JP4733388B2 - Ｇｓｋ−３のインヒビターとして有用なピラゾール組成物 - Google Patents

Description

（関連出願に対する相互参照）
本願は、２００２年８月２日に出願された米国仮特許出願６０／４００，９６７優先権を主張する。その内容は、本明細書中で参考として援用される。

（発明の技術分野）
本発明は、プロテインキナーゼ、特に、セリン／スレオニンプロテインキナーゼであるグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）のインヒビターに関する。本発明はまた、本発明のインヒビターを含有する組成物、およびこれらの組成物を種々の障害（例えば、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症（ＭＳ）、脳卒中、神経系障害および神経変性障害、ならびに精神障害）の処置において利用する方法を提供する。

（発明の背景）
新しい治療薬の探索は、近年、標的疾患に関連する酵素および他の生体分子の構造のより良い理解によって、非常に助けられている。広範な研究の目的になっている酵素のうちの１つの重要なクラスは、プロテインキナーゼである。

プロテインキナーゼは、細胞内のシグナル伝達を媒介する。これらは、ヌクレオシド三リン酸からシグナル経路に関与するタンパク質アクセプターへのリン酸基転移に影響を与えることによってこのことを行う。そこを通って細胞外および他の刺激による種々の細胞応答が細胞の内側で起こるようにする、多数のキナーゼおよび経路が存在する。このような刺激の例としては、環境ストレスシグナルおよび化学ストレスシグナル（例えば、浸透圧ショック、熱ショック、紫外線照射、菌体内毒素、およびＨ_２Ｏ_２）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α））、および増殖因子（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））が挙げられる。細胞外刺激は、細胞の増殖、移動、分化、ホルモンの分泌、転写因子の活性化、筋肉の収縮、グルコース代謝、タンパク質合成の制御、および細胞周期の調節に関連する、１以上の細胞応答に影響し得る。

多くの疾患が、プロテインキナーゼ媒介事象により誘発される異常な細胞応答に関連する。これらの疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝病、神経疾患および神経変性疾患、癌、心血管疾患、アレルギーおよび喘息、アルツハイマー病およびホルモン関連疾患が挙げられる。従って、医薬品化学において、治療薬として有効なプロテインキナーゼインヒビターを見出すための相当な努力がなされている。

グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、各々が異なる遺伝子によってコードされるαアイソフォームおよびβアイソフォームを含む、セリン／スレオニンプロテインキナーゼである（Ｃｏｇｈｌａｎら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，７９３−８０３（２０００）；ＫｉｍおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄｅｖ．，１０，５０８−５１４（２０００））。ＧＳＫ−３は、種々の疾患（糖尿病、アルツハイマー病、ＣＮＳ障害（例えば、双極性障害および神経変性疾患）、ならびに心筋細胞肥大が挙げられる）に関与する（例えば、ＷＯ ９９／６５８９７；ＷＯ ００／３８６７５；ＫａｙｔｏｒおよびＯｒｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１２、２７５−８（２０００）；Ｈａｑら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５１，１１７−３０（２０００）；Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、８、１２６−３２（２００２）を参照のこと）。これらの疾患は、ＧＳＫ−３が役割を果たす特定の細胞シグナル経路の異常な作用に関連する。

ＧＳＫ−３は、多数の調節タンパク質をリン酸化し、そしてそのタンパク質の活性を調節することが見出されている。これらのタンパク質としては、グリコーゲン合成のために必要な律速酵素であるグリコーゲンシンターゼ、微小管関連タンパク質Ｔａｕ、遺伝子転写因子β−カテニン、翻訳開始因子ｅ１Ｆ−２Ｂ、ならびにＡＴＰシトレートリアーゼ、アキシン（ａｘｉｎ）、熱ショック因子−１、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＣＲＥＢ、およびＣＥＰＢαが挙げられる。これらの様々な標的は、細胞の代謝、増殖、分化および発生の多くの局面において、ＧＳＫ−３に関与する。

ＩＩ型糖尿病の処置に関連するＧＳＫ−３媒介経路において、インスリン誘導シグナルは、細胞のグルコース摂取およびグリコーゲン合成をもたらす。この経路において、ＧＳＫ−３は、インスリン誘導シグナルのネガティブな調節因子である。通常は、インスリンの存在は、ＧＳＫ−３が媒介するリン酸化の阻害およびグリコーゲン合成の不活化を引き起こす。ＧＳＫ−３の阻害は、増加したグリコーゲン合成およびグルコース摂取をもたらす（Ｋｌｅｉｎら，ＰＮＡＳ，９３，８４５５−９（１９９６）；Ｃｒｏｓｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０３、２１−２６（１９９４）；Ｃｏｈｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２１，５５５−５６７（１９９３）；およびＭａｓｓｉｌｌｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２９９，１２３−１２８（１９９４）；ＣｏｈｅｎおよびＦｒａｍｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，７６９−７６（２００１））。しかし、糖尿病患者においてインスリン応答が損なわれる場合、インスリンの比較的高い血液レベルの存在にもかかわらず、グリコーゲン合成およびグルコース摂取は増加しない。これは、急性かつ長期の効果を伴うグルコースの異常に高い血液レベルをもたらし、最終的に心血管疾患、腎不全および失明を生じ得る。このような患者においては、インスリンにより誘導されるＧＳＫ−３の正常な阻害は生じない。ＩＩ型糖尿病を有する患者において、ＧＳＫ−３が過剰発現されることもまた、報告されている（ＷＯ ００／３８６７５）。従って、ＧＳＫ−３の治療的インヒビターは、インスリンに対する応答障害に罹患する糖尿病患者を処置するために有用である。

アポトーシスは、虚血性脳損傷の病態生理学に関係している（Ｌｉら、１９９７；Ｃｈｏｉら、１９９６；Ｃｈａｒｒｉａｕｔ−Ｍａｒｌａｎｇｕｅら、１９９８；ＧｒａｈｍおよびＣｈｅｎ、２００１；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９９；Ｎｉｃｏｔｅｒａら、１９９９）。最近の刊行物は、ＧＳＫ−３βの活性化が、アポトーシスの機構に関連し得ることを示す（ＫａｙｔｏｒおよびＯｒｒ、２００２；Ｃｕｌｂｅｒｔら、２００１）。中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって誘導された虚血性脳卒中のラットモデルにおける研究は、増加したＧＳＫ−３β発現が、虚血に従うことを示した（Ｗａｎｇら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、８５９、３８１−５、２０００；Ｓａｓａｋｉら、Ｎｅｕｒｏｌ Ｒｅｓ、２３、５８８−９２、２００１）。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、ラットにおいて、中大脳動脈閉塞（ＭＣＯ）の後に、虚血性脳損傷を減少させた（Ｆｉｓｈｅｒら、１９９５；Ｓｏｎｇら、２００２）。実際に、ラットにおける虚血モデルで示されたＦＧＦの神経保護効果は、ＧＳＫ−３βのＰＩ−３キナーゼ／ＡＫＴ依存性不活性化によって媒介され得る（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００２）。従って、大脳の虚血性事象の後のＧＳＫ−３βの阻害は、虚血性脳損傷を改善し得る。

ＧＳＫ−３はまた、心筋梗塞に関係する。Ｊｏｎａｓｓｅｎら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ、８９：１１９１、２００１（再灌流でのインスリン投与による心筋梗塞における減少は、Ａｋｔ依存性シグナル経路を介して媒介される）；Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０４：３３０、２００１（Ａｋｔ活性化は、インビボで、心臓の機能を保ち、かつ一過性の心臓虚血後の心筋細胞傷害を予防する）；Ｍｉａｏら、Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ、３２：２３９７、２０００（心臓における冠動脈内のアデノウイルス媒介Ａｋｔ遺伝子送達は、インビボで、虚血性再灌流後に総梗塞サイズを減少させる）；およびＦｕｊｉｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０１：６６０、２０００（Ａｋｔシグナリングは、インビトロで、心筋細胞アポトーシスを阻害し、かつマウスの心臓における虚血性再灌流傷害から守る）を参照のこと。

ＧＳＫ−３活性は、頭部外傷において役割を果たす。Ｎｏｓｈｉｔａら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ、９：２９４、２００２（Ａｋｔ／ＰＩ３−キナーゼ経路のアップレギュレーションは、外傷性脳損傷後の細胞生存のために重要であり得る）、およびＤｉｅｔｒｉｃｈら、Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１３：３０９、１９９６（ｂＦＧＦの外傷後投与は、外傷性脳損傷のラットモデルにおいて、損傷した皮質ニューロンおよび総挫傷容積を有意に減少した）を参照のこと。

ＧＳＫ−３はまた、精神障害において役割を果たすことが公知である。Ｅｌｄｅｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、８：１２６、２００２；Ｌｉら、Ｂｉｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ、４：１３７、２００２（抗精神病の抗躁うつ病薬であるＬｉＣｌおよびバルプロ酸は、ＧＳＫ３活性を減少させ、かつβ−カテニンを増加させる）、およびＬｉｊａｍら、Ｃｅｌｌ、９０：８９５、１９９７（乱雑な（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）ＫＯマウスは、異常な社会的行動および不完全な感覚運動ゲーティングを示した。ＷＮＴ経路に関与する乱雑な細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｍｉｃ）タンパク質は、ＧＳＫ３β活性を阻害する）を参照のこと。

リチウムおよびバルプロ酸によるＧＳＫ３阻害が、軸索の再構築を誘導し、かつシナプスの結合性を変化させることが示されている。Ｋａｙｔｏｒ ＆ Ｏｒｒ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、１２：２７５、２００２（ＧＳＫ３のダウンレギュレーションは、微小管関連タンパク質であるｔａｕ、ＭＡＰ１およびＭＡＰ２における変化を引き起こす）、およびＨａｌｌら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０：２５７、２００２（リチウムおよびバルプロ酸は、軸索に沿って成長した円錐様構造の形成を誘導する）を参照のこと。

ＧＳＫ−３活性はまた、アルツハイマー病に関連している。この疾患は、周知のβ−アミロイドペプチドおよび細胞内神経原線維変化の形成の存在によって特徴付けられる。この神経原線維変化は、高リン酸化Ｔａｕタンパク質を含み、ここで、Ｔａｕは、異常な部位でリン酸化される。ＧＳＫ−３は、細胞モデルおよび動物モデルにおいて、これらの異常な部位をリン酸化することを示している。さらに、ＧＳＫ−３の阻害は、細胞におけるＴａｕの高リン酸化を防止することが示されている（Ｌｏｖｅｓｔｏｎｅら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，４，１０７７−８６（１９９４）；およびＢｒｏｗｎｌｅｅｓら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８，３２５１−５５（１９９７）；ＫａｙｔｏｒおよびＯｒｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１２，２７５−８（２０００）］。ＧＳＫ３を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて、有意に増加したＴａｕ高リン酸化およびニューロンの異常な形態が観察された（Ｌｕｃａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ、２０：２７−３９（２００１））。活性なＧＳＫ３は、予め変化したニューロンの細胞質に蓄積し、このことが、ＡＤを有する患者の脳において神経原線維変化をもたらし得る（Ｐｅｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ、５８、１０１０−１９（１９９９））。従って、ＧＳＫ３の阻害は、神経原線維変化を遅らせるか停止させ、従って、アルツハイマー病の重篤度を処置するかまたは低減する。

ＧＳＫ−３がアルツハイマー病において果たす役割についての証拠は、インビトロで示されている。Ａｐｌｉｎら（１９９６），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６７：６９９；Ｓｕｎら（２００２），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ３２１：６１（ＧＳＫ３ｂは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の細胞質ドメインをリン酸化し、ＧＳＫ３ｂの阻害は、ＡＰＰトランスフェクト細胞におけるＡｂ４０およびＡｂ４２の分泌を減少する）；Ｔａｋａｓｈｉｍａら（１９９８），ＰＮＡＳ ９５：９６３７；Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍら（２００１），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：７３６６（ＧＳＫ３ｂは、ＡＰＰからのＡβの合成においてγ−セクレターゼと関連するプレレセニリン−１と複合体を形成し、これをリン酸化する）；Ｔａｋａｓｈｉｍａら（１９９８）， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３１：３１７（Ａｂ（２５−３５）によるＧＳＫ３ｂの活性化は、海馬ニューロンにおけるｔａｕのリン酸化を増強する。この観察は、Ａβと、ＡＤの別の過剰リン酸化ｔａｕで形成される神経原線維のもつれ（ｔａｎｇｌｅ）との間の結び付きを提供する）；Ｔａｋａｓｈｉｍａら（１９９３），ＰＮＡＳ ９０：７７８９（ＧＳＫ３ｂ発現または活性のブロックは、皮質および海馬培養物のＡｂ誘導性神経変性を防止する）；Ｓｕｈａｒａら（２００３），Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．２４：４３７（細胞内Ａｂ４２は、Ａｋｔ／ＧＳＫ−３ｂシグナル伝達依存的機構の活性化を妨害することにより、内皮細胞に対して毒性である）；Ｄｅ Ｆｅｒｒａｒｉら（２００３）Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ８：１９５（リチウムは、Ａβ原繊維により誘導される毒性およびｂ−カテニンの減少した核トランスロケーション／脱安定化からＮ２Ａ細胞および原発性海馬神経を保護する）；ならびにＰｉｇｉｎｏら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２３：４４９９，２００３（アルツハイマーのプレセニリン１における変異は、ＧＳＫ−３活性を調節不能にしてこれを増加させ、次いで神経における軸索の輸送に損傷を与える。影響を受けたニューロンにおける結果としての軸索の輸送の減少は、最終的に、神経変性を導く）を参照のこと。

