BR112015013071B1 - Solução de trombina aquosa, e seu método para liofilização - Google Patents

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Abstract

SOLUÇÃO DE TROMBINA E SEUS MÉTODOS DE USO. A invenção refere-se a métodos para a liofilização de uma solução de trombina aquosa, soluções de trombina para uso nesses métodos de liofilização e composições de trombina sólida produzidas por meio de tais métodos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção refere-se ao campo de soluções farmacêuticas, mais especificamente a métodos para liofilização de uma solução de trombina aquosa, de soluções de trombina para uso nesses métodos de liofilização e composições sólidas de trombina produzidas por tais métodos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A trombina é uma enzima proteolítica formada por protrom- bina plasmática durante o processo de coagulação.
[003] A trombina é amplamente usada em aplicações clínicas como fator de coagulação para estancar o sangramento de feridas pela conversão de fibrinogênio em fibrina. É um componente comum de bandagens cirúrgicas e foi usada em combinação com fibrinogênio e outras proteínas de coagulação em sistemas hemostáticos de dois componentes, como colas, adesivos e selantes de fibrina.
[004] Sabe-se que liofilizar uma solução de trombina produz um composto de trombina sólida anterior ao armazenamento, para reduzir a degradação da proteína, sendo que a composição de trombina sólida pode ser reconstituída antes do uso. A liofilização tipicamente refere- se ao processo de congelar uma mistura e, então, reduzir a concentração de água, por exemplo por sublimação, até níveis que não suportam reações químicas ou biológicas. O material sólido poroso e esponjoso resultante do processo de liofilização é chamado de torta. É desejável que tais composições de trombina sólida tenham baixo teor de água (por exemplo menos que cerca de 3%), para prender a estabilidade estrutural e a funcional por longos períodos), de preferência à temperatura ambiente, e para prender uma elevada porcentagem de atividade de trombina sob reconstituição em comparação com a ativi-
[005] de trombina na solução antes da liofilização.
[006] Exemplos de antecedentes da invenção das soluções de trombina são descritos no documento EP 813598B1; US 4.877.608; US 2010/0074865; US 5.733.873; EP 1766003; e US 2010/0168018. Os antecedentes da invenção das soluções de trombina variam consi-deravelmente no número e nos tipos de excipientes presentes, e nas concentrações dos excipientes individuais.
[007] Criopotetores ou estabilizadores são comumente usados em soluções de trombina para proteger a trombina da desnaturação ou perda de atividade devido ao estresse por congelamento, para estabilizar a proteína em etapas de produção subsequentes e para estender a vida útil. São exemplos de crioprotetores os sacarídeos, como sacarose, lactose e trealose; álcoois de açúcar, como manitol; e tensoati- vos, como poli(glicol etilênico), TritonX-100, TWEEN-20 e TWEEN-80. Além de funcionar como estabilizadores, o manitol e a sacarose (em menor grau) também são usados como agentes de formação de volume que ajudam a fornecer uma torta com uma estrutura física forte. O uso de agentes de formação de volume é especificamente importante para a formulação com um baixo teor de material sólido (por volume).
[008] A Albumina Sérica Humana (HSA) também é amplamente usada em formulações biofarmacêuticas como agente estabilizador e agente avolumador (H.R.Constantino, M.J.Pikal: Lyophilization of Biopharmaceuticals, Springer, 2004).
[009] O documento EP 813598B1 revela uma formulação de trombina simples para liofilização, contendo 40 mM de ácido glucônico, 20 mM de citrato trissódico e 150 mM de NaCl; US 5.605.884 e US 4.877.608 revelam formulações contendo até 10% de sacarídeos como sacarose, manitol ou maltose; US 2010/0074865 revela formulação contendo 5,7% de lactose, 3,1% de trealose e 0,001% TWEEN-80; e US 5.733.873 revela formulações incluindo 0,001-0,025% de polissor- bato 80 (TWEEN-80) com ou sem 0,1% PEG 4000 e 2% de manitol.
[0010] O cloreto de sódio (NaCl) é comumente usado para reduzir a precipitação e a agregação da proteína durante a liofilização de formulações biofarmacêuticas. Entretanto, o documento EP 1766003 revela que o NaCl pode ser problemático, pois diminui a temperatura de transição vítrea, necessitando, assim, de uma temperatura baixa de secagem primária e um tempo prolongado de ciclo de secagem. Ainda, US 2010/0168018 revela uma formulação sem NaCl, ou com NaCl presente em quantidades-traço.
[0011] Os métodos de liofilização dessas soluções de trombina conhecidas são frequentemente de duração muito longa, o que aumenta os custos do processo e/ou resultado em composições de trombina sólida com teor de água relativamente alto e/ou que prende uma porcentagem relativamente baixa de atividade de trombina sob reconstituição, em comparação com a atividade de trombina na solução antes da liofilização.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] A invenção, em algumas das suas modalidades, está rela cionada a métodos para liofilização de uma solução de trombina aquosa, soluções de trombina para uso em tais métodos de liofilização e composições de trombina sólida produzidas por tais métodos. Em algumas modalidades, as soluções e os métodos revelados na presente invenção possibilitam que composições de trombina sólida sejam preparadas usandMétodos de liofilização mais curtos que os métodos conhecidos para liofilização de soluções de trombina, por exemplo, 37% mais curto, aumentando assim a capacidade de liofilização e o custo- benefício.
[0013] Em algumas modalidades, os métodos de liofilização aqui descritos resultam em composições de trombina sólida com teor de água relativamente baixo e/ou altamente estáveis em temperatura ambiente por períodos de tempo relativamente longos e/ou que demonstram alta recuperação de atividade de trombina sob reconstituição. Em algumas modalidades, Método compreende o uso de uma formulação aquosa de trombina ideal.
[0014] Os aspectos e as modalidades da invenção são descritos no relatório descritivo abaixo e nas reivindicações em anexo.
[0015] De acordo com um aspecto de algumas modalidades aqui descritas, é fornecido um método para liofilização de uma solução de trombina aquosa, método que compreende o fornecimento de uma solução de trombina aquosa que compreende cerca de 1 até menos de 4,6% (peso por volume) de sacarídeo ou álcool de açúcar; ao menos cerca de 0,7 até menos de cerca de 1,75% (peso por volume) de cloreto de sódio; cerca de 0,2 até cerca de 3% de albumina; cloreto de cálcio; e acetato de sódio; e liofilizar a solução de trombina aquosa.
[0016] Em algumas modalidades, a presença de cálcio na solução de trombina aquosa estabiliza a estrutura de trombina, preservando assim sua atividade durante a liofilização. Ainda, o cálcio é necessário para sustentar a atividade trombina-hemostática. Após a liofilização de uma solução de trombina aquosa, um material sólido poroso e esponjoso, chamado de torta (também chamado na presente invenção de composição de trombina sólida) é obtido.
[0017] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa compreende cerca de 200 a 2000 UI/ml de trombina; cerca de 0,3 até cerca de 1,5% (peso por volume) de cloreto de cálcio; e cerca de 0,14 até cerca de 1% (peso por volume) de acetato de sódio.
[0018] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa compreende cerca de 1,6 até menos de cerca de 4,6% (peso por volume) de sacarídeo ou álcool de açúcar; cerca de 0,7 até cerca de 1,7% (peso por volume) de cloreto de sódio; mais que cerca de 0,2 até menos que cerca de 3% de albumina; cerca de 0,3 até cerca de 1,2% (peso por volume) de cloreto de cálcio; e cerca de 0,14 até cerca de 0,7% (peso por volume) de acetato de sódio.
[0019] Em algumas modalidades, o sacarídeo ou álcool de açúcar está presente em uma concentração de 2% (peso por volume); a albumina está presente em uma concentração de cerca de 0,6% (peso por volume); o cloreto de sódio está presente em uma concentração de cerca de 0,76% (peso por volume); o cloreto de cálcio está presente em uma concentração de cerca de 0,6% (peso por volume), e o acetato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 0,27% (peso por volume).
[0020] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa consiste essencialmente em trombina; sacarídeo ou álcool de açúcar; cloreto de sódio; albumina; cloreto de cálcio; e acetato de sódio.
[0021] Em algumas modalidades, o sacarídeo compreende um monossacarídeo (selecionado opcionalmente do grupo que consiste em glicose, frutose, galactose, xilose e ribose) e/ou dissacarídeo (selecionado opcionalmente do grupo que consiste em sacarose, maltose e lactose). Em algumas modalidades, o dissacarídeo compreende sacarose e/ou maltose, opcionalmente em uma concentração de cerca de 2% (peso por volume).
