JP2024041917A - 細胞を再プログラム化するための精製された修飾rnaを含むrna調製物 - Google Patents
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Abstract
【課題】iPS細胞誘導因子をコードする一本鎖mRNAを含む精製されたRNA調製物を用いて、体細胞を再プログラム化するための組成物および方法を提供する。【解決手段】インビトロに存在する哺乳類細胞を誘導して組換えタンパク質を産生する方法であって、組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、インビトロで合成されたmRNAの調製物と、前記哺乳類細胞とを接触させる工程を包含し、前記mRNAは、インビトロで転写することにより得られ、Ψ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)又は修飾された核酸塩基を含むΨ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)を含み、かつ前記mRNAの調製物は、生得的免疫応答を誘導することによる前記細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く精製工程を用いて精製される、方法である。【選択図】図1
Description
本出願は、そのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれる、2009年12月7日に出願された米国仮出願シリアル番号第61/267,312号に対する優先権を主張する。
本出願は、2005年8月23日に出願された米国仮出願第60/710,164号に対する優先権を主張する2006年8月21日に出願されたPCT/US06/32372の米国国内登録である2009年3月27日に出願された米国出願シリアル番号第11/990,646号に対する優先権も主張し、これらのすべては全体として引用により本明細書に組み込まれる。
(本発明の分野)
本発明は、ヒトまたは他の動物細胞を含む真核細胞の分化の状態を、該真核細胞と再プログラム化因子(例えば、iPS細胞誘導因子)を各々コードする1つ以上の異なる一本鎖mRNA分子を含むかまたは該分子からなる精製されたRNA調製物を接触させることによって変化または再プログラム化するための組成物および方法に関する。精製された一本鎖mRNA分子は好ましくは、対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに(例えば、対応する修飾されていないA、C、G、またはTの通常のヌクレオシドの実質的にすべての替わりに)、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド(例えば、プソイドウリジン(ギリシャ文字「プサイ」または「Ψ」によって略記)、5-メチルシトシン(m5C)、5-メチルウリジン(m5U)、2’-O-メチルウリジン(Umまたはm2’-OU)、2-チオウリジン(s2U)、およびN6-メチルアデノシン(m6A)からなる群から選択される)を含む。加えて、一本鎖mRNA分子は好ましくは、意図されていない応答を活性化させ、一本鎖mRNAの発現を低下させ、および/または細胞におけるRNAセンサーを活性化させるであろうRNA夾雑物分子が実質的にないように精製される。ある実施態様において、精製されたRNA調製物は、完全長の一本鎖mRNA分子よりも短いかもしくは長い、二本鎖の、および/またはキャッピングされていないRNAである、RNA夾雑物分子が実質的にない。
本発明は、ヒトまたは他の動物細胞を含む真核細胞の分化の状態を、該真核細胞と再プログラム化因子(例えば、iPS細胞誘導因子)を各々コードする1つ以上の異なる一本鎖mRNA分子を含むかまたは該分子からなる精製されたRNA調製物を接触させることによって変化または再プログラム化するための組成物および方法に関する。精製された一本鎖mRNA分子は好ましくは、対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに(例えば、対応する修飾されていないA、C、G、またはTの通常のヌクレオシドの実質的にすべての替わりに)、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド(例えば、プソイドウリジン(ギリシャ文字「プサイ」または「Ψ」によって略記)、5-メチルシトシン(m5C)、5-メチルウリジン(m5U)、2’-O-メチルウリジン(Umまたはm2’-OU)、2-チオウリジン(s2U)、およびN6-メチルアデノシン(m6A)からなる群から選択される)を含む。加えて、一本鎖mRNA分子は好ましくは、意図されていない応答を活性化させ、一本鎖mRNAの発現を低下させ、および/または細胞におけるRNAセンサーを活性化させるであろうRNA夾雑物分子が実質的にないように精製される。ある実施態様において、精製されたRNA調製物は、完全長の一本鎖mRNA分子よりも短いかもしくは長い、二本鎖の、および/またはキャッピングされていないRNAである、RNA夾雑物分子が実質的にない。
2006年において、4つのタンパク質因子(OCT4(オクタマー-4;POUクラス5ホメオボックス1)、SOX2(SRY(性決定領域Y)-ボックス2)、KLF4(Krueppel様因子4)、およびc-MYC)をコードする遺伝子の、分化したマウス体細胞への導入は、多能性幹細胞(本明細書では「人工多能性幹細胞」、「iPS細胞」、または「iPSC」と呼ぶ)になるよう該細胞を誘導することが報告された(Takahashi and Yamanaka 2006)。この元の報告に続いて、多能性幹細胞は、ヒト体細胞を、類似のヒトタンパク質因子(OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC)をコードする遺伝子で形質転換することによっても(Takahashi et al. 2007)、またはヒトOCT4およびSOX2をコードする遺伝子ならびに2つの他のヒト因子であるNANOGおよびLIN28(Lin-28ホモログA)をコードする遺伝子で形質転換することによっても(Yu et al. 2007)誘導された。これらの方法はすべて、レトロウイルスまたはレンチウイルスを用い、再プログラム化因子をコードする遺伝子を、形質転換された細胞のゲノムへと組み込み、体細胞は、長時間にわたってのみiPS細胞へと再プログラム化された(例えば、1週間超)。
分化した体細胞からのiPS細胞の作製は、細胞移植を通じて疾患を治療するための可能な手段として大いに期待される。個々の患者由来の体細胞からiPS細胞を作製する可能性は、免疫拒絶によるリスクを低下させた患者特異的療法の開発も可能にし得る。なおもさらに、疾患特異的体細胞からのiPS細胞の作製は、特異的疾患状態を治療するための薬剤を研究および開発するための手段として期待される(Ebert et al. 2009, Lee et al. 2009, Maehr et al. 2009)。
タンパク質再プログラム化因子(または「iPSC因子」)をコードする遺伝子のウイルス送達は、体細胞からiPS細胞を作製するための非常に効率的な方法を提供するが、外来性DNAのゲノムへの組み込みは、ランダムであろうと非ランダムであろうと、予測不可能な結果を生じ、究極的には癌をもたらし得る(Nakagawa et al. 2008)。新たな報告は、iPS細胞がゲノム組み込みを必要としない他の方法を用いることによって、(より低い効率で)作製されることができることを示す。例えば、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCについての遺伝子を含む発現プラスミドのマウス胚性線維芽細胞への反復した形質移入によりiPS細胞を作製することが示された(Okita et al. 2008)。人工多能性幹細胞は、ヒトOCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG、およびLIN28をコードする遺伝子を発現したプラスミドの導入によって、ヒト体細胞からも作製された(Yu et al. 2009)。iPS細胞を作製するための他の成功したアプローチには、体細胞を、組換えタンパク質再プログラム化因子(Zhou et al. 2009)、非組み込みアデノウイルス(Stadtfeld et al. 2008)、またはピギーバック式トランスポゾン(Woltjen et al. 2009)で処理して、再プログラム化因子を送達することが含まれる。現在のところ、これらの非ウイルス送達技術を用いて、再プログラム化因子を送達するiPS細胞の作製は、極度に非効率的である。可能性のある臨床用途のためにiPS細胞を作製するための方法は、ゲノム完全性を維持しながらiPS細胞の形成の速度および効率性を高める必要がある。
本発明は、ヒトまたは他の動物細胞を含めた真核細胞の分化の状態を、該細胞を、再プログラム化因子(例えば、iPS細胞誘導因子)を各々コードする1つ以上の異なる一本鎖mRNA分子を含むかまたは該分子からなる精製されたRNA調製物と接触させることによって再プログラム化するための組成物および方法を提供する。精製された一本鎖mRNA分子は好ましくは、(例えば、プソイドウリジン(Ψ)、5-メチルシトシン(m5C)、5-メチルウリジン(m5U)、2’-O-メチルウリジン(Umまたはm2’-OU)、2-チオウリジン(s2U)、およびN6-メチルアデノシン(m6A)からなる群から選択された)少なくとも1つの修飾されたヌクレオシドを、対応する修飾されていないA、C、G、またはTの通常のヌクレオシドの対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの替わりに含む。加えて、一本鎖mRNA分子は好ましくは、細胞において、意図されていない応答を活性化し、一本鎖mRNAの発現を低下させ、および/またはRNAセンサー(例えば、二本鎖RNA依存性酵素)を活性化するであろうRNA夾雑物分子が実質的にないように精製される。ある実施態様において、精製されたRNA調製物は、完全長の一本鎖mRNA分子よりも短いかまたは長いRNA、二本鎖RNA、および/またはキャッピングされていないRNAである、RNA夾雑物分子が実質的にない。いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、ヒトまたは他の動物体細胞を含めた分化した真核細胞を、iPS細胞誘導因子を各々コードする1つ以上の異なる一本鎖mRNA分子を含むかまたは該分子からなる精製されたRNA調製物と接触させることによってプログラム化するための組成物および方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、体細胞の分化の状態を変化させるための方法であって、iPS細胞誘導因子をコードするmRNAを体細胞へ導入して、再プログラム化された脱分化した細胞を作製し、この中で、該mRNAは、少なくとも1つの5-メチルシチジン(または本明細書に説明される他の修飾された塩基)を含むことを含む、該方法を提供する。
ある実施態様において、本発明は、第一の分化した状態または表現型を呈する細胞を、第二の分化した状態または表現型を呈する細胞に再プログラム化するための方法であって、第一の分化した状態を呈する細胞に少なくとも1つの再プログラム化因子をコードする修飾されたmRNA分子を含む精製されたRNA調製物を導入することと、細胞が第二の分化した状態を呈する条件下で該細胞を培養することとを含む、該方法を提供する。ある実施態様において、修飾されたmRNA分子は、プソイドウリジンまたは5-メチルシチジンからなる群から選択される少なくとも1つの修飾されたヌクレオシドを含む。ある実施態様において、該細胞は、ヒトまたは動物由来である。さらなる実施態様において、精製されたRNA調製物は、i)第一のiPS細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖mRNAを含み、この中で、第一の一本鎖完全mRNAの実質的にすべては、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含み、かつii)該体細胞においてRNAセンサーを活性化することのできるRNA夾雑物分子が実質的にない。ある実施態様において、RNA夾雑物分子は、該iPS細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的なmRNA、完全長のmRNAよりも小さなRNA分子、完全長のmRNAよりも大きなRNA分子、二本鎖mRNA分子、およびキャッピングされていないmRNA分子からなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、本発明は、体細胞を再プログラム化する(例えば、脱分化するかまたは分化転換する)ための方法であって、体細胞を精製されたRNA調製物と接触させて、再プログラム化された細胞を作製し、この中で、精製されたRNA調製物は、i)第一のiPS細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖mRNAを含み、この中で、第一の一本鎖完全mRNAの実質的にすべては、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含み、かつii)該体細胞においてRNAセンサーを活性化することのできる夾雑物分子(例えば、RNA夾雑物分子)が実質的にない。特定の実施態様において、RNA夾雑物分子は、該iPS細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的なmRNA、iPS細胞誘導因子をコードしかつiPS細胞誘導因子の少なくとも1つの追加的な部分をコードする一本鎖続走(run-on)mRNA、二本鎖mRNA分子、およびキャッピングされていないmRNA分子を含む。ある実施態様において、また、第一の一本鎖mRNAは、第一のiPS細胞誘導因子の追加的な部分をコードしない。
