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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von
Antrodia camphorata, das die Inokulation von Antrodia camphorata-Stämmen in
ein Holzstück
umfassen, um einen Fruchtkörper
von Antrodia camphorata im großen
Maßstab
zu kultivieren.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Antrodia
camphorata wird auch "Niu
Zang Zhi-Pilz" oder "Niu Zang-Pilz" genannt (Antrodia
cinnamomea), und er gehört
zur Gattung Antrodia, Familie Polyporaceae, Ordnung Aphyllophorales,
und es ist ein beständiger
Pilz und ein in Taiwan spezifischer Fungus. Der parasitiert lediglich
an der inneren Wand eines hohlen Stamms von Cinnamomum kanehirai
Hay oder auf der feuchten Oberfläche
des abgestorbenen, faulenden Stamms von Cinnamomum kanehirai Hay
in den Berggebieten von Taiwan in einer Höhe von 200 bis 2000 m. Die
hauptsächlichen
aromatischen Verbindungen in Cinnamomum kanehirai Hay sind Terpenoide
(nicht Kampfer), wobei es sich um aromatische Verbindungen handelt,
die in Cinnamomum camphora (Linn.) Presl vorhanden sind. Der früher verwendete
wissenschaftliche Name Antrodia camphorata für Cinnamomum kanehirai Hay
wurde durch die Pilzkultivierungsexperten Dongzhu Zhang und Wenneng
Zhou in Antrodia cinnamomea geändert.
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Der
Fruchtkörper
von Antrodia camphorata wird ausgehend von dem hohlen Stamm von
Cinnamomum kanehirai Hay in einer anfänglich flachen Form kultiviert,
und er wächst
durch Anhaften an die innere Oberfläche des Stamms, wobei sich
dann die vordere Kante des Fruchtkörpers vom Stamm weg wölbt und nach
oben gebogen wird, und eine hufeisenförmige Form oder eine unregel mäßige Form
bildet. Je länger
der Fruchtkörper
wächst,
desto enger ist der Kontakt und er wird mit der Zeit lignifiziert
oder suberinisiert. Der Fruchtkörper
weist ein flach geformtes Erscheinungsbild oder ein glockenförmiges Erscheinungsbild
auf und hat einen starken bitteren Geruch. Die obere Oberfläche des
jährlich
vorkommenden oder des dauerhaften Fruchtkörpers ist tangerin, orange-braun
bis leicht fleischfarben und wandelt sich anschließend in
braun um. Die Oberfläche
ist glatt und weist konzentrische Kreise auf, und die Ostiolen liegen
in kreisförmig
oder in Form eines Vielecks vor und enthalten Sporen. Die frische
Oberfläche
der Ostiolen des Fruchtkörpers
ist tangerin, orange-braun bis leicht fleischfarben und die ältere Oberfläche ist
rötlich-braun
gefärbt.
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Aufgrund
der Detoxifizierung bei Lebensmittelvergiftung, Diarrhoe, Erbrechen,
Pestizidvergiftung usw. ist Antrodia camphorata ein exzellentes
Gegengift, und es wird darüber
hinaus angenommen, dass es vorteilhafte Wirkungen bei Krebs oder
chronischen Erkrankungen aufweist. Ein gewöhnlicher Fungus kann auf einem Kampferbaum
nicht wachsen, da dieser einen starken Geruch aufweist und Insekten
vertreiben kann; lediglich Antrodia camphorata kann auf dem in Taiwan
heimischen Cinnamomum kanehirai Hay parasitieren, nicht hingegen
auf ähnlichen
Bäumen,
wie beispielsweise auf dem gewöhnlichen
Kampferbaum und Cinnamomum camphora. Aus diesem Grund ist die Produktivität von Antrodia
camphorata nicht ausreichend. Darüber hinaus ist Cinnamomum kanehirai
Hay, auf dem Antrodia camphorata wächst, eine vorrangig geschützte Baumart, und
es ist verboten, Antrodia camphorata als Anhängsel zu ernten, sodass Antrodia
camphorata knapp bemessen ist und die Anforderungen des Marktes
nicht erfüllen
kann. Aus diesem Grund wird Antrodia camphorata auch als "Taiwan-Rubin" genannt, der lediglich
in Nanzhuang, Miaoli und Liugui, Gaoxiong usw. produziert wird.
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Die
therapeutischen Wirkungen von Antrodia camphorata bei chronischen
Erkrankungen und Krebs sind seit langem bekannt und akzeptiert,
sodass der Preis für
Antrodia camphorata auf dem Markt weiter erhöht wird. Tatsächlich haben
wissenschaftliche Arbeiten darauf hingewiesen, dass die Fähigkeit
von Antrodia camphorata, p388-Lymphomzellen der Maus abzutöten bemerkenswert
sind. Die in heißem
Wasser löslichen Polysaccharide
in den Myzelien von Antrodia camphorata können Lymphozyten im Blut eines
normalen Erwachsenen dazu stimulieren, Zytokin zu produzieren, das
humane U937-Lymphomzellen abtötet,
und sie können
ferner die Phagozytosefähigkeit
von Makrophagen erhöhen,
sowie die Proliferation von Splenozyten und die Sekretion von Interleukin
IL-5 fördern.
Darüber
hinaus kann Antrodia camphorata auch das Wachstum von Streptococcus
aureus und Trichophytone mentagrophytes sowie das von mehreren intestinalen
Floren hemmen. Im Allgemeinen hat Antrodia camphorata die Wirkungen,
dass es Blut reinigt, toxische Substanzen entfernt, die Niere stärkt, die
Leber schützt,
den Darm reguliert, das Herz stärkt,
den Blutdruck anpasst, den Körper
aufbaut, Resistenz gegenüber
Erkältung
verleiht, gegen Bakterien wirkt, Husten unterdrückt, Sputum eliminiert, Schmerzen
lindert, beruhigt, gegen Krebs wirkt, von Tumoren befreit, Toxin
entfernt usw., sodass es ein medizinischer Fungus mit weitreichender
Wirksamkeit ist.
