die Polyporensäuren aus Betulinus polyporus
und die Ganoderic Acids aus Ganoderma lucidum bekannt (H: Laatsch, Antibase,
Database of Bioactive Microbial Products, Chemical Concenpts Heidelberg, 2000; Chapman and
Hall Database of Natural Compounds on CD ROM, Edition 2001, Chapman Hall).
-
Nicht bekannt ist jedoch bisher die Wirksamkeit von Verbindungen der allgemeinen
Formeln I und II als Inhibitoren von HSD, COX-1 und COX-2. Die Verwendung von
Pilzbestandteilen, wie z. B. solcher des Ascomyceten Poria cocos oder des Basidiomyceten
Ganoderma lucidum als Bestandteil diverser medizinisch und kosmetisch wirksamen
Zubereitungen wurde bereits in Patenten beansprucht, ohne daß diese Ansprüche durch
festgestellte biochemische Interaktionen von Inhaltsstoffen mit krankheitsrelevanten Targets
begründet wurden. Beispielsweise wird Poria cocos cocos mit der Ausnahme eines Patentes
(siehe z. B. Maybeck, A. und Bonte, F., US-Pat No. 5.716.800, PCT/FR 94/00.786; 27.12.
1995, "Anti-acne composition containing a Poria cocos Wolfextract") in native
(nichtextrahierter) Form in variablem Mischungsverhältnis mit zahlreichen pflanzlichen
Naturprodukten zur Anwendung gebracht (siehe z. B. Murad, H., US-Pat. 5.804.168; 8.9.1998;
Pharmaceutical compositions and methods for protecting and treating sun damaged skin").
Diese Patente sind daher im Falle der vorliegenden Erfindung nicht relevant. Für die anderen
oben genannten Pilzinhaltsstoffe konnten keine Wirkungen deren Anwendung als
Inhibitoren der HSD und der Cyclooxygenasen betreffende Patente ermittelt werden.
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Es wurde überraschend gefunden, daß pilzliche Lanostane vom Typ I und II
mit den Resten R1, R2, R3, R4 und R5, vorkommend in Tumulosinsäure und deren
Derivaten aus dem Pilz Poria cocos, den Quercininsäuren aus dem Pilz Daedalea quercina, den
Hebelomasäuren aus dem Pilz Hebeloma senescens, den Polyporensäuren aus
Polyporus betulinus, den Fasciculolen und Fasciculinsäuren aus dem Pilz Hypholoma fascicularis
und den Ganoderic acids aus Ganoderma lucidum als Einzelsubstanzen oder Gemische
diese Enzyme stark inhibieren.
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Worin die Substituenten z. B. die folgenden Bedeutungen haben:
R1 = H, OH, -O-(3'-Methyl-3'-hydroxy-glutaryl-N-glycine),
-O-(3'-Methyl-3'-hydroxyglutaryl), wobei die Substituenten - oder β-ständig sein können
R2 = OH, -O-(3'-Methyl, 3'-hydroxy-glutaryl-N-glycine), -O-(3'-Methyl, 3'-hydroxy-glutaryl),
-O-Acetyl, -O-Malonyl, -O-Malonsäuremethylester, wobei die Substituenten - oder
βständig sein können
R3 = -CH(CH3)CH2C(=CH2)CH(CH3)COOH, -CH(COOH)CH2)C(=CH2)CH(CH3)2,
-CH(COOH)(CH2)2C(=CH2)CH(CH3)COOH, -CH(CH3)CH2CH(OH)C(CH3)2OH,
-CH(CH2OH)CH2CH(OH)C(CH3)2OH, -CH(CH3)CH2C(=O)CH2CH(CH3)COOH,
-CH(CH3)CH2C(=O)CH(CH3)CH(CH3)COOH, -2'(1'-Hydroxy-5'-(2"-Hydroxypropan),
-2'(1'-Acetoxyoxy-5'-(2"-Hydroxypropan), -CH(CH2OH)CH2CH(OH)C(OH)(CH3)2,
-CH(COOH)CH2C(=CH2)C(CH3)2OH, -CH(CH3)(CH2)2C=C(CH3)COOH,
-CH(CH3)(CH2)2C=C(CH3)CH2OH, wobei die Substituenten - oder β-ständig sein können
R4 = H, -OH oder β-OH
R5 = H, -OH oder β-OH
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Tumulosinsäure, Quercininsäuren, Fasciculinsäuren, Fasciculole, Polyporensäuren,
