JP5438073B2 - 液体中に懸濁された粒子を特徴付けるための使い捨てカートリッジ - Google Patents
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Description
本発明は、液体中に懸濁された粒子がインピーダンス測定を利用する粒子の検出および特徴付けのためにオリフィスまたはアパーチャを通過する粒子特徴付け装置に関する。詳細には、本発明は、ミリメートル以下のオリフィスの精密機械加工のための基材(base material)としてのポリマー膜の利用に関する。ポリマー膜にオリフィスを形成することは、材料費および製造費が低いため、血液学分析用の単回使用カートリッジの構築を容易にする。
さらに、低い費用で、正確性および再現性を有するオリフィスを持つ膜を製造する方法が必要である。
単回使用カートリッジは、1つの液体サンプルの分析後、廃棄されることを意図される。
したがって、好ましくは、ポリマー膜は、その膜が自立する(self-sustained)ように、硬化ポリマーまたは硬質ポリマーから製造される。
したがって、好ましくは、膜の精密機械加工は、フォトリソグラフィ以外のプロセスを含む。
高エネルギーレーザスポットは、そのスポットの集束領域で材料の蒸発または削磨を引き起こす。エキシマレーザのレーザスポットは、数マイクロメートルに集束させることができ、本発明に従う所望の正確性を提供する。
好ましくは、レーザは、その優秀なレーザ切断の正確性のためにUV-レーザである。
好ましくは、UV-レーザは、150nm〜350nmの範囲の波長を有するエキシマレーザである。
この結果、オリフィスの中心部でオリフィスを通る粒子およびオリフィスのエッジ近くでオリフィスを通る粒子により発生する電気パルスは、実質的に同じパルスを生じる。丸められたエッジがなければ、エッジ近くでオリフィスを通る粒子は、歪んだパルスを発生する。
好ましくは、丸められたエッジの曲率半径は、長さ対直径比1を有するオリフィス径の1/4に相当する。この結果、均質な電界が、エッジで場が乱れることなく、なおオリフィス内に到達する。
オリフィスの丸められたエッジを設けるために、始めはより大きな領域を、次いでオリフィスの実効直径を規定する直径にまで狭めて加工処理するようにレーザをプログラムする。
さらに、0μm〜5μmの範囲の内部表面の表面粗さを有するオリフィスを持つポリマー膜が提供される。これにより、オリフィスの中心部で実質的に均質な電界が提供され得る。
なおさらに、±1%〜±10%の範囲のオリフィス長軸に沿ったオリフィス径の偏差を有するオリフィスを持つポリマー膜が提供される。これによりオリフィスの中心部で実質的に均質な電界が提供され得る。
したがって、サンプリング部材は、精密な容量の液体サンプルを受容および保持するため、ならびに混合チャンバの入口へサンプルを移動させるために動作する。
したがって、穴は、毛細管引力による液体サンプルの進入のための第1の毛細管トンネルを構成し得る。毛細管トンネルは、穴とサンプリングすべき液体との間の接触の際に、液体のサンプルが毛細管引力により穴中に引き込まれるような寸法である。
さらに、空洞は、毛細管引力により空洞中に液体サンプルを引き込むように適合させた第2の毛細管トンネルを構成し得る。好ましくは、第1および第2の毛細管トンネルは同じ直径を有する。また、第1の位置で、第1および第2の毛細管トンネルは、実質的に同じ長手方向の中心軸に沿って伸びるのが好ましい。
加えて、または択一的には、サンプリング部材は、空洞の長軸に実質的に垂直な方向に移動してもよい。
あるいは、毛細管トンネル壁は、別のタイプの材料から作製されても、ポリマーまたは試薬のような親水性材料で共有結合的または非共有結合的にコーティングされてもよい。
毛細管トンネルはまた、トンネル内壁に付着または化学的に結合した1以上の試薬を含んでもよい。これらの試薬は、サンプルの毛細管引力をさらに促進する目的、および任意には液体サンプル中で化学反応をも引き起こす目的(例えば、血液サンプル中に抗凝固活性を導入する目的)に役立つ。このような試薬は、ヘパリン、EDTAの塩などを含んでもよい。
好ましくは、サンプリング部材はポリマーから作製される。
カートリッジは、オリフィスを通る液体フローを引き起こすために収集チャンバと連通するカートリッジポートをさらに備えてもよく、ドッキングステーションは、オリフィスを通る液体フローを引き起こす圧力の印加のために、カートリッジがドッキングステーションに受容されているとき、カートリッジポートと気体接続を形成するための対応するポートをさらに備えてもよい。
