JP6526565B2 - トロンビン溶液及びその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、医薬品溶液の分野、より具体的には、水性トロンビン溶液の凍結乾燥法、かかる凍結乾燥法で用いるトロンビン溶液、及びかかる方法によって製造される固体トロンビン組成物に関する。

トロンビンは、凝固プロセス中に血漿中プロトロンビンから形成されるタンパク分解酵素である。

トロンビンは、フィブリノゲンのフィブリンへの変換による創傷部の止血のために、臨床用途において凝固因子として広く使用されている。これは、外科用ドレッシング材の一般的な成分であり、フィブリン糊、接着剤、及びシーラントなどの２剤系止血システムにおいて、フィブリノゲン及び他の凝固タンパク質と組み合わせて使用されている。

タンパク質分解を低減させるため、保存前にトロンビン溶液を凍結乾燥して固体トロンビン組成物を製造することは既知であり、固体トロンビン組成物を使用前に再構成することができる。凍結乾燥は、典型的には、混合物を凍結した後、例えば昇華によって、生体反応又は化学反応を支持しないレベルまで水分濃度を低減するプロセスを指す。凍結乾燥プロセスによって得られる多孔質かつスポンジ状の固体物質を、ケークと称する。含水量が低く（例えば、約３％未満）、好ましくは室温で長期間構造的及び機能的安定性を保持し、かつ、凍結乾燥前の溶液におけるトロンビン活性と比較して、再構成時点で高い割合のトロンビン活性を保持しているような固体トロンビン組成物が望ましい。

背景技術のトロンビン溶液の例は、欧州特許第８１３５９８Ｂ１号、米国特許第５，６０５，８８４号、同第４，８７７，６０８号、米国特許出願公開第２０１０／００７４８６５号、米国特許第５，７３３，８７３号、欧州特許第１７６６００３号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１６８０１８号に記載されている。背景技術のトロンビン溶液は、存在する賦形剤の数や種類、及び個々の賦形剤の濃度がかなり異なる。

抗凍結剤、つまり安定剤は、凍結ストレスによる変性又は活性消失からトロンビンを保護し、後続する製造工程においてタンパク質を安定化させ、かつ、貯蔵寿命を延ばすために、トロンビン溶液中で一般に使用される。抗凍結剤の例として、スクロース、ラクトース、及びトレハロースなどの糖類；マンニトールなどの糖アルコール；並びに、ポリエチレングリコール、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴＷＥＥＮ−２０、及びＴＷＥＥＮ−８０などの界面活性剤が挙げられる。安定剤としての機能以外に、マンニトール及びスクロース（前者には及ばない）を充填剤としても使用し、強い物理的構造（physical strcture）を有するケークを得るために役立てる。充填剤の使用は、固体物質含量（体積当たり）が低い処方にとって特に重要である。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もまた、安定化剤及び充填剤として生物製剤処方中で広く使用されている（Ｈ．Ｒ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ，Ｍ．Ｊ．Ｐｉｋａｌ：Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００４）。

欧州特許第８１３５９８Ｂ１号は、４０ｍＭのグルコン酸、２０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、凍結乾燥向けの平易なトロンビン処方を開示し、米国特許第５，６０５，８８４号及び同第４，８７７，６０８号は、スクロース、マンニトール又はマルトースなどの糖類を最大１０％含む処方を開示し、米国特許出願公開第２０１０／００７４８６５号は、５．７％のラクトース、３．１％のトレハロース、及び０．００１％のＴＷＥＥＮ−８０を含む処方を開示し、米国特許第５，７３３，８７３号は、０．１％のＰＥＧ ４０００及び２％のマンニトールの有無にかかわらず、０．００１〜０．０２５％のポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ−８０）を含む処方を開示している。

塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、生物製剤処方の凍結乾燥中のタンパク質の沈殿と凝集を減らすために一般的に用いられる。しかしながら、欧州特許第１７６６００３号は、ＮａＣｌがガラス転移温度を低下させ、それにより一次乾燥温度を低く、乾燥サイクル時間を長くする必要があるため、問題となり得ることを開示している。また、米国特許出願公開第２０１０／０１６８０１８号は、ＮａＣｌを含まない、又はＮａＣｌを微量に含む処方を開示している。

このような既知のトロンビン溶液の凍結乾燥法は非常に長時間かかることが多く、このことによって、プロセスのコストが増加し、並びに／又は、比較的含水量が高く、及び／若しくは凍結乾燥前の溶液におけるトロンビン活性と比較して、再構成時点で比較的低い割合のトロンビン活性を保持する固体トロンビン組成物をもたらす。

本発明は、そのいくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液の凍結乾燥法、かかる凍結乾燥法で用いるトロンビン溶液、及びかかる方法によって製造される固体トロンビン組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される溶液及び方法は、トロンビン溶液の既知の凍結乾燥法と比較して短縮、例えば３７％短縮し、それによって凍結乾燥能力と費用効果が高まる凍結乾燥法を使用した、固体トロンビン組成物の調製を可能にする。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の凍結乾燥法は、比較的含水量が低く、及び／又は、比較的長期間にわたって室温で高度に安定であり、及び／又は、再構成時点で高いトロンビン活性回復率を示す、固体トロンビン組成物をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、最適な水性トロンビン処方の使用を含む。

本発明の態様及び実施形態は、本明細書中以下、及び添付の請求項において、記載される。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態の態様によると、水性トロンビン溶液の凍結乾燥法が提供され、この方法は、約１〜約４．６％（ｗ／ｖ）未満の糖類又は糖アルコールと、少なくとも約０．７〜約１．７５％（ｗ／ｖ）未満の塩化ナトリウムと、約０．２〜約３％のアルブミンと、塩化カルシウムと、酢酸ナトリウムと、を含む、水性トロンビン溶液を用意する工程と、水性トロンビン溶液を凍結乾燥する工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液中のカルシウムの存在がトロンビン構造を安定化し、これによって凍結乾燥中に活性を保持する。また、カルシウムは、トロンビンの止血活性を補助するために必要とされる。水性トロンビン溶液の凍結乾燥後、ケークと称される（本明細書では固体トロンビン組成物とも称される）多孔質かつスポンジ状固体物質が得られる。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、約２００〜約２０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンと、約０．３〜約１．５％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、約０．１４〜約１％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、約１．６〜約４．６％（ｗ／ｖ）未満の糖類又は糖アルコールと、約０．７〜約１．７％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムと、約０．２超〜約３％未満のアルブミンと、約０．３〜約１．２％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、約０．１４〜約０．７％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む。

いくつかの実施形態では、糖類又は糖アルコールは２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、アルブミンは約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、塩化ナトリウムは約０．７６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、塩化カルシウムは約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、酢酸ナトリウムは約０．２７％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、トロンビン、糖類又は糖アルコール、塩化ナトリウム、アルブミン、塩化カルシウム、及び酢酸ナトリウムから本質的になる。

いくつかの実施形態では、糖類は、単糖類（任意に、グルクトース、フルクトース、ガラクトース、キシロース及びリボースからなる群から選択される）及び／又は二糖類（任意に、スクロース、マルトース及びラクトースからなる群から選択される）を含む。いくつかの実施形態では、二糖類は、任意に約２％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び／又はマルトースを含む。

いくつかの実施形態では、糖アルコールは、任意に、マンニトール、ソルビトール、及びキシリトールからなる群から選択される、単糖類由来糖アルコールを含む。

いくつかの実施形態では、単糖類由来糖は、任意に約２％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトールを含む。

いくつかの実施形態では、糖アルコールは、任意に、マルチトール、イソマルト、及びラクチロールからなる群から選択される、二糖類由来糖アルコールである。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、１種類の糖類（単糖類若しくは二糖類のいずれか）又は糖アルコールを含む。いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、２種類以上の糖類又は糖アルコールを含まない。いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、ポリエチレングリコール及びヒスチジンのうち少なくとも１つを含まない。

いくつかの実施形態では、この方法は更に、凍結乾燥に先立ち、水性トロンビン溶液のｐＨを約５．５〜約９の範囲のｐＨに調整する工程を含む。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さは、容器の最下点から測定するとき、約１０ｍｍ以下、例えば、約１０ｍｍ、約９ｍｍ、約８ｍｍ、約７ｍｍ、又は約６ｍｍなどである。いくつかの代表的な実施形態では、高さは約８ｍｍである。

水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であるいくつかのかかる実施形態では、総凍結乾燥時間は、約３５時間以下、例えば、約３５時間、約３４時間、約３３時間、約３２時間、約３１時間、約３０時間、又は約２９時間などである。いくつかの代表的な実施形態では、総凍結乾燥時間は約３０時間以下である。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さは約２０ｍｍ以下である。いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液の高さは、約１５〜約１９ｍｍの範囲内、例えば、１５ｍｍ、１６ｍｍ、１７ｍｍ、１８ｍｍ、又は１９ｍｍなどである。いくつかの代表的な実施形態では、凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さは約１７ｍｍである。

水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であるいくつかのかかる実施形態では、総凍結乾燥時間は約６８時間以下である。

