JP5118032B2 - γ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、γ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法に関し、未熟豆又はその莢を用いて、グルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物からγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物を製造する方法に関する。

γ−アミノ酪酸は、ＧＡＢＡと略称され、神経抑制作用、精神安定などの機能を有していることが分かり、最近は血圧降下作用、脳の新陳代謝促進作用、動脈硬化の予防、二日酔い防止、皮膚の活性化（シミ防止）などに効果ある物質として注目され、その開発、研究が進められている。

このγ−アミノ酪酸は、グルタミン酸脱炭酸酵素の下で、グルタミン酸から変換されることが知られている。例えば、下記の特許文献１には、食品蛋白の分解物として、乳、トウモロコシ又はカカオ豆の分解物を使用し、それに、カボチャ及び／又はキュウリの磨砕物、あるいは同カボチャ及び／又はキュウリから抽出したグルタミン酸脱炭酸酵素を作用させ、上記分解物中のグルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換した呈味改善食品素材が開示されている。

また、下記の特許文献２には、γ−アミノ酪酸を多量にすなわち１０％以上含むγ−アミノ酪酸高含有素材を簡便かつ効率的に製造する方法として、カボチャに存在する酵素によるグルタミン酸のγ−アミノ酪酸への変換反応を利用することが開示されている。
特開２０００−１６６５０２号公報 特開２００１−２５２０９１号公報

しかしながら、上記の特許文献１，２で多くの食品素材が検討された中、高効率でグルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換できる素材としては、カボチャやキュウリの発見にとどまっており、これ以上に、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸へ高効率で変換できる素材及び、緩和な条件で変換反応を可能とする素材については検討されていない。

以上のような課題に鑑み、本発明は、グルタミン酸を更に効率良くγ−アミノ酪酸に変換して、緩和な条件で変換反応を可能し、γ−アミノ酪酸を含有する組成物及び食品を製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者は、未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物が、γ−アミノ酪酸変換能が大きいとされているカボチャやγ−アミノ酪酸含量が最も多いトマトと比較して、グルタミン酸脱炭酸酵素活性が非常に高いこと、また、温度、時間、ｐＨ等の反応条件を厳密に管理することなく、効率的に、高い割合でグルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。

（１） 未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁を破壊処理してなる細胞壁破壊処理物と、グルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物と、を混合し、所定の時間保持する、γ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。

この態様によれば、未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物は、γ−アミノ酪酸変換能が大きいとされているカボチャやγ−アミノ酪酸含量が最も多いトマト等に比べて、グルタミン酸脱炭酸酵素活性が非常に高いので、未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物にグルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物を添加して、所定の時間保持することでグルタミン酸が高い割合でγ−アミノ酪酸に変換され、γ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸高含有組成物を製造することができる。

本発明は、後述実施例で示す通り、γ−アミノ酪酸変換能が大きく、厳密なｐＨ等の管理を必要とせず、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸を製造することができる。具体的には、引用文献２は、かぼちゃ１００ｇ当たり約１０〜１５ｇのグルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換しているが、本発明では、例えば枝豆莢を用いた場合、枝豆莢１００ｇ当たり約５５〜６０ｇ（後述実施例５及び１２）のグルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換することが可能である。よって、本発明は、従来技術よりも多くのγ−アミノ酪酸を製造することを可能とする。

ここで、未熟豆又は未熟豆の莢とは、未熟なうちに収穫する青果用豆類又はその莢をいう。また、細胞壁破壊処理物とは、豆又は豆莢の細胞壁が破壊される程度に破砕、磨砕等の処理が行われたものをいう。また、所定の時間とは、ある温度で添加したグルタミン酸が有意にγ−アミノ酪酸へ変換される時間をいう。添加するグルタミン酸量やその変換率、また、製造されたγ−アミノ酪酸含有組成物の目標とするγ−アミノ酪酸含量に応じて、適宜決定される。

（２） 前記未熟豆又は該未熟豆の莢は、（Ａ）枝豆又はその莢、（Ｂ）そらまめ又は該そらまめの莢、（Ｃ）さやいんげん、（Ｄ）さやえんどう、からなる群より選ばれる１種以上である（１）に記載のγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。

上記の豆又は豆莢は、グルタミン酸脱炭酸酵素活性に優れるので、γ−アミノ酪酸への変換能が高く、グルタミン酸から効率的にγ−アミノ酪酸を製造することができる。

（３） 前記細胞壁破壊処理物は、前記未熟豆又は該未熟豆の莢を破砕した破砕物、該破砕物を含む水懸濁液、該水懸濁液の分離処理物、のいずれかである（１）又は（２）に記載のγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。

この態様によれば、上記いずれの形態であっても、効率的に、高割合でグルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換することができる。未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物をγ−アミノ酪酸の変換反応に使用する場合の具体的形態としては、未熟豆又は該未熟豆の莢を細胞壁が破壊される程度に破砕、磨砕等の処理した破砕物であってもよい。また、この破砕等の処理をしたものを水等に分散させた水懸濁液であってもよい。また、この水懸濁液の分離処理物であってもよい。ここで、分離処理物とは、水懸濁液をろ過して不溶物を分別、除去した溶液、又は、未熟豆又はその莢の破砕物を水等で抽出した抽出液、未熟豆の莢の破砕物溶液を塩析し、これを脱塩し、カラム精製した溶液等が挙げられる。