いくつかの実施態様において、再プログラムされた細胞は、脱分化した細胞(例えば、幹細胞または幹細胞様細胞)である。他の実施態様において、再プログラム化された細胞は、分化転換した細胞である(例えば、皮膚細胞は、ニューロン細胞、または他の種類の変化へと再プログラム化される)。さらなる実施態様において、第一の一本鎖mRNAは、完全な第一のiPS誘導因子をコードする(例えば、mRNAは、特定のiPS誘導因子についての完全なコード配列をコードする)。他の実施態様において、該接触することはさらに、(例えばある時間後に)体細胞を増殖因子および/またはサイトカインと接触させることを含む。さらなる実施態様において、該接触はさらに、体細胞を免疫応答阻害因子と接触させることを含む。
ある実施態様において、第一の一本鎖mRNAにおけるウリジンヌクレオシドのすべてまたはほぼすべては、プソイドウリジンヌクレオシドによって置き換えられる。他の実施態様において、第一の一本鎖mRNAにおけるシチジンヌクレオシドのすべてまたはほぼすべては、5-メチルシチジンヌクレオシドまたは本明細書に列挙された他の塩基によって置き換えられる。
特定の実施態様において、本発明は、再プログラム化された細胞を作製するための方法であって、体細胞を精製されたRNA調製物と接触させて、培養物において少なくとも10日間(例えば、少なくとも10日間…少なくとも13日間…少なくとも16日間…少なくとも20日間…少なくとも40日間…または細胞株を形成することのできる日数)生存することのできる再プログラム化された細胞を作製し、この中で、精製されたRNA調製物は、iPS細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖mRNAを含み、かつこの中で、大部分の第一の一本鎖mRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含むことを含む、該方法を提供する。
ある実施態様において、精製されたRNA調製物は、再プログラム化された細胞が培養物において少なくとも10日間(例えば、少なくとも10日間…少なくとも15日間…少なくとも20日間…少なくとも40日間、またはそれより長く)生存することを妨げるのに十分な体細胞における免疫応答を活性化するであろう量のRNA夾雑物分子がない。他の実施態様において、RNA夾雑物分子には、iPS細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的mRNA、iPS細胞誘導因子を完全にコードしかつiPS細胞誘導因子の少なくとも1つの追加的な部分をコードする一本鎖続走mRNA、二本鎖mRNA分子、キャッピングされていないmRNA分子、およびこれらの混合物が含まれる。ある実施態様において、作製された再プログラム化された細胞は、再プログラム化された細胞株を形成することができる。他の実施態様において、精製されたRNA調製物は、再プログラム化された細胞株の作製を妨げるるのに十分な体細胞における免疫応答を活性化するであろう量のRNA夾雑物分子がない。
特定の実施態様において、RNA夾雑物分子は、iPS細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的mRNA、iPS細胞誘導因子をコードしかつiPS細胞誘導因子の少なくとも1つの追加的な部分をコードする一本鎖続走mRNA、二本鎖mRNA分子、キャッピングされていないmRNA分子、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、本発明は、a)体細胞を精製されたRNA調製物と接触させて、再プログラム化された細胞を作製し、この中で、精製されたRNA調製物は、iPS細胞誘導因子をコードするmRNAを含み、かつこの中で、大部分のmRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含むこと、ならびにb)脱分化した細胞を培養して、再プログラム化された細胞株を作製すること、を含む、再プログラム化された細胞株を作製するための方法を提供する。他の実施態様において、精製されたRNA調製物は、再プログラム化された細胞株の作製を妨げるのに十分な体細胞の免疫応答を活性化するであろう量の夾雑物分子がない。ある実施態様において、免疫応答は、体細胞におけるRNAセンサーの活性化を包含する。
いくつかの実施態様において、本発明は、体細胞を再プログラム化するための方法であって、体細胞を精製されたRNA調製物と接触させて、再プログラム化された細胞を作製し、この中で、精製されたRNA調製物は、i)第一のiPS細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖mRNAを含み、この中で、第一の一本鎖mRNAの実質的にすべては、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含み、かつii)a)第一のiPS細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的mRNA、およびb)二本鎖mRNA分子が実質的にないことを含む、該方法を提供する。さらなる実施態様において、また、第一の一本鎖mRNAは、第一のiPS細胞誘導因子の追加的な部分をコードしない。特定の実施態様において、第一の一本鎖mRNAは、第一のiPS細胞誘導因子を完全にコードする。他の実施態様において、また、精製されたRNA調製物は、第一のiPS細胞誘導因子をコードしかつ第一のiPS細胞誘導因子の少なくとも1つの追加的な部分をコードする一本鎖続走mRNAが実質的にない(かまたは本質的にないかまたは事実上ないかまたはない)。他の実施態様において、第一の一本鎖完全mRNAの実質的にすべては5’キャッピングされている。他の実施態様において、また、精製されたRNA調製物は、キャッピングされていないmRNA分子が実質的にない。いくつかの実施態様において、第一の一本鎖mRNAの実質的にすべては、少なくとも1つのプソイドウリジン残基を含む。追加的な実施態様において、実質的にすべての第一の一本鎖mRNAは、少なくとも1つの5‐メチルシチジン残基を含む。他の実施態様において、実質的にすべての第一の一本鎖mRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含む。
ある実施態様において、精製されたRNA調製物は、形質移入試薬を含む。他の実施態様において、精製されたRNA調製物は、かなりの量の部分的mRNAおよび二本鎖mRNAを含有するRNA試料のHPLC精製によって得られる。さらなる実施態様において、精製されたRNA調製物は、部分的mRNAおよび一本鎖続走mRNAが本質的にない。いくつかの実施態様において、精製されたRNA調製物は、二本鎖mRNA分子が本質的にないかまたは事実上ないかまたはない。他の実施態様において、精製されたRNA調製物は、キャッピングされていないmRNA分子が本質的にないかまたは事実上ないかまたはない。いくつかの実施態様において、実質的にすべての第一の一本鎖mRNAはポリアデニル化されている。他の実施態様において、第一の一本鎖完全mRNAは、7-メチルグアノシンでキャッピングされている。
いくつかの実施態様において、第一のiPS細胞誘導因子は、KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2からなる群から選択される。他の実施態様において、精製されたRNA調製物は、i)第二のiPS細胞誘導因子をコードする第二の一本鎖mRNAをさらに含み、この中で、第二の一本鎖mRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含み、かつii)a)第二のiPS細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的mRNA、およびb)二本鎖mRNAがさらに実質的にない。他の実施態様において、精製されたRNA調製物はさらに、第二のiPS細胞誘導因子をコードしかつ第二のiPS細胞誘導因子の少なくとも1つの追加的な部分をコードする一本鎖続走mRNAが実質的にない。いくつかの実施態様において、第二のiPS細胞誘導因子は、KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2からなる群から選択される。ある実施態様において、体細胞は線維芽細胞である。他の実施態様において、再プログラム化された細胞は、多能性幹細胞である。他の実施態様において、脱分化した細胞は、NANOGおよびTRA-1-60を発現する。いくつかの実施態様において、細胞はインビトロである。さらなる実施態様において、細胞は培養物中に存する。特定の実施態様において、細胞は、マウス胎仔由来線維芽細胞(MEF)馴化培地中に存する。
いくつかの実施態様において、本発明は、精製されたRNA調製物を含む組成物を提供し、この中で、精製されたRNA調製物は、i)第一のiPS細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖mRNAを含み、この中で、第一の一本鎖mRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5‐メチルシチジン残基を含み、かつii)体細胞におけるRNAセンサーを活性化することのできるRNA夾雑物分子が実質的にない。ある実施態様において、本発明は、精製されたRNA調製物を含む組成物を提供し、この中で、精製されたRNA調製物は、i)第一のiPS細胞誘導因子をコードする第一の一本鎖mRNAを含み、この中で、第一の一本鎖完全mRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含み、かつii)a)第一のiPS細胞誘導因子の一部のみをコードする部分的mRNA、およびb)二本鎖RNAが実質的にない、組成物を提供する。
ある実施態様において、また、精製されたRNA調製物は、第一のiPS細胞誘導因子をコードしかつ第一のiPS細胞誘導因子の少なくとも1つの追加的な部分をコードする一本鎖続走mRNAが実質的にない。いくつかの実施態様において、精製されたRNA調製物は、i)第二のiPS細胞誘導因子をコードする第二の一本鎖mRNAをさらに含み、この中で、第二の一本鎖完全mRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基、およびii)a)第二の第一のiPS細胞誘導因子をコードしかつ第二のiPS細胞誘導因子の少なくとも1つの追加的な部分をコードする一本鎖続走mRNAが実質的にない。
いくつかの実施態様において、本発明は、MYC遺伝子をコードするインビトロで合成されたmRNAを含む組成物を提供し、この中で、インビトロで合成されたmRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含む。ある実施態様において、組成物は、体細胞におけるRNAセンサーを活性化することのできるRNA夾雑物分子が実質的にない。
特定の実施態様において、本発明は、MYCタンパク質を産生するよう哺乳類細胞を誘導するための方法であって、哺乳類細胞を、MYC遺伝子をコードするインビトロで合成されたmRNAと接触させ、この中で、インビトロで合成されたmRNAは、少なくとも1つのプソイドウリジン残基および/または少なくとも1つの5-メチルシチジン残基を含み、それによりMYCタンパク質を産生するよう哺乳類細胞を誘導することを含む、該方法を提供する。他の実施態様において、哺乳類細胞は樹状細胞である。他の実施態様において、哺乳類細胞は、肺胞細胞、星状細胞、小膠細胞、またはニューロンである。
いくつかの実施態様において、本発明は、対象を、先におよび本明細書に説明されたMYCタンパク質産生哺乳類細胞と接触させることを含む、対象を治療する方法を提供する。
さらなる実施態様において、本発明は、MYC遺伝子をコードするインビトロで転写されるRNA分子を合成する方法であって、単離されたRNAポリメラーゼ、MYC遺伝子をコードするテンプレート核酸配列、修飾されていないヌクレオチド、および少なくとも1つのプソイドウリジンまたは5-メチルシチジン残基を含む、MYC遺伝子をコードするインビトロで転写されるRNA分子が生成されるような条件下で、プソイドウリジンまたは5-メチルシチジンにより修飾されたヌクレオチドを組み合わせることを含む、MYC遺伝子をコードするインビトロで転写されるRNA分子を合成する方法を提供する。
本発明の実施態様の開発中に実施された実験は、mRNA分子が、細胞に投与されて脱分化過程を誘導して、多能性幹細胞を含めた脱分化した細胞を作製することができることを示した。したがって、本発明は、iPS細胞を作製するための組成物および方法を提供する。驚くべきことに、mRNAの投与は、iPS細胞の非常に効率的な作製を提供することができる。
本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子療法ベクター、それらの合成方法、ならびに遺伝子置換、遺伝子療法、遺伝子転写サイレンシング、および治療用タンパク質の該分子を含む組織へのインビボでの送達のための方法も提供する。本発明は、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子の免疫原性を低下させる方法も提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、1つ以上のiPSC誘導因子をコードするmRNAを体細胞に導入して脱分化した細胞を作製することを含む、体細胞を脱分化させるための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、1つ以上のiPSC誘導因子をコードするmRNAを体細胞に導入すること、および、細胞が生存可能でありかつ細胞に導入されるmRNAが、脱分化した細胞を作製するのに十分な量かつ十分な時間で翻訳される条件下で、細胞を維持することを含む、体細胞を脱分化させるための方法を提供する。いくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞は、人工多能性幹細胞である。