水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であるいくつかの実施形態では、総凍結乾燥時間は、凍結乾燥容器中の同じ高さの対照溶液を使用した凍結乾燥サイクルよりも短い。「対照溶液」は、本明細書に記載の組成とは異なる組成を有する。対照組成は、追加の、若しくは別の種類の賦形剤を含む点、及び／又は、個々の賦形剤の濃度の点で本発明の組成とは異なり得る。

いくつかの実施形態では、既知の技術の溶液で使用するものと比較して、総凍結乾燥時間が約３７％短縮される。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥工程は、ｉ）水性トロンビン溶液に凍結手順を行って凍結トロンビン溶液を生産する工程と、ｉｉ）工程ｉ）の凍結トロンビン溶液に一次乾燥手順を行う工程と、ｉｉｉ）工程ｉｉ）の生産物に二次乾燥手順を行う工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、凍結手順は、約−４５℃〜約−５５℃の凍結温度で行われる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥（lypophilization）は凍結乾燥器棚上で行われ、凍結手順は、凍結乾燥器棚を、約−４５℃〜約−５５℃、例えば約−５０℃などの凍結温度（本明細書では凍結ソークとも称する）に維持することを含む。

いくつかの実施形態では、凍結手順は約０．１メガパスカル（約１気圧）の圧力で行われる。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍ）であるいくつかの実施形態では、凍結温度は約５時間以下にわたって維持される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下（例えば１５〜１９ｍｍ、例えば約１７ｍｍ）であるいくつかの実施形態では、凍結温度は約６時間以下にわたって維持される。

いくつかの実施形態では、凍結温度（凍結乾燥器棚の温度など）は、約２．５時間以下の時間（本明細書では凍結勾配とも称する）をかけて到達される。

いくつかの実施形態では、一次乾燥手順は約−１２℃〜約−１８℃で行われる。いくつかの実施形態では、一次乾燥手順は、凍結乾燥器棚を、約１０Ｐａ〜約１６Ｐａ（約１００μＢａｒ〜約１６０μＢａｒ）の圧力で、約−１２℃〜約−１８℃、例えば約−１２℃、約−１３℃、約−１４℃、約−１５℃、約−１６℃、約−１７℃、又は約−１８℃の一次乾燥温度（本明細書では一次乾燥ソークとも称する）に維持することを含む。いくつかの代表的な実施形態では、一次乾燥温度は約−１５℃である。

いくつかの実施形態では、一次乾燥温度（凍結乾燥器棚の温度など）は、約８０〜約９０分間の時間（本明細書では一次乾燥勾配とも称する）をかけて到達される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍなど）であるいくつかの実施形態では、一次乾燥温度及び圧力は、約１３時間以下、例えば、約１３時間、約１２時間、又は約１１時間などにわたって維持される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下（例えば１５〜１９ｍｍ、又は約１７ｍｍなど）であるいくつかの実施形態では、一次乾燥温度（凍結ソーク）及び圧力は、約３１時間以下にわたって維持される。

いくつかの実施形態では、二次乾燥手順は約２０℃〜約３０℃で行われる。いくつかの実施形態では、二次乾燥手順は、約２０℃〜約３０℃（例えば、約２５℃など）の二次乾燥温度（本明細書では二次乾燥ソークとも称する）及び約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満、例えば、約２Ｐａ（約２０μＢａｒ）未満などの圧力に、凍結乾燥器棚を維持することを含む。

いくつかの実施形態では、二次乾燥温度は、約６０〜約９０分間の時間（本明細書では二次乾燥勾配とも称する）をかけて到達される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍなど）であるいくつかの実施形態では、二次乾燥温度及び圧力は、約１１時間以下（例えば、約９．５〜約１１時間など）にわたって維持される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下（例えば約１５〜１９ｍｍ、例えば約１７ｍｍ）であるいくつかの実施形態では、二次乾燥温度及び圧力は、約１５時間以下にわたって維持される。いくつかのかかる実施形態では、この方法は、二次乾燥手順に先立ち、約５〜約１５℃で行われる中間乾燥手順を更に含む。いくつかの実施形態では、二次乾燥手順は、約５〜約１５℃、例えば約１０℃などの中間乾燥温度（本明細書では中間乾燥ソークとも称する）に凍結乾燥器棚を維持することを含む。いくつかのかかる実施形態では、中間乾燥手順中の圧力は約１２Ｐａ（約１２０μＢａｒ）である。いくつかのかかる実施形態では、中間乾燥温度は約１３時間以下にわたって維持される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍなど）であるいくつかの実施形態では、凍結乾燥器棚における凍結乾燥は、
ａ）凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
ｂ）凍結温度を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
ｃ）約５０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｂ）の凍結乾燥器棚の温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約１０〜約１６Ｐａ（約１００〜約１６０μＢａｒ）にする工程と、
ｄ）一次乾燥温度及び圧力を約１１〜約１３時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
ｅ）約６０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｄ）の凍結乾燥器棚の温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約５Ｐａ（５０μＢａｒ）未満まで減少させる工程と、
ｆ）工程ｅ）の二次乾燥温度及び圧力を約９．５〜約１１時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、を含む。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下（例えば約１５〜１９ｍｍ、例えば１７ｍｍ）であるいくつかの実施形態では、凍結乾燥器棚における凍結乾燥は、
ａ）凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
ｂ）工程ａ）の凍結温度を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって維持し、凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
ｃ）約３０〜約７０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｂ）の凍結乾燥器棚の温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約１０〜約１６Ｐａ（約１００〜約１６０μＢａｒ）にする工程と、
ｄ）一次乾燥温度及び圧力を約３０〜約３２時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
ｅ）約４０〜約８０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｄ）の凍結乾燥器棚の温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満まで減少させる工程と、
ｆ）二次乾燥温度及び圧力を約１３〜約１７時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、工程ａ）及びｂ）は大気圧において実施される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の方法に従って得られる固体トロンビン組成物が提供される。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、約３％（ｗ／ｗ）以下の含水量と、少なくとも９５％のトロンビン活性回復率と、を有する。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、約１．５％（ｗ／ｗ）以下の含水量と、少なくとも９８％のトロンビン活性回復率と、を有する。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、室温などの非凍結保存条件下で少なくとも２年間安定である。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、約１９．５％〜約７８％（全組成物のｗ／ｗ）のマンニトールと、約１％〜約２０％（全組成物のｗ／ｗ）の酢酸ナトリウムと、約２％〜約５３％（全組成物のｗ／ｗ）のアルブミンと、約２．５％〜約３１％（全組成物（compositoin）のｗ／ｗ）の塩化カルシウムと、約６％〜約４５％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化ナトリウムと、を含む。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、約２２％〜約６６％（全組成物のｗ／ｗ）のマンニトールと、約１．５％〜約１０％（全組成物のｗ／ｗ）の酢酸ナトリウムと、約２．５％〜約４３％（全組成物のｗ／ｗ）のアルブミンと、約４％〜約１７％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化カルシウムと、約９．５％〜約２５％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化ナトリウムと、を含む。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態の態様によると、約１〜約４．６％（ｗ／ｖ）未満の糖類又は糖アルコールと、少なくとも約０．７〜約１．７５％（ｗ／ｖ）未満の塩化ナトリウムと、約０．２〜約３％（ｗ／ｖ）のアルブミンと、塩化カルシウムと、酢酸ナトリウムと、を含む、水性トロンビン溶液が提供される。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、約２００〜約２０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンと、約０．３〜約１．５％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、約０．１４〜約１％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、約１．６〜約４．６％（ｗ／ｖ）未満の糖類又は糖アルコールと、約０．７〜約１．７％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムと、約０．２超〜約３％未満のアルブミンと、約０．３〜約１．２％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、約０．１４〜約０．７％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む。

水性トロンビン溶液のいくつかの実施形態では、糖類又は糖アルコールは約２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、アルブミンは約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、塩化ナトリウムは約０．７６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、塩化カルシウムは約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、酢酸ナトリウムは約０．２７％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、トロンビン、糖類又は糖アルコール、塩化ナトリウム、アルブミン、塩化カルシウム、及び酢酸ナトリウムから本質的になる。

いくつかの実施形態では、糖類は単糖類、例えばグルクトース、フルクトース、ガラクトース、キシロース及びリボースからなる群から選択される単糖類である。

いくつかの実施形態では、糖類は二糖類、例えばスクロース、マルトース及びラクトースからなる群から選択される二糖類である。

いくつかの実施形態では、糖アルコールは単糖類由来糖アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、及びキシリトールからなる群から選択される単糖類由来糖アルコールを含む。いくつかの実施形態では、単糖類由来糖アルコールは、任意に約２％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトールを含む。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、１種類の糖類又は糖アルコール（例えば、スクロース単独、マルトース単独、又はマンニトールのうち１つ）を含む。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、２種類以上の糖類又は糖アルコールを含まない。

いくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液は、ポリエチレングリコール及びヒスチジンのうち少なくとも１つを含まない。