ＧＳＫ−３がアルツハイマー病において果たす役割についての証拠は、インビボで示されている。Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（１９９６），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ９２：２３２；Ｐｅｉら（１９９９），Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５８：１０１０（ＧＳＫ３ｂの免疫反応性は、ＡＤ脳の敏感な領域において上昇する）；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら（２００２），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ８３：１５２９（条件付きＧＳＫ３ｂ過剰発現を有するトランスジェニックマウスは、ＡＤのトランスジェニックＡＰＰマウスモデルと同様に認識不全を示す）；ＤｅＰｅｒｒａｒｉら（２００３）Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８：１９５（継続的なリチウム処置は、Ａβ原繊維の海馬内注入により引き起こされる神経変性および行動障害（モリスの水迷路）を減少させた）；ＭｃＬａｕｒｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，８：１２６３，２００２（ＡＤのトランスジェニックマウスにおけるＡβ免疫は、ＡＤ様神経病理および空間記憶障害の両方を減少する）；およびＰｈｉｅｌら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２３：４３５（ＧＳＫ３は、ＡＤ ｔｇマウスにおけるγセクレターゼの直接的阻害を通じてアミロイドβペプチド産生を調節する）を参照のこと。

プレセニリン−１およびキネシン−１はまた、近年Ｐｉｇｉｎｏ，Ｇ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２３：４４９９，２００３）によって記載されたように、ＧＳＫ−３の基質であり、ＧＳＫ−３がアルツハイマー病において果たす役割の別の機構に関する。ＧＳＫ３βは、キネシン−１軽鎖をリン酸化して、膜結合オルガネラからキネシン−１を遊離し、迅速な巡行的軸索輸送の減少を導くことが見出された（Ｍｏｒｆｉｎｉら，２００２）。この著者らは、ＰＳ１における変異が、ＧＳＫ−３活性を調節不全にしてこれを増加させ、次いで、ニューロンにおける軸索輸送に損傷を与えることを示唆している。影響を受けたニューロンにおけるその後の軸索輸送の減少は、最終的に、神経変性を導く。

ＧＳＫ−３はまた、筋萎縮性側索硬化（ＡＬＳ）にも関連する。ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＣｌｅｖｅｌａｎｄ，１９９９（軸索輸送は、ｍＳＯＤ１マウスにおけるＡＬＳの最早期において妨げられる）；Ｗａｒｉｔａら，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，６：３４５，２００１（大部分の脊髄運動ニューロンは、このＡＬＳのＳＯＤ１ ｔｇ動物モデルにおけるニューロンの有意な喪失の前の早期段階および前駆症状段階において、ＰＩ３−ＫおよびＡｋｔの両方に対する免疫反応性を喪失した）；およびＳａｎｃｈｅｚら，２００１（ＰＩ−３Ｋの阻害は、ＧＳＫ３活性化により媒介される神経突起の退縮を誘導する）を参照のこと。

ＧＳＫ−３活性はまた、脊髄および末梢神経の損傷にも関連する。リチウムおよびバルプロ酸によるＧＳＫ３阻害は、軸索のリモデリングを誘導し、シナプスの連結性を変更し得ることが示された。ＫａｙｔｏｒおよびＯｒｒ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，１２：２７５，２００２（ＧＳＫ３のダウンレギュレーションは、微小管結合タンパク質；ｔａｕ、ＭＡＰ１、および２における変化を引き起こす）を参照のこと。Ｇｒｏｔｈｅら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，８８５：１７２，２０００（ＦＧＦ２は、シュヴァン細胞の増殖を刺激し、軸索成長の間の髄鞘形成を阻害する）；ＧｒｏｔｈｅおよびＮｉｋｋｈａｈ，２００１（ＦＧＦ−２は、神経破壊後５時間以内に近位および遠位の神経断端においてアップレギュレートされる）；およびＳａｎｃｈｅｚら，２００１（ＰＩ−３Ｋの阻害は、ＧＳＫ３活性化により媒介される神経突起の退縮を誘導する）もまた参照のこと。

別のＧＳＫ−３の基質は、β−カテニンであり、これは、ＧＳＫ−３によるリン酸化後、分解される。精神分裂病の患者では、β−カテニンのレベルが低下していることが報告されており、これはまた、神経細胞死の増大に関係している他の疾患と関連している［Ｚｈｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３９５，６９８〜７０２（１９９８）；Ｔａｋａｓｈｉｍａら、ＰＮＡＳ，９０，７７８９−９３（１９９３）；Ｐｅｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．，５６，７０〜７８（１９９７）；およびＳｍｉｔｈら、Ｂｉｏ−ｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１，６３５−６３９（２００１）］。さらに、β−カテニンおよびＴｃｆ−４は、脈管平滑筋細胞のアポトーシスを阻害し増殖を促進することにより脈管のリモデリングにおいて二重の役割を果たす（Ｗａｎｇら，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，９０：３４０，２００２）。従って、ＧＳＫ−３は、脈管形障害に関連する。Ｌｉｕら，ＦＡＳＥＢＪ，１６：９５０，２００２（ＧＳＫ３の活性化は、肝細胞増殖因子を減少して、内皮細胞障壁機能を変更し、脈管の統合性を減少する）およびＫｉｍら，ｋ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：４１８８８，２００２（ＧＳＫ３βの活性化は、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグアッセイを用いたインビボ脈管形成を阻害する；ＧＳＫ３βシグナル伝達の阻害は、毛細管形成を増強する）を参照のこと。

ＧＳＫ−３とハンティングトン病との間の関連が示されている。Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７７：３３７９１，２００２（ＧＳＫ３βの阻害は、β−カテニンおよびその関連する転写経路における増加を通じて、ポリグルタミンにより誘導されるニューロン細胞および非ニューロン細胞の死から細胞を保護する）を参照のこと。ＧＳＫ３の過剰発現は、熱ショック転写因子１および熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０の活性化を減少する（Ｂｉｊｕｒら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７５：７５８３，２０００）。ＨＳＰ７０は、インビトロＨＤモデルにおけるポリ−（Ｑ）凝集体および細胞死の両方を減少することが示されている（Ｗｙｔｔｅｎｂａｃｈら，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，１１：１１３７，２００２）。

ＧＳＫ−３は、ＦＧＦ−２レベルに影響し、それらのレセプターは、ラット脳を再ミエリン化する脳凝集体培養物の再ミエリン化の間に増加する。Ｃｏｐｅｌｍａｎら，２０００，Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈら，２０００；ならびにＨｉｎｋｓおよびＦｒａｎｋｌｉｎ，２０００を参照のこと。ＦＧＦ−２は、オリゴ樹状細胞による突起成長を誘導し、再ミエリン化におけるＦＧＦの関与と結び付いていること（ＯｈおよびＹｏｎｇ，１９９６；Ｇｏｇａｔｅら，１９９４）およびＦＧＦ−２遺伝子療法は、実験的アレルギー脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスの回復を改善することが示された（Ｒｕｆｆｉｎｉら，２００１）こともまた発見された
ＧＳＫ−３はまた、毛髪成長にも関連する。というのも、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、毛包の形態形成および分化において主要な役割を果たすことが示されているからである（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏｔら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１４：１１８１，２０００；Ｍｉｌｌａｒ，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１１８：２１６，２００２）。皮膚におけるＷｎｔシグナル伝達のインヒビターを構成的に発現させると、毛包が発達できなかったことが見出された。Ｗｎｔシグナル伝達は、毛包の初期発達に必要とされ、ＧＳＫ３は、β−カテニンを阻害することにより、Ｗｎｔ経路を構成的に調節する（Ａｎｄｌら，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ２：６４３，２００２）。一過的なＷｎｔシグナルは、β−カテニンおよび内皮毛包前駆体におけるＴＣＦにより調節される遺伝子転写を活性化することにより、新規の毛髪成長サイクルの開始に重要な初期刺激を提供する。（Ｖａｎ Ｍａｔｅｒら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１７：１２１９，２００３）。

ＧＳＫ−３活性は、精子の運動性に関連するので、ＧＳＫ−３の阻害は、女性の避妊に有用である。精子ＧＳＫ３活性の低下が、ウシおよびサルの精巣上体における精子の運動性の発達に関連することが示された（Ｖｉｊａｙａｒａｇｈａｖａｎら，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，５４：７０９，１９９６；Ｓｍｉｔｈら，Ｊ Ａｎｄｒｏｌ，２０：４７，１９９９）。さらに、ＧＳＫ３のチロシンおよびセリン／スレオニンリン酸化は、雄ウシにおいて、非運動性精子と比較して、運動性精子において高い（Ｖｉｊａｙａｒａｇｈａｖａｎら，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，６２：１６４７，２０００）。この効果はまた、ヒト精子においても実証された（Ｌｕｃｏｎｉら，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ，１６：１９３１，２００１）。

ＧＳＫ−３タンパク質キナーゼに関連する状態の大部分に対して現在利用可能な処置選択肢がないため、このタンパク質標的を阻害する新規の治療因子に対して依然として大きな必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、式Ｉ：

の化合物または薬学的に受容可能なその塩（ここで、Ｗ、Ｒ^１、およびＲ^ｙは以下に記載される通りである）を提供することにより、この必要性に取り組むものである。

本発明の化合物は、ＧＳＫ−３活性を阻害することが可能である。本発明に従って、これらの化合物はまた、ＧＳＫ−３活性を阻害するための組成物および方法ならびに患者におけるＧＳＫ−３に関連する疾患または状態の重篤度を処置または減少させるための方法においても用いられる。

本発明の方法が効果的な疾患または状態としては、例えば、神経学的障害および神経変性障害、糖尿病、精神医学的障害、多発性硬化症（ＭＳ）、心筋梗塞、再灌流／虚血、禿頭症、および発作が挙げられる。

（発明の詳細な説明）
本発明は、以下の式Ｉ：

の化合物またはその薬学的に受容な塩を提供し、ここで、
Ｗは、窒素またはＣＨであり；
Ｒ^１は、水素またはフッ素から選択され；そして
Ｒ^ｙは、必要に応じてＮ（Ｒ^２）_２で置換されたＣ_１〜４の脂肪族基、または窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する飽和５〜６員環であり、ここで；
各Ｒ^２は、水素または必要に応じてＯＨ、Ｎ（Ｒ^２）_２で置換されたＣ_１〜３の脂肪族基、あるいは窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する飽和５〜６員環から独立して選択され；そしてここで：
各Ｒ^３は、水素またはＣ_１〜３の脂肪族基から独立して選択され；
但し：
Ｒ^１が水素であり、そしてＷがＣＨである場合、Ｒ^ｙはメチル以外である。

本明細書中で使用される場合、用語「脂肪族」または「脂肪族基」とは、完全に飽和であるかまたは１単位以上の不飽和を含む直鎖または分枝鎖のＣ_１〜Ｃ_４炭化水素鎖、あるいは完全に飽和であるかまたは１単位以上の不飽和を含む単環式Ｃ_３〜Ｃ_４炭化水素を意味するが、これらは、芳香族（本明細書中では、「炭素環」または「シクロアルキル」ともいわれる）ではなく、残りの分子への単一の結合点を有する。例えば、適切な脂肪族基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：直鎖または分枝鎖あるいはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびこれらのハイブリッド（例えば、（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニル）。

単独またはより大きな部分のうちの一部として用いられる場合、用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」は、１〜４個の炭素原子、アルケニルの場合において、少なくとも２個の炭素原子と１つの二重結合、ならびにアルキニルの場合において、少なくとも２個の炭素原子と１つの三重結合を含む、直鎖および分枝鎖の両方を含む。

本発明に使用される化合物は、化学的に実現可能でありかつ安定な化合物に限定される。従って、上記の化合物における置換基または可変基の組み合わせは、安定な化合物または化学的に実現可能な化合物を生じるこのような組み合わせに限って、可能である。安定な化合物または化学的に実現可能な化合物は、化学構造が４０℃以下の温度で維持された場合、湿度または他の化学反応条件の非存在下において、少なくとも１週間、実質的に改変しない化合物である。

本発明の特定の化合物が、互変異性形態で存在し得、化合物の全てのこのような互変異性形態は、本発明の範囲内であることが、当業者に明らかである。

特に明記しない限り、本明細書中に示される構造はまた、構造の全ての立体化学的形態（すなわち、各不斉中心のＲ立体配座およびＳ立体配座）を含むことが意味される。従って、本発明の化合物の単一の立体異性体ならびにエナンチオマー混合物およびジアステレオマー混合物は、本発明の範囲内である。特に明記しない限り、本明細書中に示される構造はまた、１つ以上の同位体的に富化された原子の存在下でのみ異なる化合物を含むことが意味される。例えば、重水素または三重水素による水素の置換あるいは^１３Ｃ〜^１４Ｃの富化された炭素による炭素の置換を除き、本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。

本発明の化合物は、ＰＣＴ公報ＷＯ ０２／２２６０７に記載される化合物の属の範囲内である。しかし、発明者らは、虚血損傷に対するニューロン細胞の保護および発作の処置において驚くべきかつ予想外に増大した可能性を有する本発明の化合物を発見した。

本発明の１つの局面は、Ｒ^ｙが非置換のＣ_１〜４脂肪族基である式Ｉの化合物に関する。式Ｉの化合物の好ましい脂肪族基は、アルキル基である。このようなアルキル基は、メチル、エチル、シクロプロピル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはイソプロピルが好ましい。式Ｉのより好ましいアルキル基は、メチル、シクロプロピルおよびｔｅｒｔ−ブチルである。