いくつかの実施態様において、本発明は、1つ以上の再プログラム化因子をコードするmRNAを細胞に導入すること、および、細胞が生存可能でありかつ、細胞に導入されるmRNAが、該mRNAが導入された細胞と比較して、分化の変化した状態を呈する細胞を作製するのに十分な量かつ十分な時間で翻訳される条件下で細胞を維持することを含む、真核細胞の分化の状態(または分化した状態)を変化させるための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、1つ以上の再プログラム化因子をコードするmRNAを細胞に導入すること、および、細胞が生存可能でありかつ細胞に導入されるmRNAが、該mRNAが導入された細胞と比較して分化の変化した状態を呈する細胞を作製するのに十分な量および十分な時間で翻訳される条件下で細胞を維持することを含む、真核細胞の分化の状態を変化させるための方法を提供する。いくつかの実施態様において、分化の変化した状態は、該mRNAが導入された細胞と比較して、分化の脱分化した状態である。例えば、いくつかの実施態様において、分化の変化した状態を呈する細胞は、該mRNAが導入された体細胞(例えば、線維芽細胞、心筋細胞、または別の分化した細胞種類へと分化する細胞)と比較して脱分化する多能性幹細胞である。いくつかの実施態様において、mRNAが導入される細胞は、1つの細胞系列、表現型、または機能の体細胞であり、分化の変化した状態を呈する細胞は、mRNAが導入された細胞のものとは異なる細胞系列、表現型、または機能を呈する体細胞であり、したがって、これらの実施態様において、該方法は、分化転換を結果として生じる(Graf and Enver 2009)。
本発明は、mRNAが導入される特定の細胞に関して限定されない。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、mRNAが導入される細胞は、任意の多細胞性真核生物に由来する。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、mRNAが導入される細胞は、ヒト細胞および別の動物細胞のうちから選択される。本明細書に呈される作業は、ヒトまたは他の動物の細胞を用いて実施されたが、本出願者はさらに、人および動物の細胞を、1つ以上の精製された一本鎖mRNA分子(該分子の各々は、タンパク質再プログラム化因子(例えば、転写因子)をコードする)からなる精製されたRNA調製物と接触させることよって、該細胞を再プログラム化することを含む、本発明の方法が、他の真核細胞(例えば、植物細胞および真菌細胞)の再プログラム化にも関することをさらに主張する。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、mRNAが導入される細胞は、公知の疾患のない生物体に由来する正常細胞である。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、mRNAが導入される細胞は、公知の疾患を有する生物体に由来する細胞である。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、mRNAが導入される細胞は、公知の病態のない細胞である。先の方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、mRNAが導入される細胞は、疾患状態または公知の病態を呈する細胞(癌細胞、または糖尿病細胞に特徴的な代謝特性を呈する膵ベータ細胞)である。
本発明は、脱分化した細胞(例えば、iPS細胞)を作製するために、1つ以上のiPSC細胞誘導因子をコードするmRNAを導入することを含む本方法の実施態様における特異的な細胞種類の使用に(例えば、特異的な体細胞種類に)限定されない。iPS細胞誘導因子を用いて脱分化できるる任意の細胞が熟慮される。このような細胞には、線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、リンパ球、T細胞、B細胞、単核臍帯血における細胞、頬粘膜細胞、肝細胞、HeLa、MCF-7、または他の癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、細胞は、インビトロ(例えば、培養液中)またはインビボに存在する。いくつかの実施態様において、培養物中で発生させる場合、無細胞馴化培地(例えば、MEF馴化培地)が用いられる。下に示されるように、このような培地は、亢進したiPS細胞発生を提供した。本発明はしかしながら、用いられる培養条件に限定されない。(例えば、体細胞からiPSを作製して該細胞を維持するための)現在公知のまたは本発明の方法に有用であるとして後に特定される任意の培養条件または培地が、本発明を用いた使用のために企図される。例えば、好ましくはないが、本方法のいくつかの実施態様において、本方法を用いて処理される細胞を培養するために、フィーダー細胞層が馴化培地の替わりに用いられる。
これらの方法のいずれにも関するいくつかの実施態様において、mRNAを導入する工程は、該mRNAを細胞(例えば、ヒトまたは他の動物の体細胞)に形質移入試薬(例えば、TRANSIT(商標)mRNA形質移入試薬、MirusBio、Madison、WI)を用いて送達することを含む。
しかしながら、本発明は、利用される形質移入方法の性質によって限定されない。実際、mRNA分子を細胞にインビトロまたはインビボで送達することのできる公知のまたは将来特定される任意の形質移入プロセスが熟慮され、これには、培養物中のまたは生命支持培地中の細胞が、単離された細胞または真核生物の組織もしくは臓器を含む細胞を含むのであろうと、該細胞に該mRNAを送達する方法、あるいは、ヒト、動物、植物、または真菌などの生物体における細胞に該mRNAをインビボで送達する方法が含まれる。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、脂質(例えば、リポソーム、ミセルなど)を含む。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、ナノ粒子またはナノチューブを含む。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、陽イオン性化合物(例えば、ポリエチレンイミン、またはPEI)を含む。いくつかの実施態様において、形質移入方法は、該mRNAを細胞に(例えば、電気穿孔法によって)送達するために電流を用いる。いくつかの実施態様において、形質移入方法は、微粒子銃法を用いて、該mRNAを細胞に送達する(例えば、「遺伝子銃」または「微粒子銃粒子送達システム」)。
本明細書に呈されるデータは、細胞に導入されるmRNAに関して、本明細書で説明される実施例において用いられるある量のmRNAが結果的に、他の量のmRNAよりも用いられる特定の体細胞からの多能性幹細胞のより高い効率およびより迅速な誘導を生じたことを示す。しかしながら、本発明の方法は、細胞に導入する特定量のmRNAの使用に限定されない。例えば、いくつかの実施態様において、各用量が、各々異なるヒト再プログラム化因子をコードする各6の異なるmRNAを18マイクログラム含む合計3回用量を用いて、mRNAを10cmプレートにおけるおよそ3×105のヒト線維芽細胞に導入したが、あの実施態様において、より多量のまたはより少量のmRNAを用いて、細胞に導入した。
本発明は、用いられるmRNAの特定の化学的形態に限定されないが、ある形態のmRNAは、より効率的な結果を生じ得る。しかしながら、いくつかの好ましい実施態様において、mRNAは、(例えば、プソイドウリジン(Ψ)、5-メチルシトシン(m5C)、5-メチルウリジン(m5U)、2’-O-メチルウリジン(Umまたはm2’-OU)、2-チオウリジン(s2U)、およびN6-メチルアデノシン(m6A)からなる群から選択される)少なくとも1つの修飾されたヌクレオシドを、対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに含む(いくつかの好ましい実施態様において、実質的にすべての対応する修飾されていないA、C、G、またはTの通常のヌクレオシドの替わりに少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド)。いくつかの実施態様において、mRNAは、ポリアデニル化されている。いくつかの好ましい実施態様において、mRNAは、インビトロで転写される(IVT)RNAのポリアデニル化によって調製され、該方法は、ポリ(A)ポリメラーゼ(例えば、酵母RNAポリメラーゼまたは大腸菌ポリ(A)ポリメラーゼ)を用いてIVT RNAを接触させることを含む。いくつかの実施態様において、mRNAは、ポリ(A)末端をコードするDNAテンプレートを用いることによって、IVTの間にポリアデニル化される。RNAがポリ(A)ポリメラーゼを用いて、またはDNAテンプレートのIVTの間にポリアデニル化されるかどうかにかかわらず、いくつかの好ましい実施態様において、mRNAは、ポリA末端(例えば、50~200ヌクレオチド、例えば、好ましくは100~200、150~200ヌクレオチド、または150ヌクレオチド超を有するポリA末端)を含むが、いくつかの実施態様において、より長いまたはより短いポリA末端が用いられる。いくつかの実施態様において、本方法において用いられるmRNAがキャッピングされる。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のmRNA分子がキャップを含有することが好ましい。いくつかの好ましい実施態様において、mRNAは、本方法において用いられるmRNA分子は、キャッピング酵素系の存在下で、キャッピングされていない一次RNAをインキュベートすることによって、インビトロで合成される。いくつかの好ましい実施態様において、mRNAは、キャッピング酵素反応において用いられる一次RNAは、合成されるべきRNAをコードするDNA分子のインビトロでの転写(IVT)によって合成される。合成されるべきRNAをコードするDNAは、RNAポリメラーゼプロモーターを含有し、これに、RNAポリメラーゼが結合して、そこから転写を開始する。また、mRNA分子がしばしば、翻訳開始コドンの前および翻訳されていない翻訳終止コドンの後に配置される異なる配列の領域を有することは、当該技術分野において公知である。それぞれ、5プライム非翻訳領域(5’UTR)および3プライム非翻訳領域(3’UTR)と呼ばれるこれらの領域は、mRNAの安定性、mRNAの局在、およびそれらの結合したmRNAの翻訳効率に影響を及ぼし得る。アルファグロビンおよびベータグロビンについてのものなど、ある5’UTRおよび3’UTRは、mRNAの安定性およびmRNAの発現を改良することが公知である。したがって、いくつかの好ましい実施態様において、再プログラム化因子(例えば、iPSC誘導因子)をコードするmRNAは、該細胞においてより大きなmRNA安定性およびより高いmRNA発現を結果として生じる5’UTRおよび/または3’UTR(例えば、アルファグロビンまたはベータグロブンの5’UTRおよび/または3’UTR、例えば、アフリカツメガエルまたはヒトのアルファグロブリンまたはベータグロブリンの5’UTRおよび/または3’UTR、あるいは、例えば、タバコエッチ病ウイルス(TEV)の5’UTR)を呈する。
IVTは、RNAをコードするDNAテンプレートからのmRNAの合成が、個々の同族のRNAポリメラーゼプロモーターから特異的かつ十分に開始され、かつ完全長のmRNAが得られる限り、任意のRNAポリメラーゼを用いて実施されることができる。いくつかの好ましい実施態様において、RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、およびT3 RNAポリメラーゼのうちから選択される。いくつかの他の実施態様において、キャッピングされたRNAは、IVT反応におけるジヌクレオチドキャップアナログを用いること(例えば、AMPLICAP(商標)T7キットまたはMESSAGEMAX(商標)T7 ARCA-CAPPED MESSAGE転写キット、EPICENTREまたはCellScript, Madison, WI, USAを用いること)によって、同時転写的に合成される。キャッピングが同時転写的に実施される場合、好ましくは、ジヌクレオチドキャップアナログは、抗逆キャップアナログ(ARCA)である。しかしながら、個別のIVT反応の使用に続く、およそ100%のRNAがキャッピングされる結果を生じるキャッピング酵素系を用いたキャッピングは、典型的には、約80%のRNAしかキャッピングされないことを結果として生じる同時転写キャッピングよりも好ましい。したがって、いくつかの好ましい実施態様において、本発明の方法において用いられるmRNA分子のより高い割合がキャッピングされる(mRNA分子の集団の80%超、90%超、95%超、98%超、99%超、99.5%超、または99.9%超がキャッピングされる)。いくつかの好ましい実施態様において、本発明の方法において用いられるmRNAは、キャップ1構造を備えたキャップを有しており、キャップヌクレオチドに関して最後から2番目のヌクレオチドにおけるリボースの2’ヒドロキシルがメチル化されることを意味する。しかしながら、いくつかの実施態様において、本方法において用いられるmRNAは、キャップ0を備えたキャップを有しており、キャップヌクレオチドに関して最後から2番目のヌクレオチドにおけるリボースの2’ヒドロキシルがメチル化されていないことを意味する。いくつかの、しかしすべてではない転写産物を用いて、キャップ1構造を備えたキャップを有するmRNAを用いた真核細胞の形質移入は、同じ細胞の同じmRNAを用いるが、キャップ0構造を有するキャップを用いた形質移入と比較して、形質移入された細胞におけるより高レベルのまたはより長い持続時間のタンパク質の発現を結果的に生じる。