Hebelomasäuren und Ganoderic Acids (Ganoderinsäuren) und deren Derivate können auf
dem Fachmann bekanntem Wege aus Fruchtkörpern, Myzelien und Sklerotien von Asco-
oder Basidiomyceten z. B. durch Extraktion mit Lösemitteln oder überkritischem CO2
gewonnen und für die Anwendung bereitgestellt werden (H. Laatsch, Antibase, Dictionary of
Microbial Products, Chemical Concepts, Heidelberg, 2000; Chapman & Hall, Dictionary of
Natural Products on CD-ROM, Ed. 2000, Chapman & Hall Publishers).
-
Die Erfindung betrifft somit
die Verwendung von pilzlichen Lanostanen der allgemeinen Formeln I und II als Inhibitoren
der 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und Cyclooxygenasen-I und -II,
die Verwendung von pilzlichen Lanostanen der allgemeinen Formeln I
und II als Bestandteil von Therapeutika für Erkrankungen, an deren Entstehung und
Pathogenese 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und die Cyclooxygenasen-I und -II beteiligt
sind sowie die Anwendung von Lanostanen der allgemeinen Formeln I und II als
Einzelsubstanzen oder in Form von Gemischen für die Herstellung von pharmazeutischen und
kosmetischen Zubereitungen sowie Gesundheitspflegemitteln.
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Die Anwendung von Lanostanen der allgemeinen Formeln I und II kann einzeln oder als
Gemisch mit anderen Inhaltsstoffen von Pilzen wie Poria cocos, Hebeloma senescens,
Polyporus betulinus, Hypholoma fasciculare, Daedalea quercina oder Ganoderma
lucidum in Form üblicher Zubereitungen, z. B. als Suspensionen und Lösungen in Ölen und
Salben, in oral applizierbaren Kapseln oder in Liposomen erfolgen.
Ausführungsbeispiele
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Die Erfindung wird durch folgende Beispiele belegt, ohne sie dadurch zu begrenzen. Diese
Beispiele betreffen Poria cocos, treffen jedoch in gleicher Weise für die in der Erfindung
genannten anderen Quellen für Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II zu.
Beispiel 1
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Für die Herstellung von Extrakten des Pilzes Poria cocos (identisch mit Wolfiporia cocos)
werden beispielsweise Sklerotien oder in Kultur angezogene Myzelien verwendet. Die
Extraktion von 5 kg in Scheiben geschnittener Sklerotien oder Myzelmasse erfolgt mit 10 l
eines 1 : 1 Gemisches von Dichlormethan und Methanol für 36 Stunden bei Raumtemperatur.
Die Extraktion wird auf gleiche Weise wiederholt. Die vereinigten Extrakte werden im
Vakuum zur Trockne eingeengt. Anwesendes Wasser im Rückstand wird durch Lyophilisation
entfernt. Es hinterbleiben 7,5 g eines hellbraunen Rückstandes, der in organischen
Lösemitteln, Fetten und Ölen gut löslich ist. Die Analyse des Gemisches mittels LC-MS zeigt die
Anwesenheit von Lanostanen der allgemeinen Formeln I und II in der von T. Tai et al.
(Phytochemistry 40, 225-231, 1995) publizierten Zusammensetzung. Der so erhaltene
Extrakt zeigt starke Wirksamkeit gegen 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und
Cyclooxygenase I und II (siehe Anwendungsbeispiele 3 und 4). Analog können die Extrakte anderer
Pilze hergestellt werden.