１つの実施形態に従って、本発明は、式Ｉの化合物に関し、ここでＲ^ｙは、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜２個のへテロ原子を有する飽和６員環で置換されたＣ_１〜４脂肪族基である。このような飽和６員環としては、モルホリニル、ピペリジニルおよびピペラジニルが挙げられる。

別の実施形態に従って、本発明は、Ｒ^ｙがＮ（Ｒ^２）_２で置換されたＣ_１〜４脂肪族基である式Ｉの化合物に関する。

特定の実施形態において、本発明は、Ｒ^２が水素である式Ｉの化合物に関する。

別の実施形態に従って、本発明は、Ｒ^２が非置換Ｃ_１〜３脂肪族基である式Ｉの化合物に関する。

なお別の実施形態は、Ｒ^２がＯＨまたはＮ（Ｒ^３）_２で置換されたＣ_１〜３の脂肪族基である式Ｉの化合物に関する。

なお別の実施形態は、Ｒ^２が窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜２個のへテロ原子を有する飽和６員環で置換されたＣ_１〜３脂肪族基である、式Ｉの化合物に関する。このような飽和６員環としては、モルホリニル、ピペリジニルおよびピペラジニルが挙げられる。

１つの実施形態に従って、本発明は、Ｗが窒素である式Ｉの化合物に関する。

別の実施形態に従って、本発明は、ＷがＣＨである式Ｉの化合物に関する。

なお別の実施形態に従って、本発明は、Ｒ^１が水素である式Ｉの化合物に関する。

別の実施形態に従って、本発明は、Ｒ^１がフッ素である式Ｉの化合物に関する。

本明細書中に記載されるような、実施形態の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせが、本発明の範囲内であることが理解される。

式Ｉの化合物の代表的な例は、以下の表１に示される。

（表１．式Ｉの化合物）

本発明の化合物は、以下のスキームＩ〜ＩＩおよび当業者に公知の一般的な方法によって例示されるように調製され得る。

（スキームＩ）

試薬および条件：（ａ）塩化オキサリル、ジクロロメタン、７０℃；（ｂ）ジメチルアミン、ペンタン、ＴｉＣｌ_４；（ｃ）ＮＨ_４ＯＡｃ、ＨＯＡｃ、ＴＨＦ、還流；（ｄ）ＰＯＣｌ_３、ｎ−Ｐｒ_３Ｎ、還流；（ｅ）１６０℃、ニート。

上記のスキームＩは、本発明の化合物を調製するための一般的な方法を示す。工程（ａ）で、アリールアミド１を塩化オキサリルで処理し、アシルイソシアネート２を形成する。工程（ｃ）に示されるように、アシルイソシアネート２は、エナミン３と縮合され、ピリミジノン４を得ることができる（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ（１９９３），５８，４１４−４１８；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，（１９９２），３５，１５１５−１５２０；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，９１９６７，３２，３１３−２１４）。中間体４を、ＰＯＣｌ_３で処理し、クロロ化合物５を形成し、次いで、これをアミノインダゾール誘導体６と合わせ、式Ｉの化合物を得る。アミノインダゾール誘導体６を調製する方法は、当該分野で公知である。特に、これらの誘導体の合成は、ＷＯ ０２／２２６０７に示される。

（スキーム２）

試薬および条件：（ａ）ｉＬｉＮ（ＴＭＳ）_２、エーテル、ＴＨＦ、ｉｉＨＣｌ；（ｂ）ＮａＯＥｔ、ＥｔＯＨ、還流。

上記スキームＩＩは、ピリミジノン中間体５を調製するための代替方法を示し、これは、上記のスキームＩの工程（ｅ）に示されるような式Ｉの化合物の調製に使用され得る。工程（ａ）で、アリールニトリル７はベンズアミジンであり、そして中間体８は、次いで、β−ケトエステル９で処理され、ピリミジノン化合物５を形成し、これを上記のように使用し得る。

当業者は、容易に合成されるかまたは市販の試薬を使用して、本明細書の教示に従って、本発明の他の化合物を合成し得る。

ＧＳＫ−３のインヒビターとして本発明に使用される化合物の活性を、インビトロ、インビボまたは細胞株において、アッセイし得る。インビトロアッセイとしては、活性化されたＧＳＫ−３のリン酸化活性またはＡＴＰａｓｅ活性のどちらかの阻害を決定するアッセイが挙げられる。インビトロアッセイの代替物は、ＧＳＫ−３に結合するためのインヒビターの能力を、定量化する。インヒビター結合を、結合する前にインヒビターを放射標識すること、インヒビター／ＧＳＫ−３複合体を単離すること、および結合した放射標識量を決定することによって、測定し得る。あるいは、新規インヒビターを、既知の放射性リガンドに結合するＧＳＫ−３とともにインキュベートする競合実験を行うことによって、インヒビター結合を決定し得る。

別の実施形態に従って、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に受容可能な塩および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントもしくはビヒクルを含む組成物を提供する。本発明の組成物中の化合物の量は、生物学的サンプルまたは患者において、プロテインキナーゼ（特にＧＳＫ−３）を検出可能に阻害するのに効果的な量である。好ましくは、本発明の組成物は、このような組成物を必要とする患者に投与すつために処方される。最も好ましくは、本発明の組成物は、患者に経口投与するために処方される。

本明細書中に使用される場合、用語「患者」とは、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトを意味する。

用語「薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクル」とは、処方される本発明の化合物の薬学的活性を破壊しない、非毒性のキャリア、アジュバント、またはビヒクルをいう。本発明の組成物において使用され得る薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂。

本明細書中に使用される場合、用語「検出可能に阻害する」とは、前記組成物の非存在下で、前記組成物およびＧＳＫ−３キナーゼを含むサンプルとＧＳＫ−３キナーゼを含む等価のサンプルとの間におけるＧＳＫ−３活性の測定可能な変化を意味する。

「薬学的に受容可能な塩」とは、本発明の化合物の任意の非毒性塩、エステル、エステルの塩または他の誘導体であって、レシピエントに投与した際、本発明の化合物またはそれらの阻害活性代謝物または残留物を直接的または間接的のいずれかで提供できるものを意味する。

本明細書中に使用される場合、用語「阻害活性代謝物またはその残留物」とは、本発明の化合物の代謝物またはその残留物がまたＧＳＫ−３キナーゼインヒビターであることを意味する。

本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩としては、薬学的に受容可能な、無機酸および有機酸、ならびに無機塩基および有機塩基から誘導されたものが、挙げられる。適切な酸塩の例としては、以下が挙げられる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホネート（ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルモン酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩。

他の酸（例えば、シュウ酸）は、それ自体は薬学的に受容可能ではないが、本発明の化合物およびその薬学的に受容可能な酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において、使用され得る。

適切な塩基由来の塩基としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム塩およびＮ^＋（Ｃ_１−４アルキル）_４塩が挙げられる。本発明はまた、本明細書中に開示される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化を想定する。水溶性もしくは油溶性の生成物または水もしくは油に分散可能な生成物は、このような四級化によって得られ得る。

本発明の組成物は、経口投与、非経口投与、吸入スプレー、局所投与、直腸投与、鼻投与、頬投与、膣投与、または移植レザバによって、投与され得る。用語「非経口」とは、本明細書中で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内注射、肝臓内、病変内、および頭蓋内の、注射または注入技術を包含する。好ましくは、この組成物は、経口投与、腹腔内投与、または静脈内投与される。本発明の組成物の滅菌した注射可能形態は、水性または油性の、懸濁物であり得る。これらの懸濁物は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術に従って処方され得る。この滅菌した注射可能な調製物は、非経口的に受容可能な非毒性の希釈剤または溶媒中にある、滅菌した注射可能な溶液または懸濁物（例えば、１，３−ブタノール中の溶液）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌した不揮発性油が、溶媒または懸濁媒質として従来使用される。

このために、刺激性の低い任意の不揮発性油（合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む）が、使用され得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）が、この注射可能調製物中で有用であり、同様に、天然の薬学的に受容可能な油（例えば、オリーブ油またはヒマシ油（特に、そのポリオキシエチル化形態））も、有用である。
これらの油溶液または油懸濁物はまた、長鎖アルコール希釈剤または長鎖アルコール分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース）または薬学的に受容可能な投薬形態（エマルジョンおよび懸濁物を含む）の処方において一般的に使用される同様の分散剤も含み得る。他の一般的に使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および薬学的に受容可能な固体、液体、もしくは他の投薬形態の製造において一般的に使用される他の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ増強剤）もまた、処方目的のために使用され得る。

本発明の薬学的組成物は、経口的に受容可能な任意の投薬形態（カプセル、錠剤、水性懸濁物または水溶液を含むが、これらに限定されない）で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用されるキャリアとしては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）もまた、代表的に添加される。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。−水性懸濁物が経口使用のために必要とされる場合、その活性成分は、乳化剤および懸濁剤と合わされる。所望される場合、特定の甘味剤、矯味矯臭剤または着色剤もまた、添加され得る。

あるいは、本発明の薬学的組成物は、直腸投与のために坐剤形態で投与され得る。これらは、室温では固体であるが直腸温度では液体である適切な非刺激性賦形剤とその薬剤とを混合することによって、調製され得、従って、直腸で融解してその薬物を放出する。このような物質としては、ココアバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。

本発明の薬学的組成物はまた、特に、処置標的が、局所適用により容易に接近可能な領域または器官を含む場合（眼の疾患、皮膚の疾患、または腸管下部の疾患）に、局所投与され得る。適切な局所処方物は、これらの領域または器官の各々のために容易に調製される。

腸管下部のための局所適用は、直腸坐剤処方物（上記を参照のこと）または適切な浣腸処方物の状態で、もたらされ得る。局所的経皮パッチもまた、使用され得る。

局所適用のために、この薬学的組成物は、１つ以上のキャリア中に懸濁または溶解された活性成分を含む、適切な軟膏中で処方され得る。本発明の化合物の局所投与のためのキャリアとしては、鉱物油、流動パラフィン、白色鉱油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、この薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁または溶解された活性成分を含む、適切なローションまたはクリームの状態で処方され得る。適切なキャリアとしては、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルろう、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられるが、これらに限定されない。

眼への使用のために、この薬学的組成物は、滅菌した等張性のｐＨ調整生理食塩水中の微粉化懸濁物としてか、または好ましくは、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム）を含むかもしくは含まない、滅菌した等張性のｐＨ調整生理食塩水中の溶液として、処方され得る。あるいは、眼への使用のために、この薬学的組成物は、軟膏（例えば、ペトロラタム）中で処方され得る。

本発明の薬学的組成物はまた、経鼻エアロゾルまたは吸入によっても、投与され得る。このような組成物は、薬学処方物の分野で周知の技術に従って調製され、そしてベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤と使用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。

最も好ましくは、本発明の薬学的に受容可能な組成物は、経口投与のために処方される。

単回投薬形態を産生するためにキャリア材料と組合わされ得る本発明の化合物の量は、処置される患者および特定の投与形態に依存して変化する。好ましくは、組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間のインヒビターの投薬量がこれらの組成物を受ける患者に投与され得るように処方されるべきである。

任意の特定の患者に対する特定の投薬量および処置レジメンが、種々の要因（使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態（ｇｅｎｅｒａｌ ｈｅａｌｔｈ）、性別、食餌、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、および処置医の判断、および処置される特定の疾患の重症度を含む）に依存することもまた、理解すべきである。組成物中の本発明の化合物の量もまた、組成物中の特定の化合物に依存する。

処置または予防されるべき、特定の状態または疾患に依存して、その状態を処置または予防するために通常投与されるさらなる治療剤がまた、本発明の組成物中に存在し得る。

例えば、神経疾患または神経変性疾患を処置するための神経栄養因子または他の薬剤を、神経疾患または神経向性疾患を処置するために、本発明の化合物と組み合わせ得る。公知の神経栄養因子の例としては、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＭＡＯ阻害剤、インターフェロン、抗痙攣薬、イオンチャンネル遮断薬、リルゾールおよび抗パーキンソン病薬が挙げられるが、これらに限定されない。

脳卒中のための公知の処置の例としては、Ａｃｔｉｖａｓｅ^Ｒ、組換え体または遺伝子改変体、組織プラスミノーゲン活性因子（ｒｔ−ＰＡ）、ヘパリン、グルタミン酸拮抗薬、カルシウム拮抗薬、オピエート拮抗薬、ＧＡＢＡ拮抗薬および抗酸化剤が挙げられる。

薬剤の他の例として、本発明の化合物はまた、以下に挙げられるがこれらに限定されないものと組合わされ得る：抗鬱剤（例えば、Ｚｏｌｏｆｔ^Ｒ、Ｐｒｏｚａｃ^Ｒ、Ｐａｘｉｌ^ＲおよびＢｕｓｐａｒ^Ｒ）；抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド、ＴＮＦブロッカー、ＩＬ−１ ＲＡ、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびスルファサラジン）；免疫調節剤および免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、インターフェロン、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、およびスルファサラジン）；神経栄養因子（例えば、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、ＭＡＯインヒビター、インターフェロン、抗痙攣剤、イオンチャネルブロッカー、リルゾール（ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、および抗パーキンソン症候群薬剤；心血管疾患を処置するための薬剤（例えば、β−ブロッカー、ＡＣＥインヒビター、利尿剤、ニトレート、カルシウムチャネルブロッカー、およびスタチン（ｓｔａｔｉｎ）；糖尿病を処置するための薬剤（例えば、インスリン、インスリン類似体、α−グリコシダーゼ阻害剤、ビグアナイドおよびインスリン増感剤；ならびに免疫不全障害を処置するための薬剤（例えば、γ−グロブリン）。

