JP5026918B2

JP5026918B2 - ベニクスノキタケの培養方法

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Inventors: 達銘蔡
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Description

本発明は、木材片へベニクスノキタケ菌株を接種して、大規模にベニクスノキタケの子実体を培養する工程を含む、ベニクスノキタケの培養方法に関する。

牛樟芝（ＮｉｕＺａｎｇＺｈｉ）または牛樟茸（Ａｎｔｒｏｄｉａｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）とも呼ばれるベニクスノキタケ（Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａ）は、ヒダナシタケ（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）目サルノコシカケ（Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ）科シカタケ（Ａｎｔｒｏｄｉａ）属に属する多年生の茸であり、台湾固有の菌類である。ベニクスノキタケは、台湾の高度２００メートルから２０００メートルの山岳部における、牛樟（ＣｉｎｎａｍｏｍｕｍｋａｎｅｈｉｒａｉＨａｙ）の樹洞の内壁または牛樟の枯れて腐った幹の湿った表面にしか寄生しない。牛樟における主な芳香はテルペノイドであり、クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒａ（Ｌｉｎｎ．）Ｐｒｅｓｌ）に存在する芳香族化合物である樟脳（ｃａｍｐｈｏｒ）ではないので、牛樟に対しかつて用いられた学名Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａは、茸栽培の専門家であるドンチュー・チャン（ＤｏｎｇｚｈｕＺｈａｎｇ）およびウェンネン・ジョウ（ＷｅｎｎｅｎｇＺｈｏｕ）によって、Ａｎｔｒｏｄｉａｃｉｎｎａｍｏｍｅａとして訂正された。

ベニクスノキタケの子実体は牛樟の樹洞から生長し、初期には平坦な形状を有するが、幹の内面に付着して生長し、次いで、子実体の先の方の縁部が幹から離れて丸まり、上方へ曲がって、蹄鉄形または不規則な形状を形成する。子実体がより長く生長すると、接触はより密になり、徐々に木化またはコルク化する。子実体は板状または鐘形の外観を有し、強い香ばしい匂い（ｂｉｔｔｅｒｓｍｅｌｌ）を有する。一年生または多年生の子実体の上面の色は、赤橙色、橙褐色から明るい肉色であり、次いで、茶色へと変化する。表面は平滑で、同心円状である。また、小孔は円または多角形の形状であり、その中に胞子を有する。子実体の小孔の新鮮な表面の色は、赤橙色、橙褐色から明るい肉色であり、古びた表面の色は赤褐色である。

食中毒、下痢、嘔吐、農薬中毒などを解毒するため、ベニクスノキタケは優れた解毒剤であり、また、癌または慢性病に対し望ましい効果を有するとも考えられている。一般の菌類が樟脳木上で生長することは不可能であるが、強い芳香を有し、昆虫を撃退することが可能であるので、一般の樟脳木およびクスノキなど同様の樹木ではなく、台湾に固有の牛樟にのみベニクスノキタケが寄生することが可能である。したがって、ベニクスノキタケの生産は不充分である。さらに、ベニクスノキタケの生長する牛樟は第一級保護樹木種であり、付随物としてのベニクスノキタケを採取することは禁止されているため、ベニクスノキタケは不足しており、市場の需要を満たすことは不可能である。したがって、ベニクスノキタケは「台湾のルビー」とも呼ばれ、苗栗縣（Ｍｉａｏｌｉ）の南庄郷（Ｎａｎｚｈｕａｎｇ）や、高雄縣（Ｇａｏｘｉｏｎｇ）の六亀郷（Ｌｉｕｇｕｉ）などでしか生産されていない。