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Die
großtechnische
künstliche
Kultivierung von Antrodia camphorata ist ein großer Engpass, der von vielen
miteinander verwandten Industriezweigen durchbrochen werden will,
damit die Verwendung von Antrodia camphorata bekannt wird, der hohe
Marktpreis stabilisiert wird und der langfristige Schutz von Cinnamomum
kanehirai Hay beibehalten wird. Gegenwärtig umfassen die meisten der
künstlichen
Kultivierungsverfahren von Antrodia camphorata die Kultivierung
von Myzelien mittels Flüssig-
oder Festfermentation und eine anschließende Inokulation der Stämme in einen
Beutel (space bag), um den Fruchtkörper von Antrodia camphorata
anzuzüchten.
Das Wachstum der Myzelien ist jedoch unzureichend, wenn diese durch
die herkömmliche Technologie
kultiviert werden, und der Ertrag ist ungewiss, und es ist wahrscheinlich,
dass verschiedene Fungi wachsen, wenn der Fruchtkörper im
Inneren des Beutels kultiviert wird. Darüber hinaus ist der Fruchtkörper von
Antrodia camphorata, der unter Verwendung des Beutels kultiviert
wurde, im Vergleich mit dem Fruchtkörper von wildem Antrodia camphorata
dünner,
und der Gehalt an Triterpenoiden ist im Vergleich zum wilden Antrodia
camphorata signifikant härter.
Es ist jedoch schwierig, den Beutel im Boden abzubauen, was zu einem Umweltproblem
führt.
Obwohl heutzutage Beutel aus biodegradierbarem Material verfügbar sind,
stellen diese aufgrund ihres hohen Preises unzweifelhaft eine Kostenbelastung
dar, soweit sie bei der Kultivierung von Fungus oder Pilzen im großen Maßstab eingesetzt
werden. Besonders wichtig ist, dass die Spore von wildem Antrodia
camphorata bei Infektion eines Holzstücks aufgrund ihrer offensichtlichen
Wirtsspezifität
nur Cinnamomum kanehirai Hay infizieren kann und darin parasitieren
kann, um einen Fruchtkörper
zu bilden. Bei der bestehenden Technologie können künstlich kultivierte Myzelien
von Antrodia camphorata keine Holzstücke von unterschiedlichen Baumarten
infizierten. Aus diesem Grund wird die Kultivierung des Fruchtkörpers unmittelbar
durch Verwendung des Holzstücks
von wildem Cinnamomum kanehirai Hay durchgeführt, das mit der Spore von
Antrodia camphorata infiziert wurde. Dieses künstliche Kultivierungsverfahren
ist jedoch nicht für
das Anzüchten
einer Kultur von Antrodia camphorata mit vielen festen Fruchtkörpern geeignet,
und der Gehalt an Triterpenoiden und Polysacchariden ist ebenfalls
begrenzt.
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Da
die meisten der kommerziell verfügbaren
Fruchtkörper
dünne,
einjährige
Fungi sind und die dicken und festen mehrjährigen Fungi selten sind, gibt
es auf dem Markt eine große
Nachfrage nach Antrodia camphorata. Es ist jedoch schwierig, natürlichen
wilden Antrodia camphorata zu bekommen, und daher gibt es ein extrem
hohen Druck bei der Ernte. Somit ist die Entwicklung eines künstlichen
Kultivierungsverfahrens für
Antrodia camphorata mit einem dicken und festen Fruchtkörper und
einem hohen Gehalt an Triterpenoiden mittels eines Holzstücks zur
wirksamen Bereitstellung von Antrodia camphorata in guter Qualität ein technisches Gebiet,
das weiterer Untersuchung bedarf.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Antrodia
camphorata ist ein in Taiwan spezifischer Fungus, der auch "Niu Zang"-Pilz (Antrodia cinnamomea)
genannt wird, und der lediglich in Cinnamomum kanehirai Hay wächst, welches
eine in Taiwan geschützte
Pflanze ist. Aus diesem Grund ist es sehr schwierig, Antrodia camphorata,
der in einem hohlen Stamm von Cinnamomum kanehirai Hay gewachsen
ist, zu ernten, und die Produktion ist darüber hinaus sehr klein. Demgemäß richtet
sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung eines Festkulturverfahrens
für Myzelien
von Antrodia camphorata, das die Inokulation von Antrodia camphorata-Stämmen in
einen Behälter umfasst,
der ein Hefekulturmedium sowie Holzmehl (wood flour) enthält, sowie
das Kultivieren, um Myzelien von Antrodia camphorata zu erhalten.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf die Bereitstellung
eines Flüssigkulturverfahrens
für Myzelien
von Antrodia camphorata, das die Inokulation von Antrodia camphorata-Stämmen in
einen Behälter umfasst,
der Hefekulturmedium enthält,
sowie das Kultivieren, um Myzelien von Antrodia camphorata zu erhalten.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf die Bereitstellung
eines Kultivierungsverfahrens für einen
Fruchtkörper
von Antrodia camphorata, das die Inokulation einer Ma trix umfasst,
welche Myzelien von Antrodia camphorata enthält, in ein Holzstück, sowie
das Kultivieren für
einen Zeitraum, um den Fruchtkörper von
Antrodia camphorata zu erhalten.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf die Bereitstellung
eines Fruchtkörpers
von Antrodia camphorata, der gemäß des Kultivierungsverfahrens
für Fruchtkörper von
Antrodia camphorata kultiviert worden ist, wobei dieser reich an
Triterpenoiden ist und wobei dieser ein medizinischer Fungus ist,
der eine vielversprechende potentielle Bioverfügbarkeit aufweist.
