JP6357467B2 - 標的化された／免疫調節性融合タンパク質およびそれを作製するための方法 - Google Patents

Description

[001] 関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年４月３０日に出願されたインド特許出願第１６８９／ＣＨＥ／２０１２号および２０１２年４月３０日に出願されたインド特許出願第１６９０／ＣＨＥ／２０１２号の優先権を主張し、その両方の特許出願の内容は、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられている。

[002] 技術分野
[003] 本発明は、一般的に、癌治療に用いられる融合タンパク質を作製する分野、より具体的には、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関し、その融合またはキメラポリペプチドは、少なくとも１つの標的化部分、および癌細胞の免疫寛容に対抗する少なくとも１つの免疫調節性部分を含む。

[004] 関連技術
[005] 免疫系は、ヒト身体に、異物として、または潜在的に有害であるとして認識された微生物および物質を認識し、かつそれらから防御する手段を提供する。モノクローナル抗体での癌の受動免疫治療、および腫瘍細胞を攻撃するＴ細胞の受動伝達は、臨床効果を示しているが、これらの免疫エフェクターを誘導し、かつ腫瘍細胞に対する免疫記憶を確立する積極的な治療ワクチン接種の目標は、まだ達成されないままである。いくつかの腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原が同定されているが、まだこれらの抗原は一般的に免疫原性が弱く、腫瘍は、免疫性攻撃を逃れることを可能にする免疫寛容誘発性環境を生み出す多様な機構を用いる。そのような免疫寛容を克服するストラテジー、ならびに頑強なレベルの抗体および／またはＴ細胞応答を活性化することが、効果的な癌免疫治療の鍵を握っている。より重要なことには、個々のタンパク質、および活性三次構造を有する活性キメラポリペプチドを作製する方法が探索される必要がある。

[006] 本発明は、癌細胞において発現するポリヌクレオチド、およびそれらによりコードされるポリペプチドを提供する。これらのポリヌクレオチドおよび発現したポリペプチドは、癌の処置のための様々な治療方法において有用である。本発明はさらに、癌細胞の免疫寛容に対抗することにより癌細胞の成長を低下させる方法であって、Ｔ細胞が活性状態を維持し、かつ腫瘍に対する免疫系の応答を抑制することが知られている制御性Ｔ細胞の動員をＴ細胞が阻害する、方法を提供する。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列によって生じたキメラポリペプチドは、発現した融合またはキメラポリペプチドのおかげで癌を処置するのに有用である。

[007] 一態様において、本発明は、癌細胞を標的とするための少なくとも１つの標的化部分、および癌細胞の免疫寛容に対抗する少なくとも１つの免疫調節性部分を含有するキメラポリペプチドであって、その標的化部分と免疫調節性部分が、両方の部分がそれらの個々の標的に首尾よく結合することができるように、アミノ酸残基の十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されている、キメラポリペプチドを提供する。代替の態様においては、標的化部分と癌細胞の免疫寛容に対抗する免疫調節性部分は、お互いに直接、結合していてもよい。本発明のキメラ／融合ポリペプチドは、癌細胞受容体に結合し、かつ癌細胞の免疫応答を回避する能力を低下させるのに有用である。

[008] 本発明は、癌細胞の免疫寛容に対抗し、またはそれを逆転させる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現によってキメラ／融合タンパク質を調製することに基づいている。癌細胞は、化学療法剤または腫瘍を標的とする抗体による排除を、腫瘍微小環境における特異的な免疫抑制機構を介して逃れることができ、そのような癌細胞の能力は、免疫寛容として認識されている。そのような免疫抑制機構は、免疫抑制性サイトカイン（例えば、トランスフォーミング成長因子β（TGF-β））および制御性Ｔ細胞および／または免疫抑制性骨髄系樹状細胞（DC）を含む。腫瘍誘発性免疫寛容に対抗することにより、本発明は、任意に別の既存の癌処置と併用した、癌処置のための効果的な組成物および方法を提供する。本発明は、腫瘍誘発性免疫寛容に対抗し、かつ抵抗性または播種性癌細胞に対するＴ細胞媒介性適応抗腫瘍を活性化し、かつ活用することにより、化学療法の抗腫瘍効力を増強するストラテジーを提供する。

[009] 別の態様において、本発明は、少なくとも１つの免疫調節性部分と融合した少なくとも１つの標的化部分を含む分子を提供する。標的化部分は、標的分子に特異的に結合し、免疫調節性部分は、以下の分子の１つに特異的に結合する：（ｉ）トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）；（ｉｉ）プログラム死−１リガンド１（PD-L1）またはプログラム死−１リガンド２（PD-L2）；（ｉｉｉ）核因子−ＫＢ活性化受容体（RANK）リガンド（RANKL）；（ｉｖ）トランスフォーミング成長因子−β受容体（TGF-pR）；（ｖ）プログラム死−１（PD-1）；（ｖｉ）４−１ＢＢ受容体、または（ｖｉｉ）核因子−κＢ活性化受容体（RANK）。

[0010] さらなる態様において、標的化部分には、腫瘍細胞、腫瘍抗原、腫瘍脈管構造、腫瘍微小環境、または腫瘍浸潤性免疫細胞の成分に特異的に結合する、抗体、抗体の軽鎖もしくは重鎖、ｓｃＦｖ、またはＦｃ含有ポリペプチドを含む抗体断片が挙げられる。好ましくは、標的化部分は、腫瘍細胞上の成分への結合親和性を有する抗体またはその断片である。注目すべきことには、重鎖および軽鎖のそれぞれは個々に、離れた、別々の免疫調節性部分に連結していてもよい。さらに、抗体標的化部分の重鎖または軽鎖は、免疫調節性部分に連結していてもよく、順に第２の免疫調節性部分にさらに連結することができ、その２つの免疫調節性部分の間にリンカーがある。

[0011] なおさらなる態様において、腫瘍標的化部分、およびトランスフォーミング成長因子β（TGF-β）に結合する分子を含む免疫調節性部分を含むキメラポリペプチドであって、その腫瘍標的化部分が、ＥＧＦＲ１に結合する抗体であり、その抗体が完全抗体、重鎖、または軽鎖であり得る、キメラポリペプチドが提供される。腫瘍標的化部分として、癌細胞を標的とするモノクローナル抗体が挙げられ、それらには、セツキシマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ、チウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、Ｉ−１３１トシツモマブ、エファリズマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、エタネルセプト、ＩＧＮ１０１（Aphton）、ボロシキシマブ（Biogen IdecおよびPDL BioPharm）、抗ＣＤ８０ｍＡｂ（Biogen Idec）、抗ＣＤ２３ｍＡｂ（Biogen Idel）、ＣＡＴ−３８８８（Cambridge Antibody Technology)、ＣＤＰ−７９１（Imclone）、エプラツズマブ（Immunomedics）、ＭＤＸ−０１０（MedarexおよびBMS）、ＭＤＸ−０６０（Medarex）、ＭＤＸ−０７０（Medarex）、マツズマブ（Merck）、ＣＰ−６７５、２０６（Pfizer）、ＣＡＬ（Roche）、ＳＧＮ−３０（Seattle Genetics）、ザノリムマブ（SeronoおよびGenmab）、アデカツムマブ（Sereno）、オレゴボマブ（United Therapeutics）、ニモツズマブ（YM Bioscience）、ＡＢＴ−８７４（Abbott Laboratories）、デノスマブ（Amgen）、ＡＭ １０８（Amgen）、ＡＭＧ ７１４（Amgen）、フォントリズマブ（Biogen IdecおよびPDL BioPharm）、ダクリズマブ（Biogent IdecおよびPDL BioPharm）、ゴリムマブ（CentocorおよびSchering-Plough）、ＣＮＴＯ １２７５（Centocor）、オクレリズマブ（GenetechおよびRoche）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０（Genmab）、ベリムマブ（HGSおよびGSK）、エプラツズマブ（Immunomedics）、ＭＬＮ１２０２（Millennium Pharmaceuticals）、ビシリズマブ（PDL BioPharm）、トシリズマブ（Roche）、オクレリズマブ（Roche）、セルトリズマブペゴール（UCB、以前はCelltech）、エクリズマブ（Alexion Pharmaceuticals）、パキセリズマブ（Alexion PharmaceuticalsおよびProcter & Gamble）、アブシキシマブ（Centocor）、ラニビズマブ（Genetech）、メポリズマブ（GSK）、ＴＮＸ−３５５（Tanox）、またはＭＹＯ−０２９（Wyeth）が挙げられるが、それらに限定されない。

[0012] 別の態様において、腫瘍標的化部分は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ１に結合するモノクローナル抗体であり、その抗体は、完全抗体、重鎖、または軽鎖であり得る。

[0013] さらに別の態様において、標的化部分は、上皮成長因子受容体（EGFR1、Erb-Bl）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Erb-B2）、ＣＤ２０、Ｔｒｅｇ機能（CD 152）に必須である細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（CTLA-4）；Ｈ−１およびインターロイキン−６（IL-6）に特異的に結合する分子である。

[0014] なおさらなる態様において、標的化部分は、制御性Ｔ細胞（treg）、骨髄系サプレッサー細胞、または樹状細胞の成分に特異的に結合する。別の態様において、標的化部分は、以下の分子の１つに特異的に結合する：（ｉ）ＣＤ４；（ｉｉ）ＣＤ２５（IL-2ct受容体；IL-2aR）；（ｉｉｉ）トランスフォーミング成長因子−β受容体（TGF-pR）；（ｖｉ）トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）；（ｖｉｉ）プログラム死−１（PD-1）；（ｖｉｉｉ）プログラム死−１リガンド（PD-L1またはPD-L2）。