好ましくは、オリフィスの長さまたは深さは、1〜1000μmであり、例えば約50μmである。望ましくは、オリフィスの長さは、0.1〜100μm直径の粒子を検出するときにオリフィス内にただ1つの粒子が存在するように選択する。しかし、オリフィス中の電界の均質性を考慮すれば、直径より長いかまたは直径と等しいオリフィスの長さが必要になり得る。カウント(このうちいくらかは、2つの粒子の同時カウントであり得る)は、統計学的推定を行なうことにより数学的に較正することができる。オリフィスの縦横比(長さまたは深さ/直径)は、好ましくは0.5:1〜5:1、より好ましくは1:1〜3:1である。
好ましくは、オリフィスの最大断面寸法は、5〜200μm、例えば10〜50μmである。
好ましくは、容量計量手段は、収集チャンバと連通する入力、および出力を有する容量計量チャンバを備える。ここで、入力および出力のそれぞれで、液体の存在が検出される。
例えば、液体の存在は、空気で満たされているときから液体で満たされているときまでのチャンネル構成の光学特性変化により光学的に検出されてもよい。これは、表面からの反射率または透過率検出として構成される。ここで、入射光は、空のチャンネルから反射されそして満たされたチャンネルを透過し、したがって検出した反射光または透過光に明確なシフトを生じる。
計量チャンバの入力および出力は、計量チャンバの容量に比較してほんの少量の液体容量を収容するための狭いチャンネルによって形成されることが好ましい。その結果、チャンネル中の容量計量手段(例えば光学反射率検出)の実際の配置は、容量計量手段の測定値の正確性に実質的に影響しない。
混合チャンバまたは収集チャンバが容量計量チャンバを構成してもよい。しかし、容量計量手段(例えば光学反射率検出)の配置を容易にする独立の容量計量チャンバを提供することが好ましい。
容量計量手段は、計量チャンバ中の液体が、容量計量チャンバの各自レベルにまたはそれより上にある時を検知するように配置されてもよい。
容量計量手段は、液体のレベルが各自計量手段が液体で満たされているかまたは満たされていないようなレベルである時を検知するために使用してもよく、したがって固定容量の液体がオリフィスを通過したその期間の始めおよび終わりを決定するために働いてもよい。例えば、粒子特徴付けは、液体のレベルが計量手段のレベルを超えてちょうど上昇するときに始まり、液体のレベルが第2の計量手段を超えてちょうど上昇するときに終了してもよい。この期間の間にオリフィスを通過する液体の容量は、各自計量手段の分離によって規定される。
規定容量の液体の通過の終点が、1つのチャンバがオリフィスのレベルの下まで事実上空になることである場合、収集チャンバおよび混合チャンバのそれぞれ(または少なくとも液体が去るチャンバ)は、チャンバ高のオリフィスより上の実質的部分にわたるチャンバの横断面積より実質的に小さいオリフィスレベルでの横断面積を有することが好ましい。
図1は、本発明に従う使い捨てカートリッジの構成要素の側断面図である。
図2は、フロースルーセンサ概念を概略的に説明する。
図3は、使い捨てカートリッジ、ドッキングステーションおよび読み取り器を有する、本発明に従う装置を概略的に説明する。
図4は、実施例1で得られた結果のプロットである。
図5は、実施例2で得られた結果のプロットである。
図6は、実施例3で得られた結果のプロットである。
図7は、実施例4で得られた結果のプロットである。
図8は、実施例5で得られた結果のプロットである。
図9は、本発明の実施形態に従うオリフィスを有する膜の製造を概略的に説明する。
図10は、本発明の別の実施形態に従うオリフィスを有する膜の製造を概略的に説明する。
図11は、本発明に従って製造された膜オリフィスの断面を示す。
実施例1−ポリマービーズの採寸
電解質に懸濁された5μm粒子と10μm粒子との混合物を、図3に示した装置のオリフィスを通して吸引した。検出した粒子数および検出した各粒子のサイズを記録した。検出した粒子サイズの二峰性分布が図に明らかに見られる。
実施例2−赤血球細胞のカウント
血球の測定を行ない、結果を図5に示す。赤血球細胞は、図5から理解できるように、通常、直径が1〜7μm付近であり、全血中に最大頻度で存在する。分布は、期待されたように、ガウス曲線である。血球カウントは臨床診断に用いることができる。血液学のとって基本パラメータと考えられる("Fundamentals of Clinical Haematology", Stevens, W.B. Saunders Company, ISBN 0-7216-4177-6を参照)インピーダンス測定により赤血球、白血球および血小板をカウントすることはかなり簡単である