[0022] Em algumas modalidades, o álcool de açúcar compreende um álcool de açúcar derivado de monossacarídeo, selecionado opcionalmente do grupo que consiste em manitol, sorbitol e xilitol.
[0023] Em algumas modalidades, o açúcar derivado de monossa- carídeo compreende manitol, opcionalmente em uma concentração de cerca de 2% (peso por volume).
[0024] Em algumas modalidades, o álcool de açúcar é derivado de dissacarídeo, selecionado opcionalmente do grupo que consiste em maltitol, isomalte e lactitol.
[0025] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa compreende um único sacarídio (tanto monossacarídeo como dissaca- rídeo) ou álcool de açúcar. Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa é desprovida de mais de um tipo de sacarídeo ou álcool de açúcar. Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa é desprovida de ao menos um poli(glicol etilênico) e histidina.
[0026] Em algumas modalidades, Método compreende adicional mente, antes da liofilização, ajuste do pH da solução de trombina aquosa para um pH na faixa de cerca de 5,5 para cerca de 9.
[0027] Em algumas modalidades, a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização, como medida a partir do ponto mais baixo do vaso, não é maior que cerca de 10 mm, como, por exemplo, cerca de 10 mm, cerca de 9 mm, cerca de 8 mm, cerca de 7 mm ou cerca de 6 mm. Em algumas modalidades exemplificadoras, a altura é de cerca de 8 mm.
[0028] Nas modalidades em que a altura da solução de trombina aquosa não é maior que cerca de 10 mm, o tempo total de liofilização não é maior que cerca de 35 horas, como, por exemplo, cerca de 35 horas, cerca de 34 horas, cerca de 33 horas, cerca de 32 horas, cerca de 31 horas, cerca de 30 horas ou cerca de 29 horas. Em algumas modalidades exemplificadoras, o tempo total de liofilização não é maior que 30 horas.
[0029] Em algumas modalidades, a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm. Em algumas modalidades, a altura da solução de trombina aquosa está na faixa de cerca de 15 até cerca de 19 mm, como, por exemplo, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm ou 19 mm. Em algumas modalidades exemplificadoras, a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização é de cerca de 17 mm.
[0030] Em algumas dessas modalidades, em que a altura da solu- ção de trombina aquosa não é maior que cerca de 20 mm, o tempo total de liofilização não é maior que cerca de 68 horas.
[0031] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa não é maior que cerca de 20 mm, o tempo total de liofilização é mais curto que aquele de um ciclo de liofilização usando uma solução de controle de altura idêntica em um vaso de liofilização. Uma "solução de controle" tem uma composição diferente da composição aqui descrita. A composição de controle pode ser diferente da composição da invenção ao compreender excipientes adicionais ou de outros tipos e/ou nas concentrações dos excipientes individuais.
[0032] Em algumas modalidades, o tempo total de liofilização em comparação com aquele que usa soluções de técnica anterior é reduzido em cerca de 37%
[0033] Em algumas modalidades, a liofilização compreende: i) submeter a solução de trombina aquosa a um procedimento de congelamento para produzir uma solução de trombina congelada; ii) submeter a solução de trombina congelada da etapa i) a um procedimento de secagem primária; e iii) submeter o produto da etapa ii) a um segundo procedimento de secagem primária.
[0034] Em algumas modalidades, o procedimento de congelamen to é executado a uma temperatura de congelamento de cerca de -45°C até cerca de -55°C. Em algumas modalidades, a liofilização é executada em uma prateleira liofilizante, e o procedimento de congelamento compreende manter a prateleira liofilizante a uma temperatura de congelamento (na presente invenção também chamada de molho conge- lante) de cerca de -45°C até cerca de -55°C, como, por exemplo, cerca de -50°C.
[0035] Em algumas modalidades, o procedimento de congelamen to é executado em uma pressão de cerca de 0,1 megapascal (1 atmosfera).
[0036] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como cerca de 8 mm), a temperatura de congelamento é mantida por não mais que cerca de 5 horas.
[0037] Em algumas modalidades, em que a solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como 15-19 mm, por exemplo, cerca de 17 mm), a temperatura de congelamento é mantida por não mais que cerca de 6 horas.
[0038] Em algumas modalidades, a temperatura de congelamento, como a temperatura da prateleira liofilizante, é alcançada por um período (na presente invenção também chamado de rampa de congelamento) de não mais que cerca de 2,5 horas.
[0039] Em algumas modalidades, o procedimento de secagem primária é executado a cerca de -12°C até cerca de -18°C. Em algumas modalidades, o procedimento de secagem primária compreende manter a prateleira liofilizante a uma temperatura de secagem primária (na presente invenção também chamada de molho de secagem primária) de cerca de -12°C até cerca de -18°C, como cerca de -12°C, cerca de -13°C, cerca de -14°C, cerca de -15°C, cerca de -16°C, cerca de -17°C ou cerca de -18°C, a uma pressão de cerca de 10 Pa até cerca de 16 Pa (cerca de 100 μBar até cerca de 160 μBar). Em algumas modalidades exemplificadoras, a temperatura de secagem primária é de cerca de -15°C.
[0040] Em algumas modalidades, a temperatura de secagem pri mária, como a temperatura da prateleira liofilizante, é atingida em um período (na presente invenção também chamado de rampa de secagem primária) de cerca de 80 a cerca de 90 minutos.
[0041] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como, por exemplo, cerca de 8 mm), a temperatura e a pres- são de secagem primária são mantidas por não mais que cerca de 13 horas, como, por exemplo, cerca de 13 horas, cerca de 12 horas ou cerca de 11 horas.
[0042] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como, por exemplo, cerca de 15 até cerca de 19 mm, ou cerca de 17 mm), a temperatura e a pressão de secagem primária (molho congelante) são mantidas por não mais que cerca de 31 horas.
[0043] Em algumas modalidades, o procedimento de secagem se cundária é executado a cerca de 20°C até cerca de 30°C. Em algumas modalidades, o procedimento de secagem secundária compreende manter a prateleira liofilizante a uma temperatura de secagem secundária (na presente invenção também chamada de molho de secagem secundária) de cerca de 20° C até cerca de 30°C (como, por exemplo, cerca de 25°C) e a uma pressão de menos que cerca de 5 Pa (50 μBar), como, por exemplo, menos que cerca de 2 Pa (20 μBar).
[0044] Em algumas modalidades, a temperatura da secagem se cundária é atingida em um período (também chamado de rampa de secagem secundária) de cerca de 60 até cerca de 90 minutos.
[0045] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como, por exemplo, cerca de 8 mm), a temperatura e a pressão de secagem secundária são mantidas por não mais que cerca de 11 horas (como, por exemplo, cerca de 9,5 até cerca de 11 horas).
[0046] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como cerca de 15 até cerca de 19 mm, por exemplo, cerca de 17 mm), a temperatura e a pressão de secagem secundária são mantidas por não mais que cerca de 15 horas. Em algumas dessas modalidades, Método compreende adicionalmente, antes do procedimento de secagem secundária, um procedimento de secagem intermediária, executado a cerca de 5 até cerca de 15°C. Em algumas modalidades, o procedimento de secagem secundária compreende manter a prateleira liofilizante a uma temperatura de secagem intermediária (na presente invenção também chamada de molho de secagem intermediária) de cerca de 5 até cerca de 15°C, como, por exemplo, cerca de 10°C. Em algumas dessas modalidades, a pressão durante o procedimento de secagem intermediária é de cerca de 12 Pa (120 μBar). Em algumas dessas modalidades, a temperatura de secagem intermediária é mantida por não mais que 13 horas.
[0047] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como, por exemplo, cerca de 8 mm), a liofilização em uma prateleira liofilizante compreende:
[0048] a) ajustar a temperatura da prateleira liofilizante para uma temperatura de congelamento de cerca de -50°C, por um período de tempo na faixa de cerca de 1,5 até cerca de 2,5, horas;
[0049] b) manter a temperatura de congelamento por um período de tempo na faixa de cerca de 4 até cerca de 6 horas;
[0050] c) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa b) para uma temperatura de secagem primária de cerca de -15°C e ajustar a pressão de cerca de 10 até cerca de 16 Pa (cerca de 100 até cerca de 160 μBar), por um período de tempo na faixa de cerca de 50 até cerca de 90 minutos;
[0051] d) manter a temperatura e a pressão de secagem primária por um período de tempo na faixa de cerca de 11 até cerca de 13 horas;
[0052] e) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa d) para uma temperatura de secagem secundária de cerca de 25°C e diminuir a pressão para menos de cerca de 5 Pa (50 μBar) por um pe- ríodo de tempo na faixa de cerca de 60 até cerca de 90 minutos; e
[0053] f) manter a temperatura e a pressão de secagem secundá ria da etapa e) por um período de tempo na faixa de cerca de 9,5 até cerca de 11 horas.