[0015] 別の態様において、免疫調節性部分は、以下の分子の１つに特異的に結合する：（ｉ）トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）；（ｉｉ）プログラム死−１リガンド（PD-L1またはPD-L2）；または４−１ＢＢ受容体。

[0016] さらに別の態様において、免疫調節性部分として、ＴＧＦ−βに結合し、かつその機能を阻害する分子が挙げられる。具体的には、免疫調節性部分には、トランスフォーミング成長因子−β受容体ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＴＧＦ−βＲＩＩｂ、またはΤＧＦ−βＲＩＩＩの細胞外リガンド結合ドメインが挙げられる。別の態様において、免疫調節性部分には、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外リガンド結合ドメイン（ECD）が挙げられる。なおさらに、免疫調節性部分には、４−１ＢＢ受容体に結合して、Ｔ細胞を刺激し、腫瘍を根絶する(eradicate)のを助けるＨ−４−１ＢＢリガンドが挙げられ得る。

[0017] なおさらなる態様において、標的化部分には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ１、ＣＤ２０、または細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する抗体、抗体断片、またはポリペプチドが挙げられ、免疫調節性部分には、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外リガンド結合ドメインが挙げられる。

[0018] さらに別の態様において、免疫調節性部分には、プログラム死−１リガンド１（PD-L1）またはプログラム死−１リガンド２（PD-L2）に特異的に結合して、その活性を阻害する分子が挙げられる。別の態様において、免疫調節性部分には、プログラム死−１（PD-1）の細胞外リガンド結合ドメインまたは外部ドメインが挙げられる。

[0019] さらなる態様において、標的化部分には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲｌ、ＣＤ２０、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２５（ｌＬ−２ａ受容体；ＩＬ−２ａＲ）、またはＣＤ４に特異的に結合する抗体、抗体断片、またはポリペプチドが挙げられ、免疫調節性部分には、プログラム死−１（PD-1）の細胞外リガンド結合ドメインまたは外部ドメインが挙げられる。

[0020] なおさらなる態様において、標的化部分には、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体または抗体断片が挙げられ、免疫調節性部分には、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）由来の配列が挙げられる。

[0021] 一態様において、本発明は、ヒト対象において癌を処置するための、少なくとも１つの標的化部分および少なくとも１つの免疫調節性部分を含む融合ポリペプチドをコードする最適化された遺伝子であって、ヒト対象において発現を増加させるように改変されている、最適化された遺伝子を提供する。好ましくは、最適化された遺伝子は、配列番号１２〜２８から選択される、標的化部分または免疫調節性部分をコードするための配列を含む。

[0022] 別の態様において、本発明は、ヒト対象において癌を処置するための最適化された遺伝子を含むベクターであって、その最適化された遺伝子が、ＣＧ配列を増加させるように改変されている、ベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、配列番号１２〜２８から選択される、少なくとも１つの標的化部分および少なくとも１つの免疫調節性部分をコードするための配列を含む。

[0023] さらに別の態様において、本発明は、対象において癌を処置する方法であって、
ａ．配列番号１２〜２８から選択される、少なくとも１つの標的化部分および少なくとも１つの免疫調節性部分をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換えベクターを提供する工程と、
ｂ．該ヌクレオチド配列が、対象において治療的有効量のコードされた融合タンパク質を産生するレベルで発現するような条件下で、組換えベクターを対象に投与する工程と
を含む、方法を提供する。

[0024] 代替の態様において、本発明は、配列番号１２〜２８から選択される、少なくとも１つの標的化部分および少なくとも１つの免疫調節性部分をコードする最適化された遺伝子のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

[0025] さらに別の態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質ペプチドをコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトした組換え宿主細胞を提供する。

[0026] なおさらなる態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質を調製する方法であって、
ａ．キメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を宿主細胞にトランスフェクトして、形質転換された宿主細胞を産生する工程であって、そのポリヌクレオチド配列が、配列番号１２〜２８から選択される、少なくとも１つの標的化部分および少なくとも１つの免疫調節性部分をコードする、工程と、
ｂ．そのペプチドの発現に十分な生物学的条件下で、形質転換された宿主細胞を維持する工程と
を含む、方法を企図する。

[0027] 別の態様において、本発明は、癌の処置のための薬物の使用における、図１〜１５に示されているようなキメラ融合タンパク質の使用に関する。好ましくは、融合タンパク質は、宿主細胞において発現し、そのような発現したタンパク質は、それを必要としている対象において癌の影響を低下させる治療的量で投与される。

[0028] なおさらなる態様において、本発明は、新生物疾患を防止または処置する方法を提供する。方法は、それを必要としている対象への本発明の１つまたは複数の融合タンパク質の投与を含み、様々な態様において、対象は、本発明の１つまたは複数の分子を、別の抗癌治療と併用して、投与され、一態様において、抗癌治療には、化学療法分子、抗体、小分子キナーゼ阻害剤、ホルモン剤、または細胞傷害性薬物が挙げられる。抗癌治療にはまた、電離放射線、紫外線放射、凍結融解壊死治療、熱剥離、またはラジオ波焼灼療法が挙げられ得る。

[0029] さらに別の態様において、本発明は、治療的に活性な抗体−ペプチド融合タンパク質を調製する方法であって、
ａ．該融合タンパク質のコドン最適化配列を調製する工程と
ｂ．一過性または持続的発現の能力がある宿主細胞において該融合タンパク質の最適化配列をクローニングする工程と、
ｃ．培地中で成長させるのに適切な条件下で宿主細胞を成長させ、その宿主細胞がクローン化タンパク質を発現することを可能にする工程と、
ｄ．発現したタンパク質を精製に供し、任意に、そのタンパク質のその標的への二重特異性(bi-specificity)結合能力を調べる工程と
を含む、方法を提供する。

[0030] 好ましい実施形態において、治療的に活性な抗体−ペプチド融合タンパク質は、癌細胞の免疫寛容に対抗する１つまたは複数の免疫調節性部分に融合した標的化抗体である。一態様において、免疫調節性部分は、その分子の二重特異性結合を可能にするのに十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されていてもよい。免疫調節性部分は、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかのＣ末端に結合していてもよい。

[0031] 上記のような好ましい方法において、免疫調節性部分は、（ｉ）トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）、（ｉｉ）プログラム死−１（PD-1）、（ｉｉｉ）ＣＴＬＡ−４、もしくは（ｉｖ）４−１ＢＢ、またはその部分であり、標的化抗体は、上皮成長因子受容体（EGFR1、Erb-Bl）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Erb-B2）、ＣＤ２０、ＣＤ６、ＣＴＬＡ−４、ムチン１（MUC-1）、インターロイキン−２（IL-2）、またはインターロイキン−６（IL-6）に結合する。

[0032] 本発明の方法は、治療的に活性な抗体−ペプチド融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供し、そのような発現は、一過性細胞株または安定細胞株において行われ得る。一過性発現は、融合タンパク質を有するベクターを哺乳動物宿主細胞へトランスフェクトまたは形質転換することにより、達成される。

[0033] 融合ペプチドが発現したならば、それらは、好ましくは、精製、およびその二重特異性、すなわち、標的部分および免疫調節性部分の両方に結合する能力を有することを調べるためのインビトロ試験に供される。そのような試験には、二機能性(bi-functional)標的結合または免疫細胞刺激を検証するためのＥＬＩＳＡまたはＮＫ／Ｔ細胞結合アッセイなどのインビトロ試験が挙げられ得る。

[0034] 注目すべきことには、特異的融合ペプチドが所望の二重特異性を示したならば、そのような融合ペプチドは、より大きなスケールの発現および精製のための安定細胞株へのサブクローニングのために選択される。そのような安定細胞株は、以前に開示されており、非限定的にＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、またはＮＳＯを含む哺乳動物細胞株などである。

[0035] さらなる態様において、培地は、そのような培地への添加により改善することができる。例えば、培地は、培養中のラクテートの蓄積および／または融合タンパク質の不均一性(heterogeneity)を低下させるために、最初にまたはフェッドバッチ様式で細胞培養物へ添加される二価遷移金属塩を含んでもよい。望ましい遷移金属塩には、亜鉛イオンが挙げられ、金属イオンの添加は、産生の様々な相の中で実行されてもよい。