いくつかの実施形態では、水性トロンビンは、約５．５〜約９の範囲のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような水性トロンビン溶液を用意する工程と、水性トロンビン溶液を凍結乾燥する工程と、を含む、水性トロンビン溶液の凍結乾燥法が提供される。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さは、約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍなど）である。いくつかのかかる実施形態では、総凍結乾燥（lyophililzation）時間は、約３５時間以下である。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さは、約２０ｍｍ以下（例えば約１５〜１９ｍｍ、例えば約１７ｍｍ）である。いくつかのかかる実施形態では、総凍結乾燥時間は、約６８時間以下である。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、ｉ）水性トロンビン溶液に凍結手順を行って凍結タンパク質溶液を生産する工程と、ｉｉ）工程ｉ）の凍結トロンビン溶液に一次乾燥手順を行う工程と、ｉｉｉ）工程ｉｉ）の生産物に二次乾燥手順を行う工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、凍結手順は、約−４５℃〜約−５５℃の凍結温度で行われる。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥は凍結乾燥棚上で行われ、凍結手順は、凍結乾燥器棚を、約−４５℃〜約−５５℃、例えば約−５０℃などの凍結温度に維持することを含む。

いくつかの実施形態では、凍結手順は約０．１メガパスカル（約１気圧）の圧力で行われる。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さは、約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍなど）である。いくつかのかかる実施形態では、凍結温度は約５時間以下にわたって維持される。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さは、約２０ｍｍ以下（例えば１５〜１９ｍｍ、例えば約１７ｍｍ）である。いくつかのかかる実施形態では、凍結温度は約６時間以下にわたって維持される。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥器棚の温度を、約２．５時間以下の時間をかけて凍結温度にする。

いくつかの実施形態では、一次乾燥手順は、凍結乾燥器棚を、約１０Ｐａ〜約１６Ｐａ（約１００μＢａｒ〜約１６０μＢａｒ）の圧力で、約−１２℃〜約−１８℃（例えば約−１５℃など）の一次乾燥温度に維持することを含む。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥器棚の温度を、約８０〜約９０分間の時間（本明細書では一次乾燥勾配とも称する）をかけて一次乾燥温度にする。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍなど）であるいくつかの実施形態では、一次乾燥温度及び圧力は、約１３時間以下（例えば、約１１〜約１３時間など）にわたって維持される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下（例えば約１５〜１９ｍｍ、例えば約１７ｍｍ）であるいくつかの実施形態では、一次乾燥温度及び圧力は、約３１時間以下にわたって維持される。

いくつかの実施形態では、二次乾燥手順は、約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満（例えば、約２Ｐａ（約２０μＢａｒ）未満など）の圧力で、約２０℃〜約３０℃の二次乾燥温度に工程ｉｉ）の凍結乾燥器棚を維持することを含む。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥器棚の温度を、約６０〜約９０分間の時間をかけて二次乾燥温度にする。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍなど）であるいくつかの実施形態では、二次乾燥温度及び圧力は、約１１時間以下（例えば、約９．５〜約１１時間など）にわたって維持される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下（例えば約１５〜約１９ｍｍ、例えば、約１７ｍｍ）であるいくつかの実施形態では、二次乾燥温度及び圧力は、約１５時間以下（例えば、約１１〜約１３時間など）にわたって維持される。いくつかのかかる実施形態では、工程ｉｉｉ）に先立ち、工程ｉｉ）の凍結乾燥器棚は、約５〜約１５℃（例えば、約１０℃など）の中間乾燥温度に維持される。

いくつかの実施形態では、工程ｉｉ）の凍結乾燥器棚は、１２Ｐａ（１２０μＢａｒ）の圧力で中間乾燥温度に維持される。

いくつかの実施形態では、中間乾燥温度は約１３時間以下にわたって維持される。

凍結乾燥容器中の水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下（例えば約８ｍｍなど）であるいくつかの実施形態では、凍結乾燥器棚における凍結乾燥は、
ａ）凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
ｂ）工程ａ）の凍結温度を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって維持し、凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
ｃ）約５０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｂ）の凍結乾燥器棚の温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約１０〜約１６Ｐａ（約１００〜約１６０μＢａｒ）にする工程と、
ｄ）一次乾燥温度及び圧力を約１１〜約１３時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
ｅ）約６０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｄ）の凍結乾燥器棚の温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満まで減少させる工程と、
ｆ）二次乾燥温度及び圧力を約９．５〜約１１時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、を含む。

凍結乾燥容器中の水性（aequeous）トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下（例えば約１５〜１９ｍｍ、例えば約１７ｍｍ）であるいくつかの実施形態では、凍結乾燥器棚における凍結乾燥は、
ａ）凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
ｂ）凍結温度を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって維持し、凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
ｃ）約３０〜約７０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｂ）の凍結乾燥器棚の温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約１０〜約１６Ｐａ（約１００〜約１６０μＢａｒ）に減少させる工程と、
ｄ）一次乾燥温度及び圧力を約３０〜約３２時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
ｅ）約４０〜約８０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｄ）の凍結乾燥器棚の温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満まで減少させる工程と、
ｆ）二次乾燥温度及び圧力を約１３〜約１７時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、工程ａ）及びｂ）は大気圧において実施される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の方法に従って得られる固体トロンビン組成物が提供される。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、約３％（ｗ／ｗ）以下の含水量と、少なくとも９５％のトロンビン活性回復率と、を有する。

いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、約１．５％（ｗ／ｗ）以下の含水量と、少なくとも９８％のトロンビン活性回復率と、を有する。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、非凍結保存条件下（例えば室温）で少なくとも２年間安定である。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、約１９．５％〜約７８％（全組成物のｗ／ｗ）のマンニトールと、約１％〜約２０％（全組成物のｗ／ｗ）の酢酸ナトリウムと、約２％〜約５３％（全組成物のｗ／ｗ）のアルブミンと、約２．５％〜約３１％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化カルシウムと、約６％〜約４５％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化ナトリウムと、を含む。

いくつかの実施形態では、固体トロンビン組成物は、約２２％〜約６６％（全組成物のｗ／ｗ）のマンニトールと、約１．５％〜約１０％（全組成物のｗ／ｗ）の酢酸ナトリウムと、約２．５％〜約４３％（全組成物のｗ／ｗ）のアルブミンと、約４％〜約１７％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化カルシウムと、約９．５％〜約２５％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化ナトリウムと、を含む。

別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。加えて、記載、材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、限定することを意図するものではない。本発明を実施する上で、本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができる。

本明細書において使用するとき、用語「ケーク」又は「固体ケーク」は、凍結乾燥から生じる多孔質及びスポンジ構造様組成物を指す。

本明細書において使用するとき、ケークに関する用語「圧潰する」とは、ケークがもはやそれ自体の構造を支持できなくなる時点を指す。

本明細書において使用するとき、用語「固体組成物」とは、固体組成物の総重量に基づき、約３％（ｗ／ｗ）以下、例えば１．５％以下の含水量を有する組成物を指す。

本明細書において使用するとき、用語「トロンビン活性回復率」は、凍結乾燥前の水性トロンビン溶液中の初期トロンビン活性に対する、再構成時点の固体組成物中トロンビン活性を指す。典型的には、活性回復率は百分率で示される。

本明細書において使用するとき、凍結乾燥された／固体トロンビン組成物に関する用語「安定」とは、例えば、ケークを圧潰することなくその構造を実質的に支持できる組成物、及び／又は、非凍結温度保存条件、例えば２〜８℃、及び最高で室温（例えば２５℃未満）である温度で、少なくとも２年間、その活性を少なくとも８０％（例えば９０％、９５％、又はそれ以上）維持する組成物である。本発明の一実施形態では、固体組成物は、室温で保存されるとき、２年間安定である。典型的には、圧潰は、乾燥中のケーク構造の損失によって、最も明白に特徴付けられる。通常圧潰は、ケークの調製に用いられた処方物の体積より顕著に小さい体積の構造をもたらす。更に、平均孔径及び多孔率の低下、並びに嵩密度の増加が観察され得る。

用語「凍結乾燥」は、典型的には、溶液を凍結した後、例えば昇華によって、生体反応又は化学反応を支持しないレベルまで水分濃度を低減するプロセスを指す。得られた凍結乾燥組成物は、比較的長期間にわたって保存することが可能である。保存後、凍結乾燥組成物は、粉末として使用することができ、又は様々な量の水溶液の添加によって再構成することができる。再構成中に添加される量は、凍結乾燥前の溶液量と同様、それより少ない、又はそれより多くてよい。

本明細書において使用するとき、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する」、及びその文法的変形は、記載される特徴、整数、工程、又は構成要素を特定するものとして理解されるが、１つ以上の追加的特徴、整数、工程、構成要素、又はこれらの群の追加を排除するものではない。これらの用語は、用語「〜からなる」、及び「〜から本質的になる」を包含する。

本明細書において使用するとき、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、「少なくとも１つの」又は「１つ以上の」を意味する。

本明細書において使用するとき、用語「約」は、±１０％を指す。

本明細書に記載される溶液及び方法は、当該技術分野において現在既知の凍結乾燥法と比べて短い凍結乾燥サイクルによって、固体トロンビン組成物を得ることを可能にし、それによって凍結乾燥能力を高め、製造コストを低減する。本明細書に記載される溶液及び方法を用いて得られる固体トロンビン組成物は、既知のトロンビン組成物と比べて凍結乾燥後の含水量が低く、比較的長期間にわたる室温での保存中安定であり、再構成時点で高い割合のトロンビン活性回復率を示す。