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Für die oben
genannten Zwecke stellt die vorliegende Erfindung ein Festkulturverfahren
für Myzelien von
Antrodia camphorata bereit, bei dem man: (a) ein Kulturmedium, das
Hefe enthält
bei 5 bis 35°C
für 3 bis 30
Tage fermentiert; (b) zu dem fermentierten Kulturmedium unter Rühren Holzmehl
zugibt; (c) das Holzmehl und das Kulturmedium in einen Behälter einbringt;
(d) den Behälter,
der das Holzmehl und das Kulturmedium enthält, sterilisiert; und (e) Antrodia
camphorata-Stämme
in den sterilisierten Behälter,
der das Holzmehl und das Kulturmedium enthält, inokuliert und bei 5 bis
35°C kultiviert,
um Myzelien von Antrodia camphorata zu erhalten.
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Vorzugsweise
enthält
das Kulturmedium in Schritt (a) 1 bis 8% Zucker, 0,06 bis 1,2% Hefe,
0,01 bis 0,4% Magnesiumsulfat sowie 0,01 bis 0,4% Kaliumdihydrogenphosphat.
Es ist notwendig, das Hefe-enthaltende Kulturmedium für 7 bis
14 Tage zu fermentieren.
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Vorzugsweise
wird die Kultur in Schritt (c) in einem Behälter mit einer Feuchtigkeit
von 60 bis 90% (am stärksten
bevorzugt 80%) durchgeführt.
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Vorzugsweise
werden die Antrodia camphorata-Stämme in Schritt (e) bei 20 bis
30°C kultiviert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Flüssigkulturverfahren für Myzelien
von Antrodia camphorata bereit, bei dem man: (a) ein Kulturmedium,
das Hefe enthält,
bei 5 bis 35°C
für 3 bis
30 Tage fermentiert; (b) das fermentierte Kulturmedium in einen
Behälter
einbringt; (c) den Behälter,
der das Kulturmedium enthält, sterilisiert;
und (d) Antrodia camphorata-Stämme
in das sterilisierte Kulturmedium inokuliert und bei 5 bis 35°C kultiviert,
um Myzelien von Antrodia camphorata zu erhalten.
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Vorzugsweise
enthält
das Kulturmedium in Schritt (a) Zucker, Hefe, Magnesiumsulfat und
Kaliumdihydrogenphosphat, und noch stärker bevorzugt enthält es 1
bis 8% Zucker, 0,06 bis 1,2% Hefe, 0,01 bis 0,4% Magnesiumsulfat
und 0,01 bis 0,4% Kaliumdihydrogenphosphat. Es ist notwendig, dass
Hefeenthaltende Kulturmedium für
7 bis 14 Tage zu fermentieren.
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Vorzugsweise
werden die Antrodia camphorata-Stämme in Schritt (d) bei 20 bis
30°C kultiviert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Kultivierungsverfahren für einen
Fruchtkörper
von Antrodia camphorata bereit, bei dem man: (a) eine Matrix, die
Myzelien von Antrodia camphorata enthält, in ein Holzstück inokuliert;
(b) das Holzstück,
das mit Myzelien von Antrodia camphorata inokuliert wurde, in eine
Umgebung einbringt, in der eine Temperatur von 5 bis 35°C und eine
Feuchtigkeit von 65 bis 85% herrscht und für einen Zeitraum kultiviert;
und (c) die Matrix, die auf dem Holzstück verblieben ist, entfernt
und das Holzstück in
eine Umgebung einbringt, in der eine Temperatur von 15 bis 35°C und eine
Feuchtigkeit von 80 bis 98% herrscht und für einen Zeitraum kultiviert,
um einen Fruchtkörper
von Antrodia camphorata zu erhalten.
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Vorzugsweise
umfasst die Matrix in Schritt (a), welche die Myzelien von Antrodia
camphorata enthält, eine
feste Matrix oder eine flüssige
Matrix, und die feste Matrix kann Holzmehl sein.
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Vorzugsweise
wird das Holzstück
in Schritt (b) für
mindestens mehr als einen Monat in einer Umgebung kultiviert, in
der eine Temperatur von 25 bis 30°C
und eine Feuchtigkeit von 75 bis 85% herrscht.
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Vorzugsweise
wird die Kultur in Schritt (c) in einer Umgebung durchgeführt, in
der eine Temperatur von 26 bis 30°C
und eine Feuchtigkeit von 80 bis 98% herrscht, und die Kultivierungszeit
beträgt
mindestens mehr als 3 Monate.
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Vorzugsweise
werden die Kulturen in Schritt (b) und (c) in einer Umgebung durchgeführt, in
der die Konzentration an CO2 geringer als
2% ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Kultivierungsverfahren für Antrodia
camphorata bereit, bei dem man: (a) ein Kulturmedium, das Hefe enthält, bei
5 bis 35°C
für 3 bis
30 Tage fermentiert; (b) zu dem fermentierten Kulturmedium unter
Rühren
Holzmehl zugibt; (c) das Holzmehl und das Kulturmedium in einen
Behälter
einbringt; (d) den Behälter,
der das Holzmehl und das Kulturmedium enthält, sterilisiert; und (e) Antrodia camphorata-Stämme in den
sterilisierten Behälter,
der das Holzmehl und das Kulturmedium enthält, inokuliert und bei 5 bis
35°C kultiviert,
um Myzelien von Antrodia camphorata zu erhalten; (f) das Holzmehl,
das die Myzelien von Antrodia camphorata enthält, in ein Holzstück inokuliert;
(g) das Holzstück,
das mit Myzelien von Antrodia camphorata inokuliert wurde, in eine
Umgebung einbringt, in der die Temperatur 5 bis 35°C und die Feuchtigkeit
65 bis 85% beträgt,
und für
einen Zeitraum kultiviert; und (h) das Holzmehl, das auf dem Holzstück verblieben
ist, entfernt und das Holzstück
anschließend
in eine Umgebung einbringt, in der die Temperatur 15 bis 35°C und die
Feuchtigkeit 80 bis 98% beträgt,
und für
einen Zeitraum kultiviert, um einen Fruchtkörper von Antrodia camphorata
zu bilden.