本発明の組成物中に存在する追加治療薬の量は、唯一の活性剤としてその治療薬を含有する組成物で通常投与される量以下である。好ましくは、現在開示された組成物中の追加治療薬の量は、唯一の活性剤としてその治療薬を含有する組成物中で通常存在する量の約５０％〜１００％の範囲である。

別の実施形態に従って、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）のための処置、パーキンソン病のための処置、多発性硬化症（ＭＳ）を処置するための薬剤、喘息のための処置、抗炎症剤、免疫調節剤および免疫抑制剤、神経栄養因子、脳卒中を処置するための薬剤、心臓血管疾患を処置するための薬剤、抗鬱剤、抗神経病薬剤、または糖尿病を処置するための薬剤から選択される、さらなる治療薬剤を患者に投与することに関する。ここで：
前記さらなる治療薬剤は、処置される疾患に対して適切であり；そして、
前記さらなる治療薬剤は、単一投薬形態として前記組成物と一緒に、または複数投薬形態の一部として前記組成物と分けて投与される。

他の実施形態に従って、本発明は、生体試料において、ＧＳＫ３キナーゼ活性を阻害する方法に関し、該方法は、該生体試料を、本発明の化合物または該化合物を含有する組成物と接触させる工程を包含する。

本明細書中で使用する「生体試料」との用語は、細胞培養物またはそれらの抽出物；哺乳動物またはその抽出物から得られる生検材料；および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙液、または他の体液またはそれらの抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。

生体試料でのＧＳＫ３キナーゼ活性の阻害は、当業者に公知の種々の目的のために有用である。このような目的の例には、輸血、臓器移植、生体試料の保存および生物検定が挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態に従って、本発明は、患者のＧＳＫ−３キナーゼ活性を阻害する方法に関し、該方法は、該患者に、本発明の化合物または該化合物を含む組成物を投与する工程を包含する。

別の実施形態に従って、本発明は、患者におけるＧＳＫ−３媒介性疾患または状態の重症度を処置または軽減させるための方法を提供し、該方法は、本発明に従う組成物を患者に投与する工程を包含する。

用語「ＧＳＫ−３媒介性疾患」とは、本明細書中で使用される場合、ＧＳＫ−３が役割を果すことが公知である任意の疾患または他の有害状態を意味する。そのような疾患または状態としては、自己免疫疾患、炎症疾患、代謝障害、精神障害、糖尿病、血管形成障害、タウオパチー、神経疾患または神経変性疾患、脊髄損傷、緑内障、禿頭症または心臓血管疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態に従って、本発明は、自己免疫疾患、炎症疾患、代謝障害、精神障害、糖尿病、血管形成障害、タウオパチー、神経疾患または神経変性疾患、脊髄損傷、緑内障、禿頭症または心臓血管疾患から選択される疾患、障害または状態の重症度を、必要とする患者に対して処置するか、または軽減する方法に関し、該方法は、該患者に、本発明の化合物またはその組成物を投与する工程を包含する。

別の実施形態に従って、本発明は、アレルギー、喘息、糖尿病、アルツハイマー疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、頭蓋骨損傷による傷害、精神分裂病、不安症、躁鬱病、タウオパチー、精髄神経障害、末梢神経障害、心筋梗塞、心筋細胞肥大、緑内障、注意不足障害（ＡＤＤ）、うつ病、不眠症、再灌流／虚血、脳卒中、血管形成障害、または禿頭症から選択される疾患または状態の重症度を処置するか、または軽減する方法に関する。ここで、該方法は、それを必要としている患者に、本発明の化合物またはその組成物を投与する工程を包含する。

好ましい実施形態に従って、本発明の方法は、脳卒中の重症度を処置するか、または軽減することに関する。

別の好ましい実施形態に従って、本発明の方法は、神経変性疾患または神経疾患の重症度を処置するか、または軽減する方法に関する。

本発明の別の局面は、男性患者の精子の運動性を減少させる方法に関し、該方法は、該患者に本発明の化合物またはその組成物を投与する工程を包含する。

別の実施形態において、さらなる治療薬剤を含まない組成物を利用する本発明の方法は、
前記患者に、さらなる治療薬剤を分けて投与する、さらなる工程を包含する。それらのさらなる治療薬剤を分けて投与する場合、それらは、本発明の化合物の投与前、投与に連続して、または投与後に、投与され得る。

本明細書中に記載される発明を、さらに十分に理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、唯一説明する目的のためであり、いかなる方法においても本発明を制限するものとして構成されていないことは、理解されるべきである。

本明細書中で用いられる場合、「方法Ａ」として示されるＨＰＬＣ法は、以下の通りである：
カラム：Ｃ１８、３μｍ、２．１×５０ｍｍ、Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙによる「Ｌｉｇｈｔｉｎｇ」。

勾配：４．０分かけて、１００％水（１％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡを含む）から１００％アセトニトリル（０．１％ ＴＦＡを含む）へ、１００％アセトニトリルにて１．４分間保持、そして最初の条件に戻す。

合計泳動時間７．０分。

流量：０．８ｍＬ／分。

本明細書中で用いられる場合、用語「Ｒ_ｔ」とは、示されたＨＰＬＣ法を用いて化合物について得られた保持時間（分）をいう。以下の実施例に示される化合物番号は、上記の表１に示される化合物番号に対応する。

（実施例１）
６−メチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オン：エタノール（２０ｍＬ）中の２−トリフルオロメチル−ベンズアミジン（２．１３ｇ、４ｍｍｏｌ）およびナトリウムエトキシド（０．８３ｇ、１２ｍｍｏｌ）の混合物をアセト酢酸メチル（０．４４ｍＬ、４ｍｍｏｌ）で処理し、そして２４時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、水で希釈し、そして２Ｎ塩酸で酸性にした。得られた溶液を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［ＳｉＯ_２、メタノール：ジクロロメタン（３：９７）］による精製によって、表題化合物（０．５１ｇ、５０％の収率）が黄色固体として提供された；

（実施例２）
４−クロロ−６−メチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン：オキシ塩化亜リン酸（３９ｍＬ、４１９ｍｍｏｌ）中の６−メチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オン（１０．７ｇ、４１．９ｍｍｏｌ）の溶液をトリ−ｎ−プロピルアミン（１６ｍＬ、８３．９ｍｍｏｌ）で処理し、そして１１０℃〜１２０℃において１時間にわたって還流した。溶媒をエバポレートし、トルエンとともに３回共沸し、次いで減圧しながら乾燥した。残渣を酢酸エチル中に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム、水およびブラインで順番に洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［ＳｉＯ_２、酢酸エチル：ヘキサン（１：９）］による精製により、表題化合物（９．６１ｇ、８４％の収率）が橙色オイルとして提供された。

（実施例３）
（５−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−［６−メチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−４−イル］アミン（Ｉ−２）：４−クロロ−６−メチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン（０．１０ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）および５−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イルアミン（０．０７２ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の混合物を、１６０℃〜１７０℃において８時間、ニートで加熱した。得られた残渣を室温まで冷却し、次いでＮ−メチル−ピロリジノン（２ｍＬ）中に溶解した。この混合物を水（２０ｍＬ）中に注ぎ、そして重炭酸ナトリウム（５ｍＬ）を添加し、そして得られた混合物を濾過し、水で洗浄した。分取ＨＰＬＣによる精製により、表題化合物（０．０８１ｇ、４３％の収率）が黄褐色固体として提供された。

（実施例４）
６−ｔｅｒｔ−ブチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オン：エタノール（５０ｍＬ）中の２−トリフルオロメチルベンズアミジン（１．１２ｇ、５ｍｍｏｌ）、ナトリウムエトキシド（１．０２ｇ、１５ｍｍｏｌ）および４，４−ジメチル−３−オキソ−ペンタン酸メチルエステル（０．８０ｍＬ、５ｍｍｏｌ）の混合物を還流にて１６時間加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、水で希釈し、そして２Ｎ塩酸で酸性にした。この溶液を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［ＳｉＯ_２、メタノール：ジクロロメタン（２：９８）］による精製により、表題化合物（０．４８ｇ、３２％の収率）が黄色固体として提供された；

（実施例５）
６−ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン：オキシ塩化亜リン酸（１．６５ｍＬ、１５．９ｍｍｏｌ）中の６−ｔｅｒｔ−ブチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オン（０．４７ｇ、１．５９ｍｍｏｌ）の溶液をトリ−ｎ−プロピルアミン（０．６１ｍＬ、３．１７ｍｍｏｌ）で処理し、そして１１０℃〜１２０℃で１時間加熱した。溶媒をエバポレーションにより除去し、次いでトルエンとともに共沸した。残渣を酢酸エチル中に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム、水およびブラインで順番に洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［ＳｉＯ_２、酢酸エチル：ヘキサン（１：９）］による精製により、表題化合物（０．３３ｇ、６６％の収率）が黄色オイルとして提供された。

（実施例６）
［６−ｔｅｒｔ−ブチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−３）：４−クロロ−６−ｔｅｒｔ−ブチル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン（０．１０ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）および１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イルアミン（０．０６４ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の混合物を、１６０℃〜１７０℃で１６時間、ニートで加熱した。得られた残渣を冷却し、Ｎ−メチル−ピロリジノン（２ｍＬ）中に溶解し、次いで水（２０ｍＬ）および重炭酸ナトリウム（５ｍＬ）中に注ぎ、そして酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水で４回洗浄し、ブラインで１回洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮した。粗製生成物を分取ＨＰＬＣにより精製して、表題化合物（０．００７ｇ、４％の収率）を黄色固体として提供した。

（実施例７）
・６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オン：（１−シクロプロピル−ビニル）−ジメチルアミン：窒素下にて０℃のペンタン（６００ｍＬ）中のシクロプロピルメチルケトン（１９．８ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）の溶液にジメチルアミン／テトラヒドロフラン（２Ｍ、５００ｍＬ、１０００ｍｍｏｌ）を添加し、次いでペンタン（６０ｍＬ）中の塩化チタン（ＩＶ）（１２．１ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下様式で添加した。反応物を０℃にて０．５時間、そして室温にて５時間攪拌した。反応物をＣｅｌｉｔｅを通して濾過し、ペンタンおよびエーテルで洗浄し、１５℃〜２０℃の浴温度にて減圧下で濃縮し、次いで橙色オイルとして−４℃にて一晩保存した。

・２−トリフルオロメチルベンゾイルイソシアネート：窒素下にて室温の１，２−ジクロロエタン（６００ｍＬ）中の２−トリフルオロメチルベンズアミド（３４．９ｇ、１８５ｍｍｏｌ）の溶液を、塩化オキサリル（２０．２ｍＬ、２３０ｍｍｏｌ）で迅速な滴下で処理し、そして反応物を７０℃〜８０℃にて一晩攪拌した。溶媒をエバポレーションにより除去し、そして残渣をトルエンとともに２回共沸した。

・６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン４−オン：窒素下にて０℃の（１−シクロプロピル−ビニル）−ジメチルアミンの溶液に、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の２−トリフルオロメチルベンゾイルイソシアネートの溶液を滴下様式で添加した。反応物を０．５時間攪拌し、次いで酢酸アンモニウム（７８ｇ、１０００ｍｍｏｌ）および酢酸（４００ｍＬ）を添加した。反応混合物を、テトラヒドロフランを連続的に除去しながら還流にて３時間加熱し、次いでプールし、そして水（１．２Ｌ）中に注いだ。得られた沈澱物を濾過により収集し、水およびエーテルで洗浄して、６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オン（２８．７９ｇ、５６％の収率）を白色固体として得た。この白色固体は、表題化合物と（２−トリフルオロメチル−ベンゾイル）−ウレア（ＨＰＬＣによれば９１：９）との混合物である。

（実施例８）
４−クロロ−６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン：オキシ塩化亜リン酸（４０ｍＬ、４２８ｍｍｏｌ）中の６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オン（１２．０ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）を、７５℃〜８０℃にて１時間加熱した。溶媒をエバポレーションにより除去し、そしてトルエンとともに３回共沸した。残渣を０℃まで冷却し、酢酸エチル中に溶解し、氷小片および水で処理した。次いで、混合物を重炭酸ナトリウム、水およびブラインで順番に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［ＳｉＯ_２、５：９５の酢酸エチル：ヘキサン（５：９５）］による精製により、表題化合物（９．７１ｇ、７６％の収率）が無色のオイルとして提供された。

（実施例９）
［６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−インダゾール−３−イル）−アミン（Ｉ−４）：４−クロロ−６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン（０．０８ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および１Ｈ−インダゾール−３−イルアミン（０．０３６ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の混合物を１６０℃〜１７０℃にて６時間、ニートで加熱した。残渣を冷却し、そしてＮ−メチル−ピロリジノン（２ｍＬ）中で溶解し、水（３０ｍＬ）および重炭酸ナトリウム（５ｍＬ）中に注ぎ、次いで濾過し、水およびエーテルで洗浄した。収集した沈澱物およびエーテル洗浄液を合わせ、そして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［ＳｉＯ_２、メタノール：ジクロロメタン（２：９８）］による精製により、表題化合物（０．０１７ｇ、１５％の収率）が淡黄色固体として得られた。

（実施例１０）
［６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−１）：Ｎ−メチルピロリジノン（５０ｍＬ）中の４−クロロ−６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン（７．００ｇ、２３．４ｍｍｏｌ、実施例８において上記の通りに調製した）および１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イルアミン（９．４３ｇ、７０．３ｍｍｏｌ）の混合物を、１３０℃にて１２時間加熱した。残渣を冷却し、Ｎ−メチル−ピロリジノン（２ｍＬ）中に溶解し、水（５００ｍＬ）および重炭酸ナトリウム（１５ｍＬ）中に注ぎ、次いで濾過し、水で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィー［ＳｉＯ_２、酢酸エチル：ヘキサン（３５：６５）］による精製により、表題化合物（５．２５ｇ、５７％の収率）が白色固体として提供された。

