JPH03503171A - 抗菌薬及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 び　　の 本発明は、例えば白血球サブ集団を含む血液細胞の計数及び大きさの測定に特に 適した血液希釈方法及び血液希釈剤における抗菌薬及びその使用に係る。

特に血液分析を例として本発明を説明する。

血液の分析データは健康及び安寧の指標として特に重要である。血液細胞集団は 医学的な状態変化に速やかな応答を示すので、血液細胞集団の分析は診断及び治 療のための有用な情″報を与える。

多くの分析方法は基本細胞の細胞容積の規則性に依存する。循環血液中の各種細 胞はそれ自体の特性容積を有し、小さいものは血小板の２立方μから大きいもの は多形核細胞の４５０立方μの範囲である。血液細胞及び関連成分の測定を容易 に且つ迅速に行なうために自動血液分析装置が開発された。かかる測定値の例は 、白血球数（ＷＢＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）、血小板数（ＰＬＴ）、ヘマトクリ ット（ＩＩＴｃ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、平均小体容積（ＭＣＶ）、平均小 体ヘモグロビン（ＭＣＩ（＞、平均小体ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、並びに 、リンパ球、単球、顆粒球のごとき−ＢＣサブ集団である。

自動血液分析装置で血液細胞数を測定する前に、血液をある濃度に希釈する。希 釈剤は、導電性の電解溶液を生じる化学塩の安定な水溶液から成り、この水溶液 に血液サンプルを添加し、測定、計数及び評価すべき、赤血球、白血球、血小板 並びにその他の血液成分を希釈し得る０例えば、米国特許第４，２１３，８７６ 号、第４，２４４，８３７号、第４，５２１，５１８号及び第４，７４５，０７ １号参照。

自動血液分析装置または別の分析方法（手動語微鏡観察を含む）によって血液を 分析する際、希釈剤が分析中の血液細胞の化学的及び物理的な完全性（ｉｎｔｅ ｇｒｉｔｙ）に不利な影響を与えないことが必須である０例えば、血液希釈剤が 等強性でなく血液に対して浸透圧平衡でないとき、血液細胞は膨張または収縮す るであろう、希釈剤が血液分析自体に不利な影響を与えないことが重要である。

また、血液分析の支障になる粒子を希釈剤から除去しておかなければならない０ 粒径０．２μより大きい粒子を除去するために通常は製造の際に希釈剤をｒ遇す るが、希釈剤は、希釈剤の製造及び包装後に増殖する微生物の支持体になり易い 、微生物が存在すると不正確で再現性のない結果が得られることになる。

慣用としては、微生物の増殖を抑制するために血液希釈剤に抗菌薬を混入してい る。抗菌薬は希釈剤の他の成分と同様に、血液細胞に不利な影響を与えたりまた は分析に不利な影響をあたえたり分析の支障となったりしてはならない。従って 、血液希釈剤中の抗菌薬の存在は望ましいが、その選択及び使用は慎重でなけれ ばならない。

血液希釈剤中に長年使用されてきた抗菌薬はナトリウムアジドである。しかしな がらこの物質の使用には問題がなくはない、第一に、ナトリウムアジドの存在が 、血液サンプル中のヘモグロビン決定用の色原体シアンメトヘモグロビンの形成 に影響を与えることが知見された。例えば、希釈剤中にナトリウムアジドが存在 しないときに測光法で測定されるヘモグロビンは、アジドが存在するときの測定 値とはかなり異なる。第二に、ナトリウムアジドの水溶液は極めて有毒である（ １〜６の６段階毒性基準で毒性レベル６）。

にｏｓｓｅｌｉｎ他（ｅｄｓ、）、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　 ｏｆ　ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＰｒｏｃｌｕｃｔｓ、　Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ 　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。

５ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　１９８４（Ｓｅｃｔｉｏｎ　Ｕ　Ｄ、　Ｐｏ５ｉｔ ｉｏｎｌｌｌ　）参照。最後に、銅または鉛を含む下水系にナトリウムアジドを 廃棄すると重金属アジドが形成され長年のうちには蓄積するであろう。

血液希釈剤中の抗菌薬としてナトリウムアジドの代替物質が必要とされるにもか かわらず、少数の代替物質しか提案されていない、ナトリウムアジドを別の保存 剤で代替することも提案され、その代表例は米国特許第３，９６２，１２５号及 び第４，１０２，８１０号である。これらの特許では抗菌薬として２−フェノキ シエタノールを使用する。