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Vorzugsweise
beträgt
die Feuchtigkeit in dem Behälter
in Schritt (c) 60 bis 90%, und stärker bevorzugt 80%.
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Vorzugsweise
wird das Holzstück
in Schritt (g) in einer Umgebung kultiviert, in der die Temperatur
25 bis 30°C
und die Feuchtigkeit 75 bis 85% beträgt, und in der die Konzentration
an CO2 geringer ist als 2%.
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Vorzugsweise
wird das Holzstück
in Schritt (h) in einer Umgebung kultiviert, in der die Temperatur
26 bis 30°C
beträgt,
die Feuchtigkeit 90 bis 98% beträgt,
und in der die Konzentration an CO2 geringer
ist als 2%.
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Vorzugsweise
beträgt
die Kultivierungszeit für
das Holzstück
in Schritt (g) mindestens mehr als einen Monat.
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Vorzugsweise
beträgt
die Kultivierungszeit für
den Fruchtkörper
von Antrodia camphorata in Schritt (h) mindestens mehr als drei
Monate.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner einen Fruchtkörper von
Antrodia camphorata bereit, der gemäß des Kultivierungsverfahrens
für Antrodia
camphorata kultiviert wurde.
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Aus
der obigen Beschreibung ist ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Kultivierungsverfahren
für Antrodia
camphora ta Myzelien von Antrodia camphorata, der unter Verwendung
eines künstlich
fermentierten Kulturmediums kultiviert wurde, in Holzstücke von
mehreren Baumarten inokuliert, wodurch die Spezifität des parasitierten
Wirts durchbrochen wird und das Ziel einer massiven Kultivierung
von Fruchtkörpern
von Antrodia camphorata erreicht wird; dadurch wird die dringende
Nachfrage nach Antrodia camphorata auf dem Markt erfüllt, und
der Bereich der Anwendung auf dem Gebiet der Biotechnologie und
Pharmazie wird erweitert.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Bild eines Fruchtkörpers
von Antrodia camphorata, der unter Verwendung eines Holzstücks von
Cinnamomum camphora (Linn.) Presl gemäß der vorliegenden Erfindung
kultiviert wurde.
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2 ist
ein Bild eines Fruchtkörpers
von Antrodia camphorata, der unter Verwendung eines Holzstücks von
Acacia confusa Merr gemäß der vorliegenden
Erfindung kultiviert wurde.
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3 ist
ein Bild eines Fruchtkörpers
von Antrodia camphorata, der unter Verwendung eines Holzstücks von
Cinnamomum kanehirai Hay gemäß der vorliegenden
Erfindung kultiviert wurde.
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4 ist
ein HPLC-Spektrum des Fruchtkörpers
von Antrodia camphorata, der unter Verwendung eines Holzstücks von
Cinnamomum camphora (Linn.) Presl gemäß der vorliegenden Erfindung
kultiviert wurde.
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5 ist
ein HPLC-Spektrum des Fruchtkörper
von Antrodia camphorata, der unter Verwendung eines Holzstücks von
Acacia confusa Merr gemäß der vorliegenden
Erfindung kultiviert wurde.
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6 ist
ein HPLC-Spektrum des Fruchtkörpers
von Antrodia camphorata, der unter Verwendung eines Holzstücks von
Cinnamomum kanehirai Hay gemäß der vorliegenden
Erfindung kultiviert wurde.
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7 ist
ein Überlappungsvergleich
von HPLC-Spektren eines kommerziellen Produkts (Kapsel) von Antrodia
camphorata, eines Fruchtkörpers
von wildem Antrodia camphorata und von Fruchtkörpern von Antrodia camphorata,
die mit Hilfe von Cinnamomum camphora (Linn.) Presl, Acacia confusa
Merr und Cinnamomum kanehirai Hay gemäß der vorliegenden Erfindung
kultiviert wurden.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung erhöht
die Wahrscheinlichkeit der Fruchtbildung auf dem Holzstück, indem man
Myzelien von Antrodia camphorata künstlich in ein Holzstück inokuliert,
sodass im großen
Maßstab
dicke und feste Fruchtkörper
kultiviert werden, die Aktivitäten
und Inhaltsstoffe aufweisen, welche zu denen von wildem Antrodia
camphorata vergleichbar sind oder diesen überlegen sind. Da natürlicher
Antrodia camphorata lediglich auf Cinnamomum kanehirai Hay wächst, wäre ein signifikanter
Durchbruch für
die Kultivierungstechnik mit künstlichen
Holzstücken
erreicht, wenn Antrodia camphorata-Stämme erfolgreich in ein Holzstück aus einer
anderen Baumart inokuliert werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst ein Kultivierungsverfahren für Myzelien von Antrodia camphorata:
das Fermentieren eines Kulturmediums, das Hefe enthält, bei
5 bis 35°C
für 3 bis
30 Tage. Die Mikroorganismen in dem Kulturmedium werden während der
Fermentation umgewandelt, was vorteilhaft für die anschließende Aufnahme
von Nährstoff-Bestandteilen
durch die Antrodia camphorata-Kultur ist; anschließend wird
unter Rühren
Holzmehl zu dem fermentierten Kulturmedium zugegeben; als Nächstes werden