慢性病と癌に対するベニクスノキタケの治療効果は昔から認められ、受け入れられていたため、市場のベニクスノキタケの価格はさらに上昇している。実際、ベニクスノキタケがマウスのリンパ腫細胞ｐ−３８８を死滅させる性能が著しく高いことは、科学的な研究によって示されている。ベニクスノキタケ菌糸体に含まれる温水に可溶な多糖類は、正常な成人の血中のリンパ細胞を刺激してサイトカインを産生させ、ヒトのリンパ腫細胞Ｕ−９３７を死滅させることが可能であり、また、マクロファージの食作用能を増加させ、脾
細胞の増殖およびインターロイキンＩＬ−５の分泌を促進することが可能である。これに加えて、ベニクスノキタケは、黄色ブドウ球菌および白癬菌や、多数の腸内細菌叢の生長を阻害することも可能である。一般に、ベニクスノキタケは、血液浄化、毒性物質の除去、腎臓強壮、肝臓の保護、整腸、強心、血圧の調節、強身、耐感冒、抗細菌、鎮咳、鎮痰、痛みの緩和、鎮静、抗癌、抗腫瘍、毒素放出などの効果を有するため、広汎な効能を有する薬用菌類である。

ベニクスノキタケの使用を普及させ、市場の高い価格を安定化させ、牛樟の長期保護を維持する目的において、多くの関連産業によって打破されるべき主な障害は、ベニクスノキタケの大規模な人工培養である。現在、ベニクスノキタケの人工培養方法のほとんどには、液体発酵または固体発酵によって菌糸体を培養し、次いで、スペースバッグ（ｓｐａｃｅｂａｇ）中に菌株を接種して、ベニクスノキタケの子実体を生長させることが含まれる。しかしながら、既存の技術によって培養されるとき、菌糸体の成長は充分ではない。また、封入は厳密ではなく、スペースバッグを用いて屋内で子実体を培養するとき、雑多な菌類が生長する可能性がある。これに加えて、野生のベニクスノキタケの子実体と比較して、スペースバッグを用いて培養されたベニクスノキタケの子実体は薄く、野生のベニクスノキタケよりもトリテルペノイドの含有量は相当ひどい。さらに、スペースバッグを土壌中で劣化させることは困難であるため、環境問題を引き起こす。今日では、生物分解性材料製のスペースバッグが利用可能であるが、それらは価格が高いため、菌類および茸の大規模培養において適用する費用に対し負担であることは疑いない。最も重要なことに、木材片を感染させるとき、明白な宿主特異性のため、野生のベニクスノキタケの胞子は牛樟に感染し、そこに寄生して子実体を形成することのみが可能である。既存の技術では、人工培養されたベニクスノキタケ菌糸体が異なる樹木種の木材片に感染することは不可能である。したがって、子実体の培養は、ベニクスノキタケの胞子に感染した野生の牛樟の木材片を用いることによって直接的に実行されている。しかしながら、この人工培養方法は、多くの充実した子実体を有するベニクスノキタケ培養物を成長させるには不適切であり、トリテルペノイドおよび多糖類の含有量も制限されている。

ほとんどの商業的に入手可能な子実体は、薄い一年生の菌類であり、厚く充実した多年生の子実体は稀少であるため、市場にはベニクスノキタケに対する大きな需要が存在する。しかしながら、天然の野生のベニクスノキタケを入手することは困難であるため、収穫には極端に大きな圧力が存在する。したがって、良質なベニクスノキタケを効率的に供給するように、厚く充実した子実体を有し、トリテルペノイドが豊富である、木材片によるベニクスノキタケの人工培養方法を開発することは、本技術分野においてさらなる研究の価値を有する技術分野である。

ＮｉｕＺａｎｇ茸（Ａｎｔｒｏｄｉａｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）とも呼ばれるベニクスノキタケ（Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａ）は、台湾に固有の菌類であり、台湾における保護植物である牛樟にしか生長しない。したがって、牛樟の樹洞において生長したベニクスノキタケを採取することは非常に困難であり、その生産量も非常に少ない。したがって、本発明は、イースト培地および木粉を収容している容器へベニクスノキタケ菌株を接種し、培養してベニクスノキタケ菌糸体を得る工程を含む、ベニクスノキタケ菌糸体の固体培養法を提供することに関する。

さらに、本発明は、イースト培地を収容している容器へベニクスノキタケ菌株を接種し、培養してベニクスノキタケ菌糸体を得る工程を含む、ベニクスノキタケ菌糸体の液体培養法を提供することに関する。