[0054] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como cerca de 15 a 19 mm, por exemplo, 17 mm) a liofilização em uma prateleira liofilizante compreende:
[0055] a) conduzir a temperatura da prateleira liofilizante para uma temperatura de congelamento de cerca de -50°C, por um período de tempo na faixa de cerca de 1,5 até cerca de 2,5 horas;
[0056] b) manter a temperatura de congelamento da etapa a) por um período de tempo na faixa de cerca de 4 até cerca de 6 horas para produzir uma solução de trombina congelada;
[0057] c) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa b) para uma temperatura de secagem primária de cerca de -15°C e ajustar a pressão de cerca de 10 até cerca de 16 Pa (cerca de 100 até cerca de 160 μBar), por um período de tempo na faixa de cerca de 30 até cerca de 70 minutos;
[0058] d) manter a temperatura e a pressão de secagem primária por um período de tempo na faixa de cerca de 30 até cerca de 32 horas;
[0059] e) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa d) para uma temperatura de secagem secundária de cerca de 25°C e diminuir a pressão para menos que cerca de 5 Pa (50 μBar), por um período de tempo na faixa de cerca de 40 até cerca de 80 minutos; e
[0060] f) manter a temperatura e a pressão de secagem secundá ria por um período de tempo na faixa de cerca de 13 até cerca de 17 horas.
[0061] Em algumas modalidades, as etapas a) e b) são executa- das na pressão atmosférica.
[0062] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição de trombina sólida que pode ser obtida de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos.
[0063] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida tem um teor de água de não mais que cerca de 3% (em peso) e uma recuperação de atividade de trombina de ao menos 95%.
[0064] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida tem um teor de água de não mais que cerca de 1,5% (em peso) e uma recuperação de atividade de trombina de ao menos 98%.
[0065] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida é estável por ao menos 2 anos sob condições de armazenagem de não congelamento, como à temperatura ambiente.
[0066] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida compreende cerca de 19,5% até cerca de 78% (em peso da composição total) de manitol, cerca de 1% até cerca de 20% (em peso da composição total) de acetato de sódio; cerca de 2% até cerca de 53% (em peso da composição total) de albumina; cerca de 2,5% até cerca de 31% (em peso da composição total) de cloreto de cálcio; e cerca de 6% até cerca de 45% (em peso da composição total) de cloreto de sódio.
[0067] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida compreende cerca de 22% até cerca de 66% (em peso da composição da total) de manitol, cerca de 1,5% até cerca de 10% (em peso da composição total) de acetato de sódio; cerca de 2,5% até cerca de 43% (em peso da composição total) de albumina; cerca de 4% até cerca de 17% (em peso da composição total) de cloreto de cálcio; e cerca de 9,5% até cerca de 25% (em peso da composição total) de cloreto de sódio.
[0068] De acordo com um aspecto de algumas modalidades aqui descritas, é fornecida uma solução de trombina aquosa que compreende cerca de 1 até menos que cerca de 4,6% (peso por volume) de sacarídeo ou álcool de açúcar; ao menos cerca de 0,7 até menos que cerca de 1,75% (peso por volume) de cloreto de sódio; cerca de 0,2 até cerca de 3% (peso por volume) de albumina; cloreto de cálcio; e acetato de sódio.
[0069] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa compreende cerca de 200 até cerca de 2000 UI/ml de trombina; cerca de 0,3 até cerca de 1,5% (peso por volume) de cloreto de cálcio; e cerca de 0,14 até cerca de 1% (peso por volume) de acetato de sódio.
[0070] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa compreende cerca de 1,6 até menos que cerca de 4,6% (peso por volume) de sacarídeo ou álcool de açúcar; cerca de 0,7 até cerca de 1,7% (peso por volume) de cloreto de sódio; mais que cerca de 0,2 até menos que cerca de 3% de albumina; cerca de 0,3 até cerca de 1,2% (peso por volume) de cloreto de cálcio; e cerca de 0,14 até cerca de 0,7% (peso por volume) de acetato de sódio.
[0071] Em algumas modalidades da solução de trombina aquosa, o sacarídeo ou álcool de açúcar está presente em uma concentração de cerca de 2% (peso por volume); a albumina está presente em uma concentração de cerca de 0,6% (peso por volume), o cloreto de sódio está presente em uma concentração de cerca de 0,76% (peso por volume), o cloreto de cálcio está presente em uma concentração de cerca de 0,6% (peso por volume) e o acetato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 0,27% (peso por volume).
[0072] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa consiste essencialmente em trombina; sacarídeo ou açúcar de álcool; cloreto de sódio; albumina; cloreto de cálcio; e acetato de sódio.
[0073] Em algumas modalidades, o sacarídeo é um monossacarí- deo, como um monossacarídeo selecionado do grupo que consiste em glicose, frutose, galactose, xilose e ribose.
[0074] Em algumas modalidades, o sacarídeo é um dissacarídeo, como um dissacarídeo selecionado do grupo que consiste em sacarose, maltose e lactose.
[0075] Em algumas modalidades, o álcool de açúcar compreende um álcool de açúcar derivado de um monossacarídeo, como um álcool de açúcar derivado de um monossacarídeo selecionado do grupo que consiste em manitol, sorbitol e xilitol. Em algumas modalidades, o álcool de açúcar derivado de monossacarídeo compreende manitol, opcionalmente em uma concentração de cerca de 2% (peso por volume).
[0076] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa compreende um único sacarídeo ou álcool de açúcar (como um de sacarose sozinho, de maltose sozinho ou de manitol).
[0077] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa é desprovida de mais de um tipo de sacarídeo ou álcool de açúcar.
[0078] Em algumas modalidades, a solução de trombina aquosa é desprovida de ao menos um poli(glicol etilênico) e histidina.
[0079] Em algumas modalidades, a trombina aquosa tem pH na faixa de cerca de 5,5 até cerca de 9.
[0080] Em algumas modalidades, é apresentado um método para liofilização de uma solução de trombina aquosa, que compreende fornecer uma solução de trombina aquosa como aqui descrito; e liofilizar a solução de trombina aquosa.
[0081] Em algumas modalidades, a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como, por exemplo, cerca de 8 mm). Em algumas dessas modalidades, um tempo total de liofilização não é maior que cerca de 35 horas.
[0082] Em algumas modalidades, a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como cerca de 15-19 mm, por exemplo, cerca de 17 mm). Em algu- mas dessas modalidades, um tempo total de liofilização não é maior que cerca de 68 horas.
[0083] Em algumas modalidades, a liofilização compreende: i) submeter a solução de trombina aquosa a um procedimento de congelamento para produzir uma solução de proteína congelada. ii) submeter a solução de trombina congelada da etapa i) a um procedimento de secagem primária; e iii) submeter o produto da etapa ii) a um procedimento de secagem secundária.
[0084] Em algumas modalidades, o procedimento de congelamen to é executado a uma temperatura de congelamento de cerca de -45°C até cerca de -55°C.
[0085] Em algumas modalidades, a liofilização é executada em uma prateleira de liofilização, e o procedimento de congelamento compreende manter a prateleira liofilizante a uma temperatura de congelamento de cerca de -45°C até cerca de -55°C, como, por exemplo, cerca de -50°C.
[0086] Em algumas modalidades, o procedimento de congelamen to é executado em uma pressão cerca de 0,1 megapascal (1 atmosfera).
[0087] Em algumas modalidades, a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como, por exemplo, cerca de 8 mm). Em algumas modalidades, a temperatura de congelamento é mantida por não mais que cerca de 5 horas.
[0088] Em algumas modalidades, a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como 15-19 mm, por exemplo, cerca de 17 mm). Em algumas modalidades, a temperatura de congelamento é mantida por não mais que cerca de 6 horas.
[0089] Em algumas modalidades, a temperatura da prateleira liofi- lizante é conduzida à temperatura de congelamento por um período de não mais que cerca de 2,5 horas.