das Holzmehl und das Kulturmedium in einen Behälter eingebracht; anschließend wird
der Behälter,
der das Holzmehl und das Kulturmedium enthält, sterilisiert; und abschließend werden
Antrodia camphorata-Stämme
in den sterilisierten Behälter,
der Holzmehl und das Kulturmedium enthält, inokuliert und es wird
bei 5 bis 35°C
kultiviert, um hochaktive Myzelien zu erhalten.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst ein Kultivierungsverfahren für Antrodia camphorata: zunächst die
Inokulation der Matrix, welche Myzelien von Antrodia camphorata
enthält,
in ein Holzstück;
als Nächstes
das Einbringen des Holzstücks,
das mit Myzelien von Antrodia camphorata inokuliert wurde, in eine Umgebung,
in der die Temperatur 5 bis 35°C
und die Feuchtigkeit 65 bis 85% beträgt, und in der die Konzentration
an CO2 geringer als 2% ist, und das Kultivieren
für einen
Zeitraum; anschließend
die Entfernung der Matrix, die auf dem Holzstück verblieben ist, und das
Einbringen des Holzstücks
in eine Umgebung, in der die Temperatur 15 bis 35°C und die
Feuchtigkeit 80 bis 98% beträgt,
und in der die Konzentration an CO2 geringer ist
als 2%, und das Kultivieren für
einen Zeitraum, um einen Fruchtkörper
von Antrodia camphorata zu erhalten. Die Matrix, die Myzelien von
Antrodia camphorata enthält,
kann eine feste Matrix oder eine flüssige Matrix sein.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst ein Kultivierungsverfahren für einen Fruchtkörper von
Antrodia camphorata: zunächst
das Fermentieren eines Kulturmediums, das Hefe enthält, bei
5 bis 35°C
für 3 bis 30
Tage; das Zufügen
von Holzmehl zu dem fermentierten Kulturmedium unter Rühren; das
Einbringen des Holzmehls und des Kulturmediums in einen Behälter; das
Sterilisieren des Behälters,
der das Holzmehl und das Kulturmedium enthält; die Inokulation von Antrodia
camphorata- Stämmen in
den sterilisierten Behälter,
der das Holzmehl und das Kulturmedium enthält, und das Kultivieren bei
5 bis 35°C,
um hochaktive Myzelien zu erhalten; die Inokulation des Holzmehls,
das Myzelien von Antrodia camphorata enthält, in ein Holzstück; das Einbringen
des Holzstücks,
das mit Myzelien von Antrodia camphorata inokuliert ist, in eine
Umgebung, in der die Temperatur 5 bis 35°C und die Feuchtigkeit 65 bis
85% beträgt,
und in der die Konzentration an CO2 geringer
ist als 2%, und das Kultivieren für einen Zeitraum; und das Entfernen
der Matrix, die auf dem Holzstück verblieben
ist, und anschließend
das Einbringen des Holzstücks
in eine Umgebung, in der die Temperatur 15 bis 35°C und die
Feuchtigkeit 80 bis 98% beträgt,
und in der der Gehalt an CO2 geringer als
2%, sowie das Kultivieren für
einen Zeitraum, um Fruchtkörper
von Antrodia camphorata zu erhalten.
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Die
Art des Holzstücks,
das für
das Kultivierungsverfahren für
den erfindungsgemäßen Fruchtkörper von
Antrodia camphorata geeignet ist, umfasst (ist jedoch nicht beschränkt auf)
Cinnamomum kanehirai, Kampferbaum, wie beispielsweise Cinnamomum
Camphora (Linn) Presl und Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Nees,
Chinesischer Kampferbaum oder ein anderer Baum, wie beispielsweise
Acacia confusa Merr, Cinnamomum osmophloeum Kaneh, Cunninghamia
Lanceolata, Machilus kusanoi, Ahorn, Psidium guajava L., Betulaceae,
Hamamelidaceae und Fagaceae, bei denen Arten mit hartem Holz besonders
bevorzugt sind.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ist auf jede Art von Antrodia
camphorata-Stämmen
anwendbar, beispielsweise, auf diejenigen, die im Institut für Ernährungswissenschaft
unter der Zugriffsnummer BCRC 35396, BCRC 35716, BCRC 35398 oder
BCRC 36401 hinterlegt worden sind, und die kostenlos erhalten werden
können.
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Die
vorliegende Erfindung wird im weiteren genauer mit Bezug auf die
nachstehenden Beispiele beschrieben, welche die vorliegende Erfindung
beschreiben sollen, jedoch den Bereich der vorliegenden Erfindung
nicht beschränken.
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Beispiele
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Beispiel 1: Kultivierung des Fruchtkörpers von
Antrodia camphorata durch Verwendung eines Holzstücks von Cinnamomum
camphora (Linn.) Presl.
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Ein
Kulturmedium, das Hefe enthält,
wurde bei 28°C
für 14
Tage fermentiert. Die Mikroorganismen im Kulturmedium werden während der
Fermentation umgewandelt, was für
die anschließende
Aufnahme von Nährstoff-Bestandteilen
durch Antrodia camphorata vorteilhaft ist. Als Nächstes wurde zu dem fermentierten Kulturmedium
unter Rühren
Holzmehl zugegeben. Anschließend
wurden das Holzmehl und das Kulturmedium in einen Kolben eingebracht,
und der mit dem Holzmehl und dem Kulturmedium gefüllte Kolben
wurde bei einer hohen Temperatur sterilisiert. Abschließend wurde
der sterilisierte Kolben, der das Holzmehl und das Kulturmedium
enthielt, mit Antrodia camphorata-Stämmen inokuliert und bei 28°C für 2,5 Monate
kultiviert, um Myzelien zu erhalten.