いくつかの実施態様において、本発明の方法において用いられるmRNAは、修飾されたキャップヌクレオチドを有する。本明細書の実施例において呈される実験の前に実施されたいくつかの実験において、本出願者は、1079またはIMR90ヒト線維芽細胞に、ウリジンまたはウリジンの替わりのプソイドウリジンのいずれかを含有するOCT4mRNAを形質移入した場合、ウリジンを含有するmRNAよりもプソイドウリジン含有mRNAを高レベルで、または長い持続時間で翻訳することを発見した。それゆえ、いくつかの好ましい実施態様において、本発明の方法において用いられるmRNA(複数可)において含有されるウリジンのうちの1つ以上またはすべては、プソイドウリジンによって置換される(例えば、ウリジン-5’-三リン酸の替わりに該RNAを合成するために、IVT反応におけるプソイドウリジン-5’-三リン酸を置換することによる)。しかしながら、いくつかの実施態様において、本発明の方法において用いられるmRNAは、ウリジンを含有し、かつプソイドウリジンを含有しない。いくつかの好ましい実施態様において、該mRNAは、(プソイドウリジン(Ψ)、5-メチルシトシン(m5C)、5-メチルウリジン(m5U)、2’-O-メチルウリジン(Umまたはm2’-OU)、2-チオウリジン(s2U)、およびN6-メチルアデノシン(m6A)からなる群から選択される)少なくとも1つの修飾されたヌクレオシドを、対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに(例えば、対応する修飾されていないA、C、G、またはTの通常のヌクレオシドの実質的にすべての替わりに)含む。いくつかの好ましい実施態様において、該mRNAは、プソイドウリジン(Ψ)および5-メチルシトシン(m5C)からなる群から選択される少なくとも1つの修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの好ましい実施態様において、該mRNAは、プソイドウリジン(Ψ)および5-メチルシトシン(m5C)の両方を含む。加えて、特定の目標を達成するために、本発明の方法のいずれにおいても真核細胞に導入されるmRNAのヌクレオチドの1つ以上における核酸塩基、糖部分、またはヌクレオチド間結合は、修飾された核酸塩基、糖部分、またはヌクレオチド間結合を含んでもよい。
本発明は、本発明の方法のいずれかにおける真核細胞に送達されるmRNAの源に関しても限定されない。実施例において説明されるものなど、いくつかの実施態様において、該mRNAは、線形化したプラスミドベクターにおいてクローン化された遺伝子を含むDNAテンプレートのインビトロでの転写によって、またはPCRもしくはRT-PCRによって(すなわち、PCR像副産物のIVTによって)合成されるDNAテンプレートのインビトロでの転写によって、キャッピング酵素系を用いたキャッピングによって、またはIVT、およびポリ(A)ポリメラーゼを用いるポリアデニル化の間のジヌクレオチドキャップアナログ(例えば、ARCA)の組み込みによる同時転写キャッピングによって合成される。いくつかの好ましい実施態様において、該mRNAは、線形化されたプラスミドベクターにおいてクローン化された遺伝子またはPCRもしくはRT-PCRの増幅産物を含むDNAテンプレートのIVTによって合成され、この中で、DNAテンプレートは、3’ポリ(A)末端をコードする。いくつかの他の実施態様において、本発明の方法のいずれかにおいて真核細胞に送達されるmRNAは、細胞または生物試料に直接由来する。例えば、いくつかの実施態様において、細胞または生物試料に由来するmRNAは、RNA増幅反応を用いてmRNAを細胞または生物試料から増幅すること、および増幅されたmRNAを、キャッピング酵素系を用いてキャッピングすることまたはIVT中のジヌクレオチドキャップアナログ(例えば、ARCA)の組み込みによる同時転写キャッピングによって得られ、増幅されたmRNAが、RNA増幅反応由来のテンプレートでコードされたポリ(A)末端をすでに含有していない場合、増幅されたmRNAを、ポリ(A)ポリメラーゼを用いてポリアデニル化する。
脱分化した細胞(例えば、iPS細胞)を作製するために、1つ以上のiPS細胞誘導因子をコードするmRNAを導入することを含む方法に関して、本発明は、用いられるiPS細胞誘導因子の性質によって限定されない。脱分化における使用が見出される今や公知の、または後に発見される1つ以上のタンパク質誘導因子をコードする任意のmRNAが、本発明における使用について企図される。いくつかの実施態様において、KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、またはSOX2をコードする1つ以上のmRNAが採用される。Oct-3/4および、Sox遺伝子ファミリーのうちのあるメンバー(Sox1、Sox2、Sox3、およびSox15)は、誘導プロセスに包含される転写調節因子として同定されている。しかしながら、Klfファミリーのうちのあるメンバー(Klf1、Klf2、Klf4、およびKlf5)、Mycファミリー(C-myc、L-myc、およびN-myc)、Nanog、およびLIN28を含む追加的な遺伝子は、誘導効率を高めることが確認されている。任意の1つ以上のこのような因子を所望の通り用いてもよい。
本発明の組成物および方法は、iPS細胞を作製するために用いられ得るが、本発明は、このような細胞の作製に限定されない。例えば、いくつかの実施態様において、1つ以上の再プログラム化因子をコードするmRNAは、mRNAが導入された細胞と比較して分化の変化した状態を有する細胞を作製するために、細胞に導入される。例えば、いくつかの実施態様において、1つ以上のiPS細胞誘導因子をコードするmRNAを用いて、iPS細胞ではない脱分化した細胞を作製する。このような細胞は、研究、薬剤スクリーニング、および他の用途における使用が見出される。
いくつかの実施態様において、本発明はさらに、先の方法によって作製された脱分化した細胞を採用する方法を提供する。例えば、このような細胞は、ヒトまたは他の動物における研究、薬剤スクリーニング、および治療用途における使用が見出される。例えば、いくつかの実施態様において、作製された細胞は、iPS細胞誘導因子および分化または脱分化と関連した他の因子の特定および特徴づけにおける使用が見出される。いくつかの実施態様において、作製された脱分化した細胞を生物体に、またはインビトロもしくはインビボで存在する組織に移植する。いくつかの実施態様において、作製された細胞の寄主となる生物体、組織、または培養系は、試験化合物に曝露され、細胞に及ぼすまたは生物体、組織、もしくは培養系に及ぼす試験化合物の効果が観察または測定される。
いくつかの実施態様において、上記の方法を用いて作製された脱分化細胞(例えばiPS細胞)は、該作製された脱分化細胞が由来する体細胞と比較して同じ分化状態または細胞種類を有する分化細胞を作製するためにさらに処理される。他のいくつかの実施態様では、上記の方法を用いて作製された脱分化細胞(例えばiPS細胞)は、該作製された脱分化細胞が由来する体細胞と比較して異なる分化状態または細胞種類を有する分化細胞を作製するためにさらに処理される。いくつかの実施態様において、分化細胞は、1つまたは複数の処理の間に、1つ以上の再プログラム化因子をコードするmRNAを、作製されたiPS細胞に導入し、mRNAが導入された細胞を、その細胞が生存可能であり、1つ以上の再プログラム化因子をコードするmRNAが導入された、作製された脱分化細胞(例えば作製されたiPS細胞)と比較して変更した分化状態または細胞種類を有する細胞に分化させる条件下で維持することにより、作製された脱分化細胞(例えば作製されたiPS細胞)から作製される。これらの実施態様のいくつかにおいて、変更された分化状態を有する作製された分化細胞は、(例えば、ヒトまたは他の動物における)研究、薬剤スクリーニング、および治療用途に使用される。例えば、作製された分化細胞は、分化に関連する再プログラム化因子の特定および特性決定において用途が見出される。いくつかの実施態様において、作製された分化細胞は生物体に移植されるか、インビトロあるいはインビボで存在する組織に移植される。いくつかの実施態様では、作製された分化細胞の寄主となる生物体、組織、または培養系が試験化合物に曝露され、該生物体、組織、または培養系に及ぼす試験化合物の効果が観察または測定される。
1つ以上のiPSC誘導因子をコードするmRNAを体細胞に導入することと、該細胞が生存可能であり、かつ細胞に導入されるmRNAが脱分化した細胞を作製するのに十分な量かつ十分な時間発現する条件下で細胞を維持することとを含む(例えば、この中で、脱分化した細胞は、人工多能性幹細胞である)方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するのに十分な時間は、1週間未満である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり50以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり100以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり150以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり200以上の脱分化した細胞である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞(例えば、iPSC)を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり300以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の投入された細胞あたり400以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり500以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり600以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり700以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり800以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり900以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。この方法のいくつかの好ましい実施態様において、脱分化した細胞を作製するための再プログラム化効率は、mRNAが導入される3×105の移入された細胞あたり1000以上の脱分化した細胞(例えば、iPSC)である。したがって、いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも2倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも5倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも10倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも20倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも25倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも30倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールより35倍超効率的であった。いくつかの好ましい実施態様において、この方法は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を用いた再プログラム化因子の送達を含む公表されたプロトコールよりも40倍超効率的であった。
本発明は、本方法において用いられるか有用な、および/または本明細書に記載される方法により作製される組成物(系、キット、反応混合物、細胞、mRNA)をさらに提供する。例えば、いくつかの実施態様において、本発明は、iPS細胞誘導因子をコードするmRNAを提供し、該mRNAは、ウリジンに替えてプソイドウリジンを有する。
本発明は、形質移入試薬およびiPS細胞誘導因子をコードするmRNA(例えば、形質移入試薬およびmRNAの混合物)を含む組成物をさらに提供する。いくつかの好ましい実施態様において、この組成物は、KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2を含むがこれらに限定されない複数(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ)のiPS細胞誘導因子をコードするmRNAを含む。
前記組成物はさらに、本明細書に説明される方法のいずれかを実施するのに十分な、必要な、または有用な任意の他の試薬または成分を含んでもよい。このような試薬または成分には、形質移入試薬、培地(例えば、MEF馴化培地)、細胞(例えば、体細胞、iPS細胞)、容器、箱、緩衝液、阻害剤(例えば、RNase阻害剤)標識(例えば、蛍光、発光、放射性等)、陽性および/または陰性対照分子、キャッピングされたmRNAを作製するための試薬、ドライアイスまたは他の保冷材、使用のための説明書、細胞培養用具、検出/分析用具、ならびにこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。
本発明は、プソイドウリジンもしくは修飾されたヌクレオシドを含むRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子療法ベクター、それらを含む遺伝子療法および遺伝子転写サイレンシング方法、それらの免疫原性を低下させる方法、およびそれらを合成する方法を提供する。
