CN104688782B - 一种从茯苓皮中高效提取三萜类活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从茯苓皮中高效提取三萜类活性成分的方法。本发明以茯苓皮为原料，粉碎后按照一定比例加入醇液浸泡，回流提取并对提取液进行减压浓缩，获取茯苓皮提取物；茯苓皮提取物经过加热超声溶解，通过大孔树脂进行纯化，最后制备得到茯苓皮总三萜。本发明所得到的茯苓皮总三萜提取物的收率可达5.6%，远远高于以茯苓块为原料提取出来的茯苓总三萜收率2.32%。本发明提取效果好，没有或很少化学溶剂残留，茯苓皮总三萜的含量大于60%。本发明方法提取成本相对低廉，可大规模生产，变废为宝，具有良好的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及医药及保健食品技术领域，具体涉及一种从茯苓皮中高效提取三萜类活性成分的方法。
背景技术
茯苓为多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）的干燥菌核，是常用的药食两用中药。茯苓性平，味甘、淡，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿、健脾和胃、宁心安神之功效，其主要活性成分为多糖、三萜类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节、保肝等多种药理活性。
我国茯苓资源丰富，目前对茯苓有效成分包括三萜类提取工艺已有一定研究。茯苓菌核经过发汗处理后削下的外皮为“茯苓皮”，内部白色部分切成茯苓块或茯苓片。目前临床药用茯苓以茯苓块或茯苓片为主。中医认为，茯苓块或茯苓片归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿，健脾，宁心的功效；而茯苓皮归肺、脾、肾经，仅具有利水消肿的功效。由于茯苓皮外表面棕褐色至黑褐色，有疣状突起，内面淡棕色并常带有白色或淡红色的皮下部分；质地较松软，略具弹性；气微、味淡，嚼之粘牙；相对于茯苓块或茯苓片，茯苓皮卖相差，且较难提取出其中的活性成分，因此，在实际生产加工过程中茯苓皮多被废弃。
已有的茯苓皮有效物质提取中都采用溶剂萃取法，此法提取总三萜类化合物含量较低，目前未能应用于大批量生产，同时这些方法所选用的化学溶剂相对较多，其应用受到一定的限制。因此，开发出一种高效环保的从茯苓皮提取三萜类活性成份的方法具有非常实际的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从茯苓皮中高效提取三萜类活性成分的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种茯苓皮总三萜的提取方法，包括下列步骤：
1)以茯苓皮为原料，粉碎后按照一定比例加入无水或含水醇液浸泡2～10小时，浸泡后回流提取1～3次，每次提取2～3小时，过滤收集提取液；
2)对提取液进行减压浓缩，获取茯苓皮提取物；
3)用醇液对茯苓皮提取物进行加热超声溶解，并将所得溶解液滴加到装有大孔树脂的柱床中进行静止吸附至少2小时，用水和不同浓度的醇液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离；
4)收集洗脱液，浓缩获得茯苓皮总三萜。
进一步的，步骤1）中所用醇液为70%v/v～100%v/v的甲醇或70%v/v～95%v/v的乙醇。
进一步的，步骤1）中提取时，茯苓皮和醇液的重量比为1:（3～10）。
进一步的，步骤2）中减压浓缩时，醇提取液浓缩温度为60～80℃。
进一步的，步骤3）用浓度70%～100%v/v甲醇或70%～95%v/v乙醇溶液对茯苓皮提取物进行加热超声溶解。
进一步的，步骤3）中大孔树脂可以是极性、中等极性、弱极性或非极性大孔树脂。
进一步的，步骤3）用水和浓度分别为50%v/v、70%v/v、100%v/v的甲醇或50%v/v、70%v/v、95%v/v的乙醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，且每一浓度洗脱4个保留体积。
进一步的，步骤4）收集100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇洗脱液。
一种茯苓皮总三萜的提取方法，包括下列步骤：
1)以茯苓皮为原料，粉碎后按照茯苓皮和醇液的重量比为1:（5～6）的比例加入100%甲醇或95%v/v的乙醇浸泡2～5小时，浸泡后回流提取1～3次，每次提取2～3小时，过滤收集提取液；