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Ein
Holzstück
von Cinnamomum camphora (Linn.) Presl wurde mit dem kultivierten
Holzmehl, das Antrodia camphorata-Myzelien enthielt, inokuliert und anschließend in
eine Umgebung eingebracht, in der die Temperatur 5 bis 35°C und die
Feuchtigkeit 65 bis 85% betrug, und in der die Konzentration an
CO2 geringer war als 2%, und es wurde für 2,5 Monate
kultiviert. Nachdem das Holzstück
mit Antrodia camphorata-Myzelien infiziert worden war, wurde das
Holzmehl, das auf dem Holzstück
verblieben war, entfernt. Anschließend wurde das Holzstück in eine
Umgebung eingebracht, in der die Temperatur 15 bis 35°C und die
Feuchtigkeit 80 bis 98% betrug, und in der die Konzentration an
CO2 geringer war als 2%, und es wurde für 7 Monate
kultiviert, um einen Fruchtkörper
von Antrodia camphorata zu erhalten, wie er in 1 gezeigt
ist. Es ist in 1 klar zu erkennen, dass der
Fruchtkörper
von Antrodia camphorata, der gemäß dem Kultivierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung kultiviert wurde, dick und fest ist und
eine Konfiguration aufweist, die der des Fruchtkörpers von wildem Antrodia camphorata ähnelt. Die
Analyse des Gehalts an Triterpenoid-Bestandteilen ist im Folgenden
genau beschrieben.
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Beispiel 2: Kultivierung des Fruchtkörpers von
Antrodia camphorata durch Verwendung eines Holzstücks von Acacia
confusa Merr
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Ein
Kulturmedium, das Hefe enthielt, wurde bei 28°C für 14 Tage kultiviert. Die Mikroorganismen
in dem Kulturmedium wurden während
der Fermentation umgewandelt, was für die nachfolgende Aufnahme
von Nährstoff-Bestandteilen
durch Antrodia camphorata vorteilhaft war. Als Nächstes wurde zu dem fermentierten Kulturmedium
unter Rühren
Holzmehl zugegeben. Anschließend
wurden das Holzmehl und das Kulturmedium in einen Kolben gefüllt und
bei einer hohen Temperatur sterilisiert. Abschließend wurde
der sterilisierte Kolben, der das Holzmehl und das Kulturmedium
enthielt, mit Antrodia camphorata-Stämmen inokuliert und bei 5 bis 35°C für 3 Monate
kultiviert, um Myzelien von Antrodia camphorata zu erhalten.
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Ein
Holzstück
von Acacia confusa Merr wurde mit dem kultivierten Holzmehl, das
Myzelien von Antrodia camphorata enthielt, inokuliert und anschließend in
eine Umgebung eingebracht, in der die Temperatur 5 bis 35°C und die
Feuchtigkeit 65 bis 85% betrug, und in der die Konzentration an
CO2 geringer war als 2%, und es wurde für 3 Monate
kultiviert. Nachdem das Holzstück
mit Myzelien von Antrodia camphorata infiziert worden war, wurde
das Holzmehl, das auf dem Holzstück
verblieben war, entfernt. Anschließend wurde das Holzstück in eine
Umgebung eingebracht, in der die Temperatur 15 bis 35°C und die
Feuchtigkeit 80 bis 98% betrug, und in der die Konzentration an
CO2 geringer war als 2%, und es wurde für 6 Monate
kultiviert, um einen Fruchtkörper
von Antrodia camphorata zu erhalten, wie er in 2 gezeigt
ist. In 2 ist deutlich zu erkennen,
dass der Fruchtkörper
von Antrodia camphorata, der gemäß dem Kultivierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung kultiviert wurde, dick und fest ist und
eine Konfiguration aufweist, die der eines Fruchtkörpers von wildem
Antrodia camphorata ähnelt.
Die Analyse des Gehalts an Triterpenoid-Bestandteilen wird im Folgenden näher beschrieben.
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Beispiel 3: Kultivierung eines Fruchtkörpers von
Antrodia camphorata durch Verwendung eines Holzstücks von Cinnamomum
kanehirai Hay
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Ein
Kulturmedium, das Hefe enthielt, wurde bei 5 bis 35°C für 3 bis
30 Tage kultiviert. Die Mikroorganismen in dem Kulturmedium wurden
während
der Fermentation umgewandelt, was für die nachfolgende Aufnahme
von Nährstoff-Bestandteilen
durch Antrodia camphorata vorteilhaft ist. Als Nächstes wurde dem fermentierten
Kulturmedium unter Rühren
Holzmehl zugegeben. Anschließend
wurden das Holzmehl und das Kulturmedium in einen Kolben gefüllt und
bei einer hohen Temperatur sterilisiert. Abschließend wurde
der sterilisierte Kolben, der das Holzmehl und das Kulturmedium
enthielt, mit Antrodia camphorata-Stämmen inokuliert, und es wurde
bei 5 bis 35°C
für 2,5
Monate kultiviert, um Myzelien zu erhalten.
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Ein
Holzstück
von Cinnamomum kanehirai Hay wurde mit dem kultivierten Holzmehl,
das Myzelien von Antrodia camphorata enthielt, inokuliert und anschließend in
eine Umgebung eingebracht, in der die Temperatur 5 bis 35°C und die
Feuchtig keit 65 bis 85% betrug, und in der die Konzentration an
CO2 geringer war als 2%, und es wurde für 2,5 Monate
kultiviert. Nachdem das Holzstück
mit Myzelien von Antrodia camphorata infiziert worden war, wurde
das Holzmehl, das auf dem Holzstück
verblieben war, entfernt. Anschließend wurde das Holzstück in eine
Umgebung eingebracht, in der die Temperatur 15 bis 35°C und die
Feuchtigkeit 80 bis 98% betrug, und in der die Konzentration an
CO2 geringer war als 2%, und es wurde für 8 Monate
kultiviert, um einen Fruchtkörper
von Antrodia camphorata zu erhalten, wie er in 3 gezeigt
ist. In 3 ist deutlich zu erkennen,
dass der Fruchtkörper
von Antrodia camphorata, der gemäß dem Kultivierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung kultiviert wurde, dick und fest ist und
eine Konfiguration aufweist, die der eines Fruchtkörpers von
wildem Antrodia camphorata ähnelt.
