PT1532145E

PT1532145E - Composiçoes de pirazole úteis como inibidores de gsk-3

Info

Publication number: PT1532145E
Application number: PT03767010T
Authority: PT
Inventors: Cornelia J Forster; Larry C Park; Marion W Wannamaker; Yung-Mae Yao
Original assignee: Vertex Pharma
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2007-01-31
Also published as: AU2003257078A1; DE60308387D1; TW200409774A; ATE339419T1; WO2004013140A1; ES2273043T3; US7491730B2; CA2494100A1; JP2006273872A; EP1532145B1; BR0313176A; CN1319968C; KR20050032105A; NZ550883A; JP2005539012A; IL166620A; CN101037438A; AU2003257078B2; US20090118278A1; EA200500299A1

Description

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DESCRIÇÃO "Composições de pirazole úteis como inibidores de GSK-3"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a inibidores de proteína-quinases, especialmente glicogénio-sintase-quinase-3 (GSK-3), uma serina/treonina-proteina-quinase. A invenção proporciona também composições compreendendo os inibidores da invenção e métodos de utilização dessas composições no tratamento de várias desordens, tais como diabetes, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, esclerose múltipla (EM) , icto, desordens neurológicas e neurodegenerativas, e desordens psiquiátricas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A pesquisa de novos agentes terapêuticos tem sido grandemente auxiliada em anos recentes por um melhor entendimento da estrutura de enzimas e outras biomoléculas associadas com doenças alvo. Uma importante classe de enzimas que tem sido o objecto de extensivo estudo é a das proteína-quinases.

As proteína-quinases medeiam a transdução de sinais intracelulares. Fazem isto efectuando uma transferência de fosforilo de um nucleósido-trifosfato para uma proteína aceitadora que está envolvida numa via de sinalização. Existem várias quinases e vias através das quais estímulos extracelulares e outros estímulos fazem com que ocorram uma variedade de respostas celulares no interior da célula. Os exemplos destes estímulos incluem sinais de stress ambiental e químico (e.g., choque osmótico, choque térmico, radiação ultravioleta, endotoxina bacteriana e H2O2) , citóquinas (e.g., interleucina-1 (IL-1) e factor α de necrose tumoral (TNF-α)), e factores de crescimento (e.g., factor estimulante de colónias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF)). Um estímulo extracelular pode afectar uma ou mais respostas celulares relacionadas com o crescimento, a migração e a diferenciação celulares, a secreção de hormonas, a activação de factores de transcrição, 2 ΕΡ 1 532 145 /PT a contracção de músculos, o metabolismo da glucose, o controlo da síntese de proteínas e a regulação do ciclo celular.

Muitas doenças estão associadas com respostas celulares anómalas desencadeadas por eventos mediados por proteína-quinase. Estas doenças incluem doenças auto-imunes, doenças inflamatórias, doenças ósseas, doenças metabólicas, doenças neurológicas e neurodegenerativas, cancro, doenças cardiovasculares, alergias e asma, doença de Alzheimer e doenças relacionadas com hormonas. Assim, tem havido um esforço substancial na química médica para encontrar inibidores de proteína-quinase que sejam eficazes como agentes terapêuticos. A glicogénio-sintase-quinase-3 (GSK-3) é uma serina/treonina-proteína-quinase constituída pelas isoformas α e β que são, cada uma, codificadas por genes distintos

[Coghlan et ai., Chemistry & Biology, 7, 793-803 (2000); Kim e Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 10, 508-514 (2000)]. A GSK-3 foi implicada em várias doenças incluindo diabetes, doença de Alzheimer, desordens do SNC tais como a desordem maníaco-depressiva e doenças neurodegenerativas, e hipertrofia cardiomiocítica [veja-se, e.g., WO 99/65897; WO 00/38675; Kaytor e Orr, Curr. Opin. Neurobiol., 12, 275-8 (2000); Haq et al., J. Cell Biol., 151, 117-30 (2000); Eldar-Finkelman, Trends Mol. Med., 8, 126-32 (2002)]. Estas doenças estão associadas com a operação anómala de certas vias de sinalização celulares em que a GSK-3 desempenha um papel.

Verificou-se que a GSK-3 fosforila e modula a actividade de várias proteínas reguladoras. Estas incluem glicogénio-sintase, que é a enzima limitante da velocidade necessária para a síntese de glicogénio, a proteína Tau associada aos microtúbulos, o factor de transcrição génica β-catenina, o factor de iniciação da tradução elF-2B, bem como ATP-citrato-liase, axina, factor-1 do choque térmico, c-Jun, c-myc, c-myb, CREB e CEPBa. Estes alvos diversos implicam a GSK-3 em muitos aspectos de metabolismo, proliferação, diferenciação e desenvolvimento celulares.

Numa via mediada por GSK-3 que é relevante para o tratamento de diabetes de tipo II, a sinalização induzida por 3 ΕΡ 1 532 145 /PT insulina conduz à assimilação celular de glucose e à síntese de glicogénio. A GSK-3 é um regulador negativo do sinal induzido por insulina nesta via. Normalmente, a presença de insulina causa a inibição da fosforilação mediada por GSK-3 e desactivação da glicogénio-sintase. A inibição de GSK-3 conduz a síntese de glicogénio e assimilação de glucose aumentadas [Klein et al., PNAS, 93, 8455-9 (1996); Cross et al., Biochem. J., 303, 21-26 (1994); Cohen, Biochem. Soc. Trans., 21, 555-567 (1993); e Massillon et al., Biochem. J. 299, 123-128 (1994); Cohen e Frame, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2, 769-76 (2001)]. Contudo, quando a resposta da insulina é insuficiente num paciente diabético, a síntese de glicogénio e a assimilação de glucose não conseguem aumentar apesar da presença de níveis sanguíneos relativamente elevados de insulina. Isto conduz a níveis sanguíneos anormalmente elevados de glucose com efeitos agudos e crónicos que podem por último resultar em doença cardiovascular, insuficiência renal e cegueira. Nestes pacientes, a inibição induzida por insulina normal da GSK-3 não ocorre. Foi também relatado que a GSK-3 é super-expressa em pacientes com diabetes tipo II [WO 00/38675]. Os inibidores terapêuticos de GSK-3 são portanto úteis para o tratamento de pacientes diabéticos que sofrem de uma resposta insuficiente à insulina. A apoptose foi implicada na patofisiologia de danos cerebrais isquémicos (Li et al., 1997; Choi, et al., 1996; Charriaut-Marlangue et al., 1998; Grahm e Chen, 2001; Murphy et al., 1999; Nicotera et al., 1999). Publicações recentes indicam que a activação de 6ΞΚ-3β pode estar envolvida em mecanismos apoptóticos (Kaytor e Orr, 2002; Culbert et al., 2001) . Estudos em modelos de rato de icto isquémico induzido por oclusão da artéria cerebral média (MCAO) mostraram que uma expressão aumentada de ΰ3Κ-3β se segue à isquemia (Wang et al., Brain Res, 859, 381-5, 2000; Sasaki et al., Neurol Res, 23, 588-92 ,2001). O factor de crescimento de fibroblastos (FGF) reduziu as lesões cerebrais isquémicas após oclusão permanente da artéria cerebral média (MCO) em ratos (Fisher et al. 1995; Song et al. 2002) . De facto, os efeitos neuroprotectores do FGF demonstrados em modelos de isquemia em ratos podem ser mediados por uma inactivação dependentes de quinase PI-3/AKT da 6ΞΚ-3β (Hashimoto et al., 2002). Assim, a 4 ΕΡ 1 532 145 /PT inibição de GSK-3P após um evento isquémico cerebral pode melhorar as lesões cerebrais isquémicas. A GSK-3 está também implicada no enfarte do miocárdio. Veja-se Jonassen et al., Circ Res, 89:1191, 2001 (A redução no enfarte do miocárdio por administração de insulina na reperfusão é mediada por meio da via de sinalização dependente de Akt); Matsui et al.r Circulation, 104:330, 2001 (a activação de Akt preserva a função cardíaca e previne a lesão cardiomiocítica após isquemia cardíaca transiente in vivo) ; Miao et al., J Mol Cell Cardiol, 32:2397, 2000 (a entrega intracoronária do gene de Akt mediada por adenovírus no coração reduziu a dimensão do enfarte massivo após lesão de isquemia-reperfusão in vivo); e Fujio et al., Circulation et al., 101:660, 2000 (a sinalização de Akt inibe a apoptose dos miócitos cardíacos in vitro e protege contra a lesão de isquemia-reperfusão no coração de ratinho). A actividade de GSK-3 desempenha um papel no traumatismo da cabeça. Veja-se Noshita et al., Neurobiol Dis, 9 :294, 2002

(A sobre-regulação da via de Akt/Pl3-quinase pode ser crucial para a sobrevivência celular após lesão traumática do cérebro) e Dietrich et al., J Neurotrauma, 13:309, 1996 (A administração pós-traumática de bFGF reduziu significativamente o volume de contusão total & neurónios corticais danificados num modelo de rato de lesão traumática do cérebro).

Sabe-se também que a GSK-3 desempenha um papel em desordens psiquiátricas. Veja-se Eldar-Finkelman, Trends Mol Med, 8:126, 2002; Li et al., Bipolar Disord, 4:137, 2002 (LiCl e ácido Valpróico, fármacos anti-psicóticos, estabilizantes do humor, diminuem as actividades de GSK3 e aumentam a beta-catenina) e Lijam et al., Cell, 90 : 895, 1997 (ratinhos com Dishevelled desactivada (Dishevelled-KO) apresentaram comportamento social e controlo sensoriomotor defeituosos. A Dishevelled, uma proteína citoplasmática envolvida na via de WNT, inibe as actividades de GSK3beta).

Mostrou-se que a inibição de GSK3 por lítio e ácido valpróico induz a remodelação axonal e uma alteração da conectividade sináptica. Veja-se Kaytor & Orr, Curr Opin 5

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Neurobiol, 12:275, 2002 (A infra-regulação de GSK3 provoca alterações em proteínas associadas a microtúbulos: tau, MAPI & 2) e Hall et al., Mol Cell Neurosci, 20:257, 2002 (o lítio e o ácido valpróico induzem a formação de estruturas do tipo cones de crescimento ao longo dos axónios). A actividade de GSK-3 está também associada à doença de Alzheimer. Esta doença é caracterizada pela presença do bem conhecido péptido β-amilóile e à formação de emaranhados neurofibrilares intracelulares. Os emaranhados neurofibrilares contêm proteína Tau hiperfosforilada, em que a Tau está fosforilada em locais anómalos. Mostrou-se que a GSK-3 fosforila estes locais anómalos em modelos celulares e animais. Adicionalmente, mostrou-se que a inibição de GSK-3 previne a hiperfosforilação de Tau em células [Lovestone et al. , Curr. Biol., 4, 1077-86 (1994); e Brownlees et al.,

Neuroreport 8, 3251-55 (1997); Kaytor e Orr, Curr. Opin.

Neurobiol., 12, 275-8 (2000)]. Em ratinhos transgénicos que sobre-expressam GSK3, foram observadas significativa hiperfosforilação de Tau aumentada e morfologia anómala de neurónios [Lucas et al., EMBO J, 20:27-39 (2001)]. A GSK3 activa acumula-se no citoplasma de neurónios pré-emaranhados, que podem conduzir a emaranhados neurofibrilares em cérebros de pacientes com DA [Pei et al., J Neuropathol Exp Neurol, 58, 1010-19 (1999)]. Portanto, a inibição de GSK-3 retarda ou pára a produção de emaranhados neurofibrilares e desse modo trata ou reduz a gravidade da doença de Alzheimer. A evidência do papel que a GSK-3 desempenha na doença de Alzheimer foi mostrada in vitro. Veja-se Aplin et al (1996), J Neurochem 67:699; Sun et al (2002), Neurosci Lett 321:61 (a GSK3b fosforila o domínio citoplasmático da Proteína Precursora Amilóide (APP) e a inibição de GSK3b reduz a secreção de Ab40 & Ab42 em células transfectadas com APP) ; Takashima et al (1998), PNAS 95:9637; Kirschenbaum et al (2001), J Biol Chem 276:7366 (a GSK3b complexa com, e fosforila, a presenilina-1, que está associada com a actividade de gama-secretase na síntese de Αβ de APP); Takashima et al (1998), Neurosci Res 31:317 (A activação de GSK3b por Ab(25-35) aumenta a fosforilação de tau nos neurónios do hipocampo. Esta observação proporciona uma ligação entre Αβ e emaranhados neurofibrilares compostos por 6 ΕΡ 1 532 145 /PT tau hiperfosforilada, outro marco patológico da DA); Takashima et al (1993), PNAS 90 : 7789 (O bloqueio da expressão ou da actividade de GSK3b previne a neuro-degeneração induzida por Ab de culturas primárias cortiçais e do hipocampo); Suhara et al (2003), Neurobiol Aging. 24:437 (A Ab42 intracelular é tóxica para células endoteliais interferindo com a activação do mecanismo dependente da sinalização de Akt/GSK-3b); De Ferrari et al (2003) Mol Psychiatry 8:195 (0 litio protege células N2A & neurónios primários do hipocampo da citotoxicidade induzida por fibrilhas de Αβ, & reduziu a translocação/desestabilização nuclear de b-catenina); e Pigino et al., J Neuroscl, 23:4499, 2003 (As mutações na presenilina 1 de Alzheimer podem desregular e aumentar a actividade de GSK-3, que por sua vez, danifica o transporte axonal em neurónios. As consequentes reduções no transporte axonal em neurónios afectados pode ultimamente conduzir à neurodegeneração). A evidência do papel que a GSK-3 desempenha na doença de Alzheimer foi mostrada in vivo. Veja-se Yamaguchi et al (1996), Acta Neuropathol 92:232; Pei et al (1999), J Neuropath Exp Neurol 58:1010 (A imunorreactividade de GSK3b é elevada em regiões susceptíveis de cérebros de DA) ; Hernandez et al (2002), J Neurochem 83:1529 (Ratinhos transgénicos com sobre-expressão de GSK3b condicional exibem défices cognitivos similares aos de modelos de ratinhos APP transgénicos de DA) ; De Ferrari et al (2003) Mol Psychiatry 8:195 (O tratamento crónico com litio recuperou da neurodegeneração e de desordens comportamentais (labirinto aquático de Morris) causadas por injecção intra-hipocampo de fibrilhas de Αβ.); McLaurin et al., Nature Med, 8:1263, 2002 (A imunização com Αβ num modelo transgénico de DA reduz tanto a neuropatologia semelhante a DA como os danos de memória espacial); e Phiel et al (2003) Nature 423:435 (A GSK3 regula a produção de péptido beta-amilóide por via da inibição directa de gama-secretase em ratinhos tg DA). A presenilina-1 e a cinesina-1 são igualmente substratos para a GSK-3 e relacionam-se com outro mecanismo para o papel que a GSK-3 desempenha na doença de Alzheimer, como foi recentemente descrito por Pigino, G., et al., Journal of Neuroscience (23:4499, 2003). Verificou-se que a GSK3beta 7 ΕΡ 1 532 145 /PT fosforila a cadeia leve da cinsesina-I, o que resulta numa libertação de cinesina-1 pelos organelos ligados à membrana, conduzindo a uma redução no transporte axonal anterógrado rápido (Morfini et al., 2002). Os autores sugerem que as mutações em PS1 podem desregular e aumentar a actividade de GSK-3, que por sua vez, danifica o transporte axonal nos neurónios. As consequentes reduções no transporte axonal em neurónios afectados ultimamente conduzem a neurodegeneração. A GSK-3 está também associada com a esclerose lateral amiotrófica (ELA). Veja-se Williamson e Cleveland, 1999 (O transporte axonal é retardado numa fase muito precoce de ELA em ratinhos mSODl); Morfini et al., 2002 (A GSK3 fosforila as cadeias leves de cinesina e inibe o transporte axonal anterógrado); Warita et al., Apoptosis, 6:345, 2001 (A maioria dos neurónios motores espinais perde as imunorreactividades tanto para PI3-K como Akt no estágio precoce e pré-sintomático que precedem a perda significativa dos neurónios neste modelo animal tg SOD1 de ELA); e Sanchez et al., 2001 (A inibição de PI-3K induz a reatracção de neurites mediada por activação de GSK3). A actividade de GSK-3 está também ligada a lesões da medula espinal e nervos periféricos. Mostrou-se que a inibição da GSK3 por litio e ácido valpróico pode induzir remodelação axonal e alterar a conectividade sináptica. Veja-se Kaytor & Orr, Curr Opin Neurobiol, 12:275, 2002 (A infra-regulação de GSK3 provoca alterações em proteínas associadas aos microtúbulos: tau, MAPI & 2) e Hall et al., Mol Cell Neurosci, 20:257, 2002 (O litio e o ácido valpróico induzem a formação de estruturas do tipo cones de crescimento ao longo dos axónios) . Veja-se também Grothe et al., Brain Res, 885:172, 2000 (O FGF2 estimula a proliferação de células de Schwann e inibe a mielinização durante o crescimento axonal); Grothe e Nikkhah, 2001 (O FGF-2 é supra-regulado nos cotos nervosos proximal e distai em 5 horas após o esmagamento dos nervos); e Sanchez et al., 2001 (A inibição de PI-3K induz a retracção de neurites mediada pela activação de GSK3).