（４） 前記細胞壁破壊処理物は、前記未熟豆の莢を破砕した破砕物又は該破砕物を含む水懸濁液であって、該破砕物又は該水懸濁液を水不溶性成分の除去を行うことなく用いる（１）から（３）いずれかに記載のγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。

この態様によれば、後述する実施例のように、水懸濁液をろ過したものに比べて、より高効率でγ−アミノ酪酸への変換を行うことができる。すなわち、未熟豆の莢の細胞質破壊処理物においては、水溶性成分のみならず、水不溶性成分においてもγ−アミノ酪酸への変換反応を進めることができる。

（５） ｐＨを４から８の範囲内で前記所定の時間保持する、（１）から（４）いずれかに記載のγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。

グルタミン酸がγ−アミノ酪酸に変換するγ−アミノ酪酸の変換反応は、反応液のｐＨに影響される。すなわち、反応液がｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ５．８程度であるとγ−アミノ酪酸の変換反応が促進される。したがって、未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物とグルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物とを混合し、γ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物を製造する際には、未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物のｐＨを上記の範囲に調整することで、効率的に行うことができる。

尚、この反応系では、グルタミン酸を多く添加してｐＨが４以下となっても、アルカリ溶液（例えばＮａＯＨ溶液等）でｐＨを上記範囲に調整すれば反応が進むので、より多くのグルタミン酸を添加することができる。また、反応中のｐＨ変化をあまり厳密に管理しなくても、反応が進む。

（６） 未熟豆の莢由来の水溶性繊維質と、γ−アミノ酪酸と、を含有するγ−アミノ酪酸含有組成物。

本発明のγ−アミノ酪酸高含有組成物は、水溶性繊維質とγ−アミノ酪酸とを所定の割合で含有するものである。このため、γ−アミノ酪酸の効果に加えて、水溶性繊維質の効果、例えば、整腸作用、小腸での栄養吸収を和らげて、血糖値の急な上昇を抑えたり、コレステロールを減少させるなどの効果も同時に得られる。また、一般的に廃棄処理される未熟豆の莢由来のものであるので、コストが安く、しかも資源の有効利用となる。

（７） （１）から（５）いずれかに記載の製造方法より得られたγ−アミノ酪酸含有組成物、又は（６）に記載のγ−アミノ酪酸含有組成物のいずれかを含有した食品。

本発明の食品は、常法により、上記のγ−アミノ酪酸含有組成物を食品に混合することにより、又は、食品加工原料に混合して加工することにより得られる。この食品によれば、γ−アミノ酪酸を所望の濃度で含有する食品が容易に得られる。なお、本発明における食品とは、健康食品をも含む概念であり、また、その形態も通常の飲食品形態のみならず、タブレットなどの形態も含むものである。

本発明によれば、未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物と、グルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物と、を混合し、所定の時間保持するだけで、グルタミン酸が高割合でγ−アミノ酪酸に変換されるので、グルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物を原料として効率よくγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含量が高いγ−アミノ酪酸含有組成物を製造することができる。

また、未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物は、カボチャやトマトに比べてグルタミン酸脱炭酸酵素活性が高く、グルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換する反応の温度、時間、ｐＨ等の反応条件を特に厳密に管理をしなくても、効率的に、高割合でγ−アミノ酪酸に変換できる。また、この反応系は、植物の中でもグルタミン酸脱炭酸酵素活性が高いとされるカボチャを用いた場合と比して、より多くのグルタミン酸を入れても反応が進むため、手間がかからず、短時間に大量のγ−アミノ酪酸組成物ができ、大量生産で有利である。

また、一般的に廃棄処理されている「未熟豆の莢」をγ−アミノ酪酸変換に使用できるので、γ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸高含有組成物を安いコストで製造することができると共に未利用資源を有効に活用できる。

発明を実施するための形態

以下、本発明のγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法についての実施形態について説明する。

本発明は、未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物と、グルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物と、を混合し、所定の時間保持することで、未熟豆又はその莢に由来するグルタミン酸脱炭酸酵素のγ−アミノ酪酸の変換能によりγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物を製造するものである。

＜未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物＞
本発明で使用する未熟豆又は該未熟豆の莢は、未熟なうちに収穫する青果用豆又はその莢であれば特に限定はない。例えば、枝豆及び該枝豆の莢、そらまめ及び該そらまめの莢、さやいんげん及びさやえんどう等が挙げられる。