さらに、本発明は、ベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材を木材片へ接種し、一定期間、培養して、ベニクスノキタケの子実体を得る工程を含む、ベニクスノキタケの子実体の培養方法を提供することに関する。

さらに、本発明は、トリテルペノイドが豊富であり、有望な生物学的利用能の可能性を有する薬用菌類である、ベニクスノキタケの子実体の培養方法によって培養した、ベニクスノキタケの子実体を提供することに関する。

上述の目的のために、本発明では、ベニクスノキタケ菌糸体の固体培養法を提供する。この方法は、（ａ）イーストを含有している培地を５〜３５℃で３〜３０日間、発酵させる工程と、（ｂ）発酵した培地に撹拌によって木粉を加える工程と、（ｃ）木粉および培地を容器の中へ入れる工程と、（ｄ）木粉および培地を収容している容器を滅菌する工程と、（ｅ）木粉および培地を収容している滅菌した容器へベニクスノキタケ菌株を接種し、５〜３５℃で培養して、ベニクスノキタケ菌糸体を得る工程とを含む。

好適には、工程（ａ）における培地は、１〜８％の糖質、０．０６〜１．２％のイースト、０．０１〜０．４％の硫酸マグネシウム、および０．０１〜０．４％のリン酸二水素カリウムを含む。イーストを含有している培地は、７〜１４日間、発酵することが必要である。

好適には、工程（ｃ）における培養は、湿度が６０〜９０％（最も好適には、８０％）の容器中で実行される。
好適には、工程（ｅ）におけるベニクスノキタケ菌株は、２０〜３０℃で培養される。

さらに、本発明では、ベニクスノキタケ菌糸体の液体培養法を提供する。この方法は、（ａ）イーストを含有している培地を５〜３５℃で３〜３０日間、発酵させる工程と、（ｂ）発酵した培地を容器の中へ入れる工程と、（ｃ）培地を収容している容器を滅菌する工程と、（ｄ）滅菌した培地へベニクスノキタケ菌株を接種し、５〜３５℃で培養して、ベニクスノキタケ菌糸体を得る工程とを含む。

好適には、工程（ａ）における培地は、糖質、イースト、硫酸マグネシウム、およびリン酸二水素カリウムを含み、より好適には、１〜８％の糖質、０．０６〜１．２％のイースト、０．０１〜０．４％の硫酸マグネシウム、および０．０１〜０．４％のリン酸二水素カリウムを含む。イーストを含有している培地は、７〜１４日間、発酵することが必要である。

好適には、工程（ｄ）におけるベニクスノキタケ菌株は、２０〜３０℃で培養される。
さらに、本発明では、ベニクスノキタケの子実体の培養方法を提供する。この方法は、（ａ）ベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材を木材片へ接種する工程と、（ｂ）ベニクスノキタケ菌糸体を接種した木材片を温度が５〜３５℃かつ湿度が６５〜８５％である環境に配置し、一定期間、培養する工程と、（ｃ）木材片に残る基材を除去し、温度が１５〜３５℃かつ湿度が８０〜９８％である環境に木材片を配置し、一定期間、培養して、ベニクスノキタケの子実体を得る工程とを含む。

好適には、工程（ａ）においてベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材は、固体基材または液体基材であり、固体基材は木粉であることが可能である。
好適には、工程（ｂ）における木材片は、温度が２５〜３０℃かつ湿度が７５〜８５％である環境において、１ヶ月を超える期間、培養される。

好適には、工程（ｃ）における培養は、温度が２６〜３０℃かつ湿度が８０〜９８％である環境において実行され、培養期間は３ヶ月を超える。
好適には、工程（ｂ）および（ｃ）における培養は、ＣＯ_２の濃度が２％未満である環境において実行される。