Die Analyse der Konzentration an Triterpenoid-Bestandteilen wird
im Folgenden näher
beschrieben.
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Beispiel 4: Vergleich der Inhaltsstoff-Gehalte
von Antrodia camphorata, der gemäß der vorliegende
Erfindung kultiviert wurde, wildem Antrodia camphorata und kommerziell
verfügbarem
Antrodia camphorata
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Das
Fingerprint-Spektrum jeder Probe der Hochdruck-Flüssigchromatographie
(HPLC) wird auf Basis des Prinzips analysiert, nachdem gleiche Arten
die gleichen Inhaltsstoffe aufweisen. Die Fingerprint-Spektren werden
dazu verwendet, die Homologie zwischen den Proben zu vergleichen,
und um den Gesamtgehalt der Inhaltsstoffe zu analysieren und zu
vergleichen, so dass die Qualität
jeder Probe bewertet wird.
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Herstellung der Probenlösung
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Fünf Proben,
die den Fruchtkörper
von wildem Antrodia camphorata, den Pulver-Inhalt von kommerziell
verfügbaren
Kap seln von Antrodia camphorata, und den künstlichen Fruchtkörper von
Antrodia camphorata, der gemäß dem Kultivierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung auf drei unterschiedlichen Holzstücken, d.
h. Cinnamomum kanehirai Hay, Cinnamomum camphora (Linn.) Presl und
Acacia confusa Merr (Beispiele 1 bis 3), kultiviert wurde, umfassten,
wurden in dem Experiment analysiert. Zunächst wurden diese 5 Proben
in kleine Stücke
geschnitten oder in Pulver zermahlen, in einen Ofen mit einer konstanter
Temperatur von 60°C
eingebracht und für
20 Stunden durchgehend getrocknet und anschließend herausgenommen und in
einem Trockner gekühlt.
Als Nächstes
wurden 800 mg jeder Probe genau abgewogen und in 25 ml-Messkolben
eingebracht; anschließend
wurden 15 ml Methanol zugegeben, und die Messkolben wurden fest
verschlossen. Anschließend
wurden die Messkolben in einem Ultraschallschüttler für 3 Stunden geschüttelt, und die
abgesaugte Lösung
wurde durch eine Filtermembran von 0,45 μm gefiltert, wobei eine klare
Flüssigkeit
erhalten wurde, die als Probenlösung
für die
Analyse verwendet wurde.
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Hochdruckflüssigchromatographie:
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Die
Hochdruck-Flüssigchromatographie,
die bei der Analyse verwendet wurde, ist aus der HITACHI D-7000
Serie, einschließlich
einer Pumpe: L-7100, eines Detektors: L-7420, eines Autosamplers:
L-7200, wobei die HPLC-Säule
RP-18 eine Länge
von 250 mm und einen inneren Durchmesser von 4,6 mm (Partikelgröße von 5 μm) aufwies.
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Die
Analysebedingungen umfassten: Flussrate: 1 ml/min, Absorptionswellenlänge bei
der Detektion: UV 210 nm, Injektionsvolumen: 25 μl, Analysezeit: 190 min. Für eine Gradientenelution
wurde ein System aus zwei Lösungsmitteln
als mobile Phasen verwendet: Mobile Phase A: 10% Acetonitril (enthaltend
1% Phosphorsäure),
mobile Phase B: 100% Acetonitril (enthal tend 1% Phosphorsäure). Die
Bedingungen der Gradientenelution sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Bedingungen der Gradientenelution
der mobilen Phase der HPLC
Zeit
(min) | Mobile
Phase A | Mobile
Phase B | Fluss
(ml/min) |
0,0 | 100,0 | 0,0 | 1,0000 |
5,0 | 100,0 | 0,0 | 1,0000 |
10,0 | 70,0 | 30,0 | 1,0000 |
15,0 | 55,0 | 45,0 | 1,0000 |
25,0 | 55,0 | 45,0 | 1,0000 |
30,0 | 50,0 | 50,0 | 1,0000 |
45,0 | 50,0 | 50,0 | 1,0000 |
55,0 | 40,0 | 60,0 | 1,0000 |
70,0 | 40,0 | 60,0 | 1,0000 |
80,0 | 20,0 | 80,0 | 1,0000 |
90,0 | 0,0 | 100,0 | 1,0000 |
145,0 | 0,0 | 100,0 | 1,0000 |
165,0 | 100,0 | 0,0 | 1,0000 |
190,0 | 100,0 | 0,0 | 1,0000 |
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Die
Fläche
des Absorptionspeaks wird automatisch durch die integrierte Software
berechnet, wobei der Schwellenwert für die Peakunterdrückung (peak
rejection level) auf 200000 eingestellt wird, und solche mit einer
Fläche
des Absorptionspeaks von weniger als 200000 als Hintergrund angesehen
werden und nicht berechnet sondern verworfen werden; solche mit
einer Fläche
des Absorptionspeaks, die 200000 erreicht, die jedoch einen irregulären Absorptionspeak
aufweisen, werden ebenfalls durch manuelle Überprüfung verworfen; die verlässlichen
Flächen
des Absorptionspeaks werden schließlich für jede Probenlösung für die Analyse addiert
und miteinander verglichen, um eine Bewertung der Qualität durchzuführen.