そして、この未熟豆又は該未熟豆の莢の細胞壁破壊処理物とは、未熟豆又は該未熟豆の莢を細胞壁が破壊される程度に破砕、磨砕等の処理が行われたものである。尚、破砕、磨砕等の方法やその処理物の形状、粒度等には特に限定されない。この処理を行う装置として、例えば、ホモミキサー、ジューサーミキサー等が挙げられる。この処理方法としては、例えば、ホモミキサーで７０００ｒｐｍ、３分間粉砕又は磨砕する方法等が挙げられる。これらの細胞壁破壊処理物の形態としては特に限定はないが、未熟豆又は該未熟豆の莢を粉砕した粉砕物、この粉砕物を水に分散させた水懸濁液、又は、未熟豆又は該未熟豆の莢の粉砕物やこの粉砕物を含む水懸濁液から一部を取り出した分離処理物であってもよい。この分離処理物としては、例えば、この粉砕物を水等で抽出した抽出物、水懸濁液をろ過したろ液、あるいはこの水懸濁液を塩析し、これを脱塩し、カラム精製した粗酵素液等が挙げられる。

また、未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物のグルタミン酸脱炭酸酵素活性は、後述する実験例１で検証しているように、カボチャ、トマト、キュウリ、ニンジン等の野菜類に比べて非常に高いグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有することが確認された。また、未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物を用いることにより、カボチャ等の野菜類に比べて、温度、時間、ｐＨ等の反応条件を特に厳しく管理することなく、比較的短時間で効率的に、しかも高い割合でグルタミン酸をγ−アミノ酪酸に変換することができる。

＜グルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物＞
本発明で使用するグルタミン酸としては、グルタミン酸やその塩類を用いることができ、特に限定はない。グルタミン酸やその塩類が１００％のものや、主成分であるものを用いることができる。市販されている食品添加用のグルタミン酸やその塩類が好ましく、微生物のアミノ酸発酵や酵素反応によって得られた高純度のグルタミン酸やその塩類が特に好ましい。以下、本発明においてグルタミン酸という場合には、グルタミン酸やその塩類をさす場合がある。

また、グルタミン酸含有組成物としては、素材中にグルタミン酸等を含有しているものであれば、特に限定はない。本発明ではγ−アミノ酪酸を多く得ることを目的の一つとしているので、その原料であるグルタミン酸等をより多く含む食品等を用いるのが好ましい。グルタミン酸含量の高い調味料、あるいは蛋白を分解したアミノ酸混合物（例えば、カゼイン、乳、トウモロコシ、カカオ豆等の食品蛋白分解物等）が好ましく使用することができる。その組成物の性状としては、水溶液、懸濁液又は乳化物等の液状、粉末等の固形状、又はペースト状であってもよい。

さらに、グルタミン酸は溶解度が低く水溶液として添加するには多量の溶液を必要とするので、粉体のまま未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物溶液に投入し、攪拌しながら徐々に溶解させるのが好適である。

＜製造方法＞
本発明のγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造は、未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物溶液にグルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物を所定量添加し、所定温度及び所定時間で保持すればよい。この温度と時間は、対応する時間及び温度、基質の濃度、酵素の濃度等により異なるので、一概に規定することはできない。

温度は、上記の通り一概に規定することはできないが、所定時間で反応が進む温度であれば特に限定されず、例えば５〜６０℃、好ましくは１５〜６０℃、２０〜６０℃、より好ましくは２５〜４５℃、最も好ましくは２５〜４０℃で行うことができる。この範囲であれば、γ−アミノ酪酸への変換反応は効率良く行われるので好ましい。また、本発明では、低温であっても、γ−アミノ酪酸への変換反応は効率良く行われる。この観点から、５〜３０℃、好ましくは５〜２０℃、より好ましくは５〜１５℃、最も好ましくは１０〜１５℃で行うことができる。この範囲であれば、γ−アミノ酪酸への変換反応は効率良く行われ、かつ、菌数を低く抑えることができるため、食品衛生上、非常に利点がある。

時間は、上記の通り一概に規定することはできないが、所定温度で反応が進む時間であれば特に限定はない。例えば、３０分〜４８時間で行うことができる。また、所定の時間とは、ある温度で添加したグルタミン酸が有意にγ−アミノ酪酸へ変換される時間をいい、特に限定はない。また、添加したグルタミン酸の大部分をγ−アミノ酪酸に変換させたい場合には、得られるγ−アミノ酪酸含有組成物がグルタミン酸由来の呈味性をほとんど感じられない程度まで、変換反応が進む時間ということができる。

また、このγ−アミノ酪酸の変換反応は、未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物溶液のｐＨが４程度より低いとγ−アミノ酪酸の変換反応が大幅に低下し、一方、ｐＨ９以上では、γ−アミノ酪酸の変換反応が行われない。よって、本発明の反応は、ｐＨ４〜８、好ましくはｐ４．８〜６．８で行うのがよい。

グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換反応は、水存在下で行われる。この水は、反応時に存在すれば良く、その起源は特に限定されない。水を反応系に添加することもできるが、グルタミン酸含有組成物として水を多く含む食品を用いれば、外から水を添加する必要がない場合もある。また、グルタミン酸等を水溶液又は懸濁液として、これを反応系に添加してもよい。さらに、未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物を水懸濁液等にして、これを反応系に添加してもよい。

グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換反応に使用する未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物は、破砕、磨砕処理された破砕物に好ましくは固形分に対して１倍量以上の水を加え、ジューサー等で充分に攪拌しジュース状にした水懸濁液で用いることができる。また、この懸濁液は不溶性の繊維質や豆又はその莢粕を除いた回収溶液であってもよい。さらには、前記破砕物を上記のように抽出、分別、精製処理にしてその一部を抜き出した溶液であってもよい。反応系に水が十分に存在するときは、破砕物をそのまま反応系に添加することもできる。これらの使用方法としては、未熟豆又はその莢全体を使用するのが好ましい。これによって、未熟豆又は該未熟豆の莢に内在するグルタミン酸脱炭酸酵素がより有効的に利用される。

特に、未熟豆の莢を変換反応に用いる場合には、その水不溶性成分の除去を行うことなく変換反応に用いることが好ましい。本発明では、特に、枝豆莢の粉砕物又は磨砕物を水中で十分攪拌したものから水不溶性成分を除去したものを用いた場合と比較して、当該水不溶性成分を除去しないで用いた場合の方が、変換率が高くなる。

特に、未熟豆の莢を変換反応に用いる場合には、未熟豆の莢の粉砕度合いや磨砕度合いは、任意に設定することができ、特に限定はない。その度合いは、反応が進む程度（酵素活性を示す程度）であればよい。特に、枝豆莢の場合は、反応が進む程度（酵素活性を示す程度）に粉砕等すれば良く、過剰に細かく粉砕等しても、優位な差が出るほど、反応効率は上がらない。

未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物溶液に対するグルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物の添加量は、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換が阻害されない範囲で任意の割合で添加することができる。好ましくは未熟豆又はその莢の原料１００ｇ対しグルタミン酸量として０．１〜１００ｇ、より好ましくは１〜６０ｇであるのがよい。またグルタミン酸を複数回で添加する場合は、１回当たり、未熟豆又はその莢の原料１００ｇ対しグルタミン酸量として１〜３０ｇ添加するのが好ましい。この際、グルタミン酸を添加することにより、未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物溶液のｐＨが低下することになるので、ＮａＯＨ溶液等のアルカリ溶液でｐＨが４以上、好ましくは５〜６程度に調整するのが好ましい。グルタミン酸を添加したとき、ｐＨ４〜６の間であれば、調整しなくてもよい場合がある。

本発明では、グルタミン酸の添加により変換反応に好ましくないｐＨまで低くなった場合、アルカリ溶液によりｐＨを調整すれば、変換反応が可能である。本発明は、特許文献２に記載されているようなグルタミン酸の添加によってｐＨを５．０〜６．０の範囲に調整する必要はない。よって、本発明は、変換反応が阻害されない範囲で一度に多量グルタミン酸を添加することができるので、より多くのγ−アミノ酪酸を得ることができる。

尚、グルタミン酸をグルタミン酸ナトリウム塩等の塩類の形態で添加する場合には、水溶液が酸性を示す必要があるため必要に応じて塩酸等の酸を併用してｐＨを調整するのが好ましい。

このグルタミン酸を添加する操作は複数回繰り返して行ってもよい。この場合にも、必要に応じて反応液のｐＨを４以上、好ましくは５〜６程度に調整するのが好ましい。

グルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物を未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物溶液に添加する方法としては、等量ずつ分割して添加する方法、最初に添加した量から徐々に少なくして添加する方法、γ−アミノ酪酸変換反応が阻害されない範囲の量を添加する方法等のいずれであってもよい。尚、本発明においては、上述のように未熟豆又はその莢を用いたことにより厳密なｐＨ管理等を行わなくても反応が進むため、γ−アミノ酪酸変換が阻害されない範囲で一度に多くの量を添加することが可能である。これによって、上記の操作の繰り返し回数が低減され、作業の煩雑性が解消される。

本発明においては、上記した方法によってグルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物に未熟豆又はその莢の細胞壁破壊処理物を用いた反応では、厳密なｐＨ管理等を行わなくても、添加したグルタミン酸の７０％以上をγ−アミノ酪酸に変換することが可能である。尚、このγ−アミノ酪酸への変換率は、使用する未熟豆又はその莢の種類により異なるが、特に、枝豆や枝豆莢では添加したグルタミン酸の９９％以上をγ−アミノ酪酸に変換することが可能である。

上記γ−アミノ酪酸の変換反応後の反応溶液を、所要の加熱処理、乾燥処理をすることにより、γ−アミノ酪酸を２０質量％以上、好ましくは２５質量％以上、さらに好ましくは３０質量％以上含有するγ−アミノ酪酸含有組成物として調製してもよい。特に、枝豆や枝豆莢では５０質量％以上、枝豆莢では更に５５質量％以上、好ましくは６０質量％以上含有するγ−アミノ酪酸含有組成物の製造が可能である。このγ−アミノ酪酸含有組成物は、使用する未熟豆の種類により異なるが、添加したグルタミン酸の７０質量％以上がγ−アミノ酪酸に変換されるので、グルタミン酸由来の呈味性はほとんど感じられない。特に、枝豆や枝豆莢では９９％以上がγ−アミノ酪酸に変換されるので、グルタミン酸由来の呈味性は感じられない。