一実施態様において、本発明は、プソイドウリジン残基を含むメッセンジャーRNAを提供する。別の実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質をコードするRNA分子を提供し、該RNA分子は、プソイドウリジン残基を含む。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで転写されるRNA分子を提供する。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドを提供し、この中で、修飾されたヌクレオシドは、m5C、m5U、m6A、s2U、Ψ、または2’-O-メチル-Uである。別の実施態様において、本発明は、インビトロで合成されたポリリボヌクレオチド分子を含む遺伝子療法ベクターを提供し、この中で、ポリリボヌクレオチド分子は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む。
別の実施態様において、本発明は、その配列の一部としてプソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含有する、およびsiRNAまたはshRNAをさらに含む、二本鎖RNA(dsRNA)を提供する。別の実施態様において、dsRNA分子は、長さ50ヌクレオチド超である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、哺乳類細胞を、組換えタンパク質をコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ(該インビトロで合成されたRNA分子は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む)、それにより哺乳類細胞を誘導して、組換えタンパク質を産生することを含む、哺乳類細胞を誘導して、組換えタンパク質を産生するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたRNA分子と接触させ(該インビトロで合成されたRNA分子は、エリスロポエチンをコードする)、それにより対象における貧血を治療することを含む、対象における貧血を治療する方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたRNA分子と接触させ(インビトロで合成されたRNA分子は、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)をコードする)、それにより対象における血管攣縮を治療することを含む、対象における血管攣縮を治療するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象における細胞を、インビトロで合成されたRNA分子と接触させ(該インビトロで合成されたRNA分子は、熱ショックタンパク質をコードする)、それにより対象における細胞の生存率を改良することを含む、該細胞の生存率を改良するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、血管の細胞をインビトロで合成されたRNA分子と接触させ(該インビトロで合成されたRNA分子は、熱ショックタンパク質をコードする)、それにより対象における再狭窄の発生率を低下させることを含む、血管を拡張させる手順後の血管の再狭窄の発生率を低下させる方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、頭皮の細胞をインビトロで合成された分子と接触させ(インビトロで合成されたRNA分子は、テロメラーゼまたは免疫抑制タンパク質をコードする)、それにより毛髪濾胞からの発毛を高めることを含む、対象の頭皮における濾胞からの発毛を高めるための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、細胞をインビトロで合成されたRNA分子と接触させ(該インビトロで合成されたRNA分子は、抗酸化活性を有する酵素をコードする)、それにより細胞における該酵素の発現を誘導することを含む、該細胞における抗酸化活性を有する酵素の発現を誘導する方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたRNA分子と接触させ(該インビトロで合成されたRNA分子は、嚢胞性線維症幕貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)をコードする)、それにより対象における嚢胞性線維症を治療することを含む、対象における嚢胞性線維症を治療するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたRNA分子と接触させ(該インビトロで合成されたRNA分子は、ブルトン型チロシンキナーゼをコードする)、それによりX連鎖無ガンマグロブリン血症を治療することを含む、対象におけるX連鎖無ガンマグロブリン血症を治療するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞をインビトロで合成されたRNA分子と接触させ(該インビトロで合成されたRNA分子は、ADAをコードする)、それによりADA SCIDを治療することを含む、対象におけるアデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全(ADA SCID)を治療するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、インビトロ翻訳装置¥をインビトロで合成されたポリリボヌクレオチドと接触させ(該インビトロで合成されたポリリボヌクレオチドは、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む)、それにより組換えタンパク質を産生することを含む、組換えタンパク質を産生するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、単離されたポリメラーゼを、修飾されていないヌクレオチドと修飾されたヌクレオチドとの混合物と接触させることを含む、プソイドウリジンにより修飾されたヌクレオシドを有する修飾されたヌクレオチドを含むインビトロで転写されるRNA分子を合成する方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、修飾されていないヌクレオチド、プソイドウリジンもしくは修飾されたヌクレオシドを含有するヌクレオチド、およびポリメラーゼを含む、インビトロでの転写装置を提供する。別の実施態様において、本発明は、修飾されていないヌクレオチド、プソイドウリジンもしくは修飾されたヌクレオシドを含有するヌクレオチド、およびポリメラーゼを含むインビトロ転写キットを提供する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
以下の図は、本明細書の部分を形成し、本発明のある態様をさらに示すよう含まれる。本発明は、本明細書に呈される具体的な実施態様に関する詳細な説明との組み合わせで、これらの図の1つ以上に対する引用によりより良好に理解され得る。
図1は、実施例において説明されるように調製された6のヒト再プログラム化因子の各々をコードするmRNAが、ヒト新生児1079線維芽細胞への形質移入後に翻訳され、および推定細胞下位置に局在することを示す。未処理のヒト1079線維芽細胞:写真A、E、I、M、Q、およびUは、再プログラム化因子をコードするmRNAで形質転換されていない未処理のヒト1079線維芽細胞の位相差画像を示し、写真B、F、J、N、R、およびVは、細胞が各再プログラム化因子に特異的な抗体を用いて染色した後の同じ場の蛍光画像を示し、これらの結果は、未処理のヒト1079線維芽細胞において、これらの内在性再プログラム化因子タンパク質がほとんどまたは全くなかったことを示す。処理したヒト1079線維芽細胞:写真C、G、K、O、S、およびWは、示された再プログラム化因子をコードするmRNAを形質移入したヒト1079線維芽細胞の位相差画像を示し、写真D、H、L、P、T、およびXは、細胞が形質移入24時間後に各再プログラム化因子に特異的な抗体を用いて染色した後の同じ場の蛍光画像を示す。これらの結果は、再プログラム化因子タンパク質の各々が、個々の再プログラム化因子をコードするmRNAを用いた形質移入の24時間後にヒトの1079の線維芽細胞において発現したこと、および再プログラム化因子タンパク質が、推定細胞下位置に局在したことを示す。A~Tは、20倍の倍率である。U~Xは、10倍の倍率である。
図2は、ヒト再プログラム化因子(KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2)をコードするmRNAが、ヒト体細胞におけるiPS細胞を作製することを示す。図2は、再プログラム化因子をコードするmRNAを用いた最終的な形質移入の12日後のiPSの明視野(A、C)画像および免疫蛍光(B、D)画像を示す。NANOG染色は、コロニー#1(B、D)において観察される。画像AおよびBは10倍の倍率である。CおよびDは20倍の倍率である。
図3は、ヒト1079およびIMR90体細胞由来のiPSコロニーが、NANOGおよびTRA-1-60に対して陽性であることを示す。図3は、1079細胞(A、D)およびIMR90細胞(G)由来のiPSコロニーの位相差(A、D、G)画像および免疫蛍光(B、C、E、F、H、I)画像を示す。(A)に示される同じiPSコロニーは、NANOG(B)およびTRA-1-60(C)の両方について陽性である。(D)に示されるiPSコロニーは、NANOG陽性(E)およびTRA-1-60陽性(F)である。IMR90線維芽細胞(G)から作製されたiPSコロニーも、NANOG(H)およびTRA-1-60(I)について陽性である。すべての画像は20倍の倍率である。
図4は、迅速な亢進した効率のiPSCコロニー形成が、細胞に、MEF馴化培地において再プログラム化因子をコードするmRNAを形質移入することによって達成されることを示す。200超のコロニーを、最終的な形質移入の3日後に検出し、10cm皿において、IMR90細胞に36μgの(すなわち、KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2をコードする)各再プログラム化mRNAを3回形質移入した。代表的なiPSCコロニーを、4倍(A、B)、10倍(C~E)、および20倍の倍率(F)で示す。6の再プログラム化因子をコードするmRNAを用いた最終的なmRNA形質移入の8日後、1000超のiPSCコロニーを、18μg(G、I)または36μg(H)の6のmRNAの各々を形質移入したIMR90細胞において計数した。代表的なコロニーを4倍の倍率(G~H)および10倍の倍率(I)で示す。
図5は、1079由来およびIMR90由来のiPSCコロニーが、NANOGおよびTRA-1-60について陽性であることを示す。6つの再プログラム化因子の各々について36μgのmRNAを用いた最終的なmRNA形質移入の8日後、1079由来のiPSCコロニー(A、D、およびGに示す)は、NANOG(B、E、およびH)およびTRA-1-60(C、F、およびI)について陽性である。6つの再プログラム化因子の各々について18μg(J~L)または36μg(M~O)のmRNAを用いた最終的なmRNA形質移入の8日後、IMR90由来のiPSコロニーも、NANOG(K、N)およびTRA-1-60(L、O)について陽性である。
天然RNAを用いて形質移入したMDDCによるTNF-αの産生であり、修飾されていないインビトロで合成されたRNAおよび細菌RNAおよび哺乳類ミトコンドリアRNAが非常に免疫原性であるのに対し、他の哺乳類RNAが弱い免疫原性であることを示す。ヒトMDDCを単独のあるいはR-848(1μg/mL)または293細胞(全RNA、核RNA、および細胞質RNA)、マウス心臓(ポリA+mRNA)、ヒト血小板ミトコンドリアRNA、ウシtRNA、細菌tRNA、およびRNase消化を有するもしくは有さない全RNA(大腸菌)と複合体形成したLipofectin(登録商標)とともにインキュベートした。8時間後、TNF-αをELISAにより上清中で測定した。平均値±標準誤差を示す。結果は、3つの独立した実験の代表値である。
RNAによるTLR依存性活性化は、m6A修飾およびs2U修飾がTLR3シグナル伝達を遮断するのに対し、すべての修飾がTLR7およびTLR8のシグナル伝達を遮断すること、ならびに、より少なく修飾されている細菌RNAおよび修飾されていないインビトロで転写されるRNAが3つのTLRすべてを活性化することを示す。(A)m5C、m6A、Ψ、m5U、またはS2Uヌクレオシド修飾を有さない(なし)または有するインビトロで転写されるRNA-1571の一定分量(1μg)を、変性アガロースゲルに続いて臭化エチジウム染色およびUV照明において分析した。(B)ヒトTLR3、TLR7、TLR8、および対照ベクターを発現する293細胞を、Lipofectin(登録商標)単独、Lipofectin(登録商標)-R-848(1μg/mL)、またはRNA(5μg/mL)で処理した。RNA-730およびRNA-1571において存在する修飾されたヌクレオシドに注意する。(C)CpG ODN-2006(5μg/mL)、LPS(1.0μg/mL)、およびRNA単離物をラット肝臓、マウス細胞株(TUBO)、およびヒト脾臓(全体)、ヒト血小板ミトコンドリアRNA、または2つの異なる大腸菌源から得た。293-hTLR9細胞は、対照として機能した。8時間後、IL-8をELISAによる上清において測定した。平均値±標準誤差を示す。hTLR3を標的にしたsiRNAを含有する細胞株を星印で示す。結果は、4つの独立した実験の代表値である。