[0036] 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。

[0037]抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖のアミノ酸配列（配列番号１）、および太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着した抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を含む、ＬＣ定常領域における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー（配列番号３）は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ軽鎖とＴＧＦ−βＲＩＩとの間に位置し、イタリック体で示されている。 [0038]抗ＥＧＦＲ１重鎖のアミノ酸配列（配列番号５）、および太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着した抗ＥＧＦＲ１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）を含む、ＬＣ定常領域における抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー（配列番号３）は、抗ＥＧＦＲ１軽鎖とＴＧＦ−βＲＩＩとの間に位置し、イタリック体で示されている。 [0039]抗ＣＴＬＡ４重鎖のアミノ酸配列（配列番号７）、および太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着した抗ＣＴＬＡ４軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８）を含む、ＬＣ定常領域における抗ＣＴＬＡ４−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー（配列番号３）は、抗ＣＴＬＡ４軽鎖とＴＧＦ−βＲＩＩとの間に位置し、イタリック体で示されている。 [0040]抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ＨＣ−４−１ＢＢおよびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＨＣ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号１）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号９）が手書きテキストフォント(written text font)で示され、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２）が太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着しており、リンカー（配列番号３）が、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ軽鎖とＴＧＦ−βＲＩＩとの間に位置する。 [0041] 抗ＥＧＦＲ１ ＨＣ−４−１ＢＢおよびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＥＧＦＲ１重鎖−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＥＧＦＲ１重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号５）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、軽鎖抗ＥＧＦＲ１のアミノ酸配列（配列番号６）が太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着しており、それらの間にリンカー（配列番号３）を伴う。 [0042] 抗ＣＴＬＡ４ ＨＣ−４−１ＢＢおよびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＣＴＬＡ４重鎖−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＣＴＬＡ４重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号７）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、抗ＣＴＬＡ４軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８）が太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着しており、それらの間にリンカー（配列番号３）を伴う。 [0043] 抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ＨＣ−ＰＤ１およびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号１）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＰＤ１（免疫調節性部分）についての配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２）が太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着しており、それらの間にリンカー（配列番号３）を伴う。 [0044] 抗ＥＧＦＲ１ ＨＣ−ＰＤ１およびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＥＧＦＲ１重鎖−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＥＧＦＲ１重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号５）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＰＤ１（免疫調節性部分）についての配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、抗ＥＧＦＲ１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）が太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着しており、それらの間にリンカー（配列番号３）を伴う。 [0045] 抗ＣＴＬＡ４ ＨＣ−ＰＤ１およびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＣＴＬＡ４重鎖−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＣＴＬＡ４重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号７）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＰＤ１（免疫調節性部分）についての配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、抗ＣＴＬＡ４軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８）が太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着しており、それらの間にリンカー（配列番号３）を伴う。 [0046] 抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号１）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で示され、間にリンカー（配列番号１１）を伴う４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、図は抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。 [0047] 抗ＥＧＦＲ１ ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＥＧＦＲ１重鎖−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＥＧＦＲ１重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号５）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で示され、間にリンカー（配列番号１１）を伴う４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、図は抗ＥＧＦＲ１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）を含む。 [0048] 抗ＣＴＬＡ４ ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＣＴＬＡ４重鎖−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＣＴＬＡ４重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号７）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で示され、間にリンカー（配列番号１１）を伴う４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、図は抗ＣＴＬＡ４軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８）を含む。 [0049] 抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号１）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で示され、間にリンカー（配列番号１１）を伴うＰＤ−１（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、図は抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。 [0050] 抗ＥＧＦＲ１ ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＥＧＦＲ１重鎖−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＥＧＦＲ１重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号５）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で示され、間にリンカー（配列番号１１）を伴うＰＤ−１（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、図は抗ＥＧＦＲ１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）を含む。 [0051] 抗ＣＴＬＡ４ ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗ＣＴＬＡ４重鎖−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗ＣＴＬＡ４重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号７）がイタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で示され、間にリンカー（配列番号１１）を伴うＰＤ−１（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号８）が手書きテキストフォントで示され、図は抗ＣＴＬＡ４軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８）を含む。 [0052]ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化されている、リンカーを伴う抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す図である。 [0053]ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５）、およびリンカーを伴う抗ＥＧＦＲ１重鎖定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す図である。 [0054]ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗ＥＧＦＲ１重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１７）、抗ＥＧＦＲ１軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１８）、抗ＣＴＬＡ４重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１９）、および抗ＣＴＬＡ４軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す図である。 [0055]ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１分子のヌクレオチド配列（配列番号２１）、抗ＣＤ２０重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２２）、および抗ＣＤ２０軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２３）を示す図である。 [0056]ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化されている、４−１ＢＢのヌクレオチド配列（配列番号２４）および抗ＩＬ６Ｒ重鎖のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す図である。 [0057]ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗ＩＬ６Ｒ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２６）、抗４−１ＢＢ重鎖のヌクレオチド配列（配列番号２７）、および抗４−１ＢＢ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す図である。 [0058]プロテインＡ精製された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩおよび抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの１２％ＰＡＧＥにおける分析を示す図である。 [0059]Ａは、プロテインＡ／ＳＥＣクロマトグラフィーにより分析された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ試料を示す図であり、Ｂは、プロテインＡ／ＳＥＣクロマトグラフィーにより分析された抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ試料を示す図である。 [0060]Ａは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩおよび抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ分子がＴＧＦβに結合することを示す図であり、そのことは、その融合タンパク質が機能しうることを示し、Ｂは、抗ＨＥＲ２−ＴＧＦβＲＩＩが、Ｂｍａｂ２００（ハーセプチン）と同様に、ＢＴ４７４細胞株の増殖を阻害することを示す図である。 [0061]抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩが、セツキシマブと同様に、Ａ４３１細胞株の増殖を阻害することを示す図である。 [0062]抗ＨＥＲ２−ＴＧＦβＲＩＩのＢＴ４７４細胞へのＡＤＣＣ活性がＢｍａｂ２００（ハーセプチン）のそれと類似していることを示す図である。 [0063]抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩのＡ４３１細胞へのＡＤＣＣ活性を示す図であり、そのＡＤＣＣ活性がセツキシマブのそれと類似している。 [0064]抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩおよびセツキシマブと比較した、抗ＥＧＦＲ１−４−１ＢＢのＡＤＣＣ活性を示す図である。 [0065]Ａは、抗ＣＴＬＡ４−ＴＧＦβＲＩＩのＴＧＦβ１への結合活性が抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと同程度であることを示す図であり、Ｂは、抗ＣＴＬＡ４−ＴＧＦβＲＩＩのＣＴＬＡ４への結合活性を示す図である。 [0066]Ａは、ＰＤ１−Ｆｃ結合のレベルを決定するための抗ＣＴＬＡ４−ＴＧＦβＲＩＩの結合活性を示す図であり、Ｂは、４−１ＢＢＬの結合を決定するための抗ＥＧＦＲ１−４−１ＢＢの結合活性を示す図である。 [0067]Ａは、抗ＥＧＦＲ１−４−１ＢＢのＥＧＦＲへの結合活性を示す図であり、Ｂは、ＰＤＬ１−Ｆｃを見出すためのＰＤ１−Ｆｃ−４−１ＢＢの結合活性を示す図である。 [0068]抗ＥＧＦＲ１−ＰＤ１のＥＧＦＲおよびＰＤ１への結合活性を示す図である。 [0069]発現したタンパク質およびその還元アルキル化の写真である。 [0070]Ａは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合体の軽鎖（LC）（還元型）のマススペクトル／マススペクトルを示す図であり、Ｂは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合体のＬＣ（還元型）のデコンボリューション化マススペクトルを示す図である。 [0071]抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合体の重鎖（HC）（還元型）のマススペクトルを示す図である。 [0072]Ａは、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのＬＣ（還元型）のマススペクトルを示す図であり、Ｂは、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのＬＣ（還元型）のデコンボリューション化マススペクトルを示す図である。 [0073]抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのＨＣ（還元型）のマススペクトルを示す図である。 [0074]Ａは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質のトリプシンペプチドのＵＶクロマトグラムを示す図であり、Ｂは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質のトリプシンペプチドの総イオンクロマトグラム（TIC）を示す図である。 [0075]抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質の軽鎖の予想される／観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。 抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質の重鎖の予想される／観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。 抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質の連結モチーフの予想される／観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。 [0076]Ａは、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質のトリプシンペプチドのＵＶクロマトグラムを示す図であり、Ｂは、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質のトリプシンペプチドの総イオンクロマトグラム（TIC）を示す図である。 [0077]抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質の軽鎖の予想される／観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。 [0078]抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質の重鎖の予想される／観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。 [0079]抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質の重鎖の予想される／観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。 [0080]カンツズマブ（Cantuzumab）重鎖のアミノ酸配列（配列番号２９）、および太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着したカンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０）を含む、ＬＣ定常領域におけるカンツズマブ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー（配列番号３）は、カンツズマブ軽鎖とＴＧＦ−βＲＩＩとの間に位置し、イタリック体で示されている。 [0081]シクスツムマブ（Cixutumumab）重鎖のアミノ酸配列（配列番号３１）、および太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着したシクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３２）を含む、ＬＣ定常領域におけるシクスツムマブ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー（配列番号３）は、シクスツムマブ軽鎖とＴＧＦ−βＲＩＩとの間に位置し、イタリック体で示されている。 [0082]クリバツズマブ（Clivatuzumab）重鎖のアミノ酸配列（配列番号３３）、および太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着したクリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３３）を含む、ＬＣ定常領域におけるクリバツズマブ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー（配列番号３）は、クリバツズマブ軽鎖とＴＧＦ−βＲＩＩとの間に位置し、イタリック体で示されている。 [0083]プリツムマブ（Pritumumab）重鎖のアミノ酸配列（配列番号３５）、および太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着したプリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３６）を含む、ＬＣ定常領域におけるプリツムマブ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー（配列番号３）は、プリツムマブ軽鎖とＴＧＦ−βＲＩＩとの間に位置し、イタリック体で示されている。 [0084]カンツズマブ ＨＣ−４−１ＢＢおよびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、カンツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号２９）が、イタリック体で示されているリンカー（配列番号３）に付着しており、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、カンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０）が、太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着し、その間にリンカー（配列番号３）を有する。 [0085] シクスツムマブ ＨＣ−４−１ＢＢおよびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、シクスツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３１）が、イタリック体で示されているリンカー（配列番号３）に付着しており、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、シクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３２）が、太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着し、その間にリンカー（配列番号３）を有する。 [0086] クリバツズマブ ＨＣ−４−１ＢＢおよびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、クリバツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３３）が、イタリック体で示されているリンカー（配列番号３）に付着しており、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、クリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３４）が、太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着し、その間にリンカー（配列番号３）を有する。 [0087] プリツムマブ ＨＣ−４−１ＢＢおよびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、プリツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３５）が、イタリック体で示されているリンカー（配列番号３）に付着しており、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、プリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３６）が、太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着し、その間にリンカー（配列番号３）を有する。 [0088]カンツズマブ ＨＣ−ＰＤ１およびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、カンツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号２９）が、イタリック体で示されているリンカー（配列番号３）に付着しており、ＰＤ１（免疫調節性部分）についての配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、カンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０）が、太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着し、その間にリンカー（配列番号３）を有する。 [0089] シクスツムマブ ＨＣ−ＰＤ１およびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、シクスツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３１）が、イタリック体で示されているリンカー（配列番号３）に付着しており、ＰＤ１（免疫調節性部分）についての配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、シクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３２）が、太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着し、その間にリンカー（配列番号３）を有する。 [0090] クリバツズマブ ＨＣ−ＰＤ１およびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、クリバツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３３）が、イタリック体で示されているリンカー（配列番号３）に付着しており、ＰＤ１（免疫調節性部分）についての配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、クリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３４）が、太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着し、その間にリンカー（配列番号３）を有する。 [0091] プリツムマブ ＨＣ−ＰＤ１およびＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、プリツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３５）が、イタリック体で示されているリンカー（配列番号３）に付着しており、ＰＤ１（免疫調節性部分）についての配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、プリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３６）が、太字で特定されたＴＧＦ−βＲＩＩ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸残基（配列番号４）に付着し、その間にリンカー（配列番号３）を有する。 [0092]カンツズマブＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、カンツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号２９）が、イタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で特定され、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー（配列番号１１）を有し、図はカンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０）を含む。 [0093]シクスツムマブＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、シクスツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３１）が、イタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で特定され、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー（配列番号１１）を有し、図はシクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３２）を含む。 [0094]クリバツズマブＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、クリバツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３３）が、イタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で特定され、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー（配列番号１１）を有し、図はクリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３４）を含む。 [0095]プリツムマブＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−４−１ＢＢ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、プリツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３５）が、イタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で特定され、４−１ＢＢ（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号９）が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー（配列番号１１）を有し、図はプリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３６）を含む。 [0096]カンツズマブＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、カンツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号２９）が、イタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で特定され、ＰＤ１（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー（配列番号１１）を有し、図はカンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０）を含む。 [0097]シクスツムマブＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、シクスツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３１）が、イタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で特定され、ＰＤ１（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー（配列番号１１）を有し、図はシクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３２）を含む。 [0098]クリバツズマブＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、クリバツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３３）が、イタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で特定され、ＰＤ１（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー（配列番号１１）を有し、図はクリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３４）を含む。 [0099]プリツムマブＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ−ＰＤ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、プリツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列（配列番号３５）が、イタリック体で示されたリンカー（配列番号３）に付着しており、ＴＧＦβＲＩＩ（免疫調節性部分）についての配列（配列番号４）が太字で特定され、ＰＤ１（免疫調節性部分）についてのアミノ酸配列（配列番号１０）が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー（配列番号１１）を有し、図はプリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３６）を含む。