しかしながらフェノキシエタノールの使用にも難点がある。第一に、フェノキシ エタノールはかなり弱い抗菌薬である。ヒドロキシベンゾエートのごとき別の保 存剤と併用されたときにはより有効であることが知見された０Ｍａｒｔｉｎｄａ ｌｅ、ｔｈｅ　　Ｅｘｔｒａ　　Ｐｈａｒ＋＊ａｅｏｐｏｅｉａ（２７ｔｈ　　 ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｈｅ　　Ｐｂａｒｖａｃｅｕｔｉｅａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌ ｏｎｄｏｎ、　１９７７、　ｐ、１２８１）、第二に、ナトリウムアジドより毒 性は弱いがフェノキシエタノールもやはり有毒である（６段階毒性基準の毒性レ ベル４）、　Ｇｏｓｓｅｌｉｎ他、上掲（Ｓｅｅｔｉｏｎｌｌ　Ｄ、　ｐｏｓｉ ｔｉｏｎ４６３）参照、最後に、米国特許第３，９６２４２５号及び第４，１０ ２，８１０号においては、ヘモグロビン色原体形成を促進するために、提案され た希釈剤中にフェノキシエタノールと共にフッ化ナトリウムを含むことが必須で ある。フッ化ナトリウムの毒性はナトリウムアジドよりもやや弱いだけである（ 毒性レベル４〜５）、　Ｇｏｓｓｅ−１ｉｎ他、上掲に６ｃｔｉＨＩｒ［１，ｐ ｏｓｉｔｉｏｎｌｏｏ）参照。

米国特許第４，２４８，６３４号ではナトリウムアジドを別の保存剤で代替する ことが提案され、抗菌薬としてデヒドロ酢酸ナトリウムを使用している。殺真菌 薬であるデヒドロ酢酸ナトリウムは高い薬用量では有毒であるが、その毒性はナ トリウムアジド、フッ化ナトリウム及びフェノキシエタノールよりも弱い（毒性 レベル３）、　Ｇｏｓｓｅｌｉｎ他、上掲（Ｓｅｃ−ｔｉｏｎＩ［Ｄ、　ｐｏｓ ｉｔｉｏｎ　１１８７）参照。

従って、本発明の目的の１つは、効力を有しながら廉価で好ましくは無毒性の汎 用生物殺傷剤（ｂｉｏｃｉｃｌａｌ　ａｇｅｎｔ）を提供することである。

本発明の別の目的は、血液分析の支障にならない血液希釈剤用抗菌薬を提供する ことである。

本発明の更に別の目的は、効力を有しながら比較的無毒な血液希釈剤用抗菌薬を 提供することである。

上記以外の本発明の目的及び利点は添付図面に基づく以下の記載より明らかにさ れるであろう。

本発明は、有効濃度、典型的には約０．０２ｇ７１〜１．ｈ＃のＥＤＴ＾を含有 する抗菌薬、例えば靜真菌薬及び／または抗真菌薬を提供する。好ましくは抗菌 薬が更に、有効濃度、典型的には約０．０２ｇ＃〜０．５ｇ／ｌのフッ化ナトリ ウムを含有する。

本発明の抗菌薬は血液希釈剤の形態にできる。

本発明はまた、 （ａ）真菌殺傷及び／まなは真菌静止に有効な濃度のＥＤＴ＾（及び好ましくは 同じく有効濃度のフッ化ナトリウム）を含有する希釈剤で血液サンプルを希釈し 、 （ｂ）細胞サブ集団の細胞数及び／または大きさを測定する段階を含む血液サン プル中の細胞サブ集団の細胞数及び／または大きさを測定する方法を提供する。

本発明はまた、好ましくはフッ化ナトリウムと併用されたＥＤＴ＾の汎用的な用 途、即ち抗菌薬、抗真菌薬または靜真菌薬としての使用を包含する。

従って本発明は一般的に、ＥＤＴ＾を含有するかまたはＥＤＴ＾とフッ化ナトリ ウムとを含有する抗菌薬及び／または靜真菌薬、並びにその使用及びその用法を 提供する。好ましい実施態様によれば本発明は、血液希釈方法、血液希釈剤、及 び血液希釈剤中で使用するための抗菌薬または試薬を提供することを目的とする 。より一般的には本発明は、抗菌試薬としてＥＤＴ＾を単独使用するかまたはフ ッ化すトリウムと併用することによって例えば滅菌のための微生物殺傷法を改良 する。より特定的には本発明は抗菌試薬及び／または靜真菌試薬としてＥＤＴ＾ を単独使用するがまたはフッ化ナトリウムと併用することによって、浸透圧平衡 した溶液に希釈した血液サンアル中の細胞または細胞サブ集団数及び／または大 きさを測定する方法を改良する。