（実施例１１）
［６−シクロプロピル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン塩酸塩：化合物Ｉ−１（８．４２ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）を６Ｎ塩酸中に溶解して溶解することによりこのＨＣｌ塩を調製して、表題化合物（９．２４２ｇ、９９％）を黄色固体として提供した。

（実施例１２）
６−ブト−３−エニル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オン：６−ブト−３−エニル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン４−オンを、３−オキソ−ヘプト−６−エン酸エチルエステルを用いたこと以外は実施例１において上記の通りに調製した。この反応により、表題化合物（２．５４５ｇ、４９％の収率）がクリーム色の固体として提供された。

（実施例１３）
４−ブト−３−エニル−６−クロロ−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン：表題化合物を、６−ブト−３−エニル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−３Ｈ−ピリミジン−４−オンを用いたこと以外は実施例２に記載の通りに調製して、黄色オイル（０．４９ｇ、９９％の収率）を提供した。

（実施例１４）
［６−ブト−３−エニル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−７）：表題化合物を、４−ブト−３−エニル−６−クロロ−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジンを用いたこと以外は実施例６に記載の通りに調製して、クリーム色の固体（２．７１２ｇ、６２％の収率）を提供した。

（実施例１５）
［６−（３−モルホリン−４−イル−プロピル）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（１−８）：−７８℃のメタノール（５ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の［６−ブト−３−エニル−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（０．１０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液を、オゾンを通して５分間発泡させた。この混合物に、モルホリン（０．０５ｍＬ、０．５６ｍｍｏｌ）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．３９ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２４時間攪拌し、この時点でさらなるモルホリン（０．１０ｍＬ、１．２８ｍｍｏｌ）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．３９ｇ，１．８５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで攪拌をさらに２時間続けた。反応物を重炭酸ナトリウムでクエンチし、そしてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、１：９のメタノール：ジクロロメタンを用いて溶出した）、続いて分取ＨＰＬＣによる精製により、表題化合物が山吹色の凍結乾燥物（０．０６８ｇ、３８％の収率）として提供された。

（実施例１６）
以下の化合物を、本明細書中で実施例１〜１５、一般的スキームに記載される方法と実質的に類似の方法および当業者に公知の方法により調製した。

［６−（３−ピペリジン−１−イル−プロピル）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−９）：

［６−（３−ジエチルアミノ−プロピル）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−１０）：

［６−（３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−プロピル）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−１１）：

［６−（３−ピペラジン−１−イル−プロピル）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−１２）：

［６−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−１３）：

Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’−｛３−［６−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル−アミノ）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−４−イル］−プロピル｝−エタン−１，２−ジアミン（Ｉ−１４）：

［６−（３−メチルアミノ−プロピル）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−１５）：

２−｛３−［６−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イルアミノ）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピリミジン−イル］プロピルアミノ｝−エタノール（Ｉ−１６）：

［６−（３−（２−モルホリン−４−イル−エチルアミノ）−プロピル）−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−１７）：

［６−｛３−［メチル−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミノ］−プロピル｝−２−（２−トリフルオロメチル−フェニル）ピリミジン−４−イル］−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−アミン（Ｉ−１８）：

（実施例１７Ｋ）
（ＧＳＫ−３の阻害についてのＫ_ｉ決定）
化合物を、標準的な結合酵素系（Ｆｏｘら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７，２２４９）を用いて、ＧＳＫ−３（ＡＡ １−４２０）活性を阻害する能力についてスクリーニングした。反応を、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２５ｍＭ ＮａＣｌ、３００μＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１．５％ ＤＭＳＯを含む溶液中で実施した。このアッセイにおける最終基質濃度は、２０μＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および３００μＭペプチド（ＨＳＳＰＨＱＳ（ＰＯ_３Ｈ_２）ＥＤＥＥＥ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）であった。反応を、３０℃および２０ｎＭ ＧＳＫ−３βにおいて実施した。結合酵素系の成分の最終濃度は、２．５ｍＭホスホエノールピルベート、３００μＭ ＮＡＤＨ、３０μｇ／ｍｌピルビン酸キナーゼおよび１０μｇ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼであった。

ＡＴＰおよび目的の試験化合物を除いて上記に列挙した試薬の全てを含む、アッセイストック緩衝溶液を調製した。このアッセイストック緩衝溶液（１７５μｌ）を、０．００２μＭ〜３０μＭの範囲にわたる最終濃度で５μｌの目的の試験化合物を含む９６ウェルプレートにおいて、３０℃にて１０分間インキュベートした。代表的には、１２点滴定を、ＤＭＳＯを用いて、娘プレートにおいて試験化合物の（１０ｍＭ化合物ストックからの）系列希釈物を調製することによって行った。反応を、２０μｌのＡＴＰ（最終濃度２０μＭ）の添加によって開始した。反応速度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を３０℃にて１０分間用いて得た。Ｋ_ｉ値を、阻害濃度の関数として、速度のデータから決定した。

本発明の化合物は、上記のアッセイを用いて、１００ｎＭ未満のＫ_ｉ値を有することが見出された。

（実施例１８）
（神経保護パーセントの決定）
本明細書中で用いられる場合、用語「保護パーセント」は、虚血損傷（ＯＧＤ）に対して保護されたニューロン細胞の百分率を表し、そして以下の通りに算出される：
保護％＝（試験−ＯＧＤ）／（正常−ＯＧＤ）×１００。

本プロトコルは、培養海馬ニューロン細胞において無酸素−再酸素付加によって実験的虚血を誘導するために用いられる手順を記載する。試験化合物の神経保護効果を、虚血誘導性のニューロン細胞損傷および細胞死に対して評価する。

以下の工程を、アッセイ日の前に実施した：
ＬｏＧ−Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ［ＬｏＧ−Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌは、ＮｏＧ−Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，特別注文）＋０．５ｍＭグルコース、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．２５×ペニシリン／ストレプトマイシンを含む］を、低酸素チャンバ中で一晩、予め平衡化した。

このＬｏＧ−Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌを、通常のインキュベータ（５％ ＣＯ_２）中で一晩、予め平衡化した。

この通常のインキュベータ（５％ ＣＯ_２）中で、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７ＡＯ［Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７ＡＯは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ Ｃａｔ ＃２１１０３−０４９）を、２×Ｂ２７−ＡＯ補充物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ Ｃａｔ ＃１０８８９−０３８）、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、および０．２５×ペニシリン／ストレプトマイシンとともに含む］を、一晩、予め平衡化した。

以下の工程を、アッセイ日に実施した：
ＬｏＧ−Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を低酸素チャンバから除去し、そしてこの培地に、１００％ Ｎ_２を３０分間軽く発泡させて完全に脱酸素した。

このＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７ｍ培養培地［Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７ｍは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を、２×Ｂ２７補充物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ Ｃａｔ ＃１７５０４−０４４）および０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンとともに含む］を、無菌のガラスパスツールピペットを取り付けた真空ポンプを用いて各１２ウェルプレート中の細胞から吸引した。

このプレートを、以下から調製した２ｍｌのグルコース非含有ＢＳＳ_０（ｐＨ７．４）で１回洗浄した：１４３．６ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２６．２ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１０ｍｇ／１フェノールレッド、および０．２５×Ｐ／Ｓ。

ニューロン（最初の培養から１０〜１１日）を、ＬｏＧ−Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（１２ウェルプレートの各ウェルについて、１ウェルあたり１ｍｌ）を用いて脱酸素した。これらのニューロン細胞を、Ｐａｒｋ ＬＣ，Ｃａｌｉｎｇａｓａｎ ＮＹ，Ｕｃｈｉｄａ Ｋ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｇｉｂｓｏｎ ＧＥ．（２０００）「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｅｌｉｃｉｔｓ ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ」．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ７４（１）：１１４−１２４に従って調製した。

試験化合物を、各ウェルに直接添加した（３つの濃度の化合物＋ポジティブコントロール、各々三連）。これらの化合物を１００％ ＤＭＳＯ中に溶解し、ここで、ＤＭＳＯの濃度は、０．５％を決して超えず、次いで、これらのプレートを、プレートの蓋を半開きにした状態で、Ｈｙｐｏｘｉｃ Ｃｈａｍｂｅｒ中に５時間配置した。

酸素正常状態のコントロールについて、予め平衡化した（ｅｑｕａｌｉｂｒａｔｅｄ）酸素正常状態ＬｏＧ−Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、通常の培養インキュベータ中に４時間、再度配置した。

４時間の低酸素後、既存の培地を注意深く吸引し、そして２ｍＬの新たな酸素付加（予め平衡化した）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７ＡＯを各ウェルに添加した。再度酸素付加培地を、使用前に培地を一晩、培養インキュベータ（５％ＣＯ_２／９５％Ｏ_２）中に配置することによって達成した。

同じ濃度を有する同じ試験化合物を、対応するウェルに添加し、そしてプレートを細胞培養インキュベータ（５％ ＣＯ_２／９５％ Ｏ_２）中に配置し、そして２０〜２４時間、再度酸素付加した。２０〜２４時間の再酸素付加後、下記の細胞トラッカーグリーン蛍光法を用いて生存ニューロンの数を計数する。

既存の培養培地を、１２ウェルプレートの各ウェルから吸引し、そしてニューロンを、３０℃〜３７℃に予め温めた２ｍｌのＨＢＳＳ（ｐＨ７．４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃａｔ ＃１４１７０−１１２）で１回洗浄した。

このプレートの各ウェルに、ＨＢＳＳ中に溶解した１ｍｌの２．５μＭ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔ ＃２９２５）および５μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２蛍光色素を添加した。次いで、これらのプレートを暗所にて室温で１５分間配置し、次いでこれらのニューロンを２ｍｌのＨＢＳＳで１回洗浄した。１ｍｌのＨＢＳＳを各ウェルに添加し、そして生存蛍光細胞および死んだ蛍光細胞の数を、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標）自動画像化システムを用いて計数した。

本発明の化合物は、３０％以下の保護％値を有することが見出された。

（実施例１９）
（中大脳動脈閉塞モデル（ＭＣＡＯ））
本研究において用いた動物は、２７０ｇと３３３ｇとの間の体重の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＮＣ）であった。これらのラットを、１２時間明／暗の日周期にて、少なくとも１週間にわたって動物施設に順応させた。これらに、食物および水を自由に摂取させた。

中大脳動脈（ＭＣＡ）の起点をブロックするために用いた管腔内動脈オクルダーを、２５ｍｍの長さのセグメントに切断した４−０ナイロンモノフィラメント縫合糸から作製した。縫合糸の先端部を、熱に曝露することにより丸めた。この動脈の管腔をブロックするためのオクルダーの有効性を高めるために、これらに、１％ ポリ−Ｌ−リジン懸濁物をコーティングし、そして６０℃に設定したオーブン中で１時間にわたって乾燥した。縫合糸をＥｔｈｅｌｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪから購入した。化学試薬を、以下の通りに利用した：
１．塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（すなわち、ＴＴＣ、Ｃａｔ ＃Ｔ８８７７、ロット＃５０Ｋ１４３５）およびＰＥＧ４００（Ｃａｔ ＃Ｐ−３２６５）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから購入した。

２．リン酸緩衝化ホルマリン（Ｃａｔ ＃２４５−６８５）を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｍｄｄｌｅｔｏｗｎ，ＶＡから購入した。

３．蒸留水を社内で生成した。

４．エタノール（Ｃａｔ ＃Ｅ７０２−３）を、Ａｌｄｒｉｄｇｅ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから購入した。

限局性大脳虚血の管腔内縫合糸モデルを、実質的にＬｏｎｇａら，Ｓｔｒｏｋｅ，２０：８４−９１（１９８９）に記載された通りに用いた。左の外側静脈を、ビヒクルまたは化合物の投与のためにカニューレ挿入した。

ラットが研究の間の水分補給を維持するのを補助するために、水および酸素加リンゲル溶液（各々５ｍｌ）中の５％デキストロースを、ＭＣＡＯの１０時間後、２４時間後および４８時間後に各側腹部に皮下注射した。

最初の算入基準を満たしたラット（２の神経学的スコアおよび体温３８．５℃未満）を、ビヒクル処置群または化合物処置群への逐次割り当てによってランダム化した。特定の群へのラットの最初の毎日の割り当ては、１日おきであった。

化合物またはビヒクルでの処置を、ＭＣＡＯの６時間後、ｉ．ｖ．ボーラス注射によって開始し、そしてＩｎｆｕ Ｄｉｓｋポンプを用いた一定の注入により、次の１８時間にわたって継続した。これらのラットを短時間で麻酔し、そして頸静脈カテーテルを、背面の首切開部を通して露出させた。化合物またはビヒクルのボーラス用量を投与し、そして注入ポンプを５分後に作動させた。注入ポンプを、ジャケットによりラットの背面に取り付けた。

