JP3700091B2 - Ｃｃ−１０６５のアナログ類および誘導体の細胞結合剤複合体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な細胞障害剤及びその治療用途に関する。より詳しくは、本発明は、ＣＣ−１０６５のアナログ類およびＣＣ−１０６５の誘導体およびその治療用途からなる新規な細胞障害剤に関する。これらの新規な細胞障害剤は、該アナログ類および誘導体を細胞結合剤に化学的に連結することにより標的化の様式で特定の細胞集団に該アナログ類および誘導体を送達させる結果、治療用途を有する。
【０００２】
【従来の技術およびその問題点】
近年、モノクローナル抗体−薬物複合体を用いた腫瘍細胞の特異的標的化の試みについて、無数の報告がなされている〔（セラら、イン・イムノコンジュゲーツ、ページ１８９−２１６（シー．ボーゲル編、１９８７）；ゴースら、イン・ターゲッティッド・ドラッグズ、ページ１−２２（イー．ゴールドバーグ編、１９８３）；ディーナーら、イン・アンチボディー・メディエーティッド・デリバリー・システムズ、ページ１−２３（ジェイ．ロッドウェル編、１９８８）；ピーターツら、イン・アンチボディー・メディエーティッド・デリバリー・システムズ、ページ２５−５３（ジェイ．ロッドウェル編、１９８８）；ブモルら、イン・アンチボディー・メディエーティッド・デリバリー・システムズ、ページ５５−７９（ジェイ．ロッドウェル編、１９８８）。
【０００３】
メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシルおよびメイタンシノイド類などの細胞障害薬（cytotoxic drugs ）は、種々のマウスモノクローナル抗体と結合されている。ある場合には、薬物分子は、血清アルブミン〔（ガーネットら、４６キャンサー・リサーチ、２４０７−２４１２（１９８６）；オーカワら、２３ Cancer Immunol. Immunother., ８１−８６（１９８６）；エンドウら、４７ キャンサー・リサーチ、１０７６−１０８０（１９８０）〕、デキストラン〔ハ−ウィッツら、２ Appl. Biochem. ２５−３５（１９８０）；マナビら、３４ バイオケミカル・ファーマコロジー、２８９−２９１（１９８５）；ディルマンら、４６ キャンサー・リサーチ、４８８６−４８９１（１９８６）；ショーバルら、８５ プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー．エス．エー．、８２７６−８２８０（１９８８）〕またはポリグルタミン酸〔ツカダら、７３ J. Natl. Canc. Inst. ７２１−７２９（１９８４）；カトーら、２７ ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、１６０２−１６０７（１９８４）；ツカダら、５２ Br. J. Cancer １１１−１１６（１９８５）〕のような中間のキャリアー分子を介して結合された。
【０００４】
リンカー技術の広範な進展が、上記のような免疫複合体の調製に利用され、開裂性及び非開裂性リンカーが詳細に検討された。しかしながら、多くの場合、薬物の最大細胞障害活性は、薬物分子が標的部位で非修飾形として複合体（conjugate)から放出された場合にのみ観察される。
【０００５】
抗体−薬物複合体の調製に用いられる開裂性リンカーの１つは、シス−アコニット酸に基づく酸開裂性リンカーであり、該リンカーはレセプターで介在されたエンドサイトーシス中に遭遇するエンドソームおよびリソソームのような異なる細胞内コンパートメントの酸性環境を利用できる。シェンおよびライサーは、この方法をダウノルビシンと高分子担体との複合体の調製に導入した（１０２ バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション １０４８−１０５４ （１９８１））。ヤングおよびライスフェルドは、同じ技術をダウノルビシンと−抗メラノーマ抗体との複合体に使用した（８０ J. Natl. Canc. Inst. １１５４−１１５９（１９８８））。ディルマンらも、ダウノルビシンと−抗Ｔ細胞抗体との複合体の調製に同様の方法で酸開裂性リンカーを使用した（４８ キャンサー・リサーチ、６０９７−６１０２（１９８８）。
【０００６】
もう１つのアプローチは、トロートらにより開拓され、ペプチドスペーサーアームを介してダウノルビシンを抗体と結合させることに関する〔７９ プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー．エス．エー．、６２６−６２９（１９８２）〕。この方法は、遊離の薬物がリソソームのペプチダーゼの作用により複合体から放出され得るという前提の下になされる。
【０００７】
しかしながら、インビトロでの細胞障害性試験では、抗体−薬物複合体はめったに遊離の非結合性薬物と同じ細胞障害活性を示すことはない。このことは、薬物分子が抗体から放出されるメカニズムは、非常に非効率的であることを示唆している。イムノトキシンの領域では、モノクローナル抗体と触媒的に作用するタンパク質トキシンの間のジスルフィド結合を介して形成される複合体は、他のリンカーを含有する複合体よりもより細胞障害性が強いことが示された。ランバートら、２６０ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１２０３５−１２０４１（１９８５）；ランバートら、イン・イミノトキシンズ、１７５−２０９（エー．フランケン編 １９８８）；ゲーテら、４８ キャンサー・リサーチ、２６１０−２６１７（１９８８）参照。これは、抗体分子とトキシンとの間のジスルフィド結合の効率的開裂に高い細胞内濃度を有するグルタチオンが寄与するからである。これにもかかわらず、薬物と高分子の間の複合体形成にジスルフィド結合を利用した例は、ごくわずかしか報告されていない。シェンらは、メトトレキセートをメルカプトエチルアミド誘導体に変換し、次いでジスルフィド結合を介してポリーＤ−リシンとの複合体とすることを記載している（２６０ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１０９０５−１０９０８（１９８５））。最近の報告は、３つのスルフィドを含有する細胞障害性薬物カリケアマイシンと抗体との複合体の調製を記載している（メネンデツら、フォース・インターナショナル・カンファレンス・オン・モノクローナル・アンチボディ・イムノコンジュゲーツ・フォー・キャンサー、サンジエゴ、アブストラクト８１（１９８９））。
【０００８】
ジスルフィド結合で連結された抗体−薬物複合体のない１つの理由は、薬物を抗体とジスルフィド結合を介して連結するのに容易に使用できる硫黄原子を含む基を有する細胞障害性薬物を利用できなかったことにある。さらに、現存する薬物の化学修飾は、細胞障害活性を減少することなく行うのは困難である。
【０００９】
現在の抗体−薬物複合体の他の主要な欠点は、標的抗原の数が限られていることおよびメトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンのような静ガン性薬物の比較的温和な細胞障害性のために、十分量の薬物を標的部位に送達することができないことによる。十分な細胞障害性を発揮させるために、数多くの薬物分子を直接に、または高分子担体分子を通して抗体と結合させることが必要になる。しかしながら、そのように高度に修飾された抗体は、標的抗原に対してしばしば不十分な結合性しか示さず、生体内で血流から急速に除去される。
【００１０】
ＣＣ−１０６５は、ストレプトマイセス・ゼレンシス（Streptomyces zelensis）の培養物から単離された強力な抗腫瘍抗生物質であり、インビトロで特に優れた細胞障害性を示す。
【００１１】
ＣＣ−１０６５（化合物１、Ｆｉｇ．１Ａ）の構造は、Ｘ線結晶解析によって決定された〔マーチン、ディー．ジー．ら、３３ ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス、９０２−９０３（１９８０）、およびチデスター、シー．ジー．ら、１０３ ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、７６２９−７６３５（１９８１）〕。ＣＣ−１０６５分子は、アミド結合によって連結された３つの置換されたピロロインドール部分からなる。“Ａ”サブユニットは、分子中の唯一の不斉炭素を含むシクロプロピル環を有する。一方、これら炭素の相対配置だけが、Ｘ線データから利用でき、絶対配置は、ＤＮＡをキラル試薬として用いることにより、３ｂＲ、４ａＳと推定されている（ハーレイ、エル．エイチ．ら、２２６ サイエンス、８４３−８４４（１９８４））。“Ｂ”および“Ｃ”サブユニットは、同一のピロロインドール部分である。
【００１２】
ＣＣ−１０６５の細胞障害活性は、ＣＣ−１０６５のアルキル化活性及びＤＮＡ−結合性またはＤＮＡ−インターカレート活性と相関する。２種の活性は、該分子の２つの分離した部分に帰属する。アルキル化活性は、ＣＰＩユニットＡ （シクロプロピルピロロインドール・ユニット）に含まれ、ＤＮＡ−結合性は、２つのサブユニットＢおよびＣに含まれる（Ｆｉｇ．１Ａ参照）。
【００１３】
ＣＣ−１０６５は、メトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンのような公知のガン化学療法剤よりも１００〜１０００倍細胞障害性が強い（ビー．ケイ．ブーヤンら、４２ キャンサー・リサーチ、３５３２−３５３７（１９８２））。しかしながら、マウスに対するＣＣ−１０６５の投与は、１２．５μｇ／ｋｇの単回静注後５０日で死に至る遅延性肝障害を引き起こす（ブイ．エル．レイノルズら、ＸＸＸＩＸ ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス、３１９−３３４（１９８６））。マウスに対する遅延性致死を起こすことなく親薬物のインビトロでの高い細胞障害性を保持したＣＣ−１０６５のいくつかの新規アナログ（Ｆｉｇ．１Ｂおよび１Ｃ参照）の合成が最近報告された（エム．エイ．ワーペホスキら、３１ ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８））。ＣＣ−１０６５のように、これらのアナログは、ＤＮＡと共有結合の様式で結合し、細胞死を引き起こすアルキル化剤である。これらの化合物は、Ｌ１２１０ネズミ白血病細胞の成長を、インビトロでのＩＣ50が１×１０-10 から１×１０-11 Ｍの範囲で抑制する。これら化合物のいくつかは、マウスの生体内でＰ３８８白血病に効果を示す。最も効果のあるアナログＵ−７３９７５（Ｆｉｇ．１Ｃ）は、１日目、５日目および９日目に最適用量０．０５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与することで、無処理のコントロールの生存期間を１７０％延長する。しかしながら、この用量では、６匹中の１匹の処理マウスが３０日を超えて生存したにすぎない。これらの薬物は、治療効果を発揮するのに必要な濃度での高い毒性のために、ごくわずかな治療価値しか持たない。
【００１４】
従って、ＣＣ−１０６５およびそのアナログの治療効率を改善し、該化合物の細胞障害性を保持しつつ全身に対する毒性を軽減する必要性が存在する。
【００１５】
【発明の開示】
本発明の目的は、細胞結合剤と共有結合することのできる、ＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体を提供することにある。該細胞結合剤複合体は、実質的にその細胞障害性を妨げることなく該アナログおよび誘導体を標的送達し、それにより非標的細胞への毒性を低下させ、従って全身毒性を低下させる。
【００１６】
上記の及び他の目的は、１または２以上のＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体を連結した細胞結合剤からなる細胞障害剤を提供することにより達成され、細胞結合剤に該アナログおよび誘導体を連結させる前に、該アナログおよび誘導体は、Ａサブユニットのピロール部分の２級アミノ基とＢ−サブユニットのＣ−２カルボキシル基とのアミド結合を介して、式（Ｆ−１）、（Ｆ−２）、（Ｆ−３）、（Ｆ−４）、（Ｆ−５）、（Ｆ−６）、（Ｆ−７）、（Ｆ−８）、（Ｆ−９）または（Ｆ−１０）のＢ−サブユニットまたはＢ−Ｃサブユニットと共有結合した式（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−３）または（Ａ−４）のＡサブユニットからなる群から選ばれ、
式（Ａ−１）から（Ａ−４）は以下に示すものであり、
【００１７】
【化１９】
【００１８】
及び、式（Ｆ−１）から（Ｆ−１０）は以下に示すもの、
【００１９】
【化２０】
【００２０】
【化２１】
【００２１】
〔式中、ＲおよびＲ´またはＲ4 のいずれかはＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との連結を可能にする基を示し；ＲまたはＲ´が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ1 からＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し；Ｒ4 が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ5 およびＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し、Ｒ´はＮＨ2 、アルキル基、Ｏ−アルキル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示す。〕
である。
【００２２】
本発明はまた、
（ａ）１または２以上の上記細胞障害剤の細胞障害量、および
（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤
を含む選択された細胞集団を殺す治療薬を提供するものである。
【００２３】
本発明の他の目的は、選択された細胞集団（cell population ）由来の細胞を含むと推測される細胞集団または組織を、細胞障害量の１または２以上の上記細胞障害剤と接触させることからなる選択された細胞集団を殺す方法を提供するものである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、Ａサブユニットのピロール部分の２級アミノ基とＢ−サブユニットのＣ−２カルボキシル基とのアミド結合を介して、式（Ｆ−１）、（Ｆ−２）、（Ｆ−３）、（Ｆ−４）、（Ｆ−５）、（Ｆ−６）、（Ｆ−７）、（Ｆ−８）、（Ｆ−９）または（Ｆ−１０）のＢ−サブユニットまたはＢ−Ｃサブユニットと共有結合した式（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−３）または（Ａ−４）のＡサブユニットからなる群から選ばれ、
式（Ａ−１）から（Ａ−４）は以下に示すものであり、
【００２５】
【化２２】
【００２６】
及び、式（Ｆ−１）から（Ｆ−１０）は以下に示すもの、
【００２７】
【化２３】
【００２８】
【化２４】
【００２９】
〔式中、ＲおよびＲ´またはＲ4 のいずれかはＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との連結を可能にする基を示し；ＲまたはＲ´が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ1 からＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し；Ｒ4 が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ5 およびＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し、Ｒ´はＮＨ2 、アルキル基、Ｏ−アルキル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示す。〕
であるＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体を提供することにある。
【００３０】
本発明者は、ＣＣ−１０６５およびそのアナログの治療効果が、薬物を腫瘍部位に標的送達することで生体内での分布を変更することにより改善し、その結果非標的組織への毒性を低下させ、全身に対する毒性も低下されることにを見出した。この目的を達成するため、本発明者は薬物のインドリルまたはベンゾフラニル末端部分のＣ−５位に置換基を有するチオール基またはジスルフィド基を含有する細胞障害薬２および３（Ｆｉｇ．１Ｂおよび１Ｃ）のアナログを合成した。これらの化合物は、親薬物の高い細胞障害性を保持しているだけでなく、ジスルフィド結合を介して細胞結合剤と結合することができる。本発明者は既に高い細胞障害性を有する薬物をジスルフィド結合のような開裂性の結合を用いて抗体と連結することで、細胞内で最大の活性を有する薬物を放出させ得ること、およびそのような複合体が抗原特異的な様式で細胞障害性を有することを示した（アール．ブイ．ジェイ．カリら、５２ キャンサー・リサーチ、１２７−１３１（１９９２）；ともに係属する米国特許出願第０７／４２６，２４７号）。本出願において、本発明者は、新規薬物アナログの合成、モノクローナル抗体との複合体形成の手順、これらの複合体のインビトロでの細胞障害性および特異性について記載する。本発明は、ＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体が、その活性を保持し、無差別な細胞障害性のいくつかをなくす。この様に、本発明は、最小の副作用を示しながら、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞（自己抗体を産生する細胞）、活性化細胞（移植片拒絶または移植片対宿主病に関連するもの）、または他の任意の病気のまたは異常な細胞型のような殺されまたは消化されるべき病気のまたは異常な細胞の除去に有用な薬剤を提供するものである。
【００３１】
この様に、本発明は、細胞結合剤と化学的に結合でき、親化合物ＣＣ−１０６５の高い細胞障害性を維持するＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体の合成を開示する。さらに、これらの化合物は、細胞結合剤と結合したとき、細胞結合剤が結合する細胞に対してのみ高い細胞障害性を有し、非特異的細胞には相当少ない障害性しか示さない。高い細胞障害性とは、インビトロで薬物に対し２４時間さらしたときのＳＷ２細胞について測定したＩＣ50が約１０-9Ｍ以下であることで定義される。親化合物は、これらの条件下で２×１０-10 ＭのＩＣ50を示す。
【００３２】
細胞障害剤
本発明の細胞障害剤は、細胞結合剤と結合した１または２以上のＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体を含む。
【００３３】
本発明によると、ＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体は、ＡサブユニットＣＰＩ（シクロプロパピロロインドール ユニット）を天然の閉環したシクロプロピル形態または開環したクロロメチルの形態で含むか、または密接に関連したＣＢＩユニット（シクロプロピルベンズインドール ユニット）を天然の閉環したシクロプロピル形態または開環したクロロメチルの形態で含む必要がある。ＣＣ−１０６５のＢおよびＣサブユニットは、非常に類似しており、いずれも２−カルボキシ−インドール誘導体である。ＣＣ−１０６５のアナログは、活性発現のために２−カルボキシ−インドールサブユニットまたは２−カルボキシ−ベンゾフランサブユニットの少なくとも１種を必要とするが、２つのサブユニットを含む（即ち、ＢおよびＣ）ほうがより強力なアナログである。天然のＣＣ−１０６５および刊行物に記載されたアナログ（例えば、ワーペホスキら、３１ ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８））から明らかなように、ＢおよびＣサブユニットは、インドールまたはベンゾフラン環の異なる位置に、異なる置換基を有することもできる。
【００３４】
ＣＣ−１０６５と細胞結合剤を連結するために、ＣＣ−１０６５は最初に、ジスルフィド結合、酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基またはエステラーゼ−開裂性基を介して細胞結合剤と連結し得る誘導体となるような基（moiety）を含むように誘導体化しなければならない。該アナログは、ジスルフィド結合、酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基またはエステラーゼ−開裂性基を介して該アナログを細胞結合剤と連結するのに必要な基をすでに含有するように調製される。
【００３５】
より詳しくは、本発明によれば、ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、Ａサブユニットのピロール部分の２級アミノ基と、式（Ｆ−１）〜（Ｆ−１０）を有する以下のＢまたは共有結合したＢ及びＣサブユニットのＣ−２カルボキシル基とのアミド結合を介して共有結合した式（Ａ−１）〔ＣＰＩ（シクロプロピル型）〕、（Ａ−２）〔ＣＰＩ（クロロメチル型）〕、（Ａ−３）〔ＣＢＩ（シクロプロピル型）〕および（Ａ−４）〔ＣＢＩ（クロロメチル型）〕の以下の任意のＡサブユニットである。
【００３６】
Ａサブユニット
【００３７】
【化２５】
【００３８】
Ｂまたは共有結合したＢ及びＣサブユニット
【００３９】
【化２６】
【００４０】
【化２７】
【００４１】
〔式中、ＲおよびＲ´またはＲ4 のいずれかはＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との連結を可能にする基を示し；ＲまたはＲ´が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ1 からＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し；Ｒ4 が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ5 およびＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し、Ｒ´はＮＨ2 、アルキル基、Ｏ−アルキル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示す。〕。
【００４２】
１級アミノ基の例としては、メチルアミン、エチルアミンおよびイソプロピルアミンが挙げられる。
【００４３】
２級アミノ基の例としては、ジメチルアミン、ジエチルアミンおよびエチルプロピルアミンが挙げられる。
【００４４】
３級アミノ基の例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびエチルイソプロピルメチルアミンが挙げられる。
【００４５】
アミド基の例としては、Ｎ−メチル−アセトアミド、Ｎ−メチル−プロピオンアミド、Ｎ−アセトアミドおよびＮ−プロピオンアミドが挙げられる。
【００４６】
Ｒ´で示されるアルキル基としては、Ｒ´が連結基（linking group ）でないときには、Ｃ1 〜Ｃ5 の直鎖または分枝を有するアルキル基が挙げられる。
【００４７】
Ｒ´で示されるＯ−アルキル基としては、Ｒ´が連結基でないときには、アルキル基の部分がＣ1 〜Ｃ5 の直鎖または分枝を有するアルキル基である化合物が挙げられる。
【００４８】
好ましい実施態様としては、Ｒ1 〜Ｒ6 はすべて水素原子であり、ＲおよびＲ´はＣＣ−１０６５の誘導体またはＣＣ−１０６５のアナログの誘導体がジスルフィド結合を介して細胞結合剤と連結し得る基を示す。
【００４９】
特に好ましい実施態様としては、ＲまたはＲ4 がＮＨＣＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨＣＯＣ6 Ｈ4 （ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、およびＲ´が（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 〔式中、Ｚ0 は、ＨまたはＳＲ7 を示し、Ｒ7 はメチル基、直鎖アルキル基、分枝を有するアルキル基、環状アルキル基、無置換または置換されたアリール基、または複素環を示し、ｌは１〜１０の整数を示す。〕である。
【００５０】
Ｒ7 で示される直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基およびヘキシル基が挙げられる。
【００５１】
Ｒ7 で示される分枝を有するアルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基および１−エチルプロピル基が挙げられる。
【００５２】
Ｒ7 で示される環状アルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が挙げられる。
【００５３】
Ｒ7 で示される無置換アリール基としては、フェニル基およびナフチル基が挙げられる。
【００５４】