本発明の血液希釈剤は一般に、適当なｐｎに調整された有機バッファと、細胞安 定化剤と、導電率、イオン強度及び浸透圧を調節する無機塩とを含み、また抗菌 薬としてＥＤＴ＾を単独で含有するか、または抗菌試薬として作用するＥＤＴ＾ とフッ化ナトリウムとの混合物を含有する。

第１八図、第１Ｂ図及び第１Ｃ図は、抗菌薬非含有の標準希釈剤を用い自動血液 分析装置で分析した細胞数対細胞容積を示すピストグラムである。

第２八図、第２Ｂ図及び第２Ｃ図は、抗菌薬と１７てフッ化ナトリウムだけを含 有する標準希釈剤を用い自動血液分析装置で分析しな細胞数対細胞容積を示すヒ ストグラムである。

第３八図、第３Ｂ図及び第３Ｃ図は、本発明の希釈剤の１つの実施例を用い自動 血液分析装置で分析した細胞数対細胞容積を示すヒストグラムである。

第４Ａ図、第４Ｂ図及び第４Ｃ図は、本発明の希釈剤の第２の実施例を用い自動 血液分析装置の細胞数対細胞容積を示すヒストグラムである。

本発明の１つの実施態様では、血液サンプル中の血液細胞の集団及びサブ集団の 分化を分析するために希釈剤中で使用される抗菌薬が提供される。常用手順では かがる分析が、自動血液分析装置例えば５ｅｑｕｉｏａ−Ｔｕｒｎｅｒ　ＣＥＬ Ｌ−ＤＹＮ２０００血液分析装置を製造業者の指示通りに使用して行なう。

勿論本発明の希釈剤は、希釈剤の多目的使用に適した特性、即ち細胞に対するそ の他の分析方法（例えば手動顕微鏡観察）にも有用な特性を有する。

上記のごとく、微生物の増殖を抑制するために血液希釈剤中に抗菌薬を含有させ ることは常用の処置である。後述する実験で対照として使用した希釈剤（以後「 対照希釈剤」と呼ぶ）は、抗菌薬として１−ヒドロキシピリジン−２−千オンを 含有しており、米国特許第４，７４５，０７１号に記載の組成を有する。該米国 特許の記載内容は本発明に包含されるものとする。対照希釈剤は、自動血液分析 装置例えば５ｅｑｕｉｏａ−Ｔｕｒｎｅｒ　ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　２０００血液分 析装置を用いた血液細胞集団の分析に広く使用されて成果を上げている。しかし ながら、対照希釈剤の使用中に微生物のある程度の増殖が観察された。

対照希釈剤中の微生物増殖の予備的な視覚分析によれば、増殖は細菌増殖でなく 真菌増殖であることが示唆された。

真菌増殖が存在し細菌増殖が存在しないことは、対照希釈剤１−ヒドロキシピリ ジン−２−チオンの抗菌薬が、靜細菌薬または抗細菌薬として有効であるが、靜 真菌薬または抗真菌薬としては有効でないことを示す。

本発明は、一般的な環境例えば血液希釈剤中で微生物増殖、特に真菌増殖を阻止 する０本発明で使用される血液希釈剤は、細胞安定化剤、抗菌薬、適当なｐｔｌ に調整された有機バッファ、静真菌薬または試薬（類）、並びに適当なイオン強 度及び正常細胞容積を維持する浸透圧を与える付加的なイオン成分を含有する水 溶液から成る。

本発明の希釈剤は、血液細胞分析業界で公知の種々の成分を含む溶液である０例 えば、溶媒としては、廉価で安全であり分析すべきサンプルと概して相溶性の水 の使用が普通である。

本発明の好ましい細胞安定化剤は、１．３−ジメチルウレアであり、本発明の好 ましい有機バッファはＮ−（２−アセトアミド）−２−イミノニ酢酸（＾Ｄ＾） である、これらが好ましい化金物であるが、これらの化合物に代替して、これら の化合物と等価の既知の化合物及び今後開発されるであろう化合物を使用するこ とが可能である。ＩＩ衝希釈剤を、例えば水酸化ナトリウムでｐＨ約６．９に調 整するのが好ましいが、ｐｌｌの調整に別の塩基を使用してもよく、また希釈剤 の予定の用途に実質的な支障を与えずにｐｎが少なくとも６．５〜７．５の範囲 で変動してもよい。