[0090] Em algumas modalidades, o procedimento de secagem primária compreende manter aprateleira liofilizante a uma temperatura de secagem primária de cerca de -12°C até cerca de -18°C (como, por exemplo, cerca de -15°C) e a uma pressão de cerca de 10 Pa até cerca de 16 (cerca de 100 μBar até cerca de 160 μBar).
[0091] Em algumas modalidades, a temperatura da prateleira liofi- lizante é conduzida à temperatura de secagem primária por um período (na presente invenção também chamado de rampa de secagem primária) de cerca de 80 até cerca de 90 minutos.
[0092] Em algumas modalidades, em que a solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como, por exemplo, cerca de 8 mm), a temperatura e a pressão de secagem primária são mantidas por não mais que cerca de 13 horas (como, por exemplo, cerca de 11 até cerca de 13 horas).
[0093] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como cerca de 15 até cerca de 19 mm, por exemplo, cerca de 17 mm), a temperatura e a pressão de secagem primária são mantidas por não mais que cerca de 31 horas.
[0094] Em algumas modalidades, o procedimento de secagem se cundária compreende manter a prateleira liofilizante da etapa ii) a uma temperatura de secagem secundária de cerca de 20°C até cerca de 30°C e a uma pressão de menos que cerca de 5 Pa (50 μBar) (como, por exemplo, menos que cerca de 2 Pa (20 μBar)).
[0095] Em algumas modalidades, a temperatura da prateleira liofi- lizante é ajustada na temperatura de secagem secundária por um período de cerca de 60 até cerca de 90 minutos.
[0096] Em algumas modalidades, em que a solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como, por exemplo, cerca de 8 mm), a temperatura e a pressão de secagem secundária são mantidas por não mais que cerca de 11 horas (como, por exemplo, cerca de 9,5 horas até cerca de 11 horas).
[0097] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como cerca de 15 até cerca de 19 mm, por exemplo, cerca de 17 mm), a temperatura e a pressão de secagem secundária são mantidas por não mais que cerca de 15 horas (como, por exemplo, cerca de 11 até cerca de 13 horas). Em algumas modalidades, antes da etapa iii), a prateleira liofilizante da etapa ii) é mantida a uma temperatura de secagem intermediária de cerca de 5 até cerca de 15°C (como, por exemplo, cerca de 10°C).
[0098] Em algumas modalidades, a prateleira liofilizante da etapa ii) é mantida na temperatura de secagem intermediária a uma pressão de 12 Pa (120 μBar),
[0099] Em algumas modalidades, a temperatura de secagem in termediária é mantida por não mais que cerca de 13 horas.
[00100] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 10 mm (como, por exemplo, cerca de 8 mm), a liofilização em uma prateleira liofilizante compreende:
[00101] a) ajustar a temperatura da prateleira liofilizante para uma temperatura de congelamento de cerca de -50°C, por um período de tempo na faixa de cerca de 1,5 até cerca de 2,5 horas;
[00102] b) manter a temperatura de congelamento da etapa a) por um período de tempo na faixa de cerca de 4 até 6 horas para produzir uma solução de trombina congelada;
[00103] c) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa b) para uma temperatura de secagem primária de cerca de -15°C e ajustar a pressão de cerca de 10 até cerca de 16 Pa (cerca de 100 até cerca de 160 μBar), por um período de tempo na faixa de cerca de 50 até 90 minutos;
[00104] d) manter a temperatura e a pressão de secagem primária por um período de tempo na faixa de cerca de 11 até cerca de 13 horas;
[00105] e) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa d) para uma temperatura de secagem secundária de cerca de 25°C e diminuir a pressão para menos que 5 Pa (50 μBar), por um período de tempo na faixa de cerca de 60 a 90 minutos; e
[00106] f)manter a temperatura e a pressão de secagem secundária por um período de tempo na faixa de cerca de 9,5 até cerca de 11 horas.
[00107] Em algumas modalidades, em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que cerca de 20 mm (como cerca de 15 até cerca de 19, por exemplo, cerca de 17 mm), a liofilização em uma prateleira liofilizante compreende:
[00108] a) ajustar a temperatura da prateleira liofilizante para uma temperatura de congelamento de cerca de -50°C, por um período de tempo na faixa cerca de 1,5 até cerca de 2,5 horas;
[00109] b) manter a temperatura de congelamento por um período de tempo na faixa de cerca de 4 até cerca de 6 horas para produzir uma solução de trombina congelada;
[00110] c) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa b) para uma temperatura de secagem primária de cerca de -15°C e diminuir a pressão para a partir de cerca de 10 até cerca de 16 (cerca de 100 até cerca de 160 μBar), por um período de tempo na faixa de cerca de 30 até cerca de 70 minutos;
[00111] d) manter a temperatura e a pressão de secagem primária por um período de tempo na faixa de cerca de 30 até cerca de 32 ho- ras.
[00112] e) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa d) para uma temperatura de secagem secundária de cerca de 25°C e diminuir a pressão para menos que cerca de 5 Pa (50 μBar), por um período de tempo na faixa de cerca de 40 até cerca de 80 minutos; e
[00113] f) manter a temperatura e a pressão de secagem secundária por um período de tempo na faixa de cerca de 13 até cerca de 17 horas.
[00114] Em algumas modalidades, as etapas a) e b) são executadas na pressão atmosférica.
[00115] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição de trombina sólida que pode ser obtida de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos.
[00116] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida tem um teor de água de não mais que cerca de 3% (em peso) e uma recuperação de atividade de trombina de ao menos 95%.
[00117] Em algumas modalidades, a composição de trombina tem um teor de água de não mais que 1,5% (em peso) e uma recuperação de atividade de trombina de ao menos 98%.
[00118] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida é estável por ao menos 2 anos sob condições de armazenamento de não congelamento (como à temperatura ambiente).
[00119] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida compreende cerca de 19,5% até por votla de 78% (em peso da composição total) de manitol, cerca de 1% até cerca de 20% (em peso da composição total) de acetato de sódio; cerca de 2% até cerca de 53% (em peso da composição total) de albumina; cerca de 2,5% até cerca de 31% (em peso da composição total) de cloreto de cálcio; e cerca de 6% até cerca de 45% (em peso da composição total) de cloreto de sódio.
[00120] Em algumas modalidades, a composição de trombina sólida compreende cerca de 22% até cerca de 66% (em peso da composição total) de manitol, cerca de 1,5% até cerca de 10% (em peso da composição total) de acetato de sódio; cerca de 2,5% até cerca de 43% (em peso da composição total) de albumina; cerca de 4% até cerca de 17% (em peso da composição total) de cloreto de cálcio; e cerca de 9,5% até cerca de 25% (em peso da composição total) de cloreto de sódio.
[00121] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica ao qual a invenção se aplica. Além disso, as descrições, materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a limitar. Métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos podem ser usados nas práticas da presente invenção.
[00122] Como usado aqui, o termo "torta" ou "torta sólida" refere-se a uma composição tipo estrutura porosa e esponjosa resultante do processo de liofilização.
[00123] Como usado aqui, o termo "colapso" em relação a uma torta, refere-se ao ponto no qual a torta não pode mais sustentar a sua própria estrutura.
[00124] Como usado aqui, o termo "composição sólida" refere-se a uma composição que tem um teor de água igual a ou menor que cerca de 3% (em peso) de água, como igual a ou menor que 1,5%, com base no peso total da composição sólida.
[00125] Como usado aqui, o termo "recuperação de atividade de trombina" refere-se à atividade de trombina na composição sólida sob reconstituição, em comparação com a atividade inicial de trombina na solução de trombina aquosa antes da liofilização. Tipicamente, a recuperação de atividade é apresentada em porcentagem.
[00126] Como usado aqui, o termo "estável" com relação à compo- sição de trombina sólida/liofilizada é, por exemplo, uma composição que pode substancialmente sustentar sua própria estrutura sem colapso da torta, e/ou uma composição que prende ao menos 80% da sua atividade (como 90%, 95% ou mais) por ao menos 2 anos em condições de armazenamento de não congelamento, por exemplo a uma temperatura de 2-8°C e até mais em temperatura ambiente, tal como menos de 25°C. Em uma modalidade da invenção, a composição sólida é estável por 2 anos se armazenada em temperatura ambiente. Tipicamente, o colapso é caracterizado de maneira mais evidente pela perda da estrutura de torta durante a secagem. O colapso geralmente resulta em uma estrutura cujo volume é significativamente menor que o volume da formulação usada para preparar a torta. Além disso, a redução do tamanho médio dos poros e da porosidade, assim como um aumento na densidade aparente, pode ser observada.