さらに、本発明では、ベニクスノキタケの培養方法を提供する。この方法は、（ａ）イーストを含有している培地を５〜３５℃で３〜３０日間、発酵させる工程と、（ｂ）発酵した培地に撹拌によって木粉を加える工程と、（ｃ）木粉および培地を容器の中へ入れる工程と、（ｄ）木粉および培地を収容している容器を滅菌する工程と、（ｅ）木粉および培地を収容している滅菌した容器へベニクスノキタケ菌株を接種し、５〜３５℃で培養して、ベニクスノキタケ菌糸体を得る工程と、（ｆ）ベニクスノキタケ菌糸体を収容している木粉を木材片へ接種する工程と、（ｇ）ベニクスノキタケ菌糸体を接種した木材片を温度が５〜３５℃かつ湿度が６５〜８５％である環境に配置し、一定期間、培養する工程と、（ｈ）木材片に残る木片を除去し、温度が１５〜３５℃かつ湿度が８０〜９８％である環境に木材片を配置し、一定期間、培養して、ベニクスノキタケの子実体を形成させる工程とを含む。

好適には、工程（ｃ）における容器中の湿度は６０〜９０％であり、より好適には８０％である。
好適には、工程（ｇ）における木材片は、温度が２５〜３０℃、湿度が７５〜８５％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境において培養される。

好適には、工程（ｈ）における木材片は、温度が２６〜３０℃、湿度が９０〜９８％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境において培養される。
好適には、工程（ｇ）における木材片の培養期間は１ヶ月を超える。

好適には、工程（ｈ）におけるベニクスノキタケの子実体の培養期間は３ヶ月を超える。
さらに、本発明では、ベニクスノキタケの培養方法によって培養したベニクスノキタケの子実体を提供する。

上述の記載から、本発明のベニクスノキタケの培養方法によって、人工発酵した培地を用いることによって培養したベニクスノキタケ菌糸体を多数の樹木種の木材片へ接種して、寄生宿主特異性を破り、ベニクスノキタケの子実体の大量培養の目的を達成することによって、市場におけるベニクスノキタケの切なる需要は満たされ、生物工学および医薬分野における適用範囲が拡大される。

本発明では、野生のベニクスノキタケと同等かまたは野生のベニクスノキタケより優れた活性および成分を有する、厚く充実した子実体を大規模に培養するように、ベニクスノキタケ菌糸体を木材片へ人工的に接種することにより、木材片上で結実させる機会を改良する。天然のベニクスノキタケは牛樟上でのみ生長するので、ベニクスノキタケ菌株を異なる樹木種の木材片へ接種することに成功した場合、人工木材片培養技術において相当な進歩が得られる。

本発明では、ベニクスノキタケ菌糸体の培養方法は、イーストを含有している培地を５〜３５℃で３〜３０日間、発酵させる工程を含む。培地中の微生物は発酵中に変換され、これは続くベニクスノキタケ培養物の栄養成分摂取に有益である。また、その後、発酵した培地に撹拌によって木粉を加える工程と、次に、木粉および培地を容器の中へ入れる工程と、次いで、木粉および培地を収容している容器を滅菌する工程と、最後に、木粉およ
び培地を収容している滅菌した容器へベニクスノキタケ菌株を接種し、５〜３５℃で培養して、高活性の菌糸体を得る工程とを含む。

本発明では、ベニクスノキタケの子実体の培養方法は、最初に、ベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材を木材片へ接種する工程と、次に、ベニクスノキタケ菌糸体を接種した木材片を、温度が５〜３５℃、湿度が６５〜８５％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境に配置し、一定期間、培養する工程と、その後、木材片に残る基材を除去し、温度が１５〜３５℃、湿度が８０〜９８％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境に木材片を配置し、一定期間、培養して、ベニクスノキタケの子実体を得る工程とを含む。ベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材は、固体基材であることも、あるいは液体基材であることも可能である。

本発明では、ベニクスノキタケの子実体の培養方法は、最初に、イーストを含有している培地を５〜３５℃で３〜３０日間、発酵させる工程と、発酵した培地に撹拌によって木粉を加える工程と、木粉および培地を容器の中へ入れる工程と、木粉および培地を収容している容器を滅菌する工程と、木粉および培地を収容している滅菌した容器へベニクスノキタケ菌株を接種し、５〜３５℃で培養して、高活性の菌糸体を得る工程と、ベニクスノキタケ菌糸体を収容している木粉を木材片へ接種する工程と、ベニクスノキタケ菌糸体を接種した木材片を温度が５〜３５℃、湿度が６５〜８５％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境に配置し、一定期間、培養する工程と、木材片に残る基材を除去し、温度が１５〜３５℃、湿度が８０〜９８％、かつＣＯ_２の含有量が２％未満である環境に木材片を配置し、一定期間、培養して、ベニクスノキタケの子実体を得る工程とを含む。