[00100] 本発明の実施は、他の指示がない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの通常の技術を用い、それらは、当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（1989）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（F. M. Ausubelら編（1987））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Academic Press, Inc.）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（M. J. MacPherson、B. D. Hames、およびG. R. Taylor編（1995））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（1989）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ならびにＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（R. I. Freshney編（1987））を参照されたい。

[00101] 定義
[00102] 他の規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における通常の技能を有する者によって一般的に理解された意味をもつ。本明細書で用いられる用語法は、特定の実施形態のみを記載することを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の説明および添付された特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに別な意図で示していない限り、複数形もまた含むことを意図される。以下の用語は下記に示された意味をもつ：

[00103] 本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは、本明細書では、５’から３’方向への方向で提示される。本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（DNA）分子またはリボ核酸（RNA）分子であり得る。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、その分子は、遺伝子またはｃＤＮＡ分子であり得る。ヌクレオチド塩基は、本明細書では、以下の一文字コードによって示される：アデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）、シトシン（C）、イノシン（I）、およびウラシル（U）。本発明のポリヌクレオチドは、当業者によく知られた標準技術を用いて調製することができる。

[00104] 本明細書で用いられる場合、用語「最適化された」は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物体、一般的に真核細胞、例えば、ピキアの細胞、トリコデルマの細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、またはヒト細胞において好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように変化していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、出発のヌクレオチド配列（「親」配列としても知られている）によって本来コードされたアミノ酸配列を完全に、またはできる限り多く保持するように操作される。本明細書における最適化された配列は、ＣＨＯ哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている；しかしながら、他の真核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現もまた、本明細書において構想される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されたと言われる。本明細書で用いられる場合、用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列のそのプロモーターによって駆動される転写および／または翻訳として定義される。

[00105] 本明細書で用いられる場合、細胞の「トランスフェクション」という用語は、細胞を遺伝子改変するために、遺伝子材料が細胞へ導入されることを意味する。トランスフェクションは、形質導入またはエレクトロポレーションなどの当技術分野で知られた様々な手段によって達成することができる。

[00106] 本明細書で用いられる場合、用語「癌」は、異常な細胞の急速かつ制御されない成長によって特徴づけられる疾患として定義される。癌細胞は、身体の他の部分へ、局所的に、または血流およびリンパ系を通して、広がることができる。様々な癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、眼癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、それらに限定されない。

[00107] 用語「導入遺伝子」は、標的細胞における発現のためのベクター内に組み込まれた任意の異種性ヌクレオチド配列、およびプロモーターなどの付随した発現調節配列を意味するように広い意味で用いられる。発現調節配列は、標的細胞において導入遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択されることが当業者に認識される。導入遺伝子の例は、本発明のキメラ融合タンパク質をコードする核酸である。

[00108] 本明細書で用いられる場合、用語「発現ベクター」は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも部分をコードする核酸配列を含有するベクターを意味する。発現ベクターは、様々な調節配列を含有することができ、その調節配列は、特定の宿主生物体における、作動可能に連結されたコード配列の転写および場合により、翻訳に必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果たす核酸配列もまた含有してもよい。その用語はまた、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞へ送達されるポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドまたはウイルスを含む。好ましくは、宿主細胞は、一過性細胞株または安定細胞株であり、より好ましくは、哺乳動物宿主細胞であり、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、およびＮＳＯからなる群から選択される。

[00109] 本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、ヒト、またはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ラット、およびマウスを含む脊椎動物を意味する。

[00110] 本明細書で用いられる場合、用語「治療的有効量」は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医が達成しようと努力している、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を引き起こすだろう対象化合物の量を意味する。

[00111] 本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤、または賦形剤が、製剤の他の成分と適合し、かつそのレシピエントにとって有害ではないことを意味する。

[00112] 本明細書で用いられる場合、用語「組換え体」は、一般的に天然で見出されるものとは異なる遺伝的実体を意味する。ポリヌクレオチドまたは遺伝子に適用される場合、これは、そのポリヌクレオチドが、天然で見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物の産生を生じる、クローニング、制限、および／またはライゲーション工程、ならびに他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。

[00113] 本明細書で用いられる場合、用語「実質的同一性」または「実質的類似性」は、核酸またはその断片に言及される時は、別の核酸（またはその相補鎖）と、適切なヌクレオチド挿入または欠失を含めて最適に整列した場合、その配列の少なくとも約９５〜９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。

[00114] 用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、アミド結合によって共有結合された少なくとも２個のアミノ酸の配列重合体を表示するように、交換可能に用いられる。

[00115] 本明細書で用いられ、かつペプチドに関する場合、用語「相同の」は、２つのペプチド間のアミノ酸配列類似性を指す。そのペプチドの両方におけるアミノ酸位置が、同一のアミノ酸によって占有される場合、それらはその位置において相同である。したがって、「実質的に相同の」は、全てというわけではないが、大部分は、相同であるアミノ酸配列であって、それが相同である配列の活性の大部分または全部を保持する、アミノ酸配列を意味する。本明細書で用いられる場合、「実質的に相同の」は、配列が、参照ペプチドと少なくとも５０％同一であり、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは９５％相同性であることを意味する。ペプチドが、非改変ペプチドと実質的に同じ活性または機能を有する限り、本明細書に開示された配列のアミノ酸配列の微量なバリエーション、欠失、置換、または誘導体化などの追加のペプチド配列改変が含まれる。とりわけ、改変ペプチドは、非改変ペプチドに関連した活性または機能を保持するだろうし、改変ペプチドは、一般的に、非改変配列のアミノ酸配列と「実質的に相同な」アミノ酸配列を有する。