Ｒ7 で示される置換されたアリール基としては、アルキル基、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆなどのハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、カルボン酸基、ヒドロキシ基またはアルコキシ基で置換されたフェニル基およびナフチル基などのアリール基が挙げられる。
【００５５】
Ｒ7 で示される複素環としては、ヘテロ原子がＯ、ＮおよびＳから選ばれた化合物であり、例えば、フリル基、ピロリル基、ピリジル基およびチオフェンが挙げられる。
【００５６】
本発明のジスルフィド基を含有した、およびメルカプト基を含有したＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体は、インビトロで種々の望ましくない細胞系の増殖を抑制する能力で評価することができる。例えば、ヒト類表皮カルチノーマ系ＫＢ、ヒト胸腫瘍系ＳＫＢＲ３、およびバーキットリンパ腫系ナマルワ（Namalwa ）のような細胞系をこれら化合物の細胞障害性の評価に使用することができる。評価されるべき細胞は、該化合物に２４時間さらし、生存している細胞のフラクションが公知の方法による直接試験で測定される。ＩＣ50値は、次いで、試験結果から計算される。
【００５７】
モノインドリルＣＣ−１０６５アナログ６、インドリル−ベンゾフラニル−ＣＰＩ化合物１８およびビス−インドリルＣＰＩ誘導体２２のヒトガン細胞系に対するインビトロでの細胞障害性が、測定された。その結果、モノインドリル化合物６は、異なる細胞系試験（ＳＷ２、ナマルワおよびＡ−３７５）に対しＩＣ50値が２．０−７．０×１０-10 Ｍの間であった。ＣＰＩ誘導体１８は、ヒト小細胞（small cell）肺ガン細胞系ＳＷ２およびヒトバーキットリンパ腫細胞系ナマルワに対して高度に細胞障害性であり、薬物に２４時間さらした後のＩＣ50値は各々５×１０-12 Ｍおよび１×１０-11 Ｍであった。ビス−インドリルＣＰＩ誘導体２２も非常に細胞障害性であり、ＳＷ２細胞に対するＩＣ50値は４×１０-11 Ｍであった。
【００５８】
上記のＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体は、天然物からの単離、引き続く修飾、合成的調製またはこれらの組み合わせを含む公知の方法により調製できる。
【００５９】
代表的な合成例を、以下に記載する
合成例１
Ｂサブユニットのインドール基のＣ−５位の側鎖上にチオール置換基を有するモノ−インドリルＣＣ−１０６５アナログ７の合成は、スキーム１（Ｆｉｇ．２）に略記される。フェニルジチオプロピオン酸４をトリエチルアミンの存在下にイソブチルクロロホルメートと処理して混合酸無水物を得、次いで５−アミノインドール−２−カルボン酸と反応させて、アミド５を得る。アミド５とＣＰＩのカップリングは、上記のようにエチル−ジアミノプロピル−カルボジイミド（ＥＤＣ）〔エム．エイ．ワーペホスキら、３１ ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８）〕の存在下に行い、フェニルジチオ基を含有するＣＰＩ誘導体６を得た。該誘導体６のチオール含有誘導体７への還元は、４℃で１．１当量のジチオスレイトールの存在下で円滑に進行した。該反応は、１時間で完結したと判断され、生成物は、逆相Ｃ−１８カラムを用いるＨＰＬＣにより精製された。
【００６０】
合成例２
活性化されたジスルフィド基を有するインドリル−ベンゾフラニル−ＣＰＩ誘導体１８の調製の合成工程は、スキーム２および３（Ｆｉｇ．３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）に略記される。ｔｅｒｔ−ブチル５−アミノインドール−２−カルボキシレート１０は、エチル５−ニトロインドール−２−カルボキシレート８から調製された（スキーム２ａ；Ｆｉｇ．３Ａ）。５−（２´−ピリジル−ジチオ−メチル）ベンゾフラン−２−カルボン酸１５は、５−メチルベンゾフラン−２−カルボン酸１１から調製された（スキーム２ｂ；Ｆｉｇ．３Ｂ）。カルボン酸１１は、ｔｅｒｔ−ブチルエステルに変換され、次いでベンジル位をＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）でブロム化されてモノブロモメチル化合物１２を得た。臭素をチオ酢酸により置換し、次いで水素化ホウ素ナトリウムで還元して、遊離のチオール基を２−ピリジルジスルフィドと反応させてエステル１４を得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステルのトリフルオロ酢酸での加水分解は０℃で円滑に進行して化合物１５を得た。化合物１５のｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノインドール−２−カルボキシレート１０とのカップリングは、ジシクロヘキシルカルボジイミド／４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＣＣ／ＤＭＡＰ）またはカルボニルジイミダゾールを用いて行われ、インドリル−ベンゾフラニル化合物１６を得た。
ｔｅｒｔ−ブチルエステルを加水分解してカルボン酸１７を得、次いでＣＰＩとＥＤＣの存在下にカップリングして薬物１８を得た（スキーム２ｃ；Ｆｉｇ．３Ｃ）。
【００６１】
合成例３
チオール含有ビス−インドリルＣＰＩ誘導体２２は、スキーム３（Ｆｉｇ．４）に略記される工程により合成された。フェニルジチオプロピオン酸４をイソブチルクロロホルメートで活性化し、次いでｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノインドール−２−カルボキシレート１０と反応させてエステル１９を得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステルをトリフルオロ酢酸で加水分解し、次いでＤＣＣの存在下にもう１分子の化合物１０とカップリングして、ビス−インドリルエステル２０を得た。再度エステル２０を加水分解し、次いでＣＰＩとカップリングして、薬物２１を得た。フェニルジチオ保護基のジチオスレイトールによる開裂は、０℃でモノ−インドリル−ＣＰＩ化合物６のジスルフィド基の還元のために用いた上記の条件と同じ条件で行い、チオール含有薬物２２を得た。
【００６２】
連結基（ linking group)
上記合成例で記載されたものの他の連結基も、本発明のＣＣ−１０６５の誘導体またはＣＣ−１０６５のアナログの調製に使用できる。
【００６３】
好ましい連結基は、当該分野で良く知られており、それは、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基およびエステラーゼ−開裂性基が挙げられ、好ましくはジスルフィド基である。
【００６４】
本発明によれば、連結基は上記の常法により、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５のアナログと共有結合する化学基の一部である。該化学基は、末端のインドールまたはベンゾフラン基のＣ−４またはＣ−５位で、アルキル基、アミノ基、アミド結合またはエーテル結合を介してＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５のアナログと共有結合できる。好ましい実施態様において、該化学基はＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５のアナログと、末端のインドールまたはベンゾフラン基のＣ−５位に、メチレン基（ＣＨ2 ）またはアミド基（ＮＨＣＯＣＨ2 ＣＨ2 ）基を介して共有結合できる。
【００６５】
細胞結合剤の調製
治療剤としての本発明の化合物の効果は、適当な細胞結合剤の注意深い選択に依存する。細胞結合剤は、現在知られまたは知られるようになるペプチドおよび非ペプチドを含む任意のもので良い。一般に、これらは、抗体（特にモノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、栄養物−輸送因子（たとえばトランスフェリン）または他の任意の細胞結合分子または物質で良い。
【００６６】
細胞結合剤のより詳しい例は、以下のものを含む。
【００６７】
− モノクローナル抗体；
− 単一鎖抗体（single chain antibody ）；
− Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）2 およびＦV のような抗体フラグメント（パーハム、１３１ ジャーナル・オブ・イムノロジー、２８９５−２９０２ （１９８３）；スプリングら、１１３ ジャーナル・オブ・イムノロジー、４７０−４７８（１９７４）；ニソノフら、８９ Arch. Biochem. Biophys. 、２３０−２４４（１９６０）；
− インターフェロン（例えば、α、β、γ）；
− ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６のようなリンホカイン；
− インシュリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、アンドロゲンおよびエストロゲンのようなステロイドホルモン等のホルモン類；
− ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ〔バーゲス、５ イムノロジー・トゥデイ、１５５−１５８（１９８４）〕；及び
− トランスフェリン〔オケフら、２６０ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、９３２−９３７（１９８５）〕。
【００６８】
モノクローナル抗体の技術により、特異的なモノクローナル抗体の形態で高度に特異的な細胞結合剤を製造することができる。マウス、ラット、ハムスターまたは他の任意の哺乳動物を無傷標的細胞、標的細胞からから単離された抗原、ウイルス全体（whole virus ）、弱毒化したウイルス全体およびウイルスコート蛋白質のようなウイルス蛋白質等の関連する抗原で免疫化することにより産生される、モノクローナル抗体の製造技術が、当該分野で特によく知られている。
【００６９】
適当な細胞結合剤の選択は、標的化される特別な細胞集団に依存する選択の問題であるが、一般には、適当なものが利用できるのであれば、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７０】
例えば、モノクローナル抗体Ｊ５は、コモン・アキュート・リンホブラスティック・ロイケミア・アンチゲン（Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen ）（ＣＡＬＬＡ）〔リッツら、２８３ ネイチャー ５８３−５８５（１９８０）〕に特異的に結合するマウスＩｇＧ2a抗体であり、もし標的細胞が急性リンパ芽球性白血病の疾患のようにＣＡＬＬＡを発現するときには使用できる。同様に、モノクローナル抗体、抗−Ｂ４はマウスＩｇＧ1 であり、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合し（ナドラーら、１３１ ジャーナル・オブ・イムノロジー、２４４−２５０（１９８３））、もし標的細胞がＢ細胞、または非ホジキンリンホーマ（non-Hodgkin's lymphoma) または慢性リンパ芽球性白血病のようなこの抗原を発現する病気の細胞であれば使用できる。
【００７１】
さらに、骨髄性細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病由来の病気の細胞に対する細胞結合剤として使用できる。活性化されたＴ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶を阻止し、移植片対宿主疾患の治療及び予防し、および急性Ｔ−細胞白血病を治療するのに使用できる。メラニン細胞に結合するＭＳＨは、メラノーマの治療に使用できる。
【００７２】
胸および精巣のガンは、エストロゲン（またはエストロゲンアナログ）またはアンドロゲン（またはアンドロゲンアナログ）を細胞結合剤として各々使用して、好ましく標的化できる。
【００７３】
細胞障害剤（複合体）の調製
本発明のＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体と細胞結合剤との複合体は、現在知られており、または将来開発される任意の技術を用いて形成できる。ＣＰＩまたはＣＢＩと結合したインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニル、またはベンゾフラニル−インドリル誘導体は、遊離のアミノ基（例えば化合物１０で出発する）を含むように調製でき、次いで酸開裂性リンカーまたは光開裂性リンカーを介して抗体または他の細胞結合剤と結合される。細胞障害性の化合物は、ペプチドと縮合され、次いで細胞結合剤と連結されてペプチダーゼ開裂性リンカーを製造することができる。細胞障害性の化合物は、１級ヒドロキシル基（例えば化合物１２で出発する）を有するように調製でき、該１級ヒドロキシル基はスクシニル化され、細胞結合剤と連結されて、細胞内エステラーゼで開裂されて遊離の薬物を放出する複合体を製造することができる。最も好ましくは、細胞障害性化合物は、遊離のまたは保護されたチオール基を付与するように処理され、次いで１または多数のジスルフィドまたはチオール含有誘導体が、ジスルフィド結合を介して細胞結合剤と共有結合的に連結される。
【００７４】
本発明の代表的な複合体は、ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と抗体、抗体フラグメント、表皮成長因子（ＥＧＦ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エストロゲン、エストロゲンアナログ、アンドロゲンおよびアンドロゲンアナログとの複合体である。
【００７５】
ＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体と細胞結合剤の種々の複合体製造の代表例が、以下に記載される。
【００７６】
ジスルフィドリンカー
小細胞肺ガン細胞（small cell lung cancer cells）〔ジェイ．ディー．グリフィン、ティー．ハーセンド、アール．ベバリッジ アンド エス．エフ．シュロスマン、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３０：２９４７（１９８３）〕の表面に発現されるＣＤ−５６抗原に結合する抗体Ｎ９０１が、複合体の調製に用いられた。抗体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−ピリジルジチオプロピオネートを用いて上記のように修飾し〔ジェイ．カールソン、エイチ．ドレビン アンド アール アクセン、Biochem. J. 、１７３：７２３（１９７８）〕、抗体１分子当たり平均して４つのピリジルジチオ基を導入した。修飾された抗体は、チオール含有ＣＣ−１０６５アナログ７と反応させてジスルフィド結合で連結した複合体を製造した。結合された薬物分子の数は、抗体分子に導入されたピリジルジチオ基と非常に近いものであった。ビス−インドリル−ＣＰＩ薬物２０は、同様に抗体との複合体とされた（方法Ａ、Ｆｉｇ．５Ａ参照）。
【００７７】
活性化されたジスルフィド含有インドリル−ベンゾフラニルＣＰＩ誘導体１８（Ｆｉｇ．３Ｃ）の複合体を調製するために、抗体を以前に記載されているように〔ジェイ．エム．ランバートら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６０；１２０３５（１９８５）〕２−イミノチオランで修飾し、抗体１分子当たり平均して４〜６のスルフヒドリル基を導入した。薬物１８との反応により、抗体１分子当たり平均して３〜４分子の薬物を含む複合体を製造した （方法Ｂ、Ｆｉｇ．５Ｂ参照）。
【００７８】
酸−開裂性リンカー
ＣＰＩは、末端のインドリルまたはベンゾフラニル部分のＣ−５位に保護アミノ基を含有する置換基を有するインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニル、またはベンゾフラニル−インドリル誘導体と結合できる。保護基は、温和な酸性条件下で開裂し、遊離のアミノ基を生じることのできるｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはビフェニルプロピルオキシカルボニルなどの官能基が挙げられる。このアミノ基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、上記のように酸−開裂性リンカーを介して抗体または他の細胞結合剤と連結できる〔ダブリュー．エイ．ブラッターら、バイオケミストリー ２４、１５１７−１５２４（１９８５）；米国特許第４，５４２，２２５， ４，５６９，７８９， ４，６１８，４９２， ４，７６４，３６８〕。
【００７９】
同様に、ＣＰＩは、末端のインドリルまたはベンゾフラニル部分のＣ−５位に保護ヒドラジド基を含有する置換基を有するインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニル、またはベンゾフラニル−インドリル誘導体と結合できる。保護基はまた、温和な酸性条件下で開裂し、遊離のヒドラジド基を生じることのできるｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはビフェニルプロピルオキシカルボニルなどの官能基が挙げられる。
このヒドラジド基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、酸−開裂性ヒドラゾンリンカーを介して抗体または他の細胞結合剤の炭水化物部分と連結できる〔ヒドラゾンリンカーの例としては、ビー．シー．ラグザら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、３２、５４８−５５５（１９８９）；アール．エス．グリーンフィールドら、キャンサー・リサーチ、５０、６６００−６６０７（１９９０）参照〕。
【００８０】
光−開裂性リンカー
前記のアミノ基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、上記のように光開裂性リンカーを介して抗体または他の細胞結合剤と連結できる〔ピー．センターら、フォトケミストリー・アンド・フォトバイオロジー、４２、２３１−２３７（１９８５）；米国特許第４，６２５，０１４号〕。
【００８１】
ペプチダーゼ−開裂性リンカー
前記のアミノ基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体もまた、ペプチドスペーサーを介して細胞結合剤と連結できる。薬物と高分子量タンパク質担体の間の短いペプチドスペーサーは血清中では安定であるが細胞内ペプチダーゼにより容易に加水分解されることがすでに示されている〔エー．トロウトら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ、７９、６２６−６２９（１９８２）〕。アミノ基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、およびＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕなどのペプチドと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ（ＥＤＣ−ＨＣｌ）などの縮合剤の存在下に縮合させて細胞結合剤と連結したペプチド誘導体を得ることができる。
【００８２】
エステラーゼ−開裂性リンカー
ＣＰＩは、末端のインドリルまたはベンゾフラニル部分のＣ−５位にヒドロキシアルキル基を含有する置換基を有するインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニルまたはベンゾフラニル−インドリル誘導体と結合できる。このＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、コハク酸無水物でスクシニル化し、次いで細胞結合剤と連結することにより、細胞内エステラーゼで加水分解されて遊離の薬物を放出する複合体を製造できる〔例えば、イー．アボウド−ピラクら、Biochem. Pharmacol., ３８、６４１−６４８（１９８９）〕。
【００８３】
上記方法により製造された複合体は、標準的なカラムクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣにより精製される。
【００８４】
モノクローナル抗体または細胞結合剤とＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の間の複合体は、好ましくは、上記のようにジスルフィド結合を介して連結され、ＣＣ−１０６５またはそのアナログを送達できるものである。そのような細胞結合性複合体は、モノクローナル抗体をスクシンイミジルピリジル−ジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）で修飾するような公知の方法により調製される〔カールソンら、１７３ Biochem. J., ７２３−７３７（１９７８）〕。得られたチオピリジル基は、次いでチオール基を含有するＣＣ−１０６５またはそのアナログで処理することにより置換され、ジスルフィドで連結された複合体を得る。または、アリルジチオ−ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の場合には、細胞結合性複合体の形成は、ＣＣ−１０６５誘導体のアリル−チオール基を、抗体分子にあらかじめ導入されていたスルフヒドリル基で直接置換することにより行われる。ジスルフィド結合を介して連結された１〜１０個のＣＣ−１０６５薬物を含む複合体は、いずれかの方法により容易に調製される。
【００８５】
より詳しくは、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液 （ｐＨ７．０）中のジチオピリジル基で修飾された抗体の１ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を、チオール含有ＣＣ−１０６５またはそのアナログ（１．２５モル当量／ジチオピリジル基）と処理する。修飾された抗体からのチオピリジンの放出は、３４３ｎｍで分光学的にモニターされ、約３０分で完結する。抗体−ＣＣ−１０６５複合体は、未反応の薬物及び他の低分子量物質をセファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過により除去して精製する。抗体分子当たりに結合するＣＣ−１０６５分子またはＣＣ−１０６５アナログ分子の数は、２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比率を測定することにより決定される。平均１〜１０個のＣＣ−１０６５分子またはそのアナログ／抗体分子が、この方法によりジスルフィド結合を介して連結できる。
【００８６】
非開裂的に連結された抗体とＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の複合体を調製することもできる。該抗体は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳまたはスクシンイミジル−ヨードアセテートのような架橋試薬を用い、文献の記載に従い修飾し、１〜１０個の反応性基を導入する。ヨシタケら、１０１ ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、３９５−３９９（１９７９）；ハシダら、J. Applied. Biochem., ５６−６３（１９８４）；およびリウら、１８ バイオケミストリー、６９０−６９７（１９７９）参照。修飾された抗体は、次いでＣＣ−１０６５のチオール含有アナログまたは誘導体と反応させ、複合体を調製する。該複合体は、セファデックスＧ−２５を通すゲル濾過により精製する。
【００８７】
修飾された抗体は、チオール含有ＣＣ−１０６５（１．２５モル当量／マレイミド基））と処理する。該混合物は、約１時間、約４℃でインキュベートする。
抗体とＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の複合体は、セファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過により精製する。典型的には、平均１〜１０個のＣＣ−１０６５分子またはアナログ／抗体が、連結される。
【００８８】
好ましい方法は、抗体をスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で修飾してマレイミド基を導入し、次いで修飾された抗体を、チオール基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体で修飾し、チオエーテル基で連結された複合体を得る。抗体分子当たり１〜１０の薬物分子を有する複合体になる。
【００８９】
細胞結合剤とＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の複合体のインビトロでの細胞障害性
ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体並びにその細胞結合剤との複合体の、ナマウラおよびＳＷ２のような非粘着細胞系に対する細胞障害性は、ゴールドマッヒャーら、１３５ ジャーナル・オブ・イムノロジー、３６４８−３６５１ （１９８５）の記載のような細胞増殖の逆−外挿（back-extrapolation）により測定される。これらの化合物のＡ−３７５やＳＣａＢＥＲのような粘着細胞系に対する細胞障害性は、ゴールドマッヒャーら、１０２ J. Cell Biol., １３１２−１３１９（１９８６）に記載されたようなクローン原性試験（clonogenic assay）により測定される。
【００９０】
選択された細胞集団を殺す治療剤及び方法
本発明はまた、以下のものからなる選択された細胞集団を殺す治療剤も提供する：
（ａ）細胞結合剤と結合した１または２以上の上記ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の細胞障害量、および
（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤。
【００９１】
同様に、本発明は、選択された細胞集団からの細胞を含むと推測される細胞集団または組織を細胞結合剤と結合した１または２以上の上記ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体からなる細胞障害剤の細胞障害量と接触させることからなる選択された細胞集団を殺す方法を提供するものである。
【００９２】
該細胞障害剤は、上記のようにして調製される。
【００９３】
好ましい薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床的位置付けを保証するよう当業者が決定できる。
【００９４】
好ましい担体、希釈剤および／または賦形剤の例としては、（１）ヒト血清アルブミンを約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌを含むドゥルベコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、（２）０．９％生理食塩水（０．９％Ｗ／Ｖ ＮａＣｌ），および（３）５％（Ｗ／Ｖ）デキストロースが挙げられる。
【００９５】
選択された細胞集団を殺す方法は、インビトロ、インビボまたはイクスビボ （ex vivo ）で実施される。
【００９６】
インビトロでの使用例としては、標的抗原を発現しない目的とするバリアント（variant ）を除くすべての細胞殺すため；または望ましくない抗原を発現するバリアントを殺すために細胞培養物を処理することが挙げられる。
【００９７】
インビトロでの使用の非臨床的条件は、当業者により容易に決定される。
【００９８】
イクスビボでの使用例としては、病気のまたは悪性の細胞を殺すために、同じ患者への移植に先立ち自己骨髄を処理すること：コンピテントＴ細胞を殺し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するために、該移植の前に骨髄を処理することが挙げられる。
【００９９】
ガン治療または自己免疫疾患の治療において、自己移植の前に骨髄から腫瘍細胞またはリンパ系細胞を除去するため、またはＧＶＨＤを防止するために移植の前に同種間（allogeneic）骨髄または組織からＴ細胞または他のリンパ系細胞を除去するため、処理が以下のようにしてなされる。骨髄は、患者または他の個人から集められ、次いで本発明の細胞障害剤を約１０μＭ〜１ｐＭの範囲の濃度で加えた血清を含む培地を約３０分〜約４８時間、約３７℃でインキュベートされる。インキュベーションの正確な濃度及び時間条件（＝用量(dose)）は、当業者により容易に決定される。インキュベーションの後、骨髄細胞は血清を含む培地で洗浄され、公知の方法に従い静脈注入により患者に戻される。患者が、骨髄を採取してから処理された細胞を再注入するまでに間に切除的化学療法（ablative chemotherapy ）または全身照射のコースのような他の治療を受けている環境下では、処理された骨髄は標準的な医療器具を用い、液体窒素で凍結して保存される。
【０１００】
臨床的なインビボの使用では、本発明の細胞障害剤は、無菌性（sterility ）およびエンドトキシン レベルが試験された溶液として、あるいは注射用滅菌水に溶解できる凍結乾燥固体として供給できる。複合体投与の好ましいプロトコールの例を、以下に示す。複合体は、静注ボーラス（i.v. bolus）として毎日５日間投与するか、５日間持続的に注入するなどの方法で、５日間毎日投与される。
ボーラスの用量は、ヒト血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンの濃縮溶液の０．５〜１ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）が添加された通常生理食塩水（normal saline ）の５０〜１００ｍＬを投与される。持続注入の場合には、２４時間当たり、ヒト血清アルブミンの上記濃縮溶液の２．５〜５ｍＬが添加された２５０〜５００ｍＬの通常生理食塩水が投与される。投与量は、静注で１日当たり１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である（１日当たり１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲）。治療の１〜４週間後に、患者は第２コースの治療を受ける。投与経路、賦形剤、希釈剤、用量、時間などに関する特別な臨床的プロトコールは、臨床立場を保証するように当業者により決定される。
【０１０１】
選択された細胞集団を殺すインビボまたはイクスビボの方法に従い処理できる医学的条件の例としては、肺ガン、乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、腎臓ガン、すい臓ガン、卵巣ガンおよびリンパガンなどの任意の型のガン、メラノーマ、自己免疫疾患、慢性関節リウマチなどの全身性狼瘡、および多発性硬化症、腎臓移植片拒絶、肝臓移植片拒絶、肺移植片拒絶、心臓移植片拒絶および骨髄移植片拒絶などの移植片拒絶（transplant rejection）、移植片対宿主病、ＣＭＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなどのウイルス感染、細菌感染、ジアルジア鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症などの寄生虫感染および当業者により決定されるその他のものが挙げられる。
【０１０２】
【実施例】
本発明は、非限定的な実施例を参照して例示される。特に言及しない限り、すべてのパーセント、比率、部などは重量による。
【０１０３】
物質及び方法
融点は、電熱装置を用いて測定され、補正はされていない。ＮＭＲスペクトルは、Hitachi 1100 連続波長（６０ＭＨｚ）装置またはBruker AM300 （３００ＭＨｚ）分光計で記録した。ケミカルシフトは、内部標準としてのＴＭＳに対する相対的なｐｐｍで記録する。紫外線スペクトルは、Hitachi U1200 分光計で記録した。ＨＰＬＣは、Gilsonの可変波長検出器およびWaters Radialpak 逆相Ｃ−１８カラムを備えたRainin HPLC システムを用いて行われた。薄層クロマトグラフィーは、Analtech GF シリカゲルＴＬＣプレート上で行われた。フラッシュカラムクロマトグラフィー用のシリカゲルは、Baker から得た。テトラヒドロフランは、リチウムアルミニウムヒドリドを用いて蒸留することにより乾燥した。ジメチルアセトアミドおよびジメチルホルムアミドは、減圧下にカルシウムヒドリド上で蒸留することにより乾燥した。使用した他のすべての溶媒は、試薬級またはＨＰＬＣ級であった。
【０１０４】
ヒト小細胞肺ガン細胞系ＳＷ２は、ダナ−ファーバー・キャンサー・インスティテュート（Dana-Farber Cancer Institute）から得た。ヒトガン細胞系ナマルワ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ １４３２）、Ａ−３７５（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ １６１９）、およびＳＣａＢＥＲ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ベテスダ、エムディー（Bethesda、MD）から各々得た。
【０１０５】
実施例１
モノインドリルＣＣ−１０６５アナログ７の合成
モノインドリルＣＣ−１０６５アナログ７は、Ｆｉｇ．２に示されたスキーム１に従い合成された。
【０１０６】
３−（フェニルジチオ）プロピオン酸（４）
ジフェニルジスルフィド（９．３３ｇ、４２．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解し、３−メルカプトプロピオン酸（１．５１ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍＬ）溶液および１０Ｍ ＮａＯＨ（１．４ｍＬ）溶液で順に処理した。反応混合物を窒素雰囲気下に室温で３時間撹拌した。次いで溶液を減圧下に留去し、白色の残渣を酢酸エチルに再溶解し、シリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物は、５％酢酸を含有する酢酸エチル：ヘキサンで溶出し、化合物４を白色固体として得た（１．８２ｇ、６０％）、融点５８〜５９℃。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ２．５−３．０（ｍ，４Ｈ）、７．１−７．６（ｍ，５Ｈ）および１０．８（ｓ，１Ｈ）。
【０１０７】
５−〔３−（フェニルジチオ）プロピオニルアミノ〕−インドール−２−カルボン酸（５）
化合物４（５３５ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を、アルゴン雰囲気下に−２３℃に冷却した。トリエチルアミン（２５３ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）およびイソブチルクロロホルメート（３４０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。５−アミノ−インドール−２−カルボン酸〔エム．エイ．ワーペホスキら、３１、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８）；およびエス．エム．パーメーターら、８０、J. Med. Chem. Soc., ４６２１（１９５８）〕（５４５ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を加え、反応混合物を室温まで暖め、さらに４５分間撹拌した。次いで、沈殿を濾過により除去し、濾液を減圧下に留去し、褐色の残渣を得た。５％酢酸を含有する酢酸エチル：ヘキサンで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、褐色生成物として化合物４を得た（１８５ｍｇ、２０％）。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ ２．２７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、３．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、７．００（ｓ，１Ｈ）、７．１−７．７（ｍ，８Ｈ）、７．９８（ｓ，１Ｈ）、９．９２（ｓ，１Ｈ）、１１．６２（ｓ，１Ｈ）。
【０１０８】
モノ−インドリルＣＣ−１０６５アナログ６
ＣＰＩをカルボン酸５と結合し、生成物を上記のようにして精製した〔エム．エイ．ワーペホスキら、３１、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８）〕。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ ２．４２（ｓ，３Ｈ）、２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、３．１５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、３．５０−３．６５（ｍ，１Ｈ）、３．８５−４．２０（ｍ，２Ｈ）、４．５０−４．８５（ｍ，２Ｈ）、７．００−８．９５（ｍ，１１Ｈ）、８．１６（ｓ，１Ｈ）、９．１７（ｓ，１Ｈ）、９．９３（ｓ，１Ｈ）、１０．７５（ｓ，１Ｈ）。
【０１０９】
モノ−インドリルＣＣ−１０６５アナログ７
ジスルフィド６（１．４μｍｏｌ）の試料をアセトニトリル（０．２６ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下に４℃に冷却した。ジチオスレイトール（１．５μｍｏｌ）の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（０．０６ｍＬ，ｐＨ７．５）を加え、反応の進行（１時間で完結する）をWaters radialpak 逆相Ｃ−１８カラムを用い、アセトニトリル：水（５０％ＣＨ3 ＣＮ ０−８分、５０−１００％ＣＨ3 ＣＮ ８−１２分；流速＝１．５ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出するＨＰＬＣによりモニターした。出発物質６は、保持時間が１２．３分であったが、生成物７は５．７分で溶出した。生成物７のチオール含量は、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ´ｓ）比色試験を用いて測定し、分光学的に測定した薬物濃度と正確に比例した。
【０１１０】
実施例２
インドリル−ベンゾフラニルＣＣ−１０６５アナログ１８の合成
インドリル−ベンゾフラニルＣＣ−１０６５アナログ１８は、Ｆｉｇ．３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示されたスキーム２ａ、２ｂおよび２ｃに従い合成された。
【０１１１】
ｔ−ブチル ５−ニトロインドール−２−カルボキシレート（９）
エチル ５−ニトロインドール−２−カルボキシレート（８）（４．３ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ−メタノール（１：１、ｖ／ｖ）（１００ｍＬ）撹拌溶液に、アルゴン下に室温でＮａＯＨ（１２ｇ，３００ｍｍｏｌ）の水（３００ｍＬ）溶液を加えた。得られた深い赤−褐色の溶液を３時間撹拌し、希塩酸でｐＨ１まで酸性化して反応を停止した。析出した生成物を吸引濾過で集め、溶解したままの生成物をＴＨＦ：酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）で抽出した。沈殿をＴＨＦに溶かし、この溶液を抽出からの有機層と合わせた。硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して５−ニトロインドール−２−カルボン酸（３．６ｇ、収率９０％）を淡褐色固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ ７．０−９．０（ｍ，４Ｈ）、δ ９．５（ｓ，１Ｈ）、δ １２．５（ｓ，１Ｈ）。５−ニトロインドール−２−カルボン酸（３．１ｇ、１５ｍｍｏｌ）の１５０ｍＬ ＴＨＦ撹拌溶液に、アルゴン下にオキザリルクロリド（４．８ｇ、３７．６ｍｍｏｌ）を加え、次いでＤＭＦを０．１ｍＬ加えることにより、激しくガスが発生した。４０分後、反応混合物を蒸発乾固した。得られた固体を１００ｍＬのＴＨＦに溶解し、−２３℃に冷却してアルゴン下に撹拌した。カリウムｔ−ブトキシド（１．０Ｍ ＴＨＦ中、４５ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）溶液を３０分かけて滴下し、さらに２０分間撹拌した。反応を５倍量の水で停止し、希塩酸で中和して、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、次いで濃縮して６（３．２４ｇ、収率８３％）を褐色固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ７．４−８．９（ｍ，５Ｈ）。
【０１１２】
ｔ−ブチル ５−アミノインドール−２ カルボキシレート（１０）
化合物９（３．５ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）および１００ｍＬ乾燥ＴＨＦを加えたフラスコをアルゴンガスで置換（purged）した。次いでこの溶液にパラジウム水素添加触媒（炭素上１０％、０．６ｇ）を加え、該反応混合物を水素で２．５日間バブリングした。触媒を濾過で除去し、溶媒を留去して化合物１０（２．８ｇ、収率９１％）を褐色固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ６．６−７．６（ｍ，４Ｈ）。
【０１１３】
なお、この生成物は不安定であるが、暗所、−２０℃で不活性ガス雰囲気下に貯蔵できる。
【０１１４】
ｔ−ブチル ５−（ブロモメチル）ベンゾフラン２−カルボキシレート（１２）
５−メチルベンゾフラン−２−カルボン酸（１１）を、最初に以下のようにしてｔ−ブチルエステルに変換した。化合物１１（２０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）の２５０ｍＬ乾燥ＴＨＦ撹拌溶液に、アルゴン下にオキザリルクロリド（４５ｇ、３５６ｍｍｏｌ）を加え、次いでＤＭＦを０．２５ｍＬ加えることにより、激しくガスが発生した。４０分後、該溶液を蒸発乾固した。固体残渣を２５０ｍＬの乾燥ＴＨＦに再溶解し、アルゴン下に撹拌しながら−２３℃に冷却した。次いで、カリウムｔ−ブトキシド（１．０Ｍ ＴＨＦ中、２８０ｍＬ、２８０ｍｍｏｌ）溶液を１時間かけて滴下した。反応混合物を６００ｍＬの水に注ぎ、次いで酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、留去して該エステル（２４．４ｇ、収率９３％）を黄色液体として得、−２０℃に冷却して固体とした。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ２．４（ｓ，３Ｈ）、δ ７．１−７．６（ｍ，４Ｈ）。
【０１１５】
このエステル（１０ｇ、４３．１ｍｍｏｌ）の１００ｍＬ蒸留四塩化炭素撹拌溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（９．２ｇ、５１．７ｍｍｏｌ）およびベンゾイルペルオキシド（０．２ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を１時間加熱還流した。ジブロム化した化合物の十分な形成が起こる前に反応を止めるのが重要であるため、反応の進行は、ＮＭＲ（メチル：δ ２．４；ブロモメチル：δ ４．６；ジブロモメチル：δ ６．８）によりモニターした。沈殿したスクシンイミドは、溶液から濾別し、濾液を水、飽和炭酸水素ナトリウム、水の順で洗浄した。四塩化炭素溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、留去して化合物１２（１２．９ｇ、収率９６％）を黄−白色固体として得た。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ４．６（ｓ，２Ｈ）、δ ７．３−７．９（ｍ，４Ｈ）。
【０１１６】
ｔ−ブチル ５−（Ｓ−アセチルチオメチル）ベンゾフラン−２−カルボキシレート（１３）
化合物１２（１０ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）の１００ｍＬ乾燥アセトン撹拌溶液に、アルゴン下室温でカリウムチオアセテート（６．１１ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）を加えた。３．５時間後、該反応混合物を４００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で処理し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して濃厚黒色オイルを得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチル：ヘキサン（１０：９０）で溶出しながら精製して化合物１３（５．２ｇ、収率５５％）を淡赤色固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ２．３（ｓ，３Ｈ）、δ ４．２（ｓ，２Ｈ）、７．２−７．７（ｍ，４Ｈ）。
【０１１７】
ｔ−ブチル ５−（２−ピリジルジチオメチル）ベンゾフラン−２−カルボキシレート（１４）
化合物１３（１．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）の５０ｍＬ無水エタノール溶液をアルゴン下室温で撹拌し、水素化ホウ素ナトリウム（２．５ｇ、６５ｍｍｏｌ）の７５ｍＬエタノール溶液で処理した。反応混合物のＴＬＣ分析（シリカゲル、クロロホルム：ヘキサン ６０：４０）で出発物質のエステルが消失したとき（〜２時間）反応混合物を０℃に冷却し、３０ｍＬの水で処理した。溶液のｐＨは氷酢酸を加えて４にした。次いで溶液を３ＭのＮａＯＨを添加してｐＨを５とし、２−ピリジル−ジスルフィド（２．８７ｇ、１３ｍｍｏｌ）の１０ｍＬ無水エタノール溶液を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて停止し、該混合物をクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、留去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチル：ヘキサン（２０：８０）で溶出しながら精製し、純粋な生成物１４を白色固体として回収した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ４．１（ｓ，２Ｈ）、６．８−７．６（ｍ，７Ｈ）、８．３−８．５（ｍ，１Ｈ）。
【０１１８】
５−（２−ピリジルジチオメチル）ベンゾフラン−２−カルボン酸（１５）
トリフルオロ酢酸１５ｍＬに、アルゴン下０℃で撹拌しながらエステル１４ （２．２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を加えた。１．５時間後、トリフルオロ酢酸を反応混合物から留去し、化合物１５（１．８ｇ、収率９７％）を白色固体として得た。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ） δ ４．３（ｓ，２Ｈ）、７．０−７．８（ｍ，７Ｈ）、８．３−８．５（ｍ，１Ｈ）。
【０１１９】
ｔ−ブチル ５−〔（５−（２−ピリジルジチオメチル）ベンゾフラン−２−イルカルボニル）アミノ〕インドール−２−カルボキシレート（１６）
化合物１５（２４７ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）の３０ｍＬ乾燥ＴＨＦ溶液に、アルゴン下室温で撹拌した溶液を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１７７ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の５ｍＬ塩化メチレン溶液、４−（ジメチルアミノ）−ピリジン（２９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の２ｍＬ塩化メチレン溶液、および化合物１０（２００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の５ｍＬ塩化メチレン溶液の順で処理した。反応混合物を１昼夜撹拌した。ジシクロヘキシルウレアを反応混合物から濾別し、濾液を水、冷０．１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および水で洗浄した。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して暗色オイルを得た。粗生成物をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、酢酸エチル：ヘキサンで溶出しながら精製し、化合物１６をオフホワイト固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ４．３（ｓ，２Ｈ）、δ ７．０−８．６（ｍ，１２Ｈ）。
【０１２０】
５−〔（５−２−ピリジルジチオメチル）ベンゾフラン−２−イル−カルボニル）アミノ〕インドール−２−カルボン酸（１７）
４ｍＬのトリフルオロ酢酸を０℃に冷却し、アルゴン下撹拌しながら化合物１６（１２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、トリフルオロ酢酸を減圧下に除去し、化合物１７をオフホワイト固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ ４．３（ｓ，２Ｈ）、δ ７．３−８．７（ｍ，１２Ｈ）。