2)对提取液进行减压浓缩，获取茯苓皮提取物；
3)在60～80℃的温度范围内，用100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇对茯苓皮提取物进行加热超声溶解，并将所得溶解液以5 mL/min的速度滴加到装有D-101或AB-8大孔树脂的柱床中进行静止吸附至少2小时，用水和50%v/v、70%v/v、100%v/v的甲醇或50%v/v、70%v/v、95%v/v的乙醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，且每一浓度洗脱4个保留体积；
4)收集100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇洗脱液，浓缩获得茯苓皮总三萜。
本发明的有益效果是：
本发明以茯苓皮为原料，采用无水或含水醇为提取溶剂，提取的浸膏经大孔树脂纯化，
得到的茯苓皮总三萜提取物的收率可达 5.6%，远远高于以茯苓块为原料提取出来的茯苓总三萜收率2.32%。
从成本方面考虑，目前临床用药以茯苓块或茯苓片为主，无人收购茯苓皮，即使有少量收购，其价格也远远低于白茯苓，其成本基本可以忽略不计；而茯苓皮来源广泛，价格低廉，不仅可以降低成本，还能变废为宝，具有良好的经济效益及社会效益。以茯苓块或茯苓片为原料则成本较高，以获得1Kg所述茯苓总三萜提取物为例，所需茯苓块原料成本为1077.5元。由此可见，本发明方法技术从茯苓皮中高效提取三萜类活性成分，提取成本相对低廉，可大规模生产，变废为宝。
本发明提取效果好，没有或很少化学溶剂残留，提取物经过香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得茯苓皮总三萜的含量大于60%。本发明方法提取成本相对低廉，可大规模生产，变废为宝。
利用从本发明的产品中分离纯化得到的三萜类单体化合物为标准品，经高效液相色谱分析，对本发明方法制备的茯苓皮总三萜中14种三萜类成分进行了指认和归属，其中茯苓新酸A、3-氢化去氢松苓酸和去氢伊布里酸三个三萜类成分为主要成分，产品总三萜含量高，主要活性成分明确。
经清除DPPH烷自由基，清除超氧阴离子自由基能力测试表明：本发明的产品具有很强的清除DPPH自由基、超氧阴离子的能力，具有抗氧化作用；经酒精诱导小鼠急性肝损伤实验表明：本发明的产品具有很强的保肝活性，具有预防酒精性肝损伤作用；不仅如此，还具有较强的抗炎、抗过敏、降糖、降脂作用。可广泛应用于医药、保健食品及化妆品等领域。
附图说明
图1为本发明茯苓皮总三萜中分离得到的三萜类化合物的结构；
图2为本发明茯苓皮总三萜的HPLC图谱；
其中1是去氢土莫酸、2是去氢伊布里酸乙酸酯、3是去氢伊布里酮酸、4是3-氢化去氢松苓酮酸、5是3β-乙酰氧基-羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸、6是去氢茯苓酸、7是茯苓酸、8是3-氢化去氢松苓酸、9是去氢伊布里酸、10是茯苓新酸D、11是茯苓新酸A、12是茯苓新酸AM、13是3-去氢松苓酸、14是伊布里酸；
图3为3-氢化去氢松苓酸的HPLC图谱；
图4为去氢伊布里酸的HPLC图谱；
图5为茯苓新酸A的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
其中茯苓皮总三萜或茯苓三萜含量测定均采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法。
1）溶液配制
5%香草酸-冰醋酸溶液：称取香草醛0.5 g，用适量冰醋酸溶解并转入容量瓶中，冰醋酸定容至10 mL，摇匀，当日使用；
乌苏酸对照品溶液：精密称取乌苏酸11.1 mg，甲醇定容于100 mL容量瓶中，即得0.111 mg/mL的乌苏酸对照品溶液；
样品溶液：准确称取实施例中所得总三萜提取物10.0 mg，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，即得0.40 mg/mL的样品溶液。
2）测定含量
使用分光光度法测定样品中总三萜含量：精密吸取乌苏酸对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，60℃恒温水浴加热，除去溶剂。分别加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL和1 mL高氯酸，摇匀，在60℃恒温水浴下反应20 min后，冰水冷却，再加入5 mL冰醋酸，摇匀，以空白试剂为参比，在548 nm波长下测定体系的吸光度，以乌苏酸对照品的质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作图得标准工作曲线，测得总三萜的含量。