Outro substrato de GSK-3 é a β-catenina, que é degradada após fosforilação por GSK-3. Foram relatados níveis reduzidos de β-catenina em pacientes esquizofrénicos e foram também 8

ΕΡ 1 532 145 /PT associados com outras doenças relacionados com o aumento da morte de células neuronais [Zhong et al., Nature, 395, 698-702 (1998); Takashima et al., PNAS, 90, 77S9-93 (1993); Pei et al., J. Neuropathol. Exp, 56, 70-78 (1997); e Smith et al., Bio-org. Med. Chem. 11, 635-639 (2001)]. Adicionalmente, a β-catenina e Tcf-4 desempenham um papel duplo na remodelação vascular inibindo a apoptose de células do músculo liso vascular e promovendo a proliferação (Wang et ai., Circ Res, 90:340, 2002). Assim, a GSK-3 está associada com desordens angiogénicas. Veja-se também Liu et al., FASEB J, 16:950, 2002 (A activação de GSK3 reduz o factor do crescimento de hepatócitos, conduzindo a uma função de barreira celular endotelial alterada e integridade vascular diminuída) e Kim et ai., J Biol Chem, 277:41888, 2002 (A activação de GSK3beta inibe a angiogénese in vivo utilizando o ensaio de tampão de Matrigel: a inibição da sinalização de GSK3beta aumenta a formação capilar).

Foi mostrada a associação entre GSK-3 e a doença de Huntington. Veja-se Carmichael et al., J Biol Chem., 277:33791, 2002 (A inibição de GSK3beta protege as células de morte celular neuronal induzida por poliglutamina e não neuronal por via de aumentos na b-catenina e da sua via de transcrição associada). A sobre-expressão de GSK3 reduziu a activação do factor-1 de transcrição de choque térmico e a proteína de choque térmico HSP70 (Bijur et al. , J Biol Chem, 275:7583, 2000) que se mostrou diminuírem tanto agregados de poli-(Q) como a morte celular num modelo HD in vitro (Wyttenbach et ai., Hum Mol Genet, 11:1137,2002). A GSK-3 efectua os níveis de FGF-2 e os seus receptores são aumentados durante a remielinização de culturas de agregados cerebrais de cérebros de rato em mielinização. Veja-se Copelman et al., 2000, Messersmith, et al., 2000; e Hinks e Franklin, 2000. Verificou-se também que o FGF-2 induz a excrescência de processos por oligodendrócitos implicando envolvimento de FGF na remielinização (Oh e Yong, 1996; Gogate et al., 1994) e que a terapia com o gene de FGF-2 mostrou melhorar a recuperação de ratinhos com encefalomielite alérgica experimental (EAE) (Ruffini, et al., 2001). 9

ΕΡ 1 532 145 /PT A GSK-3 foi também associada com o crescimento do cabelo porque se mostrou que a sinalização de Wnt/beta-catenina desempenha um papel importante na morfogénese e diferenciação de foliculos pilosos (Kishimotot et al. Genes Dev, 14:1181, 2000; Millar, J Invest Dermatol, 118:216, 2002). Verificou-se que os ratinhos com sobre-expressão constitutiva dos inibidores da sinalização de Wnt na pele não conseguiram desenvolver foliculos pilosos. Os sinais de Wnt são necessários para o desenvolvimento inicial de foliculos pilosos e a GSK3 regula constitutivamente as vias de Wnt inibindo a beta-catenina. (Andl et al., Dev Cell 2:643, 2002). Um sinal transiente de Wnt proporciona o estímulo inicial crucial para o início de um novo ciclo de crescimento piloso, activando a beta-catenina e a transcrição génica regulada por TCF em precursores de foliculos pilosos epiteliais (Van Mater et al., Genes Dev, 17:1219, 2003)

Como a actividade de GSK-3 está associada com a motilidade do esperma, a inibição de GSK-3 é útil como um contraceptivo masculino. Mostrou-se que um declínio na actividade de GSK3 do esperma está associado com o desenvolvimento de motilidade do esperma no epidídimo bovino e de macaco (Vijayaraghavan et al., Biol Reprod, 54: 709, 1996;

Smith et al., J Androl, 20:47, 1999). Adicionalmente, a fosforilação de tirosina & serina/treonina de GSK3 é elevada em esperma móvel, em comparação com imóvel, em touros (Vijayaraghavan et al., Biol Reprod, 62:1647, 2000). Este efeito foi também demonstrado com esperma humano (Luconi et al., Human Reprod, 16:1931, 2001). WO 02/22601 refere-se a compostos de pirazole que são úteis como inibidores de proteína-quinase, especialmente inibidores das proteína-quinases GSK-3 e Aurora-2.

Considerando a falta de opções de tratamento presentemente disponíveis para a maioria das condições associadas com a proteína-quinase GSK-3, existe ainda uma grande necessidade de novos agentes terapêuticos que inibam esta proteína alvo. 10

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção aborda esta necessidade proporcionando compostos de fórmula I:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que W, R1 e Ry são conforme adiante se descreve.

Os compostos da presente invenção são capazes de inibir a actividade de GSK-3. De acordo com a invenção, estes compostos são também utilizados em composições e métodos para a inibição da actividade de GSK-3 e métodos para o tratamento ou mitigação da gravidade de doenças ou condições associadas com GSK-3 em pacientes.

As doenças ou condições susceptíveis aos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, desordens neurológicas e neurodegenerativas, diabetes, desordens psiquiátricas, esclerose múltipla (EM), enfarte do miocárdio, reperfusão/isquemia, calvície e icto.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa os efeitos do tratamento com um composto de fórmula I em comparação com controlo de veículo, administrados 6 horas após o Modelo de Oclusão da Artéria Cerebral Média (MCAO), como uma diminuição no volume do enfarte total, volume do enfarte cortical, lesão isquémica do estriado e formação de edema. A Figura 2 representa a função neurológica de ratos, ao longo do tempo em que decorre a experiência, tratados com um composto de fórmula I em comparação com o grupo de controlo de veículo. 11

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um composto de fórmula I:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: W é azoto; R1 é seleccionado entre hidrogénio ou flúor; e

Ry é um grupo alifático Ci_4, em que o referido grupo alifático é uma cadeia de hidrocarboneto Ci-C4 linear ou ramificada que está completamente saturada ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, ou um hidrocarboneto C3-C4 monociclico que está completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromático, que possui um único ponto de fixação ao resto da molécula. 0 termo "alifático" ou "grupo alifático", quando aqui utilizado, significa uma cadeia de hidrocarboneto C1-C4 linear ou ramificada que está completamente saturada ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, ou um hidrocarboneto C3-C4 monociclico que está completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromático (também aqui referido como "carbociclo" ou "cicloalquilo") , que possui um único ponto de fixação ao resto da molécula. Por exemplo, os grupos alifáticos adequados incluem, mas não se lhes limitam, grupos alquilo, alcenilo, alcinilo lineares ou ramificados e seus híbridos tais como (cicloalquil)alquilo, (cicloalcenil)alquilo ou (cicloalquil)alcenilo.

Os termos "alquilo", "alcenilo" e "alcinilo", utilizados isoladamente ou como parte de uma porção maior, incluirão cadeias, tanto lineares como ramificadas, contendo um a quatro átomos de carbono e pelo menos dois átomos de carbono e uma ligação dupla no caso de alcenilo e pelo menos dois átomos de carbono e uma ligação tripla, no caso de alcinilo. 12

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Os compostos utilizados na presente invenção estão limitados àqueles que são quimicamente exequíveis e estáveis. Portanto, uma combinação de substituintes ou variáveis nos compostos descritos acima apenas é permissível se essa combinação resultar num composto estável ou quimicamente exequível. Um composto estável ou um composto quimicamente exequível é um composto em que a estrutura química não é substancialmente alterada quando mantido a uma temperatura de 40°C ou menos, na ausência de humidade ou outras condições quimicamente reactivas, durante pelo menos uma semana.

Será evidente para um perito na especialidade que certos compostos da presente invenção podem existir em formas tautoméricas, estando todas estas formas tautoméricas dos compostos dentro do escopo da invenção. A menos que de outro modo afirmado, as estruturas aqui representadas pretendem também incluir todas as formas estereoquímicas da estrutura; i.e., as confiqurações R e S para cada centro assimétrico. Portanto, os isómeros estereoquímicos individuais assim como misturas enantioméricas e diastereoméricas dos presentes compostos, estão dentro do escopo da invenção. A menos que de outro modo afirmado, as estruturas aqui representadas pretendem também incluir compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exemplo, os compostos possuindo as presentes estruturas excepto quanto à substituição de um hidrogénio por um deutério ou trítio, ou a substituição de um carbono por um carbono enriquecido 13C ou 14C, estão dentro do escopo da presente invenção.

Os compostos da presente invenção caiem dentro do género de compostos descritos na publicação PCT WO 02/22607. Contudo, os requerentes verificaram que os presentes compostos possuem uma potência surpreendente e inesperadamente aumentada na protecção de células neuronais contra a lesão isquémica e no tratamento de icto.

Um aspecto da presente invenção refere-se a um composto de fórmula I em que Ry é um grupo alifático C1-4 não substituído. Os grupo alifáticos preferidos de compostos de fórmula I são os grupos alquilo. Estes grupos alquilo são preferivelmente metilo, etilo, ciclopropilo, terc-butilo ou isopropilo. Os grupos alquilo da fórmula I mais preferidos são metilo, ciclopropilo e terc-butilo. 13

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De acordo com uma concretização, a presente invenção refere-se a um composto de fórmula I em que W é azoto.

De acordo com ainda outra concretização, a presente invenção refere-se a um composto de fórmula I em que R1 é hidrogénio.

De acordo com outra concretização, a presente invenção refere-se a um composto de fórmula I em que R1 é flúor.

Entenda-se que todas as combinações e sub-combinações de concretizações, conforme aqui descrito, estão dentro do escopo da presente invenção.

Os exemplos representativos de compostos de fórmula I são apresentados na Tabela 1 adiante.

Tabela 1. Compostos de Fórmula I

1-7 14

ΕΡ 1 532 145 /PT

Os compostos da presente invenção podem ser preparados conforme ilustrado pelos Esquemas I-II adiante e por métodos gerais conhecidos dos peritos na arte.

Reagentes e condições: (a) cloreto de oxalilo, dicloroetano, 70eC; (b) dimetilamina, pentano, TiCl4; (c) NH4Oac, HOAc, THF, refluxo; (d) P0C13, n-Pr3N, refluxo; (e) 160aC, líquido. u rsquema i anterior mostra um metoao gerar para a preparação de compostos da presente invenção. No passo (a), a arilamida 1 é tratada com cloreto de oxalilo para formar o isocianato de acilo 2. Como mostrado no passo (c), um isocianato de acilo 2 pode ser condensado com uma enamina 3 para proporcionar pirimidinona 4 (J. Org. Chem (1993), 58, 414-418; J. Med. Chem., (1992), 35, 1515-1520; J. Org. Chem., 91967, 32, 313-214). O intermediário 4 é tratado com POCI3 para formar o composto de cloro 5 que é então combinado com o derivado amino-indazole 6 para proporcionar um composto de fórmula I. Os métodos para a preparação dos derivados amino-indazole 6 são conhecidos na especialidade. Especificamente, a síntese destes derivados está estabelecida em WO 02/22607.

15 ΕΡ 1 532 145 /PT

Esquema II CF, CF, NH

NHa 7 8

O + RyÃ/C02E(

O

5 9

Reagentes e condições: (a) 1LíN(TMS)2, éter, THF, ii HC1; (b) NaOEt, EtOH, refluxo. 0 Esquema II anterior mostra um método alternativo para a preparação do intermediário pirimidinona 5, que pode ser utilizado na preparação de compostos de fórmula I como representado no Esquema I no passo (e) anterior. No passo (a), o arilnitrilo 7 é o intermediário benzamidina 8 é então tratado com o beta-cetoéster 9 para formar o composto de pirimidinona 5 que pode ser utilizado como descrito atrás.

Uma pessoa competente na matéria pode sintetizar outros compostos da presente invenção seguindo os ensinamentos da descrição utilizando reagentes que são facilmente sintetizados ou estão comercialmente disponíveis. A actividade de um composto utilizado na presente invenção como inibidor de GSK-3 pode ser avaliada in vitro, in vivo ou numa linha celular. Os ensaios in vitro incluem ensaios que determinam a inibição ou da actividade de fosforilação ou da actividade de ATPase da GSK-3 activada. Ensaios in vitro alternativos quantificam a capacidade do inibidor para se ligar a GSK-3. A ligação do inibidor pode ser medida por marcação radioactiva do inibidor antes da ligação, isolamento do complexo inibidor/GSK-3 e determinação da quantidade de marcador radioactivo ligado. Alternativamente, a ligação do inibidor pode ser determinada correndo uma experiência de competição onde são incubados novos inibidores com GSK-3 ligada a ligandos radioactivos conhecidos.

De acordo com outra concretização, a invenção proporciona uma composição compreendendo um composto da presente invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitáveis. A quantidade de composto nas composições da presente invenção é tal que seja eficaz para inibir de forma detectável uma proteína-quinase, particularmente a GSK-3, numa amostra 16 ΕΡ 1 532 145 /PT biológica ou num paciente. Preferivelmente, a composição da presente invenção é formulada para administração a um paciente com necessidade desta composição. Mais preferivelmente, a composição da presente invenção é formulada para administração oral a um paciente. 0 termo "paciente", quando aqui utilizado, significa um animal, preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente um ser humano. A expressão "transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitáveis", refere-se a um transportador, adjuvante ou veículo não tóxicos, que não destroem a actividade farmacológica do composto com o qual são formulados. Os transportadores, adjuvantes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nas composições da presente invenção incluem, mas não se lhes limitam, permutadores iónicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina sérica humana, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicéridos parciais de ácidos gordos vegetais saturados, água, sais ou electrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de blocos de polietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e lanolina. A expressão "inibir de forma detectável", quando aqui utilizada, significa uma alteração mensurável na actividade de GSK-3 entre uma amostra compreendendo a referida composição e quinase GSK-3 e uma amostra equivalente compreendendo quinase GSK-3 na ausência da referida composição.