更に、希釈剤の浸透圧を血液細胞の正常な細胞容積の維持に適当であることがわ かっている約３２０ミリオスモル濃度に調整するために常用の塩化ナトリウムを 使用する。他の塩及び他の浸透圧レベルが可能なことは明らかである。

希釈剤に適当なイオン強度を与えるために一般には硫酸ナトリウムを使用する。

しがしながら、この特性をもつ別の化合物で代替してもよい。

本発明の抗菌薬及び／または靜真菌薬または試薬は、（１）エチレンジアミン四 酢酸（ＥＤＴ＾）を単独使用するか、または（２）ＥＤＴ＾とフッ化ナトリウム とを併用する。前者を使用する希釈剤の好ましい組成を表１に示し、混合試薬を 含有する希釈剤の好ましい組成を表２に示す。

表１ 希釈剋組處 成分　　　　　　　　　　藝匣　　　妨１基硫酸ナトリウム　　　　　　　　　 　８〜１２　　ｙ　　　　１０．ｈ塩化ナトリウム　　　　　　　　　　３〜６ ｇ　　　　４．２ｇ１．３ジメチルウレア　　　　　　　　　０．５〜３．０ｇ １．０ｇ１−ヒドロキシピリジン−２−チオン　　０．０５〜２．０ｇ　　　　 ０．１ｙＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　０．０１〜１．０ｙ　　　 　０．３ｇＡＤＡバッフ　７　　　　　　　　　　　０．５〜４．０１１　　　 １．４ｇ水酸化ナトリウム　　　　　　　　　ｐｌｌ６．９を得る量　　ｏ、ｓ ｌＦ水　　　　　　　　　　　　　　　　総量１１まで表ス 希釈剋岨或 成分　　　　　　　　　　　　　巨匠　　　　奸濃租處硫酸ナトリウム　　　　 　　　　　　８〜１２　　ｇ　　　　１０．ｈ塩化ナトリウム　　　　　　　　 　　３〜６ｇ　　　　４．２゜１．３ジメチルウレア　　　　　　　　　０．５ 〜３．０ｇ　　　　１．０゜１−ヒドロキシピリジン−２−チオン　　０．０５ 〜２．０ｇ　　　　Ｏ，１゜ＥＤＴ＾　　　　　　　　　　　　　　　０，０１ 〜ｔ、ｏ、、　　　　０．３ｇ八へ＾バ・ンファ　　　　　　　　　　　　０・ ５〜４・Ｏｇ１°４ｇ水酸化ナトリウム　　　　　　　　　ｐＨ６，９を得る量 　　０．５ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　総量１１までフッ化ナトリウ ムは優れた血液保存剤として知られている（Ｎｅｃｌ　Ｊ、＾ｕｓｔ、　１：１ ９３９．１９６８）、フッ化ナトリウムは有毒物質として分類されている（最高 段階６の毒性基準で毒性レベル４〜５）、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ他、上掲（Ｓｅｃｔ ｉｏｎ［Ｄ、ｐｏｓｉｔｉｏｎｌｏｏ）。

対照的に、単独使用されたＥＤＴ＾またはフッ化ナトリウムと併用されたＥＤＴ ＾の抗菌特性は全く知られていない、　ＥＤＴＡ自体は比較的無毒である。この 酸及びその塩の多くは金属カチオンに緊密に結合してこれらを実質的に無害にす る。

Ｇｏｓｓｅｌｉｎ他、上掲（Ｓｅｃｔｉｏｎ　ＩＩ　Ｄ、　ｐｏｓｉｔｉｏｎ１ ５０６）参照、　ＥＤＴ＾のカルシウム塩は、鉛の解毒及び腎排泄を促進するた めに静注で使用される。カルシウム誘導体（キレート）は実験動物中で低毒性を 有しく６段階毒性基準で毒性レベル２）、ニナトリウム塩はマウスで１ｇ／ｋｔ ｔより高い薬用量が許容される（毒性レベル約３）。

本発明を更に説明するために以下の実験を行なって、抗菌薬として単独使用され たＥＤＴ＾、及びフッ化ナトリウムと併用されたＥＤＴ＾の効力を、（１）自動 血液分析結果、及び（２）培養物中の微生物増殖に対する効果によって証明した 。

特に注釈がなければ、パーセント（％）記号を付した量はすべて１００ミリリツ トル（１１１）あたりのグラム（ｇ）数を示す。

他に注釈がなければ、重量はすべてグラム（ｇ）またはミリグラム（ｍｙ）で与 えられ、濃度はすべてミリモル（ｍＭ）またはマイクロモル（ｐＨ）で与えられ 、容積はすべてリットル（１）またはミリリットル（Ｉｌｌ）で与えられる。