[00127] O termo "liofilização" refere-se tipicamente ao processo de congelar uma solução e então reduzir a concentração de água, por exemplo, por sublimação até níveis que não suportam reações químicas ou biológicas. A composição liofilizada resultante pode ser armazenada por um período de tempo relativamente longo. Após o armazenamento, a composição liofilizada pode ser usada como pó ou pode ser reconstituída pela adição de vários volumes de uma solução aquosa. O volume adicionado durante a reconstituição pode ser similar, menos ou maior ao volume da solução antes da liofilização.
[00128] Como usado aqui, os termos "que compreende", "incluindo", "que tem/com" e suas variantes gramaticais devem ser interpretados como especificando os recursos, totais, etapas ou componentes declarados, mas não excluem a adição de um ou mais dos seus recursos, totais, etapas componentes ou grupos adicionais. Esses termos abrangem os termos "consiste em" e "consistindo/que consiste essencialmente em".
[00129] Como usado aqui, os artigos indefinidos "um" e "uma" significam "ao menos um/uma" ou "um/uma ou mais", a menos que o contexto claramente determine de outro modo.
[00130] Como usado aqui, o termo "cerca de" refere-se a ± 10%.
[00131] As soluções e os métodos descritos na presente invenção possibilitam que uma composição de trombina sólida seja obtida por meio de um ciclo mais curto em comparação aos métodos de liofiliza- ção atualmente conhecidos na técnica, aumentando assim a capacidade de liofilização e reduzindo os custos de produção. As composições de trombina sólida obtidas com o uso das soluções e dos métodos descritos na presente invenção têm baixo teor de água após a lio- filização, em comparação com composições de trombina conhecidas, são estáveis durante o armazenamento em temperatura ambiente por períodos de tempo relativamente longos e mostram alta porcentagem de recuperação da atividade de trombina sob reconstituição.
BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO
[00132] Algumas modalidades da invenção são descritas nesse documento com referência às figuras em anexo. A descrição, juntamente com a figura, torna evidente para o versado na técnica como algumas modalidades da invenção podem ser praticadas. A figura é para fins de discussão ilustrativa e nenhuma tentativa é feita para mostrar os detalhes estruturais de uma modalidade em mais detalhes do que o que é necessário para uma compreensão fundamental da invenção. Por motivos de clareza, alguns objetivos mostrados nas figuras não estão em escala.
[00133] Na figura:
[00134] A Figura 1 mostra a aparência visual de uma torta obtida seguindo um ciclo curto de liofilização exemplificadora como descrito aqui.
DESCRIÇÃO DE ALGUMAS MODALIDADES DA INVENÇÃO
[00135] A invenção, em algumas das suas modalidades, está rela- cionada a métodos paraliofilização de uma solução de trombina aquosa, soluções de trombina para uso nesses métodos de liofilização e composições de trombina sólida produzidas por meio de tais métodos.
[00136] Os princípios, os usos e as implementações dos ensinamentos da presente invenção podem ser melhor entendidos com referência à descrição anexa. Com a leitura minuciosa da descrição, o versado na técnica é capaz de implementar a invenção sem esforço ou experimentação indevidos.
[00137] Antes de explicar ao menos uma modalidade em detalhes, é necessário entender que a invenção não é necessariamente limitada, em sua aplicação, aos detalhes de construção e de disposição dos componentes e/ou métodos apresentados na seguinte descrição. A invenção tem capacidade para outras modalidades ou para ser praticada ou realizada de várias maneiras. A fraseologia e a terminologia utilizadas na presente invenção são para fins de descrição e não devem ser consideradas como limitadoras.
[00138] Como mencionado acima, as soluções de trombina conhecidas variam consideravelmente no número e nos tipos de excipientes presentes, e nas concentrações dos excipientes individuais.
EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS SOLUÇÃO DE ESTOQUE DE TROMBINA:
[00139] A solução de estoque de trombina usada para preparar as soluções de trombina aquosa descritas nos Exemplos abaixo compreenderam cerca de 3.500 UI/ml de trombina, cerca de 200 mM de NaCl, com estabilizadores de 2% de manitol e 0,2% de albumina sérica humana (HSA) (a menos que seja indicado de outro modo). A solução de estoque foi preparada a partir do Fator II (pró-trombina) de plasma humano que foi ativado e purificado pelo uso sequencial de resina de troca dietilaminoetil celulose ânion (DEAE) e resina trocadora de cátion SP, essencialmente como descrito na Patente US 5143838, por meio desta incorporada por referência.
LIOFILIZAÇÃO: A. LIOFILIZAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE TROMBINA DE ALTURA 8 MM DENTRO DO VASO DE LIOFILIZAÇÃO:
[00140] A liofilização foi executada em uma prateleira liofilizante de um congelador secante Christ Epsilion 2-8D (Christ, Alemanha) em frascos de vidro siliconizado de 8 ml. Cada frasco foi enchido com 2 ml de solução de trombina aquosa. A altura da solução em cada frasco foi de aproximadamente 8 mm.
[00141] Dois ciclos curtos de liofilização diferentes foram executados como especificado na Tabela 1 (tempo total de 34 horas) e na Tabela 2 (tempo total de 30 horas) abaixo. As temperaturas dadas são aquelas da prateleira liofilizante.
[00142] Após a liofilização, foi obtida uma composição de trombina sólida com volume similar ao volume da solução aquosa antes da liofi- lização. TABELA 1
Figure img0001
[00143] Como usado aqui, o termo "molho" com relação a um processo de secagem ou congelamento refere-se a manter a composição que está sendo liofilizada em temperatura e pressão constantes por um período de tempo especificado para efetivar o congelamento ou a secagem, respectivamente.
[00144] Como usado aqui, o termo "rampa" com relação a um processo de congelamento ou secagem refere-se a uma etapa em que a temperatura e a pressão da composição que está sendo liofilizada são gradualmente alteradas por um período de tempo especificado para ajustar a composição para uma temperatura de secagem ou congelamento e pressão especificadas, respectivamente. TABELA 2
Figure img0002
B. A LIOFILIZAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE TROMBIN A DE ALTURA DE 17 MM DENTRO DO VASO DE LIOFILIZAÇÃO:
[00145] A Liofilização foi executada em uma prateleira liofilizante de um congelador secante Christ Epsilion 2-8D (Christ, Alemanha) em copos LYOGUARD® (GORE®). Cada frasco foi enchido com 52 ml de solução de trombina aquosa. A altura da solução em cada frasco foi de aproximadamente 17 mm.
[00146] Ciclos curtos de liofilização foram executados como especificado na Tabela 3 (tempo total de 68 horas). As temperaturas dadas são aquelas da prateleira liofilizante.
[00147] Após a liofilização, uma composição de trombina sólida com volume similar ao volume da solução aquosa antes da liofilização foi obtida. TABELA 3
Figure img0003
A QUANTIFICAÇÃO DO TEOR DE ÁGUA NA COMPOSIÇÃO DE TROMBINA LIOFILIZADA:
[00148] A determinação do teor de água foi executada com o uso do Método volumétrico Karl Fischer Titration (KFT), que é baseado no ensaio da Farmacopeia dos EUA (USP 27, <921>, páginas 2.398 a 2.399). Antes da titulação, a água foi extraída da composição liofilizada com a adição de metanol seco no frasco contendo a composição e a agitação do frasco. Uma amostra da sobrenadante foi removida da titulação.
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE TROMBINA:
[00149] A atividade de trombina de soluções de trombina aquosa foi determinada usando um ensaio de Tempo de Coagulação medindo a atividade de coagulação da trombina nas diferentes soluções de acordo com o procedimento do Ensaio de Farmacopeia Europeu modificado (0903/1997). Brevemente, as soluções padrão de trombina (4, 6, 8 e 10 UI/ml) ou as soluções de teste foram incubadas por 2 minutos a 37°C. Então, 40 μl de cada solução de teste ou solução padrão foi misturada com 160 μl de solução de fibrinogênio (0,1%; de pesquisa de enzima; cat. n° FIB1 2800L) e o tempo de coagulação foi medido. Uma curva de calibração de tempos de coagulação logarítmica em função da concentração de trombina logarítmica foi diagramada usando os padrões. A atividade de trombina nas diferentes soluções de teste foi determinada pelo tempo de coagulação obtido (calculado automaticamente por uma máquina de coagulação (Diagnostica Stago STart Coagulation Analyzer) interpolada pela curva de calibração e multiplicada pelo fator de diluição).