如无特殊说明，以下实施例中所用的醇液浓度均为体积比浓度。
实施例1
1、制备茯苓皮总三萜
取干燥的茯苓皮1.5Kg，粉碎后加入重量比为5倍量的95%乙醇浸泡2小时，回流提取，2次，每次提取2小时，纱布过滤得到提取液，合并提取液，减压浓缩得茯苓皮提取物。将茯苓皮提取物用95%乙醇加热超声溶解，以5 mL/min的速度将样品溶液滴加在已装好的D-101大孔树脂上，静止吸附2 h，依次用水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集95%乙醇洗脱液浓缩得到茯苓皮总三萜83.58g，计算总三萜提取物的收率= 总三萜提取物的质量/茯苓皮的质量×100% = 83.6g / 1500g ×100% =5.6%。
2、含量测定
利用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得茯苓皮提取物中总三萜的含量为64.74%± 0.83%。
3、抗氧化活性测试（对烷自由基DPPH影响试验）。
1）溶液及样品配置
DPPH储备液：称8.0 mg DPPH，用甲醇溶解定容至100 mL，得200 uM的DPPH储备液；
样品：用甲醇溶解成不同浓度。
2）实验过程
取100 ul DPPH储备液，加入100 ul样品溶液，混匀，室温避光30 min后在546 nm测OD值；其中调零组以甲醇代替DPPH + 药物；空白组以甲醇代替DPPH；对照组以甲醇代替药物。
3）实验结果
实验结果测得IC50 = 0.72 mg/mL，表明本实施例制备的茯苓皮总三萜具有较强的清除烷自由基DPPH·的活性。
4、结果分析
本实施例中以茯苓皮为原料提取出来的茯苓皮总三萜提取物收率为5.6%，总三萜含量为64.74% ± 0.83%，具有较强的清除烷自由基DPPH活性。说明茯苓皮是活性三萜物质的良好来源。利用本实施例的方法获得1 Kg茯苓皮总三萜提取物，需要茯苓皮的量为1Kg÷5.6% = 17.9 Kg。目前临床用药以茯苓块或茯苓片为主，无人收购茯苓皮，即使有少量收购，其价格也远远低于白茯苓，其成本基本可以忽略不计。
实施例2
1、制备茯苓皮总三萜
取干燥的茯苓皮3.0Kg，粉碎后加入重量比为6倍量的100%甲醇浸泡5小时，回流提取3次，每次提取3小时，纱布过滤得到提取液，合并提取液，减压浓缩得茯苓皮甲醇提取物。取茯苓皮甲醇提取物200g，用100%甲醇加热超声溶解，以5mL/min的速度将样品溶液滴加在已装好的AB-8大孔树脂上。静止吸附2 h，依次用水、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集100%甲醇洗脱液浓缩得到茯苓皮总三萜。
2、含量测定
利用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得茯苓皮提取物中总三萜的含量为63.95 %± 1.25%。
3、茯苓皮总三萜中三萜类化合物的分离鉴定
取本实施例中所得茯苓皮总三萜37. 8g，上硅胶柱、采用环己烷-乙酸乙酯（30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯）以及氯仿-丙酮（50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、丙酮）梯度洗脱，TCL检视，合并相似组分，共得到15个部分，再经ODS柱层析，采用甲醇-水（50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、甲醇）梯度洗脱，TCL检视，含有三萜的组分经制备型HPLC（不同比例甲醇-水洗脱）制备分离，共从茯苓皮总三萜产品中分离得到14个单体化合物，通过UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS等手段鉴定分别为：去氢土莫酸、去氢伊布里酸乙酸酯、去氢伊布里酮酸、3-氢化去氢松苓酮酸、3β-乙酰氧基-羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、3-氢化去氢松苓酸、去氢伊布里酸、茯苓新酸D、茯苓新酸A、茯苓新酸AM、3-去氢松苓酸、伊布里酸。
茯苓皮总三萜中分离鉴定的化合物结构见图1。
实施例3