Ｉｌｌ毘 え１燵り 自動血液分析装置（ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　２００００血液分析装置、５ｅ−ｑｕｏ ｉａ−Ｔｕｒｎｅｒ　Ｃｏｒｐ、、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅ＠、　Ｃａ１ｉ ｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示通りに使用し、血液サンプルの白血球（ＩＩＩ ＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）及び血小板（ＰＬＴ）の集団の分析並びに−ＢＣサブ 集団の分析を常用の手順で行なった。

第１図から第４図は血液細胞の集団及びサブ集団の分化の分析に対して本発明希 釈剤の抗菌薬が与える効果を示す。

ＲＢＣとＭＢＣとの細胞容積がかなりオーバーラツプするので、双方が存在する ときに大きさの違いに基づいて一方だけを計数することはできない、従って、本 発明の希釈剤は溶血試薬（Ｉｙｔｉｃ　ｒｅｃｅｎｔ）に対しても希釈剤として 作用する。

米国特許第４，７４５，０７１号に記載のごとき標準的溶血試薬及び溶血方法を 使用して各集団を別々に分析する。該特許の記載内容は本発明に含まれるものと する。

ＷＢＣをＲＢＣから分離する溶解段階後に、ＭＢＣサブ集団を観察し得る。　Ｗ ＢＣサブ集団のキャラクタライゼーションは当業界で公知である０例えば米国特 許第４，４８５，１７５号参照。

細胞を大きさに基づいて再度分画する。このようにして、多くの場合３つのサブ 集団を同定し得る。これらの３つのサブ集団は、（小さい順に）リンパ球、単球 及び顆粒球から成る。−粗球は好中球、好酸球及び好塩基球を含む不均一なグル ープである。

血液細胞の集団及びサブ集団のキャラクタライゼーションは病理状態の同定に極 めて有用である。病理状態は血液細胞プロフィルに少なくとも３種の変化を生じ させる。第一に、存在する集団及び／またはサブ集団の大きさが変化する（例え ば１４ＢＣが大きくなる）、第二に、存在する気団またはサブ集団の正常な大き さの細胞数が変化する（例えば単球が増加する）、最後に、全く異なる集団また はサブ集団が発生する（例えば前骨髄細胞が出現する）。

第１八図は、表１の好ましい組成からＥＤＴ＾を除去した希釈剤を用いたときに 分析装置で得られたＭＢＣのヒストグラムを示す、３つのＭＢＣサブ集団を同定 できる。リンパ球サブ集団ピーク（１０）は平均細胞容積約６２立方μを示す、 単球すプ集団（１１）は細胞の大きさが約８０〜１８０立方μの範囲である。Ｗ Ｉ粒粒寸サブ集団ピーク１２）は平均細胞容積約３２０立方μを示す、細胞スト ローマ（１３）のレベルが比較的低いことに注目されたい。

第１Ｂ図は、第１八図と同じ希釈剤を使用したときのＲＢＣのヒストグラムを示 す、ＲＢＣ集団ピーク（１４）の平均細胞容積は約８６立方μである。ヒストグ ラムは、急激に上昇して緩慢に下降するこのピークだけを有する。

第１Ｃ図は、第１八図及び第１Ｂ図と同じ希釈剤を使用したときのＰＬＴのヒス トグラムを示す、　ＰＬＴ集団ピーク（１５）の平均細胞容積は約７立方μであ る。

第２八図から第２Ｃ図は、単独使用されたフッ化ナトリウムが分析に与える影響 を評価するように設計された実験の結果を示す６表２の好ましい組成からＥＤＴ ＾を除去した希釈剤を使用する。フッ化ナトリウムが微生物の増殖阻止に使用で きることが期待されていた０期待に反して、フッ化ナトリウムの添加はリンパ球 サブ気団のピーク（２０）を第１八図の（対照希釈剤の）ＷＢＣ集団ビーク（１ ０）に比較して右にシフトさせた。平均細胞容積は約８５立方μである。従って 、リンパ球サブ集団ピーク（２０）が単球サブ集団（２１）の範囲に侵入する。

更に、ストローマ（２３）のレベルが許容不可能な程度まで劇的に増加する。第 ２Ｂ図によれば、ＲＢＣ集団ピーク（２４）の位置は変わらない、また第２ｃ図 によれば、血小板集団ピーク（２５）が明らかに左にシフトしていることが観察 される。