Um "sal farmaceuticamente aceitável" significa qualquer sal, éster, sal de um éster ou outro derivado, não tóxicos, de um composto da presente invenção, que, por administração a um beneficiário, é capaz de proporcionar, seja directa ou indirectamente, um composto da presente invenção ou um seu metabolito ou resíduo activo como inibidor. 17

ΕΡ 1 532 145 /PT

Quando aqui utilizada, a expressão "seu metabolito ou resíduo activo como inibidor", significa um metabolito de um composto da presente invenção, ou um seu resíduo, que é também um inibidor da quinase GSK-3.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção incluem os que são derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplos de sais de ácidos adequados incluem acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formato, fumarato, gluco-heptanoato, glicerofosfato, glicolato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2-hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, tosilato e undecanoato. Outros ácidos, tais como o oxálico, embora eles próprios não farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregues na preparação de sais úteis como intermediários para obter os compostos da invenção e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.

Os sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metais alcalinos (e.g., sódio e potássio), metais alcalino-terrosos (e.g., magnésio), amónio e N+(alquilo Cl-4)4. A presente invenção abrange também a quaternização de quaisquer grupos contendo azoto básico dos compostos aqui revelados. Produtos solúveis ou dispersáveis em água ou em óleo podem ser obtidos através desta quaternização.

As composições da presente invenção podem ser administradas oralmente, parentericamente, por inalação de pulverização, topicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou por via de um reservatório implantado. 0 termo "parentérico", quando aqui utilizado, inclui técnicas de injecção ou infusão subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intra-articulares, intra- sinoviais , intrasternais, intratecais, intra-hepáticas, 18 ΕΡ 1 532 145 /PT intralesionais e intracranianas. Preferivelmente, as composições são administradas oralmente, intraperitonealmente ou intravenosamente. As formas injectáveis estéreis das composições da presente invenção podem ser suspensões aquosas ou oleaginosas. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na especialidade utilizando agentes de dispersão ou molhantes e agentes de suspensão, adequados. A preparação injectável estéril pode também ser uma solução ou suspensão injectável estéril num diluente ou solvente não tóxico, parentericamente aceitável, por exemplo, uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão a água, a solução de Ringer e a solução isotónica de cloreto de sódio. Em adição, são convencionalmente empregues óleos estéreis, fixos, como meio solvente ou de suspensão.

Para este fim, pode ser empregue qualquer óleo brando fixo incluindo mono- ou di-glicéridos sintéticos. Ácidos gordos, tais como ácido oleico e seus derivados glicéridos, são úteis na preparação de injectáveis, assim como óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como azeite ou óleo de rícino, especialmente nas suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas podem também conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como carboximetilcelulose ou agentes de dispersão similares que são vulgarmente utilizados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensioactivos vulgarmente utilizados, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsionantes ou promotores de biodisponibilidade que são vulgarmente utilizados no fabrico de formas de dosagem sólidas, líquidas, ou outras, farmaceuticamente aceitáveis, podem também ser utilizadas para fins de formulação.

As composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser oralmente administradas em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não se lhes limitando, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de comprimidos para utilização oral, os transportadores vulgarmente utilizados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, são também tipicamente adicionados. Para 19 ΕΡ 1 532 145 /PT administração oral na forma de cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando são necessárias suspensões aquosas para utilização oral, o ingrediente activo é combinado com agentes emulsionantes e de suspensão. Se desejado, podem também ser adicionados certos agentes edulcorantes, aromatizantes ou corantes.

Alternativamente, as composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser administradas na forma de supositórios para administração rectal. Estes podem ser preparados misturando o agente com um excipiente não irritante adequado que é sólido à temperatura ambiente mas líquido à temperatura rectal e portanto irá derreter no recto para libertar o fármaco. Estes materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelha e polietilenoglicóis.

As composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem também ser administradas topicamente, especialmente quando o alvo do tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis por aplicação tópica, incluindo doenças dos olhos, da pele ou do tracto intestinal inferior. As formulações tópicas adequadas são facilmente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos. A aplicação tópica para o tracto intestinal inferior pode ser efectuada numa formulação de supositório rectal (veja-se atrás) ou numa formulação de enema adequada. Podem também ser utilizados pensos transdérmicos tópicos.

Para aplicações tópicas, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas num unguento adequado contendo o componente activo suspenso ou dissolvido num ou mais transportadores. Os transportadores para administração tópica dos compostos da presente invenção incluem, mas não se lhes limitam, óleo mineral, vaselina líquida, vaselina branca, propilenoglicol, polioxietileno, polioxipropileno composto, cera emulsionante e água. Alternativamente, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas numa loção ou creme adequados contendo os componentes activos suspensos ou dissolvidos num ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Os transportadores adequados incluem, mas não se lhes limitam, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, 20 ΕΡ 1 532 145 /PT polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.

Para utilização oftálmica, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas na forma de suspensões micronizadas em solução salina isotónica, estéril, com pH ajustado, ou, preferivelmente, na forma de soluções em solução salina isotónica, estéril, com pH ajustado, com ou sem um conservante tal como cloreto de benzilalcónio. Alternativamente, para utilizações oftálmicas, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas num unguento tal como vaselina.

As composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem também ser administradas por aerossol ou inalação nasais. Estas composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas na especialidade da formulação farmacêutica e podem ser preparadas na forma de soluções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes convencionais.

Mais preferivelmente, as composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção são formuladas para administração oral. A quantidade dos compostos da presente invenção que pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma composição numa única forma de dosagem variarão dependendo do hospedeiro tratado, do modo particular de administração. Preferivelmente, as composições deverão ser formuladas de modo a que possa ser administrada uma dosagem entre 0,01-100 mg/kg de peso corporal/dia do inibidor, a um paciente que receba estas composições.

Deve-se entender que uma dosagem e regime de tratamento específicos para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de factores, incluindo a actividade do composto específico empregue, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, e da opinião do médico assistente e da 21 ΕΡ 1 532 145 /PT gravidade da doença particular que está a ser tratada. A quantidade de um composto da presente invenção na composição dependerá também do composto particular na composição.

Dependendo da condição particular, ou doença, a tratar ou prevenir, podem também estar presentes nas composições da presente invenção agentes terapêuticos adicionais, que são normalmente administrados para tratar ou prevenir essa condição.

Por exemplo, factores neurotróficos ou outros agentes para o tratamento de desordens neurológicas ou neurodegenerativas, podem ser combinados com os compostos da presente invenção para tratar desordens neurológicas e neurodegenerativas. Os exemplos de factores neurotróficos conhecidos incluem, mas não se lhes limitam, inibidores da acetilcolinesterase, inibidores de MAO, interferões, anticonvulsivos, bloqueadores de canais iónicos, riluzole e agentes anti-parkinsonianos.

Os exemplos de tratamentos conhecidos para icto incluem Activase®, um activador do plasminogénio tissular recombinante, ou geneticamente manipulado, (rt-PA), heparina, antagonistas de glutamato, antagonistas de cálcio, antagonistas de opiatos, agonistas de GABA e antioxidantes.

Outros exemplos de agentes dos compostos da presente invenção que podem também ser combinados incluem, sem limitação, agentes antidepressivos, tais como Zoloft®, Prozac®, Paxil® e Buspar®; agentes anti-inflamatórios tais como corticosteróides, bloqueadores de TNF, IL-1 RA, azatioprina, ciclofosfamida e sulfasalazina; agentes imunomoduladores e imunossupressores tais como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, micofenolato mofetil, interferões, corticosteróides, ciclofofamida, azatioprina e sulfasalazina; factores neurotróficos tais como inibidores de acetilcolinesterase, inibidores de MAO, interferões, anticonvulsivos, bloqueadores dos canais iónicos, riluzole e agentes anti-parkinsonianos; agentes para o tratamento de doença cardiovascular tais como beta-bloqueadores, inibidores de ACE, diuréticos, nitratos, bloqueadores dos canais do cálcio e estatinas; agentes para o tratamento da diabetes tais 22

ΕΡ 1 532 145 /PT como insulina, análogos da insulina, inibidores da alfa-glucosidase, biguanidas e sensibilizadores à insulina; e agentes para o tratamento de desordens de imunodeficiência tais como gama-globulina. A quantidade de agente terapêutico adicional presente nas composições da presente invenção não será superior à quantidade que seria normalmente administrada numa composição compreendendo esse agente terapêutico como único agente activo. Preferivelmente, a quantidade de agente terapêutico adicional nas composições presentemente reveladas variará de cerca de 50% a 100% da quantidade normalmente presente numa composição compreendendo esse agente como único agente terapeuticamente activo.

De acordo com outra concretização, a presente invenção refere-se à administração a um paciente de um agente terapêutico adicional seleccionado entre um tratamento para Doença de Alzheimer (DA), um tratamento para a Doença de Parkinson, um agente para o tratamento de Esclerose Múltipla (EM), um tratamento para asma, um agente anti-inflamatório, um agente imunomodulador ou imunossupressor, um factor neurotrófico, um agente para o tratamento de icto, um agente para o tratamento de doença cardiovascular, um antidepressivo, um agente anti-psicótico ou um agente para o tratamento da diabetes, em que: o referido agente terapêutico adicional é apropriado para a doença a tratar; e o referido agente terapêutico adicional é administrado conjuntamente com a referida composição na forma de uma única forma de dosagem ou separadamente da referida composição na como parte de uma forma de dosagem múltipla.

De acordo com outra concretização, a invenção refere-se a um método de inibição da actividade da quinase GSK-3 numa amostra biológica compreendendo o passo de colocar em contacto a referida amostra biológica com um composto da presente invenção, ou uma composição compreendendo o referido composto. A expressão "amostra biológica", quando aqui utilizada, inclui, sem limitação, culturas celulares ou seus extractos; material de biópsia obtido de um mamífero ou seus extractos; e 23 ΕΡ 1 532 145 /PT sangue, saliva, urina, fezes, sémen, lágrimas ou outros fluidos corporais ou seus extractos. A inibição da actividade da quinase GSK-3 numa amostra biológica é útil para uma variedade de fins que são conhecidos de um perito na especialidade. Os exemplos destes fins incluem, mas não se lhes limitam, transfusão de sangue, transplantação de órgãos, armazenagem de espécimes biológicos e ensaios biológicos.

De acordo com outra concretização, a invenção refere-se a um método de inibição da actividade da quinase GSK-3 num paciente compreendendo o passo de administração ao referido paciente de um composto da presente invenção, ou de uma composição compreendendo o referido composto.

De acordo com outra concretização, a invenção proporciona um método para o tratamento ou mitigação da gravidade de uma doença ou condição mediadas por GSK-3 num paciente compreendendo o passo de administração ao referido paciente de uma composição de acordo com a presente invenção. A expressão "doença mediada por GSK-3", quando aqui utilizada, significa qualquer doença ou outra condição prejudicial ou doença em que se sabe que a GSK-3 desempenha um papel. Estas doenças ou condições incluem, sem limitação, doença auto-imune, uma doença inflamatória, uma desordem metabólica, uma desordem psiquiátrica, diabetes, uma desordem angiogénica, taupatia, uma desordem neurológica ou neurodegenerativa, uma lesão na medula espinal, glaucoma, calvície ou uma doença cardiovascular.

De acordo com outra concretização, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento ou mitigação da gravidade de uma doença, desordem ou condição seleccionadas entre uma doença auto-imune, uma doença inflamatória, uma desordem metabólica, uma desordem psiquiátrica, diabetes, uma desordem angiogénica, taupatia, uma desordem neurológica ou neurodegenerativa, uma lesão na medula espinal, glaucoma, calvície ou uma doença cardiovascular, num paciente disso necessitado, compreendendo a administração ao referido 24 ΕΡ 1 532 145 /PT paciente de um composto da presente invenção ou de uma sua composição.

De acordo com outra concretização, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento ou mitigação da gravidade de uma doença ou condição seleccionadas entre alergia, asma, diabetes, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, demência associada à sida, esclerose lateral amiotrófica (ELA, doença de Lou Gehrig), esclerose múltipla (EM), uma lesão devida a traumatismo na cabeça, esguizofrenia, ansiedade, desordem bipolar, taupatia, uma lesão na medula espinal ou em nervos periféricos, enfarte do miocárdio, hipertrofia cardiomiocitica, glaucoma, desordem de défice de atenção (DDA), depressão, uma desordem do sono, reperfusão/isquemia, icto, uma desordem angiogénica, ou calvície, em que o referido método compreende a administração a um paciente disso necessitado de um composto da presente invenção ou de uma sua composição.

De acordo com uma concretização preferida, o método da presente invenção refere-se ao tratamento ou mitigação da gravidade do icto.

De acordo com outra concretização preferida, o método da presente invenção refere-se ao tratamento ou mitigação da gravidade de uma desordem neurodegenerativa ou neurológica.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de diminuição da motilidade do esperma num paciente do sexo masculino compreendendo a administração ao referido paciente de um composto da presente invenção ou de uma sua composição.

Numa concretização alternativa, os métodos da presente invenção que utilizam composições que não contêm um agente terapêutico adicional, compreendem o passo adicional de administração separada ao referido paciente de um agente terapêutico adicional. Quando estes agentes terapêuticos adicionais são administrados separadamente, podem ser administrados ao paciente antes, sequencialmente, ou após, a administração das composições da presente invenção. 25

ΕΡ 1 532 145 /PT

Para que a invenção aqui descrita possa ser mais bem entendida, apresentam-se os seguintes exemplos. Deve entender-se que estes exemplos são para fins ilustrativos apenas e não são construídos como limitantes da presente invenção de nenhuma maneira.

EXEMPLOS

Quando "Método A" é aqui como utilizado, se segue: o Método de HPLC designado Coluna: C18, 3 um, 2,1 X 5 0 mm, "Lighting" de Jones

Chromatography.

Gradiente: 100% de água (contendo 1% de acetonitrilo, 0,1% de TFA) até 100% de acetonitrilo (contendo 0,1% de TFA) ao longo de 4,0 minutos, manutenção a 100% de acetonitrilo durante 1,4 minutos e retorno às condições iniciais.

Tempo total de operação: 7,0 minutos.

Caudal: 0,8 mL/minuto.

Quando aqui utilizado, o termo "Rf" refere-se ao tempo de retenção, em minutos, obtido para o composto utilizando o designado método de HPLC. Os números dos compostos nos Exemplos adiante correspondem aos números dos compostos citados na Tabela 1, supra. Os três compostos apresentados adiante nos Exemplos 3, 9 e 15, não são exemplos da presente invenção.

Exemplo 1 6-Metil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona:

Tratou-se uma mistura de 2-trifluorometilbenzamidina (2,13 g, 4 mmol) e etóxido de sódio (0,83 g, 12 mmol) em etanol (20 mL) , com acetoacetato de metilo (0,44 mL, 4 mmol) e aqueceu-se a durante 24 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional, concentrou-se, diluiu-se com água e acidificou-se com ácido clorídrico 2 N. Extractou-se a solução resultante com acetato de etilo, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A purificação por cromatografia flash [S1O2, metanol:diclorometano (3:97)] proporcionou o composto do título (0-51 g, rendimento de 50%) na forma de um sólido amarelo; 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de) δ 12,7 (s lg, 1H), 7,9 (m, 26

ΕΡ 1 532 145 /PT 1Η), 7,8 (m, 2 H), 7,7 (m, 1H), 6,3 (s, 1H), 2,21 (s, 3H) ppm; MS (FIA) 255,0 (M+H); Rt (Método A) 2,578 minutos.