RNAを形質移入した樹状細胞によるサイトカイン産生は、すべての修飾がサイトカイン産生樹状細胞の活性化を遮断するのに対し、ウリジン修飾のみが血液由来の樹状細胞活性化を遮断することを示す。GM-CSF/IL-4(A、C)またはGM-CSF/IFN-α MDDC(B)を用いて作製されたMDDC、および初代樹状細胞1および樹状細胞2(D)を、Lipofectin(登録商標)単独、Lipofectin(登録商標)-R-848(1μg/mL)、またはRNA(5μg/mL)で8~16時間処理した。RNA-1571に存在する修飾されたヌクレオシドに注意する。TNF-α、IL-12(p70)、およびIFN-αを、ELISAによって上清中で測定した。平均値±標準誤差を示す。結果は、10(AおよびC)、4(B)、および6(D)の独立した実験の代表値である。E.RNAによる樹状細胞の活性化。MDDCを、単独または1μg/mLのポリ(I):(C)ともしくは陽性対照としてのR-848と複合体形成したLipofectin(登録商標)で(上部パネル)、あるいは示されるRNAと複合体形成したLipofectin(登録商標)(5μg/mL、下部パネル)で20時間処理した。RNA-1886において存在する修飾されたヌクレオシドに注意する。CD83、CD80、およびHLA-DRの発現をフローサイトメトリーによって決定した。
E.RNAによる樹状細胞の活性化。MDDCを、単独または1μg/mLのポリ(I):(C)ともしくは陽性対照としてのR-848と複合体形成したLipofectin(登録商標)で(上部パネル)、あるいは示されるRNAと複合体形成したLipofectin(登録商標)(5μg/mL、下部パネル)で20時間処理した。RNA-1886において存在する修飾されたヌクレオシドに注意する。CD83、CD80、およびHLA-DRの発現をフローサイトメトリーによって決定した。
RNAによる樹状細胞の活性化は、すべてのヌクレオシド修飾がRNA仲介性の樹状細胞活性化を阻害することを示す。MDDCをLipofectin(登録商標)単独、Lipofectin(登録商標)-R-848(1μg/mL)、または示されるように修飾されたRNA-1571(5μg/mL)で20時間処理した。(A)CD83およびHLA-DR染色。(B)RNAを伴うインキュベーションに対する応答における上清中のTNF-αレベルならびにCD80およびCD86の平均蛍光。培地の容積は、星印によって示されるように、フローサイトメトリーについて30倍増大した。データは、4の独立した実験の代表値である。
異なる量(対応する修飾されていないNTP に対する0、1、10、50、90、99、および100%の修飾されたヌクレオシド)を含有するキャッピングされたRNA-1571を転写し、数個のヌクレオシドのみの修飾が樹状細胞の活性化の阻害を結果的に生じることを見出した。(A)すべての転写産物を一リン酸に消化し、逆相HPLCによって分析して、修飾されたヌクレオシド組み込みの相対量を決定した。示される(Ψ:U)比で得られた代表的な吸光度特性を示す。プソイドウリジン(Ψ)、シチジン(C)、グアノシン(G)、ウリジン(U)、7-メチルグアノシン(「m7G」)、およびアデノシン(「A」)について、溶出時間に注意する。(B)RNA-1571の修飾されたヌクレオシド含有量。RNA-1571におけるm6A、Ψ(プソイドウリジン)、またはm5Cの期待される割合を、RNA-1571の転写反応およびヌクレオシド組成(A:505、U:451、C:273、G:342)における修飾されたNTPの相対量に基づいて算出した。測定された修飾されたヌクレオシド含有量についての値を、HPLCクロマトグラムの定量に基づいて決定した。注記:A:ATP、UTP、およびCTPそれぞれに対するm6ATP、ΨTP、またはm5CTPについての値(%)。B:すべてのNMPに対するm6A、Ψ、およびm5C一リン酸についての値。(C)MDDCに、示される量のm6A、Ψ、またはm5Cを含有する、Lipofectin(登録商標)と複合体形成したキャッピングされたRNA-1571(5μg/mL)を形質移入した。8時間後、TNF-αを上清中で測定した。データは、TNF-αの相対的な阻害として表す。3の独立した実験において得られた平均値±標準誤差を示す。
オリゴリボヌクレオチドを形質移入された樹状細胞によるTNF-αの発現は、1つという少ない修飾されたヌクレオシドでも樹状細胞の活性化を低下させることを示す。(A)化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチド(ORN1~4)の配列(配列番号6~9)またはインビトロで転写されるオリゴリボヌクレオチド(ORN5~6)の配列(配列番号10~11)を示す。修飾されたヌクレオシドUm(2’-O-メチルウリジン)、m5C、およびΨの位置を強調している。ヒトMDDCにLipofectin(登録商標)単独(培地)、R-848(1μg/mL)、またはRNA(5μg/mL)と複合体形成したLipofectin(登録商標)を形質移入した。記載するところでは、細胞を2.5μg/mLのシクロヘキシミド(CHX)で処理した。8時間のインキュベーション後、TNF-αを上清中で測定した。(C)細胞由来のRNAをノザンブロット法によって分析した。3つの独立した実験の代表的な平均値±標準誤差を示す。
A.Ψ修飾したmRNAは、インビボでの炎症誘発性サイトカイン産生を刺激しない。血清試料(注射6時間後)をELISAによって分析し、3μgの修飾されていないmRNAが、3μgのΨ修飾されたmRNAよりも高いレベルのIFN-αを誘導することを明らかにした(P<0.001)。3μgのΨ修飾されたmRNAによって誘導されるIFN-αのレベルは、動物に複合体形成していないリポフェクチンを注射した場合に得られるものと類似していた。値は、平均±標準誤差として表す(n=3または5個体/群)。B.類似の結果をTNF-αについても観察した。
プソイドウリジン(Ψ)を含有するmRNAは、PKRを活性化しない。Ψ:プソイドウリジン。対照:修飾されていないRNA。m5C:m5C修飾を有するmRNA。
ウサギ網状赤血球溶解産物におけるプソイドウリジン含有mRNAからのルシフェラーゼの増大した発現。Luc-Y:プソイドウリジン修飾を伴うmRNA、luc-C:修飾されていないRNA。データを、修飾されていないルシフェラーゼRNAに対してルシフェラーゼ活性を標準化することによって表す。
培養された細胞におけるプソイドウリジン含有mRNAからのウミシイタケの増大した発現。A.293細胞。B.マウス初代ウシ骨髄由来マウス樹状細胞。renilla-Y:プソイドウリジン修飾を有するmRNA、renilla-C:修飾されていないRNA。記載されるとおり、RNAをm5C、m6A、およびm5Uで修飾した。
A.Ψ修飾されたmRNAの翻訳効率に及ぼす3’要素および5’要素の相加効果。293細胞に従来のホタルルシフェラーゼおよびΨ修飾された、5’キャップ(capLuc)、50ヌクレオチド長の3’ポリA末端(TEVlucA50)を有したmRNA(これらの要素は両方であるかまたはいずれでもない(それぞれ、capTEVlucA50およびLuc))を形質移入した。細胞を4時間後に溶解し、全溶解産物の一定分量(1/20)においてルシフェラーゼ活性を測定した。B.Ψ修飾されたmRNAは、修飾されていないmRNAよりも安定である。修飾されていないまたはΨ修飾されたヌクレオシドを含有するcapTEVlucAnを形質移入した293細胞を、形質移入後の示される時間に溶解した。一定分量(1/20)の溶解産物をルシフェラーゼについてアッセイした。標準誤差はあまりにも小さすぎるので、誤差棒で可視化できない。C.β-ガラクトシダーゼの発現を、従来のmRNAと比較してΨ修飾されたmRNAを用いて高める。96ウェルプレートにおいて播種した293細胞にリポフェクチンと複合体形成した、細菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)をコードするmRNA(0.25μg/ウェル)を形質移入した。転写産物は、30ヌクレオチド長(caplacZ)または最大200ヌクレオチド長(caplacZ-An)のいずれかであるキャップおよび3’ポリA末端を有した。従来のUまたはΨヌクレオシドを用いて作製されるコンストラクトを試験した。形質移入の24時間後、細胞を固定し、X-galを用いて染色した。代表的なウェルから、倒立顕微鏡検査(40倍および100倍の倍率)によって画像を撮影した。
A.修飾されたまたは修飾されていないコードするmRNAの脳内注射後のウミシイタケの発現。ラット大脳皮質に8箇所/個体で注射した。1つの半球には、プソイドウリジン修飾を有する、キャッピングされウミシイタケをコードするRNAを注射した(capRenilla-Y)のに対し、対応する半球には、ヌクレオシド修飾を有さないキャッピングされたRNAを注射した(capRenilla-C)。2個体(6の注射部位)からのデータを示す。BG;本アッセイのより低レベルの検出。B.静脈内送達されたΨ修飾されたmRNAを脾臓において発現させる。リポフェクチンと複合体形成したΨmRNA(0.3μgのcapTEVlucAn/マウス)を尾静脈注射によって投与した。動物を注射2時間後および4時間後に屠殺し、ルシフェラーゼ活性を溶解緩衝液において均質化した一定分量(1/10)の臓器において測定した。値は、全臓器におけるルシフェラーゼ活性を表す。C.Ψ修飾されたmRNAは、インビボでより大きな安定性および翻訳を示す。Ψ修飾を有するまたは有さない、リポフェクチンと複合体形成したcapTEVlucAn(0.3μg/60μL/個体)をマウスに静脈内送達した。注射1、4、および24時間後に動物を屠殺し、該動物の脾臓の1/2をルシフェラーゼ酵素測定のために(左パネル)、もう半分をRNA分析のために加工した(右パネル)。ルシフェラーゼ活性を脾臓の半分から作製された一定分量(1/5)の均質液において測定した。プロットされた値は、全脾臓におけるルシフェラーゼ活性を表し、平均±標準誤差として表す(n=3または4/地点)。D.mRNAの気管内注射後のホタルルシフェラーゼの発現。capTEVluc-Y:キャッピングされホタルルシフェラーゼをコードするプソイドウリジン修飾されたRNA。CapTEVluc-C:ヌクレオシド修飾を有さないキャッピングされたRNA。
タンパク質産生は、マウスにおいて静脈内に送達されるmRNAの量に依存する。60μL/個体の容積で、示される量のリポフェクチンと複合体形成した核酸、Ψ成分を有するまたは有さない、capTEVlucAn mRNA、およびpCMVlucプラスミドDNAをマウスに静脈内注射によって送達した。mRNAまたはプラスミドDNAを注射した動物を注射6時間後または24時間後にそれぞれ屠殺し、ルシフェラーゼ活性を、溶解緩衝液において均質化された一定分量(1/10)の該動物の脾臓において測定した。各動物由来の値が示されており、短い水平線は平均を、N.D.は検出不可能を示す。
コードmRNAの気管内送達後のホタルルシフェラーゼの発現。mRNAをリポフェクチン(または注記する場合、PEI)と複合体形成し、動物に、ホタルルシフェラーゼをコードする0.3μgのΨ修飾しまたはしていないmRNAを注射した後、3時間後に屠殺した。肺を回収および均質化し、ルシフェラーゼ活性を一定分量の溶解した臓器において測定した。
Ψ修飾されたmRNAは、肺送達後の炎症性仲介因子を誘導しない。ルシフェラーゼをコードする修飾されていないmRNAまたはΨ修飾されたmRNAの気管内送達後の血清におけるTNF-αおよびIFN-αの誘導。TNF-αおよびIFN-αの血清レベルを、mRNA送達の24時間後にELISAによって決定した。
実施例35からの結果を示す:示された修飾を有する、ホタルまたはウミシイタケのルシフェラーゼをコードするmRNAを、リポフェクチンと複合体形成し、マウス樹状細胞(A)およびHEK293T細胞(B)に送達した。ヒト樹状細胞に、示された修飾を有するTransITと複合体形成した、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼをコードするmRNAを形質移入した(C)。データは、修飾されていないmRNAと比較した倍数変化として表す。
実施例36からの結果を示す。mRNAの作製に用いられたT7ポリメラーゼ転写反応は、正確な大きさの多量のRNAを結果として生じるが、夾雑物も含有している。このことは、変性条件下で大きさに基づいてRNAを分離する逆相HPLCカラムへのRNAの適用によって可視化される。Ψ修飾されたTEV-ルシフェラーゼ-A51 RNAを38%緩衝液Bにおいて該HPLCカラムに適用し、緩衝液Bが55%まで増加する直線勾配に供した。特性は、期待された物よりも小さくおよび期待された夾雑物よりも大きいことの両方を示した。
実施例37からの結果を示す:(A)示された修飾を有しかつHPLC精製を伴うまたは伴わない、EPOをコードするmRNAをマウス樹状細胞に送達し、上清におけるEPOレベルを24時間後に測定した。M5C/Ψ修飾されたmRNAは、HPLC精製前に最高レベルの翻訳を有したのに対し、Ψ修飾されたmRNAは、HPLC精製後に最高の翻訳を有した。(B)ヒト樹状細胞に、HPLC精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有する、ウミシイタケをコードするmRNAを形質移入した。
実施例38からの結果を示す。(A)ヒト樹状細胞に、HPLC精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有するTransITと複合体形成したRNAを形質移入した。IFN-αレベルを24時間後に測定した。HPLC精製は、他の修飾されていないRNAが類似のレベルのIFN-αを有し、またはHPLC精製後にレベルを低下させたので、配列に依存する、修飾されていないRNAの免疫原性を増大させた。Ψ修飾されたRNAは、対照処理された樹状細胞と類似の、測定不可能なレベルのIFN-αを有した。(B)HPLC精製前(-)およびHPLC精製後(P1およびP2)のΨ修飾されたRNAを、二本鎖RNAに特異的なモノクローナル抗体を用いるドットブロッティング法を用いて、二本鎖RNAについて分析した(J2)。RNAの精製は、二本鎖RNA夾雑物を除去した。(C)iPS因子をコードするΨ修飾されたRNAは免疫原性であり、該RNAは、該RNAのHPLCによって除去される。