【０１２１】
インドリル−ベンゾフラニル−ＣＣ−１０６５アナログ１８
ＣＰＩを上記のＥＤＣの存在下に化合物１７と結合させ、化合物１８を得た。
化合物１８の分析は、Waters 逆相Ｃ−１８ ＨＰＬＣカラムでアセトニトリルと水の混合物を溶出液（プログラム：０−４分、６０％ＣＨ3 ＣＮ；４−５分、０−１００％ＣＨ3 ＣＮ；５−１５分、１００％ＣＨ3 ＣＮ；流速 １．５ｍｌ／分）として用いて行い、８．２分に単一ピークを得た。
【０１２２】
実施例３
ビス−インドリル ＣＣ−１０６５アナログ２２の合成
ビス−インドリル−ＣＣ−１０６５アナログ２２は、Ｆｉｇ．４に示すスキーム３に従い合成された。
【０１２３】
ｔ−ブチル （３´−フェニルジチオプロピオニル）−５−アミノインドール−２−カルボキシレート（１９）
３−フェニルジチオプロピオン酸（４）（１．４０ｇ、６．５４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）撹拌溶液に、−２３℃でイソブチルクロロホルメート （０．９３ｍＬ、７．１９ｍｍｏｌ）を加え、その直後にトリエチルアミン（１．０１ｍＬ、７．１９ｍｍｏｌ）を加えた。−２３℃で１５分間撹拌後、ｔ−ブチル−５−アミノインドール−２−カルボキシレート（１０）（１．５２ｇ、６．５４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．９２ｍＬ、６．５４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液を５分間かけてゆっくり滴下した。反応混合物を−２３℃で３０分間撹拌後、周囲の温度でさらに３０分間撹拌した。反応混合物に０．５Ｍ塩酸を５０ｍＬ加えて酸性とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和ＮａＨＣＯ3 、水の順で洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、酢酸エチルのヘキサン溶液のグラジエントで溶出しながら精製し、生成物１９をオフホワイト固体として得た（１．４３ｇ、収率５１％）。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ２．９−３．３（ｍ，４Ｈ）、δ ７．０−８．１（ｍ，９Ｈ）、９．１５（ｓ，１Ｈ）。
【０１２４】
ｔ−ブチル ５−〔（３´−フェニルジチオプロピオニル）インドール−２−イルカルボニルアミノ〕インドール−２−カルボキシレート（２０）
エステル１９（１．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１４ｍＬ）と０℃でアルゴン雰囲気下に処理した。反応混合物をこの温度で１時間撹拌した。次いで該溶液を減圧下に蒸発乾固し、得られたカルボン酸をさらに精製することなく次の工程に使用した。
【０１２５】
上記の得られたカルボン酸（２５０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ （１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下に撹拌し、アミノエステル１０（１４９ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液およびＥＤＣ（１２４ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液で処理した。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。次いで、冷０．５Ｍ ＨＣｌ（２５ｍＬ）を加え、混合物をＴＨＦ：酢酸エチル（１：１（ｖ／ｖ）、４×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて順に水（４×１００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）および水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4 で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下蒸発乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、アセトン：トルエン（３０：７０ ｖ／ｖ）で溶出しながら精製し、純粋な生成物２０（２００ｍｇ、収率５２％）を得た。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：８．１２−７．１０（ｍ，１３Ｈ）、 ３．３−２．７７（ｍ，４Ｈ）、 １．５８（ｓ，９Ｈ）。
【０１２６】
２０のビス−インドリル−ＣＣ−１０６５アナログ２１への変換
上記エステル１９の加水分解と同様にして、エステル２０を０℃でトリフルオロ酢酸を用いて０℃でカルボン酸に加水分解した。得られたカルボン酸を上記のように〔エム．エイ．ワーペホスキら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８）〕ＥＤＣを用いてＣＰＩと結合させ、ビス−インドリル−ＣＣ−１０６５アナログ２１を得た。アセトニトリルと水の混合液を溶出液（プログラム：６０−１００％ＣＨ3 ＣＮで１０分間、１００％ＣＨ3 ＣＮで５分間、流速 ２．５ｍＬ／分）として用いたWaters 逆相Ｃ−１８カラム上での化合物２１のＨＰＬＣによる分析では、１０．１分の保持時間に化合物２１の単一ピークが得られた。
【０１２７】
２１のチオール含有ＣＣ−１０６５アナログ２２への還元
ビス−インドリル−ＣＣ−１０６５アナログ２１（．０４μｍｏｌ）のアセトニトリル：ＴＨＦ（０．０８ｍＬ）（１：１、ｖ／ｖ）溶液を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５；０．０１４ｍＬ）に溶解したジチオスレイトール（．０６μｍｏｌ）で処理した。反応混合物をアルゴン雰囲気下に４℃で４時間維持した。このとき、ジチオスレイトール（０．１８μｍｏｌ）の追加分を加えた。３０分後、反応混合物をＨＰＬＣ（上記化合物２１の精製条件と同じ）で精製した。保持時間８．０分の新たなピークをチオール含有ＣＣ−１０６５アナログ２２として同定した。このピークは、特徴的な吸収スペクトルを有し、エルマン試験（Ellman's assay）〔ジー．エル．エルマン、８２、Arch. Biochem. Biophys., ７０（１９５９）〕を用いるチオール試験に陽性であった。
【０１２８】
実施例４
抗体に対する薬物複合体
抗体に対する薬物複合体は、以下のようにして得られた。
【０１２９】
方法Ａ
薬物は、チオール基を含有する：抗体は、ＳＰＤＰ〔Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート〕で修飾して、ジチオピリジル基を導入した。チオール基を含有する薬物と修飾された抗体との反応により、ジスルフィド基で結合された複合体を製造した。
【０１３０】
方法Ｂ
薬物は、活性化されたジスルフィド基を含有する：抗体は、２−イミノチオランで修飾し、チオール基を導入した。修飾された抗体の薬物との反応により、ジスルフィド基で結合された複合体を製造した。
【０１３１】
方法Ａ
抗体Ｎ９０１を前述のように〔ジェイ．カールソンら、１７３ Biochem. J.,７２３（１９７８）〕ＳＰＤＰで修飾して、抗体分子当たり平均して４〜６個のジチオピリジル基を導入した。２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム中の、４ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体溶液を１０倍モル過剰のＳＰＤＰのエタノール溶液で処理し、該混合物を３０℃で３０分間インキュベートした。修飾された抗体は、セファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過で精製し、次いで１０倍モル過剰のチオール含有薬物のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液で、ＤＭＡの最終濃度が１０％以下になるようにインキュベートした。複合体混合物は、アルゴン雰囲気下に暗所、２０℃で３時間インキュベートし、次いでセファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過で精製し、複合体になっていない薬物及び他の低分子量物質を除去した。抗体分子当たり平均４分子の薬物を含む複合体が、この方法により得られた。
【０１３２】
方法Ｂ
抗体Ｎ９０１を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）を用いて修飾し、前述のように〔ジェイ．エム．ランバートら、２６０ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１２０３５（１９８５）〕抗体分子当たり平均して４〜６個のチオール基を導入した。２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ８．０の０．１Ｍのトリエタノールアミン緩衝液中の、４ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体溶液を２−イミノチオラン（最終濃度＝１．５ｍＭ）溶液で処理し、アルゴン雰囲気下に４℃で９０分間インキュベートした。修飾された抗体は、セファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過で精製した。チオール基の導入は、エルマン試験（８２、Arch. Biochem. Biophys., ７０（１９５９））を用いて決定した。修飾された抗体に、化合物１６のＤＭＡ溶液を、化合物１６が１０倍モル過剰になるように、且つＤＭＡの最終濃度が１０％以下になるように加えた。複合体形成用混合物は、濁った状態になり、アルゴン雰囲気下に暗所、２０℃で３時間インキュベートした。
遠心分離で該溶液を透明にし、次いでセファデックスＧ−２５カラムにかけて未反応の薬物を除去した。得られた複合体は、抗体分子当たり平均３〜５分子の薬物を含んでいた。
【０１３３】
実施例５
抗体−ＳＳ−薬物複合体のインビトロでの細胞障害性及び特異性
Ｎ９０１−ＳＳ−薬物７のインビトロでの細胞障害性
ジスルフィドで連結されたモノ−インドリルＣＰＩ誘導体７の抗体Ｎ９０１との、抗体分子当たり平均３．３個の薬物分子を含有する複合体のインビトロでの細胞障害性を、抗原陽性ＳＷ２細胞および抗原陰性ナマルワ細胞について測定した。細胞は、該複合体と３７℃で２４時間さらされ、生き残った細胞フラクションを成長逆−外挿試験（growth back-extrapolation assay)〔ブイ．エス．ゴールドマッヒャーら、１３５、ジャーナル・オブ・イムノロジー、３６４８−３６５１（１９８５）〕を用いて測定した。
【０１３４】
結果をＦｉｇ．６に示す。Ｆｉｇ．６において、横軸は、薬物濃度を示し、縦軸は生存細胞のフラクションを示す。●は、ＳＷ２細胞を示し、○はナマルワ細胞を示す。
【０１３５】
この結果は、該複合体は抗原陽性ＳＷ２細胞に対する細胞障害性は、ＩＣ50値が１．４×１０-11 Ｍと、非常に強いことを示している。一方、この複合体は抗原陰性ナマルワ細胞に対し、ＩＣ50値が１×１０-9Ｍと非障害性でさえあり、細胞障害効果の特異性を示している。１０００倍過剰の非複合体抗体を添加するとＳＷ２細胞に対する細胞障害性は消滅した。これは、さらに細胞障害効果の抗原特異性を示している。
【０１３６】
上記のジスルフィドで連結された複合体のインビトロでの細胞障害性は、抗原陽性Ａ３７５細胞および抗原陰性ＳｃＡＢＥＲ細胞についても測定された。細胞は、該複合体と３７℃で２４時間さらされ、生き残った細胞フラクションをクローン原性試験（clonogenic assay）〔シー．エフ．スコットら、２５、Cancer Immunol. Immunother., ３１−４０（１９８７）〕を用いて測定した。
【０１３７】
結果をＦｉｇ．７に示す。Ｆｉｇ．７において、横軸は、薬物濃度を示し、縦軸は生存細胞のフラクションを示す。●は、Ａ３７５細胞を示し、○はＳｃＡＢＥＲ細胞を示す。
【０１３８】
この結果は、該複合体はメラノーマ細胞系のＡ３７５に対し幾分細胞障害性が低い（ＩＣ50＝２×１０-10 Ｍ、Ｆｉｇ．７）ことを示している。減少した細胞障害性は、この細胞系がＮ９０１よりもずっと少ない抗原しか発現しない事実と矛盾しない。ここでも再び、該複合体は抗原陰性のヒト膀胱ガン細胞系ＳＣａＢＥＲに対し、非障害性である（１×１０-9Ｍでの生存フラクション＝１００％）。 Ｎ９０１−ＳＳ−薬物１８のインビトロでの細胞障害性
ジスルフィドで連結されたインドリル−ベンゾフランＣＣ−１０６５アナログ１８と抗体Ｎ９０１の、抗体分子当たり平均２個の薬物分子を含有する複合体のインビトロでの細胞障害性を、抗原陽性ＳＷ２細胞および抗原陰性ナマルワ細胞について測定した。細胞は、該複合体と３７℃で２４時間さらされ、生き残った細胞フラクションを成長逆−外挿試験〔ブイ．エス．ゴールドマッヒャーら、１３５、ジャーナル・オブ・イムノロジー、３６４８−３６５１（１９８５）〕を用いて測定した。
【０１３９】
結果をＦｉｇ．８に示す。Ｆｉｇ．８において、横軸は、薬物濃度を示し、縦軸は生存細胞のフラクションを示す。●は、ＳＷ２細胞を示し、○はナマルワ細胞を示す。
【０１４０】
この結果は、該複合体は抗原陽性ＳＷ２細胞に対する細胞障害性は、ＩＣ50値が１×１０-10 Ｍ（１×１０-9Ｍで９９．９％の細胞を殺す）と、非常に強いが、一方、この複合体は抗原陰性ナマルワ細胞に対し、試験された最高の濃度である１００倍の濃度（１×１０-8Ｍ）でさえ非障害性でさえあり、１００％の細胞が生存した。
【０１４１】
Ｎ９０１−ＳＳ−薬物２２のインビトロでの細胞障害性
ジスルフィドで連結されたインドリル−ベンゾフランＣＣ−１０６５アナログ２２と抗体Ｎ９０１の、抗体分子当たり平均４個の薬物分子を含有する複合体のインビトロでの細胞障害性を、抗原陽性ＳＷ２細胞および抗原陰性ナマルワ細胞について測定した。細胞は、該複合体に３７℃で２４時間さらされ、生き残った細胞フラクションを成長逆−外挿試験〔ブイ．エス．ゴールドマッヒャーら、１３５、ジャーナル・オブ・イムノロジー、３６４８−３６５１（１９８５）〕を用いて測定した。
【０１４２】
結果をＦｉｇ．９に示す。Ｆｉｇ．９において、横軸は、複合体または薬物濃度を示し、縦軸は生存細胞のフラクションを示す。●は、抗原陽性ＳＷ２細胞に対する複合体のデータを示し、▲は遊離のＣＣ−１０６５アナログ２２を示し、■は遊離の抗体の存在下での複合体のデータを示し、◆は、抗原陰性ナマルワ細胞の複合体のデータを示す。
【０１４３】
この結果は、該複合体は抗原陽性ＳＷ２細胞に対する細胞障害性は、ＩＣ50値が１．９×１０-11 Ｍ（２×１０-9Ｍで９９．９％の細胞を殺す）と、非常に強いが、一方、この複合体は抗原陰性ナマルワ細胞に対し、１００倍高い濃度（１×１０-9Ｍ）でさえずっと弱い障害性しか示さない。
【０１４４】
本発明は、具体的な実施例を用いて説明されたけれども、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から離れないで種々の変更及び修飾を行えることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆｉｇ．１Ａは、ＣＣ−１０６５およびそのサブユニットＡ、ＢおよびＣの構造を示す。Ｆｉｇ．１ＢおよびＦｉｇ．１Ｃは、２種の公知のＣＣ−１０６５アナログの構造を示す。
【図２】Ｆｉｇ．２は、本発明のモノ−インドリルＣＣ−１０６５アナログ７を製造する合成スキームである。
【図３】Ｆｉｇ．３ＡおよびＦｉｇ．３Ｂは、本発明のインドリル−ベンゾフラニルＣＣ−１０６５アナログ１８を製造する合成スキームの一部を示す。
【図４】Ｆｉｇ．３Ｃは、本発明のインドリル−ベンゾフラニルＣＣ−１０６５アナログ１８を製造する合成スキームの一部を示す。
【図５】Ｆｉｇ．４は、本発明のビス−インドリルＣＣ−１０６５アナログ２２を製造する合成スキームを示す。
【図６】Ｆｉｇ．５ＡおよびＦｉｇ．５Ｂは、本発明の複合体を調製する方法のダイアグラムである。Ｆｉｇ．５Ａは、チオール含有ＣＣ−１０６５アナログを用いる方法のダイアグラムであり、Ｆｉｇ．５Ｂは、活性化されたジスルフィド含有ＣＣ−１０６５アナログを用いる方法のダイアグラムである。
【図７】Ｆｉｇ．６は、本発明の複合体の誘導体薬物７のＳＷ２およびナマルワ細胞に対するインビトロでの細胞障害性および特異性を示すグラフである。横軸は、複合体の濃度を示し、縦軸は細胞の生存フラクションを示す。●は、抗原陽性ＳＷ２細胞のデータを示し、○は抗原陰性ナマルワ細胞のデータを示す。
【図８】Ｆｉｇ．７は、本発明の複合体の誘導体薬物７の抗原陽性Ａ−３７５および抗原陰性ＳＣａＢＥＲ細胞に対するインビトロでの細胞障害性および特異性を示すグラフである。横軸は、複合体の濃度を示し、縦軸は細胞の生存フラクションを示す。●は、Ａ−３７５細胞のデータを示し、○はＳＣａＢＥＲ細胞のデータを示す。
【図９】Ｆｉｇ．８は、本発明のＣＣ−１０６５アナログ１８複合体のＳＷ２およびナマルワ細胞に対するインビトロでの細胞障害性および特異性を示すグラフである。横軸は、複合体の濃度を示し、縦軸は細胞の生存フラクションを示す。●は、抗原陽性ＳＷ２細胞のデータを示し、○は抗原陰性ナマルワ細胞のデータを示す。
【図１０】Ｆｉｇ．９は、本発明のＣＣ−１０６５アナログ２２複合体のＳＷ２およびナマルワ細胞に対するインビトロでの細胞障害性および特異性を示すグラフである。横軸は、複合体または遊離のＣＣ−１０６５アナログ２２の濃度を示し、縦軸は細胞の生存フラクションを示す。●は、抗原陽性ＳＷ２細胞に対する複合体のデータを示し、▲は遊離のＣＣ−１０６５アナログ２２のデータを示し、■は遊離の抗体の存在下での複合体のデータを示し、◆は、抗原陰性ナマルワ細胞の複合体のデータを示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な細胞障害剤及びその治療用途に関する。より詳しくは、本発明は、ＣＣ−１０６５のアナログ類およびＣＣ−１０６５の誘導体およびその治療用途からなる新規な細胞障害剤に関する。これらの新規な細胞障害剤は、該アナログ類および誘導体を細胞結合剤に化学的に連結することにより標的化の様式で特定の細胞集団に該アナログ類および誘導体を送達させる結果、治療用途を有する。
【０００２】
【従来の技術およびその問題点】
近年、モノクローナル抗体−薬物複合体を用いた腫瘍細胞の特異的標的化の試みについて、無数の報告がなされている〔（セラら、イン・イムノコンジュゲーツ、ページ１８９−２１６（シー．ボーゲル編、１９８７）；ゴースら、イン・ターゲッティッド・ドラッグズ、ページ１−２２（イー．ゴールドバーグ編、１９８３）；ディーナーら、イン・アンチボディー・メディエーティッド・デリバリー・システムズ、ページ１−２３（ジェイ．ロッドウェル編、１９８８）；ピーターツら、イン・アンチボディー・メディエーティッド・デリバリー・システムズ、ページ２５−５３（ジェイ．ロッドウェル編、１９８８）；ブモルら、イン・アンチボディー・メディエーティッド・デリバリー・システムズ、ページ５５−７９（ジェイ．ロッドウェル編、１９８８）。
【０００３】
メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシルおよびメイタンシノイド類などの細胞障害薬（cytotoxic drugs ）は、種々のマウスモノクローナル抗体と結合されている。ある場合には、薬物分子は、血清アルブミン〔（ガーネットら、４６キャンサー・リサーチ、２４０７−２４１２（１９８６）；オーカワら、２３ Cancer Immunol. Immunother., ８１−８６（１９８６）；エンドウら、４７ キャンサー・リサーチ、１０７６−１０８０（１９８０）〕、デキストラン〔ハ−ウィッツら、２ Appl. Biochem. ２５−３５（１９８０）；マナビら、３４ バイオケミカル・ファーマコロジー、２８９−２９１（１９８５）；ディルマンら、４６ キャンサー・リサーチ、４８８６−４８９１（１９８６）；ショーバルら、８５ プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー．エス．エー．、８２７６−８２８０（１９８８）〕またはポリグルタミン酸〔ツカダら、７３ J. Natl. Canc. Inst. ７２１−７２９（１９８４）；カトーら、２７ ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、１６０２−１６０７（１９８４）；ツカダら、５２ Br. J. Cancer １１１−１１６（１９８５）〕のような中間のキャリアー分子を介して結合された。
【０００４】
リンカー技術の広範な進展が、上記のような免疫複合体の調製に利用され、開裂性及び非開裂性リンカーが詳細に検討された。しかしながら、多くの場合、薬物の最大細胞障害活性は、薬物分子が標的部位で非修飾形として複合体（conjugate)から放出された場合にのみ観察される。
【０００５】
抗体−薬物複合体の調製に用いられる開裂性リンカーの１つは、シス−アコニット酸に基づく酸開裂性リンカーであり、該リンカーはレセプターで介在されたエンドサイトーシス中に遭遇するエンドソームおよびリソソームのような異なる細胞内コンパートメントの酸性環境を利用できる。シェンおよびライサーは、この方法をダウノルビシンと高分子担体との複合体の調製に導入した（１０２ バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション １０４８−１０５４ （１９８１））。ヤングおよびライスフェルドは、同じ技術をダウノルビシンと−抗メラノーマ抗体との複合体に使用した（８０ J. Natl. Canc. Inst. １１５４−１１５９（１９８８））。ディルマンらも、ダウノルビシンと−抗Ｔ細胞抗体との複合体の調製に同様の方法で酸開裂性リンカーを使用した（４８ キャンサー・リサーチ、６０９７−６１０２（１９８８）。
【０００６】
もう１つのアプローチは、トロートらにより開拓され、ペプチドスペーサーアームを介してダウノルビシンを抗体と結合させることに関する〔７９ プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー．エス．エー．、６２６−６２９（１９８２）〕。この方法は、遊離の薬物がリソソームのペプチダーゼの作用により複合体から放出され得るという前提の下になされる。
【０００７】
しかしながら、インビトロでの細胞障害性試験では、抗体−薬物複合体はめったに遊離の非結合性薬物と同じ細胞障害活性を示すことはない。このことは、薬物分子が抗体から放出されるメカニズムは、非常に非効率的であることを示唆している。イムノトキシンの領域では、モノクローナル抗体と触媒的に作用するタンパク質トキシンの間のジスルフィド結合を介して形成される複合体は、他のリンカーを含有する複合体よりもより細胞障害性が強いことが示された。ランバートら、２６０ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１２０３５−１２０４１（１９８５）；ランバートら、イン・イミノトキシンズ、１７５−２０９（エー．フランケン編 １９８８）；ゲーテら、４８ キャンサー・リサーチ、２６１０−２６１７（１９８８）参照。これは、抗体分子とトキシンとの間のジスルフィド結合の効率的開裂に高い細胞内濃度を有するグルタチオンが寄与するからである。これにもかかわらず、薬物と高分子の間の複合体形成にジスルフィド結合を利用した例は、ごくわずかしか報告されていない。シェンらは、メトトレキセートをメルカプトエチルアミド誘導体に変換し、次いでジスルフィド結合を介してポリーＤ−リシンとの複合体とすることを記載している（２６０ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１０９０５−１０９０８（１９８５））。最近の報告は、３つのスルフィドを含有する細胞障害性薬物カリケアマイシンと抗体との複合体の調製を記載している（メネンデツら、フォース・インターナショナル・カンファレンス・オン・モノクローナル・アンチボディ・イムノコンジュゲーツ・フォー・キャンサー、サンジエゴ、アブストラクト８１（１９８９））。
【０００８】
ジスルフィド結合で連結された抗体−薬物複合体のない１つの理由は、薬物を抗体とジスルフィド結合を介して連結するのに容易に使用できる硫黄原子を含む基を有する細胞障害性薬物を利用できなかったことにある。さらに、現存する薬物の化学修飾は、細胞障害活性を減少することなく行うのは困難である。
【０００９】
現在の抗体−薬物複合体の他の主要な欠点は、標的抗原の数が限られていることおよびメトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンのような静ガン性薬物の比較的温和な細胞障害性のために、十分量の薬物を標的部位に送達することができないことによる。十分な細胞障害性を発揮させるために、数多くの薬物分子を直接に、または高分子担体分子を通して抗体と結合させることが必要になる。しかしながら、そのように高度に修飾された抗体は、標的抗原に対してしばしば不十分な結合性しか示さず、生体内で血流から急速に除去される。