化合物溶液を、体積が５：４：１の水：ＰＥＧ４００：エタノールのビヒクルを用いて、毎日新たに調製した。このモデルにおいて利用した群および用量を、以下の表２に示す。

梗塞の体積を、Ｂｅｄｅｒｓｏｎら（１９８６）によって記載された手順の変法を用いて、塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色した７枚の連続切片の画像解析によって決定した。ＭＣＡＯの３日後、ラットを、ＣＯ_２窒息によって屠殺し、そして断頭した。脳を頭蓋冠から迅速に取り出し、そして氷浴中のＰＢＳを含む個々のビーカー中に３０分間配置した。２ｍｍの厚さの冠状脳切片を、脳マトリクススライサを用いて得た。これらの脳切片を、ＰＢＳ中に２％ ＴＴＣを含むラベルしたペトリ皿中に、３７℃にて２分間配置した。ＴＴＣは、生存可能な脳組織を赤に染色して、虚血領域を白色のままにする。次いで、脳切片を、１０％中性緩衝化ホルマリン中に、４℃にて少なくとも２４時間浸漬した。全ての切片を、屠殺の３日以内に画像化した。

ホルマリン固定したＴＴＣ染色脳切片（７個の連続切片）を、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアおよびディジタルカメラを用いてディジタルに捕捉した。画像を、ＩＰＬａｂ画像解析プログラムにインポートした。皮質梗塞の面積（白色面積）の輪郭を描いて面積を測定した。梗塞の体積を、以下の式を用いて算出した：

同側小脳半球体積および反対側小脳半球体積の合計を、同様に決定した。水腫の体積を、反対側小脳半球体積を、同側小脳半球体積から差し引くことにより算出した。ラットの処置に対して盲検にされた科学者が分析を実施した。

ラットの神経学的機能を、Ｂｅｄｅｒｓｏｎら（１９８６ｂ）によって記載されたスコア付け系を用いて、ＭＣＡＯの２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に評価した。スコアは、０〜３の範囲におよび、０が正常であり、３は重篤な欠損を示す。

２時間の虚血の時点での神経学的スコアを、研究への算入基準として用いた。ラットが少なくとも２の神経学的スコアを有さなかったかまたは３のスコアを有した場合、このラットを、研究から排除した。ラットの処置群に対して盲検にされた研究者が、神経学的評価を行った。

血液サンプル（約０．５ｍＬ）を、薬物動態学的分析のために、ボーラス注射の５分後、４時間後、２２時間後、４６時間後および７０時間後に、これらのラットから入手した。これらのラットに、イソフルランを用いて軽く麻酔した。血液を、ヘパリン処理した血液収集チューブ（０．６ｍＬの容積）中に、外側尾静脈から、２３ゲージの蝶形注入セットを用いて収集した。血液サンプルを、微量遠心機において（１０に設定した）４分間回転した。血漿を取り出し、ラベルしたバイアル中に配置し、そしてフリーザー中に−２０℃に保存した。

ＭＣＡＯの７２時間後、ラットに、ＣＯ_２吸入により深く麻酔し、そしてなるべく多くの血液を心臓穿刺により得た。血液を、ヘパリン処理した血液収集チューブ（６ｍｌの容積）中に入れた。血漿を、４０００ｒｐｍにて５分間（Ａｌｌｅｇｒａ Ｒ６）の遠心分離により、血液から分離した。血漿を収集し、ラベルしたプラスチックチューブ中に配置し、そしてフリーザ中で−２０℃で保存した。

ビヒクル群と処置群との間での梗塞サイズ、血漿グルコース、体温および体重についての統計分析を、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定により実施した。神経学的スコアの統計分析を、非パラメトリック分析により行った。これらのデータを、平均ＳＥＭとして表す。

ＭＣＡＯの６時間後に投与した式Ｉの化合物を用いた処置は、一過性限局性発作のこのモデルの梗塞体積を減少させることに非常に有効であった（図１）。化合物処置群におけるラット（８８±３１ｍｍ^３）は、ビヒクルコントロール（４１８±３１ｍｍ^３、ｐ＜０．０００１）と比較して、総梗塞体積において非常に有意な７９％減少を有した。化合物処置群における皮質虚血損傷（３２±２０ｍｍ^３）もまた、ビヒクルコントロール（２７２±２２ｍｍ^３、ｐ＜０．０００１）と比較して有意に、８８％減少した。式Ｉの化合物を用いた処置（５５±１２ｍｍ^３）は、ビヒクルコントロール（１４６±１３ｍｍ^３、ｐ＜０．０００１）と比較した場合に、線条体の虚血損傷を有意に、６２％減少させ得た。最終的に、式Ｉの化合物を用いた処置（２１±１０ｍｍ^３）は、ビヒクルコントロール群（９７±１０ｍｍ^３、ｐ＜０．０００１）と比較した場合に、水腫形成の量を７９％減少させた。

式Ｉの化合物を用いて処置したラットは、実験の時間経過にわたって神経学的機能における顕著な改善を実証した（図２）。投与の開始の１８時間後という早期に、神経学的機能における顕著な改善が、ビヒクルコントロール群と比較した場合、化合物処置群において観察された（それぞれ、１．３±０．３対２±０単位、ｐ＜０．０１）。化合物で処置したラットの神経学的スコアは、ＭＣＡＯの７２時間後に改善され続け、これらのラットは、顕著な欠損がほとんどまたは全くなく、機能し得た。対照的に、ビヒクル処置ラットは、実験の時間経過を通して、神経学的機能における改善を示さなかった。

（実施例２０）
（抗鬱剤についての動物モデル）
本発明の化合物を、Ｐｏｒｓｏｌｔ，Ｒ．Ｄ．ら，１９７７；２２９：３２７−３３６：Ｂｏｕｒｉｎ Ｍ．Ｆｕｎｄａｍ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｎｎａｃｏｌ １９９０；４：４９−６４によって記載された方法と実質的に類似の方法により、ラットにおける抗鬱活性についてアッセイした。

（ラットにおける水泳試験（鬱病試験））
ラットを、水を満たした透明なシリンダ中に配置する。ラットが頭を水の上に保つために最小の体の動きしかしない時間として定義される、不動持続時間（＝不動時間）を、手で記録する。第２試行において、４日目に、ラットを再度このシリンダ中に、今回は５分間配置する。不動時間を、試行全体を通して手で記録する。

（試行Ｉ（最初の試行）：）
１日目に、雄Ｗｉｓｔａｒラット（ＲＡ２３９系統；１６０−１８０ｇ）を、シリンダ中に１５分間配置する。ラットが頭を水の上に保つために最小の体の動きしかしない時間として定義される、不動の持続時間（＝不動時間）を、手で記録する。合理的な数の動物を１日に試験するために、記録を、１５分間の試行のうちの以下の３つの部分期間に制限する：０分〜２．５分（すなわち、試行の開始時）、６．２５分〜８．７５分（正確に、この試行の中間）および１２．５分〜１５分（この試行のまさに終了時）。この手順は、この試行全体を通しての動物の「動作」を表すことが以前に見出されている。

（試行ＩＩ（第２試行）：）
４日目に、ラットを、このシリンダ中に、今回は５分間、再度配置する。不動時間を、試行全体を通して手で記録する。

化合物処置を、０．５％メチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）中に懸濁し、そして経口投与した（５ｍｌ／ｋｇ）。薬物投与は、１日目（試行Ｉの当日）の夕（１６：００付近）、２日目および３日目の朝（０８：００付近）および夕、ならびに試行ＩＩ（４日目）の正確に１時間前においてである。一対の２匹のラットについての処置は、試行Ｉにおける動作についてのランダム化に依存して、類似であるかまたは異なっている。Ｍｅｔｈｏｃｅｌまたは１５ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．Ｄｅｓｐｉｒａｍｉｎｅ（ＤＭＩ）で処置したラットの群を、それぞれ、コントロール群およびポジティブ標準として役立てる。

本発明の化合物は、上記のモデルにおいて抗鬱活性を示すことが見出された。

（実施例２１）
（精神分裂病の動物モデル：驚愕のプレ−パルス阻害（ｐｒｅ−ｐｕｌｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）（ＰＰＩ））
注意および認識の分裂に関連する感覚運動ゲーティングの障害は、精神分裂病患者の間で一般的である。プレ−パルス阻害は、大きな聴覚刺激に進行する弱い音が、驚愕反射を阻害する場合に起こる。ＰＰＩは、予測しやすく、精神分裂病の妥当性に直面し、かつこれを構築するテストであると考えられている。

ポジティブコントロールであるクロザピンは、市販されている非定型の抗精神剤（Ｃｌｏｚａｒｉｌ（登録商標））である。クロザピンは、Ｄ４ドパミンおよび５−ＨＴ２レセプターに高い親和性を有し、動物モデルにおいてＰＰＩ応答を効率的に増強する。

ＰＰＩアッセイを、以下の様式で、Ｓｐｏｏｒｅｎら，Ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ２−ｍｅｔｈｙｌ−６−（ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｊ Ｐｈａｒｒｎａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９５：１２６７−１２７５（２０００）に記載される方法と実質的に類似の方法で実行した。

雄のＣ５７ＢＬ／６（２０〜３０ｇ）を、４群でｍａｃｒｏｌｏｎケージ（４２×２６×１５ｃｍ）に少なくとも実験３日前に入れた。ハウジング設備は、温度調節および湿度調節し、人工照明を備えた（６：００ ＡＭ〜６：００ ＰＭ照明）。動物を、水および食物に、適宜接触させた。全ての動物は、実験的に未処置であった。

手順動物を試験化合物（３０、６０、１００ｍｇ／ｋｇ）、クロザピン（３０ｍｇ／ｋｇ）（ポジティブコントロール）またはビヒクル（０．５％ メチルセルロース）で前処置した。４５分後、バックグラウンドを７０ｄＢの白色雑音にした驚愕室（ｓｔａｒｔｌｅ ｃｈａｍｂｅｒ）にマウスを個別に入れ、１０分間静かに放置した。次に、５６試験（ｔｒｉａｌ）を含む１５分のセッションを行った。驚愕刺激は、４０ｍｓ−１２０ｄＢ−白色雑音、プレパルスは７２、７４および７８ｄＢの２０ｍｓ−白色雑音から１００ｍｓの驚愕に進行する。

８種の試験を行った：プレパルス＋驚愕（プレパルス強度につき７試験）、プレパルスのみ（プレパルス強度につき７試験）、驚愕のみ（７試験）、および刺激無し（７試験）。試験間の間隔の変数は、平均１５ｓである（１０ｓと２０ｓとの間）。無刺激試験において、基線測定を行った。驚愕のみの試験において、基線聴覚驚愕振幅をプレパルス＋驚愕試験において測定し、正常驚愕の阻害の量を測定して基線驚愕の百分率で表した。プレパルスのみの試験において、弱いノイズに対する正常応答を、コントロールとして測定した。プレパルス阻害を、以下の式に従って計算した：％ ＰＰＩ＝１００−１００×［（ＰＡ２ ＰＰＰ）／ＰＡ２］。本発明者らは、本発明の化合物がマウスにおける聴覚驚愕反射のＰＰＩを増強することを見出した。

（実施例２２）
（抗不安薬に対する動物モデル）
抗不安薬アッセイを、以下の様式で、Ｓｐｏｏｒｅｎら，Ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ２−ｍｅｔｈｙｌ−６−（ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９５：１２６７−１２７５（２０００）およびＬｅｃｃｉ Ａ，Ｂｏｒｓｉｎｉ Ｆ，Ｖｏｌｔｅｒａ ＧおよびＭｅｌｉ Ａ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｔｉｃｉｐａｔｏｒｙ ａｎｘｉｅｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｎｎａｃｏｌｏｇｙ １０１：２５５−２６１（１９９０）に記載される方法と実質的に類似の方法で実行した。

（Ｉ．ストレス誘導性過温症：）
ストレス誘導性過温症（ＳＩＨ）を、Ｌｅｃｃｉら（１９９０）による原型の記載から僅かに改変して採用した。温度計（ＥＬＬＡＢ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で、０．１℃単位の最も近い温度まで、潤滑したサーミスタプローブ（２ｍｍ直径）を直腸に２０ｍｍ挿入して直腸温度を測定した。測定の間、マウスを尾の基部近くを手で捕まえていた。プローブを、安定するまでその場にとどめ、読み取りを得た（１５ｓ以内）。

１つのｍａｃｒｏｌｏｎケージ（４２×２６×１５ｃｍ）あたり１５匹の動物を入れた。実験の少なくとも２４時間前、後の同定のために、ケージ内の動物に色で毛皮に印をつけた。直腸温度を測る６０分前、所定のケージ内の全ての個体を、１分間隔で連続して、試験化合物（用量：１．３、１０または３０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．；注射容積：１０ｍｌ／ｋｇ）、クロルジアゼポキシド−ＨＣｌ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（すなわち、ポジティブコントロール）またはビヒクル（０．５％ メチルセルロース；Ａｎｉｍｅｄ）で処置した。正確に３０分間後、マウスを連続してケージから出し（再び、１分間隔）、そして直腸温度を決定し、記した。一旦温度を記録した後、動物を異なった（隣接した）ケージに入れた。従属変数（すなわち、ストレス誘導性過温症）を、６匹の最初に取り出したマウスにおける直腸温度中間値および６匹の最後に取り出したマウスにおける直腸温度中間値のΔとして規定した。このΔを、特定の温度群に依存して６〜８のケージに対して計算し、ここで、これらの６〜８の値の平均の最後の表示を、使用した。最初の方の動物の直腸温度を使用し、さらに、基礎体温に対する化合物それ自体の潜在的な効果を評価した。

（ＩＩ。ラットにおける社会的審査テスト）
成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（＝「レジデント」ラット；３５０〜４００ｇ）および幼若なＬｉｓｔｅｒ Ｈｏｏｄｅｄラット（＝「侵入者（ｉｎｔｒｕｄｅｒ）」ラット；１００〜１２０ｇ）を使用した。試験２週間前に、侵入者ラットを、一対でｍａｃｒｏｌｏｎケージ（４２×２６×１５ｃｍ）に入れ、レジデントラットを個別にｍａｃｒｏｌｏｎケージ（４２×２６×１５ｃｍ）に入れた。全ての動物を、同じ部屋に入れた。ハウジング設備は、温度調節および湿度調節し、人工照明を備えた（６：００ ＡＭ〜６：００ ＰＭ照明）。動物を、水および食物に、適宜接触させた。全ての動物は、実験的に未処置であった。