[00116] 本明細書で用いられる場合、用語「投与すること」は、宿主対象の（必要に応じて）中へ、または上への組成物の実際の物理的導入として定義される。組成物を対象の中へ導入するありとあらゆる方法は、本発明により企図される；方法は、導入のいかなる特定の手段にも依存せず、そのように解釈されるべきではない。導入の手段は当業者によく知られており、好ましくは、組成物は、皮下に、または腫瘍内に投与される。１つより多い経路を投与のために用いることができるが、特定の経路が、別の経路より、より迅速で、かつより効果的な反応を提供することができることを当業者は認識しているだろう。局所的または全身的送達は、体腔への免疫ワクチンの適用もしくは滴下、エアロゾルの吸入もしくは吸送を含む投与により、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹膜、皮下、もしくは皮内投与を含む非経口導入により、達成することができる。腫瘍が中枢神経系内にある場合、中枢神経系において免疫系のプライミングがないため、組成物は、腫瘍内に投与されなければならない。

[00117] 化学療法剤は、「免疫原性」腫瘍細胞死を誘導し、樹状細胞による抗原の交差提示を促進することができるが、腫瘍は、自然免疫応答および適応免疫応答の活性化を抑制し、かつ免疫エフェクター細胞による免疫的攻撃を腫瘍が逃れることを可能にする免疫寛容誘発環境を生み出す。本発明は、腫瘍微小環境における腫瘍誘発性免疫寛容に対抗するストラテジーを提供し、播種性癌細胞に対するＴ細胞媒介性適応抗腫瘍免疫を活性化および活用することにより、化学療法の抗腫瘍効力を増強することができる。

[00118] 本発明は、本発明の標的化された免疫調節性抗体または融合タンパク質が、癌細胞の免疫寛容に対抗し、またはそれを逆転させることができるという発見に基づいている。癌細胞は、化学療法剤または腫瘍を標的とする抗体による排除を、腫瘍微小環境における特異的免疫抑制機構を介して避れることができ、そのような癌細胞の能力は、免疫寛容として認識されている。腫瘍誘発性免疫寛容に対抗することにより、本発明は、任意に別の既存の癌処置と併用した、癌処置のための効果的な組成物および方法を提供する。

[00119] 本発明は、腫瘍微小環境における免疫寛容に対抗し、かつ再発性または播種性癌に対する耐久性のある長期保護の維持のためのＴ細胞媒介性適応抗腫瘍免疫を促進する融合タンパク質を作製するための組成物および方法を提供する。これらの融合タンパク質は、以下の少なくとも１つにより腫瘍細胞に対する効果的な長期Ｔ細胞媒介性免疫応答を促進するように設計される：
ａ．抗体依存性細胞傷害性（ADCC）の増強を介して腫瘍細胞の死を促進すること；および
ｂ．制御性Ｔ細胞および骨髄系サプレッサー細胞によって媒介される免疫抑制を無効にすることにより抗腫瘍ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化および増殖を増加させること。これらの抗腫瘍免疫応答は、腫瘍細胞の免疫エフェクター媒介性細胞傷害性に対する感受性と並行して活性化され、それにより、腫瘍細胞切除(cytoreduction)を増強し、かつ適応抗腫瘍免疫を強化するポジティブフィードバックループを確立し得る。

[00120] 加えて、本発明の融合タンパク質は、以下の態様の少なくとも１つにおいて、既存の治療用分子と区別され、かつそれらより優れている：（ｉ）腫瘍微小環境における免疫寛容に対抗し、かつ（多様な癌の防止または処置として）再発性または播種性癌に対する長期保護の維持のためにＴ細胞媒介性適応抗腫瘍免疫を促進すること；（ｉｉ）多様な癌の養子(adoptive)細胞治療のための免疫細胞組成物を作製すること、および（ｉｉｉ）多様な癌または感染性疾患の予防のための免疫アジュバントまたはワクチンとして機能すること。

[00121] 本発明の標的化された免疫刺激性抗体および／または融合タンパク質は、腫瘍微小環境における免疫抑制ネットワークを破壊する能力を提供する。腫瘍は、免疫応答を回避または抑制する豊富な制御機構を利用する。癌細胞は、抗原提示樹状細胞（DC）の分化および成熟を阻害するサイトカインおよび分子の発現を介して、腫瘍微小環境における免疫寛容を能動的に促進する。腫瘍細胞により産生される免疫抑制性サイトカインおよびリガンドには以下が挙げられる：（ｉ）トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）；（ｉｉ）プログラム死−１リガンド１（PD-L1；B7-H1）；（ｉｉｉ）血管内皮成長因子（VEGF）；および（ｉｖ）インターロイキン−１０（IL-10）。

[00122] 樹状細胞（DC）成熟をブロックすることに加えて、これらの分子は、免疫抑制性ＣＤ^４＋ Ｔ細胞（制御性Ｔ細胞；Treg細胞）および骨髄系由来サプレッサー細胞（MDSC）の特定化されたサブセットの発生を促進する。Ｔｒｅｇは、ＣＤ２５［インターロイキン−２（IL-2）受容体cc鎖］およびフォークヘッドボックスＰ３（FOXP3）転写因子を構成的に発現するＣＤ^４＋ Ｔ細胞の少数派の亜集団である。Ｔｒｅｇ（CD4+CD25+FoxP3+細胞）は、インビトロおよびインビボで、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤＳ Ｔ細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞およびＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ならびに抗原提示細胞（APC）を含む広範な免疫細胞の活性化、増殖、およびエフェクター機能を制限することにより免疫寛容を維持する。

[00123] 腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の蓄積は、腫瘍免疫寛容を強化し、腫瘍進行および転移を促進する。免疫抑制性サイトカイン（TGF-β；PD-L1）および腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇの発現の増加は、多様な型の癌を有する患者の生存の低下と相関している。本発明の融合タンパク質は、標的化された腫瘍細胞または腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞および骨髄系サプレッサー細胞（DCまたはMDSC）によって発現した鍵となる免疫抑制性分子を阻害する。したがって、それらは、腫瘍微小環境内におけるＴｒｅｇの発生または機能を阻害する標的化された能力を提供する。

[00124] 本発明は、新生物疾患を防止または処置する方法を提供する。方法は、それを必要としている対象への、別の抗癌治療と併用した、本発明の１つまたは複数の融合タンパク質の投与を含み、その抗癌治療は、化学療法分子、抗体、小分子キナーゼ阻害剤、ホルモン剤、細胞傷害性物質、標的化された治療剤、抗血管新生薬、電離放射線、紫外線照射、凍結融解壊死治療、熱剥離、またはラジオ波焼灼療法である。

[00125] 本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、天然または人工の、一価または多価抗体を含み、それには、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性の、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製される断片、抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体が挙げられる）、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、それらに限定されない。抗体は、トリおよび哺乳動物を含む任意の動物起源由来であってもよい。一態様において、抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来であり、またはそれらに由来する。さらに、そのような抗体は、抗体のヒト化型であってもよい。抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより多い多重特異性であってもよい。本明細書における抗体には、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来の、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であると同時に、その鎖（複数可）の残りが、別の種由来の、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、加えて、所望の生物活性を示す限りは、そのような抗体の断片が挙げられる。

[00126] 本明細書に開示された組成物および方法に組み入れることができる抗体の例には、トラスツズマブ（抗HER2/neu抗体）；ペルツズマブ（抗HER2 mAb）；セツキシマブ（上皮成長因子受容体EGFRに対するキメラモノクローナル抗体）：パニツムマブ（抗EGFR抗体）；ニモツズマブ（抗EGFR抗体）；ザルツムマブ（抗EGFR mAb）；ネシツムマブ（抗EGFR mAb）；ＭＤＸ−２１０（ヒト化抗HER-2二重特異性抗体）；MDX-210（ヒト化抗HER-2二重特異性抗体）；ＭＤＸ−４４７（ヒト化抗EGF受容体二重特異性抗体）；リツキシマブ（キメラマウス/ヒト抗CD20 mAb）；オビヌツズマブ（抗CD20 mAb）；オファツムマブ（抗CD20 mAb）；トシツモマブ−１１３１（抗CD20 mAb）；イブリツモマブチウキセタン（抗CD20 mAb）；ベバシズマブ（抗VEGF mAb）；ラムシルマブ（抗VEGFR2 mAb）；ラニビズマブ（抗VEGF mAb）；アフリベルセプト（IgGl Fcに融合したYEGFR1およびVEGFR2の細胞外ドメイン）：ＡＭＧ３８６（IgGl Fcに融合したアンジオポエチン−１および−２結合ペプチド）；ダロツズマブ（抗lGF-lR mAb）：ゲムツズマブオゾガマイシン（抗CD33 mAb）；アレムツズマブ（抗Campath-l/CD52 mAb）；ブレンツキシマブベドチン（抗CD30 mAb）；カツマキソマブ（上皮細胞接着分子およびCD3を標的とする二重特異性mAb）；ナプツモマブ（抗5T4 mAb）；ギレンツキシマブ（抗炭酸脱水酵素ix）：またはファルレツズマブ（抗葉酸受容体）が挙げられるが、それらに限定されない。他の例には、Ｐａｎｏｒｅｘ（商標）（17-1 A）（マウスモノクローナル抗体）；Ｐａｎｏｒｅｘ（＠（17-1 A）（キメラマウスモノクローナル抗体）；ＢＥＣ２（抗イディオタイプmAb、GDエピトープを模倣する）（BCGと共に）：Ｏｎｃｏｌｙｍ（Lym-1 モノクローナル抗体）；ＳＭＡＲＴ Ｍ ｌ ９５ Ａｂ、ヒト化１３’１ ＬＹＭ−１（Oncolym）、Ｏｖａｒｅｘ（B43.13、抗イディオタイプマウスmAb）；腺癌上のＥＧＰ４０（17-1 A）汎癌腫(pancarcinoma)抗原に結合する３６２２Ｗ９４ ｍＡｂ；Ｚｅｎａｐａｘ（SMART抗Tac（IL-2受容体）；SMART Ml 95 Ab、ヒト化Ab、ヒト化）；ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２（汎癌腫特異的Ab）：ＴＮＴ（ヒストン抗原に対するキメラmAb）；ＴＮＴ（ヒストン抗原に対するキメラmAb）；ＧＪｉｏｍａｂ−Ｈ（モノクローナル抗体 − ヒト化Ab）；ＧＮ１−２５０Ｍａｂ；ＥＭＤ−７２０００（キメラ-EGFアンタゴニスト）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（ヒト化IL.L.2抗体）；およびＭＤＸ−２６０二重特異性、ＧＤ−２を標的とする、ＡＮＡ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ ｌＤｉＯ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ ＡＢＬ ３６４ Ａｂ、またはＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡなどの抗体が挙げられる。