RECUPERAÇÃO DA ATIVIDADE DE TROMBINA APÓS A RECONS-TITUIÇÃO (% DA ATIVIDADE INICIAL):
[00150] A atividade de trombina foi medida como descrito acima nas soluções de teste antes da liofilização, e na composição de trom- bina sólida obtida por liofilização, após a reconstituição ao volume original com água purificada. A atividade recuperada foi calculada dividindo a atividade obtida na composição de trombina sólida após a reconstituição por meio da atividade obtida na solução de trombina antes da liofilização e multiplicando por 100.
AVALIAÇÃO QUALITATIVA E QUANTITATIVA DE COMPOSIÇÕES DE TROMBINA SÓLIDA OBTIDAS POR UM PROCESSO CURTO DE LIOFILIZAÇÃO:
[00151] Composições de trombina sólida obtidas por meio de submeter diferentes soluções de trombina aquosa a um ciclo curto de liofi- lização foram avaliadas pelos seguintes parâmetros: teor de água das composições sólidas, recuperação de atividade de trombina após a re-constituição das composições sólidas e aparência estrutural da torta (por meio de inspeção visual). Tipicamente, uma torta que tem uma "boa aparência estrutural" é definida como uma torta que tem volume similar àquele da solução de trombina aquosa antes da liofilização, é um bloco monolítico, tem porosidade uniforme durante a composição sólida e não tem áreas molhadas aparentes.
[00152] Para determinar o efeito de um processo curto de liofiliza- ção em diferentes formulações de trombina, várias soluções de trom- bina aquosa que compreendem diferentes ingredientes, por exemplo, diferentes sacarídeos, sais e excipientes em diferentes concentrações, foram preparadas a partir da solução de estoque de trombina descrita na seção "MATERIAIS E MÉTODOS", e as soluções foram então liofi- lizadas usando o ciclo curto de liofilização, como detalhado nas Tabelas 1, 2 ou 3.
Exemplo 1: Uso de diferentes sacarídeos e concentrações ou um álcool de açúcar em uma solução de trombina submetida a um ciclo curto de liofilização.
[00153] Foram usados dissacarídeos (sacarose e maltose) e um álcool de açúcar (manitol) em diferentes concentrações na preparação de soluções de trombina aquosa, e foram estudadas composições de trombina sólida obtidas pelo uso de tais soluções de trombina em um ciclo curto de liofilização.
[00154] O manitol foi testado em concentrações de 1,6%, 2,1%, 2,6% e 4,6% (peso por volume) por adição de manitol à solução de estoque diluída como descrito abaixo; e foram testadas sacarose e maltose em uma concentração de 2% (peso por volume). [Para preparar as soluções de teste de trombina, a solução de estoque de trombina descrita acima foi diluída em 1:3,5 com uma solução fornecendo as seguintes composições finais: 0,6% de albumina sérica humana, 20 mM de acetato de sódio (0,27%), 130 mM de NaCl (0,76%) e 0,6% de CaCl2 em água com pH 7,0, e o sacarídeo ou álcool de açúcar testado foi adicionado à solução nas concentrações listadas acima. No caso do manitol, a solução foi suplementada na concentração listada (após a diluição do estoque, a solução compreendeu cerca de 0,6% de mani- tol).
[00155] Notavelmente, a albumina sérica humana presente na solução de estoque de trombina também estava presente em todas as soluções de teste como "ingrediente de plano de fundo" em uma concentração de aproximadamente 0,06%. Ainda, a solução de estoque de trombina compreendeu 0,6% de manitol.
[00156] As soluções de trombina aquosa preparadas foram liofiliza- das usando o ciclo curto de liofilização como descrito na Tabela 2 acima, para obter composições de trombina sólida. Foram medidos o teor de água de cada composição sólida e a recuperação de atividade de trombina após a reconstituição da composição liofilizada. Os resultados são apresentados na tabela 4 abaixo. TABELA 4
Figure img0004
[00157] Os resultad os mostraram que cada um dos sacarídeos e álcoois de açúcar testados, quando presentes na solução de trombina aquosa em uma concentração de 2,6% ou menos, resultaram em composições de trombina sólida com baixo teor de água (0,4-0,6%) após um ciclo curto de liofilização e alta recuperação de atividade de trombina (95-100%) após a reconstituição da composição sólida.
[00158] Os resultados também mostraram que as soluções de trombina aquosa resultaram em tortas que mantiveram sua estrutura sem colapso e que tiveram uma boa aparência estrutural como definido acima.
[00159] Em contraste, uma solução de trombina aquosa que compreende 4,6% de manitol, quando submetida a um ciclo curto de liofili- zação, resultou em uma torta reduzida com maior teor de água em 1,7%.
[00160] Esses resultados mostram que uma solução de trombina aquosa para uso em um ciclo curto de liofilização vantajosamente compreende cerca de 1,6% até menos que cerca de 4,6% de sacarí- deos ou álcoois de açúcar para obter uma composição de trombina sólida e estável (estrutural e funcionalmente).
Exemplo 2: Uso de diferentes concentrações de Albumina Sérica Humana em uma solução de trombina submetida a um ciclo curto de liofilização.
[00161] Foram usadas diferentes concentrações de HSA na preparação de soluções de trombina aquosa, e foram estudadas composições de trombina sólida obtidas por meio do uso dessas soluções de trombina em um ciclo curto de liofilização.
[00162] HSA foi testada nas seguintes concentrações: 0,2%, 0,6%, 3% e 10%.
[00163] As soluções foram preparadas a partir da solução de estoque de trombina por meio de diluição em 1:3.5 com uma solução, fornecendo a seguinte composição final: 2,6% de manitol, 20 mM de acetato de sódio (0,27%), 130 mM de NaCl (0,76%) e 0,6% de CaCl2 em água com pH 7,0.
[00164] Notavelmente, a albumina sérica humana esteva presente em todas as soluções de teste em uma concentração de aproximadamente 0,06%, (somada às concentrações de HSA adicionadas listadas acima).
[00165] As soluções de trombina aquosa preparadas foram liofiliza- das usando o ciclo curto de liofilização descrito na Tabela 2 acima, sendo que a solução tinha uma altura de cerca de 8 mm no vaso de liofilização, para obter composições de trombina sólida. Foram medidos o teor de água de cada composição sólida e a recuperação da atividade de trombina após a reconstituição da composição sólida. Os resultados são apresentados na tabela 5 abaixo. TABELA 5
Figure img0005
[00166] Os resultados mostraram que alterar a concentração de HSA teve um efeito significativo no teor de água na composição de trombina sólida e na recuperação de atividade de trombina após a reconstituição da composição sólida.
[00167] Mais especificamente, foi mostrado que uma solução de trombina contendo 0,6% de HSA resultou em uma composição sólida que tem tanto teor de água relativamente baixo como alta recuperação da atividade de trombina sob reconstituição. Em contraste, as soluções de trombina sólida com concentrações menores de HSA resultaram em composições sólidas com teor de água aumentado, enquanto soluções com concentrações maiores de HSA resultaram em menor recuperação de atividade de trombina sob reconstituição.
[00168] Portanto, é mostrado que as soluções de trombina ideais vantajosamente compreendem HSA em uma concentração de mais que cerca de 0,2% até menos que cerca de 3%.
Exemplo 3: Uso de diferentes sais e concentrações em uma solução de trombina submetida a um ciclo curto de liofilização A. EFEITO DE CONCENTRAÇÃO DE CLORETO DE SÓDIO (NACL):
[00169] Foram usadas diferentes concentrações de NaCl (90 mM, 120 mM e 150 mM, ou seja, 0,5% peso por volume, 0,7 peso por volume, e 0,9 peso por volume, respectivamente) na preparação de soluções aquosas desprovidas de trombina, e foram estudadas composições sólidas obtidas por meio do uso dessas soluções em um ciclo curto de liofilização, em que a altura das soluções em um vaso de liofi- lização era de cerca de 8 mm.
[00170] As soluções continham, somado às diferentes concentrações de NaCl, 2% de manitol, 0,6% de HSA, 20 mM de acetato de sódio (0,27%), e 0,6% de CaCl2 com pH 7,0.
[00171] As soluções foram liofilizadas usando um ciclo curto similar àquele descrito na Tabela 2 acima, sendo que a altura da solução no vaso de liofilização era de cerca de 8 mm, sendo que o molho de secagem primária foi de uma hora a mais que o descrito na Tabela 2.