第２八図から第２Ｃ図の結果より、単独使用されたフッ化ナトリウムは、ＷＢＣ サブ集団間のオーバーラツプを生じさせるので分析の支障になることが明らかで ある。前述のごとく病理状態の同定は、正常な血液細胞パラメータの変化を検出 できる能力に依存しており、ＷＢＣサブ集団間のオーバーラツプはかかる同定の 支障となる。

フッ化ナトリウムは単独で使用されると微生物増殖の問題を解決できないことが 明らかである。しかしながら、以後の実験によって、フッ化ナトリウムは特定組 成の希釈剤中で使用されると微生物増殖の阻止に使用できることが判試験中に、 フッ化ナトリウムによる支障の除去が可能であることが判明した。

第３Ａ図から第３Ｃ図は、ＥＤＴ＾の存在下にフッ化ナトリウムを使用した実験 の結果を示す、希釈剤は表２の好ましい組成の希釈剤である。第３Ａ図は、ＥＤ Ｔ＾の存在下ではフッ化ナトリウムを添加してもリンパ球サブ集団ピーク（３０ ）が単球サブ集団（３１）の範囲に侵入しないことを示す、リンパ球ピーク（３ ０）の平均細胞容積は約６１立方μである。細胞ストローマ（３３）のレベルは 極めて低い、第３Ｂ図（ＲＢＣｉ団ピーク（３４）及び第３Ｃ図（血小板ピーク （３５））はいずれも変わらない。

この意外な結果に基づいて以後の実験を続けた。以後の実験では、表２の好まし い組成を有しＥＤＴ＾の濃度一定（０，３ｉｙ＃）の希釈剤に種々の濃度（０， １ｚｇ／ｊ！〜０．５ｉ＋ｇ＃’）のフッ化ナトリウムを添加したものを使用し た０分析の妨害は全く観察されなかった。

単独で使用されたＥＤＴ＾の効果の有無を第４八図から第４Ｃ図で示す、サブ集 団ピーク（４０）が第１＾図の対応ピーク（１０）から変化せず平均細胞容積が 約６０立方μを示す好ましい希釈剤が得られた。また、第４Ｂ図（ＲＢＣ集団ピ ーク（４４））及び第４Ｃ図（血小板ピーク（４５））も変わらない。

機上ＪＩＬ 夾差１」工 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、 　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａで行なった培養実験で微生物増殖を評価した。　ＥＤＴ ＾及びフッ化ナトリウムの濃度以外は表２に等しい組成の希釈剤からサンプルを 採取しな、　ＭｃＧｉｍｉｓ、岬１旦息」μ■−１すｊシラ上２汀−Ｍｅｄｉｃ ａｌ　Ｎ　ｃｏ！ｏ　　、＾ｅａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８０．　ｐ、 ７４〜７７に従って、５ａｂｏｕｒａｎｄ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　ａ、ｎｃｌ　Ｍ ｙｃｏｓｅｌ傾斜培地に真菌類増殖用培養物を接種してインキュベートした。従 ってこの方法は、「直接培養（ｄｉｒｅｃｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ）」である。

更に、サンプルをチオグリコラートブイヨンに接種した。

チオグリコラート中で増殖が観察されると、ブイヨンがち採取したサンプルを５ ａｂｏｕｒａｕｄ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　ａｎｄ　Ｍｙｃｏｓｅｌ傾斜培地に「継 代培養」として接種した。

増殖が酵母であると推定されるときは、酵母同定のための標準法で処理した。増 殖が真菌類であると推定されるときは、増殖するコロニーの形態を観察し、ｉ１ 見す１とｌ」蝕−ｔｈｏｃｊｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍ　ｃｏｌｏ　　、　 ＩＩｓ　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　ＨＥＮ、　ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉ ｃｅ、　ＣＤＣ，Ｊｕｎｅ　１９７８．　ｐｐ、２９〜３０に従って、ラクトフ ェノールコドン前液法（Ｌａｃｔｏｐｈｅｎｏｌ　Ｃｏｔｔｏｎ　Ｂｌｕｅｐｒ ｅｐ）を用い、スライド培養を行なった。スライド培養では、ラクトフェノール コドン前液のカバースリップを静かに着脱して真菌類の子実体を観察することが できる。フード下方で、コーンミール寒天平板から切り出した２つの方形切片（ ｓｑｕａｒｅ　ｐｌｕｇ）を滅菌した木製ピンで同じ寒天平板の表面に載せる。

未知の真菌類コロニーの一部を同じく滅菌した木製ビンで方形切片の方形「開口 」の内部及び上縁に置く、菌を接種した２つの方形切片の各々をガラスカバース リップで覆い、寒天平板を３０℃でインキュベートする。