KLF4(配列番号12)およびLIN28(配列番号13)についての配列をコードするmRNAを提供する。
cMYC(配列番号14)およびNANOG(配列番号15)についての配列をコードするmRNAを提供する。
OCT4(配列番号16)およびSOX2(配列番号17)についての配列をコードするmRNAを提供する。
ヒト再プログラム化因子(KLF4、c-MYC、OCT4、およびSOX2)をコードするmRNAが、初代ヒトケラチノサイト細胞においてiPS細胞を作製することを示す。図28は、4の再プログラム化因子をコードするmRNAを用いた最終的な形質移入の2日後のHEKn細胞(A)ならびに11日後(B)および20日後(C)のiPSコロニー形成の位相差画像を示す。画像は、10倍の倍率である。
ヒト再プログラム化因子(KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2)をコードするmRNAが、公知のiPS細胞マーカーに対して陽性であるヒトケラチノサイトにおいてiPS細胞を作製することを示す。図29は、HEKn細胞由来のコロニーの位相差画像を示す(A、D、およびG)。(A)において示される同じiPSコロニーは、KLF4(B)およびLIN28(C)に対して陽性である。(D)において示されるiPSコロニーは、SSEA4陽性(E)およびTRA-1-60陽性(F)である。(G)に示されるiPSコロニーは、NANOG陽性である(H)。すべての画像は20倍の倍率である。
図30は、再プログラム化因子NANOGを含まない4つの再プログラム化mRNA(KLF4、c-MYC、OCT4、およびSOX2)を形質移入したHEKn細胞における3のiPS関連メッセージの発現の増加を示す。該メッセージの増加した発現を定量的PCRによって検出し、GAPDH発現に対して正規化する。各メッセージの発現レベルを、元の細胞株において認められるレベルに関連して図示する。
(定義)
本発明は、下に定義される用語に基づいて理解および解釈される。
本発明は、下に定義される用語に基づいて理解および解釈される。
本明細書で使用する場合、プソイドウリジンまたは5-メチルシチジン残基を含む一本鎖完全mRNAに対する引用における「実質的にすべて」は、試料中に存在する一本鎖完全mRNAのうちの少なくとも95%が、プソイドウリジンまたは5-メチルシチジン残基のいずれかを有することを意味する。
本明細書で使用する場合、プソイドウリジンもしくは5-メチルシチジン残基を含む一本鎖完全mRNAに対する引用における「本質的にすべて」は、試料中に存在する一本鎖完全mRNAのすべてのうち少なくとも99%が、プソイドウリジンまたは5-メチルシチジン残基のいずれかを有することを意味する。
本明細書で使用する場合、「RNA夾雑物分子」は、RNA残基を含みかつ、細胞に形質移入される場合に、(例えば、RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)、レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)、Toll様受容体(TLR)3、TLR7、TLR8、およびオリゴアデニラートシンテターゼ(OAS)等のRNAセンサーを活性化することによって)免疫応答を少なくとも部分的に活性化することのできる分子、または該細胞において、(例えば、大きな二本鎖RNA分子に対するもしくは低分子二本鎖RNA分子(siRNA)に対する応答を含む)RNA干渉(RNAi)応答を少なくとも部分的に活性化することのできるRNA分子である。例示的なRNA夾雑物分子には、再プログラム化分子(例えば、非完全長iPS細胞誘導因子)の一部のみをコードする部分的なまたは非完全長のmRNA、例えば、理論によって結び付けられることなく、「続走IVT」もしくは他の機構によって再プログラム化因子(例えば、iPS細胞誘導因子)をコードする完全長のmRNAよりも大きな一本鎖mRNA、二本鎖の大きなまたは小さなmRNA分子、およびキャッピングされていないmRNA分子が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、精製されたRNA調製物は、精製されたRNA調製物における全RNAの0.5%未満が、RNA夾雑物分子(または特に列挙されたRNA夾雑物)からなる場合、RNA夾雑物分子(または特定の列挙されるRNA夾雑物)が「実質的にない」。非夾雑物mRNA分子およびRNA夾雑物分子(または特定のRNA夾雑物)の量および相対量は、RNA分子を分離および定量するために、HPLCまたは当該技術分野において用いられる他の方法によって決定され得る。
本明細書で使用する場合、精製されたRNA調製物は、精製されたRNA調製物の全RNAの1.0%未満が、RNA夾雑物分子(または特に列挙されたRNA夾雑物)からなる場合、RNA夾雑物分子(または特定の列挙されたRNA夾雑物)が「本質的にない」。非夾雑物mRNA分子およびRNA夾雑物分子(または特定のRNA夾雑物)の量および相対量は、RNA分子を分離および定量するために、HPLCまたは当該技術分野において用いられる他の方法によって決定され得る。
本明細書で使用する場合、精製されたRNA調製物は、精製されたRNA調製物の全RNAの0.1%未満が、RNA夾雑物分子(または特に列挙されたRNA夾雑物)からなる場合、RNA夾雑物分子(または特定の列挙されたRNA夾雑物)が「事実上ない」。非夾雑物mRNA分子およびRNA夾雑物分子(または特定のRNA夾雑物)の量および相対量は、RNA分子を分離および定量するために、HPLCまたは当該技術分野において用いられる他の方法によって決定され得る。
本明細書で使用する場合、精製されたRNA調製物は、精製されたRNA調製物の全RNAの0.01%未満が、RNA夾雑物分子(または特に列挙されたRNA夾雑物)からなる場合、RNA夾雑物分子(または特定の列挙されたRNA夾雑物)が「ない」。非夾雑物mRNA分子およびRNA夾雑物分子(または特定のRNA夾雑物)の量および相対量は、RNA分子を分離および定量するために、HPLCまたは当該技術分野において用いられる他の方法によって決定され得る。
用語「を含む」、「を含有する」、「を有する」、「を含む」、および「を含んでいる」は、別段の記載がない限り、「含んでいるが、これに限定されない」として解釈されるべきである。用語「a」、「an」、ならびに「the」およびに本発明を説明する文脈における、具体的には、添付の特許請求の範囲の文脈における類似の指示語は、別段の記載がない限り、単数形および複数形の両方を網羅するものとして解釈されるべきである。任意のおよびすべての例または例示的な言語(「例えば」、「例えば」、「等の」)の使用は、本発明の態様または実施態様を説明するために単に意図されており、別段の主張がない限り、その範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはそれらに類するものに「由来する」RNA(mRNAを含む)またはポリペプチドなど、「由来する」という語の使用に関して、RNAまたはポリペプチドのいずれかが試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものに存在し、あるいは、インビトロでの転写反応またはRNA増幅反応(この中で、該RNAまたはポリペプチドは、元の試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものにおける該RNAまたはポリペプチド分子のすべてまたは一部によってコードされるかあるいは該すべてまたは一部のコピーである。)等のプロセスによって、試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものにおけるRNAを用いて作製されたことを意味する。例として、このようなRNAは、インビトロでの転写またはRNA増幅反応に用いられる元のRNAが、試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものに由来した限り、試料、生物試料、細胞、腫瘍、またはこれらに類するものから直接得られるのではなく、cDNAのクローン化を伴うまたは伴わないインビトロでの転写またはRNA増幅反応に由来することができる。「試料」および「生物試料」という用語は、それらの最も広範な意味で用いられ、生物源および環境源を含めた真核細胞を含有するまたは含有し得る任意の源から得られる試料または標本を包含する。本明細書で使用する場合、「試料」という用語は、生物体から得られる生物試料を指すために用いられる場合、体液(例えば、血液または唾液)、糞便、生検、スワブ(例えば、頬側スワブ)、単離された細胞、滲出物、およびこれらに類するものを含む。生物体には、真菌、植物、動物、およびヒトが含まれる。しかしながら、これらの例は、本発明での使用が見出される試料または生物体の種類を制限するものとして解釈されるべきではない。加えて、本発明の方法または組成物の使用に関連した研究を実施しまたは該使用に関連した結果を研究するために、いくつかの実施態様において、「試料」または「生物試料」は、固定された細胞、処理された細胞、細胞溶解物、およびこれらに類するものを含む。mRNAが、公知の疾患を有する生物体由来の細胞に、または疾患状態もしくは公知の病態を呈する細胞に送達される方法の実施態様等のいくつかの実施態様において、「試料」または「生物試料」は、細菌またはウイルスも含む。
本明細書で使用する場合、用語「インキュベートすること」およびその変形は、反応の1つ以上の成分を別の1つの成分または複数の成分と、所望の反応産物が形成される条件下で、所望の反応産物が形成されるのに十分な時間接触させることを意味する。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基(例えば、通常の核酸塩基:グアニン(G)、アデニン(A)、チミン(T)、ウラシル(U)、およびシトシン(C))、または五炭糖(例えば、リボースまたは2’-デオキシリボース)と共有結合した修飾された核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン(m5C))からなるのに対し、「ヌクレオチド」または「モノヌクレオチド」は、五炭糖のヒドロキシル基のうちの1つにおいてリン酸化されたヌクレオシドからなる。線形核酸分子は、「5’末端」(5’端)および「3’末端」(3’端)を有するといわれ、その理由は、キャッピングまたはアデニル化(例えば、リガーゼによるアデニル化)に関するものを除き、モノヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して一方向に結合して、1つのモノヌクレオチド糖部分の5’炭素におけるリン酸が、その隣接するモノヌクレオチドの糖部分の3’炭素における酸素に結合するような様式で、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを生成するからである。それゆえ、線形一本鎖のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの末端または線形二本鎖核酸(RNAもしくはDNA)の1つの鎖の末端は、その5’リン酸が、モノヌクレオチド糖部分の3’炭素の酸素に結合または結合していない場合、「5’端」と呼ばれ、その3’酸素が、別のモノヌクレオチドの糖に結合した5’リン酸に結合していない場合、「3’端」と呼ばれる。末端のヌクレオチドは、本明細書で使用する場合、3’末端または5’末端の端位置におけるヌクレオチドである。
特定の目標を達成するために、本発明の方法のいずれかにおける真核細胞に導入されるmRNAのヌクレオチドのうちの1つ以上における核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間(もしくはヌクレオチド間)結合は、修飾された塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合を含んでもよい。例えば、本発明の方法を実施するために本明細書の他所で論議されたその他の修飾されたヌクレオチドに加えて、該mRNAのヌクレオチドのうちの1つ以上も、キサンチン、アリアミノ-ウラシル、アリアミノ-チミジン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、4-チオウラシル、6-チオグアニン、アザもしくはデアザウラシル、アザもしくはデアザチミジン、アザもしくはデアザシトシン、アザもしくはデアザアデニン、またはアザもしくはデアザグアニン、あるいは、ビオチン部分、ジゴキシゲニン部分、蛍光もしくは化学発光部分、クエンチング部分もしくは1つ以上の特定の他の目的を達成するためのいくつかの他の部分を含むまたはそれらからなる修飾された核酸塩基を有することができ、および/あるいは該mRNAのヌクレオチドのうちの1つ以上は、いくつかのヌクレアーゼに対して耐性を提供する2’-フルオロ-2’-デオキシリボースまたは2’-O-メチル-リボース、あるいは可視、蛍光、赤外線蛍光、または他の検出可能な色素または、電解質部分、感光性部分、アルキニル部分、もしくは他の反応性化学物質部分を有する化学物質と反応することによって標識されることのできる2’-アミノ-2’-デオキシリボースまたは2’-アジド-2’-デオキシリボースなどだがそれらに限定されない、糖部分を有することができる。