Exemplo 2 4-Cloro-6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina:

Tratou-se uma solução de 6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona (10,7 g, 41,9 mmol) em oxicloreto de fósforo (39 mL, 419 mmol), com tri-n-propilamina (16 mL, 83,9 mmol) e manteve-se em refluxo a 110-120°C durante 1 hora. Evaporou-se o solvente, formando um azeótropo três vezes com tolueno e depois secou-se in vacuo. Retomou-se o resíduo em acetato de etilo, lavou-se sequencialmente com hidróxido de sódio 1 N, água e salmoura, depois secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A purificação por cromatografia flash [SiCh, acetato de etilo:hexanos (1:9)] proporcionou o composto do título (9,61 g, rendimento de 84%) na forma de um óleo cor de laranja. 1H-RMN (CDC13, 500 MHz) δ 2,63 (3H, s), 7,26 (s, 1H), 7-61 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,67 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,76 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,82 (d, J=7,8Hz, 1H) ppm; MS (FIA) 273,0 (M+H); Rt (Método A) 3,499 min.

Exemplo 3 (5-Fluoro-lH-indazol-3-il)-[6-metil-2-(2-trifluorometilfenil )pirimidin-4-il ] amina: Aqueceu-se uma mistura de 4-cloro-6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina (0,10 g, 0,37 mmol) e 5-f luoro-lií-indazol-3-ilamina (0,072 g, 0,48 mmol) em bruto a 160-170°C durante 8 horas. Arrefeceu-se o resíduo resultante à temperatura ambiente e depois dissolveu-se em N-metilpirrolidinona (2 mL) . Verteu-se esta mistura sobre água (20 mL) e adicionou-se bicarbonato de sódio (5 mL) e filtrou-se a mistura resultante, lavando com água. A purificação por HPLC preparativa proporcionou o composto do título (0,081 g, rendimento de 43%) na forma de um sólido bronzeado. ^-RMN (500 MHz, DMSO-de) δ 12,8 (s lg, 1H) , 10,6 (s lg, 1H) , 7,86 (d, J=8,0Hz, 1H) , 7,77 (m, 4H) , 7,62 (s lg, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,29 (m, 1H) , 2,44 (s, 3H) ppm; LC-MS 388,05 (M+H); Rt (Método A) 2,900 minutos.

Exemplo 4 6-terc-Butil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona: Aqueceu-se ao refluxo durante 16 horas uma mistura de 2-trifluoremetilbenzamidina (1,12 g, 5 mmol), etóxido de sódio 27

ΕΡ 1 532 145 /PT (1,02 g, 15 mmol) e éster metílico do ácido 4,4-dimetil-3-oxopentanóico (0,80 mL, 5 mmol) em etanol (50 mL) . Arrefeceu-se a mistura reaccional, concentrou-se, diluiu-se com água e acidificou-se com ácido clorídrico 2 N.

Extractou-se esta solução com acetato de etilo, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A purificação por cromatografia flash [S1O2, metanol:diclorometano (2:98)] proporcionou o composto do título (0,48 g, rendimento de 32%) na forma de um sólido amarelo; ^-RMN (500 MHz, DMSO-de) δ 12,8 (s lg, 1H) , 7,89 (d, J=7,5Hz, 1H) , 7,78 (m, 2H) , 7,71 (d, J=7, 4Hz, 1H), 6,24 (s, 1H) , 1,20 (s, 9H) ppm; LC-MS 297, 03 (M+H); Rt (Método A) 3,30 minutos.

Exemplo 5 6-terc-Butil-6-cloro-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina:

Tratou-se uma solução de 6-te_rc-butil-2-(2- trif luorometilf enil)-3i7-pirimidin-4-ona (0,47 g, 1,59 mmol) em oxicloreto fosforoso (1,65 mL, 15,9 mmol) com tri-n- propilamina (0,61 mL, 3,17 mmol) e aqueceu-se a 110-120°C durante 1 hora. Removeu-se o solvente por evaporação e depois formou-se um azeótropo três vezes com tolueno. Retomou-se o resíduo em acetato de etilo, lavou-se sequencialmente com hidróxido de sódio 1 N, água e salmoura, depois secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A purificação por cromatografia flash [S1O2, acetato de etilo:hexanos (1:9)] proporcionou o composto do título (0,33 g, rendimento de 66%) na forma de um óleo amarelo. 1H-RMN (CDCI3, 500 MHz) δ 1,31 (9H, s), 7,25 (s, 1H), 7,51 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,58 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,74 (t, J=8,5Hz, 2H) ppm; MS (FIA) 314,9 (M+H); Rt (Método A) 4,156 minutos.

Exemplo 6 [6-terc-Butil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(lfí-pirazolo [3,4-b]piridin-3-il) amina (1-3): Aqueceu-se uma mistura de 4-cloro-6-te_rc-but il-2-(2- trifluorometilfenil)pirimidina (0,10 g, 0,32 mmol) e lií-pirazolo [3,4-b] piridin-3-ilamina (0, 064 g, 0,48 mmol) em bruto a 160-170°C durante 16 horas. Arrefeceu-se o resíduo resultante, dissolveu-se em N-metilpirrolidinona (2 mL), depois verteu-se sobre água (20 mL) e bicarbonato de sódio (5 mL) e extractou-se duas vezes com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas quatro vezes com 28

ΕΡ 1 532 145 /PT água, uma vez com salmoura, depois secaram-se sobre sulfato de sódio e concentraram-se. Purificou-se o produto bruto por HPLC preparativa para proporcionar o composto do titulo (0,007 g, rendimento de 4%) na forma de um sólido amarelo. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de) δ 13,2 (s lg, 1H) , 10,6 (s lg, 1H) , 8,49 (m, 2H), 7,84 (d, J=7,8Hz, 2H) , 7,76 (m, 2H) , 7,68 (m, 1H) , 7,12 (m, 1H), 1,32 (s, 9H) ppm; LC-MS 413,08 (M+H); Rt (Método A) 3,112 minutos.

Exemplo 7 6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona: • (1-Ciclopropilvinil)dimetilamina:

Adicionou-se a uma solução de ciclopropilmetilcetona (19,8 mL, 200 mmol) em pentano (600 mL) a 0°C sob azoto, dimetilamina/tetra-hidrofurano (2M, 500 mL, 1000 mmol), depois adicionou-se uma solução de cloreto de titânio (IV) (12,1 mL, 110 mmol) em pentano (60 mL) gota a gota. Agitou-se a mistura reaccional 0,5 hora a 0°C e depois durante 5 horas à temperatura ambiente. Filtrou-se a mistura reaccional através de Celite, lavando com pentano e éter, concentrou-se in vacuo com uma temperatura de banho de 15-20°C e depois armazenou-se durante a noite na forma de um óleo cor de laranja a -4°C. • Isocianato de 2-trifluorometilbenzoílo:

Tratou-se uma solução de 2-trifluorometilbenzamida (34,9 g, 185 mmol) em 1,2-dicloroetano (600 mL), à temperatura ambiente sob azoto, com cloreto de oxalilo (20,2 mL, 230 mmol) em gotas rápidas e agitou-se a mistura reaccional a 70-80°C durante a noite. Removeu-se o solvente por evaporação, e formou-se um azeótropo do resíduo com tolueno, duas vezes. • 6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona: A uma solução de (1-ciclopropilvinil)dimetilamina em tetra-hidrofurano (400 mL) , a 0°C sob azoto, adicionou-se uma solução de isocianato de 2-trifluorometilbenzoílo em tetra-hidrofurano (50 mL), gota a gota. Agitou-se a mistura reaccional durante 0,5 hora, e depois adicionou-se acetato de amónio (78 g, 1000 mmol) e ácido acético (400 mL) . Aqueceu-se a mistura reaccional em refluxo durante 3 horas com remoção contínua de tetra-hidrofurano, depois arrefeceu-se e verteu-se sobre água (1,2 L) . Recolheu-se o precipitado resultante por 29

ΕΡ 1 532 145 /PT filtração, lavando com água e éter para proporcionar 6-ciclopropil-2- (2-trif luorometilf enil) -3fí-pirimidin-4-ona (28,79 g, rendimento de 56%) na forma de um sólido branco que é uma mistura do composto do titulo e (2-trifluorometilbenzoil)ureia (91:9 por HPLC). 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de) δ 12,7 (s lg, 1H) , 7,87 (d, J=7,6Hz, 1H) , 7,79 (m, 2H), 7,73 (d, J=7,5Hz, 1H) , 6,32 (s, 1H) , 1,93 (m, 1H) , 0,90 (m, 4H) , [ureia: 10,8 (s lg, 1H) , 7,45 (s lg, 1H) ] ppm; LC-MS 280,96 (M+H); Rt (Método A) 2,961 minutos (composto do titulo), 2,313 minutos (impureza de ureia).

Exemplo 8 4-Cloro-6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimi-dina: Aqueceu-se 6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H- pirimidin-4-ona (12,0 g, 42,8 mmol) em oxicloreto fosforoso (40 mL, 428 mmol) a 75-80°C durante 1 hora. Removeu-se o solvente por evaporação e formou-se um azeótropo três vezes com tolueno. Recolheu-se o resíduo a 0°C, retomou-se em acetato de etilo, tratou-se com aparas de gelo e água. Lavou-se então a mistura sequencialmente com bicarbonato de sódio, água e salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A purificação por cromatografia flash (S1O2, 5:95 acetato de etilo:hexanos (5:95)] proporcionou o composto do título (9,71 g, rendimento de 76%) na forma de um óleo incolor. 1H-RMN (CDC13, 500 MHz) δ 1,12 (m, 2H) , 1,30 (m, 2H), 2.02 (m, 1H), 7,24 (s, 1H) , 7,56 (t, J=7,6Hz, 1H) , 7,64 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,79 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 299,1/300,9 (M+H); Rt (Método A) 3,882 minutos.

Exemplo 9 [6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(ÍH—indazol—3—il)amina: Aqueceu-se uma mistura de 4-cloro-6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina (0,08 g, 0,27 mmol) e lfí-indazol-3-ilamina (0,036 g, 0,41 mmol) em bruto a 160-170°C durante 6 horas. Arrefeceu-se o resíduo e dissolveu-se em N-metilpirrolidinona (2 mL) , verteu-se sobre água (30 mL) e bicarbonato de sódio (5 mL) e depois filtrou-se, lavando com água e éter. Combinaram-se o precipitado recolhido e a lavagem com éter e concentraram-se. A purificação por cromatografia flash [S1O2, metanol:diclorometano (2:98)] proporcionou o composto do título (0,017 g, rendimento de 15%) na forma de um sólido amarelo pálido. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de) δ 12,6 (s lg, 1H) , 10.2 (s lg, 1H), 8,00 (d, J=8,lHz, 2H), 7,81 (d, J=7,9Hz, 1H), 30

ΕΡ 1 532 145 /PT \—1 (m, 3H), 7,65 (t, J=7,3Hz, 1H) , 7,45 (d, C-i 11 co 4Hz, 35 \—1 7,36 (t, J=7,5Hz , 1H), 7,06 (t, J=7,5Hz , 1H) , 2,04 (m, 35 \—1 1,01 (m, (Método A) 2H), 0,96 (m, 2H) ppm; LC-MS 396 3,122 minutos. ,10 (M+H); Rt

Exemplo 10 [6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina (I—1): Aqueceu-se a 130°C durante 12 horas uma mistura de 4-cloro-6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina (7,00 g, 23,4 mmol, preparada como descrito atrás no exemplo 8) e lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamina (9,43 g, 70,3 mmol) em N-metilpirrolidinona (50 mL) . Arrefeceu-se o resíduo, dissolveu-se em N-metilpirrolidinona (2 mL) , verteu-se sobre água (500 mL) e bicarbonato de sódio (15 mL) depois filtrou-se, lavando com água. A purificação por cromatografia flash [S1O2, acetato de etilo:hexanos (35:65)] proporcionou o composto do título (5,25 g, rendimento de 57%) na forma de um sólido branco. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-dg) δ 13,1 (s lg, 1H) , 10,5 (s lg, 1H), 8,50 (m, 2H), 7,82 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,73 (m, 3H), 7,66 (t, J=7,7Hz, 1H) , 7,12 (m, 1H), 2,07 (m, 1H) , 1,02 (m, 2H) , 0,97 (m, 2H) ppm; LC-MS 397,22 (M+H) ; Rt (Método A) 3,412 minutos.

Exemplo 11

Sal cloridrato de [6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil )pirimidin-4-il] (lJí-pirazolo [3, 4-b] piridin-3-il) amina: o sal de HC1 foi preparado por dissolução do composto 1-1 (8,42 g, 21,4 mmol) em ácido clorídrico 6N e liofilização para proporcionar o composto do título (9,242 g, 99%) na forma de um sólido amarelo. ^-RMN (500 MHz, DMSO-dg) δ 13,3 (s lg, 1H), 10,9 (s lg, 1H), 8,53 (dd, J=4,4, 1,4Hz, 1H), 8,48 (lg d, J=7, 4Hz, 1H) , 7,87 (d, J=7,8Hz, 1H) , 7,79 (m, 2H) , 7,72 (t, J=6,8Hz, 2H) , 7,15 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 1,07 (m, 4H) ppm; MS (FIA) 397,3 (M+H), 395,2 (M-H), 431,2 (M-H+HC1); Rt (Método A) 2,798 minutos.

Exemplo 12 6-But-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona: Preparou-se 6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H- pirimidin-4-ona como descrito atrás no Exemplo 1, excepto utilizando éster etílico do ácido 3-oxo-hept-6-enóico. A reacção proporcionou o composto do título (2,545 g, rendimento 31

ΕΡ 1 532 145 /PT de 49%) na forma de um sólido de cor creme. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 12,8 (s, 1H), 7,88 (d, 1H), 7,79 (t, 1H), 7,75 (t, 1H), 7,68 (d, 1H), 6,22 (s, 1H), 5,80 (m, 1H), 5,03 (dd, 1H), 4,98 (dd, 1H), 2,56 (t, 2H) , 2,36 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 295,1(M+H); Rt (Método A) 3,160 minutos.

Exemplo 13 4-But-3-enil-6-cloro-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina: O composto do título foi preparado como descrito no Exemplo 2, excepto utilizando 6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona para proporcionar um óleo amarelo (0,49 g, rendimento de 99%). 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,72 (d, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,57 (t, 1H), 7,51 (t, 1H), 7,13 (s, 1H) , 5,77

(m, 1H), 4,98 (m, 2H) , 2,84 (t, 2H) , 2,49 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 313,0(M+H); Rt (Método A) 4,220 minutos.

Exemplo 14 [6-But-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina (1-7): O composto do título foi preparado como descrito no exemplo 6, excepto utilizando 4-but-3-enil-6-cloro-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina para proporcionar um sólido de cor creme (2,712 g, rendimento de 62%). ^-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 13,1 (s, 1H) , 10,56 (s, 1H), 8,50 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,84 (d, 1H), 7,76 (t, 1H), 7,69 (m, 3H), 7,13 (m, 1H) , 5,86 (m, 1H) , 5,06 (dd, 1H), 4,98 (dd, 1H), 2,76 (t, 2H) , 2,46 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 411,2(M+H); Rt (Método A) 3,019 minutos.