【００１０】
ＣＣ−１０６５は、ストレプトマイセス・ゼレンシス（Streptomyces zelensis）の培養物から単離された強力な抗腫瘍抗生物質であり、インビトロで特に優れた細胞障害性を示す。
【００１１】
ＣＣ−１０６５（化合物１、Ｆｉｇ．１Ａ）の構造は、Ｘ線結晶解析によって決定された〔マーチン、ディー．ジー．ら、３３ ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス、９０２−９０３（１９８０）、およびチデスター、シー．ジー．ら、１０３ ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、７６２９−７６３５（１９８１）〕。ＣＣ−１０６５分子は、アミド結合によって連結された３つの置換されたピロロインドール部分からなる。“Ａ”サブユニットは、分子中の唯一の不斉炭素を含むシクロプロピル環を有する。一方、これら炭素の相対配置だけが、Ｘ線データから利用でき、絶対配置は、ＤＮＡをキラル試薬として用いることにより、３ｂＲ、４ａＳと推定されている（ハーレイ、エル．エイチ．ら、２２６ サイエンス、８４３−８４４（１９８４））。“Ｂ”および“Ｃ”サブユニットは、同一のピロロインドール部分である。
【００１２】
ＣＣ−１０６５の細胞障害活性は、ＣＣ−１０６５のアルキル化活性及びＤＮＡ−結合性またはＤＮＡ−インターカレート活性と相関する。２種の活性は、該分子の２つの分離した部分に帰属する。アルキル化活性は、ＣＰＩユニットＡ （シクロプロピルピロロインドール・ユニット）に含まれ、ＤＮＡ−結合性は、２つのサブユニットＢおよびＣに含まれる（Ｆｉｇ．１Ａ参照）。
【００１３】
ＣＣ−１０６５は、メトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンのような公知のガン化学療法剤よりも１００〜１０００倍細胞障害性が強い（ビー．ケイ．ブーヤンら、４２ キャンサー・リサーチ、３５３２−３５３７（１９８２））。しかしながら、マウスに対するＣＣ−１０６５の投与は、１２．５μｇ／ｋｇの単回静注後５０日で死に至る遅延性肝障害を引き起こす（ブイ．エル．レイノルズら、ＸＸＸＩＸ ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス、３１９−３３４（１９８６））。マウスに対する遅延性致死を起こすことなく親薬物のインビトロでの高い細胞障害性を保持したＣＣ−１０６５のいくつかの新規アナログ（Ｆｉｇ．１Ｂおよび１Ｃ参照）の合成が最近報告された（エム．エイ．ワーペホスキら、３１ ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８））。ＣＣ−１０６５のように、これらのアナログは、ＤＮＡと共有結合の様式で結合し、細胞死を引き起こすアルキル化剤である。これらの化合物は、Ｌ１２１０ネズミ白血病細胞の成長を、インビトロでのＩＣ50が１×１０-10 から１×１０-11 Ｍの範囲で抑制する。これら化合物のいくつかは、マウスの生体内でＰ３８８白血病に効果を示す。最も効果のあるアナログＵ−７３９７５（Ｆｉｇ．１Ｃ）は、１日目、５日目および９日目に最適用量０．０５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与することで、無処理のコントロールの生存期間を１７０％延長する。しかしながら、この用量では、６匹中の１匹の処理マウスが３０日を超えて生存したにすぎない。これらの薬物は、治療効果を発揮するのに必要な濃度での高い毒性のために、ごくわずかな治療価値しか持たない。
【００１４】
従って、ＣＣ−１０６５およびそのアナログの治療効率を改善し、該化合物の細胞障害性を保持しつつ全身に対する毒性を軽減する必要性が存在する。
【００１５】
【発明の開示】
本発明の目的は、細胞結合剤と共有結合することのできる、ＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体を提供することにある。該細胞結合剤複合体は、実質的にその細胞障害性を妨げることなく該アナログおよび誘導体を標的送達し、それにより非標的細胞への毒性を低下させ、従って全身毒性を低下させる。
【００１６】
上記の及び他の目的は、１または２以上のＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体を連結した細胞結合剤からなる細胞障害剤を提供することにより達成され、細胞結合剤に該アナログおよび誘導体を連結させる前に、該アナログおよび誘導体は、Ａサブユニットのピロール部分の２級アミノ基とＢ−サブユニットのＣ−２カルボキシル基とのアミド結合を介して、式（Ｆ−１）、（Ｆ−２）、（Ｆ−３）、（Ｆ−４）、（Ｆ−５）、（Ｆ−６）、（Ｆ−７）、（Ｆ−８）、（Ｆ−９）または（Ｆ−１０）のＢ−サブユニットまたはＢ−Ｃサブユニットと共有結合した式（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−３）または（Ａ−４）のＡサブユニットからなる群から選ばれ、
式（Ａ−１）から（Ａ−４）は以下に示すものであり、
【００１７】
【化１９】
及び、式（Ｆ−１）から（Ｆ−１０）は以下に示すもの、
【００１９】
【化２０】
【化２１】
〔式中、ＲおよびＲ´またはＲ4 のいずれかはＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との連結を可能にする基を示し；ＲまたはＲ´が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ1 からＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し；Ｒ4 が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ5 およびＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し、Ｒ´はＮＨ2 、アルキル基、Ｏ−アルキル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示す。〕
である。
【００２２】
本発明はまた、
（ａ）１または２以上の上記細胞障害剤の細胞障害量、および
（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤
を含む選択された細胞集団を殺す治療薬を提供するものである。
【００２３】
本発明の他の目的は、選択された細胞集団（cell population ）由来の細胞を含むと推測される細胞集団または組織を、細胞障害量の１または２以上の上記細胞障害剤と接触させることからなる選択された細胞集団を殺す方法を提供するものである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、Ａサブユニットのピロール部分の２級アミノ基とＢ−サブユニットのＣ−２カルボキシル基とのアミド結合を介して、式（Ｆ−１）、（Ｆ−２）、（Ｆ−３）、（Ｆ−４）、（Ｆ−５）、（Ｆ−６）、（Ｆ−７）、（Ｆ−８）、（Ｆ−９）または（Ｆ−１０）のＢ−サブユニットまたはＢ−Ｃサブユニットと共有結合した式（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−３）または（Ａ−４）のＡサブユニットからなる群から選ばれ、
式（Ａ−１）から（Ａ−４）は以下に示すものであり、
【００２５】
【化２２】
及び、式（Ｆ−１）から（Ｆ−１０）は以下に示すもの、
【００２７】
【化２３】
【化２４】
〔式中、ＲおよびＲ´またはＲ4 のいずれかはＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との連結を可能にする基を示し；ＲまたはＲ´が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ1 からＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し；Ｒ4 が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ5 およびＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し、Ｒ´はＮＨ2 、アルキル基、Ｏ−アルキル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示す。〕
であるＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体を提供することにある。
【００３０】
本発明者は、ＣＣ−１０６５およびそのアナログの治療効果が、薬物を腫瘍部位に標的送達することで生体内での分布を変更することにより改善し、その結果非標的組織への毒性を低下させ、全身に対する毒性も低下されることにを見出した。この目的を達成するため、本発明者は薬物のインドリルまたはベンゾフラニル末端部分のＣ−５位に置換基を有するチオール基またはジスルフィド基を含有する細胞障害薬２および３（Ｆｉｇ．１Ｂおよび１Ｃ）のアナログを合成した。これらの化合物は、親薬物の高い細胞障害性を保持しているだけでなく、ジスルフィド結合を介して細胞結合剤と結合することができる。本発明者は既に高い細胞障害性を有する薬物をジスルフィド結合のような開裂性の結合を用いて抗体と連結することで、細胞内で最大の活性を有する薬物を放出させ得ること、およびそのような複合体が抗原特異的な様式で細胞障害性を有することを示した（アール．ブイ．ジェイ．カリら、５２ キャンサー・リサーチ、１２７−１３１（１９９２）；ともに係属する米国特許出願第０７／４２６，２４７号）。本出願において、本発明者は、新規薬物アナログの合成、モノクローナル抗体との複合体形成の手順、これらの複合体のインビトロでの細胞障害性および特異性について記載する。本発明は、ＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体が、その活性を保持し、無差別な細胞障害性のいくつかをなくす。この様に、本発明は、最小の副作用を示しながら、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞（自己抗体を産生する細胞）、活性化細胞（移植片拒絶または移植片対宿主病に関連するもの）、または他の任意の病気のまたは異常な細胞型のような殺されまたは消化されるべき病気のまたは異常な細胞の除去に有用な薬剤を提供するものである。
【００３１】
この様に、本発明は、細胞結合剤と化学的に結合でき、親化合物ＣＣ−１０６５の高い細胞障害性を維持するＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体の合成を開示する。さらに、これらの化合物は、細胞結合剤と結合したとき、細胞結合剤が結合する細胞に対してのみ高い細胞障害性を有し、非特異的細胞には相当少ない障害性しか示さない。高い細胞障害性とは、インビトロで薬物に対し２４時間さらしたときのＳＷ２細胞について測定したＩＣ50が約１０-9Ｍ以下であることで定義される。親化合物は、これらの条件下で２×１０-10 ＭのＩＣ50を示す。
【００３２】
細胞障害剤
本発明の細胞障害剤は、細胞結合剤と結合した１または２以上のＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体を含む。
【００３３】
本発明によると、ＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体は、ＡサブユニットＣＰＩ（シクロプロパピロロインドール ユニット）を天然の閉環したシクロプロピル形態または開環したクロロメチルの形態で含むか、または密接に関連したＣＢＩユニット（シクロプロピルベンズインドール ユニット）を天然の閉環したシクロプロピル形態または開環したクロロメチルの形態で含む必要がある。ＣＣ−１０６５のＢおよびＣサブユニットは、非常に類似しており、いずれも２−カルボキシ−インドール誘導体である。ＣＣ−１０６５のアナログは、活性発現のために２−カルボキシ−インドールサブユニットまたは２−カルボキシ−ベンゾフランサブユニットの少なくとも１種を必要とするが、２つのサブユニットを含む（即ち、ＢおよびＣ）ほうがより強力なアナログである。天然のＣＣ−１０６５および刊行物に記載されたアナログ（例えば、ワーペホスキら、３１ ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８））から明らかなように、ＢおよびＣサブユニットは、インドールまたはベンゾフラン環の異なる位置に、異なる置換基を有することもできる。
【００３４】
ＣＣ−１０６５と細胞結合剤を連結するために、ＣＣ−１０６５は最初に、ジスルフィド結合、酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基またはエステラーゼ−開裂性基を介して細胞結合剤と連結し得る誘導体となるような基（moiety）を含むように誘導体化しなければならない。該アナログは、ジスルフィド結合、酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基またはエステラーゼ−開裂性基を介して該アナログを細胞結合剤と連結するのに必要な基をすでに含有するように調製される。
【００３５】
より詳しくは、本発明によれば、ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、Ａサブユニットのピロール部分の２級アミノ基と、式（Ｆ−１）〜（Ｆ−１０）を有する以下のＢまたは共有結合したＢ及びＣサブユニットのＣ−２カルボキシル基とのアミド結合を介して共有結合した式（Ａ−１）〔ＣＰＩ（シクロプロピル型）〕、（Ａ−２）〔ＣＰＩ（クロロメチル型）〕、（Ａ−３）〔ＣＢＩ（シクロプロピル型）〕および（Ａ−４）〔ＣＢＩ（クロロメチル型）〕の以下の任意のＡサブユニットである。
【００３６】
Ａサブユニット
【００３７】
【化２５】
Ｂまたは共有結合したＢ及びＣサブユニット
【００３９】
【化２６】
【化２７】
〔式中、ＲおよびＲ´またはＲ4 のいずれかはＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との連結を可能にする基を示し；ＲまたはＲ´が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ1 からＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し；Ｒ4 が連結を可能にする基を示すときには、Ｒ、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ5 およびＲ6 は同一または異なって、水素原子、Ｃ1 −Ｃ3 直鎖アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示し、Ｒ´はＮＨ2 、アルキル基、Ｏ−アルキル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基またはアミド基を示す。〕。
【００４２】
１級アミノ基の例としては、メチルアミン、エチルアミンおよびイソプロピルアミンが挙げられる。
【００４３】
２級アミノ基の例としては、ジメチルアミン、ジエチルアミンおよびエチルプロピルアミンが挙げられる。
【００４４】
３級アミノ基の例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびエチルイソプロピルメチルアミンが挙げられる。
【００４５】
アミド基の例としては、Ｎ−メチル−アセトアミド、Ｎ−メチル−プロピオンアミド、Ｎ−アセトアミドおよびＮ−プロピオンアミドが挙げられる。
【００４６】
Ｒ´で示されるアルキル基としては、Ｒ´が連結基（linking group ）でないときには、Ｃ1 〜Ｃ5 の直鎖または分枝を有するアルキル基が挙げられる。
【００４７】
Ｒ´で示されるＯ−アルキル基としては、Ｒ´が連結基でないときには、アルキル基の部分がＣ1 〜Ｃ5 の直鎖または分枝を有するアルキル基である化合物が挙げられる。
【００４８】
好ましい実施態様としては、Ｒ1 〜Ｒ6 はすべて水素原子であり、ＲおよびＲ´はＣＣ−１０６５の誘導体またはＣＣ−１０６５のアナログの誘導体がジスルフィド結合を介して細胞結合剤と連結し得る基を示す。
【００４９】
特に好ましい実施態様としては、ＲまたはＲ4 がＮＨＣＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨＣＯＣ6 Ｈ4 （ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、およびＲ´が（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 〔式中、Ｚ0 は、ＨまたはＳＲ7 を示し、Ｒ7 はメチル基、直鎖アルキル基、分枝を有するアルキル基、環状アルキル基、無置換または置換されたアリール基、または複素環を示し、ｌは１〜１０の整数を示す。〕である。
【００５０】
Ｒ7 で示される直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基およびヘキシル基が挙げられる。
【００５１】
Ｒ7 で示される分枝を有するアルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基および１−エチルプロピル基が挙げられる。
【００５２】
Ｒ7 で示される環状アルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が挙げられる。
【００５３】
Ｒ7 で示される無置換アリール基としては、フェニル基およびナフチル基が挙げられる。
【００５４】
Ｒ7 で示される置換されたアリール基としては、アルキル基、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆなどのハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、カルボン酸基、ヒドロキシ基またはアルコキシ基で置換されたフェニル基およびナフチル基などのアリール基が挙げられる。
【００５５】
Ｒ7 で示される複素環としては、ヘテロ原子がＯ、ＮおよびＳから選ばれた化合物であり、例えば、フリル基、ピロリル基、ピリジル基およびチオフェンが挙げられる。
【００５６】
本発明のジスルフィド基を含有した、およびメルカプト基を含有したＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体は、インビトロで種々の望ましくない細胞系の増殖を抑制する能力で評価することができる。例えば、ヒト類表皮カルチノーマ系ＫＢ、ヒト胸腫瘍系ＳＫＢＲ３、およびバーキットリンパ腫系ナマルワ（Namalwa ）のような細胞系をこれら化合物の細胞障害性の評価に使用することができる。評価されるべき細胞は、該化合物に２４時間さらし、生存している細胞のフラクションが公知の方法による直接試験で測定される。ＩＣ50値は、次いで、試験結果から計算される。
【００５７】
モノインドリルＣＣ−１０６５アナログ６、インドリル−ベンゾフラニル−ＣＰＩ化合物１８およびビス−インドリルＣＰＩ誘導体２２のヒトガン細胞系に対するインビトロでの細胞障害性が、測定された。その結果、モノインドリル化合物６は、異なる細胞系試験（ＳＷ２、ナマルワおよびＡ−３７５）に対しＩＣ50値が２．０−７．０×１０-10 Ｍの間であった。ＣＰＩ誘導体１８は、ヒト小細胞（small cell）肺ガン細胞系ＳＷ２およびヒトバーキットリンパ腫細胞系ナマルワに対して高度に細胞障害性であり、薬物に２４時間さらした後のＩＣ50値は各々５×１０-12 Ｍおよび１×１０-11 Ｍであった。ビス−インドリルＣＰＩ誘導体２２も非常に細胞障害性であり、ＳＷ２細胞に対するＩＣ50値は４×１０-11 Ｍであった。
【００５８】
上記のＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体は、天然物からの単離、引き続く修飾、合成的調製またはこれらの組み合わせを含む公知の方法により調製できる。
【００５９】
代表的な合成例を、以下に記載する
合成例１
Ｂサブユニットのインドール基のＣ−５位の側鎖上にチオール置換基を有するモノ−インドリルＣＣ−１０６５アナログ７の合成は、スキーム１（Ｆｉｇ．２）に略記される。フェニルジチオプロピオン酸４をトリエチルアミンの存在下にイソブチルクロロホルメートと処理して混合酸無水物を得、次いで５−アミノインドール−２−カルボン酸と反応させて、アミド５を得る。アミド５とＣＰＩのカップリングは、上記のようにエチル−ジアミノプロピル−カルボジイミド（ＥＤＣ）〔エム．エイ．ワーペホスキら、３１ ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８）〕の存在下に行い、フェニルジチオ基を含有するＣＰＩ誘導体６を得た。該誘導体６のチオール含有誘導体７への還元は、４℃で１．１当量のジチオスレイトールの存在下で円滑に進行した。該反応は、１時間で完結したと判断され、生成物は、逆相Ｃ−１８カラムを用いるＨＰＬＣにより精製された。
【００６０】
合成例２
活性化されたジスルフィド基を有するインドリル−ベンゾフラニル−ＣＰＩ誘導体１８の調製の合成工程は、スキーム２および３（Ｆｉｇ．３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）に略記される。ｔｅｒｔ−ブチル５−アミノインドール−２−カルボキシレート１０は、エチル５−ニトロインドール−２−カルボキシレート８から調製された（スキーム２ａ；Ｆｉｇ．３Ａ）。５−（２´−ピリジル−ジチオ−メチル）ベンゾフラン−２−カルボン酸１５は、５−メチルベンゾフラン−２−カルボン酸１１から調製された（スキーム２ｂ；Ｆｉｇ．３Ｂ）。カルボン酸１１は、ｔｅｒｔ−ブチルエステルに変換され、次いでベンジル位をＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）でブロム化されてモノブロモメチル化合物１２を得た。臭素をチオ酢酸により置換し、次いで水素化ホウ素ナトリウムで還元して、遊離のチオール基を２−ピリジルジスルフィドと反応させてエステル１４を得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステルのトリフルオロ酢酸での加水分解は０℃で円滑に進行して化合物１５を得た。化合物１５のｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノインドール−２−カルボキシレート１０とのカップリングは、ジシクロヘキシルカルボジイミド／４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＣＣ／ＤＭＡＰ）またはカルボニルジイミダゾールを用いて行われ、インドリル−ベンゾフラニル化合物１６を得た。
ｔｅｒｔ−ブチルエステルを加水分解してカルボン酸１７を得、次いでＣＰＩとＥＤＣの存在下にカップリングして薬物１８を得た（スキーム２ｃ；Ｆｉｇ．３Ｃ）。
【００６１】
合成例３
チオール含有ビス−インドリルＣＰＩ誘導体２２は、スキーム３（Ｆｉｇ．４）に略記される工程により合成された。フェニルジチオプロピオン酸４をイソブチルクロロホルメートで活性化し、次いでｔｅｒｔ−ブチル−５−アミノインドール−２−カルボキシレート１０と反応させてエステル１９を得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステルをトリフルオロ酢酸で加水分解し、次いでＤＣＣの存在下にもう１分子の化合物１０とカップリングして、ビス−インドリルエステル２０を得た。再度エステル２０を加水分解し、次いでＣＰＩとカップリングして、薬物２１を得た。フェニルジチオ保護基のジチオスレイトールによる開裂は、０℃でモノ−インドリル−ＣＰＩ化合物６のジスルフィド基の還元のために用いた上記の条件と同じ条件で行い、チオール含有薬物２２を得た。
【００６２】
連結基（ linking group)
上記合成例で記載されたものの他の連結基も、本発明のＣＣ−１０６５の誘導体またはＣＣ−１０６５のアナログの調製に使用できる。
【００６３】
好ましい連結基は、当該分野で良く知られており、それは、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基およびエステラーゼ−開裂性基が挙げられ、好ましくはジスルフィド基である。
【００６４】
本発明によれば、連結基は上記の常法により、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５のアナログと共有結合する化学基の一部である。該化学基は、末端のインドールまたはベンゾフラン基のＣ−４またはＣ−５位で、アルキル基、アミノ基、アミド結合またはエーテル結合を介してＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５のアナログと共有結合できる。好ましい実施態様において、該化学基はＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５のアナログと、末端のインドールまたはベンゾフラン基のＣ−５位に、メチレン基（ＣＨ2 ）またはアミド基（ＮＨＣＯＣＨ2 ＣＨ2 ）基を介して共有結合できる。