また、上記γ−アミノ酪酸含有組成物は、γ−アミノ酪酸が上記の割合で含有されている他に、豆莢が有する水溶性繊維質を含有する。この水溶性繊維質の量は特に限定はないが、１質量％以上、好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上含有する。また、この水溶性繊維質は、豆莢の原料１００ｇに対して０．１質量％以上、好ましくは０．５質量％以上、好ましくは１質量％以上含有する。また、水溶性繊維質に対するγ−アミノ酪酸の比は、３０未満が好ましく、１０〜４がさらに好ましい。

＜加熱処理＞
本発明では、γ−アミノ酪酸変換反応が終わった後、加熱処理を行うことができる。これは、主に酵素失活処理として行われる。加熱処理の方法は、特に制限はなく、例えば、反応溶液をそのまま９０℃、１分間加熱することにより行うことができる。

＜水不溶性成分の除去処理＞
本発明では、γ−アミノ酪酸変換反応が終わった後、水不溶性成分の除去処理を行うことができる。これは、生成したγ−アミノ酪酸含有組成物を、水不溶性成分の少ない組成物として得たい場合に行うことできる。水不溶性成分の除去処理の方法は、特に制限はなく、例えば、ろ紙によるろ過、遠心分離等により行うことができる。水不溶性成分としては、例えば水不溶性の繊維質や豆又はその莢粕をいう。

＜乾燥処理＞
本発明におけるγ−アミノ酪酸含有組成物は、γ−アミノ酪酸の変換反応後の反応溶液を乾燥処理して乾燥物として調製したものでもよい。乾燥処理の方法は、特に制限はなく、乾熱乾燥、過熱水蒸気による乾燥、凍結乾燥等により行うことができる。

加熱処理、水不溶性成分の除去処理及び乾燥処理を行う場合、その順番は、特に限定されないが、通常は、加熱処理したものから水不溶性成分の除去処理をして、乾燥処理することで行うことができる。

尚、上記の変換反応後の反応溶液は、使用目的によって不溶性の繊維質や豆又は豆莢の粕等を遠心分離及び／又はろ過することにより除去してもよい。不溶性の繊維質や粕等が除去された回収液にはγ−アミノ酪酸が多量に含まれているので、それを乾燥することで、食感に優れ、より高いγ−アミノ酪酸含量の組成物を得ることができる。

本発明の製造方法で得られたγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸高含有組成物は、γ−アミノ酪酸を多量に含有するためそれを直接摂取する場合あるいは食品等に添加する場合に、その量を微量で済ませることができる。また、グルタミン酸の含有量が少ないので、食品等の本来の風味を損なうことなく添加して幅広く使用することが可能なものである。したがって、乳飲料、茶、コーヒー、紅茶等の飲料、豆腐、ふりかけ、調味料、ゼリー、インスタントスープ等の食品、チューインガム、チョコレート、ビスケット、キャンディ、和菓子等の菓子、タブレット等の健康食品、さらには薬剤として有用できる。

その他として、以下の態様が考えられる。
（８） 前記時間保持を水存在下で行うγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。

（９） 前記時間保持中に、グルタミン酸を添加して、その添加直後にｐＨを５〜６に調整する工程を、１又は２回以上行うγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。

（１０） 前記時間保持後に、加熱処理、水不溶性成分の除去処理及び乾燥処理からなる群より選ばれる１以上の処理を行うγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。

次に、実施例及び比較例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではない。

［実験例１］（各種野菜類と枝豆との酵素活性の比較）
枝豆莢（湯あがり娘：群馬産）、枝豆（湯あがり娘：群馬産）、西洋カボチャ（茨城産）、トマト（熊本産）、キュウリ（広島産）、ニンジン（千葉産）（いずれも市販品）の各種野菜類についてのグルタミン酸脱炭酸酵素活性を検証した。

＜グルタミン酸脱炭酸酵素の活性＞
各種野菜類から粗酵素液を調整し、その粗酵素液中のグルタミン酸脱炭酸酵素活性とタンパク質量を測定した。そして、蛋白質量あたりのグルタミン酸脱炭酸酵素活性を求めて、これを各種野菜類のグルタミン酸脱炭酸酵素の比活性とした。結果を表１に示す。

「Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ」は、粗酵素液中の蛋白質１ｍｇあたりのグルタミン酸脱炭酸酵素の活性を表す。１Ｕｎｉｔは、１分間に１マイクロモルのγ−アミノ酪酸を生成する酵素量を表す。

（粗酵素液の調整）
上記の各種野菜類を各５０ｇずつに１００ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．８（界面活性剤リョートーシュガーエステルＭ−１６９５を０．０２Ｍ添加）を添加し、ホモミキサーで１００００ｒｐｍ、３分間粉砕を行った。その後、この懸濁液を冷却遠心分離機により１００００Ｇの遠心力で１０分間遠心分離を行い、その上清をグルタミン酸脱炭酸酵素の粗酵素液とした。

（グルタミン酸脱炭酸酵素の活性測定）
粗酵素液と下記活性測定用試薬を混合して、トータルで１ｍＬの溶液を得た。次いで、その溶液を、３７℃、１分間で酵素反応を行い、その後、５％トリクロロ酢酸を添加してｐＨ２にすることで反応を止めた。そして、反応によって生成したγ−アミノ酪酸量を、アミノ酸分析計により測定した。生成したγ−アミノ酪酸量から、粗酵素液あたりのグルタミン酸脱炭酸酵素の活性（Ｕｎｉｔ）を求めた。