本発明のベニクスノキタケの子実体の培養方法に適切な木材片の種類には、以下に限定されないが、牛樟、クスノキおよびＣｉｎｎａｍｏｍｕｍｐａｒｔｈｅｎｏｘｙｌｏｎ（Ｊａｃｋ）Ｎｅｅｓなどの樟脳木、中国の樟脳木、または、例えば、ソウシジュ（ＡｃａｃｉａｃｏｎｆｕｓａＭｅｒｒ）、ＣｉｎｎａｍｏｍｕｍｏｓｍｏｐｈｌｏｅｕｍＫａｎｅｈ、コウヨウザン（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａＬａｎｃｅｏｌａｔａ）、オオバタブ（Ｍａｃｈｉｌｕｓｋｕｓａｎｏｉ）、カエデ（Ｍａｐｌｅ）、グアバ（ＰｓｉｄｉｕｍｇｕａｊａｖａＬ．）、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）、マンサク（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｃｅａｅ）、およびブナ（Ｆａｇａｃｅａｅ）など雑多な樹木が含まれ、木質の硬い種類が特に好適である。

本発明の方法は、例えば、登録番号ＢＣＲＣ３５３９６、ＢＣＲＣ３５７１６、ＢＣＲＣ３５３９８、またはＢＣＲＣ３６４０１にて、食品科学研究所（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ）に寄託されているものなど、任意の種類のベニクスノキタケ菌株に適用可能である。これらは無料で入手可能である。

実施例
実施例１：クスノキの木材片を用いることによるベニクスノキタケの子実体の培養
イーストを含有している培地を２８℃で１４日間、発酵させた。培地中の微生物は発酵中に変換され、これは続くベニクスノキタケの栄養成分摂取に有益である。次に、発酵した培地に撹拌によって木粉を加えた。次いで、木粉および培地をフラスコの中に入れ、木粉および培地を充填したフラスコを高温で滅菌した。最後に、木粉および培地を収容している滅菌したフラスコにベニクスノキタケ菌株を接種させ、２８℃で２．５ヶ月間、培養し、菌糸体を得た。

ベニクスノキタケ菌糸体を収容している培養した木粉をクスノキの木材片に接種させ、温度が５〜３５℃、湿度が６５〜８５％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境に配置し、２．５ヶ月間、培養した。木材片にベニクスノキタケ菌糸体を感染させた後、木材片
に残る木粉を除去した。次いで、温度が１５〜３５℃、湿度が８０〜９８％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境に木材片を配置し、７ヶ月間、培養して、図１に示すような、ベニクスノキタケの子実体を得た。図１から、本発明の培養方法によって培養したベニクスノキタケの子実体が厚く、充実しており、野生のベニクスノキタケの子実体と同様の形態を有することが明らかに分かる。トリテルペノイド成分の含有量の分析については、以下に詳細に記載する。

実施例２：ソウシジュの木材片を用いることによるベニクスノキタケの子実体の培養
イーストを含有している培地を２８℃で１４日間、発酵させた。培地中の微生物は発酵中に変換され、これは続くベニクスノキタケの栄養成分摂取に有益である。次に、発酵した培地に撹拌によって木粉を加えた。その後、木粉および培地をフラスコへ充填し、高温で滅菌した。最後に、木粉および培地を収容している滅菌したフラスコにベニクスノキタケ菌株を接種させ、５〜３５℃で３ヶ月間、培養し、ベニクスノキタケ菌糸体を得た。