【００６５】
細胞結合剤の調製
治療剤としての本発明の化合物の効果は、適当な細胞結合剤の注意深い選択に依存する。細胞結合剤は、現在知られまたは知られるようになるペプチドおよび非ペプチドを含む任意のもので良い。一般に、これらは、抗体（特にモノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、栄養物−輸送因子（たとえばトランスフェリン）または他の任意の細胞結合分子または物質で良い。
【００６６】
細胞結合剤のより詳しい例は、以下のものを含む。
【００６７】
− モノクローナル抗体；
− 単一鎖抗体（single chain antibody ）；
− Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）2 およびＦV のような抗体フラグメント（パーハム、１３１ ジャーナル・オブ・イムノロジー、２８９５−２９０２ （１９８３）；スプリングら、１１３ ジャーナル・オブ・イムノロジー、４７０−４７８（１９７４）；ニソノフら、８９ Arch. Biochem. Biophys. 、２３０−２４４（１９６０）；
− インターフェロン（例えば、α、β、γ）；
− ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６のようなリンホカイン；
− インシュリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、アンドロゲンおよびエストロゲンのようなステロイドホルモン等のホルモン類；
− ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ〔バーゲス、５ イムノロジー・トゥデイ、１５５−１５８（１９８４）〕；及び
− トランスフェリン〔オケフら、２６０ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、９３２−９３７（１９８５）〕。
【００６８】
モノクローナル抗体の技術により、特異的なモノクローナル抗体の形態で高度に特異的な細胞結合剤を製造することができる。マウス、ラット、ハムスターまたは他の任意の哺乳動物を無傷標的細胞、標的細胞からから単離された抗原、ウイルス全体（whole virus ）、弱毒化したウイルス全体およびウイルスコート蛋白質のようなウイルス蛋白質等の関連する抗原で免疫化することにより産生される、モノクローナル抗体の製造技術が、当該分野で特によく知られている。
【００６９】
適当な細胞結合剤の選択は、標的化される特別な細胞集団に依存する選択の問題であるが、一般には、適当なものが利用できるのであれば、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７０】
例えば、モノクローナル抗体Ｊ５は、コモン・アキュート・リンホブラスティック・ロイケミア・アンチゲン（Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen ）（ＣＡＬＬＡ）〔リッツら、２８３ ネイチャー ５８３−５８５（１９８０）〕に特異的に結合するマウスＩｇＧ2a抗体であり、もし標的細胞が急性リンパ芽球性白血病の疾患のようにＣＡＬＬＡを発現するときには使用できる。同様に、モノクローナル抗体、抗−Ｂ４はマウスＩｇＧ1 であり、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合し（ナドラーら、１３１ ジャーナル・オブ・イムノロジー、２４４−２５０（１９８３））、もし標的細胞がＢ細胞、または非ホジキンリンホーマ（non-Hodgkin's lymphoma) または慢性リンパ芽球性白血病のようなこの抗原を発現する病気の細胞であれば使用できる。
【００７１】
さらに、骨髄性細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病由来の病気の細胞に対する細胞結合剤として使用できる。活性化されたＴ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶を阻止し、移植片対宿主疾患の治療及び予防し、および急性Ｔ−細胞白血病を治療するのに使用できる。メラニン細胞に結合するＭＳＨは、メラノーマの治療に使用できる。
【００７２】
胸および精巣のガンは、エストロゲン（またはエストロゲンアナログ）またはアンドロゲン（またはアンドロゲンアナログ）を細胞結合剤として各々使用して、好ましく標的化できる。
【００７３】
細胞障害剤（複合体）の調製
本発明のＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体と細胞結合剤との複合体は、現在知られており、または将来開発される任意の技術を用いて形成できる。ＣＰＩまたはＣＢＩと結合したインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニル、またはベンゾフラニル−インドリル誘導体は、遊離のアミノ基（例えば化合物１０で出発する）を含むように調製でき、次いで酸開裂性リンカーまたは光開裂性リンカーを介して抗体または他の細胞結合剤と結合される。細胞障害性の化合物は、ペプチドと縮合され、次いで細胞結合剤と連結されてペプチダーゼ開裂性リンカーを製造することができる。細胞障害性の化合物は、１級ヒドロキシル基（例えば化合物１２で出発する）を有するように調製でき、該１級ヒドロキシル基はスクシニル化され、細胞結合剤と連結されて、細胞内エステラーゼで開裂されて遊離の薬物を放出する複合体を製造することができる。最も好ましくは、細胞障害性化合物は、遊離のまたは保護されたチオール基を付与するように処理され、次いで１または多数のジスルフィドまたはチオール含有誘導体が、ジスルフィド結合を介して細胞結合剤と共有結合的に連結される。
【００７４】
本発明の代表的な複合体は、ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と抗体、抗体フラグメント、表皮成長因子（ＥＧＦ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エストロゲン、エストロゲンアナログ、アンドロゲンおよびアンドロゲンアナログとの複合体である。
【００７５】
ＣＣ−１０６５のアナログおよび誘導体と細胞結合剤の種々の複合体製造の代表例が、以下に記載される。
【００７６】
ジスルフィドリンカー
小細胞肺ガン細胞（small cell lung cancer cells）〔ジェイ．ディー．グリフィン、ティー．ハーセンド、アール．ベバリッジ アンド エス．エフ．シュロスマン、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３０：２９４７（１９８３）〕の表面に発現されるＣＤ−５６抗原に結合する抗体Ｎ９０１が、複合体の調製に用いられた。抗体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−ピリジルジチオプロピオネートを用いて上記のように修飾し〔ジェイ．カールソン、エイチ．ドレビン アンド アール アクセン、Biochem. J. 、１７３：７２３（１９７８）〕、抗体１分子当たり平均して４つのピリジルジチオ基を導入した。修飾された抗体は、チオール含有ＣＣ−１０６５アナログ７と反応させてジスルフィド結合で連結した複合体を製造した。結合された薬物分子の数は、抗体分子に導入されたピリジルジチオ基と非常に近いものであった。ビス−インドリル−ＣＰＩ薬物２０は、同様に抗体との複合体とされた（方法Ａ、Ｆｉｇ．５Ａ参照）。
【００７７】
活性化されたジスルフィド含有インドリル−ベンゾフラニルＣＰＩ誘導体１８（Ｆｉｇ．３Ｃ）の複合体を調製するために、抗体を以前に記載されているように〔ジェイ．エム．ランバートら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６０；１２０３５（１９８５）〕２−イミノチオランで修飾し、抗体１分子当たり平均して４〜６のスルフヒドリル基を導入した。薬物１８との反応により、抗体１分子当たり平均して３〜４分子の薬物を含む複合体を製造した （方法Ｂ、Ｆｉｇ．５Ｂ参照）。
【００７８】
酸−開裂性リンカー
ＣＰＩは、末端のインドリルまたはベンゾフラニル部分のＣ−５位に保護アミノ基を含有する置換基を有するインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニル、またはベンゾフラニル−インドリル誘導体と結合できる。保護基は、温和な酸性条件下で開裂し、遊離のアミノ基を生じることのできるｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはビフェニルプロピルオキシカルボニルなどの官能基が挙げられる。このアミノ基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、上記のように酸−開裂性リンカーを介して抗体または他の細胞結合剤と連結できる〔ダブリュー．エイ．ブラッターら、バイオケミストリー ２４、１５１７−１５２４（１９８５）；米国特許第４，５４２，２２５， ４，５６９，７８９， ４，６１８，４９２， ４，７６４，３６８〕。
【００７９】
同様に、ＣＰＩは、末端のインドリルまたはベンゾフラニル部分のＣ−５位に保護ヒドラジド基を含有する置換基を有するインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニル、またはベンゾフラニル−インドリル誘導体と結合できる。保護基はまた、温和な酸性条件下で開裂し、遊離のヒドラジド基を生じることのできるｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはビフェニルプロピルオキシカルボニルなどの官能基が挙げられる。
このヒドラジド基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、酸−開裂性ヒドラゾンリンカーを介して抗体または他の細胞結合剤の炭水化物部分と連結できる〔ヒドラゾンリンカーの例としては、ビー．シー．ラグザら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、３２、５４８−５５５（１９８９）；アール．エス．グリーンフィールドら、キャンサー・リサーチ、５０、６６００−６６０７（１９９０）参照〕。
【００８０】
光−開裂性リンカー
前記のアミノ基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、上記のように光開裂性リンカーを介して抗体または他の細胞結合剤と連結できる〔ピー．センターら、フォトケミストリー・アンド・フォトバイオロジー、４２、２３１−２３７（１９８５）；米国特許第４，６２５，０１４号〕。
【００８１】
ペプチダーゼ−開裂性リンカー
前記のアミノ基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体もまた、ペプチドスペーサーを介して細胞結合剤と連結できる。薬物と高分子量タンパク質担体の間の短いペプチドスペーサーは血清中では安定であるが細胞内ペプチダーゼにより容易に加水分解されることがすでに示されている〔エー．トロウトら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ、７９、６２６−６２９（１９８２）〕。アミノ基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、およびＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕなどのペプチドと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ（ＥＤＣ−ＨＣｌ）などの縮合剤の存在下に縮合させて細胞結合剤と連結したペプチド誘導体を得ることができる。
【００８２】
エステラーゼ−開裂性リンカー
ＣＰＩは、末端のインドリルまたはベンゾフラニル部分のＣ−５位にヒドロキシアルキル基を含有する置換基を有するインドリル、ベンゾフラニル、ビス−インドリル、ビス−ベンゾフラニル、インドリル−ベンゾフラニルまたはベンゾフラニル−インドリル誘導体と結合できる。このＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体は、コハク酸無水物でスクシニル化し、次いで細胞結合剤と連結することにより、細胞内エステラーゼで加水分解されて遊離の薬物を放出する複合体を製造できる〔例えば、イー．アボウド−ピラクら、Biochem. Pharmacol., ３８、６４１−６４８（１９８９）〕。
【００８３】
上記方法により製造された複合体は、標準的なカラムクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣにより精製される。
【００８４】
モノクローナル抗体または細胞結合剤とＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の間の複合体は、好ましくは、上記のようにジスルフィド結合を介して連結され、ＣＣ−１０６５またはそのアナログを送達できるものである。そのような細胞結合性複合体は、モノクローナル抗体をスクシンイミジルピリジル−ジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）で修飾するような公知の方法により調製される〔カールソンら、１７３ Biochem. J., ７２３−７３７（１９７８）〕。得られたチオピリジル基は、次いでチオール基を含有するＣＣ−１０６５またはそのアナログで処理することにより置換され、ジスルフィドで連結された複合体を得る。または、アリルジチオ−ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の場合には、細胞結合性複合体の形成は、ＣＣ−１０６５誘導体のアリル−チオール基を、抗体分子にあらかじめ導入されていたスルフヒドリル基で直接置換することにより行われる。ジスルフィド結合を介して連結された１〜１０個のＣＣ−１０６５薬物を含む複合体は、いずれかの方法により容易に調製される。
【００８５】
より詳しくは、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液 （ｐＨ７．０）中のジチオピリジル基で修飾された抗体の１ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を、チオール含有ＣＣ−１０６５またはそのアナログ（１．２５モル当量／ジチオピリジル基）と処理する。修飾された抗体からのチオピリジンの放出は、３４３ｎｍで分光学的にモニターされ、約３０分で完結する。抗体−ＣＣ−１０６５複合体は、未反応の薬物及び他の低分子量物質をセファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過により除去して精製する。抗体分子当たりに結合するＣＣ−１０６５分子またはＣＣ−１０６５アナログ分子の数は、２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比率を測定することにより決定される。平均１〜１０個のＣＣ−１０６５分子またはそのアナログ／抗体分子が、この方法によりジスルフィド結合を介して連結できる。
【００８６】
非開裂的に連結された抗体とＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の複合体を調製することもできる。該抗体は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳまたはスクシンイミジル−ヨードアセテートのような架橋試薬を用い、文献の記載に従い修飾し、１〜１０個の反応性基を導入する。ヨシタケら、１０１ ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、３９５−３９９（１９７９）；ハシダら、J. Applied. Biochem., ５６−６３（１９８４）；およびリウら、１８ バイオケミストリー、６９０−６９７（１９７９）参照。修飾された抗体は、次いでＣＣ−１０６５のチオール含有アナログまたは誘導体と反応させ、複合体を調製する。該複合体は、セファデックスＧ−２５を通すゲル濾過により精製する。
【００８７】
修飾された抗体は、チオール含有ＣＣ−１０６５（１．２５モル当量／マレイミド基））と処理する。該混合物は、約１時間、約４℃でインキュベートする。
抗体とＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の複合体は、セファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過により精製する。典型的には、平均１〜１０個のＣＣ−１０６５分子またはアナログ／抗体が、連結される。
【００８８】
好ましい方法は、抗体をスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で修飾してマレイミド基を導入し、次いで修飾された抗体を、チオール基を含有するＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体で修飾し、チオエーテル基で連結された複合体を得る。抗体分子当たり１〜１０の薬物分子を有する複合体になる。
【００８９】
細胞結合剤とＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の複合体のインビトロでの細胞障害性
ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体並びにその細胞結合剤との複合体の、ナマウラおよびＳＷ２のような非粘着細胞系に対する細胞障害性は、ゴールドマッヒャーら、１３５ ジャーナル・オブ・イムノロジー、３６４８−３６５１ （１９８５）の記載のような細胞増殖の逆−外挿（back-extrapolation）により測定される。これらの化合物のＡ−３７５やＳＣａＢＥＲのような粘着細胞系に対する細胞障害性は、ゴールドマッヒャーら、１０２ J. Cell Biol., １３１２−１３１９（１９８６）に記載されたようなクローン原性試験（clonogenic assay）により測定される。
【００９０】
選択された細胞集団を殺す治療剤及び方法
本発明はまた、以下のものからなる選択された細胞集団を殺す治療剤も提供する：
（ａ）細胞結合剤と結合した１または２以上の上記ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体の細胞障害量、および
（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤。
【００９１】
同様に、本発明は、選択された細胞集団からの細胞を含むと推測される細胞集団または組織を細胞結合剤と結合した１または２以上の上記ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体からなる細胞障害剤の細胞障害量と接触させることからなる選択された細胞集団を殺す方法を提供するものである。
【００９２】
該細胞障害剤は、上記のようにして調製される。
【００９３】
好ましい薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床的位置付けを保証するよう当業者が決定できる。
【００９４】
好ましい担体、希釈剤および／または賦形剤の例としては、（１）ヒト血清アルブミンを約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌを含むドゥルベコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、（２）０．９％生理食塩水（０．９％Ｗ／Ｖ ＮａＣｌ），および（３）５％（Ｗ／Ｖ）デキストロースが挙げられる。
【００９５】
選択された細胞集団を殺す方法は、インビトロ、インビボまたはイクスビボ （ex vivo ）で実施される。
【００９６】
インビトロでの使用例としては、標的抗原を発現しない目的とするバリアント（variant ）を除くすべての細胞殺すため；または望ましくない抗原を発現するバリアントを殺すために細胞培養物を処理することが挙げられる。
【００９７】
インビトロでの使用の非臨床的条件は、当業者により容易に決定される。
【００９８】
イクスビボでの使用例としては、病気のまたは悪性の細胞を殺すために、同じ患者への移植に先立ち自己骨髄を処理すること：コンピテントＴ細胞を殺し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するために、該移植の前に骨髄を処理することが挙げられる。
【００９９】
ガン治療または自己免疫疾患の治療において、自己移植の前に骨髄から腫瘍細胞またはリンパ系細胞を除去するため、またはＧＶＨＤを防止するために移植の前に同種間（allogeneic）骨髄または組織からＴ細胞または他のリンパ系細胞を除去するため、処理が以下のようにしてなされる。骨髄は、患者または他の個人から集められ、次いで本発明の細胞障害剤を約１０μＭ〜１ｐＭの範囲の濃度で加えた血清を含む培地を約３０分〜約４８時間、約３７℃でインキュベートされる。インキュベーションの正確な濃度及び時間条件（＝用量(dose)）は、当業者により容易に決定される。インキュベーションの後、骨髄細胞は血清を含む培地で洗浄され、公知の方法に従い静脈注入により患者に戻される。患者が、骨髄を採取してから処理された細胞を再注入するまでに間に切除的化学療法（ablative chemotherapy ）または全身照射のコースのような他の治療を受けている環境下では、処理された骨髄は標準的な医療器具を用い、液体窒素で凍結して保存される。
【０１００】
臨床的なインビボの使用では、本発明の細胞障害剤は、無菌性（sterility ）およびエンドトキシン レベルが試験された溶液として、あるいは注射用滅菌水に溶解できる凍結乾燥固体として供給できる。複合体投与の好ましいプロトコールの例を、以下に示す。複合体は、静注ボーラス（i.v. bolus）として毎日５日間投与するか、５日間持続的に注入するなどの方法で、５日間毎日投与される。
ボーラスの用量は、ヒト血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンの濃縮溶液の０．５〜１ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）が添加された通常生理食塩水（normal saline ）の５０〜１００ｍＬを投与される。持続注入の場合には、２４時間当たり、ヒト血清アルブミンの上記濃縮溶液の２．５〜５ｍＬが添加された２５０〜５００ｍＬの通常生理食塩水が投与される。投与量は、静注で１日当たり１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である（１日当たり１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲）。治療の１〜４週間後に、患者は第２コースの治療を受ける。投与経路、賦形剤、希釈剤、用量、時間などに関する特別な臨床的プロトコールは、臨床立場を保証するように当業者により決定される。
【０１０１】
選択された細胞集団を殺すインビボまたはイクスビボの方法に従い処理できる医学的条件の例としては、肺ガン、乳ガン、結腸ガン、前立腺ガン、腎臓ガン、すい臓ガン、卵巣ガンおよびリンパガンなどの任意の型のガン、メラノーマ、自己免疫疾患、慢性関節リウマチなどの全身性狼瘡、および多発性硬化症、腎臓移植片拒絶、肝臓移植片拒絶、肺移植片拒絶、心臓移植片拒絶および骨髄移植片拒絶などの移植片拒絶（transplant rejection）、移植片対宿主病、ＣＭＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなどのウイルス感染、細菌感染、ジアルジア鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症などの寄生虫感染および当業者により決定されるその他のものが挙げられる。
【０１０２】
【実施例】
本発明は、非限定的な実施例を参照して例示される。特に言及しない限り、すべてのパーセント、比率、部などは重量による。
【０１０３】
物質及び方法
融点は、電熱装置を用いて測定され、補正はされていない。ＮＭＲスペクトルは、Hitachi 1100 連続波長（６０ＭＨｚ）装置またはBruker AM300 （３００ＭＨｚ）分光計で記録した。ケミカルシフトは、内部標準としてのＴＭＳに対する相対的なｐｐｍで記録する。紫外線スペクトルは、Hitachi U1200 分光計で記録した。ＨＰＬＣは、Gilsonの可変波長検出器およびWaters Radialpak 逆相Ｃ−１８カラムを備えたRainin HPLC システムを用いて行われた。薄層クロマトグラフィーは、Analtech GF シリカゲルＴＬＣプレート上で行われた。フラッシュカラムクロマトグラフィー用のシリカゲルは、Baker から得た。テトラヒドロフランは、リチウムアルミニウムヒドリドを用いて蒸留することにより乾燥した。ジメチルアセトアミドおよびジメチルホルムアミドは、減圧下にカルシウムヒドリド上で蒸留することにより乾燥した。使用した他のすべての溶媒は、試薬級またはＨＰＬＣ級であった。