Beispiel 2
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Die Herstellung von Lanostan-haltigen Extrakten des Pilzes Poria cocos erfolgt mit
überkritischem CO2 bei einem Druck von 100-800 bar und einer Temperatur von 40-90°C. Zur
Beschleunigung der Extraktion können geeignete, dem Fachmann bekannte Hilfsmittel, wie
Alkohole, zugesetzt werden. Aus 5 kg Poria cocos-Sklerotien, die in Scheiben geschnitten
wurden, wird ein flüssiges Extraktprodukt erhalten, aus dem der farblose Feststoffanteil
durch Filtration von der wässrigen Phase abgetrennt werden kann. Nach Trocknung im
Vakuum hinterbleiben 1,0-1,5 g farbloses und geruchloses Pulver, das den von Tai et al.
(Phytochemistry 40, 225-231, 1995) publizierten Gehalt an Lanostanen der allgemeinen
Formel I und II besitzt. Auf analoge Weise werden Verbindungen der Formeln I und II
durch Extraktion anderer oben genannter Pilze erhalten.
Beispiel 3
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Die Inhibierung der 3α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase durch Poria cocos-Extrakte und
Tumulosinsäure als Vertreter der darin enthaltenen Lanostane wurde nach Penning et al.
(J. Pharmaceutical Sciences 1985, 74, 651-654) im NADPH-gekoppelten Test bestimmt.
-
Extrakte von Deadalea quercina, Polyporus betulinus, Hypholoma fasciculare und
Hypholoma senescens und Ganoderma lucidum zeigen qualitativ die gleiche Wirksamkeit
Testprinzip, Testziel, Testaussage
-
Werden Zellen und Gewebe des lebenden Organismus durch chemische oder
physikalische Reize, belebte Organismen oder Allergene gereizt oder geschädigt, erfolgen als
Antwort eine Reihe vitaler Reaktionen, die mit den Begriffen Entzündung oder Irritation zu
charakterisieren sind. Mit dem Tod des Organismus verliert die Entzündung ihren Sinn.
-
Zellfreie Testsysteme sind zum Nachweis entzündungshemmender (antiinflammatorisch,
antiphlogistisch) Wirkungen deshalb als problematisch anzusehen. Dennoch wurden in den
letzten Jahren solche Test-Systeme etabliert. Sie zielen auf die Hemmung eines in der
Entzündungskaskade enthaltenen Enzymes ab, wie beispielsweise der 3α-HSD.
-
Die 3α-HSD katalysiert spezifisch die Reduktion von 5β-Dihydrocortison, und zwar unter
NADPH-Verbrauch, der mit einem Reader photometrisch nachgewiesen wird.
-
Die 3α-HSD-Aktivität aus Rattenleber-Cytosol wird durch nichtsteroidale Antiphlogistika
konzentrationsabhängig gehemmt, so daß sich mit diesem zellfreien Test potentielle
nichtsteroidale Entzündungshemmer erfassen lassen.
-
Geprüft wird der Einfluß von 2 Poria cocos-Präparaten auf die 3α-HSD-Aktivität.
Methode
Chemikalien/Reagenzien
-
- - 1 M Phosphat-Puffer: pH 6,0
- - Aqua dest.:
- - 9 mM NADPH: (SIGMA CHEMICAL CO.)
- - 5 mM 5β-dihydrocortison: (SIGMA CHEMICAL CO.)
- - Cortison: (SIGMA CHEMICAL CO.)
- - Indomethacin-Standard: (SIGMA CHEMICAL CO.)
- - Rattenleber-Cytosol: (HKI)
- - Trispuffer: (HKI)
- - Prüfsubstanz:
- 1. Poria cocos-Extrakt (ethanolisch)
- 2. Poria cocos-Probe (komplett)
Herstellung der Arbeitslösungen
-
Cortison:
Stamm: 1,8 mg/1 ml Aqua dest.