[00172] Após a liofilização, foi testado o teor de água na composição sólida. Os resultados são apresentados na Tabela 6 abaixo. TABELA 6
Figure img0006
[00173] Como mostrado na Ta bela, o teor de água foi inversamente proporcional à concentração de NaCl em até 150 mM.
[00174] Em experimentos adicionais similares usando soluções de trombina e soluções desprovidas de trombina (dados não mostrados), não foi encontrada nenhuma diminuição no teor de água quando a concentração de NaCl foi aumentada para além de 150 mM.
[00175] As concentrações de NaCl de 300 mM (1,75% peso por volume) e acima tiveram um efeito inibitório na atividade de trombina, como medido por meio de ensaio de tempo de coagulação (dados não mostrados).
[00176] Com relação à aparência estrutural da composição sólida, uma torta preparada a partir de uma solução que compreende 90 mM de NaCl tinha uma aparência pobre, sendo reduzida em comparação com o volume da solução a partir da qual foi preparada e tendo consistência granular, com porosidade não uniforme durante a composição sólida.
[00177] Portanto, foi concluído que soluções de trombina ideais vantajosamente compreendem NaCl em uma concentração de ao menos 120 mM (0,7% peso por volume) até menos que 300 mM (1,75% peso por volume).
B. EFEITO DE SUBSTITUTO PARCIAL DE NACL POR CLORETO DE POTÁSSIO (KCL)
[00178] Foi avaliado o uso potencial de KCl no lugar de NaCl na solução de trombina. Já que o NaCl está presente na solução de estoque de trombina usada para preparar as soluções de teste, não pode ser completamente removido, dessa forma a solução foi suplementada com 65 mM de KCl (ajustando a solução para uma concentração final de sal de cerca de 125 mM). Ainda, foi testada uma solução de trom- bina adicional, compreendendo a solução de estoque suplementada com NaCl, ajustando a solução para uma concentração final de sal de 130 mM).
[00179] Soluções suplementadas com NaCl ou com KCl foram preparadas diluindo a solução de estoque em 1:3.5, para fornecer uma concentração de NaCl de 60 mM. Uma primeira solução foi então su-plementada para uma concentração de NaCl de 130 mM; e uma segunda solução foi suplementada com 65 mM KCl.
[00180] A solução de estoque foi diluída para fornecer a seguinte composição final: 2,6% de manitol, 20 mM de acetato de sódio (0,27%) e 0,6% de CaCl2 em água com pH 7,0.
[00181] As soluções preparadas foram liofilizadas usando o ciclo curto de liofilização descrito na Tabela 2 acima, sendo que a solução tem uma altura de cerca de 8 mm no vaso de liofilização, e foram medidos o teor de água nas composições sólidas e a recuperação de atividade de trombina após a reconstituição da composição sólida. Os resultados são apresentados na tabela 7 abaixo. TABELA 7
Figure img0007
[00182] Descobriu-se que a substituição parcial de NaCl por KCl na solução tinha efeito prejudicial no teor de água na composição de trombina sólida obtida após um ciclo curto de liofilização (5,2% de teor de água de composição sólida após a liofilização de uma solução contendo NaCl mais KCl, em comparação com 0,6% após a liofilização de uma solução contendo NaCl sem KCl). Foi obtida uma recuperação de atividade de trombina similar após a reconstituição de uma composição sólida obtida a partir da liofilização de uma solução que compreende 130 mM de NaCl e uma solução que compreende 65 mM de KCl e 60 mM de NaCl, como mostrado na Tabela 7.
[00183] A inspeção visual da aparência estrutural da composição sólida revelou que a substituição de NaCl por KCl resultou em uma torta reduzida.
[00184] Foi concluído, portanto, que para obter vantajosamente uma composição sólida com teor de água relativamente baixo, é preferível que o KCl esteja ausente da solução de trombina.
[00185] Conclui-se adicionalmente que uma solução de trombina aquosa ideal que gera uma composição sólida com baixo teor de água e alta recuperação de atividade de trombina após a liofilização usando um ciclo curto compreende cerca de 1,6% até menos que cerca de 4,6% de sacarídeo ou álcool de açúcar, ao menos cerca de 120 mM (0,7% peso por volume) até menos que cerca de 300 mM (1,75% peso por volume) de cloreto de sódio, e mais que cerca de 0,2% até menos que cerca de 3% de albumina, somado acerca de 0,3 até cerca de 1,2% de cloreto de cálcio; e cerca de 0,14 até cerca de 0,7% de acetato de sódio.
Exemplo 4: Uso das soluções aqui descritas e das soluções similares a soluções de técnica anterior em um ciclo curto de liofiliza- ção com altura da solução de 8 mm no vaso de liofilização.
[00186] Três soluções foram preparadas: uma solução como descrito aqui e duas soluções similares a soluções de técnica anterior, como segue: 1. Uma solução de trombina como aqui descrito, que compreende 2% de manitol, 0,6% de albumina sérica humana, 20 mM de acetato de sódio (0,27%), 130 mM de cloreto de sódio (0,76%) e 40 mM de CaCl2 (0,6%) em água destilada com pH 7,0. 2. Uma solução de trombina similar àquela revelada no documento EP 1766003B1 (Jiang et al.), que compreende 3% de sacarose, 4% de manitol, 150 mM de NaCl (0,9%), 0,1% de poli(glicol etilêni- co) 3350 (PEG3350), 4 mM de CaCl2 (0,04%); e 5 mM (0,08%) de his- tidina em água destilada com pH 6.0. 3. Uma solução de trombina similar àquela revelada no documento EP 813598B1 (MacGregor et al.), que compreende 40 mM (0,78%) de ácido glicônico, 20 mM (0,5%) de citrato trissódico e 150 mM de NaCl (0,9%) em água destilada com pH 6,5.
[00187] Os componentes das soluções são apresentados a seguir na Tabela 8. TABELA 8
Figure img0008
[00188] As três soluções de trombina foram preparadas diluindo a solução de estoque de trombina descrita acima em 1:3.5 com uma solução que compreende os ingredientes listados em cada solução 1-3. Manitol e albumina sérica humana estavam presentes nas três soluções de teste em uma concentração de aproximadamente 0,6% e 0,06%, respectivamente, como ingredientes de plano de fundo.
[00189] As soluções foram liofilizadas usando os ciclos curtos de liofilização descritos na Tabela 1 ou na Tabela 2 acima (em que a solução era de cerca de 8 mm no vaso de liofilização). Foram medidos o teor de água da composição de trombina sólida e a recuperação de atividade de trombina após a reconstituição da composição de trombi- na sólida, como descrito acima.
[00190] A Figura 1 mostra a aparência visual de uma composição de trombina sólida obtida após uma curta liofilização da solução de trombina aquosa aqui descrita (solução 1; n°1 na Figura 1); e uma composição de trombina sólida obtida após uma curta liofilização de uma solução de acordo com o documento EP 1766003B1 (solução 2; n°2 na Figura 1). A composição sólida mostrada na Figura 1 foi obtida usando o ciclo como descrito na Tabela 1. Resultados similares foram obtidos quando o ciclo, como descrito na Tabela 2, foi usado.
[00191] A inspeção visual da aparência das composições de trom- bina sólida revelou que as composições sólidas obtidas após a liofili- zação da solução de trombina de acordo com a invenção e da solução 3 tinham "boa aparência estrutural" de acordo com a definição discutida acima. Entretanto, a torta obtida após o uso da solução de trombina de acordo com o documento EP 1766003B1 (solução 2) no ciclo curto de liofilização tinha uma estrutura granulada.
[00192] O teor de água nas três composições de trombina sólida e a recuperação de atividade de trombina das composições sólidas são apresentadas na Tabela 9 abaixo. TABELA 9
Figure img0009
[00193] Como mostrado na Tabela 9, descobriu-se que seguir o ciclo curto de liofilização (como descrito nas Tabelas 1 ou 2), o teor de água médio mais baixo foi encontrado na composição sólida liofilizada preparada usando a solução aqui descrita (0,7±0,14 %).
[00194] Como mostrado a seguir na Tabela 9, descobriu-se que a seguinte reconstituição das composições sólidas liofilizadas de ciclo curto, a maior recuperação de atividade de trombina foi obtida nas composições sólidas preparadas usando a solução aqui descrita (99±1,4 %), de acordo com as Tabelas 1 ou 2.
Exemplo 5: Uso das soluções aqui descritas em um ciclo curto de liofilização com altura da solução de 17 mm no vaso de liofiliza- ção.