【０１０４】
ヒト小細胞肺ガン細胞系ＳＷ２は、ダナ−ファーバー・キャンサー・インスティテュート（Dana-Farber Cancer Institute）から得た。ヒトガン細胞系ナマルワ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ １４３２）、Ａ−３７５（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ １６１９）、およびＳＣａＢＥＲ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ベテスダ、エムディー（Bethesda、MD）から各々得た。
【０１０５】
実施例１
モノインドリルＣＣ−１０６５アナログ７の合成
モノインドリルＣＣ−１０６５アナログ７は、Ｆｉｇ．２に示されたスキーム１に従い合成された。
【０１０６】
３−（フェニルジチオ）プロピオン酸（４）
ジフェニルジスルフィド（９．３３ｇ、４２．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解し、３−メルカプトプロピオン酸（１．５１ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）のメタノール（４０ｍＬ）溶液および１０Ｍ ＮａＯＨ（１．４ｍＬ）溶液で順に処理した。反応混合物を窒素雰囲気下に室温で３時間撹拌した。次いで溶液を減圧下に留去し、白色の残渣を酢酸エチルに再溶解し、シリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物は、５％酢酸を含有する酢酸エチル：ヘキサンで溶出し、化合物４を白色固体として得た（１．８２ｇ、６０％）、融点５８〜５９℃。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ２．５−３．０（ｍ，４Ｈ）、７．１−７．６（ｍ，５Ｈ）および１０．８（ｓ，１Ｈ）。
【０１０７】
５−〔３−（フェニルジチオ）プロピオニルアミノ〕−インドール−２−カルボン酸（５）
化合物４（５３５ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を、アルゴン雰囲気下に−２３℃に冷却した。トリエチルアミン（２５３ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）およびイソブチルクロロホルメート（３４０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。５−アミノ−インドール−２−カルボン酸〔エム．エイ．ワーペホスキら、３１、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８）；およびエス．エム．パーメーターら、８０、J. Med. Chem. Soc., ４６２１（１９５８）〕（５４５ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を加え、反応混合物を室温まで暖め、さらに４５分間撹拌した。次いで、沈殿を濾過により除去し、濾液を減圧下に留去し、褐色の残渣を得た。５％酢酸を含有する酢酸エチル：ヘキサンで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、褐色生成物として化合物４を得た（１８５ｍｇ、２０％）。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ ２．２７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、３．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、７．００（ｓ，１Ｈ）、７．１−７．７（ｍ，８Ｈ）、７．９８（ｓ，１Ｈ）、９．９２（ｓ，１Ｈ）、１１．６２（ｓ，１Ｈ）。
【０１０８】
モノ−インドリルＣＣ−１０６５アナログ６
ＣＰＩをカルボン酸５と結合し、生成物を上記のようにして精製した〔エム．エイ．ワーペホスキら、３１、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８）〕。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ ２．４２（ｓ，３Ｈ）、２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、３．１５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、３．５０−３．６５（ｍ，１Ｈ）、３．８５−４．２０（ｍ，２Ｈ）、４．５０−４．８５（ｍ，２Ｈ）、７．００−８．９５（ｍ，１１Ｈ）、８．１６（ｓ，１Ｈ）、９．１７（ｓ，１Ｈ）、９．９３（ｓ，１Ｈ）、１０．７５（ｓ，１Ｈ）。
【０１０９】
モノ−インドリルＣＣ−１０６５アナログ７
ジスルフィド６（１．４μｍｏｌ）の試料をアセトニトリル（０．２６ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下に４℃に冷却した。ジチオスレイトール（１．５μｍｏｌ）の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（０．０６ｍＬ，ｐＨ７．５）を加え、反応の進行（１時間で完結する）をWaters radialpak 逆相Ｃ−１８カラムを用い、アセトニトリル：水（５０％ＣＨ3 ＣＮ ０−８分、５０−１００％ＣＨ3 ＣＮ ８−１２分；流速＝１．５ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出するＨＰＬＣによりモニターした。出発物質６は、保持時間が１２．３分であったが、生成物７は５．７分で溶出した。生成物７のチオール含量は、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ´ｓ）比色試験を用いて測定し、分光学的に測定した薬物濃度と正確に比例した。
【０１１０】
実施例２
インドリル−ベンゾフラニルＣＣ−１０６５アナログ１８の合成
インドリル−ベンゾフラニルＣＣ−１０６５アナログ１８は、Ｆｉｇ．３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示されたスキーム２ａ、２ｂおよび２ｃに従い合成された。
【０１１１】
ｔ−ブチル ５−ニトロインドール−２−カルボキシレート（９）
エチル ５−ニトロインドール−２−カルボキシレート（８）（４．３ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ−メタノール（１：１、ｖ／ｖ）（１００ｍＬ）撹拌溶液に、アルゴン下に室温でＮａＯＨ（１２ｇ，３００ｍｍｏｌ）の水（３００ｍＬ）溶液を加えた。得られた深い赤−褐色の溶液を３時間撹拌し、希塩酸でｐＨ１まで酸性化して反応を停止した。析出した生成物を吸引濾過で集め、溶解したままの生成物をＴＨＦ：酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）で抽出した。沈殿をＴＨＦに溶かし、この溶液を抽出からの有機層と合わせた。硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して５−ニトロインドール−２−カルボン酸（３．６ｇ、収率９０％）を淡褐色固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ ７．０−９．０（ｍ，４Ｈ）、δ ９．５（ｓ，１Ｈ）、δ １２．５（ｓ，１Ｈ）。５−ニトロインドール−２−カルボン酸（３．１ｇ、１５ｍｍｏｌ）の１５０ｍＬ ＴＨＦ撹拌溶液に、アルゴン下にオキザリルクロリド（４．８ｇ、３７．６ｍｍｏｌ）を加え、次いでＤＭＦを０．１ｍＬ加えることにより、激しくガスが発生した。４０分後、反応混合物を蒸発乾固した。得られた固体を１００ｍＬのＴＨＦに溶解し、−２３℃に冷却してアルゴン下に撹拌した。カリウムｔ−ブトキシド（１．０Ｍ ＴＨＦ中、４５ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）溶液を３０分かけて滴下し、さらに２０分間撹拌した。反応を５倍量の水で停止し、希塩酸で中和して、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、次いで濃縮して６（３．２４ｇ、収率８３％）を褐色固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ７．４−８．９（ｍ，５Ｈ）。
【０１１２】
ｔ−ブチル ５−アミノインドール−２ カルボキシレート（１０）
化合物９（３．５ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）および１００ｍＬ乾燥ＴＨＦを加えたフラスコをアルゴンガスで置換（purged）した。次いでこの溶液にパラジウム水素添加触媒（炭素上１０％、０．６ｇ）を加え、該反応混合物を水素で２．５日間バブリングした。触媒を濾過で除去し、溶媒を留去して化合物１０（２．８ｇ、収率９１％）を褐色固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ６．６−７．６（ｍ，４Ｈ）。
【０１１３】
なお、この生成物は不安定であるが、暗所、−２０℃で不活性ガス雰囲気下に貯蔵できる。
【０１１４】
ｔ−ブチル ５−（ブロモメチル）ベンゾフラン２−カルボキシレート（１２）
５−メチルベンゾフラン−２−カルボン酸（１１）を、最初に以下のようにしてｔ−ブチルエステルに変換した。化合物１１（２０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）の２５０ｍＬ乾燥ＴＨＦ撹拌溶液に、アルゴン下にオキザリルクロリド（４５ｇ、３５６ｍｍｏｌ）を加え、次いでＤＭＦを０．２５ｍＬ加えることにより、激しくガスが発生した。４０分後、該溶液を蒸発乾固した。固体残渣を２５０ｍＬの乾燥ＴＨＦに再溶解し、アルゴン下に撹拌しながら−２３℃に冷却した。次いで、カリウムｔ−ブトキシド（１．０Ｍ ＴＨＦ中、２８０ｍＬ、２８０ｍｍｏｌ）溶液を１時間かけて滴下した。反応混合物を６００ｍＬの水に注ぎ、次いで酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、留去して該エステル（２４．４ｇ、収率９３％）を黄色液体として得、−２０℃に冷却して固体とした。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ２．４（ｓ，３Ｈ）、δ ７．１−７．６（ｍ，４Ｈ）。
【０１１５】
このエステル（１０ｇ、４３．１ｍｍｏｌ）の１００ｍＬ蒸留四塩化炭素撹拌溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（９．２ｇ、５１．７ｍｍｏｌ）およびベンゾイルペルオキシド（０．２ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を１時間加熱還流した。ジブロム化した化合物の十分な形成が起こる前に反応を止めるのが重要であるため、反応の進行は、ＮＭＲ（メチル：δ ２．４；ブロモメチル：δ ４．６；ジブロモメチル：δ ６．８）によりモニターした。沈殿したスクシンイミドは、溶液から濾別し、濾液を水、飽和炭酸水素ナトリウム、水の順で洗浄した。四塩化炭素溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、留去して化合物１２（１２．９ｇ、収率９６％）を黄−白色固体として得た。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ４．６（ｓ，２Ｈ）、δ ７．３−７．９（ｍ，４Ｈ）。
【０１１６】
ｔ−ブチル ５−（Ｓ−アセチルチオメチル）ベンゾフラン−２−カルボキシレート（１３）
化合物１２（１０ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）の１００ｍＬ乾燥アセトン撹拌溶液に、アルゴン下室温でカリウムチオアセテート（６．１１ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）を加えた。３．５時間後、該反応混合物を４００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で処理し、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して濃厚黒色オイルを得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチル：ヘキサン（１０：９０）で溶出しながら精製して化合物１３（５．２ｇ、収率５５％）を淡赤色固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ２．３（ｓ，３Ｈ）、δ ４．２（ｓ，２Ｈ）、７．２−７．７（ｍ，４Ｈ）。
【０１１７】
ｔ−ブチル ５−（２−ピリジルジチオメチル）ベンゾフラン−２−カルボキシレート（１４）
化合物１３（１．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）の５０ｍＬ無水エタノール溶液をアルゴン下室温で撹拌し、水素化ホウ素ナトリウム（２．５ｇ、６５ｍｍｏｌ）の７５ｍＬエタノール溶液で処理した。反応混合物のＴＬＣ分析（シリカゲル、クロロホルム：ヘキサン ６０：４０）で出発物質のエステルが消失したとき（〜２時間）反応混合物を０℃に冷却し、３０ｍＬの水で処理した。溶液のｐＨは氷酢酸を加えて４にした。次いで溶液を３ＭのＮａＯＨを添加してｐＨを５とし、２−ピリジル−ジスルフィド（２．８７ｇ、１３ｍｍｏｌ）の１０ｍＬ無水エタノール溶液を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて停止し、該混合物をクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、留去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチル：ヘキサン（２０：８０）で溶出しながら精製し、純粋な生成物１４を白色固体として回収した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ４．１（ｓ，２Ｈ）、６．８−７．６（ｍ，７Ｈ）、８．３−８．５（ｍ，１Ｈ）。
【０１１８】
５−（２−ピリジルジチオメチル）ベンゾフラン−２−カルボン酸（１５）
トリフルオロ酢酸１５ｍＬに、アルゴン下０℃で撹拌しながらエステル１４ （２．２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を加えた。１．５時間後、トリフルオロ酢酸を反応混合物から留去し、化合物１５（１．８ｇ、収率９７％）を白色固体として得た。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ） δ ４．３（ｓ，２Ｈ）、７．０−７．８（ｍ，７Ｈ）、８．３−８．５（ｍ，１Ｈ）。
【０１１９】
ｔ−ブチル ５−〔（５−（２−ピリジルジチオメチル）ベンゾフラン−２−イルカルボニル）アミノ〕インドール−２−カルボキシレート（１６）
化合物１５（２４７ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）の３０ｍＬ乾燥ＴＨＦ溶液に、アルゴン下室温で撹拌した溶液を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１７７ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の５ｍＬ塩化メチレン溶液、４−（ジメチルアミノ）−ピリジン（２９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の２ｍＬ塩化メチレン溶液、および化合物１０（２００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の５ｍＬ塩化メチレン溶液の順で処理した。反応混合物を１昼夜撹拌した。ジシクロヘキシルウレアを反応混合物から濾別し、濾液を水、冷０．１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および水で洗浄した。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して暗色オイルを得た。粗生成物をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、酢酸エチル：ヘキサンで溶出しながら精製し、化合物１６をオフホワイト固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ４．３（ｓ，２Ｈ）、δ ７．０−８．６（ｍ，１２Ｈ）。
【０１２０】
５−〔（５−２−ピリジルジチオメチル）ベンゾフラン−２−イル−カルボニル）アミノ〕インドール−２−カルボン酸（１７）
４ｍＬのトリフルオロ酢酸を０℃に冷却し、アルゴン下撹拌しながら化合物１６（１２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、トリフルオロ酢酸を減圧下に除去し、化合物１７をオフホワイト固体として得た。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ ４．３（ｓ，２Ｈ）、δ ７．３−８．７（ｍ，１２Ｈ）。
【０１２１】
インドリル−ベンゾフラニル−ＣＣ−１０６５アナログ１８
ＣＰＩを上記のＥＤＣの存在下に化合物１７と結合させ、化合物１８を得た。
化合物１８の分析は、Waters 逆相Ｃ−１８ ＨＰＬＣカラムでアセトニトリルと水の混合物を溶出液（プログラム：０−４分、６０％ＣＨ3 ＣＮ；４−５分、０−１００％ＣＨ3 ＣＮ；５−１５分、１００％ＣＨ3 ＣＮ；流速 １．５ｍｌ／分）として用いて行い、８．２分に単一ピークを得た。
【０１２２】
実施例３
ビス−インドリル ＣＣ−１０６５アナログ２２の合成
ビス−インドリル−ＣＣ−１０６５アナログ２２は、Ｆｉｇ．４に示すスキーム３に従い合成された。
【０１２３】
ｔ−ブチル （３´−フェニルジチオプロピオニル）−５−アミノインドール−２−カルボキシレート（１９）
３−フェニルジチオプロピオン酸（４）（１．４０ｇ、６．５４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）撹拌溶液に、−２３℃でイソブチルクロロホルメート （０．９３ｍＬ、７．１９ｍｍｏｌ）を加え、その直後にトリエチルアミン（１．０１ｍＬ、７．１９ｍｍｏｌ）を加えた。−２３℃で１５分間撹拌後、ｔ−ブチル−５−アミノインドール−２−カルボキシレート（１０）（１．５２ｇ、６．５４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．９２ｍＬ、６．５４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液を５分間かけてゆっくり滴下した。反応混合物を−２３℃で３０分間撹拌後、周囲の温度でさらに３０分間撹拌した。反応混合物に０．５Ｍ塩酸を５０ｍＬ加えて酸性とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和ＮａＨＣＯ3 、水の順で洗浄し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、酢酸エチルのヘキサン溶液のグラジエントで溶出しながら精製し、生成物１９をオフホワイト固体として得た（１．４３ｇ、収率５１％）。ＮＭＲ（アセトン−ｄ6 ）δ １．６（ｓ，９Ｈ）、δ ２．９−３．３（ｍ，４Ｈ）、δ ７．０−８．１（ｍ，９Ｈ）、９．１５（ｓ，１Ｈ）。
【０１２４】
ｔ−ブチル ５−〔（３´−フェニルジチオプロピオニル）インドール−２−イルカルボニルアミノ〕インドール−２−カルボキシレート（２０）
エステル１９（１．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１４ｍＬ）と０℃でアルゴン雰囲気下に処理した。反応混合物をこの温度で１時間撹拌した。次いで該溶液を減圧下に蒸発乾固し、得られたカルボン酸をさらに精製することなく次の工程に使用した。
【０１２５】
上記の得られたカルボン酸（２５０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ （１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下に撹拌し、アミノエステル１０（１４９ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液およびＥＤＣ（１２４ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液で処理した。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。次いで、冷０．５Ｍ ＨＣｌ（２５ｍＬ）を加え、混合物をＴＨＦ：酢酸エチル（１：１（ｖ／ｖ）、４×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて順に水（４×１００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２×１００ｍＬ）および水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4 で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下蒸発乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、アセトン：トルエン（３０：７０ ｖ／ｖ）で溶出しながら精製し、純粋な生成物２０（２００ｍｇ、収率５２％）を得た。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：８．１２−７．１０（ｍ，１３Ｈ）、 ３．３−２．７７（ｍ，４Ｈ）、 １．５８（ｓ，９Ｈ）。
【０１２６】
２０のビス−インドリル−ＣＣ−１０６５アナログ２１への変換
上記エステル１９の加水分解と同様にして、エステル２０を０℃でトリフルオロ酢酸を用いて０℃でカルボン酸に加水分解した。得られたカルボン酸を上記のように〔エム．エイ．ワーペホスキら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、５９０−６０３（１９８８）〕ＥＤＣを用いてＣＰＩと結合させ、ビス−インドリル−ＣＣ−１０６５アナログ２１を得た。アセトニトリルと水の混合液を溶出液（プログラム：６０−１００％ＣＨ3 ＣＮで１０分間、１００％ＣＨ3 ＣＮで５分間、流速 ２．５ｍＬ／分）として用いたWaters 逆相Ｃ−１８カラム上での化合物２１のＨＰＬＣによる分析では、１０．１分の保持時間に化合物２１の単一ピークが得られた。
【０１２７】
２１のチオール含有ＣＣ−１０６５アナログ２２への還元
ビス−インドリル−ＣＣ−１０６５アナログ２１（．０４μｍｏｌ）のアセトニトリル：ＴＨＦ（０．０８ｍＬ）（１：１、ｖ／ｖ）溶液を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５；０．０１４ｍＬ）に溶解したジチオスレイトール（．０６μｍｏｌ）で処理した。反応混合物をアルゴン雰囲気下に４℃で４時間維持した。このとき、ジチオスレイトール（０．１８μｍｏｌ）の追加分を加えた。３０分後、反応混合物をＨＰＬＣ（上記化合物２１の精製条件と同じ）で精製した。保持時間８．０分の新たなピークをチオール含有ＣＣ−１０６５アナログ２２として同定した。このピークは、特徴的な吸収スペクトルを有し、エルマン試験（Ellman's assay）〔ジー．エル．エルマン、８２、Arch. Biochem. Biophys., ７０（１９５９）〕を用いるチオール試験に陽性であった。
【０１２８】
実施例４
抗体に対する薬物複合体
抗体に対する薬物複合体は、以下のようにして得られた。
【０１２９】
方法Ａ
薬物は、チオール基を含有する：抗体は、ＳＰＤＰ〔Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート〕で修飾して、ジチオピリジル基を導入した。チオール基を含有する薬物と修飾された抗体との反応により、ジスルフィド基で結合された複合体を製造した。
【０１３０】
方法Ｂ
薬物は、活性化されたジスルフィド基を含有する：抗体は、２−イミノチオランで修飾し、チオール基を導入した。修飾された抗体の薬物との反応により、ジスルフィド基で結合された複合体を製造した。
【０１３１】
方法Ａ