Arbeitslösung: 4 µl Stamm + 21 µl Aqua dest
NADPH:
Stamm: 7,5 mg/ml Aqua dest.
Verdünnung 1: 1 : 15 (10 µl Stamm + 140 µl Aqua dest.)
Arbeitslösung: 6,1 µl von Verdünnung 1 + 18,9 µl Aqua dest.
Rattenleber-Cytosol:
Stamm: 20 µg/ml
Arbeitslösung: 5 µl Stamm + 20 µl Trispuffer
Prüfkonzentrationen: 100 µg/10 µl, 10 µg/10 µl und 1 µg/10 µl gelöst in Ethanol bzw.
verdünnt in Aqua dest.
Meßgerät
-
Meßgerät Labsystems iEMS Reader MF, computergesteuert,
Software Ascent für Window, Version 2.1, (Mikrotiterplatten: 96-Cliniplate,
Cat. No. 9502227, Labsystems Finnland)
Mikrotiterplatten-Belegung (Vertiefung = VT)
Gesamtvolumen/VT: 333 µl
Aqua dest./VT: 218 µl
Phosphat-Puffer/VT: 30 µl
NADPH/VT: 25 µl
Cortison/VT: 25 µl
Prüfsubstanz oder Standard/VT: 10 µl
Rattenleber-Cytosol/VT: 25 µl
-
Der Leerwert wird mit 228 µl Aqua dest. gemessen.
Auswertung
-
Ausgewertet wird die Extinktionsabnahme nach Zugabe des Rattenleber-Cytosols. Nach
Cytosolzusatz wird beim Leerwert innerhalb von 10 Minuten die Extinktion von 100%
(unmittelbar nach Cytosolzusatz) auf etwa 65-75% gesenkt.
-
Bewertet wird die 3α-HSD-Hemmaktivität der Prüfsubstanz anhand der Standards
Indomethacin.
-
Indomethacin hat starke 3α-HSD-Hemmaktivität. Der IC50-Wert liegt im Bereich von 10 bis
50 µg/ml. 20 µg/ml Indomethacin hemmen etwa 80 bis 90% der Enzymaktivität des
Cytosols.
Ergebnis und Bewertung
-
Poria cocos-Extrakt wirkte in den Konzentrationen von 3, 30 und 300 µg/ml auf die
Enzymaktivität der 3α-HSD stark hemmend und besitzt somit eindeutig antiinflammatorische
Aktivität. Die Enzym-Hemmung betrug bei 3 µg/ml 37%, bei 30 µg/ml 59% und bei 300 µg/ml
70%. Der Standard Indomethacin inaktivierte die 3α-HSD in den Konzentrationen
von 300 µg/ml zu 100% und 30 µg/ml zu 37% (Tab.: 1). Poria cocos-Probe (komplett)
beeinflußte nicht in den geprüften Konzentrationen die 3α-HSD-Aktivität.
Beispiel 4
Einfluß von Poria cocos-Extrakt (022902-1A) auf die Cyclooxygenasen-1 und -2 (COX-1-
und COX-2-Inhibitorteste)
Testprinzip, Testziel, Testaussage
-
Die Entzündung ist eine vitale Reaktion von Zellen und Geweben. Zellfreie Testsysteme
zum Nachweis entzündungshemmender (antiinflammatorisch, antiphlogistisch) Wirkungen
sind deshalb als problematisch anzusehen. Dennoch wurden solche Test-Systeme für
Screening-Zwecke etabliert. Die Cayman Chemical Company, USA, entwickelte "COX
Inhibitor Screening Kits", die zum in vitro Nachweis der Hemmung der Enzymfamilie
"Cyclooxygenasen (COX)" geeignet sind. Die Initiierung des Entzündungsprozesses erfolgt
über den COX-Stoffwechselweg der Arachidonsäure, wobei die Prostaglandin (PG)-
Endoperoxide PGG2 und PGH2 als Primärprodukte entstehen.