[00195] Uma primeira solução de trombina como aqui descrita, que compreende 2% de manitol, 0,6% de albumina sérica humana, 20 mM de acetato de sódio (0,27%), 130 mM de cloreto de sódio (0,76%) e 40 mM de CaCl2 (0,6%) em água destilada com pH 7,0; e uma segunda solução, similar à primeira, mas que compreende uma concentração de cloreto de sódio de menos que 120 mM (0,7%), cloreto de sódio (menos que 0,76%) foram liofilizadas. A primeira solução foi liofilizada usando os ciclos curtos de liofilização descritos na Tabela 3 acima; e a segunda solução (com a menor concentração de cloreto de sódio) foi liofilizada em um ciclo de liofilização com uma duração de 108 horas (sendo que a altura de cada solução era de cerca de 17 mm no vaso de liofilização).
[00196] Foram medidos o teor de água tanto de composições de trombina sólida como de recuperação de atividade de trombina após a reconstiuição das duas composições de trombina sólida, como descrito acima.
[00197] Nas duas composições sólidas, o teor de água foi de 1,5%, e a recuperação de atividade de trombina foi de 100%.
[00198] Os resultados mostram que a solução de trombina, de acordo com a invenção, possibilitou que a duração do ciclo de liofiliza- ção fosse encurtada em cerca de 37%. Em conclusão, a solução de trombina aqui descrita vantajosamente possibilita o uso de um ciclo curto de liofilização que gera uma composição sólida que tem baixo teor de água e alta recuperação de atividade de trombina em comparação com soluções de trombina conhecidas.
[00199] É apreciado que certos recursos da invenção, que são, para fins de clareza, descritos no contexto de modalidades separadas, podem também ser fornecidos em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da invenção, que são, por razões de concisão, descritas no contexto de uma única modalidade, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer sub- combinação adequada ou conforme adequado, em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Certos recursos descritos no contexto de várias modalidades não devem ser considerados recursos essenciais daquelas modalidades, a menos que a modalidade não seja funcional sem aqueles elementos.
[00200] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com modalidades específicas da mesma, fica claro que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes aos versados na técnica. Consequentemente, prevê-se que o conceito abranja todas as alternativas, modificações e variações contidas no escopo das reivindicações em anexo.
[00201] A citação ou identificação de qualquer referência nesse pedido não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anterior à invenção.

Claims (19)

1. Método para liofilização de uma solução de trombina aquosa, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a solução de trombina aquosa que compreende de 1 a 4,6% (peso por volume) de um sacarídeo ou álcool de açúcar; 0,7 a 1,75% (peso por volume) de cloreto de sódio; de 0,2 a de 3% (peso por volume) de albumina; cloreto de cálcio; e acetato de sódio; e liofilizar a solução de trombina aquosa; em que a altura da solução de trombina aquosa em um vaso de liofilização não é maior que 10 mm, em que o tempo total de lio- filização não é maior que 35 horas, e em que a solução de trombina aquosa é desprovida de polietilenoglicol.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de trombina aquosa compreende de 200 a 2000 UI/ml de trombina; de 0,3 a 1,5% (peso por volume) de cloreto de cálcio; e de 0,14 a 1% (peso por volume) de acetato de sódio.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a solução de trombina aquosa compreende; de 1,6 a 4,6% (peso por volume) de sacarídeo ou álcool de açúcar; de 0,7 a 1,7% (peso por volume) de cloreto de sódio; de 0,2 a 3% de albumina (peso por volume); de 0,3 a 1,2% (peso por volume) de cloreto de cálcio; e de 0,14 a 0,7% (peso por volume) de acetato de sódio.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo ou álcool de açúcar está presente em uma concentração de 2% (peso por volume); a albumina está presente em uma concentração de 0,6% (peso por volume); o cloreto de sódio está presente em uma concentração de 0,76% (peso por volume); o cloreto de cálcio está presente em uma concentração de 0,6% (peso por volume), e o acetato de sódio está presente em uma concentração de 0,27% (peso por volume).
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a solução de trombina aquosa consiste em trombina; sacarídeo ou álcool de açúcar; cloreto de sódio; albumina; cloreto de cálcio; e acetato de sódio.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o sacarídeo compreende um mono e/ou um dissacarídeo, opcionalmente em que o dissacarídeo é sacarose ou maltose; ou em que o dito álcool de açúcar compreende um álcool de açúcar derivado de um monossacarídeo, opcionalmente em que o álcool de açúcar derivado de um monossacarídeo é manitol e está opcionalmente presente em uma concentração de 2% (peso por volume).
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a solução de trombina aquosa compreende um único sacarídeo ou álcool de açúcar.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a solução de trombina aquosa é desprovida de histidina.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente, antes da liofilização, ajustar o pH da solução de trombina aquosa para um pH na faixa de 5,5 a 9.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a liofilização é executada em uma prateleira liofilizante e compreende: (i) . submeter a solução de trombina aquosa a um procedimento de congelamento para produzir uma solução de trombina congelada; (ii) . submeter a solução de trombina congelada da etapa (i) a um procedimento de secagem primária; e (iii) . submeter o produto da etapa (ii) a um procedimento de secagem secundária; em que o procedimento de congelamento opcionalmente compreende manter a prateleira liofilizante a uma temperatura de con-gelamento de -45°C a -55°C, opcionalmente de -50°C; e em que o procedimento de congelamento é opcionalmente executado a uma pressão de 0,1 megapascal (1 atmosfera).
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a prateleira liofilizante é mantida na temperatura de congelamento por até 5 horas e/ou em que a temperatura da prateleira liofilizante é ajustada na temperatura de congelamento por um período de até 2,5 horas.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o procedimento de secagem primária compreende manter a prateleira liofilizante a uma temperatura de secagem primária de -12°C a -18°C, opcionalmente de -15°C, a uma pressão de 10 Pa a 16 Pa (de 100 μBar a 160 μBar).
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a temperatura e a pressão de secagem primária são mantidas por até 13 horas, opcionalmente por 11 a 13 horas.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que o procedimento de secagem secundária compreende manter a prateleira liofilizante a uma temperatura de secagem secundária de 20°C a 30°C, opcionalmente de 25°C, e a uma pressão inferior a 5 Pa (50 μBar), opcionalmente é inferior a 2 Pa (20 μBar).
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a temperatura e a pressão de secagem secundária são mantidas por até 11 horas, opcionalmente por 9,5 a 11 horas.
16. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que a liofilização em uma prateleira de liofilização compreende: (a) ajustar a temperatura da prateleira liofilizante para uma temperatura de congelamento de -50°C, por um período de tempo na faixa de 1,5 a 2,5 horas; (b) manter a temperatura de congelamento da etapa (a) por um período de tempo na faixa de 4 a 6 horas para produzir uma solução de trombina congelada; (c) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa (b) para uma temperatura de secagem primária de de -15°C, e ajustar a pressão de 10 a 16 Pa (de 100 a 160 μBar) por um período de tempo na faixa de 50 a 90 minutos; (d) manter a temperatura e a pressão da etapa (c) por um período de tempo na faixa de 11 a 13 horas; (e) aumentar a temperatura da prateleira liofilizante da etapa (d) para uma temperatura de secagem secundária de 25°C e diminuir a pressão para inferior a 5 Pa (50 μBar) por um período de tempo na faixa de 60 a 90 minutos; e (f) manter a temperatura e a pressão da etapa (e) na tem-peratura e na pressão da secagem secundária por um período de tempo na faixa de 9,5 a 11 horas; em que as etapas (a) e (b) são opcionalmente executadas à pressão atmosférica.
17. Solução de trombina aquosa, caracterizada pelo fato de que compreende: de 1 a 4,6 % (peso por volume) de sacarídeo ou álcool de açúcar; de 0,7 a 1,75% (peso por volume) de cloreto de sódio; de 0,2 a 3% (peso por volume) de albumina; de 200 a 2000 UI/ml de trombina; de 0,3 a 1,5% (peso por volume) de cloreto de cálcio; e de 0,14 a 1% (peso por volume) de acetato de sódio; em que a solução de trombina aquosa é desprovida de po- lietilenoglicol.
18. Solução de trombina aquosa, de acordo com a reivindi-cação 17, caracterizada pelo fato de que a solução de trombina aquosa é como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 8.
19. Solução de trombina aquosa, de acordo com a reivindi-cação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que tem pH na faixa de de 5,5 a 9.
BR112015013071-2A 2012-12-03 2013-11-28 Solução de trombina aquosa, e seu método para liofilização BR112015013071B1 (pt)

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