1、制备茯苓皮总三萜
取干燥的茯苓皮1.5 Kg加入重量比为6倍量的95%乙醇浸泡3小时，回流提取2次，每次提取2小时，纱布过滤得到提取液，合并提取液，减压浓缩得茯苓皮乙醇提取物。取茯苓皮乙醇提取物用95%乙醇加热超声溶解，以5 mL/min的速度将样品溶液滴加在已装好的D-101大孔树脂上，静止吸附3小时，依次用水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集95%乙醇洗脱液浓缩得到茯苓皮总三萜。
2、含量测定
利用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得茯苓皮提取物中总三萜的含量为64.01 %± 2.15%。
3、抗氧化活性测试（清除超氧阴离子试验）。
1）溶液及样品配置
①Tris-HCl：称取Tris-HCl 3.0 g，用少量蒸馏水溶解，另取1.5mL浓盐酸用300mL蒸馏水稀释，混合后调节pH到8.1，定容至500 mL；
②NADH溶液：精密称取NADH 25.4 mg，用上述Tris-HCl 溶解定容至50 mL；
③NBT溶液：精密称取NBT 7.0 mg，用上述Tris-HCl 溶解定容至50 mL；
④PMS溶液：精密称取PMS 4.0 mg，用上述Tris-HCl 溶解定容至250 mL，测定时用Tris-HCl稀释5倍后使用；
⑤样品：用甲醇溶解成不同浓度。
2）实验步骤
分别取NADH溶液、NBT溶液、样品溶液各50ul加入到96孔板中，加入稀释后的PMS溶液50ul，混匀，室温避光反应5 min后在546 nm测OD值。
3）实验结果
实验结果测得IC50 = 0.12 mg/mL，表明本实施例制备的茯苓皮总三萜具有较强的清除超氧阴离子的活性。
4、茯苓皮总三萜指纹图谱分析
取实施例2中分离得到的三萜类化合物单体作为标准品，对本实施例获得的茯苓皮总三萜利用高效液相色谱仪进行色谱分析。
样品的指纹图谱分析条件为色谱柱：Amethyst C18-H (4.6×250 mm 5 um)；检测波长：200～400 nm；流动相：0.5% H3PO4-H2O(A)和CH3OH(B)；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；梯度洗脱程序为：0～29min，76%B；30～33min，76%～80%B；34～40min，80%～90%B；41～55min，90%～100%B；56～65min，100%B。
茯苓皮总三萜的指纹图谱见图2；相同条件下3-氢化去氢松苓酸(8)的HPLC图谱见图3；相同条件下去氢伊布里酸(9)的HPLC图谱见图4；相同条件下茯苓新酸A(11)的HPLC图谱见图5。
5、茯苓皮总三萜对小鼠酒精性肝损伤的防治作用
1）仪器与试剂
酶标仪：ST-360 上海科华有限公司；
紫外可见分光光度计：UV-2550 日本岛津；
医用离心机：TDZ5-WS 长沙平凡仪器仪表有限公司；
总蛋白定量测试盒（考马斯亮蓝法），谷丙转氨酶（GPT/ALT）测试盒（赖氏法），谷草转氨酶（GOT/AST）测试盒，谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）测试盒，还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒均为南京建成生物工程研究所生产；
甘油三酯（TG）测定试剂盒为上海名典生物工程有限公司生产。
2）试验方法
实验动物：SPF级雄性昆明种小鼠50只，体重24～30g，随机分为5组，每组10只，各组给药剂量如表1所示：
表1实验动物分组
连续给药22天，从第23天起，每天每组小鼠仍按上表所示剂量灌胃给药，每次给药后3小时，空白组灌胃给予双蒸水（12mL/kg）外，其余各组小鼠均灌胃50%酒精（12mL/kg），连续5天。末次灌胃50%酒精后，各组小鼠禁食不禁水12小时，眼球取血，颈椎脱臼处死，快速摘取肝脏。按试剂盒说明书方法制备小鼠血清及肝组织匀浆后，测定血清中ALT、AST及肝匀浆中TG、GSH及GSH-PX的含量。数据用Mean ± SD 表示，采用 IBM SPSS Statistics 19软件进行统计分析, 组间比较采用单因素方差分析，P≤0.05时认为差异具有统计学意义。
3）实验结果
表2茯苓皮总三萜对酒精性肝损伤小鼠血清AST和ALT的影响
表3 茯苓皮总三萜对酒精性肝损伤小鼠肝组织匀浆中TG、GSH、GSH-PX的影响
表2和3结果表明：实施例3制备的茯苓皮总三萜可显著降低酒精引起的急性肝损伤小鼠血清ALT、AST和肝脏中TG的水平；提高肝脏GSH及GSH-PX水平。对酒精引起的肝损伤具有显著的预防作用。