本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、本明細書において記載される。図面と共に説明を読むことにより、本発明のいくつかの実施形態がどのように実施され得るかということが、当業者にとって明らかとなる。図面は、例示的な記載の目的のためであり、実施形態における構造の詳細を、本発明の基本的理解に必要である以上に詳細に示そうとするものではない。明確性のため、図面に示されるいくつかの物体は、縮尺通りではない。

図面は以下の通りである。
本明細書に説明される代表的な短時間凍結乾燥サイクル後に得られたケークの外観を示す。

本発明は、そのいくつかの実施形態では、水性トロンビン溶液の凍結乾燥法、かかる凍結乾燥法で用いるトロンビン溶液、及びかかる方法によって製造される固体トロンビン組成物に関する。

本明細書における教示の原理、使用法、及び実施は、添付の説明を参照してよりよく理解され得る。この説明を精査することにより、当業者は、過度な努力又は実験を行うことなく、本発明を実施することができる。

少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、理解されたいこととして、本発明は、その用途において、以下の説明に記載した構成要素及び／又は方法の構造又は構成の詳細に必ずしも限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法によって実行又は実施することが可能である。本明細書において使用される表現及び用語は、記述的目的のためであり、限定としてみなされるべきではない。

上述のように、既知のトロンビン溶液は、存在する賦形剤の数や種類、及び個々の賦形剤の濃度がかなり異なる。

材料及び方法
トロンビン原液：
以下の実施例に記載する水性トロンビン溶液の調製に使用されるトロンビン原液は、約３，５００ＩＵ／ｍＬのトロンビン、約２００ｍＭのＮａＣｌを、安定剤である２％マンニトール及び０．２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と共に含んでいた（別途記載のない限り）。原液は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース陰イオン交換樹脂及びＳＰ陽イオン交換樹脂を連続的に使用することによって活性化かつ精製された、ヒト血漿の第ＩＩ因子（プロトロンビン）から調製した（本質的に米国特許第５１４３８３８号に記載されており、参考することによって本明細書に組み込む）。

凍結乾燥：
Ａ．凍結乾燥容器内高さ８ｍｍのトロンビン溶液の凍結乾燥：
凍結乾燥は、８ｍＬのシリコン処理済みガラスバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、Ｃｈｒｉｓｔ Ｅｐｓｉｌｉｏｎ ２−８Ｄ凍結乾燥器（Ｃｈｒｉｓｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の凍結乾燥器棚上で実施した。各バイアルに２ｍＬの水性トロンビン溶液を充填した。各バイアル中の溶液の高さは約８ｍｍであった。

以下の表１（総時間３４時間）及び表２（総時間３０時間）に記載するように、２種類の短時間凍結乾燥サイクルを実施した。記載の温度は凍結乾燥器棚のものである。

凍結乾燥後、凍結乾燥前の水溶液体積と同様の体積を有する固体トロンビン組成物が得られた。

本明細書において使用するとき、凍結又は乾燥プロセスに関する用語「ソーク」は、それぞれ凍結又は乾燥させるために、特定の時間一定の温度及び圧力で凍結乾燥される組成物を維持することを指す。

本明細書において（hereinm）使用するとき、凍結又は乾燥プロセスに関する用語「勾配」は、組成物をそれぞれ特定の凍結又は乾燥温度及び圧力にするために、特定の時間をかけて凍結乾燥される組成物の温度及び圧力を徐々に変化させる工程を指す。

Ｂ．凍結乾燥容器内高さ１７ｍｍのトロンビン溶液の凍結乾燥：
凍結乾燥は、ＬＹＯＧＵＡＲＤ（登録商標）カップ（ＧＯＲＥ（登録商標））内で、Ｃｈｒｉｓｔ Ｅｐｓｉｌｉｏｎ ２−８Ｄ凍結乾燥器（Ｃｈｒｉｓｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の凍結乾燥器（lyophilzer）棚上で実施した。各バイアルに５２ｍＬの水性トロンビン溶液を充填した。各バイアル中の溶液の高さは約１７ｍｍであった。

表３（総時間６８時間）に記載するように、短時間凍結乾燥サイクルを実施した。記載の温度は凍結乾燥器棚のものである。

凍結乾燥後、凍結乾燥前の水溶液体積と同様の体積を有する固体トロンビン組成物が得られた。

凍結乾燥トロンビン組成物内の含水量の定量：
含水量測定は、米国薬局方試験法（ＵＳＰ２７，＜９２１＞，Ｐ．２３９８〜２３９９）に基づく、体積カール・フィッシャー滴定法（ＫＦＴ）を用いて実施した滴定に先立ち、凍結乾燥組成物を含むバイアルに乾燥メタノールを加え、バイアルを振盪することによって、凍結乾燥組成物から水を抽出した。滴定には、上清からサンプルを取った。

トロンビン活性の測定：
水性トロンビン溶液のトロンビン活性は、欧州薬局方試験法（０９０３／１９９７）の手順の変法に従って、様々な溶液中のトロンビン凝固活性を測定することによる凝固時間アッセイを用いて判定した。簡潔には、トロンビン標準液（４、６、８及び１０ＩＵ／ｍＬ）又は試験溶液を、３７℃で２分間インキュベートした。その後、４０μＬの試験溶液又は標準液をそれぞれ１６０μＬのフィブリノゲン溶液（０．１％；Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ；カタログＮｏ ＦＩＢ１ ２８００Ｌ）と混合し、凝固時間を測定した。標準液を使用して、凝固時間の対数対トロンビン濃度の対数の較正曲線をプロットした。異なる試験溶液中のトロンビン活性を、得られた凝固時間によって判定した（凝固検査器（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ ＳＴａｒｔ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ）によって、較正曲線から内挿され、希釈係数を乗じて自動的に算出される）。

再構成後のトロンビン活性回復率（初期活性の％）：
凍結乾燥前の試験溶液において、及び、精製水で元の体積まで再構成した後の凍結乾燥によって得られた固体トロンビン組成物において、トロンビン活性を上記のように測定した。回復した活性は、再構成後の固体トロンビン組成物で得られた活性を、凍結乾燥前のトロンビン溶液で得られた活性で除し、１００を乗じることによって算出した。

短時間凍結乾燥プロセスによって得られた固体トロンビン組成物の定性的及び定量的評価：
異なる水性トロンビン溶液を短時間凍結乾燥サイクルにかけて得られた固体トロンビン組成物を、固体組成物の含水量、固体組成物の再構成後のトロンビン活性回復率、及びケークの構造外観（目視検査による）のパラメータによって評価した。典型的には、「良好な構造外観」を有するケークとは、凍結乾燥前の水性トロンビン溶液と同様の体積を有し、一体化したブロックで、固体組成物全体に均一な多孔性を有し、明らかな濡れ領域を有さないケークとして定義される。

異なるトロンビン処方における短時間凍結乾燥プロセスの影響を判断するため、異なる成分、例えば異なる糖類、塩、及び賦形剤を、異なる濃度で含むいくつかの水性トロンビン溶液を、「材料及び方法」に記載したトロンビン原液から調製し、続いて、表１、２又は３に詳述した短時間凍結乾燥サイクルを用いて、これらの溶液を凍結乾燥した。

実施例１：短時間凍結乾燥サイクルを行うトロンビン溶液中における異なる糖類及び濃度又は糖アルコールの使用
異なる濃度の二糖類（スクロース及びマルトース）並びに糖アルコール（マンニトール）を水性トロンビン溶液の調製において使用し、かかるトロンビン溶液を短時間凍結乾燥サイクルで使用することによって得られる固体トロンビン組成物を試験した。

以下に記載するように希釈原液にマンニトールを加えることによって、１．６％、２．１％、２．６％、及び４．６％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトールを試験し、スクロース及びマルトースは２％（ｗ／ｖ）の濃度で試験した。トロンビン試験溶液の調製には、上記トロンビン原液を、０．６％ヒト血清アルブミン、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（０．２７％）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ（０．７６％）、及び０．６％ ＣａＣｌ_２の水溶液（ｐＨ ７．０）である最終組成の溶液で、１：３．５に希釈し、試験した糖類又は糖アルコールを上記濃度でこの溶液に添加した。マンニトールの場合、溶液を上記濃度まで追加した（原液の希釈後、溶液は約０．６％マンニトールを含んだ）。

留意すべきことに、トロンビン原液中に存在するヒト血清アルブミンも、約０．０６％の濃度で「バックグラウンド成分」として全ての試験溶液中に存在していた。また、原液は０．６％マンニトールを含んでいた。

調製した水性トロンビン溶液を、上記表２に示す短時間凍結乾燥サイクルを使用して凍結乾燥し、固体トロンビン組成物を得た。各固体組成物の含水量、凍結乾燥組成物の再構成後のトロンビン活性回復率を測定した。結果を次の表４に示す。

この結果は、試験した糖類及び糖アルコールのそれぞれが、水性トロンビン溶液中に２．６％以下の濃度で存在するとき、短時間凍結乾燥（lyophiliztion）サイクル後に含水量が低く（０．４〜０．６％）、固体組成物の再構成後に高いトロンビン活性回復率を有する（９５〜１００％）固体トロンビン組成物が得られたことを示した。