ベニクスノキタケ菌糸体を収容している培養した木粉をソウシジュの木材片に接種させ、温度が５〜３５℃、湿度が６５〜８５％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境に配置し、３ヶ月間、培養した。木材片にベニクスノキタケ菌糸体を感染させた後、木材片に残る木粉を除去した。次いで、温度が１５〜３５℃、湿度が８０〜９８％、かつＣＯ_２の含有量が２％未満である環境に木材片を配置し、６ヶ月間、培養して、図２に示すようなベニクスノキタケの子実体を得た。図２から、本発明の培養方法によって培養したベニクスノキタケの子実体が厚く、充実しており、野生のベニクスノキタケの子実体と同様の形態を有することが明らかに分かる。トリテルペノイド成分の含有量の分析については、以下に詳細に記載する。

実施例３：牛樟の木材片を用いることによるベニクスノキタケの子実体の培養
イーストを含有している培地を５〜３５℃で３〜３０日間、発酵させた。培地中の微生物は発酵中に変換され、これは続くベニクスノキタケの栄養成分摂取に有益である。次に、発酵した培地に撹拌によって木粉を加えた。その後、木粉および培地をフラスコへ充填し、高温で滅菌した。最後に、木粉および培地を収容している滅菌したフラスコにベニクスノキタケ菌株を接種させ、５〜３５℃で２．５ヶ月間、培養し、菌糸体を得た。

ベニクスノキタケ菌糸体を収容している培養した木粉を牛樟の木材片に接種させ、温度が５〜３５℃、湿度が６５〜８５％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境に配置し、２．５ヶ月間、培養した。木材片にベニクスノキタケ菌糸体を感染させた後、木材片に残る木粉を除去した。次に、温度が１５〜３５℃、湿度が８０〜９８％、かつＣＯ_２の濃度が２％未満である環境に木材片を配置し、８ヶ月間、培養して、図３に示すようなベニクスノキタケの子実体を得た。図３から、本発明の培養方法によって培養したベニクスノキタケの子実体が厚く、充実しており、野生のベニクスノキタケの子実体と同様の形態を有することが明らかに分かる。トリテルペノイド成分の濃度の分析については、以下に詳細に記載する。

実施例４：本発明によって培養したベニクスノキタケ、野生のベニクスノキタケ、および商業的に入手可能なベニクスノキタケの成分含有量の比較
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による各試料の指紋スペクトルは、同じ種類の成分は同じであるという原理に基づき分析される。指紋スペクトルは、各試料の品質を評価するように、試料間の相同性を比較し、成分の全含有量を分析、比較するために用いられる。

試料溶液の調製
この実験では、野生のベニクスノキタケの子実体、ベニクスノキタケの商業的に入手可
能なカプセルの粉末内容物、ならびに３つの異なる木材片、すなわち、牛樟、クスノキ、およびソウシジュ（実施例１〜３）上で本発明の培養方法によって培養したベニクスノキタケの人工子実体を含む、５つの試料を分析した。まず、これらの５つの試料をファインカットまたは粉体へと粉砕し、６０℃の定温オーブンに配置して、２０時間連続的に乾燥し、次いで、取り出して、乾燥機中で冷却した。次に、各試料を正確に８００ｍｇ秤量し、２５ｍＬの秤量フラスコへ入れ、次いで、メタノール１５ｍｌを正確に加え、しっかりと蓋をした。その後、この秤量フラスコを超音波振とう器中で３時間、振とうさせ、吸引した。吸引した溶液を０．４５μｍの濾過膜によって濾過し、分析用の試料溶液として用いる透明な液体を得た。

高圧液体クロマトグラフィー：
分析に用いる高圧液体クロマトグラフは、ＨＩＴＡＣＨＩＤ−７０００シリーズであり、ポンプ（Ｌ−７１００）、検出器（Ｌ−７４２０）、およびオートサンプラ（Ｌ−７２００）を備える。ここで、ＨＰＬＣカラムＲＰ−１８の長さは２５０ｍｍ、内径は４．６ｍｍ（粒径５μｍ）である。