全ての動物に試験化合物（０．３、３、１０または３０ｍｇ／ｋｇ）、クロザピン（５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．；ＣＤＺ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）、参照／ポジティブ化合物としてＬｉＣｌ（１０、３０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（０．５％ メチルセルロース）を与えた。注射容積は２ｍｌ／ｋｇであった。経口処置を侵入者ラットのみに与え、化合物投与１時間後にテストを行った。全ての観察を、明期（ｌｉｇｈｔ ｐｈａｓｅ）（８： ００ＡＭ〜１： ００ＰＭ）にレジデントラットのホームケージ（上述）にて行った。ケージの床を、おがくずで覆った。１匹の侵入者ラットおよび１匹のレジデントラットで構成された一対を、ランダムに実験群またはコントロール群に割り当てた。レジデントに対する侵入者ラットの活性アプローチ挙動の持続時間（＝社会的活動に費やした時間）（嗅ぐ行動（ｓｎｉｆｆｉｎｇ）、肛門性器探索（ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ）、鼻を押し付ける行動（ｎｏｓｉｎｇ）、毛づくろい（ｇｒｏｏｍｉｎｇ）、舐める行動（ｌｉｃｋｉｎｇ）、遊び（ｐｌａｙｉｎｇ））を、５分の間、手で記録（ｓｃｏｒｅ）して累積的に記録（ｒｅｃｏｒｄ）した。

（ＩＩＩ．上昇プラスメイズ（Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ）テスト：）
雄の成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１８０〜２２０ｇ）を、４群でｍａｃｒｏｌｏｎケージ（４２×２６×１５ｃｍ）内に、実験の少なくとも３日前に入れた。ハウジング設備は、温度調節および湿度調節し、人工照明を備えた（６：００ ＡＭ〜６：００ ＰＭ照明）。動物を、水および食物に、適宜接触させた。全ての動物は、実験的に未処置であった。

上昇プラス−メイズは、２つの開放腕（ｏｐｅｎ ａｒｍ）（４０×１２ｃｍ）および閉鎖腕（ｅｎｃｌｏｓｅｄ ａｒｍ）（４０×１２×２０ｃｍ）から成り、これらは、すべて共通の中央プラットホーム（１２×１２ｃｍ）から延びる。および互いに反対に配置された類似の腕を有する、プラス記号の形状を形成する立体構造、および装置は、中央台上の床から６０ｃｍ上に上がる。このメイズは、灰色のプレキシグラスからできている。開放腕を掴むことは、小さなその周囲の小さく持ち上がった縁（０．２５ｃｍ）を含めることによって促進される。

この方法を、以下の様式で、Ｈａｎｄｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．およびＭｉｔｈａｎｉ，Ｓ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｐｈａ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ａ ｍａｚｅ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｏｆ”ｆｅａｒ”−ｍｏｔｉｖａｔｅｄ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ．Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｔｖｚｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３２７：１−５（１９８４）に記載の方法と実質的に類似の方法で実施した。ラットを、種々の処置のうちの１つにランダムに割り当てた。動物を、テストの少なくとも１時間前に、ハウジング室から実験室に移動した。経口化合物投与後、ラットを、個々にｍａｃｒｏｌｏｎケージ（２２×１６×１４ｃｍ）内に入れ、６０分後に、閉鎖腕に面した中央プラットホームに配置した。８分間の試験を行い、メイズを被験体間で完全に洗浄した。直接位置決定を、メイズの側に座している観察者によって行い、以下の従来パラメータを使用した：開放腕および閉鎖腕の侵入数（腕の侵入は、四肢が腕に侵入したことによって定義した）、および開放腕上で過ごした時間（中央プラットホームを除く）。異なった処置群由来の動物を、代わる代わるテストし、そして試験を、８：３０ＡＭ〜１２：３０ＰＭ（すなわち、明期の前半部）に行った。パラメータを反映する以下の不安を、記録した：開放腕上で過ごした時間の比率（開放／全体）、第１腕を離れるまでの持続時間、そして腕侵入の総数。

本発明の化合物は、上述の動物モデルにおいて、抗不安薬様の効果を示す。

（実施例２３）
（アルツハイマー病についての細胞アッセイ−ニューロン生存）
Ｋｉｅｎｌｅｎ−Ｃａｍｐａｒｄら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：１５６６６（２００２）に記載の方法と実質的に類似の方法で以下のアッセイを行った。海馬ニューロンの一次培養物、Ｅ１８ラット胚から調製した（Ｐａｒｋら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，７４：１１４，２０００）。細胞を、６ウェルまたは９６ウェル培養皿（４×１０^５細胞／ｃｍ^２）中またはスライドガラス（１． ２５×１０^５細胞／ｃｍ^２）にプレート培養し、ポリ（Ｄ−リジン）で前処理し、そして６日間インビトロで２％Ｂ−２７および０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンで補充したＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬＴＭ倍地中で培養し、その後組換えアデノウイルスを感染させた。これらの条件の下で、ニューロン培養物（ニューロンの９８％まで）は、高い分化率および生存率を示す。

組換えアデノウイルスおよびニューロン感染−−アデノウイルスをコードする変異体（ＡＰＰ６９５の形態）の産生、伝播、および精製を行う。インビトロで６時間後、ニューロン培養物を、１００の多重感染で４時間、最小の培養培地容積で感染させる。次いで感染培地を、新しい培養培地で３〜５日間置換した。これらの条件の下で、少なくとも７５％のニューロンは、組換えアデノウイルスによってコードされるタンパク質を発現する。

細胞生存−−ニューロン生存を、呈色ＮＴＴアッセイまたはＣｅｌｌｏｍｉｃｓ自動画像化システムを使用してＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ蛍光細胞生存度アッセイによって測定した。核染色については、細胞を固定し（リン酸緩衝か生理食塩水中０．３７％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒド）、そしてＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素（１μｇ／ｍｌ）中で３０分間培養した。

Ａβ産生の定量−−培養培地を収集し、プロテアーゼインヒビターで処理し （１μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）、そして遠心分離（１６，０００×ｇ、５分、４℃）によって除去する。１００μｌの上清を、以下に記載するＥＬＩＳＡ方法を用いたβアミロイド定量のために使用する。

（実施例２４）
（βアミロイド（１−４０）賛成の阻害）
アルツハイマー病は、細胞外プラークおよび脳内の細胞間神経細線維もつれによって特徴付けられる。これらのプラークの主要なタンパク質成分は、βアミロイド（「ａｒｓ」）ペプチドであり、これは、アミロイド前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）によって切断される。

（細胞株および化合物処理：）
Ａβを分泌可能な安定細胞株を、ヒトＨ４神経膠腫症細胞において、ＡＰＰ６９５含有Ｓｗｅｄｉｓｈ変異体（Ｋ５９５Ｎ、Ｍ５９６Ｌ）およびＹＦＰを分泌マーカーとして発現するレトロウイルスベクターの導入によって構築した。ＡＰＰ６９５を発現する安定な形質導入体を、高レベルのＹＦＰを発現する細胞の選別によって選択した。

細胞を、１ウェルあたり８０，０００細胞で、９６ウェルプレート中で、１０％胎仔ウシ血清（ＰＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１１９６５−０９２）中でプレート培養した。２４時間後、この培地を目的の化合物を含有する新しい培地と交換した。ここで、この２０μＭ〜１０ｎＭの範囲の濃度の化合物を、７点滴定で二連でテストした。試験化合物で１８〜２４時間、３７℃でインキュベート後、上清中ｈＡＤ（１−４０）濃度を、ｈＡβ４０ ＥＬＩＳＡを用いて決定した。

（Ａβ分泌についてのＥＬＩＳＡアッセイ）
サンプルの培養物上清におけるｈＡβ４０のインビトロ定量測定のために、Ｔｈｅ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｓｉｇｎａｌ Ｓｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎβ Ａｍｙｌｏｉｄ（ｈＡβ４０）ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＫＨＢ３４８２）を使用した。ＮＨ_２末端特異的なモノクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェル上にコートした。サンプル（公知のｈＡβ成分標準を含む）をこれらのウェル内にピペット分注し、その後、ｈＡβの１−４０配列について特異的なウサギ抗体を添加した。次いで、結合ウサギ抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体の使用により検出した。過剰な抗ウサギ抗体の除去後、結合酵素により切断されて色を呈する基質溶液を加えた。この呈された色の強度は、サンプル中のｈＡβ（１−４０）の濃度に正比例する。

（ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った：）
サンプルおよび既知の濃度のｈＡβ（１−４０）ペプチドを含む標準を、標準／サンプル希釈剤（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ試薬）中に希釈した。プロテアーゼインヒビターＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ−６４、ロイペプチン、およびペプスタチンＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ＳｅｔＩＩＩ，カタログ番号５３９１３４）を全てのサンプルに添加し、Ａβペプチドのタンパク質溶解を防いだ。１００μｌのサンプルを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに加え、そして室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、１００μｌの洗浄緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ試薬）で４回洗浄し、次いで、１００μｌの検出抗体を加え、そしてプレートを２時間室温でインキュベートした。検出抗体は、ｈＡβ（１−４０）配列を認識する。

このウェルを４回１００μｌの洗浄緩衝液で洗浄し、次いで１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ二次抗体を加えた。プレートｗくぉ室温で２時間インキュベートした。次いで、ウェルを、１００μｌの洗浄緩衝液で５回戦上司、次いで１００μｌの安定化色素原を加えた。このプレートを、室温で３０分間、暗所でインキュベートした。安定化色素原は、結合ＨＲＰによって切断したときに青くなる基質溶液であり、従って、標準マイクロタイタープレートリーダー中でモニターされ得る。次いで、１００μｌの停止溶液を加え、そしてウェル中の色の強度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ３４０プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。代表的に、化合物を点用量反応（２連で実行）において、２０μＭ〜１０μＭの範囲の化合物濃度で分析した。サンプル中のＡβの濃度（１−４０）を、既知の濃度のＡβペプチドを含む標準から産生された標準曲線から計算した。

本発明の化合物を、３日間に渡ってテストした。毎日、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍγセクレターゼ「インヒビターＸ」を、コントロールに含めた。これは、報告されたＩＣ５０を有する、５０ｎＭの細胞許容性ヒドロキシエチルジペプチドアイソスター（カタログ番号５６５７７１）である。

（実施例２５）
（アルツハイマー病（ＡＤ）についてのトランスジェニック動物アッセイ）
（Ｉ．ＡＤトランスジェニック動物）
Ｌｙｓ６７０−−＞Ａｓｎ、Ｍｅｔ６７１−−＞Ｌｅｕ変異を含むヒトアルツハイマーβアミロイド（Ａβ）前駆体タンパク質の形態の６９５アミノ酸を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｎ．Ｙ．から市販される）は、３月齢で空間参照および改変課題においておよび正常な学習および記憶を有したが、９〜１０月齢で障害を示した。Ａβ（１−４０）における５倍の増加およびＡβ（１−４２／４３）における１４倍の増加が、これらの行動の欠陥の出現を達成した。Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ色素で染色された多くのＡβプラークは、マウスの皮質構造および辺縁構造において、Ａβの増加した量で存在する。これらのトランスジェニックマウスにおけるアルツハイマー病を暗示する行動異常、生化学的異常、病理学的異常に相関する出現は、この疾患の病理学および神経生物学の新規の探索の機会を示唆する。Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｅｍｏｒｙ ｄｅｆｉｃｉｔｓ，Ａｂｅｔａ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６ Ｏｃｔ ４；２７４（５２８４）：９９−１０２を参照のこと。

Ｔｇ２５７６マウスは、本明細書中に記載のモデルに特定されているが、市販および個人的にの両方で入手可能な他のトランスジェニックマウスがこれらのモデルにおける使用に感受性であることが理解される。

（ＩＩ．β−アミロイドＥＬＩＳＡプロトコル）
Ｔｇ２５７６マウスのアルツハイマー病モデルにおけるＡβと記憶との間の関係。Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年３月１日，２２（５）：１８５８−１８６７。

凍結した脳半球（ｈｅｍｉｂｒａｉｎ）を、連続して２工程抽出で抽出する［（１）２％ ＳＤＳおよび（２）７０％蟻酸（ＦＡ）中の超音波処理］。後の画分は、Ａｂｎｓｏｌと呼ばれる。サンプルの超音波処理の後、１００，０００×ｇで１時間４℃で遠心分離し、上清を回収し、そしてペレットを次の溶液で超音波処理した。脳抽出物を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって以前記載されたように（Ｓｕｚｕｋｉら，１９９４；Ｇｒａｖｉｎａら，１９９５）測定した。以下のシステムを使用した：（１）ＢＡＮ−５０捕捉およびＢＡ−２７またはＢＣ−０５検出または（２）３１６０捕捉およびＢＡ−２７またはＢＣ−０５検出、これらは両方ともＡβ １−４０およびＡβ １−４２を、それぞれ検出する。全ての年齢のマウスの多くのＴｇ２５７６脳の検出比較は、３１６０捕捉ＥＬＩＳＡによって検出されるＡβ４０およびＡβ４２の量を示し、これは、ＢＡＮ−５０が捕捉のために使用される場合と本質的に同一である。２％ ＳＤＳ抽出物は、少なくとも１：４０で希釈され、従って、このアッセイは、０．０５％ ＳＤＳ中で行われる。より大きな希釈がＳＤＳについて矯正するため、これらをまた、０．０５％ ＳＤＳ中でアッセイする。ＦＡ抽出物を、１Ｍ Ｔｒｉｓリン酸緩衝液中１：２０の希釈で中性化する（ｐＨ ８．０）。Ｓｏｆｔｍａｘプログラムを使用し、マイクロリットル中フェムトモルを、サンプルと同一溶液中の既知の濃度の合成Ａβ １−４０およびＡβ １−４２のサンプル吸光度の比較により計算し、これらの値を、湿重量グラムあたりピコモルで最終的に発現された元のホモジネートの湿重量で矯正する。全ての場合において、非トランスジェニック組織を、トランスジェニック組織と同様に平行して処理する。