十分な増殖後、方形「開口」の内縁に子実体が存在するか否かを検査するために 寒天平板の裏面を観察する。

これらの微生物試験の結果を表３に示す（ＥＤＴ＾及びフッ化ナトリウムの濃度 だけを示す）。

襄１」Ｌ１０旧ＪＬ１ １艷股１炙　　　　　　【１１１俣虹江　ｌえ１１（ト）虹１０．０ｇ／ｆｆ１ ＥＤＴ＾＋Ｏ，Ｏｇ／ｊ！ＮａＦ　ＰＡＥＣＩＬＯＭＹＣＥＳ　　　ＰＡＥＣＩ ＬＯＭＹＣＥＳＯ，３ｔｔ／ＩＥＤＴ＾＋Ｏ，Ｏｙ／ｊ’ＮａＦ増殖無し　　　 　ＰＡＥＣＩＩ、０ＮＹＣＥＳＯ，３ｇ／ＩＥＤＴ＾＋０．１ｙ／ＩＮａＦ増殖 無し　　　　ＰＡＥＣＩＬＯＭＹＣＥＳＯ，３ｇ＃ＥＤＴＡ十０．２ｇ／ｊ！Ｎ ａＦ増殖無し　　　　ＰＡＥＣＩＬＯ１４ＹＣＥＳＯ，３ｇ／ｌ’ＥＤＴＡ十０ ．３ｇ／ｊ！ＮａＦ増殖無し　　　　ＰＡＥＣＩＬＯＮＹＣＥＳＯ，３ｇ＃！Ｅ ＤＴ＾＋０．３ｙ＃ＮａＦ増殖無し　　　　増殖無しこれらのデータより、希釈 剤に抗菌薬として１−ヒドロキシピリジン−２−千オン（０，１ｇ＃’）だけを 配合すると、微生物が増殖することが明らかである。３０℃で７日間培養すると き、主な微生物はＰａｅｃ辻姐ｇである。

表３の最も意外な結果は、（１）ＥＤＴ＾の単独使用及び（２）ＥＤＴ＾とフッ 化ナトリウムとの併用の双方が直接培養物中での増殖阻止に有効なことである。

血液希釈剤としてまたはその他の用途で、ＥＤＴ＾の抗菌性はこれまで言及され たことがなかっただけにこの結果は意外である。

表３のデータによれば、継代培養では異なる増殖レベルが測定される。この理由 は恐らく、希釈剤がチオグリコラートに導入されたときに抗菌薬の濃度が低下し た（１５ｚｊｉ中に１ｍ１）ためである、　ＥＤＴ＾とフッ化ナトリウムはより 高い濃度で併用されると継代培養物中の増殖阻止に有効であることに注目された い。

表３の結果に基づいて、より高い濃度のＥＤＴ＾及びフッ化ナトリウムによる増 殖阻止試験を継続した。血液分析に不利な影響を与えないＥＤＴ＾及びフッ化ナ トリウムの有効濃度は、 ＥＤＴ＾（０，０２ｔ／ｌ〜１．０ｙ／ｉ’）フッ化ナトリウム（０，０２ｇ７ １〜０．５ｇ＃）であることが判明した。

従って本発明は、血液を浸透圧平衡溶液中に希釈した血液サンプル中の細砲の集 団及びサブ薬面の細胞数及び大きさを決定するための新規な改良された方法を提 供することが理解されよう０本発明はまた、血液分析に支障のない血液希釈剤用 抗菌薬を含有する新規な血液希釈剤、即ち、効力があり比較的無毒で廉価な希釈 剤を提供する。

記載の実施例、特に実施例２は、単独使用される有効濃度のＥＤＴ＾及びフッ化 ナトリウムと併用される有効濃度のＥＤＴ＾が、汎用性があり特に血液希釈剤と して有用なこれまで知られなかった抗菌薬及び／または靜真菌薬を与えることを 証明する。

本発明の実施においては、本文中に記載の方法及び材料の種々の変更が可能であ ることは理解されよう１本発明は請求の範囲によって定義されており、請求の範 囲の材料及び方法ならびにそれらと等価の材料及び方法は本発明の範囲に包含さ れる。