実施例3−すべての血球を保存するように選択した試薬組成物を含む希釈剤を使用する白血球細胞カウント
材料
本発明に記載するような機能を含むカートリッジおよび装置
塩化ナトリウム 7.9g/L、塩化カリウム 0.4g/L、リン酸水素二ナトリウム 1.9g/L、リン酸二水素ナトリウム 0.2g/L、2ナトリウム−EDTA 0.4g/Lおよびフッ化ナトリウム 0.3g/Lを含む、Isoton, Beckman Coulter(製品番号24655)
Vacutainer(K3E, Becton & Dickinson, 製品番号367652)
Bayer, ADVIA-120装置
手順の完全な流れは以下のとおりである:
− Vacutainerチューブに静脈血サンプルを収集
− 沈降プロセスを進行させるために3時間サンプルを放置
− バフィコート区分の大部分が含まれる血漿相を抽出
− 白血球の含有量についての比較値を得るためにBayer Advia 120装置を使用して分析を実施
− 検査リグ(test rig)のチャンバに希釈剤として5.00mlの等張溶液を添加
− チャンバに10.0μlのサンプルを添加
− チャンバで液体を混合
− コンピュータで検査シーケンスを開始(くみ上げを開始しサンプリングを準備)
− 液体が第1のレベルの電極に達したときにサンプリングを開始
− 液体が第2のレベルの電極に達したときにサンプリングを停止
− サンプリングした値をファイルに保存
− データを分析し、赤血球細胞と重複する白血球の減算を含む計算法を使用して結果を計算するために「pulse-viewer」を使ってファイルを開く。
Bayer Advia-120: 11.96×109 白血球/L
検査リグ: 11.92×109 白血球/L
正確性の差: (11.96−1.92)/11.96=0.33%
実施例4−赤血球細胞を主に溶血するように選択した試薬組成物を含む希釈剤を使用する白血球細胞分離
材料
本発明に記載したような機能を含むカートリッジおよび装置
塩酸プロカイン 0.10g/L、1,3-ジメチロール尿素 0.90g/L、N−(1−アセトアミド)イミノ2酢酸 1.28g/L、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド 7.51g/Lおよび塩化ナトリウム 0.03g/Lを含む希釈剤
Vacutainer(K3EDTA, Becton & Dickinson, 製品番号367652)
手順の完全な流れは以下のとおりである:
− Vacutainerチューブに静脈血サンプルを収集
− 沈降プロセスを進行させるために3時間サンプルを放置
− バフィコート区分の大部分が含まれる血漿相を抽出
− 検査リグのチャンバに上記のような2.000mlの希釈剤を添加
− チャンバに4.0μlのサンプルを添加
− チャンバで液体を混合
− コンピュータで検査シーケンスを開始(くみ上げを開始しサンプリングを準備)
− 液体が第1のレベルの電極に達したときにサンプリングを開始
− 液体が第2のレベルの電極に達したときにサンプリングを停止
− サンプリングした値をファイルに保存
− データを分析し、結果を作成するために「pulse-viewer」を使ってファイルを開く。
図6のヒストグラムで理解できるように、白血球に対応する粒子集団は、赤血球細胞の非存在下で容易に同定される。
実施例5−体性細胞のカウント
乳質は、農家、日々の生産者および消費者にとって重要である。農家は、特定の質の乳汁を配達しなければならない。質は、いわゆる体性細胞カウント(SCC)により制御される。乳質の検査において、乳汁中の体性細胞は感染(臨床乳腺炎)を決定するためにカウントされる。日々の再販には、農家は、400,000細胞/mlの限度を満たさなければならない。飼料の変化、ストレスまたは乳腺炎は、より高いSCCレベルを導き、したがって乳質を低下させ、結果的には単位容量あたりの価格を低下させる。安価な細胞カウンタは、農家や日々の生産者がSCCレベルをモニターするのを助けるであろう。
好ましくは、レーザ100はUVレーザであり、例えば、その優秀なレーザ切断の正確性のために、150nm〜350nmの範囲の波長を有するエキシマレーザである。