活性測定用試薬；
０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．８
１０ｍＭグルタミン酸
０．２ｍＭピリドキサル５−リン酸

（蛋白質量の測定）
粗酵素液中の蛋白質含量をローリー法の変法により測定した。

表１で示すように、枝豆、枝豆莢は、他の野菜類に比較して、非常に高いグルタミン酸脱炭酸酵素活性を持っていた。他の野菜は果肉が中心であるが、枝豆は未熟種子であり、その未熟種子自身には高い酵素活性があることが検証された。また、その莢には、更に高い活性が認められた。

［実験例２］（枝豆莢を用いたγ−アミノ酪酸の変換反応）
枝豆莢を用いてγ−アミノ酪酸の変換反応について検証した。尚、以下の実験例では、枝豆及びその莢は中札内産、そらまめ及びその莢は鹿児島産、さやいんげん及びさやえんどうは千葉産、カボチャは日本カボチャ（品種名）・佐賀産、トマトは福岡産を用いた。

〔実施例１〕（枝豆莢）
枝豆莢１５０ｇに水３００ｇを加え、ホモミキサーで７０００ｒｐｍ、３分間粉砕した。この枝豆莢粉砕液を４０℃に維持しながら、グルタミン酸５ｇを加えて、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．７〜５．９へｐＨ調整を行い、攪拌した。以後、４０℃で攪拌しながら、１時間毎にグルタミン酸５ｇを添加し、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．７〜５．９へｐＨ調整を行い、計１２回添加した（グルタミン酸添加総量：５ｇ×１２回＝６０ｇ）。そして、最後の添加から、更に１時間攪拌し、計１２時間反応を行った。２回目以降のグルタミン酸添加直前のｐＨは、５．９〜６．４であった。

次いで、反応後の反応液を９０℃で１分間加熱後、ろ紙により水不溶性成分をろ過し、得られたろ液を凍結乾燥し、凍結乾燥物（水分含量 約６質量％）を得た。

〔比較例１〕（カボチャ）
枝豆莢１５０ｇの代わりに、カボチャ１５０ｇを用いた以外は、上記実施例１と同様の方法により、凍結乾燥物を得た。

〔実施例２〕（枝豆莢）
反応温度を２５℃にした以外は、上記実施例１と同様の方法により、凍結乾燥物を得た。

＜グルタミン酸、γ−アミノ酪酸含量の分析及び、変換率＞
上記の得られた凍結乾燥物に水を加え、ホモミキサーで粉砕処理して凍結乾燥物の懸濁液を調整した。この懸濁液に５％トリクロロ酢酸を混合攪拌後、遠心処理し、上清をフィルターでろ過して、ろ液を得た。得られたろ液をアミノ酸分析計（アミノ酸アナライザーＬ―８８００Ａ 日立製）により分析した。

また、変換率は、変換されなかったグルタミン酸の質量割合（添加したグルタミン酸量に対する残存したグルタミン酸量の質量割合）を求めて、これを１００から引いた値（％）として算出した。

なお、外部よりグルタミン酸を添加する前のグルタミン酸含量は、いずれも固形分当たり０．１質量％以下であり、本実験に影響を与える量ではなかった。

これらの測定結果と変換率を表２に示した。

表２で示すように、枝豆莢は、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸に変換する酵素活性が高いとされるカボチャと比較して、高い割合で変換されており（枝豆莢の変換率９９．８に対しカボチャは５４．６）、非常に強いγ−アミノ酪酸変換能を有することがわかった。

〔実施例３〕（枝豆莢）
枝豆莢１５０ｇに水３００ｇを加え、ホモミキサーで７０００ｒｐｍ、３分間粉砕を行った。この枝豆莢粉砕液を６０℃に維持しながら、グルタミン酸７．５ｇ加えて、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．７〜５．９へｐＨ調整を行い、攪拌した。以後、６０℃で攪拌しながら、１時間毎にグルタミン酸７．５ｇ添加し、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．７〜５．９へｐＨ調整を行い、計１２回添加した（グルタミン酸添加総量：７．５ｇ×１２回＝９０ｇ）。そして最後の添加から、更に１３時間攪拌し、計２４時間反応を行った。

次いで、反応後の反応液を上記実施例１と同様の方法により処理して、凍結乾燥物を得た。

〔比較例２〕（カボチャ）
枝豆莢１５０ｇの代わりに、カボチャ１５０ｇを用いた以外は、上記実施例３と同様の方法により、凍結乾燥物を得た。

〔実施例４〕（枝豆莢）
反応温度を２５℃にした以外は、上記実施例３と同様の方法により、凍結乾燥物を得た。

これらの凍結乾燥物について、上記実験例２と同様の方法により、グルタミン酸及びγ−アミノ酪酸含量、並びに変換率を求めた。結果を表３に示した。

表３で示すように、枝豆莢は、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸に変換する酵素活性が高いとされるカボチャと比較して、高い割合で変換されており（枝豆莢の変換率９８．７に対しカボチャは６６．１）、非常に強いγ−アミノ酪酸変換能を有することがわかった。