[00127] 抗体を作製するために様々な方法が用いられている。単一の型の抗体を産生するクローン化細胞株を指すハイブリドーマテクノロジーは、マウス（ネズミ）、ハムスター、ラット、およびヒトを含む様々な種の細胞を用いる。抗体を調製するための別の方法は、組換えＤＮＡ技術を含む遺伝子操作を用いる。例えば、これらの技術から作製された抗体には、とりわけ、キメラ抗体およびヒト化抗体が挙げられる。キメラ抗体は、１つより多い型の種由来のＤＮＡコード領域を組み合わせる。例えば、キメラ抗体は、可変領域がマウスに由来し、定常領域がヒトに由来する。ヒト化抗体は、それが非ヒト部分を含有したとしても、大部分はヒトに由来する。キメラ抗体と同様に、ヒト化抗体は、完全にヒトの定常領域を含有してもよい。しかし、キメラ抗体とは違って、可変領域は、部分的にヒトに由来してもよい。ヒト化抗体の非ヒトの合成部分は、マウス抗体におけるＣＤＲに由来する場合が多い。いずれにしても、これらの領域は、その抗体が特定の抗原を認識し、かつ結合することを可能にするのに重要である。

[00128] 一実施形態において、ハイブリドーマは、標的化部分および免疫調節性部分を含む標的化された融合タンパク質を産生することができる。一実施形態において、抗体、抗体断片、またはポリペプチドを含む標的化部分は、リンカーと共に、またはリンカーなしで、ポリペプチドからなる免疫調節性部分に連結または融合している。リンカーは、アミノ酸リンカーであり得る。一実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、または８である）である。例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）。別の実施形態において、リンカーは、ＥＰＫＳＣＤＫ（配列番号１１）である。様々な態様において、リンカーの長さは、標的部分の結合または免疫調節性部分の機能を最適化するように改変され得る。様々な態様において、免疫調節性部分は、標的化抗体の重鎖またはＦｃ含有融合タンパク質のＦｃ領域のＣ末端に融合するポリペプチドである。別の態様において、免疫調節性部分は、標的化抗体の軽鎖のＣ末端に融合するポリペプチドである。

[00129] 抗体断片は、無傷抗体の一部（例えば、その抗原結合領域または可変領域が挙げられる）を含むことができる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片；Ｆｃ断片またはＦｃ融合産物；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片（複数可）から形成された多特異性抗体が挙げられる。無傷抗体は、抗原結合性可変領域、加えて、軽鎖定常領域（CL）ならびに重鎖定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然の配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントもしくは任意の他の修飾されたＦｃ（例えば、グリコシル化または他の操作されたＦｃ）であってもよい。

[00130] 本発明の融合タンパク質は、当技術分野において知られた通常の技術により、例えば、固相ペプチド合成などの化学合成により、合成されてもよい。そのような方法は、当業者に知られている。一般的に、これらの方法は、当技術分野においてよく知られた、固相かまたは溶液相のいずれかの合成方法を用いる。具体的には、方法は、１つまたは複数のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸の成長ペプチド鎖への逐次付加を含む。通常、最初のアミノ酸のアミノ基かまたはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される。その後、保護された、または誘導体化されたアミノ酸は、アミド結合を形成するのに適した条件下で、適切に保護された、相補（アミノまたはカルボキシル）基を有するその配列において次のアミノ酸を付加することで、不活性固体支持体に付着するか、または溶液中で利用することができる。その後、保護基は、この新しく付加されたアミノ酸残基から除去され、その後、（適切に保護された）次のアミノ酸が付加される、など。結局、所望のアミノ酸は、正しい配列において連結されており、いかなる残存する保護基もいかなる固体支持体も逐次的か、または同時かのいずれかで除去されて、最終ポリペプチドが得られる。この一般的な手順の簡単な改変により、一度に１個より多いアミノ酸を成長鎖へ付加することが可能であり、例えば、保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドと（キラル中心をラセミ化しない条件下で）カップリングさせて、脱保護後、ペンタペプチドを形成することにより、これが可能である。

[00131] 典型的な保護基には、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Boc）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、ｐ−トルエンスルホニル（Tos）；２，４−ジニトロフェニル、ベンジル（Bzl）、ビフェニルイソプロピルオキシ−カルボキシカルボニル、シクロヘキシル、イソプロピル、アセチル、ｏ−ニトロフェニルスルホニルなどが挙げられる。これらのうち、ＢｏｃおよびＦｍｏｃが好ましい。

[00132] 典型的な固体支持体は、一般的に、架橋したポリマー材料である。これらには、ジビニルベンゼン架橋スチレンに基づいたポリマー、例えば、ジビニルベンゼン−ヒドロキシメチルスチレンコポリマー、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレンコポリマー、およびジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレンコポリマーが挙げられる。ｐ−メチル−ベンズヒドリルアミン樹脂を用いる、本明細書に図示されているようなジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレンコポリマーは、末端アミド官能基をペプチド鎖へ直接導入するという利点を提供し、その機能は、鎖が支持体から切断された場合、その鎖によって保持される。

[00133] 一つの方法において、ポリペプチドは、アミドペプチド型の合成を可能にする樹脂を用い、かつ標準溶媒および試薬と共にｔ−Ｂｏｃアミノ酸誘導体（Peninsula Laboratories, Inc.）を用いる、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）４３０Ａペプチド合成機における通常の固相化学合成により調製される。Ｌ−アミノ酸かまたはＤ−アミノ酸のいずれかを含有するポリペプチドは、この様式で合成されてもよい。ポリペプチド組成物は、定量的アミノ酸分析により確認され、各ペプチドの特定の配列は、配列分析により決定されてもよい。

[00134] 好ましくは、ポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを合成することによる組換えＤＮＡ技術により作製することができる。いったん所望のポリペプチドについてのコード配列が合成または単離されたならば、それらは、発現のために任意の適切なベクターへクローニングすることができる。多数のクローニングベクターが当業者に知られており、適切なクローニングベクターの選択は選択できる事柄である。遺伝子は、プロモーター、（細菌発現について）リボソーム結合部位、および任意に、オペレーター（まとめて、本明細書では「調節」エレメントと呼ばれる）の調節下に置くことができ、その結果、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、この発現構築を含有するベクターによって形質転換された宿主細胞においてＲＮＡへ転写される。コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含有してもよいし、含有しなくてもよい。異種性リーダー配列は、宿主生物体からの発現したポリペプチドの分泌を引き起こすコード配列に付加することができる。宿主細胞の成長に関連してタンパク質配列の発現の制御を可能にする他の制御配列もまた望ましい場合がある。そのような制御配列は、当業者に知られており、例として、制御化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものが挙げられる。制御エレメントの他の型もまた、ベクター内に存在してもよく、例えば、エンハンサー配列である。

[00135] 調節配列および他の制御配列は、上記のクローニングベクターなどのベクターへの挿入の前にコード配列にライゲーションされてもよい。あるいは、コード配列は、調節配列および適切な制限部位をすでに含有する発現ベクターへ直接、クローニングすることができる。

[00136] その後、発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために用いられてもよい。いくつかの哺乳動物細胞株が当技術分野において知られており、それらには、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が挙げられ、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、メイディン・ダービー・ウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、肉腫などの癌腫細胞由来のＮＯＳ細胞、およびその他があるが、それらに限定されない。同様に、大腸菌、枯草菌、および連鎖球菌種などの細菌宿主が、本発現構築物と共に用いられる。本発明において有用な酵母宿主には、とりわけ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）、ハンゼヌラ・ポリモーファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ピキア・ギリエルモンディ（Pichia guillerimondii）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）が挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に用いられる昆虫細胞には、とりわけ、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）オートグラファ・カリフォルニア（Autographa californica）、カイコ（Bombyx mori）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）、およびイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）が挙げられる。そのタンパク質はまた、トリパノソーマにおいて発現してもよい。