浄書（内容に変更なし） 手続補正′！″□ 黴 特許庁長官植　松　敏　殿　　　　　　　　　　平成３年４月２４日１、事件の 表示　　　ＰＣＴ／ＧＢ　　８９１０１４２１、発明の名称　　　抗菌薬及びそ の使用３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　　　　　ユニリーバ−・ナームローゼ・ペンノートシャープ４、代　理　 人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正命令の日付　平 成３年４月１６日６、補正の対象　　　図面の鉢μ文 ７、補正の内容 （１）適正な図面の翻訳文を別紙の通り補充する。（内容に変更なし）国際調査 報告 １＋ｔｌｅｍａ１ｍｖｌＡＩＮｔ＃ＩｍＭｐ（７〒ｉｒ１／ｌ’ＪＩＲ’１７０ １４２１１″゛〜ｊｌｌｌ１ＭＩ　Ａ″に′□　”ｍ−ｔｎ真　ＱＱ１０１４フ １国際調査報告 ＧＢ　８９０１４２１ ＳＡ　　　　３２９８６

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．有効濃度のＥＤＴＡを含む抗菌薬。
2. ２．有効濃度のＥＤＴＡを含む静真菌及び／または殺真菌薬。
3. ３．真菌殺傷及び／または真菌静止に有効な濃度のＥＤＴＡを含む血液希釈剤。
4. ４．ＥＤＴＡが濃度約０．０２ｇ／ｌ〜１．０ｇ／ｌの範囲で存在することを特 徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の抗菌薬、静真菌及び／または殺 真菌薬または血液希釈剤。
5. ５．有効濃度のＥＤＴＡとフッ化ナトリウムとを含む抗菌薬。
6. ６．有効濃度のＥＤＴＡとフッ化ナトリウムとを含む静真菌及び／または殺真菌 薬。
7. ７．真菌殺傷及び／または真菌静止に有効な濃度のＥＤＴＡとフッ化ナトリウム とを含む血液希釈剤。
8. ８．ＥＤＴＡが濃度約０．０２ｇ／ｌ〜１．０ｇ／ｌの範囲で存在しフッ化ナト リウムが濃度約０．０２ｇ／ｌ〜０．５ｇ／ｌの範囲で存在することを特徴とす る請求項５から７のいずれか一項に記載の抗菌藥、静真菌及び／または殺真菌薬 または血液希釈剤。
9. ９．（ａ）真菌殺傷及び／または真菌静止に有効な濃度のＥＤＴＡを含有する希 釈剤で血液サンブルを希釈し、（ｂ）細胞サブ集団の細胞数及び／または大きさ を測定する段階を含むことを特徴とする血液サンブル中の細胞サブ集団の細胞数 及び／または大きさの測定方法。
10. １０．血液希釈剤中にＥＤＴＡが約０．０２ｇ／ｌ〜１．０ｇ／ｌの濃度で存在 することを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. １１．（ａ）真菌殺傷及び／または真菌静止に有効な濃度のＥＤＴＡとフッ化ナ トリウムとを含む希釈剤で血液サンブルを希釈し、 （ｂ）細胞サブ集団の細胞数及び／または大きさを測定する段階を含むことを特 徴とする血液サンブル中の細胞サブ集団の細胞数及び／または大きさの測定方法 。
12. １２．ＥＤＴＡ濃度が約０．０２ｇ／ｌ〜１．０ｇ／ｌの範囲であり、フッ化ナ トリウム濃度が約０．０２ｇ／ｌ〜０．５ｇ／ｌの範囲であることを特徴とする 請求項１１に記載の方法。
13. １３．微生物の増殖を阻止するために希釈剤に殺真菌薬及び／または静真菌薬が 使用され、この薬がＥＤＴＡを含むことを特徴とする血液希釈剤による血液の希 釈方法。
14. １４．微生物の増殖を阻止するために希釈剤に殺真菌薬及び／または静真菌薬が 使用され、この薬がＥＤＴＡとフッ化ナトリウムとの混合物を含むことを特徴と する血液希釈剤による血液の希釈方法。
15. １５．抗菌薬、殺真菌薬または静真菌薬としてのＥＤＴＡの使用。
16. １６．血液希釈剤における請求項１５に記載の使用。
17. １７．ＥＤＴＡ濃度が約０．０２ｇ／ｌ〜１．０ｇ／ｌの範囲であることを特徴 とする請求項１５または１６に記載の使用。
18. １８．殺真菌薬または静真菌薬としてのＥＤＴＡとフッ化ナトリウムとの混合物 の使用。
19. １９．血液希釈剤における請求項１８に記載の使用。
20. ２０．ＥＤＴＡ濃度が約０．０２ｇ／ｌ〜１．０ｇ／ｌの範囲でありフッ化ナト リウム濃度が約０．０２ｇ／ｌ〜０．５ｇ／ｌの範囲であることを特徴とする請 求項１８または１９に記載の使用。