分析条件には、流量：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出吸収波長：ＵＶ２１０ｎｍ、注入体積：２５μＬ、分析時間：１９０分、が含まれる。勾配溶出法では、移動相として、移動相Ａ：１０％のアセトニトリル（１％のリン酸を含有）と、移動相Ｂ：１００％のアセトニトリル（１％のリン酸を含有）との、２溶媒系を用いる。勾配溶出条件をテーブル１に示す。

吸収ピーク面積は組込ソフトウェアによって自動的に計算される。ここで、ピーク棄却水準は２００，０００に設定され、２００，０００未満の吸収ピーク面積を有するものはノイズであると見なされ、計算されずに棄却される。また、２００，０００に達する吸収ピーク面積を有するが不規則である吸収ピークも、手動のふるい分けによって棄却される。最後に、分析における各試料溶液の高信頼性の吸収ピーク面積が加えられ、相互に比較されて、品質評価が行われる。

以下のテーブル２に示すように、野生のベニクスノキタケの子実体に対する全吸収ピーク面積を総合すると、１３９，９８３，３７０である。ソウシジュの木材片上で培養したベニクスノキタケの子実体に対する全面積を総合すると、７６，１６５，７１５である。クスノキの木材片上で培養したベニクスノキタケの子実体に対する全面積を総合すると、１１１，３５６，２０６である。牛樟の木材片上で培養したベニクスノキタケの子実体に対する全面積を総合すると、１５２，７６０，２６７である。また、ベニクスノキタケの商業的に入手可能なカプセルに対する全面積を総合すると、２１，１２６，１３８であり、これは４つの試料よりはるかに低い。

結果
これらの５つの試料のスペクトルは、同じ吸収強度（１３００ｍＶ）および同じ保持時間（１８０ｍｉｎ）にて分析される。クスノキ、ソウシジュ、および牛樟のそれぞれのＨＰＬＣスペクトルを、図４，５，６に示す。

これに加えて、これらの５つの試料を用いることによって、図７に示すように、ベニクスノキタケの市販製品（カプセル）、野生のベニクスノキタケの子実体、ならびに３つの異なる木材片、すなわち、クスノキ、ソウシジュ、および牛樟によって培養したベニクスノキタケの人工子実体の指紋スペクトルが、重ねて比較される。重ねた図から、３つの人工培養したベニクスノキタケの子実体の指紋スペクトルは、吸収強度に幾らか差が存在する以外、広いベニクスノキタケの子実体と同じ位置に（すなわち、同じ保持時間に）同じ吸収グループを有すること、また、ベニクスノキタケの商業的に入手可能な製品の指紋スペクトルは、３つの試料のものとは著しく異なり、吸収強度は非常に弱いことが観察される。重ねた図の比較および分析により得られる結果によって、牛樟、クスノキ、ソウシジュによって培養したベニクスノキタケの人工子実体は、野生のベニクスノキタケの子実体と一致することが明らかに示される。このことは、異なる木材片によって培養した本発明のベニクスノキタケの子実体が同様のトリテルペノイド成分を有し、野生のベニクスノキタケの子実体と同じ生理学活性および利用を有することを示している。

分析結果から、本発明によって、大規模のベニクスノキタケの子実体の人工培養方法が
提供されることが観察される。この培養したベニクスノキタケの子実体は厚く、充実しており、野生のまたは商業的に入手可能な人工培養されたベニクスノキタケのものと同等またはより優れた活性成分を有する。したがって、本発明は、ベニクスノキタケの子実体の人工培養の技術における相当な進歩である。

本発明によってクスノキの木材片を用いることにより培養したベニクスノキタケの子実体の画像。本発明によってソウシジュの木材片を用いることにより培養したベニクスノキタケの子実体の画像。本発明によって牛樟の木材片を用いることにより培養したベニクスノキタケの子実体の画像。本発明によってクスノキの木材片を用いることにより培養したベニクスノキタケの子実体のＨＰＬＣスペクトルの図。本発明によってソウシジュの木材片を用いることにより培養したベニクスノキタケの子実体のＨＰＬＣスペクトルの図。本発明によって牛樟の木材片を用いることにより培養したベニクスノキタケの子実体のＨＰＬＣスペクトルの図。ベニクスノキタケの市販製品（カプセル）、野生のベニクスノキタケの子実体、ならびに本発明によってクスノキ、ソウシジュ、および牛樟により培養したベニクスノキタケの子実体のＨＰＬＣスペクトルを重ねた比較の図。