[00137] 選択された発現系および宿主に依存して、本発明のタンパク質は、対象とするタンパク質が発現する条件下で上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を成長させることにより産生される。その後、タンパク質は、宿主細胞から単離され、精製される。発現系がそのタンパク質を成長培地へ分泌する場合には、そのタンパク質は、培地から直接、精製することができる。そのタンパク質が分泌されない場合には、それは、細胞可溶化物から単離される。適切な成長条件および回収方法の選択は当業者の能力の範囲内である。いったん精製されたならば、そのタンパク質のアミノ酸配列は、すなわち、エドマン分解、続いてＨＰＬＣによるアミノ酸分析のサイクルの繰り返しにより決定することができる。アミノ酸シーケンシングの他の方法もまた当技術分野において知られている。

[00138] いったん合成され、または別の方法で作製されたならば、候補ポリペプチドの阻害活性は、例えば、マウス内皮細胞を用いることにより、ＮＦ−κＢのリポ多糖誘導性核移行を阻害する候補物質の能力を評価することにより試験することができる。

[00139] 本発明の融合タンパク質は、非限定的に、液体溶液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、座剤、高分子マイクロカプセルまたはマイクロベシクル、リポソーム、および注射用または注入用溶液などの様々な剤形で治療用組成物へ製剤化することができる。好ましい形は、投与様式および標的とされる特定の癌型に依存する。組成物はまた、好ましくは、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、および硫酸プロタミンなどの塩または電解質などの、当技術分野においてよく知られた、薬学的に許容される媒体、担体、または補助剤を含む。適切な媒体は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。そのような組成物を調製する実際の方法は、当業者に知られており、または明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１８版、１９９０を参照。

[00140] 上記の組成物は、非限定的に、静脈内、腹腔内、経口、リンパ管内、または皮下投与を含む通常の送達様式を用いて投与することができる。問題の腫瘍への、または炎症部位への局所投与、例えば、関節炎関節への直接的注射もまた、本発明と共に用いられる。

[00141] 治療的有効用量は、当業者によって容易に決定され、疾患の重症度および経過、患者の健康状態、および処置に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。

[00143] 以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。その例は、例証のみを目的として提供され、決して、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。用いられる数（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然のことながら、許容されるべきである。

[00144] （実施例１）
[00145] 免疫調節物質（サプレッサーかまたはアクチベーターのいずれか）リガンドに連結されたＩｇＧ重鎖を含む融合タンパク質を、ＣＨＯ細胞の発現のためにコドン最適化遺伝子により発現させた。配列番号１２〜２８により定義されたコドン最適化ヌクレオチド配列が、（CHO）細胞において発現し、発現したキメラ／融合タンパク質は表１に示されている。

[00146] 発現したタンパク質を、ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いることにより特徴づけ、発現した融合タンパク質抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩおよび抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩを、プロテインＡカラムを用いて培養上清から精製し、その結果は図２２に示されている。注目すべきことには、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ軽鎖の質量が、より高く、それは、軽鎖および重鎖の可変領域上の２つのグリコシル化部位の存在のためである可能性がある。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ重鎖および抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ重鎖の質量はどちらも、ＴＧＦβＲＩＩのためにより高い。また、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ重鎖は、４つのＮ−グリコシル化部位を有し、一方、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩは５つのＮ−グリコシル化部位を有する。

[00147] （実施例２）
[00148] プロテインＡ／ＳＥＣクロマトグラフィー。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩおよび抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ試料を、プロテインＡ／ＳＥＣクロマトグラフィーにより分析し、その結果は図２３に示されている。図２３Ａは、ＴＧＦβＲＩＩ領域に存在する３つの追加のＮ−グリコシル化部位があるので、Ｂｍａｂ２００（ハーセプチン）の溶出の鋭いピーク対より幅広い溶出ピークが、グリコシル化の存在による不均一性の度合いであると考えられることを示す。注目すべきことには、−８０Ｃでの保存が、凝集を引き起こさなかった。ＳＥＣカラムにおける初期でのピークの位置または出現のシフトは、分子量の増加が融合パートナーによることを示している。これにより、完全長分子が発現しつつあることが再度、確認される。図２３Ｂは、Ｂｍａｂ２００（ハーセプチン）の溶出の鋭いピーク対より幅広い溶出ピークを示し、ＴＧＦβＲＩＩ領域に存在する３つの追加のＮ−グリコシル化部位があるので、グリコシル化部位の存在による不均一性の度合いであると考えられる。この場合もやはり、−８０Ｃでの保存が、凝集を引き起こさなかった。ＳＥＣカラムにおける初期でのピークの位置または出現のシフトは、分子量の増加が融合パートナーによることを示している。これにより、完全長分子が発現しつつあることが、再度確認される。

[00149] （実施例３）
[00150] 融合タンパク質についての機能アッセイ。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩおよび抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩのＴＧＦβへの結合能力を調べるためにＥＬＩＳＡ実験を行った。図２４Ａは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ分子および抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ分子がＴＧＦβに結合することを示し、その融合タンパク質が機能しうることを表している。図２４Ｂは、抗ＨＥＲ２−ＴＧＦβＲＩＩが、Ｂｍａｂ２００（ハーセプチン）と同様に、ＢＴ４７４細胞株の増殖を阻害することを示している。図２５は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩが、セツキシマブと同様に、Ａ４３１細胞株の増殖を阻害することを示している。

[00151] （実施例４）
[00152] 抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質についての抗体依存性細胞傷害性ＡＤＣＣ活性を導き、そのタンパク質が、細胞上の標的受容体に結合することを決定した。結果は図２６に示されており、活性がＢＴ４７４細胞において決定され、ＢＴ４７４細胞における抗ＨＥＲ２−ＴＧＦβＲＩＩのＡＤＣＣ活性（細胞の％溶解）が、Ｂｍａｂ２００（ハーセプチン）のそれと類似していることが明らかである。図２７は、Ａ４３１細胞における抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩのＡＤＣＣ活性を示し、そのＡＤＣＣ活性は、セツキシマブのそれと類似している。図２８は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩおよびセツキシマブと比較した、抗ＥＧＦＲ１−４−１ＢＢのＡＤＣＣ活性を示す。

[00153] （実施例５）
[00154] 発現したタンパク質の結合活性。このアッセイの目的は、用量依存的様式で細胞上の標的受容体に結合する、融合タンパク質の機能性を試験することである。図２９Ａは、抗ＣＴＬＡ４−ＴＧＦβＲＩＩのＴＧＦβ１への結合活性が、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと同程度であることを示し、Ｂは、抗ＣＴＬＡ４−ＴＧＦβＲＩＩのＣＴＬＡ４への結合活性を示す。図３０Ａは、ＰＤ１−Ｆｃ結合のレベルを決定するための抗ＣＴＬＡ４−ＴＧＦβＲＩＩの結合活性を示し、Ｂは、４−１ＢＢＬの結合を決定するための抗ＥＧＦＲ１−４−１ＢＢの結合活性を示す。図３１Ａは、抗ＥＧＦＲ１−４−１ＢＢのＥＧＦＲへの結合活性を示し、Ｂは、ＰＤＬ１−Ｆｃを見出すためのＰＤ１−Ｆｃ−４−１ＢＢの結合活性を示す。図３２は、抗ＥＧＦＲ１−ＰＤ１のＥＧＦＲおよびＰＤ１への結合活性を示す。

[00155] （実施例６）
[00156] 分子の一次構造の確認。図３３に示されているように、発現したタンパク質は、分子量およびグリコシル化の存在を決定するために評価される。試料を、還元性および非還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。抗体の重鎖および軽鎖は、還元アルキル化によって分離され、その結果、還元された構造を評価することができる。融合タンパク質のトリプシン消化により、一次配列の同定がもたらされる。タンパク質のＭＳ／ＭＳ分析を実施する。

[00157] 抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩおよび抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの質量分析。図１に示された融合タンパク質を発現させ、試験した。図３４Ａは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合体の軽鎖（LC）（還元型）のマススペクトル／マススペクトルを示し、Ｂは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合体のＬＣ（還元型）のデコンボリューション化マススペクトルを示す。図３５は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合体の重鎖（HC）（還元型）のマススペクトルを示す。

[00158] 図２に示された融合タンパク質を発現させ、試験した。図３６Ａは、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのＬＣ（還元型）のマススペクトルを示し、Ｂは、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのＬＣ（還元型）のデコンボリューション化マススペクトルを示す。図３７は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのＨＣ（還元型）のマススペクトルを示す。

[00159] （実施例７）
[00160] 図１および２に記載されているようなアミノ酸配列を有する融合タンパク質を、ＵＶクロマトグラフィーを用い、かつ融合タンパク質のトリプシン消化物のクロマトグラフィー的分離から生じたクロマトグラムを作成して、点検し、ＵＶ２１８〜２２２ｎｍ波長で試験した。ＵＶトレースに対応する総イオン電流（TIC）もまた評価した。図３８Ａは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質のトリプシンペプチドのＵＶクロマトグラムを示し、Ｂは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質のトリプシンペプチドの総イオンクロマトグラム（TIC）を示す。図３９、４０、および４１は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質の軽鎖、重鎖、および連結モチーフの予想される／観察されたトリプシンペプチドのリストをそれぞれ、提供する。注目すべきことには、軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドおよび連結モチーフ（ＴＧＦ βＲＩＩ）のペプチドを含む、その分子の予想されるペプチド全てが、同定された。

[00161] 図４２Ａは、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質のトリプシンペプチドのＵＶクロマトグラムを示し、Ｂは、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質のトリプシンペプチドの総イオンクロマトグラム（TIC）を示す。図４３、４４、４５は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ融合タンパク質の軽鎖、重鎖、および連結モチーフの予想される／観察されたトリプシンペプチドのリストをそれぞれ、提供する。この場合もやはり、軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドおよび連結モチーフ（ＴＧＦ βＲＩＩ）のペプチドを含む、その分子の予想されるペプチド全てが、同定された。