-
Das Testprinzip des Kits beruht darauf, dass eine Heme-katalysierte Hydroperoxidase von
COX in Gegenwart von Arachidonsäure und Luminol Chemilumineszenz erzeugt, die mit
einem Chemilumineszenz-Messgerät quantitativ nachweisbar ist. Arachidonsäure wird
dabei über PGG2 in PGH2 umgesetzt. Der Testkit ist auf der 96er Mikrotiterplatte adaptiert.
-
Cyclooxygenasen, auch als Prostaglandin-H-Synthetase bezeichnet, katalysieren aus
Arachidonsäure den ersten Schritt zur Biosynthese von Prostaglandinen (PG), Thromboxanen
und Prostazyklinen. PG haben unterschiedliche physiologische und pathophysiologische
Funktionen. Nicht-steroidale Antiinflammatorika (NSAIDs) unterdrücken die PG-Synthese
durch Hemmung der COX-Aktivität. Die NSAIDs wirken antiinflammatorisch, analgetisch
und antipyretisch. Es wurden zwei COX-Isoenzyme identifiziert: COX-1, die konstitutive
Isoform produziert PG mit homöostatischen Funktionen, wie dem Schutz der
gastrointestinalen Mukosa, der Aufrechterhaltung der Thrombozytenaggregation und der
Nierenfunktion; COX-2, die induzierbare Isoform, ist verantwortlich für die deutlich gesteigerte
Synthese verschiedener PG, insbesondere PGE2 aus PGH2, die Ursache für die
inflammatorischen Symptome, wie Cytokinfreisetzung, Gewebsödeme und Hyperalgesie ist. Eine
selektive Hemmung der PGE2-Synthese, also der COX-2-Expression, stellt einen
wirkungsvollen Ansatz zur Behandlung akuter und chronischer entzündlicher Erkrankungen dar.
-
Geprüft wird der Hemmeffekt von Naturstoffen oder Extrakten auf die COX-1- und COX-2-
Aktivität. Eine COX-Hemmaktivität wird vorgetäuscht, wenn die Prüfsubstanzen
Scavenger-Eigenschaften besitzen. Scavenger haben Radikal-neutralisierende Wirkung und
zeigen durch verminderte Chemilumineszenz eine COX-Hemmaktivität an, die jedoch nicht
auf einer Enzymhemmung beruht. Zum Ausschluss solcher Scavenger-Wirkungen werden
Prüfsubstanzen vor dem COX-Test im Horse-radish peroxidase-Test geprüft.
Methode
Chemikalien, Reagenzien und Prüfsubstanzen
-
- - Chemiluminescent COX (ovine) Inhibitor Screening Assay, Catalog No. 760101;
Cayman Chemical Company, bestehend aus Assay Puffer (10×), Heme, COX-1 (ovine),
COX-2 (ovine), Arachidonsäure, KOH und Luminol
- - Ethanol, DMSO, Aqua dest. oder physiologische Lösemittel
- - Poria cocos (022902-1A)
- - Indomethacin
Herstellung der Arbeitslösungen
-
Assay Puffer: 3 ml Pufferkonzentrat werden mit 27 ml Aqua dest. (HPLC-Qualität) verdünnt
(0.1 M Tris-HCl).
Heme: 58 µl Heme (gelöst in DMSO) werden mit 942 µl Assay Puffer verdünnt.
COX-1: 100 µl COX-2 werden mit 500 µl Assay Puffer verdünnt.
COX-2: 100 µl COX-1 werden mit 500 µl Assay Puffer verdünnt.