Exemplo 15 [6-(3-Morfolin-4-ilpropil)-2-(2-trifluorometilfenil)piri-midin-4-il] (lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il) amina: Uma solução de [6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il](1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina (0,10 g, 0,25 mmol) em metanol (5 mL) e tetra-hidrofurano (5 mL) a -78°C foi borbulhada com ozono durante 5 minutos. A esta mistura adicionou-se morfolina (0,05 mL, 0,56 mmol) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (0,39 g, 1,85 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 24 horas, quando se adicionaram mais morfolina (0,10 mL, 1,28 mmol) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (0,39 g, 1,85 mmol) e depois continuou-se a agitação mais 2 horas. Extingui-se a reacção com bicarbonato de sódio e evaporou-se. A purificação por 32

ΕΡ 1 532 145 /PT cromatografia flash (Si02, eluída com metanol:diclorometano 1:9), seguida de HPLC preparativa proporcionaram o composto do titulo na forma de um liofilato amarelo brilhante (0,068 g, rendimento de 38%). 484, 3 (M+H) . 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 13,2 (S, 1H) , 10 , 7 (s, 1H), 9,60 (s lg, 1H) , 8,52 (m, 1H) , 8, 47 (d, 1H) , 7, 86 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H) , 7, 14 (m, 1H) , 3,9 7 (m lg, 2H), 3, ,61 (m lg, 2H) , 3,44 (m lg, 2H) , 00 \—1 00 (m ig, 2H) , 3, 05 (m lg, 2H), 2,78 (t, 2H), 2,08 (m, 2H) ppm.

Exemplo 16

Prepararam-se os seguintes compostos por métodos substancialmente similares aos aqui descritos nos Exemplos 1-15, nos Esquemas Gerais, e por métodos conhecidos das pessoas competentes na matéria.

[6-(3-Piperidin-l-ilpropil)-2-(2-trifluorametilfenil)pirimidin-4-il] (lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il) amina (1-9): 482,2(M+H). 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 13,2 (s, 1H), 10,7 (S, 1H) , 9,04 (s lg, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H) , 3,42 (m, 2H) , 3,10 (m, 2H) , 2,85 (m, 2H), 2,77 (t, 2H) , 2,09 (m, 2H), 1,79 (m, 2H), 1,61 (m, 3H), 1,35 (m, 1H) ppm. (6-(3-Dietilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il](lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina (1-10): 470 (M+H). 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H) , 9,07 (s, 1H), 8,50 (m, 1H), 7,85 (m, 1H) , 7,78 (d, 1H) , 7,76 (m, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,14 (m, 1H) , 3,11 (m, 6H) , 2,80 (t, 2H) , 2,05 (m, 2H), 1,15 (t, 6H) ppm.

[6-(3-(4-Metilpiperazin-l-il)propil)-2-(2-trifluorometil-fenil)pirimidin-4-il](lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina d- 11) : 497 ,2 (M+H), XH -RMN (500 MHz, DMSO- -d6) δ 13, .2 (s, 1H) , O \—1 7 (s, 1H :), 8,52 (m, 1H) , 8,47 (m, 2H) , 7,85 (d, 1H) , 7, 77 (m, 1H) , 7, 72 (m, 3H), 7, 14 (m, 1H), 3,0- 3,7 (lg, 10H) , 2, 83 (s, 3H) , 2, 77 (t, 2H), 2,05 (m, 2H) ppm.

[6-(3-Piperazin-l-ilpropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimi-din-4-il](lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina (1-12): 483,3 (M+H), 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 33

ΕΡ 1 532 145 /PT 9,06 (s lg, 2H), 8,52 (m, 1H) , 8,47 (d, 1H) , 7,85 (d, 1H) , 7.77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H) , 7,14 (m, 1H) , 3,34 (m lg, 8H) , 3,15 (m lg, 2H), 2,77 (t, 2H), 2,06 (m, 2H) ppm.

[6-(3-Dimetilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il](lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina (1-13): 442,1 (M+H), 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,40 (s lg, 1H), 8,52 (m, 1H) , 8,47 (d, 1H) , 7,85 (d, 1H) , 7.78 (m, 1H), 7,71 (m, 2H) , 7,14 (m, 1H) , 3,12 (m, 2H) , 2,77 (m, 8H), 2,06 (m, 2H) ppm. N,N-Dimetil-N'—{3—[6—(lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamino)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]propil}etano-l, 2-diamina (1-14): 485,3 (M+H). 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,7 (lg, 1H), 8,8 (s lg, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,48 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H) , 7,71 (m, 2H) 7,14 (m, 1H) , 3,32 (s, 4H) , 3,07 (m lg, 2H) , 2,84 (s, 6H) , 2,80 (m, 2H), 2,04 (m, 2H) ppm.

[6-(3-Metilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il](lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina (1-15): 428,1 (M+H). 1H-RMN (500 MHz, DMS0-d6) δ 13,2 (s, 1H) , 10,7 (s, 1H) , 8,51 (m, 1H), 8,48 (d, 1H), 8,37 (s lg, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H) , 2,97 (m, 2H) , 2,78 (t, 2H) , 2,55 (m, 3H), 2,01 (m, 2H) ppm. 2-{3-[6-(ÍH-Pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamino)-2-(2-trifluoro-metilfenil)pirimidinil]propilaminojetanol (1-16): 458,2 (M+H). 1H-RMN (500 MHz, DMS0-d6) δ CM 00 \—1 (s , 1H) , 10, 7 (s, 1H) , 8,52 (m, 1H) , 8,47 (m, 2H) , 7,85 (d, 1H ), 7,77 (m, 1H) , 7,69 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,62 (t, 2,04 (m, 2H) ppm. 2H) , 2, 99 (m, 4H) , 2, 78 (t, 2H) , [6-(3-(2-Morfolin-4-iletilamino)propil)-2-(2-trifluorometil-fenil)pirimidin-4-il](lH-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina d -17) : 527,2 (M+H). ΤΗ- -RMN (500 MHz, DMSO- -d6) δ 13,2 (s, 1H) , 10 , 7 (s , 1H) , 8, 76 (s lg, 2H) , 8,52 (m, 1H) , 8,48 (d, 1H) , 7, 85 (d , 1H) , 7, 78 (m, 1H) , 7, 70 (m, 2H) , 7, 14 (m, 1H) , 3,81 (s ig, 4H) , 3 ,1-3,3 (m lg, 8H) , 3,06 (t, 2H) , O 00 CM (t, 2H) , 2,05 (t, 2H) ppm. 34

ΕΡ 1 532 145 /PT

[6-{3-[Metil(2-morfolin-4-iletil)amino]propil}-2-(2-trifluoro-metilfenil)pirimidin-4-il](lH-pirazolo[3, 4-b]piridin-3-il)- amina (I- 18) : 541, 2 (M+H), 1H-RMN (500 MHz, DMS0-d6) δ 13,2 (s, 1H) , 10, 7 (s, 1H), 8,52 (m, 1H) , 8 ,47 (d, 1H), 7,85 (d, \—1 7, 78 (m, 1H) , 7,70 (m, 2H) , 7,14 (m, 1H), 3,73 (s lg, 4H) , 3,39 (m, 2H) , 3,21 (m, 2H), 2,8-3, 3 (m lg, 6H) 2,81 (s, 3H) , 2, 78 (t, 2H) , 2,09 (m, 2H) ppm.

Exemplo 17

Determinação de Kj para a Inibição de GSK-3

Os compostos foram rastreados quanto à sua capacidade para inibir a actividade de GSK-3p (AA 1-420) utilizando um sistema Standard de enzima acoplada (Fox et al. (1998) Protein

Sei. 7, 2249). As reacções foram realizadas numa solução contendo HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, NADH 300 μΜ, DTT 1 mM e DMSO a 1,5%. As concentrações finais de substrato no ensaio eram de 20 μΜ de ATP (Sigma Chemicals, St Louis, MO) e 300 μΜ de péptido (HSSPHQS (PO3H2) EDEEE, American Peptide, Sunnyvale, CA). As reacções foram realizadas a 30°C e 20 nM de 03Κ-3β. As concentrações finais dos componentes do sistema de enzima acoplada eram de 2,5 mM de fosfoenolpiruvato, 300 μΜ de NADH, 30 pg/ml de piruvato-quinase e 10 pg/ml de lactato-desidrogenase.

Preparou-se uma solução tampão de ensaio de reserva contendo todos os reagentes enumerados acima com a excepção de ATP e o composto de teste de interesse. A solução tampão de ensaio de reserva (175 μΐ) foi incubada numa placa de 96 poços com 5 μΐ do composto de teste de interesse em concentrações finais que se estendem de 0, 002 μΜ a 30 μΜ a 30°C durante 10 minutos. Tipicamente, conduziu-se uma titulação de 12 pontos preparando diluições em série (a partir de reservas de composto 10 mM) com DMSO dos compostos de teste nas placas-filhas. Iniciou-se a reacção pela adição de 20 μΐ de ATP (concentração final de 20 μΜ). As velocidades de reacção foram obtidas utilizando um leitor de placas Molecular Devices Spectramax (Sunnyvale, CA) ao longo de 10 minutos a 30°C. Os valores de K± foram determinados a partir dos resultados de velocidade em função da concentração de inibidor. 35

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Verificou-se que os compostos da presente invenção possuem um valor de Ki inferior a 100 nM utilizando o ensaio atrás descrito.

Exemplo 18

Determinação da Percentagem de Neuroprotecção

Quando aqui utilizada, a expressão "Percentagem de Protecção" representa a percentagem de células neuronais protegidas contra a lesão isquémica (OGD) e é calculada como: % de protecção = (OGD de teste)/(OGD normal)*100

Este protocolo descreve o procedimento utilizado para induzir isquemia experimental por anóxia-reoxigenação em células neuronais do hipocampo em cultura. O efeito neuroprotector dos compostos de teste é avaliado contra a lesão de células neuronais induzida por isquemia e morte celular.

Realizaram-se os seguintes passos antes do dia do ensaio: O LoG-Neurobasal [LoG-Neurobasal contém meio NoG-

Neurobasal (Invitrogen Corp, encomenda individualizada) mais glucose 0,5 mM, L-glutamina 0,5 mM e 0,25x Penicilina/ Estreptomicina] foi pré-equilibrado na câmara hipóxica durante a noite. O LoG-Neurobasal foi pré-equilibrado na incubadora normal (5% de CO2) durante a noite.

Na incubadora normal (5% de C02), Neurobasal/B27AO [Neurobasal/B27AO contém meio Neurobasal (Invitrogen Corp, número de Cat 21103-049) com 2x B27 menos suplemento AO (Invitrogen Corp., número de Cat 10889-038), L-glutamina 0,5 mM e 0,25x Penicilina/ Estreptomicina] foi pré-equilibrado durante a noite.

Realizaram-se os seguintes passos no dia do ensaio:

Removeu-se o meio LoG-Neurobasal da câmara hipóxica, e borbulhou-se o meio ligeiramente com N2 a 100% durante 30 minutos para desoxigenar completamente. 36

ΕΡ 1 532 145 /PT Ο meio de cultura Neurobasal/B27m [Neurobasal/B27m contém meio Neurobasal com 2x suplemento B27 (Invitrogen Corp., número de Cat 17504-044) e L-glutamina 0,5 mM] foi aspirado das células em cada placa de 12 poços utilizando a bomba de vácuo com uma pipeta de pasteur de vidro, estéril, ligada.

Lavou-se a placa uma vez com 2 ml de BSSo isento de glucose (pH 7,4), preparado a partir do seguinte: NaCl 143,6 mM, KC1 5,4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgS04 0, 8 mM, NaH2P04 1 mM, NaHCCL 26,2 mM, vermelho de fenol a 10 mg/1 e 0,25x P/S.

Os neurónios (10-11 dias desde a cultura inicial) foram novamente colocados em LoG-Neurobasal desoxigenado (1 ml por poço para cada poço de uma placa de 12 poços) . Estas células neuronais foram preparadas de acordo com Park LC, Calingasan NY, Uchida K, Zhang H, Gibson GE. (2000) "Metabolic impairment elicits brain cell type-selective changes in oxidative stress and cell death in culture. "J Neurochem 74(1):114-124.

Os compostos de teste foram adicionados directamente a cada poço (3 concentrações do composto mais controlo positivo, cada um em triplicado). Os compostos foram dissolvidos em DMSO a 100%, onde a concentração de DMSO nunca excedeu 0,5%, e de depois colocaram-se as placas na Câmara Hipóxica durante 5 horas com as tampas das placas ligeiramente abertas.

Para controlos de normoxia, adicionou-se meio LoG-Neurobasal normóxico pré-equilibrado a cada poço e substituiu-se a placa na incubadora de cultura normal durante 4 horas.

Após 4 horas de hipóxia, aspiraram-se cuidadosamente os meios existentes e adicionaram-se 2 mL de novo Neurobasal/B27AO oxigenado (pré-equilibrado) a cada poço. Conseguiu-se um meio reoxigenado colocando o meio durante a noite na incubadora de cultura (5% de C02/95% de 02) antes da utilização.

Os mesmos compostos de teste com as mesmas concentrações foram adicionados aos poços correspondentes e as placas foram colocadas na incubadora de cultura celular (5% de C02/95% de 02) e reoxigenadas durante 20-24 horas. Após reoxigenação 37 ΕΡ 1 532 145 /PT durante 20-24 horas, contou-se o número de neurónios vivos utilizando o método de identificação de células com verde fluorescente descrito adiante. O meio de cultura existente foi aspirado de cada poço das placas de 12 poços e lavaram-se os neurónios uma vez com 2 ml de HBSS (pH 7,4, Invitrogen Corp, número de Cat 14170-112) pré-aquecido a 30-37°C.

Adicionou-se a cada poço da placa 1 ml de verde traçador de células (Cell Tracker Green) 2,5 μΜ ((Molecular Probes, número de Cat 2925) e corantes fluorescentes Hoechst 33342 5 μΜ dissolvidos em HBSS. As placas foram colocadas no escuro à temperatura ambiente durante 15 minutos e depois lavaram-se os neurónios uma vez com 2 ml de HBSS. Adicionou-se 1 ml de HBSS a cada poço, e contaram-se os números de células fluorescentes vivas e mortas utilizando o sistema de formação de imagem automático Cellomics®.

Verificou-se que os compostos da presente invenção possuem um valor de % de protecção >30%.

Exemplo 19

Modelo de Oclusão da Artéria Cerebral Média (MCAO)

Os animais utilizados neste estudo eram ratos Sprague-Dawley machos pesando entre 270 e 333 g (Charles River, NC) . Deixaram-se os ratos ambientar-se às instalações durante pelo menos uma semana num ciclo diurno de luz/escuridão de 12 horas. Deu-se-lhes livre acesso a alimentos e água.

Os oclusores arteriais intraluminais utilizados para bloquear a origem da artéria cerebral média (MCA) eram feitos de corte de sutura de monofilamento de nylon 4-0 com segmentos de 25 mm de comprimento. A ponta da sutura foi arredondada por exposição ao calor. Para aumentar a eficácia do oclusor para bloquear o lúmen da artéria, estes foram revestidos com uma suspensão de poli-L-lisina a 1% e secos durante 1 hora num forno a 60°C. As suturas foram adquiridas a Ethelon, Somerville, NJ. Os reagentes químicos foram utilizados como se segue: 38

ΕΡ 1 532 145 /PT 1. Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio, ou TTC, número de Cat T8877, Lot 50K1435, e PEG400, número de Cat P-3265, foram adquiridos a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. 2. A formalina tamponada com fosfato, número de Cat 245-685, foi adquirida a Fisher Scientific Co., Middletown, VA. 3. A água destilada foi produzida no laboratório. 4. 0 etanol, número de Cat E702-3, foi adquirido a Aldridge, Milwaukee, WI. 0 modelo de sutura intraluminal de isquemia cerebral focal foi utilizado substancialmente como descrito por Longa, et al., Stroke, 20 : 84-91 (1989). A veia jugular externa esquerda foi canulada para administração de veiculo ou de composto.