对比例1
1、制备茯苓总三萜
取干燥的茯苓块1.5 Kg，粉碎后加入重量比为5倍量的95%乙醇浸泡2小时，然后回流提取2次，每次提取2小时，纱布过滤得到提取液，合并提取液，减压浓缩得茯苓提取物。将茯苓提取物用95%乙醇加热超声溶解，以5 mL/min的速度将样品溶液滴加在已装好的D-101大孔树脂上，静止吸附2 小时，依次用水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集95%乙醇洗脱液浓缩得茯苓总三萜34.82g，计算总三萜提取物的收率 = 总三萜提取物的质量/茯苓块的质量×100%= 34.82g / 1500g ×100% =2.32%。
2、含量测定
利用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得茯苓皮提取物中总三萜的含量为62.05 %± 1.75%。
3、结果分析
实施例1中以茯苓皮为原料提取出来的茯苓总三萜提取物收率为5.6%，而对比例1中以茯苓块为原料提取出来的茯苓总三萜提取物收率为2.32%，远低于采用本发明技术的茯苓皮提取效果。以获得1Kg所述茯苓总三萜提取物为例，共需茯苓块的量为1Kg÷2.32% =43.1 Kg，茯苓块的市场价按25元/Kg计算，所需成本为1077.5元。而茯苓皮来源广泛，价格低廉，不仅可以降低成本，还能变废为宝，具有良好的经济效益及社会效益。
Claims (7)
1.一种茯苓皮总三萜的提取方法，其特征在于：包括下列步骤：
1） 以茯苓皮为原料，粉碎后按照一定比例加入无水或含水醇液浸泡2～10小时，浸泡后回流提取1～3次，每次提取2～3小时，过滤收集提取液；
2） 对提取液进行减压浓缩，获取茯苓皮提取物；
3） 用浓度70%～100%v/v甲醇或70%～95%v/v乙醇溶液对茯苓皮提取物进行加热超声溶解，并将所得溶解液滴加到装有大孔树脂的柱床中进行静止吸附至少2小时，用水和浓度分别为50%v/v、70%v/v、100%v/v的甲醇或50%v/v、70%v/v、95%v/v的乙醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离；
4） 收集100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇溶液的洗脱液，浓缩获得茯苓皮总三萜。
2.根据权利要求1所述的一种茯苓皮总三萜的提取方法，其特征在于：步骤1）中所用醇液为70%v/v～100%v/v的甲醇或70%v/v～95%v/v的乙醇。
3.根据权利要求1所述的一种茯苓皮总三萜的提取方法，其特征在于：步骤1）中提取时，茯苓皮和醇液的重量比为1: （3～10）。
4.根据权利要求1所述的一种茯苓皮总三萜的提取方法，其特征在于：步骤2）中减压浓缩时，醇提取液浓缩温度为60～80℃。
5.根据权利要求1所述的一种茯苓皮总三萜的提取方法，其特征在于：步骤3）中大孔树脂为极性、中等极性、弱极性或非极性大孔树脂。
6.根据权利要求1所述的一种茯苓皮总三萜的提取方法，其特征在于：步骤3）每一浓度洗脱4个保留体积。
7.一种茯苓皮总三萜的提取方法，其特征在于：包括下列步骤：
1） 以茯苓皮为原料，粉碎后按照茯苓皮和醇液的重量比为1:（5～6）的比例加入100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇浸泡2～5小时，浸泡后回流提取1～3次，每次提取2～3小时，过滤收集提取液；
2） 对提取液进行减压浓缩，获取茯苓皮提取物；
3） 在60～80℃的温度范围内，用100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇对茯苓皮提取物进行加热超声溶解，并将所得溶解液以5 mL/min的速度滴加到装有D-101或AB-8大孔树脂的柱床中进行静止吸附至少2小时，用水和50%v/v、70%v/v、100%v/v的甲醇或50%v/v、70%v/v、95%v/v的乙醇溶液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，且每一浓度洗脱4个保留体积；
4） 收集100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇洗脱液，浓缩获得茯苓皮总三萜。
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