またこの結果は、これらの水性トロンビン溶液により圧潰することなく構造を維持したケークが得られ、上記で定めた良好な構造外観を有していたことも示した。

対照的に、４．６％マンニトールを含む水性トロンビン溶液は、短時間凍結乾燥サイクルにかけると、含水量が１．７％とより高い収縮したケークをもたらした。

これらの結果は、短時間凍結乾燥サイクルで使用する水性トロンビン溶液は、有利には、固体の安定（構造的かつ機能的）なトロンビン組成物を得るために、約１．６％〜約４．６％未満の糖類又は糖アルコールを含むことを示す。

実施例２：短時間凍結乾燥サイクルを行うトロンビン溶液中における異なる濃度のヒト血清アルブミンの使用
異なる濃度のＨＳＡを水性トロンビン溶液の調製において使用し、かかるトロンビン溶液を短時間凍結乾燥サイクルで使用することによって得られる固体トロンビン組成物を試験した。

ＨＳＡは、０．２％、０．６％、３％及び１０％の濃度で試験した。

トロンビン原液から、２．６％マンニトール、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（０．２７％）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ（０．７６％）、及び０．６％ ＣａＣｌ_２の水溶液（ｐＨ ７．０）である最終組成の溶液で１：３．５に希釈することによって、溶液を調製した。

留意すべきことに、ヒト血清アルブミンは、約０．０６％の濃度で全ての試験溶液中に存在していた（上記添加したＨＳＡの濃度に加えて）。

調製した水性トロンビン溶液を、上記表２に示す短時間凍結乾燥サイクル（溶液は凍結乾燥容器中で約８ｍｍの高さを有した）を使用して凍結乾燥し、固体トロンビン組成物を得た。各固体組成物の含水量、固体組成物の再構成後のトロンビン活性回復率を測定した。結果を次の表５に示す。

この結果は、ＨＳＡ濃度の変化が、固体トロンビン組成物中の含水量及び固体組成物の再構成後のトロンビン活性回復率に大きく影響したことを示した。

より具体的には、０．６％ ＨＳＡを含むトロンビン溶液は、比較的低い含水量と、再構成時点のトロンビン活性の高い回復率と、の両方を有する固体組成物をもたらしたことが示された。対照的に、より低い濃度のＨＳＡを有するトロンビン溶液により含水量が高い固体組成物が得られ、一方より高い濃度のＨＳＡを有する溶液により、再構成時点のトロンビン活性がより低かった。

したがって、最適なトロンビン溶液は、有利には、約０．２％超〜約３％未満の濃度のＨＳＡを含むことが示される。

実施例３：短時間凍結乾燥サイクルを行うトロンビン溶液中における異なる塩及び濃度の使用
Ａ．塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度の影響：
異なる濃度のＮａＣｌ（９０ｍＭ、１２０ｍＭ、及び１５０ｍＭ、すなわち、それぞれ０．５％ ｗ／ｖ、０．７ｗ／ｖ、及び０．９ｗ／ｖ）を、トロンビンを含まない水溶液の調製に用い、短時間凍結乾燥サイクル（凍結乾燥容器中の溶液高さは約８ｍｍであった）でかかる溶液を使用することによって得られた固体組成物を試験した。

溶液は、様々な濃度のＮａＣｌに加えて、２％マンニトール、０．６％ ＨＳＡ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（０．２７％）、及び０．６％ ＣａＣｌ_２を含んでいた（ｐＨ ７．０）。

この溶液を、上記表２に示すものと類似の短時間サイクルを使用して凍結乾燥したが、このとき、凍結乾燥容器中の溶液高さは約８ｍｍであり、一次乾燥ソークは表２に記載のものより１時間長かった。

凍結乾燥後、固体組成物中の含水量を試験した。結果を次の表６に示す。

表に示されるように、含水量は、１５０ｍＭまでのＮａＣｌ濃度に反比例した。

トロンビン溶液及びトロンビンを含まない溶液（データ示さず）を用いて追加の類似実験では、ＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭを超えて増加させたとき、含水量の更なる低下は見られなかった。

３００ｍＭ（１．７５％ｗ／ｖ）以上のＮａＣｌ濃度は、凝固時間アッセイで測定するとき、トロンビン活性の阻害効果を示した（データ示さず）。

固体組成物の構造外観に関しては、９０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液から調製したケークは外観が悪く、それを調製した溶液の体積と比較して収縮しており、粒状硬度を有し、固体組成物全体に均一な多孔性はなかった。

したがって、有利には、最適なトロンビン溶液は、少なくとも１２０ｍＭ（０．７％ ｗ／ｖ）〜３００ｍＭ（１．７５％ ｗ／ｖ）未満の濃度でＮａＣｌを含むと結論付けた。

Ｂ．塩化カリウム（ＫＣｌ）によるＮａＣｌの部分置換の影響
トロンビン溶液におけるＮａＣｌに代わるＫＣｌ使用の可能性を評価した。ＮａＣｌは、試験溶液の調製に使用されるトロンビン原液中に存在するため完全には除去でできず、そのため、溶液に６５ｍＭ ＫＣｌを加えた（溶液の最終塩濃度を約１２５ｍＭとする）。また、ＮａＣｌを加えた原液（溶液の最終塩濃度を１３０ｍＭとする）を含む、追加のトロンビン溶液を試験した。

ＮａＣｌ又はＫＣｌを加えた溶液は、原液を１：３．５に希釈することによって調製し、６０ｍＭのＮａＣｌ濃度を得た。次に、第１の溶液にＮａＣｌを１３０ｍＭの濃度まで追加し、第２の溶液に６５ｍＭ ＫＣｌを加えた。

２．６％マンニトール、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（０．２７％）、及び０．６％ ＣａＣｌ_２の水溶液（ｐＨ ７．０）である最終組成を得るために、原液を希釈した。

調製した溶液を、上記表２に示す短時間凍結乾燥サイクル（溶液は凍結乾燥容器中で約８ｍｍの高さを有した）を使用して凍結乾燥し、固体組成物中の含水量及び固体組成物の再構成後のトロンビン活性回復率を測定した。結果を次の表７に示す。

溶液中のＮａＣｌをＫＣｌで部分置換すると、短時間凍結乾燥サイクルの後に得られた固体トロンビン組成物の含水量に対して悪影響を示すことが分かった（ＮａＣｌ＋ＫＣｌを含む溶液の凍結乾燥の固体組成物の含水量が５．２％であるのに対し、ＮａＣｌを含みＫＣｌを含まない溶液の凍結乾燥（lyophliztion）後は０．６％）。表７に示されるように、１３０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液、並びに、６５ｍＭ ＫＣｌ及び６０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液の凍結乾燥により得られる固体組成物の再構成後に、同様のトロンビン活性回復率が得られた。

固体組成物の構造外観の目視検査によって、ＮａＣｌをＫＣｌで置換すると、ケークの収縮をもたらすことが明らかとなった。

したがって、比較的含水量が低い固体組成物を得るために、有利には、トロンビン溶液にＫＣｌを含めないことが好ましいと結論付けた。

更に、短時間サイクルを用いた凍結乾燥後に、含水量が低く、高いトロンビン活性回復率を有する固体組成物を得る最適な水性トロンビン溶液は、約０．３〜約１．２％の塩化カルシウム及び約０．１４〜約０．７％の酢酸ナトリウムに加え、約１．６％〜約４．６％未満の糖類又は糖アルコールと、少なくとも約１２０ｍＭ（０．７％ ｗ／ｖ）〜約３００ｍＭ（１．７５％ ｗ／ｖ）未満の塩化ナトリウムと、約０．２％超〜約３％未満のアルブミンと、を含むと結論付けた。

実施例４：短時間凍結乾燥サイクルにおける、凍結乾燥容器中８ｍｍの高さの本明細書に記載の溶液及び既知の技術の溶液と同様の溶液の使用
以下のように、３種類の溶液（本明細書に記載する溶液、及び既知の技術の溶液と同様の２種類の溶液）を調製した。
１．蒸留水中に、２％マンニトール、０．６％ヒト血清アルブミン、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（０．２７％）、１３０ｍＭ塩化ナトリウム（０．７６％）及び４０ｍＭ ＣａＣｌ_２（０．６％）をｐＨ ７．０で含む、本明細書に記載のトロンビン溶液。
２．蒸留水中に、３％スクロース、４％マンニトール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（０．９％）、０．１％ポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ３３５０）、４ｍＭ ＣａＣｌ_２（０．０４％）、及び５ｍＭ（０．０８％）ヒスチジンをｐＨ ６．０で含む、欧州特許第１７６６００３Ｂ１号（Ｊｉａｎｇら）に開示されるものと同様のトロンビン溶液。
３．蒸留水中に、４０ｍＭ（０．７８％）グルコン酸、２０ｍＭ（０．５％）クエン酸三ナトリウム、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ（０．９％）をｐＨ ６．５で含む、欧州特許第８１３５９８Ｂ１号（ＭａｃＧｒｅｇｏｒら）に開示されるものと同様のトロンビン溶液。

溶液の成分は表８に更に示す。

３種類のトロンビン溶液は全て、上記トロンビン原液を、各溶液１〜３に示す成分を含む溶液で１：３．５に希釈することによって調製した。マンニトール及びヒト血清アルブミンは、それぞれ約０．６％及び０．０６％の濃度で、バックグラウンド成分として３種類全ての試験溶液中に存在していた。