Para ajudar os ratos a manter a hidratação durante o estudo, injectaram-se dextrose a 5% em água e solução de Ringer lactada (5 ml cada) subcutaneamente em cada flanco às 10, 24 e 48 horas após a MCAO.

Os ratos em conformidade com os critérios iniciais de inclusão (classificação neurológica de 2 e temperatura corporal >38,5°C) foram distribuídos aleatoriamente por atribuição sequencial aos grupos de tratamento com veículo ou com composto. A atribuição diária inicial dos ratos a um grupo particular foi alternada em cada dia. O tratamento com composto ou com veículo foi iniciado por injecção de bolus i.v. 6 horas após MCAO e continuou durante as 18 horas seguintes por infusão constante utilizando a bomba Infu Disk. Os ratos foram anestesiados brevemente e o cateter jugular foi exposto através da incisão dorsal no pescoço. A dose de bolus do composto ou do veículo foi administrada e a bomba de infusão foi activada 5 minutos mais tarde. As bombas de infusão foram fixadas no dorso dos ratos através de um colete.

As soluções de composto foram preparadas de fresco diariamente utilizando um veículo de água:PEG400:etanol nos volumes de 5:4:1. Os grupos e as doses utilizadas neste modelo estão apresentados na Tabela 2 adiante. 39

ΕΡ 1 532 145 /PT

Tabela 2. Dosagem de Composto para o Modelo t-MCAO

Grupo n Tratamento Dose de bolus* (mg/kg) Dose de infusão (mg/kg/h) Composto de bolus (mg/mL) Composto de infusão** (mg/mL) 1 12 Veículo — — — — 2 10 Composto 35 14 21,4 21,4

* Volume da Dose de bolus de 0,49 mL ** Taxa de Infusão de 0,21 mL/h e Duração da Infusão de 18 horas. O volume do enfarte foi determinado por análise de imagem de 7 secções consecutivas coradas com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) utilizando uma modificação do procedimento descrito por Bederson et al. (1986). Três dias após a MCAO, os ratos foram sacrificados por asfixia com CO2 e decapitados. Os cérebros foram rapidamente removidos do crânio e colocados em provetas individuais contendo PBS num banho de gelo durante 30 minutos. Foram obtidas secções cerebrais coronais, 2 mm de espessura, utilizando um laminador de matriz cerebral. As secções do cérebro foram colocadas em placas de petri marcadas contendo TTC a 2% em PBS durante 20 minutos a 37°C. 0 TTC cora de vermelho o tecido cerebral viável, deixando as áreas isguémicas brancas. As secções do cérebro foram então imersas em formalina tamponada neutra a 10% durante pelo menos 24 horas a 4°C. Foram obtidas imagens de todas as secções em 3 dias após o sacrifício.

Secções de cérebro coradas com TTC e fixadas em formalina (7 secções consecutivas) foram captadas digitalmente utilizando o software Adobe Photoshop e uma câmara digital. As imagens foram importadas para um programa de análise de imagens IPLab. A área de enfarte cortical (área branca) foi delineada e medida. O volume do enfarte foi calculado utilizando a fórmula seguinte:

Volume do enfarte = Σ área do enfarte x 2 (a distância entre cada secção)

Os volumes dos hemisférios ipsilateral e contralateral totais foram determinados similarmente. O volume do edema foi calculado subtraindo o volume do hemisfério contralateral do 40 ΕΡ 1 532 145 /PT volume do hemisfério ipsilateral. Um cientista em desconhecimento do tratamento dos ratos realizou a análise. A função neurológica dos ratos foi avaliada às 2, 24, 48 e 72 horas após a MCAO utilizando um sistema de pontuação descrito por Bederson et ai. (1986b). A pontuação vai desde 0 a 3 sendo 0 o normal e 3 indicando um défice grave. A pontuação neurológica a 2 horas da isquemia foi utilizada como critério de inclusão no estudo. Se o rato não tinha uma pontuação neurológica de pelo menos 2 ou se tinha uma pontuação de 3, era eliminado do estudo. Um investigador, sem conhecimento do grupo de tratamento do rato, realizou as avaliações neurológicas.

Obtiveram-se amostras de sangue (-0,5 mL) dos ratos para análise farmacocinética a 5 minutos e a 4, 22, 46 e 70 horas após a injecção de bolus. Os ratos foram ligeiramente anestesiados com isoflurano. Recolheu-se sangue em tubos de recolha de sangue heparinizados (0,6 mL de capacidade) a partir de uma veia lateral da cauda utilizando um conjunto de infusão de borboleta de calibre 23. Centrifugaram-se as amostras de sangue durante 4 minutos (regulação 10) numa microcentrifuga. O plasma foi removido, colocado em frascos rotulados e armazenado a -20°C num congelador.

Setenta de duas horas depois da MCAO, anestesiaram-se profundamente os ratos por inalação de CO2 e obteve-se o máximo de sangue possível por punctura cardíaca. Colocou-se o sangue em tubos de recolha de sangue heparinzados (6 ml de capacidade). Separou-se o plasma do sangue por centrifugação a 4000 rpm durante 5 minutos (Allegra R6,). Recolheu-se o plasma, colocou-se em tubos de plástico rotulados e armazenou-se a -20°C num congelador. A análise estatística para a dimensão do enfarte, a glucose no plasma, a temperatura corporal e o peso corporal entre os grupos de veículo e de tratamento foi realizada pelo teste t de Student bicaudado. A análise estatística da pontuação neurológica foi realizada por análise não paramétrica. Os resultados estão apresentados como média ± SEM. 41

ΕΡ 1 532 145 /PT Ο tratamento com um composto de fórmula I, administrado 6 horas após a MCAO, foi muito eficaz a reduzir o volume do enfarte neste modelo de icto focal transiente (Figure 1) . Os ratos no grupo tratado com composto (88 ± 31 mm3) tinham uma redução altamente significativa de 79% do volume do enfarte total em comparação com o controlo de veiculo (418 ± 31 mm3, p<0,0001). Os danos isquémicos corticais no grupo tratado com composto (32 ± 20 mm3) foram também significativamente reduzidos em 88%, em comparação com o controlo de veiculo (272 ± 22 mm3, p<0, 0001) . O tratamento com um composto de fórmula I (55 ± 12 mm3) foi capaz de reduzir

significativamente os danos isquémicos no estriado em 62%, em comparação com o controlo de veiculo (146 ± 13 mm3, p<0,0001). Finalmente, o tratamento com um composto de fórmula I (21 ± 10 mm3) reduziu a quantidade de formação de edema em 79%, em comparação com o grupo de controlo de veiculo (97 ± 10 mm3, p<0, 0001).

Os ratos tratados com um composto de fórmula I demonstraram uma marcada melhoria na função neurológica ao longo do tempo da experiência (Figura 2) . Logo às 18 horas

após o inicio da dosagem, observou-se uma melhoria significativa da função neurológica no grupo tratado com composto em comparação com o grupo de controlo de veiculo (1,3 ± 0,3 vs. 2 ± 0 unidades, respectivamente, p<0,01). A pontuação neurológica dos ratos tratados com composto continuou a melhorar até que às 72 horas após a MCAO, estes ratos eram capazes de funcionar com pouco ou nenhum défice notável. Em contraste, os ratos tratados com veiculo não apresentaram qualquer melhoria na função neurológica ao longo do tempo da experiência.

Exemplo 20

Modelo Animal para Agente Antidepressivo

Os compostos da presente invenção foram ensaiados quanto a actividade antidepressiva em ratos por métodos substancialmente similares aos descritos por Porsolt, R.D., et al. , 1977; 229: 327-336: Bourin M. Fundam Clin Pharmacol 1990; 4: 49-64. 42

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Teste de Natação em Ratos (Teste de Depressão)

Os ratos foram colocados num cilindro transparente cheio de água. A duração da imobilidade (=tempo de imobilidade), definida como o tempo durante o qual o rato apenas efectuou os movimentos corporais mínimos para manter a sua cabeça fora da água, é registada manualmente. Num segundo ensaio, no dia 4, colocaram-se os ratos novamente no cilindro, desta vez durante 5 minutos. 0 tempo de imobilidade é registado manualmente ao longo de todo o ensaio.

Ensaio I (ensaio inicial):

No dia 1 colocaram-se ratos Wistar machos (estirpe RA239; 160—180g) durante 15 minutos num cilindro. A duração da imobilidade (=tempo de imobilidade), definida como o tempo durante o qual o rato apenas efectuou os movimentos corporais mínimos para manter a sua cabeça fora da água, é registado manualmente. De modo a testar um número razoável de animais num dia, os registos foram restringidos aos seguintes três sub-períodos no ensaio de 15 min.: 0-2,5 min. (i.e. no início do ensaio), 6,25-8,75 minutos (exactamente no meio do ensaio) e 12,5-15 minutos (exactamente no final do ensaio). Tinha-se anteriormente verificado que este procedimento representa o 'desempenho' do animal como apresentado ao longo de todo o ensaio.

Ensaio II (segundo ensaio):

No dia 4, colocaram-se os ratos novamente no cilindro, desta vez durante 5 minutos. Registou-se manualmente o tempo de imobilidade ao longo de todo o ensaio.

Os tratamentos com composto foram suspensos em metilcelulose a 0,5% (Methocel) e dados oralmente (5 ml/kg). As administrações de fármaco eram efectuadas à tarde (aproximadamente às 16:00) do dia 1 (o dia do ensaio I), de manhã (aproximadamente às 08:00) e à tarde nos dias 2 e 3 e exactamente 1 hora antes do ensaio II (no dia 4) . Os tratamentos para os dois ratos numa díade foram similares ou diferentes, dependendo da aleatorização para o desempenho no ensaio I. Os grupos de ratos tratados com Methocel ou 15 mg/kg 43 ΕΡ 1 532 145 /PT ρ.ο. de despiramina (DMI) servem como grupo de controlo e padrão positivo, respectivamente.

Verificou-se que os compostos da presente invenção apresentam actividade antidepressiva no modelo anterior.

Exemplo 21

Modelo Animal de Esquizofrenia: Inibição do Pré-impulso (PPI) de Sobressalto

Danos de controlo sensoriomotor ligados a rupturas na atenção e na cognição são comuns entre pacientes esquizofrénicos. A inibição do pré-impulso (PPI) de sobressalto está danificada em pacientes esquizofrénicos. A inibição do pré-impulso ocorre quando um som fraco que precede o estimulo acústico forte inibe o reflexo de sobressalto. A PPI é considerada um teste que dá uma boa previsão, validade de face e construção para a esquizofrenia.

Um controlo positivo, a clozapina, é um fármaco anti-psicótico atípico comercialmente disponível (Clozaril®). A clozapina tem uma alta afinidade para com a dopamina D4 & receptores de 5-HT2 e aumenta eficazmente a resposta de PPI em modelos animais. 0 ensaio de PPI foi realizado, da maneira que se segue, por métodos substancialmente similares aos descritos por Spooren et al., Anxiolytic-like effects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5 antagonist 2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine in rodents. J Pharmacol Exp Ther. 295: 1267-1275 (2000) . C57BL/6 machos (20-30g) foram alojados em grupos de quatro em gaiolas Macrolon (42x26x15 cm) durante pelo menos 3 dias antes da experiência. As instalações de alojamento tinham temperatura e humidade controladas e estavam equipadas com iluminação artificial (das 6:00 AM às 6:00 PM, com luzes acesas) . Os animais tinham acesso a água e alimento, ad libitum. Todos os animais eram experimentalmente ingénuos (nalve) . 44

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Os animais do procedimento foram pré-tratados com composto de teste (30, 60, 100 mg/kg), clozapina (30 mg/kg), um controlo positivo, ou veiculo (metilcelulose a 0,5%). Após 45 minutos, colocaram-se os ratinhos individualmente na câmara de sobressalto com um ruido de fundo branco de 70 dB, e deixaram-se sem perturbações durante 10 minutos. Depois, houve uma sessão de 15 minutos consistindo em 56 ensaios. O estimulo para o sobressalto é um som de ruido branco de 40 ms-120dB, os pré-impulsos são som de ruido branco de 20 ms de 72, 74 e 78 dB precedendo o sobressalto em 100 ms.

Fizeram-se oito tipos de ensaios: pré-impulso mais sobressalto (7 ensaios por cada intensidade de pré-impulso), pré-impulso sozinho (7 ensaios por cada intensidade de pré-impulso), sobressalto sozinho (7 ensaios), e sem estimulação (7 ensaios). O intervalo inter-ensaios variável tem em média 15 s (entre 10 e 20 s) . Nos ensaios sem estimulação, foram feitas medições de linha de base. Nos ensaios de sobressalto sozinho, a amplitude do sobressalto auditivo básico (g) foi medida e nos ensaios de pré-impulso mais sobressalto, a quantidade de inibição do sobressalto normal foi medida e expressa na forma de percentagem do sobressalto básico. Nos ensaios de pré-impulso sozinho, a resposta normal a um ruído fraco foi medida como controlo. A inibição do pré-impulso foi calculada de acordo com a fórmula, %PPI = 100-100 x [ (PA2 PPP)/PA2]. Verificou-se que os compostos da presente invenção aumentam a PPI de reflexo de sobressalto acústico em ratinhos.

Exemplo 22

Modelos Animais para Agente Ansiolítico O ensaio ansiolítico foi realizado, da seguinte maneira, por métodos substancialmente similares aos descritos por Spooren et ai., Anxiolytic-like effects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5 antagonist 2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine in rodents. J Pharmacol Exp Ther. 295: 1267-1275 (2000) e Lecci A, Borsini F, Volterra G e Meli A, Pharmacological validation of a novel animal model of anticipatory anxiety in mice. Psychopharmacology 101: 255-261 (1990) . 45

ΕΡ 1 532 145 /PT I. Hipertermia Induzida por Stress: 0 procedimento de teste para hipertermia induzida por stress (SIH) foi adoptado com mínimas modificações da descrição original de Lecci, et al. (1990). Mediu-se a temperatura rectal a menos de 0,1°C com um termómetro (ELLAB Instruments, Copenhagen, Dinamarca) por via de uma sonda termistor lubrificada (2 mm de diâmetro) inserida 20 mm no recto enquanto o ratinho era mantido manualmente próximo da base da cauda. Deixou-se a sonda no lugar até se obterem leituras estáveis (em 15 s).