[00162] （実施例８）
[00163] 組換え融合タンパク質発現に用いられる宿主細胞株は、ＣＨＯ細胞、またはＣＨＯ細胞の派生物である。本明細書で言及されるＣＨＯ細胞は、ｆｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ−Ｓ細胞（ＣＨＯ−Ｓ細胞は、高レベルの分泌型組換えタンパク質を産生する能力がある、既知組成培地(chemically defined media)中、高密度で無血清の懸濁培養に適応したＣＨＯ派生細胞である）かまたはＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１と同じである）のいずれかである。それは基本的に接着性細胞株である。安定細胞株に用いられるベクター：

[00164] ベクターの２つの異なるハイブリッドＣＭＶプロモーターの下流の対象とする１つまたは２つの遺伝子を発現するようにＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧによって設計されたＦｒｅｅｄｏｍ ｐＣＨＯ １．０ベクター。このベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）選択マーカーおよびピューロマイシン抵抗性遺伝子を含有し、ＭＴＸおよびピューロマイシンを同時に用いる選択を可能にする。

[00165] 軽鎖または軽鎖融合タンパク質をコードする核酸配列を、ＥＦ２／ＣＭＶプロモーターの調節下で制限酵素部位ＡｖｒＩＩおよびＢｓｔＺ１７にクローニングする。重鎖または重鎖融合タンパク質をコードする核酸配列を、ＣＭＶ／ＥＦ１プロモーターの調節下で制限酵素部位ＥｃｏＲＶおよびＰａｄにおいてクローニングする。

[00166] 構築物（複数可）を、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ−Ｓ細胞／ＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトする。高産生株の単一のクローン細胞系統を、組換え融合タンパク質を産生するために選択する。ＭＣＢを調製し、細胞生存率、生産性、安定性、および他のパラメーターについて特徴づける。それらの細胞を、培養に用い、続いて精製する。

[00167] （実施例９）
[00168] 細胞培養を、フェッドバッチ培養様式で実施する。細胞培養において、用いられる哺乳動物宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞であり、培地は最初に供給される。ＣＨＯ細胞を、抗体−ペプチド融合タンパク質を産生するように遺伝子操作する。硫酸亜鉛七水和物塩を０．４ｍＭの濃度で培地中に加える。対照的に、対照培地において、いかなる亜鉛塩の添加もない。産生発酵実行を、３７±１℃、０．３〜０．４５×１０^６細胞／ｍｌの最初の細胞数で開始し、バッチ相において、最初の３〜４日間を、細胞を成長させることに費やす。次の工程は、温度を３１±１℃へ低下させ、７日目までその実行を継続することを含む。ラクテートは、その実行を通して、約１０〜４０％、低下する。その後、産生された融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーの技術を用いて、培地から収集する。

[00169] （実施例１０）
[00170] 細胞培養を、フェッドバッチ培養様式で実施する。細胞培養において、哺乳動物宿主細胞、およびＨｙｃｌｏｎｅ ＣＤＭ４Ｍａｂである培地を最初に供給する。塩（亜鉛）もまた培地に加える（０．３ｍＭ）。産生発酵実行を、３７±１℃、０．３〜０．４５×１０^６細胞／ｍｌの最初の細胞数で開始し、バッチ相において、最初の３〜４日間を、細胞を成長させることに費やす。次の工程は、温度を３１＋１−１℃へ低下させ、７日目までその実行を継続することを含む。

[00171] （実施例１１）
[00172] プロテインＡカラムを用いる、抗体−ペプチド融合免疫刺激性分子の精製。融合モノクローナル抗体を含有する組換えＣＨＯ細胞株から分泌された上清培養物を、無菌条件下で力価および内毒素について試験する。上清を、Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＸｔｒａプロテインＡアフィニティー樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーに供し、洗浄し、結合緩衝液で平衡化する。上清のｐＨを、カラムと同じｐＨへ、０．５Ｍリン酸塩を用いて調整する；上清を、０．５ｍｌ／分の流速で、カラムに結合させ／カラムを通過させ、最大結合を達成させる。全ての抗体−タンパク質融合分子はＦｃ領域を通して結合するが、不純物は、通過画分として排除される。カラムを平衡緩衝液で洗浄し、結合した融合分子を、ｐＨ３．０での０．１Ｍグリシンを用いて溶出させる。溶出したタンパク質のｐＨを、中性ｐＨまたは安定な製剤ｐＨに調整し、精製されたタンパク質を、−２０℃または２〜８℃で保存する。

[00173] （実施例１２）
[00174] トラスツズマブとトラスツズマブ−ＴＧＦ βＲＩＩ受容体融合分子の差異の認識
[00175] ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する乳癌腫瘍は、恒常的活性化かまたは受容体のＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとのヘテロ二量体化のいずれかにより、腫瘍進行に至る。これは、ＥｒｂＢシグナル伝達経路と関連した成長因子の結合を含む。これに加えて、その腫瘍は、抑えられた免疫応答に関与するＴＧＦ βおよび特定のサイトカインを活性化することにより免疫系が抑制される環境を生み出す。トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が融合タンパク質としてＴＧＦ βＲＩＩ受容体と融合している新規な分子が作製される。トラスツズマブが、ＥｒｂＢ２過剰発現乳癌細胞へ誘導される標的化された分子として働くことが仮定される一方で、ＴＧＦβＲＩＩ受容体は、ＴＧＦβを封鎖し、免疫活性化をもたらすだろう。実験は、ＴＧＦβ、細胞傷害性ＣＤ８陽性細胞、およびＮＫ細胞の存在下で、（ハーセプチンの存在下でＢＴ４７４細胞を成長させることにより選択された）ハーセプチン抵抗性ＥｒｂＢ２発現細胞株の成長を利用する。トラスツズマブは、細胞傷害性を誘導することにおいて無効であるが、トラスツズマブ ＴＧＦβＲＩＩ受容体融合分子は、ＴＧＦβを封鎖し、それにより細胞傷害性ＣＤ８およびＮＫ細胞の阻害を防止するだろう。これは、トラスツズマブ単独で処置された細胞と比較して、トラスツズマブ−ＴＧＦβＲＩＩ受容体融合体で処置された細胞において観察される細胞傷害性の増強をもたらすだろう。実験についての読み出しは、存在する生細胞に正比例して活性化されるレザズリン色素である、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いる。別の方法は、比例した死細胞に直接対応するプロテアーゼ放出を測定するｃｙｔｏｔｏｘ ｇｌｏを用いることにより細胞傷害性を測定することであり得る。さらに別の方法は、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いることにより、アポトーシス細胞集団および壊死細胞集団を直接測定するフローサイトメトリーの使用であり得る。これらの複数の実験からの結果は、トラスツズマブ単独と比較して、コンジュゲート分子の活性の理解を明瞭にするだろう。

[00176] 本発明は、上記の実施例を参照して記載されているが、改変およびバリエーションが、本発明の精神および範囲の内に包含されることは理解されているだろう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (5)

1. 癌細胞を標的とするための標的化部分、免疫寛容に対抗する免疫調節性部分、およびアミノ酸スペーサーからなる、癌細胞を溶解するためのキメラ融合タンパク質であって、前記標的化部分と前記免疫調節性部分が、両方の部分がそれらの個々の標的に首尾よく結合することができるように、アミノ酸残基の十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されており、
   前記免疫調節性部分が配列番号４のアミノ酸配列からなるＴＧＦ−βＲＩＩであり、
   前記アミノ酸スペーサーが、配列番号３のアミノ酸配列であり、
   前記標的化部分が、配列番号５の重鎖および配列番号６の軽鎖からなる抗ＥＧＦＲ１であり、
   配列番号４が、前記抗ＥＧＦＲ１の配列番号５又は配列番号６のＣ末端と前記アミノ酸スペーサーを介して接続している、キメラ融合タンパク質。
2. 前記配列番号６の軽鎖のＣ末端が、前記アミノ酸スペーサーを介して前記免疫調節性部分と結合する、キメラ融合タンパク質。
3. 請求項１または２に記載のキメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
4. 対象において癌を治療するための医薬の製造におけるキメラ融合タンパク質の使用であって、
   前記キメラ融合タンパク質が、癌細胞を標的とするための標的化部分、免疫寛容に対抗する免疫調節性部分、およびアミノ酸スペーサーからなり、
   前記標的化部分と前記免疫調節性部分が、両方の部分がそれらの個々の標的に首尾よく結合することができるように、アミノ酸残基の十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されており、
   前記免疫調節性部分が配列番号４のアミノ酸配列からなるＴＧＦ−βＲＩＩであり、
   前記アミノ酸スペーサーが、配列番号３のアミノ酸配列であり、
   前記標的化部分が、配列番号５の重鎖および配列番号６の軽鎖からなる抗ＥＧＦＲ１であり、
   配列番号４が、前記抗ＥＧＦＲ１の配列番号５又は配列番号６のＣ末端と前記アミノ酸スペーサーを介して接続している、使用。
5. 前記キメラ融合タンパク質において、前記配列番号６の軽鎖のＣ末端が、前記アミノ酸スペーサーを介して前記免疫調節性部分と結合する、請求項４に記載の使用。

Images