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Wie
in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt ist, beträgt die Integration der Gesamtfläche der
Absorptionspeaks für
den Fruchtkörper
von wildem Antrodia camphorata 139.983.370; die Integration der
Gesamtfläche
für den
Fruchtkörper
von Antrodia camphorata, der auf dem Holzstück von Acacia confusa Merr
kultiviert wurde, beträgt
76.165.715; die Integration der Gesamtfläche für den Fruchtkörper von
Antrodia camphorata, der auf einem Holzstück von Cinnamomum camphora
(Linn.) Presl kultiviert wurde, beträgt 111.356.206; die Integration
der Gesamtfläche
für den
Fruchtkörper
von Antrodia camphora, der auf einem Holzstück von Cinnamomum kanehirai
Hay kultiviert wurde, beträgt
152.760.267; und die Integration der Gesamtfläche für kommerziell erhältliche
Kapseln von Antrodia camphorata beträgt 21.126.138, womit dieser
Wert weit unter denjenigen für
die 4 Proben liegt. Tabelle 2. Flächen der Absorptionspeaks für Assaylösungen von
verschiedenen Arten von künstlich
kultivierten Fruchtkörpern
von Antrodia camphorata
Wellenlänge: 210
nm | Absorptionsintensität: 1300
mV |
Probenname | Gesamtfläche der
Absorptionspeaks* |
Kommerziell
verfügbarer
Antrodia camphorata | 21.126.138 |
Wilder
Antrodia camphorata | 139.983.370 |
Künstlich
kultivierter Antrodia camphorata durch Verwendung eines anderen
Baums (Cinnamomum camphora (Linn.) Presl) | 111.356.206 |
Künstlich
kultivierter Antrodia camphorata durch Verwendung eines anderen
Baums (Acacia confusa Merr) | 76.165.715 |
Künstlich
kultivierter Antrodia camphorata durch Verwendung eines anderen
Baums (Cinnamomum kanehirai Hay) | 152.760.267 |
*Schwellenwert
für die
Unterdrückung
der Absorptionspeakfläche:
200.000;
*Zeitlimit für
die Aufnahme: 180 min. |
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Ergebnisse
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Die
Spektren dieser 5 Proben werden bei derselben Absorptionsintensität (1300
mV) und derselben Retentionszeit (180 min) analysiert. Die entsprechenden
HPLC-Spektren von Cinnamomum camphora (Linn.) Presl, Acacia confusa
Merr und Cinnamomum kanehirai Hay sind in den 4, 5 und 6 gezeigt.
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Darüber hinaus
werden unter Verwendung dieser 5 Proben Fingerprint-Spektren des
kommerziellen Produkts (Kapsel) von Antrodia camphorata, des Fruchtkörpers von
wildem Antrodia camphorata und der künstlichen Fruchtkörper von
Antrodia camphorata, welche durch die drei unterschiedlichen Holzstücke (d.
h. Cinnamomum camphora (Linn.) Presl, Acacia confusa Merr und Cinnamomum
kanehirai Hay kultiviert worden sind, mittels Überlappung miteinander verglichen,
wie es in 7 gezeigt ist. Es kann anhand
der überlappenden
Figur beobachtet werden, dass die Fingerprint-Spektren der drei
künstlich
kultivierten Fruchtkörper
von Antrodia camphorata dieselbe Absorptionsgruppe an derselben
Position (d. h. bei derselben Retentionszeit) aufweisen wie der
Fruchtkörper
von wildem Antrodia camphorata, mit der Ausnahme, dass es einige
Unterschiede in Bezug auf die Absorptionsintensitäten gibt;
darüber
hinaus unterscheidet sich das Fingerprint-Spektrum des kommerziell
verfügbaren
Produkts von Antrodia camphorata signifikant von denjenigen der
drei Proben, und die Absorptionsintensität ist sehr schwach. Das Ergebnis,
das durch Vergleich und Analyse der überlappenden Figur erhalten
wurde, zeigt eindeutig, dass die künstlichen Fruchtkörper von
Antrodia camphorata, die mit Cinnamomum kanehirai Hay, Cinnamomum
camphora (Linn.) Presl, Acacia confusa Merr kultiviert wurden, homolog
zu dem Fruchtkörper
von wildem Antrodia camphorata sind, was darauf verweist, dass die Fruchtkörper von
Antrodia camphorata der vorliegenden Erfindung, die mittels unterschiedlicher
Holzstücke kultiviert
wurden, ähnliche
Triterpenoid-Inhaltsstoffe und dieselben physiologischen Aktivitäten und
Verwendungen aufweisen wie der Fruchtkörper von wildem Antrodia camphorata.
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Es
läßt sich
aus den Analyseergebnissen beobachten, dass die vorliegende Erfindung
ein künstliches Kultivierungs verfahren
für den
Fruchtkörper
von Antrodia camphorata in großem
Maßstab
bereitstellt, und dass die kultivierten Fruchtkörper von Antrodia camphorata
dick und fest sind und die aktiven Inhaltsstoffe enthalten, die
mit denjenigen aus wildem oder kommerziell verfügbarem, künstlich kultiviertem Antrodia
camphorata übereinstimmen
oder diesen überlegen
ist. Aus diesem Grund ist die vorliegende Erfindung ein signifikanter
Durchbruch auf dem Gebiet der künstlichen
Kultivierung des Fruchtkörpers
von Antrodia camphorata.
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Andere Aspekte der Ausführung
-
Obwohl
die vorliegende Erfindung wie oben beschrieben anhand von bevorzugten
Beispielen offenbart wird, ist diese nicht auf die Offenbarung der
Beispiele beschränkt,
und es wird für
den Fachmann ersichtlich sein, dass zahlreiche Veränderungen
und Modifikationen durchgeführt
werden können,
ohne vom Umfang oder Kern der Erfindung abzuweichen. Aus diesem
Grunde hängt
der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung vom Umfang der nachfolgenden
Ansprüche
definiert ab.