Arachidonsäure: 100 µl einer ethanolischen Arachidonsäure-Lösung werden mit 100 µl
KOH und mit 9,8 ml Assay Puffer verdünnt. Finalkonzentration: 20 µM
KOH: 0,1 M KOH, gebrauchsfertig
Luminol: Luminollösung ist gebrauchsfertig
Poria cocos: 1 mg/100 µl Ethanol
Indomethacin: 1 mg/ml Ethanol
Mikrotiterplattenbelegung | Gesamtvolumen/VT | 290 µl |
| Assay Puffer/VT | 200 µl |
| Luminol/VT | 10 µl |
| COX-1 oder -2/VT | 10 µl |
| Arachidonsäure/VT | 50 µl |
| Heme/VT | 10 µl |
| Prüfsubstanz oder Standard/VT | 10 µl |
Messgerät
Labsystems Luminoskan RS, computergesteuert
-
Software: SeroCalc für Windows, Version 4.00
Mikrotiterplatten: 96 Vertiefungen (VT), White Combiplate 8 (Radius Edge, Polystyrene,
Cat. No. 95029510, Lot. No. 144500, [Labsystems Finnland])
Meßablauf
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Per Hand werden Enzym, Luminol, Heme, Prüfsubstanzen, Standard oder Assay Puffer in
die VT in die VT pipettiert. Unmittelbar nach Zugabe der Arachidonsäure (Substrat) wird
bei 25,0°C jede VT 3× gemessen. Die Meßzeit pro VT beträgt 0,1 sec.
Auswertung
-
Per PC können RLU's als Einzelwerte, Mittelwerte, Maximalwerte und graphische
Kurvenverläufe ausgewertet werden.
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Der RLU-Mittelwert ohne Inhibitorzugabe wird gleich 100% gesetzt (Luminol, Enzym,
Herne, Arachidonsäure und Assay Puffer), und die RLU-Mittelwerte der Ansätze mit den
unterschiedlichen Indomethacin- oder den Prüfsubstanz-Konzentrationen werden auf den 100%-Wert
relativiert.
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Die Bewertung der COX-Hemmaktivität erfolgt in Abhängigkeit von der Indomethacin-
Wirkung, dessen IC50-Werte für COX-1 im Konzentrationsbereich von 1 µg/ml und für
COX-2 von 32 µg/ml liegt.
Ergebnis
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Poria cocos (022902-1A) hemmte die COX-Aktivitäten in zellfreien Testsystemen. Für
COX-1 wurde ein IC50-Wert von 5 µg/ml und für COX-2 ein IC50-Wert von 4 µg/ml
gefunden.
Bewertung
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Die Hemmaktivität von Poria cocos (022902-1A) auf die Cyclooxygenasen, insbesondere
auf die COX-2 ist deutlich stärker als die von Indomethacin (IC50-Wert von 32 µg/ml). Da
die IC50-Werte für COX-1 und COX-2 mit 5 oder 4 µg/ml nahezu identisch sind, kann die
COX-Hemmaktivität von Poria cocos (022902-1A) als COX-2 selektiv bewertet werden.
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Extrakte von Deadalea quercina, Polyporus betulinus, Hypholoma fasciculare und
Hypholoma senescens und Ganoderma lucidum zeigen die qualitativ gleiche Wirksamkeit.
Beispiel 5
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Der Nachweis der entzündungshemmenden Wirkung von Poria-cocos-Extrakten erfolgte
an 20 hautgesunden Probanden im Alter zwischen 18 und 40 Jahren, deren paravertebrale
Rückenhaut durch okklusive Applikation von je 50 µl Natriumlaurylsulfat höchster Reinheit
kumulativ irritiert wurde. Es wurden 10 Felder markiert. Das Irritans wurde auf
Filterpapierscheibchen (Füllungsvolumen 50 µl) pipettiert und mittels großer Finn Chambers (∅ 12 mm)
auf die Haut gebracht. Die Einwirkungszeit betrug 2 mal 30 min im Abstand von 3
Stunden täglich. Die Testpflaster wurden nach 30 min Einwirkungszeit abgenommen und
die Felder mit Papiertüchern abgetupft. Die Irritationen fanden an den Tagen 1-4 jeweils
zur gleichen Tageszeit statt.