上記表１又は表２に記載する短時間凍結乾燥サイクル（凍結乾燥容器中の溶液の高さは約８ｍｍであった）を用いて、溶液を凍結乾燥した。固体トロンビン組成物の含水量、固体トロンビン組成物の再構成後のトロンビン活性回復率を、上記のように測定した。

図１は、本明細書に記載の水性トロンビン溶液（溶液１、図１の＃１）の短時間凍結乾燥後に得られた固体トロンビン組成物、及び、欧州特許第１７６６００３Ｂ１号による溶液（溶液２、図１の＃２）の短時間凍結乾燥後に得られた固体トロンビン組成物の外観を示す。図１に示す固体組成物は、表１に記載のサイクルを使用して得られた。表２に記載のサイクルを使用したとき、同様の結果が得られた。

固体トロンビン組成物の外観の目視検査により、本発明によるトロンビン溶液及び溶液３の凍結乾燥後に得られた固体組成物が、上記定義による「良好な構造外観」を有することが明らかとなった。しかしながら、短時間凍結乾燥サイクルにおいて欧州特許第１７６６００３Ｂ１号によるトロンビン溶液（溶液２）を使用した後に得られたケークは、顆粒状構造を有した。

３種類の固体トロンビン組成物の含水量、及び固体組成物のトロンビン活性回復率を以下の表９に示す。

表９に示されるように、短時間凍結乾燥サイクル（表１又は２に示す）後、本明細書に記載の溶液を用いて調製された凍結乾燥固体組成物において、最も低い平均含水量がみられたことがわかった（０．７±０．１４％）。

更に表９に示されるように、表１又は２による短時間凍結乾燥固体組成物の再構成後、本明細書に記載の溶液を用いて調製された固体組成物において、最も高いトロンビン活性回復率が得られた（９９±１．４％）ことがわかった。

実施例５：短時間凍結乾燥サイクルにおける、凍結乾燥容器中１７ｍｍの高さの本明細書に記載の溶液の使用
蒸留水中に、２％マンニトール、０．６％ヒト血清アルブミン、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（０．２７％）、１３０ｍＭ塩化ナトリウム（０．７６％）及び４０ｍＭ ＣａＣｌ_２（０．６％）をｐＨ ７．０で含む本明細書に記載の第１トロンビン溶液、及び、１２０ｍＭ（０．７％）未満の塩化ナトリウム（０．７６％未満）を含む以外は第１溶液と同様の第２溶液を凍結乾燥した。第１溶液を、上記表３に記載の短時間凍結乾燥サイクルを用いて凍結乾燥し、１０８時間の持続時間を有する凍結乾燥（lyophilizatin）サイクル（凍結乾燥容器中の各溶液の高さは約１７ｍｍであった）において、第２溶液（低塩化ナトリウム濃度）を凍結乾燥した。

両固体トロンビン組成物の含水量、両固体トロンビン組成物の再構成後のトロンビン活性回復率を、上記のように測定した。

両固体組成物において、含水量は１．５％であり、トロンビン活性回復率は１００％であった。

この結果は、本発明によるトロンビン溶液により、凍結乾燥サイクルの持続時間の約３７％短縮が可能となったことを示す。結論として、本明細書に記載するトロンビン溶液は、有利には、既知のトロンビン溶液と比べて、含水量が低く、高いトロンビン活性回復率を有する固体組成物を得る、短時間凍結乾燥サイクルの使用を可能にする。

本発明のいくつかの特徴は、明確性のために別個の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、単一の実施形態において組み合わせて提示されてもよい。逆に、本発明の様々な特徴は、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、別個に、若しくは任意の好適なサブコンビネーションで、又は本発明の他の記載される実施形態において好適にもたらされてもよい。様々な実施形態の文脈において記載されるいくつかの特徴は、その実施形態がそれらの要素なしには動作不可能である場合を除き、これらの実施形態の本質的特徴であるとして考慮されるべきではない。

本発明は、その特定の実施形態と共に記載されてきたが、多くの代替、修正、及びバリエーションが、当業者には明白であることが、明らかである。したがって、添付の請求項の範囲内である、これらの代替、修正、及びバリエーション全てを包含することが意図される。

本出願のいずれの参照文献の引用又は指定も、このような文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。

〔実施の態様〕
（１） 水性トロンビン溶液の凍結乾燥法であって、
約１〜約４．６％（ｗ／ｖ）未満の糖類又は糖アルコールと、少なくとも約０．７〜約１．７５％（ｗ／ｖ）未満の塩化ナトリウムと、約０．２〜約３％（ｗ／ｖ）のアルブミンと、塩化カルシウムと、酢酸ナトリウムと、を含む、水性トロンビン溶液を用意する工程と、
前記水性トロンビン溶液を凍結乾燥する工程と、を含む、方法。
（２） 前記水性トロンビン溶液が、約２００〜約２０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンと、約０．３〜約１．５％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、約０．１４〜約１％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記水性トロンビン溶液が、約１．６〜約４．６％（ｗ／ｖ）未満の糖類又は糖アルコールと、約０．７〜約１．７％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムと、約０．２超〜約３％（ｗ／ｖ）未満のアルブミンと、約０．３〜約１．２％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、約０．１４〜約０．７％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む、実施態様１又は２に記載の方法。
（４） 前記糖類又は糖アルコールが２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記アルブミンが約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記塩化ナトリウムが約０．７６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記塩化カルシウムが約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記酢酸ナトリウムが約０．２７％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、実施態様３に記載の方法。
（５） 前記水性トロンビン溶液が、トロンビン、糖類又は糖アルコール、塩化ナトリウム、アルブミン、塩化カルシウム、及び酢酸ナトリウムから本質的になる、実施態様１〜４のいずれかに記載の方法。

（６） 前記糖類が単糖類及び／又は二糖類を含む、実施態様１〜５のいずれかに記載の方法。
（７） 前記二糖類がスクロース又はマルトースである、実施態様６に記載の方法。
（８） 前記糖アルコールが単糖類由来糖アルコールを含む、実施態様１〜４のいずれかに記載の方法。
（９） 前記単糖類由来糖アルコールがマンニトールである、実施態様８に記載の方法。
（１０） 前記マンニトールが約２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、実施態様９に記載の方法。

（１１） 前記水性トロンビン溶液が１種類の糖類又は糖アルコールを含む、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１２） 前記水性トロンビン溶液が２種類以上の糖類又は糖アルコールを含まない、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１３） 前記水性トロンビン溶液が、ポリエチレングリコール及びヒスチジンのうち少なくとも１つを含まない、実施態様１〜１１のいずれかに記載の方法。
（１４） 前記凍結乾燥工程に先立ち、前記水性トロンビン溶液のｐＨを約５．５〜約９の範囲のｐＨに調整する工程を更に含む、実施態様１〜１３のいずれかに記載の方法。
（１５） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下である、実施態様１〜１４のいずれかに記載の方法。

（１６） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様１５に記載の方法。
（１７） 総凍結乾燥時間が約３５時間以下である、実施態様１５又は１６に記載の方法。
（１８） 前記総凍結乾燥時間が約３０時間以下である、実施態様１７に記載の方法。
（１９） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下である、実施態様１〜１４のいずれかに記載の方法。
（２０） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様１９に記載の方法。

（２１） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様２０に記載の方法。
（２２） 総凍結乾燥時間が約６８時間以下である、実施態様１９〜２１のいずれかに記載の方法。
（２３） 前記凍結乾燥工程が凍結乾燥器棚上で行われ、
ｉ．前記水性トロンビン溶液に凍結手順を行って凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
ｉｉ．工程ｉ）の前記凍結トロンビン溶液に一次乾燥手順を行う工程と、
ｉｉｉ．工程ｉｉ）の生産物に二次乾燥手順を行う工程と、を含む、実施態様１〜２２のいずれかに記載の方法。
（２４） 前記凍結手順が、前記凍結乾燥器棚を、約−４５℃〜約−５５℃の凍結温度に維持することを含む、実施態様２３に記載の方法。
（２５） 前記凍結手順が約０．１メガパスカル（約１気圧）の圧力で行われる、実施態様２３又は２４に記載の方法。

（２６） 前記凍結温度が約−５０℃である、実施態様２４又は２５に記載の方法。
（２７） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥器棚が約５時間以下にわたって前記凍結温度に維持される、実施態様２４〜２６のいずれかに記載の方法。
（２８） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様２７に記載の方法。
（２９） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥器棚が約６時間以下にわたって前記凍結温度に維持される、実施態様２４〜２６のいずれかに記載の方法。
（３０） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様２９に記載の方法。

（３１） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様３０に記載の方法。
（３２） 前記凍結乾燥器棚の温度を、約２．５時間以下の時間をかけて前記凍結温度にする、実施態様２４〜３１のいずれかに記載の方法。
（３３） 前記一次乾燥手順が、前記凍結乾燥器棚を、約１０Ｐａ〜約１６Ｐａ（約１００μＢａｒ〜約１６０μＢａｒ）の圧力で、約−１２℃〜約−１８℃の一次乾燥温度に維持することを含む、実施態様２３〜３２のいずれかに記載の方法。
（３４） 前記一次乾燥温度が約−１５℃である、実施態様３３に記載の方法。
（３５） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、前記一次乾燥温度及び圧力が約１３時間以下にわたって維持される、実施態様３３又は３４に記載の方法。