また、表２，３で示すように、枝豆莢は、いずれの温度帯であっても強い能力を発揮することがわかった。これは、後述する実験例７で示す通り、菌の増殖を防ぐほどの高温下でも反応が進むことを示しており、その点でも有効であることがわかった。

〔実施例５、比較例３〜４〕（枝豆莢、カボチャ及びトマト）
枝豆莢（実施例５）、カボチャ（比較例３）又は、トマト（比較例４）６００ｇに水３００ｇを加えて、ホモミキサーで７０００ｒｐｍ、３分間処理を２回行い、粉砕した。この粉砕液を２０℃に維持しながら、グルタミン酸１９ｇを加えて、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．０〜５．３へｐＨ調整を行い、攪拌した。以後、２０℃で維持しながら、１時間毎にグルタミン酸１９ｇを添加し、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．０〜５．３へｐＨ調整を行い、計１２回添加した（グルタミン酸添加総量：１９ｇ×１２回＝２２８ｇ）。そして最後の添加から、更に、３７時間攪拌し、計４８時間反応を行った。２回目以降のグルタミン酸添加直前のｐＨは、５．３〜５．５であった。

次いで、反応後のそれぞれ反応液を上記実施例１と同様の方法により処理して、凍結乾燥物を得た。

得られたそれぞれの凍結乾燥物について、上記実験例２と同様の方法により、グルタミン酸及びγ−アミノ酪酸含量、並びに変換率を求めた。また、実施例５の凍結乾燥物については、下記の方法により、水溶性繊維質の含有量を求めた。結果を表４に示した。

＜水溶性繊維質の分析＞
実施例５の凍結乾燥物１０ｇと水を攪拌混合して、トータルで１００ｍＬの溶液を得た。これに４倍溶の９５％エタノール（６０℃加温）を加え、室温で１時間放置して水溶性繊維質を沈殿させた。これを吸引ろ過し、ガラスろ過器上に補集された残渣を７８％（Ｖ／Ｖ）エタノール（２０ｍＬ×３回）、９５％エタノール（１０ｍＬ×２回）及びアセトン（１０ｍＬ×２回）で洗浄した。次に、ガラスろ過器ごと１０５℃±３℃で１夜乾燥させた後、乾燥剤としてシリカゲルを入れたデシケーター中で約１時間放冷して、洗浄後の残渣を乾燥させた。乾燥後の残渣の重量から、ケルダール法により測定した残渣の窒素含量及び、５２５℃±５℃で５時間灰化処理しで測定した灰分量、を引いた値を水溶性繊維質とした。

表４で示すように、枝豆莢は、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸に変換する酵素活性が高いとされるカボチャ、γ−アミノ酪酸含量が多いと言われるトマトと比較して、非常に強いγ−アミノ酪酸変換能を有することがわかった。また、水溶性繊維質の含量が多いことが確認された。

［実験例３］（種々の未熟豆及び豆莢との比較）
次に、未熟豆又はその豆莢の種類別でのγ−アミノ酪酸の変換反応について検証した。

〔実施例６、参考例２〜５〕（枝豆莢、そらまめとその莢、さやいんげん及びさやえんどう）
枝豆莢（実施例６）、そらまめ莢（参考例２）、そらまめ（参考例３）、さやいんげん（参考例４）又は、さやえんどう（参考例５）３００ｇに水３００ｇを加えて、ホモミキサーで７０００ｒｐｍ、３分間粉砕した。この粉砕液を３０℃に維持しながら、グルタミン酸５ｇを加えて、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．７〜５．９へｐＨ調整を行い、攪拌した。以後、３０℃で攪拌しながら、１時間毎にグルタミン酸５ｇを添加し、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．７〜５．９へｐＨ調整を行い、計１２回添加した（グルタミン酸添加総量：５ｇ×１２回＝６０ｇ）。そして最後の添加から、更に１３時間攪拌し、計２４時間反応を行った。

次いで、反応後のそれぞれ反応液を上記実施例１と同様の方法により処理して、凍結乾燥物を得た。

得られたそれぞれの凍結乾燥物について、上記実験例２と同様の方法により、グルタミン酸及びγ−アミノ酪酸含量、並びに変換率を求めた。結果を表５に示した。

表５で示すように、未熟の豆及びその莢は、いずれも強いγ−アミノ酪酸変換能を有することがわかった。また、その中でも、枝豆莢は特に強い能力を有することがわかった。

［実験例４］（枝豆、枝豆莢及び、成熟大豆の比較）
枝豆（参考例）、枝豆莢（実施例）及び、成熟大豆（比較例）でのγ−アミノ酪酸の変換反応について検証した。

〔実施例１２、参考例６、比較例５〕

枝豆（参考例６）、枝豆莢（実施例１２）又は、成熟大豆（比較例５）３００ｇに水６００ｇを加え、ホモミキサーで７０００ｒｐｍ、３分間粉砕した。この枝豆莢粉砕液を４０℃に維持しながら、グルタミン酸１４ｇを加えて、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．０〜５．３へｐＨ調整を行い、攪拌した。以後、４０℃で攪拌しながら、１時間毎にグルタミン酸１４ｇを添加し、０．５ＮのＮａＯＨ溶液によりｐＨ５．０〜５．３へｐＨ調整を行い、計１２回添加した（グルタミン酸添加総量：１４ｇ×１２回＝１６８ｇ）。そして、最後の添加から、更に１３時間攪拌し、計２４時間反応を行った。