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Auf 8 Feldern der Rückenhaut erfolgte im Anschluß an die Irritation (nach 10 min
Wartezeit) eine Nachbehandlung mit der in DAC suspendierten Prüfsubstand (Extrakt von Poria
cocos entsprechend Beispiel 1). Pro Testfeld wurden 50 µl aufgetragen und mit
behandschuhtem Finger sanft verteilt. Auf diesen Feldern fand am 5. Tag eine Abschlußmessung
statt.
-
Auf 5 weiteren Feldern der Rückenhaut erfolgte die Applikation der Testsubstanzen erst
am 4. Tag, unmittelbar nach der letzten Irritation. Sie erfolgte einmal täglich zur gleichen
Tageszeit (+/-1 Stunde) und wurde insgesamt 5 mal, bis einschließlich zum 8. Tag
durchgeführt. Ein weiteres Feld wurde ausschließlich irritiert und diente als Kontrollfeld.
-
Um auszuschließen, daß die Testsubstanzen selbst bei wiederholter Applikation eine
irritative Wirkung entfalten, wurden vier zusätzliche Testfelder im Bereich des Rückens
angelegt. Die Testfelder wurden daher ohne vorherige Irritation über 4 Tage zweimal täglich im
Abstand von 3 1/2 Stunden mit den Testzubereitungen von Poria cocos behandelt. Am 5.
Tag fand eine Abschlußmessung statt.
Klinische Beurteilung und hautphysiologische Messungen
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Die Messungen erfolgten nach einer körperlichen Ruhephase von mindestens 15 Minuten
und nach Akklimatisierung an die standardisierten Laborbedingungen (Temperatur von
20°C-22°C, Luftfeuchtigkeit zwischen 20% und 40%).
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Alle klinischen Beurteilungen und Messungen erfolgten täglich zur gleichen Tageszeit (+/-
1 Stunde) 10 Minuten vor der Irritation durch jeweils den selben Untersucher. Ab Tag 5
wurden nur noch die Prüfsubstanzen aufgetragen, wobei die verschiedenen
Untersuchungen jeweils vor der Therpaie erfolgten. 24 Stunden nach der letzten Applikation, am Tag 9,
fand eine abschließende Messung statt.
-
Es kamen folgende klinischen Beurteilungen und Meßmethoden zur Anwendung:
Irritationsscores nach Frosch und Kligman (The soap chamber test. Am. J. Dermatol 1979; 1:
161-168), Messung des transepidermalen Wasserverlustes (TEWL) als Indikator der
epidermalen Barrierefunktion mittels Tewameter TM 210 (Courage & Khazaka, Köln,
Deutschland). Die genaue Anwendung des Gerätes ist bei Pinnagoda ausführlich
beschrieben und folgte den dortigen Angaben (J. Pinnagoda et al., A report from the
Standardization group of the European Society for contact dermatitis, Contact dermatitis 1990;
22: 164-178) sowie Quantifizierung des Erythems mittels Chromameter (CR-300, Minolta
GmbH, Ahrensburg, Deutschland) nach den Empfehlungen von Elsner (P. Elsner,
Handbooks of Skin bioengineering. Cutaneous Blood Flow an Erythema. Boca Raton; CRC
Press 1994). Hierfür wurde ausschließlich der a* Wert berücksichtigt, der die Rotgrün
Achse des dreiminensionalen Meßraumes repräsentiert.
Chromametrie
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Betrachtet man die Delta a*-Werte von Tag 1 auf Tag 5, ist auf den Testfeldern nach
8maliger Applikation der Testsubstanzen auf gesunder Haut keine Zunahme der
chromametrischen a* Werte zu erkennen.