Claims

ベニクスノキタケ菌糸体の培養方法において、
（ａ）イーストを含有している培地を５〜３５℃で３〜３０日間、発酵させる工程であって、培地は、１〜８％の糖質、０．０６〜１．２％のイースト、０．０１〜０．４％の硫酸マグネシウム、および０．０１〜０．４％のリン酸二水素カリウムを含む、工程と、
（ｂ）発酵した培地に撹拌によって木粉を加える工程と、
（ｃ）木粉および培地を容器の中へ入れる工程と、
（ｄ）木粉および培地を収容している容器を滅菌する工程と、
（ｅ）木粉および培地を収容している滅菌した容器へベニクスノキタケ菌株を接種し、５〜３５℃で培養して、ベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材を得る工程と、からなる培養方法。
固体培養法である請求項１に記載の培養方法。
工程（ｃ）における容器中の湿度は６０〜９０％である請求項１に記載の培養方法。
ベニクスノキタケの子実体の培養方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法によって得たベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材を木材片へ接種する工程と、
（ｂ）接種した木材片を温度が５〜３５℃かつ湿度が６５〜８５％である環境に配置し、一定期間、培養する工程と、
（ｃ）木材片に残る基材を除去し、温度が１５〜３５℃かつ湿度が８０〜９８％である環境に木材片を配置し、一定期間、培養して、ベニクスノキタケの子実体を得る工程と、からなる培養方法。
工程（ｂ）における木材片は、温度が２５〜３０℃かつ湿度が７５〜８５％である環境において培養される請求項４に記載の培養方法。
工程（ｃ）における木材片は、温度が２６〜３０℃かつ湿度が９０〜９８％である環境
において培養される請求項４に記載の培養方法。
工程（ｂ）における培養期間は１ヶ月を超える請求項４に記載の培養方法。
工程（ｃ）におけるベニクスノキタケの子実体の培養期間は３ヶ月を超える請求項４に記載の培養方法。
ベニクスノキタケの子実体の培養方法において、
（ａ）イーストを含有している培地を５〜３５℃で３〜３０日間、発酵させる工程であって、培地は、１〜８％の糖質、０．０６〜１．２％のイースト、０．０１〜０．４％の硫酸マグネシウム、および０．０１〜０．４％のリン酸二水素カリウムを含む、と、
（ｂ）発酵した培地に撹拌によって木粉を加える工程と、
（ｃ）木粉および培地を容器の中へ入れる工程と、
（ｄ）木粉および培地を収容している容器を滅菌する工程と、
（ｅ）木粉および培地を収容している滅菌した容器へベニクスノキタケ菌株を接種し、５〜３５℃で培養して、ベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材を得る工程と、
（ｆ）工程（ｅ）において得たベニクスノキタケ菌糸体を収容している基材を木材片へ接種する工程と、
（ｇ）ベニクスノキタケ菌糸体を接種した木材片を温度が５〜３５℃かつ湿度が６５〜８５％である環境に配置し、一定期間、培養する工程と、
（ｈ）木材片に残る木片を除去し、温度が１５〜３５℃かつ湿度が８０〜９８％である環境に木材片を配置し、一定期間、培養して、ベニクスノキタケの子実体を得る工程と、からなる培養方法。
工程（ｃ）における容器中の湿度は６０〜９０％である請求項９に記載の培養方法。
工程（ｇ）における木材片は、温度が２５〜３０℃かつ湿度が７５〜８５％である環境において培養される請求項９に記載の培養方法。
工程（ｈ）における木材片は、温度が２６〜３０℃かつ湿度が９０〜９８％である環境において培養される請求項９に記載の培養方法。
工程（ｇ）における培養期間は１ヶ月を超える請求項９に記載の培養方法。
工程（ｈ）におけるベニクスノキタケの子実体の培養期間は３ヶ月を超える請求項９に記載の培養方法。