次いで、反応後のそれぞれ反応液を上記実施例１と同様の方法により処理して、凍結乾燥物を得た。

得られたこれらの凍結乾燥物について、上記実験例２と同様の方法により、グルタミン酸及びγ−アミノ酪酸含量、並びに変換率を求めた。結果を表６に示した。

表６で示すように、未熟豆の枝豆又はその莢は、成熟豆の大豆に比べて、非常に強いγ−アミノ酪酸変換能を有することがわかった。

［実験例５］（ろ過の有無による反応性の違い）
枝豆莢について、該莢粉砕液のろ過の有無によるγ−アミノ酪酸の変換反応性の違いを検証した。

〔参考例１〕
反応前（４０℃に維持して、グルタミン酸添加する前）の枝豆莢粉砕液の代わりに、この枝豆莢粉砕液を十分攪拌した後、それをろ紙によりろ過したろ液を用いた以外は、上記実施例１と同様の方法により、凍結乾燥物を得た。尚、このろ過工程は水不溶性成分の除去を目的としている。

得られた凍結乾燥物について、上記実験例２と同様の方法により、グルタミン酸及びγ−アミノ酪酸含量、並びに変換率を求めた。結果を表７に示した。

表７で示すように、枝豆莢を用いてγ−アミノ酪酸を製造する場合には、ろ過したろ液に比べて、ろ過しない枝豆莢粉砕液をそのまま用いた方が、γ−アミノ酪酸変換能を強く発揮することがわかった。

［実験例６］（枝豆莢の粉砕度の違いによる反応性）
枝豆莢について、その粉砕度の違いによるγ−アミノ酪酸の変換反応性の違いを検証した。

〔実施例１３〕
ホモミキサーで７０００ｒｐｍ、３分間粉砕の代わりに、氷冷却しながら、ホモミキサーで７０００ｒｐｍ、３０分間粉砕した以外は、上記実施例１と同様の方法により、凍結乾燥物を得た。

得られた凍結乾燥物について、上記実験例２と同様の方法により、グルタミン酸及びγ−アミノ酪酸含量、並びに変換率を求めた。結果を表８に示した。

表８で示すように、ホモミキサーによる粉砕時間を長くして枝豆莢の粉砕度を上げてもγ−アミノ酪酸量、変換率は同じ結果であり、枝豆莢の粉砕度の違いにより変換反応性の差はなかった。

［実験例７］（γ−アミノ酪酸高含有凍結乾燥物の生菌数）
得られた凍結乾燥物の生菌数を測定し、反応条件の温度、時間の関係について検証した。

上記実験例２で作製した実施例１〜４の凍結乾燥物について生菌数を測定した。結果を表９に示した。

表９で示すように、反応温度を上げることにより生菌数が抑えられることがわかった。これは、これらの反応は、高温下において高い変換率を維持しつつ、菌の増殖も防ぐことができることがわかった。

［実験例８］（γ−アミノ酪酸含有組成物を用いた食品）
上記実施例１の凍結乾燥品を用いて豆腐を作製した。

〔実施例１４〕
実施例１の凍結乾燥品０．５部、浸漬大豆９９．５部、水１４０部を混合し、豆乳メーカーより豆乳を製造した。この豆乳１Ｌに対して３ｇのにがりを添加し、豆腐を製造した。

上記豆腐は、枝豆風味の美味しい豆腐であった。また、豆腐１００ｇ中のγ−アミノ酪酸含量は７８０ｍｇであった。

［実験例９］（維持温度）
〔実施例１５、参考例７〜１０〕
反応温度を４０℃、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、および５℃にした以外は、上記実施例１と同様の方法により、凍結乾燥物を得た。これらの凍結乾燥物について、上記と同様の方法により、グルタミン酸及びγ−アミノ酪酸含量、並びに変換率を求めた。結果を表１０に示した。なお、表１０中、４０℃と２５℃の維持したときの結果は、実施例１、実施例２と同じものである。

表１０で示すように、枝豆莢は、低温、高温いずれの温度帯であっても、強いγ−アミノ酪酸変換能を発揮することがわかった。

Claims (4)

1. 枝豆の莢の細胞壁を破壊処理してなる細胞壁破壊処理物と、グルタミン酸又はグルタミン酸含有組成物と、を混合し、
   ２５〜６０℃で、所定の時間保持する、γ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。
2. 前記細胞壁破壊処理物が、前記枝豆の莢を破砕した破砕物を含む水懸濁液、該水懸濁液の分離処理物、のいずれかである請求項１に記載のγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。
3. ｐＨを４から８の範囲内で前記所定の時間保持する、請求項１又は２に記載のγ−アミノ酪酸又はγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。
4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法より得られたγ−アミノ酪酸含有組成物を含有した食品。