Alojaram-se quinze animais por gaiola Macrolon (42 χ 26 χ 15 cm) . Pelo menos 24 horas antes da experiência marcaram-se os animais numa gaiola sobre a pelagem com cores para identificação posterior. Sessenta minutos antes de medir a temperatura rectal todos os indivíduos numa determinada gaiola foram consecutivamente tratados com intervalos de 1 minuto com composto de teste (doses: 1,3, 10 ou 30 mg/kg, p.o.; volume de injecção: 10 ml/kg), clordiazepóxido-HCl (10 mg/kg, p.o.;

Research Biochemicals International), i.e., os controlos positivos ou veículo (metilcelulose a 0,5%; Animed). Exactamente 30 minutos mais tarde, removeram-se os ratinhos consecutivamente da gaiola (novamente com intervalos de 1 minuto), e determinou-se e anotou-se a temperatura rectal. Uma vez registada a temperatura, colocaram-se os animais numa gaiola diferente (adjacente). A variável dependente, i.e., hipertermia induzida por stress, foi definida como o delta da mediana da temperatura rectal nos seis ratinhos removidos inicialmente e a mediana da temperatura rectal nos últimos seis ratinhos removidos numa gaiola. Este delta foi calculado para seis a oito gaiolas dependendo do grupo de tratamento específico enquanto na representação final foi utilizada a média destes seis a oito valores. A temperatura rectal do primeiro animal foi utilizada, adicionalmente, para avaliar o efeito potencial do composto sobre a temperatura corporal basal, per se. II. Teste de Exploração Social em Ratos:

Utilizaram-se ratos Sprague-Dawley machos adultos (=ratos "residentes"; 350-400 g) e ratos Lister Hooded jovens (=ratos 46 ΕΡ 1 532 145 /PT "intrusos"; 100-120 g) . Os ratos intrusos foram alojados em pares e os ratos residentes foram alojados individualmente em gaiolas Macrolon (42 χ 26 χ 15 cm) durante 2 semanas antes do teste. Todos os animais foram alojados na mesma sala. As instalações de alojamento tinham a temperatura e a humidade controladas e estavam eguipadas com iluminação artificial (das 6:00 AM às 6:00 PM, luzes acesas). Os animais tinham acesso a água e alimento, ad libitum. Todos os ratos eram experimentalmente ingénuos.

Os animais receberam composto de teste (doses: 0,3, 3, 10 ou 30 mg/kg), clordiazepóxido-HCl (5 mg/kg, p.o.; CDZ, Research Biochemicals International, Natick, MA), LiCl (10, 30 mg/kg) como compostos de referência/positivos, ou veiculo (metilcelulose a 0,5%). O volume de injecção foi de 2 ml/kg. O tratamento oral foi dado ao rato intruso apenas, e o teste foi realizado 1 hora após a administração do composto. Todas as observações foram feitas durante a fase de luz (das 8:00 AM às 1:00 PM) na gaiola de alojamento do rato residente (veja-se atrás). 0 chão da gaiola foi coberto com serradura. Os pares, consistindo num rato intruso e um rato residente, foram atribuídos aleatoriamente a um dos grupos experimental ou de controlo. A duração dos comportamentos de abordagem activa (=tempo despendido em actividade social) do rato intruso (cheirar, exploração anogenital, encostar o nariz, limpar o pêlo, lamber, brincar) relativamente ao residente foi pontuada manualmente e cumulativamente registada ao longo de um período de 5 minutos. III. Teste do Labirinto em Cruz Elevado:

Ratos Sprague-Dawley machos adultos (180-220 g) foram alojados em grupos de quatro em gaiolas Macrolon (42 χ 26 χ 15 cm) durante pelo menos 3 dias antes da experiência. As instalações de alojamento tinham temperatura e humidade controladas e estavam equipadas com iluminação artificial (das 6:00 AM às 6:00 PM, luzes acesas). Os animais tinham acesso a água e alimento, ad libitum. Todos os animais eram experimentalmente ingénuos. 0 labirinto em cruz elevado consiste em dois braços abertos (40 χ 12 cm) e dois braços fechados (40 χ 12 χ 20 cm), 47

ΕΡ 1 532 145 /PT que se estendem todos a partir de uma plataforma central comum (12 x 12 cm) . A configuração forma uma cruz, com braços similares dispostos opostos um em relação ao outro, e o dispositivo é elevado 60 cm acima do chão num pedestal central. O labirinto é feito de Plexiglas cinzento. A tracção nos braços abetos é facilitada por inclusão de um pequeno bordo elevado (0,25 cm) em torno do seu perímetro. O método foi realizado da maneira que se segue, por métodos substancialmente similares aos descritos por Handley, S.L. e Mithani, S Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze exploration model of "fear"-motivated behaviour. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 327: 1-5 (1984). Os ratos foram aleatoriamente distribuídos por um dos vários tratamentos. Os animais foram transportados da sala do alojamento para o laboratório pelo menos 1 hora antes do teste. Após a administração oral do composto, os ratos foram individualmente alojados em gaiolas Macrolon (22 x 16 x 14 cm), e após 60 minutos foram colocados na plataforma central voltados para um braço fechado. Realizou-se um ensaio de 8 minutos, e o labirinto foi completamente limpo entre os indivíduos. Foram feitos registos directos por um observador sentado próximo do labirinto, e utilizaram-se os seguintes parâmetros convencionais: número de entradas nos braços abertos e fechados (a entrada num braço definida como todas as quatro patas terem entrado num braço) e o tempo despendido nos braços abertos (excluindo a plataforma central). Os animais dos diferentes grupos de tratamento foram alternativamente testados, e os ensaios foram realizados entre as 8:30 AM e as 12:30 PM, i.e., na primeira metade da fase iluminada. Foram registados os seguintes parâmetros, que reflectem ansiedade: razão (aberto/total) tempo despendido nos braços abertos, latência até deixar o Io braço, e número total de entradas nos braços.

Os compostos da presente invenção apresentam um efeito do tipo ansiolítico nos modelos animais anteriores. 48

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Exemplo 23

Ensaio Celular para Doença de Alzheimer - Sobrevivência

Neuronal

Realizou-se o seguinte ensaio por métodos substancialmente similares aos descritos por Kienlen-Campard, et al. , J Biol Chem 277:15666 (2002) . Culturas primárias de neurónios do hipocampo são preparados a partir de embriões de rato E18 (Park et al., J Neurochem, 74:114, 2000). As células são plaqueadas em pratos de cultura de 6 ou 96 poços (4 x 105 células/cm2) ou lamelas de vidro (1,25 x 105 células/cm2) pré-tratadas com poli(D-lisina) e cultivadas durante 6 dias in vitro em meio NEUROBASALTM suplementado com 2% de B-27 e L-glutamina 0,5 mM antes da infecção com adenovirus recombinantes. Sob estas condições, as culturas neuronais (até 98% de neurónios) apresentam elevadas taxas de diferenciação e de sobrevivência.

Adenovirus Recombinantes e Infecção Neuronal - São feitas produção, propagação e purificação da forma mutante que codifica adenovirus de APP695. Após 6 dias in vitro, as culturas neuronais são infectadas à multiplicidade de infecção de 100 durante 4 horas num volume mínimo de meio de cultura. O meio de infecção é então substituído por meio de cultura fresco durante 3-5 dias. Sob estas condições, pelo menos 75% de neurónios expressam as proteínas codificadas por adenovirus recombinantes.

Sobrevivência Celular - A sobrevivência neuronal é medida através do ensaio colorimétrico com MTT ou o ensaio de viabilidade celular com traçador fluorescente utilizando o sistema de formação de imagens automático Cellomics. Para coloração nuclear, as células são fixadas (formaldeído a 0,37%/glutaraldeído a 0,2% em solução salina tamponada com fosfato) e incubadas durante 30 minutos no corante Hoechst 33342 (1 pg/ml).

Quantificação da produção de Abeta - Recolhe-se meio de cultura, trata-se com inibidores de protease (pepstatina a 1 pg/ml, leupeptina a 10 pg/ml, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM), e clarifica-se por centrifugação (16 000 x g, 5 min, 4°C) . Utiliza-se uma centena de μΐ do 49 ΕΡ 1 532 145 /PT sobrenadante para a quantificação de beta-amilóide utilizando o método ELISA adiante descrito.

Exemplo 24

Inibição da Produção de Beta-Amilóide (1-40) A doença de Alzheimer é caracterizada pela presença de placas extracelulares e emaranhados neurofibrilares intercelulares no cérebro. A proteína componente principal destas placas é o péptido beta-amilóide ("Αβ") que é clivado da proteína precursora amilóide ("APP").

Linha Celular e Tratamento com Composto:

Uma linha celular estável capaz de secreção de Αβ foi construída em células de neuroglioma humano H4 por transdução com um vector retroviral que expressa tanto APP695 contendo as mutações Swedish (K595N, M596L) como YFP como marcador de selecção. Os transductantes estáveis que expressam APP695 foram seleccionados por separação das células que expressam elevados níveis de YFP.

As células foram plaqueadas a 80 000 células por poço numa placa de 96 poços em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (Invitrogen, n.° de catálogo 11965-092) suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 10% e penicilina/estreptomicina. Após 24 horas, o meio foi substituído por meio fresco contendo o composto de interesse onde foram testadas concentrações de composto de 20 μΜ a 10 nM em titulações de sete pontos em duplicado. Após incubação com composto de teste durante 18-24 horas a 37°C, a concentração de ϊιΑβ (1-40) no sobrenadante foi determinada utilizando o ELISA ϊιΑβ40 .

Ensaio ELISA para Αβ segregada:

Utilizou-se um ELISA da Biosource International, Inc.

, TM

Signal Select Human β Amyloid (ϊιΑβ40) (numero de catalogo KHB3482) para a determinação quantitativa in vitro de 1οΑβ40 no sobrenadante de cultura das amostras. Um anticorpo monoclonal específico para o terminal NH2 de hAp foi utilizado para revestir os poços das placas de microtítulo. As amostras, 50 ΕΡ 1 532 145 /PT incluindo padrões de teor de ΙιΑβ conhecido, foram pipetadas para estes poços após a adição de um anticorpo de coelho especifico para a sequência 1-40 de ΙτΑβ. O anticorpo de coelho ligado foi depois detectado por utilização de um anticorpo anti-coelho marcado com peroxidase de rábano. Após remoção do excesso de anticorpo anti-coelho, adicionou-se uma solução substrato, que foi clivada pela enzima ligada para produzir cor. A intensidade desta cor produzida é directamente proporcional à concentração de ϊιΑβ (1-40) presente na amostra. O ensaio ELISA foi realizado como se segue:

Amostras e padrões contendo uma concentração conhecida de péptido ϊιΑβ (1-40) foram diluídos em diluente de padrão/amostra (reagente Biosource). Os inibidores de protease AEBSF, Aprotinina, Bestatina, E-64, Leupeptina e Pepstatina A (Calbiochem, Protease Inhibitor Cocktail Set III, número de catálogo 539134) foram adicionados a todas as amostras para evitar a proteólise dos péptidos Αβ. Adicionaram-se 100 μΐ de amostras e padrões aos poços das placas de ELISA de 96 poços e incubou-se durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Os poços foram lavados 4 vezes com 100 μΐ de tampão de lavagem (Reagente Biosource) e depois adicionaram-se 100 μΐ de anticorpo de detecção e incubaram-se as placas durante 2 horas à temperatura ambiente. O anticorpo de detecção reconhece a sequência ύΑβ (1-40).

Lavaram-se os poços 4 vezes com 100 μΐ de tampão de lavagem e depois adicionaram-se 100 μΐ de anticorpo secundário anti-coelho marcado com peroxidase de rábano (HRP).

Incubaram-se as placas durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavaram-se então os poços 5 vezes com 100 μΐ de tampão de lavagem e depois adicionaram-se 100 μΐ de cromogénio estabilizado. Incubaram-se as placas durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. O cromogénio estabilizado é uma solução de substrato que quando clivada por HRP ligada fica azul e portanto pode ser monitorada num leitor de placas de microtítulo Standard. Adicionaram-se então 100 μΐ de solução de paragem e mediu-se a intensidade da cor nos poços a 450 nm utilizando um leitor de placas Molecular Devices SpectraMAX 340. Tipicamente, os compostos foram analisados numa resposta à dose de 7 pontos realizada em duplicado com 51 ΕΡ 1 532 145 /PT gamas de concentração de composto de 20 μΜ a 10 nM. As concentrações de Αβ (1-40) nas amostras foram calculadas a partir de curvas padrão geradas a partir de padrões que continham uma concentração conhecida de péptido Αβ.

Os compostos da presente invenção foram testados ao longo de um período de 3 dias. Em cada dia, o "Inibidor X" de secretase gama Calbiochem foi incluído como controlo. Este é um isóstero de dipéptido de hidroxietileno permeável nas células com uma IC50 relatada de 50 nM (número de catálogo 565771) .

Exemplo 25

Ensaios de Animais Transgénicos para a Doença de

Alzheimer (AD)

J. Animais transgénicos com DA

Ratinhos transgénicos que super-expressam a isoforma de 695 aminoácidos da proteína precursora beta-amilóide humana de Alzheimer (Abeta) contendo uma mutação Lys670 —> Asn, Met671 —> Leu (ratinhos Tg2576 estão disponíveis comercialmente de Taconic, N.Y.) tinham aprendizagem e memória normais em referência espacial e tarefas de alternação aos 3 meses de idade mas apresentavam deficiências aos 9 a 10 meses de idade. Um aumento de cinco vezes na Abeta(1-40) e um aumento de 14 vezes na Abeta(1-42/43) acompanharam o surgimento destes défices comportamentais. Numerosas placas Abeta que coraram com corante vermelho do Congo estão presentes em estruturas corticais e límbicas de ratinhos com elevadas quantidades de Abeta. O surgimento correlativo de anomalias comportamentais, bioquímicas e patológicas reminescentes da doença de Alzheimer nestes ratinhos transgénicos sugerem novas oportunidades para explorar a patofisiologia e a neurobiologia desta doença. Veja-se Correlative memory déficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 1996 Oct 4,-274(5284) :99-102.

Embora os ratinhos Tg2576 sejam especificados nos modelos aqui descritos, entender-se-á que outros ratinhos transgénicos, disponíveis tanto comercialmente como de 52 ΕΡ 1 532 145 /PT privados, são susceptíveis de utilização nos referidos modelos. II. Protocolo de ELISA para Beta-Amilóide

The Relationship between Αβ and Memory in the Tg2576 Mouse Model of Alzheimer's Disease. The Journal of

Neuroscience, March 1,2002,22(5): 1858-1867.