（３６） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様３５に記載の方法。
（３７） 前記一次乾燥温度及び圧力が約１１〜約１３時間維持される、実施態様３５又は３６に記載の方法。
（３８） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥器棚が約３１時間以下にわたって前記一次乾燥温度及び圧力に維持される、実施態様３３又は３４に記載の方法。
（３９） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様３８に記載の方法。
（４０） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様３９に記載の方法。

（４１） 前記二次乾燥手順が、前記凍結乾燥器棚を、約２０℃〜約３０℃の二次乾燥温度、及び約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満の圧力に維持することを含む、実施態様２４〜４０のいずれかに記載の方法。
（４２） 前記圧力が約２Ｐａ（約２０μＢａｒ）未満である、実施態様４１に記載の方法。
（４３） 前記二次乾燥温度が約２５℃である、実施態様４１又は４２に記載の方法。
（４４） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、前記二次乾燥温度及び圧力が約１１時間以下にわたって維持される、実施態様４１〜４３のいずれかに記載の方法。
（４５） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様４４に記載の方法。

（４６） 前記二次乾燥温度及び圧力が約９．５〜約１１時間維持される、実施態様４４又は４５に記載の方法。
（４７） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であり、前記二次乾燥温度及び圧力が約１５時間以下にわたって維持される、実施態様４１〜４３のいずれかに記載の方法。
（４８） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様４７に記載の方法。
（４９） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様４８に記載の方法。
（５０） 工程ｉｉｉ）に先立ち、前記凍結乾燥器棚を、約５〜約１５℃の中間乾燥温度に維持することを更に含む、実施態様４７〜４９のいずれかに記載の方法。

（５１） 前記中間乾燥温度が約１０℃である、実施態様５０に記載の方法。
（５２） 前記凍結乾燥器棚を前記中間乾燥温度に維持することが、１２Ｐａ（１２０μＢａｒ）の圧力で行われる、実施態様５０又は５１に記載の方法。
（５３） 前記中間乾燥温度が約１３時間以下にわたって維持される、実施態様５０〜５２のいずれかに記載の方法。
（５４） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥器棚における凍結乾燥が、
ａ）前記凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
ｂ）工程ａ）の前記凍結温度を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって維持し、凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
ｃ）約５０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｂ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約１０〜約１６Ｐａ（約１００〜約１６０μＢａｒ）にする工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記温度及び圧力を約１１〜約１３時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
ｅ）約６０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｄ）の前記凍結乾燥器棚の温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満まで減少させる工程と、
ｆ）工程ｅ）の前記温度及び圧力を、約９．５〜約１１時間の範囲内の時間にわたって前記二次乾燥温度及び圧力に維持する工程と、を含む、実施態様２３に記載の方法。
（５５） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様５４に記載の方法。

（５６） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥器棚における凍結乾燥が、
ａ）前記凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
ｂ）工程ａ）の前記凍結温度を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって維持し、凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
ｃ）約３０〜約７０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｂ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約１０〜約１６Ｐａ（約１００〜約１６０μＢａｒ）にする工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記温度及び圧力を、約３０〜約３２時間の範囲内の時間にわたって前記一次乾燥温度及び圧力に維持する工程と、
ｅ）約４０〜約８０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｄ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満まで減少させる工程と、
ｆ）工程ｅ）の前記温度及び圧力を、約１３〜約１７時間の範囲内の時間にわたって前記二次乾燥温度及び圧力に維持する工程と、を含む、実施態様２３に記載の方法。
（５７） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様５６に記載の方法。
（５８） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様５７に記載の方法。
（５９） 工程ａ）及びｂ）が大気圧で行われる、実施態様５０〜５８のいずれかに記載の方法。
（６０） 約１〜約４．６％（ｗ／ｖ）未満の糖類又は糖アルコールと、
少なくとも約０．７〜約１．７５％（ｗ／ｖ）未満の塩化ナトリウムと、
約０．２〜約３％（ｗ／ｖ）のアルブミンと、
塩化カルシウムと、
酢酸ナトリウムと、を含む、水性トロンビン溶液。

（６１） 約２００〜約２０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンと、
約０．３〜約１．５％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、
約０．１４〜約１％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む、実施態様６０に記載の水性トロンビン溶液。
（６２） 約１．６〜約４．６％（ｗ／ｖ）未満の糖類又は糖アルコールと、
約０．７〜約１．７％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムと、
約０．２超〜約３％未満のアルブミンと、
約０．３〜約１．２％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、
約０．１４〜約０．７％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む、実施態様６０又は６１に記載の水性トロンビン溶液。
（６３） 前記糖類又は糖アルコールが約２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記アルブミンが約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記塩化ナトリウムが約０．７６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記塩化カルシウムが約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記酢酸ナトリウムが約０．２７％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、実施態様６２に記載の水性トロンビン溶液。
（６４） トロンビン、糖類又は糖アルコール、塩化ナトリウム、アルブミン、塩化カルシウム、及び酢酸ナトリウムから本質的になる、実施態様６０〜６３のいずれかに記載の水性トロンビン溶液。
（６５） 前記糖類が単糖類及び／又は二糖類を含む、実施態様６０〜６４のいずれかに記載の水性トロンビン溶液。

（６６） 前記二糖類がスクロース又はマルトースである、実施態様６５に記載の水性トロンビン溶液。
（６７） 前記糖アルコールが単糖類由来糖アルコールを含む、実施態様６０〜６４のいずれかに記載の水性トロンビン溶液。
（６８） 前記単糖類由来糖アルコールがマンニトールである、実施態様６７に記載の水性トロンビン溶液。
（６９） 前記マンニトールが約２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、実施態様６８に記載の水性トロンビン溶液。
（７０） 前記水性トロンビン溶液が１種類の糖類又は糖アルコールを含む、実施態様６０〜６９のいずれかに記載の水性トロンビン溶液。

（７１） ２種類以上の糖類又は糖アルコールを含まない、実施態様６０〜６９のいずれかに記載の水性トロンビン溶液。
（７２） ポリエチレングリコール及びヒスチジンのうち少なくとも１つを含まない、実施態様６０〜７１のいずれかに記載の水性トロンビン溶液。
（７３） 約５．５〜約９の範囲のｐＨを有する、実施態様６０〜７２のいずれかに記載の水性トロンビン溶液。
（７４） 水性トロンビン溶液の凍結乾燥法であって、
実施態様６０〜７３のいずれかに記載の水性トロンビン溶液を用意する工程と、
前記水性トロンビン溶液を凍結乾燥する工程と、を含む、方法。
（７５） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下である、実施態様７４に記載の方法。

（７６） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様７５に記載の方法。
（７７） 総凍結乾燥時間が約３５時間以下である、実施態様７５又は７６に記載の方法。
（７８） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下である、実施態様７４に記載の方法。
（７９） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様７８に記載の方法。
（８０） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様７９に記載の方法。

（８１） 総凍結乾燥時間が約６８時間以下である、実施態様７８〜８０のいずれかに記載の方法。
（８２） 前記凍結乾燥工程が凍結乾燥器棚上で行われ、
ｉ．前記水性トロンビン溶液に凍結手順を行って凍結タンパク質溶液を生産する工程と、
ｉｉ．工程ｉ）の前記凍結トロンビン溶液に一次乾燥手順を行う工程と、
ｉｉｉ．工程ｉｉ）の生産物に二次乾燥手順を行う工程と、を含む、実施態様７４〜８１のいずれかに記載の方法。
（８３） 前記凍結手順が、前記凍結乾燥器棚を、約−４５℃〜約−５５℃の凍結温度に維持することを含む、実施態様８２に記載の方法。
（８４） 前記凍結手順が約０．１メガパスカル（約１気圧）の圧力で行われる、実施態様８２又は８３に記載の方法。
（８５） 前記凍結温度が約−５０℃である、実施態様８３又は８４に記載の方法。

（８６） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥器棚が約５時間以下にわたって前記凍結温度に維持される、実施態様８３〜８５のいずれかに記載の方法。
（８７） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様８６に記載の方法。
（８８） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥器棚が約６時間以下にわたって前記凍結温度に維持される、実施態様８３〜８５のいずれかに記載の方法。
（８９） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様８８に記載の方法。
（９０） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様８９に記載の方法。

（９１） 前記凍結乾燥器棚の温度を、約２．５時間以下の時間をかけて前記凍結温度にする、実施態様８３〜９０のいずれかに記載の方法。
（９２） 前記一次乾燥手順が、前記凍結乾燥器棚を、約１０Ｐａ〜約１６Ｐａ（約１００μＢａｒ〜約１６０μＢａｒ）の圧力で、約−１２℃〜約−１８℃の一次乾燥温度に維持することを含む、実施態様８３〜９１のいずれかに記載の方法。
（９３） 前記一次乾燥温度が約−１５℃である、実施態様９２に記載の方法。
（９４） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、前記凍結トロンビン溶液が約１３時間以下にわたって前記一次乾燥温度及び圧力に維持される、実施態様９２又は９３に記載の方法。
（９５） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様９４に記載の方法。