抗体Ｎ９０１を前述のように〔ジェイ．カールソンら、１７３ Biochem. J.,７２３（１９７８）〕ＳＰＤＰで修飾して、抗体分子当たり平均して４〜６個のジチオピリジル基を導入した。２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム中の、４ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体溶液を１０倍モル過剰のＳＰＤＰのエタノール溶液で処理し、該混合物を３０℃で３０分間インキュベートした。修飾された抗体は、セファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過で精製し、次いで１０倍モル過剰のチオール含有薬物のジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）溶液で、ＤＭＡの最終濃度が１０％以下になるようにインキュベートした。複合体混合物は、アルゴン雰囲気下に暗所、２０℃で３時間インキュベートし、次いでセファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過で精製し、複合体になっていない薬物及び他の低分子量物質を除去した。抗体分子当たり平均４分子の薬物を含む複合体が、この方法により得られた。
【０１３２】
方法Ｂ
抗体Ｎ９０１を２−イミノチオラン（２−ＩＴ）を用いて修飾し、前述のように〔ジェイ．エム．ランバートら、２６０ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１２０３５（１９８５）〕抗体分子当たり平均して４〜６個のチオール基を導入した。２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ８．０の０．１Ｍのトリエタノールアミン緩衝液中の、４ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体溶液を２−イミノチオラン（最終濃度＝１．５ｍＭ）溶液で処理し、アルゴン雰囲気下に４℃で９０分間インキュベートした。修飾された抗体は、セファデックスＧ−２５カラムを通すゲル濾過で精製した。チオール基の導入は、エルマン試験（８２、Arch. Biochem. Biophys., ７０（１９５９））を用いて決定した。修飾された抗体に、化合物１６のＤＭＡ溶液を、化合物１６が１０倍モル過剰になるように、且つＤＭＡの最終濃度が１０％以下になるように加えた。複合体形成用混合物は、濁った状態になり、アルゴン雰囲気下に暗所、２０℃で３時間インキュベートした。
遠心分離で該溶液を透明にし、次いでセファデックスＧ−２５カラムにかけて未反応の薬物を除去した。得られた複合体は、抗体分子当たり平均３〜５分子の薬物を含んでいた。
【０１３３】
実施例５
抗体−ＳＳ−薬物複合体のインビトロでの細胞障害性及び特異性
Ｎ９０１−ＳＳ−薬物７のインビトロでの細胞障害性
ジスルフィドで連結されたモノ−インドリルＣＰＩ誘導体７の抗体Ｎ９０１との、抗体分子当たり平均３．３個の薬物分子を含有する複合体のインビトロでの細胞障害性を、抗原陽性ＳＷ２細胞および抗原陰性ナマルワ細胞について測定した。細胞は、該複合体と３７℃で２４時間さらされ、生き残った細胞フラクションを成長逆−外挿試験（growth back-extrapolation assay)〔ブイ．エス．ゴールドマッヒャーら、１３５、ジャーナル・オブ・イムノロジー、３６４８−３６５１（１９８５）〕を用いて測定した。
【０１３４】
結果をＦｉｇ．６に示す。Ｆｉｇ．６において、横軸は、薬物濃度を示し、縦軸は生存細胞のフラクションを示す。●は、ＳＷ２細胞を示し、○はナマルワ細胞を示す。
【０１３５】
この結果は、該複合体は抗原陽性ＳＷ２細胞に対する細胞障害性は、ＩＣ50値が１．４×１０-11 Ｍと、非常に強いことを示している。一方、この複合体は抗原陰性ナマルワ細胞に対し、ＩＣ50値が１×１０-9Ｍと非障害性でさえあり、細胞障害効果の特異性を示している。１０００倍過剰の非複合体抗体を添加するとＳＷ２細胞に対する細胞障害性は消滅した。これは、さらに細胞障害効果の抗原特異性を示している。
【０１３６】
上記のジスルフィドで連結された複合体のインビトロでの細胞障害性は、抗原陽性Ａ３７５細胞および抗原陰性ＳｃＡＢＥＲ細胞についても測定された。細胞は、該複合体と３７℃で２４時間さらされ、生き残った細胞フラクションをクローン原性試験（clonogenic assay）〔シー．エフ．スコットら、２５、Cancer Immunol. Immunother., ３１−４０（１９８７）〕を用いて測定した。
【０１３７】
結果をＦｉｇ．７に示す。Ｆｉｇ．７において、横軸は、薬物濃度を示し、縦軸は生存細胞のフラクションを示す。●は、Ａ３７５細胞を示し、○はＳｃＡＢＥＲ細胞を示す。
【０１３８】
この結果は、該複合体はメラノーマ細胞系のＡ３７５に対し幾分細胞障害性が低い（ＩＣ50＝２×１０-10 Ｍ、Ｆｉｇ．７）ことを示している。減少した細胞障害性は、この細胞系がＮ９０１よりもずっと少ない抗原しか発現しない事実と矛盾しない。ここでも再び、該複合体は抗原陰性のヒト膀胱ガン細胞系ＳＣａＢＥＲに対し、非障害性である（１×１０-9Ｍでの生存フラクション＝１００％）。 Ｎ９０１−ＳＳ−薬物１８のインビトロでの細胞障害性
ジスルフィドで連結されたインドリル−ベンゾフランＣＣ−１０６５アナログ１８と抗体Ｎ９０１の、抗体分子当たり平均２個の薬物分子を含有する複合体のインビトロでの細胞障害性を、抗原陽性ＳＷ２細胞および抗原陰性ナマルワ細胞について測定した。細胞は、該複合体と３７℃で２４時間さらされ、生き残った細胞フラクションを成長逆−外挿試験〔ブイ．エス．ゴールドマッヒャーら、１３５、ジャーナル・オブ・イムノロジー、３６４８−３６５１（１９８５）〕を用いて測定した。
【０１３９】
結果をＦｉｇ．８に示す。Ｆｉｇ．８において、横軸は、薬物濃度を示し、縦軸は生存細胞のフラクションを示す。●は、ＳＷ２細胞を示し、○はナマルワ細胞を示す。
【０１４０】
この結果は、該複合体は抗原陽性ＳＷ２細胞に対する細胞障害性は、ＩＣ50値が１×１０-10 Ｍ（１×１０-9Ｍで９９．９％の細胞を殺す）と、非常に強いが、一方、この複合体は抗原陰性ナマルワ細胞に対し、試験された最高の濃度である１００倍の濃度（１×１０-8Ｍ）でさえ非障害性でさえあり、１００％の細胞が生存した。
【０１４１】
Ｎ９０１−ＳＳ−薬物２２のインビトロでの細胞障害性
ジスルフィドで連結されたインドリル−ベンゾフランＣＣ−１０６５アナログ２２と抗体Ｎ９０１の、抗体分子当たり平均４個の薬物分子を含有する複合体のインビトロでの細胞障害性を、抗原陽性ＳＷ２細胞および抗原陰性ナマルワ細胞について測定した。細胞は、該複合体に３７℃で２４時間さらされ、生き残った細胞フラクションを成長逆−外挿試験〔ブイ．エス．ゴールドマッヒャーら、１３５、ジャーナル・オブ・イムノロジー、３６４８−３６５１（１９８５）〕を用いて測定した。
【０１４２】
結果をＦｉｇ．９に示す。Ｆｉｇ．９において、横軸は、複合体または薬物濃度を示し、縦軸は生存細胞のフラクションを示す。●は、抗原陽性ＳＷ２細胞に対する複合体のデータを示し、▲は遊離のＣＣ−１０６５アナログ２２を示し、■は遊離の抗体の存在下での複合体のデータを示し、◆は、抗原陰性ナマルワ細胞の複合体のデータを示す。
【０１４３】
この結果は、該複合体は抗原陽性ＳＷ２細胞に対する細胞障害性は、ＩＣ50値が１．９×１０-11 Ｍ（２×１０-9Ｍで９９．９％の細胞を殺す）と、非常に強いが、一方、この複合体は抗原陰性ナマルワ細胞に対し、１００倍高い濃度（１×１０-9Ｍ）でさえずっと弱い障害性しか示さない。
【０１４４】
本発明は、具体的な実施例を用いて説明されたけれども、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から離れないで種々の変更及び修飾を行えることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆｉｇ．１Ａは、ＣＣ−１０６５およびそのサブユニットＡ、ＢおよびＣの構造を示す。Ｆｉｇ．１ＢおよびＦｉｇ．１Ｃは、２種の公知のＣＣ−１０６５アナログの構造を示す。
【図２】Ｆｉｇ．２は、本発明のモノ−インドリルＣＣ−１０６５アナログ７を製造する合成スキームである。
【図３】Ｆｉｇ．３ＡおよびＦｉｇ．３Ｂは、本発明のインドリル−ベンゾフラニルＣＣ−１０６５アナログ１８を製造する合成スキームの一部を示す。
【図４】Ｆｉｇ．３Ｃは、本発明のインドリル−ベンゾフラニルＣＣ−１０６５アナログ１８を製造する合成スキームの一部を示す。
【図５】Ｆｉｇ．４は、本発明のビス−インドリルＣＣ−１０６５アナログ２２を製造する合成スキームを示す。
【図６】Ｆｉｇ．５ＡおよびＦｉｇ．５Ｂは、本発明の複合体を調製する方法のダイアグラムである。Ｆｉｇ．５Ａは、チオール含有ＣＣ−１０６５アナログを用いる方法のダイアグラムであり、Ｆｉｇ．５Ｂは、活性化されたジスルフィド含有ＣＣ−１０６５アナログを用いる方法のダイアグラムである。
【図７】Ｆｉｇ．６は、本発明の複合体の誘導体薬物７のＳＷ２およびナマルワ細胞に対するインビトロでの細胞障害性および特異性を示すグラフである。横軸は、複合体の濃度を示し、縦軸は細胞の生存フラクションを示す。●は、抗原陽性ＳＷ２細胞のデータを示し、○は抗原陰性ナマルワ細胞のデータを示す。
【図８】Ｆｉｇ．７は、本発明の複合体の誘導体薬物７の抗原陽性Ａ−３７５および抗原陰性ＳＣａＢＥＲ細胞に対するインビトロでの細胞障害性および特異性を示すグラフである。横軸は、複合体の濃度を示し、縦軸は細胞の生存フラクションを示す。●は、Ａ−３７５細胞のデータを示し、○はＳＣａＢＥＲ細胞のデータを示す。
【図９】Ｆｉｇ．８は、本発明のＣＣ−１０６５アナログ１８複合体のＳＷ２およびナマルワ細胞に対するインビトロでの細胞障害性および特異性を示すグラフである。横軸は、複合体の濃度を示し、縦軸は細胞の生存フラクションを示す。●は、抗原陽性ＳＷ２細胞のデータを示し、○は抗原陰性ナマルワ細胞のデータを示す。
【図１０】Ｆｉｇ．９は、本発明のＣＣ−１０６５アナログ２２複合体のＳＷ２およびナマルワ細胞に対するインビトロでの細胞障害性および特異性を示すグラフである。横軸は、複合体または遊離のＣＣ−１０６５アナログ２２の濃度を示し、縦軸は細胞の生存フラクションを示す。●は、抗原陽性ＳＷ２細胞に対する複合体のデータを示し、▲は遊離のＣＣ−１０６５アナログ２２のデータを示し、■は遊離の抗体の存在下での複合体のデータを示し、◆は、抗原陰性ナマルワ細胞の複合体のデータを示す。
Claims (62)
- １または２以上のＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と連結された細胞結合剤からなり、細胞結合剤に該誘導体を連結させるに先立ち、該誘導体は、Ａサブユニットのピロール部分の２級アミノ基とＢ−サブユニットのＣ−２カルボキシル基とのアミド結合を介して、式（Ｆ−１）、（Ｆ−２）、（Ｆ−３）、（Ｆ−４）、（Ｆ−５）、（Ｆ−６）、（Ｆ−７）、（Ｆ−８）、（Ｆ−９）または（Ｆ−１０）のＢ−サブユニットまたはＢ−Ｃサブユニットと共有結合した式（Ａ−３）または（Ａ−４）のＡサブユニットからなる群から選ばれ、式（Ａ−３）から（Ａ−４）は以下に示すものであり、
- ＲおよびＲ´が連結を可能にする基を示し、Ｒ1 からＲ6 が水素原子を示す請求項１に記載の細胞障害剤。
- ＲおよびＲ´がＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤をジスルフィド結合を介して連結することを可能にする基を示す請求項１または２に記載の細胞障害剤。
- Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨＣＯＣ6 Ｈ4 （ＣＨ2）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 を示し、Ｒ´が（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 を示す〔式中、Ｚ0 は、ＨまたはＳＲ7 を示し、Ｒ7 はメチル基、直鎖アルキル基、分枝を有するアルキル基、環状アルキル基、無置換または置換されたアリール基、または複素環を示し、およびｌは１〜１０の整数を示す。〕、請求項１または２に記載の細胞障害剤。
- Ｚ0 は水素原子を示し、ｌは２を示す請求項４に記載の細胞障害剤。
- Ｚ0 はＳＲ7 を示し、Ｒ7 は複素環を示し、ｌは１を示す請求項４に記載の細胞障害剤。
- Ｒ7 が、２位で置換されたピリジン基である請求項６に記載の細胞障害剤。
- ＲおよびＲ´が、ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基またはエステラーゼ−開裂性基を介した連結を可能にする基を示す請求項１または２に記載の細胞障害剤。
- 前記細胞結合剤がペプチドまたは非ペプチドである請求項１または２に記載の細胞障害剤。
- 前記細胞結合剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求項１または２に記載の細胞障害剤。
- 前記細胞結合剤がモノクローナル抗体である請求項１０に記載の細胞障害剤。
- 前記細胞結合剤が少なくとも１種の前記抗体との結合部位を有する請求項１０に記載の細胞障害剤。
- 前記細胞結合剤が少なくとも１種の前記抗体との結合部位を有する請求項１１に記載の細胞障害剤。
- 前記細胞結合剤がホルモンである請求項１または２に記載の細胞障害剤。
- 前記ホルモンがメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）またはそのアナログである請求項１４に記載の細胞障害剤。
- 前記ホルモンが甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）またはそのアナログである請求項１４に記載の細胞障害剤。
- 前記細胞結合剤が成長因子である請求項１または２に記載の細胞障害剤。
- 前記成長因子が表皮成長因子（ＥＧＦ）である請求項１７に記載の細胞障害剤。
- 前記成長因子が形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）である請求項１７に記載の細胞障害剤。
- 選択された細胞集団を殺す治療薬であって、（ａ）請求項１に記載の１または２以上の細胞障害剤の細胞障害量、および（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む治療薬。
- ＲおよびＲ´が連結を可能にする基を示し、Ｒ1 からＲ6 が水素原子を示す請求項２０に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- ＲおよびＲ´がＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤をジスルフィド結合を介して連結することを可能にする基を示す請求項２０または２１に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨＣＯＣ6 Ｈ4 （ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 を示し、Ｒ´が（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 を示す〔式中、Ｚ0 は、ＨまたはＳＲ7 を示し、Ｒ7 はメチル基、直鎖アルキル基、分枝を有するアルキル基、環状アルキル基、無置換または置換されたアリール基、または複素環を示し、およびｌは１〜１０の整数を示す。〕、請求項２０または２１に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- Ｚ0 は水素原子を示し、ｌは２を示す請求項２３に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- Ｚ0 はＳＲ7 を示し、Ｒ7 は複素環を示し、ｌは１を示す請求項２３に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- Ｒ7 が、２位で置換されたピリジン基を示す請求項２５に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- ＲおよびＲ´が、ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基またはエステラーゼ−開裂性基を介した連結を可能にする基を示す請求項２０または２１に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記細胞結合剤がペプチドまたは非ペプチドである請求項２０または２１に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記細胞結合剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求項２０または２１に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記細胞結合剤がモノクローナル抗体である請求項２９に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記細胞結合剤が少なくとも１種の前記抗体との結合部位を有する請求項２９に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記細胞結合剤が少なくとも１種の前記抗体との結合部位を有する請求項３０に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記細胞結合剤がホルモンである請求項２０または２１に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記ホルモンがメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）またはそのアナログである請求項３３に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記ホルモンが甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）またはそのアナログである請求項３３に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記細胞結合剤が成長因子である請求項２０または２１に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記成長因子が表皮成長因子（ＥＧＦ）である請求項３６に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 前記成長因子が形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）である請求項３６に記載の選択された細胞集団を殺す治療薬。
- 選択された細胞集団由来の細胞を含むと推測される細胞集団または組織を請求項１に記載の細胞障害剤の細胞障害量と接触させる工程を含む選択された細胞集団を殺す方法（in vivoにおいてヒトの細胞集団を殺す場合を除く）。
- ＲおよびＲ´が連結を可能にする基を示し、Ｒ1 からＲ6 が水素原子を示す請求項３９に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- ＲおよびＲ´がＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤をジスルフィド結合を介して連結することを可能にする基を示す請求項３９または４０に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨＣＯＣ6 Ｈ4 （ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 を示し、Ｒ´が（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 、ＮＨ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 またはＯ（ＣＨ2 ）l ＳＺ0 を示す〔式中、Ｚ0 は、ＨまたはＳＲ7 を示し、Ｒ7 はメチル基、直鎖アルキル基、分枝を有するアルキル基、環状アルキル基、無置換または置換されたアリール基、または複素環を示し、およびｌは１〜１０の整数を示す。〕、請求項３９または４０に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- Ｚ0 は水素原子を示し、ｌは２を示す請求項４２に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- Ｚ0 はＳＲ7 を示し、Ｒ7 は複素環を示し、ｌは１を示す請求項４２に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- Ｒ7 が、２位で置換されたピリジン基を示す請求項４４に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- ＲおよびＲ´が、ＣＣ−１０６５のアナログまたは誘導体と細胞結合剤との酸−開裂性基、光−開裂性基、ペプチダーゼ−開裂性基またはエステラーゼ−開裂性基を介した連結を可能にする基を示す請求項３９または４０に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記細胞結合剤がペプチドまたは非ペプチドである請求項３９または４０に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記細胞結合剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求項３９または４０に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記細胞結合剤がモノクローナル抗体である請求項４８に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記細胞結合剤が少なくとも１種の前記抗体との結合部位を有する請求項４８に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記細胞結合剤が少なくとも１種の前記抗体との結合部位を有する請求項４９に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記細胞結合剤がホルモンである請求項３９または４０に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記ホルモンがメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）またはそのアナログである請求項５２に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記ホルモンが甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）またはそのアナログである請求項４８に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記細胞結合剤が成長因子である請求項３９または４０に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記成長因子が表皮成長因子（ＥＧＦ）である請求項５５に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- 前記成長因子が形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）である請求項５５に記載の選択された細胞集団を殺す方法。
- Ａサブユニットのピロール部分の２級アミノ基とＢ−サブユニットのＣ−２カルボキシル基とのアミド結合を介して、式（Ｆ−１）、（Ｆ−２）、（Ｆ−３）、（Ｆ−４）、（Ｆ−５）、（Ｆ−６）、（Ｆ−７）、（Ｆ−８）、（Ｆ−９）または（Ｆ−１０）のＢ−サブユニットまたはＢ−Ｃサブユニットと共有結合した式（Ａ−３）または（Ａ−４）のＡサブユニットからなる群から選ばれ、式（Ａ−３）から（Ａ−４）は以下に示すものであり、
- Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ 2 ） l ＳＺ 0 、ＮＨＣＯＣ 6 Ｈ 4 （ＣＨ 2 ） l ＳＺ 0 またはＯ（ＣＨ 2 ） l ＳＺ 0 を示し、およびＲ´が（ＣＨ 2 ） l ＳＺ 0 、ＮＨ（ＣＨ 2 ） l ＳＺ 0 またはＯ（ＣＨ 2 ） l ＳＺ 0 を示し〔式中、Ｚ 0 は、ＨまたはＳＲ 7 を示し、Ｒ 7 はメチル基、直鎖アルキル基、分枝を有するアルキル基、環状アルキル基、無置換または置換されたアリール基、または複素環を示し、およびｌは１〜１０の整数を示す。〕、Ｒ1 からＲ6 が水素原子を示す請求項５８に記載の誘導体。
- Ｚ0 は水素原子を示し、ｌは２を示す請求項５９に記載の誘導体。
- Ｚ0 はＳＲ7 を示し、Ｒ7 は複素環を示し、ｌは１を示す請求項５９に記載の誘導体。
- Ｒ7 が、２位で置換されたピリジン基である請求項６１に記載の誘導体。
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