As duas metades de cérebro congeladas são sequencialmente extractadas numa extracção de dois passos [tratamento com ultra-sons em (1) SDS a 2% e (2) ácido fórmico a 70% (FA) ] . Esta última fracção é designada Abnsol. Após o tratamento com ultra-sons as amostras são centrifugadas a 100 000 χ g durante 1 hora a 4°C, o sobrenadante é recuperado, e a pelete é tratada com ultra-sons com a solução seguinte. Os extractos cerebrais são medidos por ELISA em sanduíche como descrito anteriormente (Suzuki et al., 1994; Gravina et al., 1995). São utilizados os seguintes sistemas: (1) captura com BAN-50 e detecção com BA-27 ou BC-05 ou (2) captura com 3160 e detecção com BA-27 ou BC-05, em que ambos detectam Αβ 1-40 e Αβ 1-42, respectivamente. A comparação directa de muitos cérebros de Tg2576 de ratinhos de todas as idades mostrou que as quantidades de Αβ40 e Αβ42 detectadas com ELISA de captura com 3160 são essencialmente iguais a quando se utiliza BAN-50 para a captura. Os extractos de SDS a 2% são diluídos pelo menos de 1:40 de modo a que o ensaio possa ser realizado em SDS a 0,05%. Maiores diluições são corrigidas para SDS de modo a que sejam também ensaiadas em SDS a 0,05%. O extracto de FA é neutralizado através de uma diluição de 1:20 com tampão de fosfato Tris 1 M, pH 8,0. Utiliza-se o programa Softmax para calcular o número de femtomoles por mililitro por comparação da absorvância da amostra com a absorvância de concentrações conhecidas de Αβ1-40 e Αβ1-42 sintéticos em solução idêntica às amostras, e estes valores são corrigidos com o peso molhado do homogenato original para serem finalmente expressos em picomoles por grama de peso molhado. Em todos os casos, tecidos não transgénicos são processados de forma idêntica em paralelo com tecidos transgénicos. 53

ΕΡ 1 532 145 /PT III. Teste Comportamental de Ratinhos Transgénicos: Labirinto Aquático de Morris 0 labirinto aquático é adaptado para ratinhos Tg2576 com base na estirpe B6/SJL de uma maneira que permita detectar e distinguir todos os estágios de perda de memória. Este protocolo proporcionou a sensibilidade, a especificidade e a gama dinâmica necessárias para medir alterações que são subtis precocemente na vida e massivas mais tarde na vida. A interpolação de sondas durante o treino proporcionou sensibilidade. A adopção de critérios de exclusão para défices de desempenho deram a especificidade. 0 treino proporcionou extensivamente a gama dinâmica. A atribuição de pontuações de sondas médias (MPS), que é a percentagem média do tempo despendido por um ratinho no quadrante alvo durante os três ensaios com sonda, melhorou a quantificação do desempenho cognitivo de ratinhos individuais para correlações com marcadores moleculares e proporcionou uma única medição com uma ampla gama dinâmica. Os protocolos para ratinhos Tg2576 com base noutras estirpes podem requerer ajustes para diferenças específicas da estirpe nas taxas de aprendizagem e défices de desempenho. Veja-se The Relationship between Αβ and Memory in the Tg2576 Mouse Model of Alzheimer's Disease. The Journal of Neuroscience, March 1, 2002, 22(5):1858-1867. O labirinto aquático é uma piscina circular de 1 ou 1,2 m cheia com água a 25-27°C e tornada opaca por adição de uma tinta branca não tóxica. A piscina é colocada entre barras espaciais fixas consistindo em cortinas de padrão forte e prateleiras contendo objectos distintos. Os ratinhos são colocados numa proveta e suavemente baixados na água voltados para a parede da piscina. Os ratinhos tiveram primeiro um treino na plataforma visível durante 3 dias consecutivos (oito ensaios por dia), nadando para uma plataforma elevada (uma superfície quadrada de 12 χ 12 cm2) marcada com uma vara de riscas pretas e brancas. Os dias de plataforma visível são divididos em dois blocos de treino de quatro ensaios para análise estatística. Durante o treino na plataforma visível, tanto a localização da plataforma (NE, SE, SW ou NW) como a posição de partida (N, NE, E, SE, S, SW, W ou NW, excluindo as posições imediatamente adjacentes à plataforma) são variadas de forma pseudo-aleatória em cada ensaio. A pseudo- 54 ΕΡ 1 532 145 /PT aleatorização assegura que todas as posições são amostradas antes de se repetir uma determinada posição. 0 treino na plataforma escondida é conduzido ao longo de 9 dias consecutivos (quatro ensaios por dia), em que se deixa os ratinhos procurar uma plataforma submersa 1,5 cm abaixo da superfície da água. Os ratinhos que não conseguem chegar à plataforma em 60 s são conduzidos à plataforma com uma concha de escape de metal. Durante os ensaios na plataforma escondida, a localização da plataforma permanece constante (NE, SE, SW ou NW) , e os ratinhos entram na piscina numa das sete localizações seleccionadas de forma pseudo-aleatória (N, NE, E, SE, S, SW, W ou NW, excluindo a posição imediatamente adjacente à plataforma). Após cada ensaio na plataforma escondida, os ratinhos permaneceram na plataforma durante 30 segundos e são removidos da plataforma e devolvidos à sua gaiola de alojamento com a concha de escape. Os ratinhos aprenderam rapidamente a associar a concha ao escape da piscina e consistentemente orientavam-se para, ou seguiam, a concha quando esta aparecia. A capacidade dos ratinhos se orientarem para, ou seguirem a concha de escape representava medidas independentes de visão e atenção. No início do 4o, 7o, e 10° dias de treino na plataforma escondida, conduz-se um ensaio com sonda em que a plataforma é removida da piscina e se deixam os ratinhos procurar a plataforma durante 60 segundos. Todos os ensaios são monitorados através de uma câmara montada directamente por cima da piscina e são registados e analisados utilizando um sistema de registo computadorizado. A MPS é calculada para cada ratinho e utilizada para avaliar a retenção da informação espacial no labirinto aquático de Morris. Integrando a informação das sondas intercaladas, a MPS representa uma medição da aprendizagem similar em conceito ao índice de aprendizagem previamente descrito (Gallagher et al., 1993), o que amostra a memória em diferentes estágios da aprendizagem. Encontram-se resultados estatísticos similares com MPS, o índice de aprendizagem e a pontuação de aprendizagem (a soma ponderada da percentagem de tempo despendido no quadrante alvo durante os ensaios com sonda), e elegemos para representar os nossos resultados utilizando MPS devido à facilidade de representação. 55

ΕΡ 1 532 145 /PT

Após os testes, submete-se a eutanásia um subconjunto de cada grupo de ratinhos, e a metade direita do cérebro é congelada em azoto liquido para medições de Αβ. Todos os cérebros são analisados de uma maneira codificada. IV. Teste Comportamental de Ratinhos Transqénicos: Actividade Exploratória, Ansiedade e Coordenação Motora

Veja-se Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res 2003 Jul 4; 977 (1) : 38-45. A alternação espontânea é testada num labirinto em T feito de acrílico branco. O labirinto consistia numa haste central (comprimento: 30 cm) flanqueada de cada lado por dois braços (comprimento: 30 cm). A largura do labirinto é de 9 cm e cada parede é de 20 cm de altura. No ensaio inicial, os ratinhos são colocados na haste do labirinto em T com o braço direito bloqueado por uma barreira de plástico (escolha forçada). Depois de entrarem no braço disponível, os ratinhos são neste mantidos durante 60 segundos fechando-se a barreira por trás deles. Os ratinhos são então retirados e depois de remover a barreira são imediatamente colocados de novo na haste para um ensaio de escolha livre, em que os ratinhos podem explorar o braço oposto ou o mesmo (critério das quatro patas). Nos 9 dias seguintes, repetiu-se o mesmo procedimento de dois ensaios, excepto que o braço bloqueado no primeiro ensaio é trocado do direito nos dias ímpares para o esquerdo nos dias pares. O número de alternações e as latências antes da resposta durante o ensaio de escolha são medidos, com um período limite de 1 minuto por ensaio. Se os ratinhos não respondiam em 1 minuto e estavam longe do ponto de escolha, eram suave e brevemente empurrados por trás, usualmente não mais que uma vez, de modo a se poder registar uma resposta em cada ensaio. A actividade motora é medida em campo aberto, feito de acrílico branco com uma área superficial de 50x50 cm e com paredes de 38 cm de altura. A actividade nas zonas central e periférica é registada por uma câmara de vídeo superior e analisada. A zona central é de formato quadrado e começa a uma distância de 25 cm de cada parede. Os ratinhos são colocados 56 ΕΡ 1 532 145 /PT num canto do campo aberto para três sessões diárias de 5 minutos. A distância percorrida e o tempo despendido em repouso (<2 cm/s), em movimento lento (2-5 cm/s) ou em movimento rápido (>5 cm/s) em cada zona são medidos, assim como o tempo despendido na periferia e no centro do dispositivo. 0 labirinto em cruz elevado consistia em quatro braços (comprimento: 70 cm, largura: 10 cm, altura em relação ao chão: 40 cm) num formato em forma de cruz e uma região central (10 cm2). Dois dos braços estão fechados em três lados com paredes (altura: 10 cm) enquanto os outros dois são abertos, excepto quanto a um bordo mínimo (altura: 0,5 cm), utilizado para minimizar as quedas. Os dois braços fechados ou abertos estão voltados uns para os outros. Os ratinhos são colocados na região central e o número de entradas e as durações nos braços fechados e abertos são medidos em duas sessões diárias de 5 minutos com o mesmo equipamento de gravação em vídeo que se utilizou no teste anterior. As razões de entradas no braço aberto/totais e de duração são então calculadas. Nas raras ocasiões em que os ratinhos caem de um braço aberto, o tempo registado é parado e os ratinhos são colocados novamente na posição exacta em que caíram. Após cada sessão de teste de alternação espontânea, campo aberto e labirinto em cruz, o dispositivo é limpo com um pano molhado e seco antes do início do ensaio seguinte de modo a reduzir os possíveis efeitos de pistas de odor. 0 feixe estacionário é construído em plástico, com um diâmetro de 2,5 cm e um comprimento de 110 cm. O feixe é coberto por uma camada de fita de cobertura branca de modo a assegurar uma tracção firme e dividido em 11 segmentos por linhas desenhadas. O feixe é colocado a uma altura de 45 cm de um chão coberto com uma esteira, que serviu de colchão para quedas e assim evitou lesões nos ratinhos. Uma parede de cartão é inserida no final do feixe para evitar que os ratinhos escapassem. Um ensaio começa colocando os ratinhos no segmento do meio. O número de segmentos atravessados (critério das quatro patas), as latências antes de cair e o número de quedas, são medidos numa única sessão de quatro ensaios. O período limite é de 1 minuto por ensaio e o intervalo inter-ensaios é de 15 minutos. 57

ΕΡ 1 532 145 /PT A vara rotora de aceleração (Modelo 7650, Stoelting, Wood Dale, IL, EUA) é construída em plástico nervurado (diâmetro: 3 cm) . O feixe é colocado a uma altura de 13,5 cm relativamente ao nível do chão e separado em cinco secções (largura: 5,5 cm) por uma barreira de plástico. De costas para o investigador, os ratinhos são colocados no topo da vara já em rotação (4 rpm) na orientação oposta ao seu movimento, de modo que as quedas possam ser evitadas por locomoção para a frente. A vara rotora é acelerada gradual e suavemente desde 4 a 40 rpm durante cada ensaio de 5 minutos. As latências antes da queda são medidas para três sessões diárias de quatro ensaios, com um intervalo inter-ensaios de 15 minutos. Sempre que os ratinhos se mantêm na vara sem movimento (rotação passiva) durante duas revoluções completas sucessivas, considera-se que caíram. Como nenhum ratinho pareceu saltar deliberadamente, pode-se obter uma estimativa válida da perícia motora. Após o treino, é avaliada a ocorrência de vários reflexos normais e patológicos. V. Determinação da Acumulação de beta-Amilóide no Cérebro por Imuno-histoquímica

Veja-se Accelerated plaque accumulation, associative learning déficits, and upregulation of alpha 7 nicotinic receptor protein in transgenic mice co-expressing mutant human presenilin 1 and amyloid precursor proteins. J Biol Chem. 2002 Jun 21; 277 (25) : 22768-80

Os ratinhos são submetidos a perfusão cardíaca com solução salina tamponada com fosfato (NaHP04 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) e fixa-se com paraformaldeído a 4%. As secções congeladas do cérebro são seccionadas coronalmente com uma espessura de 12 pm utilizando um crióstato, montadas em lâminas de microscópio ProbeOn Plus (Fisher Scientific) , e secas ao ar. Imediatamente antes da coloração, as secções do cérebro são fixas com acetona. As secções de tecido são incubadas durante 30 minutos em H2C>2 a 0,3% e soro de cabra normal a 0,3%, são lavadas com solução salina tamponada com fosfato e incubadas com soro de cabra normal 1,5% em solução salina tamponada com fosfato durante 30 minutos. As secções de cérebro são então incubadas com anticorpo 6E10 anti-Αβ (1:1000, Senetik) corado com IgG anti-ratinho biotinilada 58

ΕΡ 1 532 145 /PT (1:200, Vector Laboratories), e imunodetectado com Reagente Vectastaína ABC (1:100, Vector Laboratories). As secções são contrastadas com hematoxilina.

Embora sejam atrás descritas várias concretizações da presente invenção, é evidente que os nossos exemplos básicos podem ser alterados para proporcionar outras concretizações que utilizem os compostos e métodos da presente invenção. Portanto, será notado que o âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas e não pelas concretizações específicas que foram representadas a título de exemplo.

Lisboa,

Claims

ΕΡ 1 532 145 /PT 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula I:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: W é azoto; R1 é seleccionado entre hidrogénio ou flúor; e Ry é um grupo alifático C1-4, em que o referido grupo alifático é uma cadeia de hidrocarboneto C1-C4 linear ou ramificada que está completamente saturada ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, ou um hidrocarboneto C3-C4 monociclico que está completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromático, que possui um único ponto de fixação ao resto da molécula.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que Ry é seleccionado entre metilo, etilo, ciclopropilo, terc-butilo ou isopropilo, preferivelmente seleccionado entre metilo, ciclopropilo ou terc-butilo.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R1 é hidrogénio ou flúor.
4. Composto seleccionado do grupo que consiste em: ΕΡ 1 532 145 /PT 2/4
5. Composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1, e um transportador, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitáveis.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, adicionalmente compreendendo um agente terapêutico adicional seleccionado entre um tratamento para Doença de Alzheimer (DA), um tratamento para Doença de Parkinson, um agente para o tratamento de Esclerose Múltipla (EM), um tratamento para asma, um agente anti-inflamatório, um agente imunomodulador ou imunossupressor, um factor neurotrófico, um agente para o tratamento de icto, um agente para o tratamento de doença cardiovascular, um antidepressivo, um agente anti-psicótico ou um agente para o tratamento de diabetes. ΕΡ 1 532 145 /PT 3/4
7. Método de inibição da actividade de quinase GSK3 numa amostra biológica, compreendendo o passo de contacto da referida amostra biológica com: a) uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6; ou b) um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
8. Composição de acordo com a reivindicação 5 ou 6; ou composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização terapêutica, especialmente para utilização na inibição da actividade de quinase GSK3 num paciente.
9. Composição de acordo com a reivindicação 5 para utilização no tratamento de uma doença auto-imune, uma doença inflamatória, uma desordem metabólica, uma desordem psiquiátrica, diabetes, uma desordem angiogénica, taupatia, uma desordem neurológica ou neurodegenerativa, uma lesão na medula espinal, glaucoma, calvície ou uma doença cardiovascular.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9, em que a referida doença, desordem ou condição é seleccionada entre alergia, asma, diabetes, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, demência associada a SIDA, esclerose lateral amiotrófica (ELA, doença de Lou Gehrig), esclerose múltipla (EM), uma lesão devida a traumatismo da cabeça, esquizofrenia, ansiedade, desordem bipolar, taupatia, uma lesão na medula espinal ou em nervos periféricos, enfarte do miocárdio, hipertrofia cardiomiocítica, glaucoma, desordem de défice de atenção (DDA), depressão, uma desordem do sono, reperfusão/isquemia, icto, uma desordem angiogénica ou calvície.
11. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que a referida doença, desordem ou condição é icto.
12. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que a referida doença, desordem ou condição é a doença de Alzheimer. ΕΡ 1 532 145 /PT 4/4
13. Composição de acordo com a reivindicação 9, em que a referida desordem é uma desordem neurológica ou neurodegenerativa.
14. Composição de acordo com a reivindicação 5 ou 6, para utilização na diminuição da motilidade do esperma.
15. Composição de acordo com a reivindicação 9, para utilização com um agente terapêutico adicional seleccionado entre um agente para o tratamento da Doença de Alzheimer (DA), um agente para o tratamento da Doença de Parkinson, um agente para o tratamento de Esclerose Múltipla (EM), um agente para o tratamento de asma, um agente anti-inflamatório, um agente imunomodulador ou imunossupressor, um factor neurotrófico, um agente para o tratamento de icto, um agente para o tratamento de doença cardiovascular, um antidepressivo, um agente anti-psicótico ou um agente para o tratamento de diabetes. Lisboa,