（９６） 前記凍結トロンビン溶液が、約１１〜約１３時間前記一次乾燥温度及び圧力に維持される、実施態様９４又は９５に記載の方法。
（９７） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であり、前記凍結トロンビン溶液が約３１時間以下にわたって前記一次乾燥温度及び圧力に維持される、実施態様９２又は９３に記載の方法。
（９８） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様９７に記載の方法。
（９９） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様９８に記載の方法。
（１００） 前記二次乾燥手順が、前記凍結乾燥器棚を、５Ｐａ（５０μＢａｒ）未満の圧力で、約２０℃〜約３０℃の二次乾燥温度に維持することを含む、実施態様８２〜９９のいずれかに記載の方法。

（１０１） 前記圧力が２Ｐａ（２０μＢａｒ）未満である、実施態様１００に記載の方法。
（１０２） 前記二次乾燥温度が約２５℃である、実施態様１００又は１０１に記載の方法。
（１０３） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、前記二次乾燥温度及び圧力が約１１時間以下にわたって維持される、実施態様１００〜１０２のいずれかに記載の方法。
（１０４） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様１０３に記載の方法。
（１０５） 前記二次乾燥手順が約９．５〜約１１時間である、実施態様８２〜１０４のいずれかに記載の方法。

（１０６） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であり、前記二次乾燥温度及び圧力が約１５時間以下にわたる、実施態様１００〜１０３のいずれかに記載の方法。
（１０７） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様１０６に記載の方法。
（１０８） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様１０７に記載の方法。
（１０９） 工程ｉｉｉ）に先立ち、前記凍結乾燥器棚を、約５〜約１５℃の中間乾燥温度に維持することを更に含む、実施態様１０６〜１０８のいずれかに記載の方法。
（１１０） 前記中間乾燥温度が約１０℃である、実施態様１０９に記載の方法。

（１１１） 前記凍結乾燥器棚を前記中間乾燥温度に維持することが、１２Ｐａ（１２０μＢａｒ）の圧力で行われる、実施態様１０９又は１１０に記載の方法。
（１１２） 前記中間乾燥温度が約１３時間以下にわたって維持される、実施態様１０９〜１１１のいずれかに記載の方法。
（１１３） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥が凍結乾燥器棚において行われ、
ａ）前記凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
ｂ）前記凍結乾燥器棚を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって前記凍結温度に維持し、凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
ｃ）約５０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｂ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させる工程と、
ｄ）前記一次乾燥温度を、約１１〜約１３時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
ｅ）約６０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｄ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させる工程と、
ｆ）前記二次乾燥温度を、約９．５〜約１１時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、を含む、実施態様７４に記載の方法。
（１１４） 前記高さが約８ｍｍである、実施態様１１３に記載の方法。
（１１５） 凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約２０ｍｍ以下であり、前記凍結乾燥が凍結乾燥器棚において行われ、
ａ）前記凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
ｂ）前記凍結温度を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって維持し、凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
ｃ）約３０〜約７０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｂ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させる工程と、
ｄ）前記一次乾燥温度を、約３０〜約３２時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
ｅ）約４０〜約８０分間の範囲内の時間をかけて、工程ｄ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させる工程と、
ｆ）前記二次乾燥温度を、約１３〜約１７時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、を含む、実施態様７４に記載の方法。

（１１６） 前記高さが約１５〜約１９ｍｍの範囲内である、実施態様１１５に記載の方法。
（１１７） 前記高さが約１７ｍｍである、実施態様１１６に記載の方法。
（１１８） 工程ａ）及びｂ）が大気圧で行われる、実施態様１１３〜１１７のいずれかに記載の方法。
（１１９） 実施態様１〜５９又は７４〜１１８のいずれかに記載の方法によって得られる固体トロンビン組成物。
（１２０） 約３％（ｗ／ｗ）以下の含水量と、少なくとも９５％のトロンビン活性回復率と、を有する、実施態様１１９に記載の固体トロンビン組成物。

（１２１） 約１．５％（ｗ／ｗ）以下の含水量と、少なくとも９８％のトロンビン活性回復率と、を有する、実施態様１２０に記載の固体トロンビン組成物。
（１２２） 非凍結保存条件下で少なくとも２年間安定である、実施態様１１９〜１２１のいずれかに記載の固体組成物。
（１２３） 室温で少なくとも２年間安定である、実施態様１２２に記載の固体組成物。
（１２４） 約１９．５％〜約７８％（全組成物のｗ／ｗ）のマンニトールと、約１％〜約２０％（全組成物のｗ／ｗ）の酢酸ナトリウムと、約２％〜約５３％（全組成物のｗ／ｗ）のアルブミンと、約２．５％〜約３１％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化カルシウムと、約６％〜約４５％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化ナトリウムと、を含む、実施態様１１９〜１２３のいずれかに記載の固体組成物。
（１２５） 約２２％〜約６６％（全組成物のｗ／ｗ）のマンニトールと、約１．５％〜約１０％（全組成物のｗ／ｗ）の酢酸ナトリウムと、約２．５％〜約４３％（全組成物のｗ／ｗ）のアルブミンと、約４％〜約１７％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化カルシウムと、約９．５％〜約２５％（全組成物のｗ／ｗ）の塩化ナトリウムと、を含む、実施態様１２４に記載の固体組成物。

Claims (17)

1. 水性トロンビン溶液の凍結乾燥法であって、
   約１〜約２．６％（ｗ／ｖ）以下の糖類又は糖アルコールと、少なくとも約０．７〜約０．９％（ｗ／ｖ）以下の塩化ナトリウムと、約０．２〜約３％（ｗ／ｖ）のアルブミンと、塩化カルシウムと、酢酸ナトリウムと、を含む、水性トロンビン溶液を用意する工程と、
   前記水性トロンビン溶液を凍結乾燥する工程と、を含み、
   凍結乾燥容器中の前記水性トロンビン溶液の高さが約１０ｍｍ以下であり、総凍結乾燥時間が約３５時間以下であり、
   前記凍結乾燥工程が凍結乾燥器棚上で行われ、
   前記凍結乾燥器棚における凍結乾燥が、
   ａ）前記凍結乾燥器棚の温度を約１．５〜約２．５時間の範囲内の時間をかけて、約−５０℃の凍結温度にする工程と、
   ｂ）前記工程ａ）の前記凍結温度を約４〜約６時間の範囲内の時間にわたって維持し、凍結トロンビン溶液を生産する工程と、
   ｃ）約５０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、前記工程ｂ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約−１５℃の一次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約１０〜約１６Ｐａ（約１００〜約１６０μＢａｒ）にする工程と、
   ｄ）前記工程ｃ）の前記温度及び圧力を約１１〜約１３時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、
   ｅ）約６０〜約９０分間の範囲内の時間をかけて、前記工程ｄ）の前記凍結乾燥器棚の前記温度を約２５℃の二次乾燥温度まで上昇させ、圧力を約５Ｐａ（約５０μＢａｒ）未満の二次乾燥圧力まで減少させる工程と、
   ｆ）前記工程ｅ）の前記温度及び圧力を約９．５〜約１１時間の範囲内の時間にわたって維持する工程と、を含む、方法。
2. 前記水性トロンビン溶液が、約２００〜約２０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンと、約０．３〜約１．５％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、約０．１４〜約１％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記水性トロンビン溶液が、約１．６〜約２．６％（ｗ／ｖ）以下の糖類又は糖アルコールと、約０．７〜約０．９％（ｗ／ｖ）以下の塩化ナトリウムと、約０．２超〜約３％（ｗ／ｖ）未満のアルブミンと、約０．３〜約１．２％（ｗ／ｖ）の塩化カルシウムと、約０．１４〜約０．７％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムと、を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記糖類又は糖アルコールが２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記アルブミンが約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記塩化ナトリウムが約０．７６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記塩化カルシウムが約０．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記酢酸ナトリウムが約０．２７％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項３に記載の方法。
5. 前記水性トロンビン溶液が、トロンビン、糖類又は糖アルコール、塩化ナトリウム、アルブミン、塩化カルシウム、及び酢酸ナトリウムからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記糖類が単糖類及び／又は二糖類を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記二糖類がスクロース又はマルトースである、請求項６に記載の方法。
8. 前記糖アルコールが単糖類由来糖アルコールを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記単糖類由来糖アルコールがマンニトールである、請求項８に記載の方法。
10. 前記マンニトールが約２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項９に記載の方法。
11. 前記水性トロンビン溶液が１種類の糖類又は糖アルコールを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記水性トロンビン溶液が２種類以上の糖類又は糖アルコールを含まない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記水性トロンビン溶液が、ポリエチレングリコール及びヒスチジンのうち少なくとも１つを含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記凍結乾燥工程に先立ち、前記水性トロンビン溶液のｐＨを約５．５〜約９の範囲のｐＨに調整する工程を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記高さが約８ｍｍである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記総凍結乾燥時間が約３０時間以下である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記工程ａ）およびｂ）が約０．１メガパスカル（約１気圧）の圧力で行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

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