TEWL
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Betrachtet man die Δ-TEWL-Werte zwischen Tag 1 und Tag 5, führte die 8malige alleinige
Applikation der Prüfsubstanzen mit den 3 verschiedenen Poria cocos Extrakt-
Konzentrationen auf gesunder Haut nicht zur Erhöhung des TEWL. Somit ergaben sich
keine Hinweise auf eine Hautbarriere-störende Wirkung der Testsubstanzen.
-
Wirkung der Prüfsubstanzen auf das SLS-induzierte Kontaktekzem bei Behandlung
während der Irritationsphase (parallele Applikation)
Visueller Score
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Betrachtet man die Entwicklung der Absolutwerte von Tag 1 auf Tag 5, kam es unter der
parallel zur Irritation durchgeführten Behandlung mit den drei Poria cocos Konzentrationen
zu einem dosisabhängigen signifikant geringeren Anstieg des visuellen Scores gegenüber
dem unbehandelten Kontrollfeld (Poria cocos 0,1%: p ≤ 0,01, Poria cocos 1% und 10%: p
≤ 0,001). Das mit DAC Creme behandelte Feld zeigte ebenfalls einen hoch signifikant
geringeren Anstieg des visuellen Scores (p ≤ 0,001), der allerdings weniger ausgeprägt als
unter Poria cocos 10% war (Abb. 1)
Chromametrie
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Betrachtet man die Δ-Chromametrie-Werte von Tag 1 auf Tag 5, kam es unter der parallel
zur Irritation durchgeführten Therapie mit Poria cocos zu einem signifikant niedrigeren
Anstieg der Chromametrie a* Werte gegenüber dem unbehandelten Kontrollfeld, auf dem ein
mittlerer Anstieg von initial 8,18 (±0,65) auf 14,42 (±0,98) induziert wurde (Abb. 2)
(p ≤ 0,01 für Poria cocos der Konzentrationen 1% und 10%). Die Wirkung von Poria
cocos 0,1% war nicht signifikant. Auch die Grundlage DAC Creme konnte signifikant
niedrigere Werte im Vergleich zum unbehandelten Kontrollfeld beiwirken (p ≤ 0,05).
TEWL
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Die TEWL-Werte bestätigten die Ergebnisse der Chromametrie. Betrachtet man die
Δ-TEWL-Werte von Tag 1 auf Tag 5, kam es unter der parallel zur Irritation durchgeführten
Therapie mit allen 3 Poria cocos Konzentrationen zu einem signifikant niedrigeren Anstieg
des TEWL gegenüber dem unbehandelten Kontrollfeld (p ≤ 0,001 für Poria cocos 1% und
10%, p ≤ 0,05 für Poria cocos 0,1%). Auch auf dem mit DAC Creme behandelten Testfeld
kam es zu einem deutlich niedrigeren Anstieg der Werte (p ≤ 0,01). Für DAC im Vergleich
mit den Poria cocos-Extrakten ergab sich lediglich für P3 (Poria cocos 10%) ein
signifikanter Unterschied (p ≤ 0,01). (Abb. 3)
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Die Ergebnisse belegen eine signifikante antientzündliche Wirkung von Poria cocos mit
einer Dosis-Wirkungsbeziehung in der Entstehung des kumulativen irritativen
Kontaktekzems in vivo.
Legenden zu den Abbildungen
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Abb. 1 Boxplots der visuellen Scores am 5. Tag
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Abb. 2 Mittelwerte der Delta-Werte der Chromametrie von Tag 1 auf Tag 5 im Vergleich zur
ausschließlich irritierten Kontrolle bei der parallelen Applikation von Prüfsubstanzen
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Abb. 3 Mittelwerte der Delta-Werte des TEWL von Tag 1 auf Tag 5 im Vergleich zur ausschließlich
irritierten Kontrolle bei der parallelen Applikation der Prüfsubstanzen.