（ＩＩＩ．トランスジェニックマウスの行動試験：モリス水迷路）
水迷路を、発明者らが記憶障害の全ての段階を検出し、識別するのを可能にする様式で、Ｂ６／ＳＪＬ株バックグラウンドのＴｇ２５７６マウスに調整する。このプロトコルは、生命の初期におけるわずかな変化および生命の後期におけるかなりの変化を測定するために必要な感受性、特異性および動的範囲を提供する。訓練の間のプローブの内挿は、感受性を提供する。性能の欠損に対する除外基準の採用は、特異性を提供する。訓練は、広範囲に、ダイナミックレンジを適合させる。平均プローブ点数（ＭＰＳ）の値は、３回のプローブ試行の間の標的象限のマウスによって費やされた時間の平均百分率であって、分子マーカーと関連した個々のマウスの認識能力の定量化を改善し、広範なダイナミックレンジを伴なう単一の測定を提供した。他の株バックグラウンドのＴｇ２５７６マウスに対するプロトコルを、学習の速度および能力欠損における株特異的差異に関して調整する必要がある場合もある。Ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａβ ａｎｄ Ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｇ２５７６ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年３月１日、２２（５）：１８５８−１８６７を参照のこと。

水迷路は、２５−２７℃の水で満たした１ｍまたは１．２ｍの円形のプールであって、無毒性の白色塗料の添加によって不透明にしている。プールは、はっきりと形づくったカーテンおよび別個の物体を備える棚からなるアミド固定した空間手掛かりを配置する。マウスをビーカー中に配置し、プールの壁に面して穏やかに水中に下げる。マウスは最初に、可視的なプラットフォーム訓練を連続３日間受け（１日当たり、８回の試行）、泳いで黒色と白色のしまの柱で印をつけたプラットフォーム（１２×１２ｃｍ^２の四角形の表面）に上がらせる。可視的なプラットフォームの日程は、統計解析のために、４回の試行の２組の訓練にわける。可視的なプラットフォーム訓練の間、プラットフォームの位置（ＮＥ、ＳＥ、ＳＷまたはＮＷ）および開始位置（プラットフォームのすぐ横に隣接した位置を除いて、Ｎ、ＮＥ、Ｅ、ＳＥ、Ｓ、ＳＷ、ＷまたはＮＷ）は、各試行において、擬似ランダム的に変動する。擬似ランダム化は、所定の位置が繰り返される前に、全ての位置がサンプリングされることを確実にする。遮蔽プラットフォームの訓練を、９連続日にわたって実施し（１日当たり、４回の試行）、この訓練では、マウスは、水の表面の１．５ｃｍ下に沈めたプラットフォームを捜す。６０秒以内にプラットフォームに到達できないマウスは、金属避難シャベル（ｍｅｔａｌ ｅｓｃａｐｅ ｓｃｏｏｐ）でプラットフォームに到達に導かれる。遮蔽プラットフォーム試行の間、プラットフォームの位置は、一定のまま（ＮＥ，ＳＥ、ＳＷまたはＮＷ）であり、そして、７つの擬似ランダム的に選択される位置（プラットフォームのすぐ横に隣接する位置を除く、Ｎ、ＮＥ、Ｅ、ＳＥ、Ｓ、ＳＷ、ＷまたはＮＷ）の一つのプールにマウスを入れる。各遮蔽プラットフォーム試行の後、３０秒間でプラットフォーム上に残ったマウスを、プラットフォームから追い去り、非難シャベルを使って飼育かごに戻される。マウスは直ちに、シャベルとプールからの避難との関係を学び、連続してシャベルの方に向くか、または、シャベルが出現するとシャベルの後を追う。マウスの避難シャベルの方に向く能力または非難シャベルを追う能力は、視力および注意力の独立した測定に相当した。遮蔽プラットフォーム訓練の開始後４日目、７日目および１０日目で、プラットフォームをプールから取り除いたプローブ試行を実施し、マウスに、プラットフォームを６０秒間捜させる。全ての試行は、プールの上に直接マウントしたカメラによってモニタリングし、コンピュータ追跡システムを使用して記録し、分析する。

ＭＰＳを各マウスについて計算し、モリス水迷路における空間情報の記憶力を評価するために使用する。挿入したプローブからの情報を統合することによって、ＭＰＳは、以前に記載された学習指標（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、１９９３）と類似した概念の学習の測定を表し、学習の種々の段階で記憶をサンプリングする。同様の統計結果は、ＭＰＳ、学習指標および学習点数（プローブ試行の間に、標的四分円で費やした時間の百分率の加重合計）を用いて見出され、本発明者らは、表現が容易なために、ＭＰＳを使用してデータを表すことを選択した。

試験後、各群のマウスの部分集合を安楽死させ、Ａβ測定のために、右半分の脳を液体窒素中で凍結させる。全ての脳をコード化した様式で分析する。

（ＩＶ．トランスジェニックマウスの行動試験：探索活動性、不安、運動神経）
βＡＰＰ６９５ＳＷＥ変異を発現するトランスジェニックマウス：探索活動性、不安および運動神経に対する効果を参照のこと。Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ２００３年７月４日；９７７（１）：３８−４５。

白色アクリルで作製されたＴ迷路で、自発的な変化を試験する。この迷路は、２本のアーム（長さ：３０ｃｍ）によって各側に隣接する中心の幹（長さ：３０ｃｍ）からなる。迷路の幅は、９ｃｍであって、各壁は、２０ｃｍの高さである。最初の試行では、マウスをＴ迷路のプラスチック障壁によってブロックされた右アームを有するＴ迷路の幹に配置する（強制選択）。利用可能なアームに入った後、マウスの後ろを障壁で閉鎖することによって、マウスを６０秒間その中に維持する。次いで、マウスを回収し、障壁を取り除いた後すぐに、自由選択試行のために、幹に戻す。マウスは、反対のアームまたは同一のアームのどちらかを探索し得る（四肢基準）。第一試行のブロックしたアームが、奇数日の右側から偶数日の左側に切り替えることを除いて、続く９日間、同じ二試行手順を繰り返す。選択試行を測定する間の反応の前の反復の数および試行ごとの１分間の切捨て期間を含む待ち時間を測定する。マウスが１分以内に反応しなかった場合、それは、選択時点ではなく、反応が全ての試行で記録され得るように、通常は、１回以下、マウスを後ろから短くつつく。

自発運動量を、５０ｃｍ×５０ｃｍの表面領域および３８ｃｍの高さの壁を有する白色アクリルで作製された開放領域で測定する。中心帯および周辺帯における活性を、頭上のビデオカメラによって記録し、分析する。中央帯は、正方形で、各壁から２５ｃｍの距離で始まった。マウスを、毎日３回、５分間の時間で、開放領域の角に配置する。移動した距離および各領域において休息（＜２ｃｍ／ｓ）に費やした時間、緩慢な移動（２〜５ｃｍ／ｓ）に費やした時間、または敏速な移動（＞５ｃｍ）に費やした時間を測定し、また、装置の周辺および中心で費やした時間も測定する。

増強したプラス迷路（ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ））は、十字型の４つのアーム（長さ：７０ｃｍ、幅：１０ｃｍ、床面からの高さ：４０ｃｍ）および中央領域（１０ｃｍ^２）からなる。アームの内２つは、壁（高さ：１０ｃｍ）によって３つの側面上に囲まれるが、他の２つは、落下を最小限にするために使用する最小限の境界（高さ：０．５ｃｍ）を除いて開放される。２つの囲まれたアームまたは開放アームは、互いに面している。マウスを中央領域に配置し、閉鎖アームおよび開放アームに入る数および入っている時間を、前述の試験で使用したものと同一のビデオ追跡装置を用いて、毎日２回、５分間の時間で測定する。次いで、開放／総アームへの進入および時間の割合を計算する。マウスが開放アームから落下する稀な場合、時間の記録を停止し、マウスを落ちた元の正確な位置に戻す。生じ得る匂いの手がかりの効果を低減させるために、自発的な反復、開放領域およびプラス迷路試験の各期間の後、装置を湿った布できれいにふきとり、次の試行の開始の前に乾燥させる。

定常梁は、プラスチックで構成し、２．５ｃｍの直径と、１１０ｃｍの長さを有する。この梁は、頑丈なグリップを確保するために、１層の白色の遮蔽テープで覆われ、線画によって１１個の部分に分けられる。梁は、艶消しで覆った床面から４５ｃｍの高さに配置し、落下を和らげるのに役立ち、それによってマウスに対する傷害を防止する。マウスが逃げるのを防止するために、梁の末端に厚紙の壁を挿入する。マウスを中央部分に配置することによって、試行を開始した。越えた部分の数（四肢基準）、落下するまでの時間および落下した数を、４回の試行時間の１回当たり測定する。切捨て期間は、試行あたり１分間で、試行間の間隔は１５分間である。

加速的回転棒（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｒｏｔｏｒｏｄ）（Ｍｏｄｅｌ ７６５０、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）は、うねのあるプラスチック（直径：３ｃｍ）から構成される。梁を、床面レベルから１３．５ｃｍの高さに配置し、プラスチック障壁によって５個の部分（幅：５．５ｃｍ）に分ける。実験者の視点から離れると、前向きの歩行運動によって落下が避けられ得るように、マウスを、既に、マウスの動きと反対向きに回転する（４ｒｐｍ）棒の上に配置する。回転棒を、各５分間の試行の間に、徐々に、滑らかに４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで加速した。落下するまでの時間を、毎日３回、１５分間の試行間の間隔を備えた４回の試行時間に対して測定する。マウスが２回の完全な回転の間、移動せずに、棒にしがみついた（受動的な回転）場合は常に、落下したとみなす。訓練後、種々の正常反射および病的反射の発生率を評価する。

（Ｖ．免疫組織化学による脳のβ−アミロイドの蓄積の定量）
変異体ヒトプレセニリン１およびアミロイド前駆体タンパク質を同時発現するトランスジェニックマウスにおける増進した血小板の蓄積、連合性学習障害およびα７ニコチンレセプタータンパク質の上方制御については、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２年６月２１日；２７７（２５）２２７６８−８０を参照のこと。

マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で心臓灌流し、その後４％ パラホルムアルデヒドで固定する。凍結した脳切片を、クリオスタットを使用して、１２μｍの厚さで冠状に切り出し、ＰｒｏｂｅＯｎ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にマウントし、その後、風乾する。染色のすぐ前に、脳切片をアセトンで固定する。組織切片を、０．３％ Ｈ_２Ｏ_２および０．３％ 正常ヤギ血清中で３０分間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水中１．５％正常ヤギ血清とともに３０分間インキュベートする。次いで、脳切片をビオチン化抗マウスＩｇＧ（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した抗Ａβ抗体６Ｅ１０（１：１０００、Ｓｅｎｅｔｉｋ）とともにインキュベートし、その後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｒｅａｇｅｎｔ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で免疫検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。

本発明の多数の実施形態が上に記載されるが、本発明者らの基本的な実施例は、変化させて、本発明の化合物および方法を使用する他の実施形態を提供し得ることが明らかである。従って、本発明の範囲は、実施例を用いて示した特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されるべきであることが理解される。

図１は、ビヒクルコントロールと比較して、中大脳動脈閉塞モデル（ＭＣＡＯ）の６時間後に投与した式Ｉの化合物による処置の効果（総梗塞量、皮質梗塞量、線条体の虚血性損傷、および水腫形成における減少）を示す。 図２は、ビヒクルコントロール群と比較して、実験の時間経過にわたる式Ｉの化合物で処置したラットの神経学的機能を示す。

Claims (6)

1. 式Ｉ：
   

   

   の化合物またはその薬学的に受容可能な塩であって、ここで：
   Ｗは、窒素であり；
   Ｒ^１は、水素またはフッ素から選択され；そして
   Ｒ^ｙは、Ｃ_１〜４脂肪族基であり、ここで、該脂肪族基は、完全に飽和であるかまたは１単位以上の不飽和を含む直鎖または分枝鎖のＣ _１ 〜Ｃ _４ 炭化水素基、あるいは完全に飽和であるかまたは１単位以上の不飽和を含む単環式Ｃ _３ 〜Ｃ _４ 炭化水素基である（ただし、芳香族炭化水素基ではない）
   化合物。
2. 請求項１に記載の化合物であって、Ｒ^ｙが、メチル、エチル、シクロプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、またはイソプロピルから選択される、化合物。
3. 請求項２に記載の化合物であって、Ｒ^ｙが、メチル、シクロプロピル、またはｔｅｒｔ−ブチルから選択される、化合物。
4. 請求項１に記載の化合物であって、Ｒ^１が、水素である、化合物。
5. 請求項１に記載の化合物であって、Ｒ^１が、フッ素である、化合物。
6. 以下：
   

   

   

   からなる群より選択される、化合物。

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