本発明に従うレーザ切断によるオリフィス59を有するポリマー膜91の製造は、インピーダンス粒子カウントおよび/採寸のための、精密機械加工したオリフィス59を有する膜91の安価で迅速な製造を提供する。
高エネルギーレーザスポット104は、スポット104の集束領域で材料の蒸発または削磨を引き起こす。エキシマレーザ100のレーザスポット104は、数マイクロメートルに集束されてもよく、これにより本発明に従う所望の正確性を提供する。
図9に示される実施形態では、レーザ100は従来のドリルのように使用される。すなわち、集束させたレーザスポット104は、オリフィスの所望の位置のままで、オリフィス59は、一連のレーザパルスにより作製される。
好ましくは、丸められたエッジ56の曲率半径は、オリフィス59の直径の1/4に相当する。
3 混合チャンバ
4 フロースルーセンサ
5 収集チャンバ
6 容量計量チャンバ
7 チャンネル
8 血液サンプル
10 空洞
11 液体希釈剤
12 接続チャンネル
13 接続チャンネル
34 電極
35 電極
58 粒子
59 オリフィス
60 検知区域
61 電極、外部端子
62 電極、外部端子
63 基底壁
64 バネ付電気コネクタ
65 バネ付電気コネクタ
66 ドッキングステーション
67 接続ポート
68 導管
69 シール
70 基部、基底壁
71 周囲側壁
72 真空ポンプ
73 ライン
85 ハウジング
90 穴
91 膜
Claims (6)
- 液体中に懸濁された粒子を特徴付けるためのインピーダンス細胞採寸カートリッジであって、
前記液体進入のための、ハウンジングの外側表面に穴を有するハウンジングを備え、
前記ハウジングは、前記粒子のインピーダンス測定のために混合チャンバと収集チャンバとの間の前記粒子の通過のためのオリフィスを含むポリマー膜によって分離された混合チャンバ及び収集チャンバを有し、
前記カートリッジは、前記ハウジング内で移動可能に位置するサンプリング部材を備え、
前記サンプリング部材は、少量で精密な容量の液体を毛細管引力により受容し、保持するための空洞を有し、
前記サンプリング部材の第1の位置において、前記空洞は、記空洞内への液体サンプルの毛細管引力による進入のために穴と連通し、前記サンプリング部材の第2の位置において、前記空洞は、前記混合チャンバ内への前記液体サンプルの放出のために前記混合チャンバと連通し、
オリフィス径が30μmから75μmまでの範囲であって、同時にただ1つの前記粒子が前記オリフィスを通過される大きさに設計され、これにより、前記インピーダンス測定により前記粒子の数及び粒子サイズが検出可能にされ、
前記オリフィスの内部表面の表面粗さが0μm〜5μmの範囲であり、これにより前記オリフィスの中心部に実質的に均質な電界が提供され、
前記オリフィスは、前記オリフィスのエッジ付近を通って進入する粒子が歪んだパルスを生じさせないように、前記ポリマー膜の一方の側に角を丸められたエッジを有し、該丸められたエッジの曲率半径が前記オリフィス径の1/4に実質的に等しく、これによりオリフィス進入口での電界の乱れが最小になり、更に前記オリフィスの中心部に実質的に均質な電界が提供されることを特徴とするインピーダンス細胞採寸カートリッジ。 - 前記オリフィス径は、50μmであることを特徴とする請求項1に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
- 前記オリフィスの長軸に沿った前記オリフィス径の偏差が±1%〜±10%の範囲にわたり、これにより前記オリフィスの中心部に実質的に均質な電界が提供され得ることを特徴とする請求項1または2に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
- 前記オリフィスの最も大きい断面直径は、50μmであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
- 前記オリフィスの長さは、1μmから1000μmまでの範囲にわたり、例えば約50μmに等しいことを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
- 前記オリフィスの長さは、50μmに等しいことを特徴とする請求項5に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
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