本発明のいくつかの実施態様において、前記mRNAのヌクレオチドのうちの1つ以上は、RNAの同時転写キャッピングのためのIVT反応において用いられるジヌクレオチドキャップアナログ(Grudzien-Nogalska et al. 2007)において、または(RNAのIVT中の修飾されたホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレナート、もしくはホスホロジセレナート結合を有するヌクレオチドの組み込みによる、または例えば、ポリ(A)ポリメラーゼを用いるポリアデニル化によるRNAにおけるポリ(A)末端への、修飾されたホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレナート、もしくはホスホロジセレナート結合を含有するATPの組み込みによる)ポリ(A)末端において含むいくつかのヌクレアーゼに対して耐性のあるホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレナート、またはホスホロジセレナート結合等の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。本発明は、方法における特定の目的のために用いられ得る例を示すために呈される、列挙された修飾された核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合に限定されない。
本明細書で使用する場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、あるヌクレオチドの糖部分の3’位が、ホスホジエステル結合によって、次のヌクレオチドの糖部分の5’位に結合し、かつ該ヌクレオチドが、特定の配列、すなわちヌクレオチドの線形の順序で結合する、ヌクレオチドの共有結合配列である。いくつかの実施態様において、該核酸またはポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、2’-デオキシリボヌクレオチド(DNA)からなるかまたはそれを含む。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド(RNA)からなるかまたはそれを含む。
用語「単離された」または「精製された」は、「単離されたRNA」または「精製されたRNA」におけるように、ポリヌクレオチドまたは核酸との関連において使用する場合、その源において通常伴う少なくとも1つの夾雑物から特定および分離される核酸を指す。したがって、単離されたまたは精製された核酸(例えば、DNAおよびRNA)は、天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定、または処置もしくは精製の方法に供する前に存在したものとは異なる形態もしくは設定において存在する。例えば、所与のDNA配列(例えば、遺伝子)は、他の遺伝子ならびに構造タンパク質および機能タンパク質、および特異的RNA(例えば、特異的タンパク質をコードする特異的mRNA)とともに、宿主細胞染色体において見出され、数多くの他のRNAおよび他の細胞成分との混合物として細胞中に見出される。単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。
「キャップ」または「キャップヌクレオチド」は、好適な反応条件下でキャッピング酵素系によって基質として用いられ、かつそれにより一次RNA転写産物をもしくは5’-二リン酸を有するRNAを含むキャッピングされていないRNAの5’-端に結合するヌクレオシド-5’-三リン酸を意味する。そのように該RNAに結合するヌクレオチドは、本明細書で「キャップヌクレオチド」とも呼ばれる。「キャップヌクレオチド」は、その5’端を通じて一次RNA転写産物の5’端に結合するグアニンヌクレオチドである。その5’端に結合したキャップヌクレオチドを有するRNAは、「キャッピングされたRNA」または「キャッピングされたRNA転写産物」または「キャッピングされた転写産物」と呼ばれる。共通のキャップヌクレオシドは、7-メチルグアノシンまたはN7-メチルグアノシン(時々、「標準キャップ」と呼ばれる)であり、「m7G」として指定された構造を有し、この場合、キャッピングされたRNAまたは「m7GキャッピングされたRNA」は、m7G(5’)ppp(5’)N1(pN)x-OH(3’)として、またはより単純にはm7GpppN1(pN)xもしくはm7G[5’]ppp[5’]Nとして指定された構造を有し、この中で、m7Gは、7-メチルグアノシンキャップヌクレオシドを表し、pppはキャップヌクレオシドの5’炭素と一次RNA転写産物の第一のヌクレオチドの間の三リン酸架橋を表し、N1(pN)x-OH(3’)は、一次RNA転写産物を表し、このうち、N1は、最も5’のヌクレオチドであり、「p」はリン酸基を表し、「G」は、グアノシンヌクレオシドを表し、「m7」は、グアニンの7位におけるメチル基を表し、および「[5’]」は、「p」がキャップヌクレオチドのリボースとmRNA転写産物の第一のヌクレオシド(「N」)に結合する位置を示す。この「標準的なキャップ」に加えて、種々の他の天然および合成のキャップ類似体が、当該技術分野において公知である。いかなるキャップヌクレオチドを有するRNAも、「キャッピングされたRNA」と呼ばれる。キャッピングされたRNAは、生物試料から自然に生じることができ、または5’三リン酸基を有するRNAの、もしくは5’二リン酸基を有するRNAの、キャッピング酵素系(例えば、ワクシニアキャッピング酵素系または出芽酵母キャッピング酵素系)を用いたインビトロでのキャッピングによって得られることができる。あるいは、キャッピングされたRNAは、RNAポリメラーゼプロモーターを含有するDNAテンプレートのインビトロでの転写(IVT)によって得られることができ、この中で、GTPに加えて、IVT反応は、当該技術分野において公知の方法を用いて(例えば、AMPLICAP(商標)T7キャッピングキットまたはMESSAGEMAX(商標)T7 ARCA-CAPPED MESSAGE転写キット、EPICENTRE、またはCellScriptを用いて)、ジヌクレオチドキャップアナログ(例えば、m7GpppGキャップアナログ、またはN7-メチル、2’-O-メチル-GpppG ARCAキャップアナログ、またはN7-メチル、3’-O-メチル-GpppG ARCAキャップアナログ)も含有する。
5’-三リン酸化した一次mRNA転写産物のインビボでのキャッピング(またはインビトロでキャッピング酵素系を用いること)は、いくつかの酵素工程を介して生じる(Higman et al. 1992、Martin et al. 1975、Myette and Niles 1996)。
以下の酵素反応が、真核生物mRNAのキャッピングに関与する:
(1)RNAトリホスファターゼは、mRNAの5’-三リン酸を二リン酸に開裂し、
pppN1(p)Nx-OH(3’) → ppN1(pN)x-OH(3’) + Pi
、次いで
(2)RNAグアニルトランスフェラーゼは、GTPの、mRNAの最も5’のヌクレオチド(N1)の5’-二リン酸への結合を触媒し、
ppN1(pN)x-OH(3’) + GTP → G(5’)ppp(5’)N1(pN)x-OH(3’) + PPi
、最後に、
(3)S-アデノシル-メチオニン(AdoMet)を補因子として用いるグアニン-7-メチルトランスフェラーゼは、キャップヌクレオチドにおけるグアニンの7-窒素のメチル化を触媒する。
(1)RNAトリホスファターゼは、mRNAの5’-三リン酸を二リン酸に開裂し、
pppN1(p)Nx-OH(3’) → ppN1(pN)x-OH(3’) + Pi
、次いで
(2)RNAグアニルトランスフェラーゼは、GTPの、mRNAの最も5’のヌクレオチド(N1)の5’-二リン酸への結合を触媒し、
ppN1(pN)x-OH(3’) + GTP → G(5’)ppp(5’)N1(pN)x-OH(3’) + PPi
、最後に、
(3)S-アデノシル-メチオニン(AdoMet)を補因子として用いるグアニン-7-メチルトランスフェラーゼは、キャップヌクレオチドにおけるグアニンの7-窒素のメチル化を触媒する。
G(5’)ppp(5’)N1(pN)x-OH(3’) + AdoMet → m7G(5’)ppp(5’)N1(pN)x-OH(3’) + AdoHyc
RNAトリホスファターゼおよびRNAグアニルトランスフェラーゼの酵素活性の作用から結果として生じるRNA、ならびにグアニン-7-メチルトランスフェラーゼ酵素活性によって追加的にメチル化されるRNAは、本明細書で「5’キャッピングされたRNA」または「キャッピングされたRNA」と呼ばれ、本明細書での「キャッピング酵素系」または、より単純には、「キャッピング酵素」は、「キャッピングされたRNA」を結果として生じる酵素活性を有する1つ以上のポリペプチドの任意の組み合わせを意味する。このような酵素のクローン化した形態を含むキャッピング酵素系が特定され、多くの源から精製され、当該技術分野において周知である(Banerjee 1980, Higman et al. 1992, Higman et al. 1994, Myette and Niles 1996, Shuman 1995, Shuman 2001, Shuman et al. 1980, Wang et al. 1997)。5’ポリリン酸を有するキャッピングされていないRNAをキャッピングされたRNAに変換することのできる任意のキャッピング酵素系を用いて、本発明の実施態様のいずれについてのキャッピングされたRNAをも提供することができる。いくつかの実施態様において、該キャッピング酵素系は、ポックスウイルスキャッピング酵素系である。いくつかの好ましい実施態様において、キャッピング酵素系は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素である。いくつかの実施態様において、キャッピング酵素系は、出芽酵母キャッピング酵素である。また、RNAトリホスファターゼ、RNAグアニルトランスフェラーゼ、およびグアニン-7-メチルトランスフェラーゼを1つの源からコードする遺伝子が、別の源からこれらの遺伝子のうちの1つまたはすべてにおける欠失を補充することができるという事実の点で、キャッピング酵素系は、1つの源から派生することができ、またはRNAトリホスファターゼ、RNAグアニルトランスフェラーゼ、および/もしくはグアニン-7-メチルトランスフェラーゼ活性のうちの1つ以上は、異なる源由来のポリペプチドを含むことができる。
RNAトリホスファターゼおよびRNAグアニルトランスフェラーゼの酵素活性の作用から結果として生じるRNA、ならびにグアニン-7-メチルトランスフェラーゼ酵素活性によって追加的にメチル化されるRNAは、本明細書で「5’キャッピングされたRNA」または「キャッピングされたRNA」と呼ばれ、本明細書での「キャッピング酵素系」または、より単純には、「キャッピング酵素」は、「キャッピングされたRNA」を結果として生じる酵素活性を有する1つ以上のポリペプチドの任意の組み合わせを意味する。このような酵素のクローン化した形態を含むキャッピング酵素系が特定され、多くの源から精製され、当該技術分野において周知である(Banerjee 1980, Higman et al. 1992, Higman et al. 1994, Myette and Niles 1996, Shuman 1995, Shuman 2001, Shuman et al. 1980, Wang et al. 1997)。5’ポリリン酸を有するキャッピングされていないRNAをキャッピングされたRNAに変換することのできる任意のキャッピング酵素系を用いて、本発明の実施態様のいずれについてのキャッピングされたRNAをも提供することができる。いくつかの実施態様において、該キャッピング酵素系は、ポックスウイルスキャッピング酵素系である。いくつかの好ましい実施態様において、キャッピング酵素系は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素である。いくつかの実施態様において、キャッピング酵素系は、出芽酵母キャッピング酵素である。また、RNAトリホスファターゼ、RNAグアニルトランスフェラーゼ、およびグアニン-7-メチルトランスフェラーゼを1つの源からコードする遺伝子が、別の源からこれらの遺伝子のうちの1つまたはすべてにおける欠失を補充することができるという事実の点で、キャッピング酵素系は、1つの源から派生することができ、またはRNAトリホスファターゼ、RNAグアニルトランスフェラーゼ、および/もしくはグアニン-7-メチルトランスフェラーゼ活性のうちの1つ以上は、異なる源由来のポリペプチドを含むことができる。
本発明の「修飾されたキャップヌクレオチド」は、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合が、対応する通常の7-メチルグアノシンキャップヌクレオチドと比較して化学的に修飾される、キャップヌクレオチドを意味する。修飾されたキャップヌクレオチドの例には、(i)デオキシリボース糖部分の2’-または3’-デオキシ位置が、アミノ基、アジド基、フッ素基、メトキシ基、チオール(もしくはメルカプト)基、またはメチルチオ(もしくはメチルメルカプト)基を含む基と置換される、修飾された2’-もしくは3’-デオキシグアノシン-5’-三リン酸(またはグアニン2’-もしくは3’-デオキシリボ核酸-5’-三リン酸)を、あるいは(ii)グアニン塩基のO6酸素がメチル化される修飾されたグアノシン-5’-三リン酸を、あるいは(iii)3’-デオキシグアノシンを含むキャップヌクレオチドが挙げられる。明確にする目的のために、「アルコキシ置換デオキシグアノシン-5’-三リン酸」が、「O-アルキル置換グアノシン-5’-三リン酸」とも呼ばれることができることは本明細書で理解されるであろうし、例として、しかし制限を有さないが、2’-メトキシ-2’-デオキシグアノシン-5’-三リン酸(2’-メトキシ-2’-dGTP)および3’-メトキシ-3’-デオキシグアノシン-5’-三リン酸(3’-メトキシ-3’-dGTP)は、本明細書においてそれぞれ、2’-O-メチルグアノシン-5’-三リン酸(2’-OMe-GTP)および3’-O-メチルグアノシン-5’-三リン酸(3’-OMe-GTP)と呼ばれることができる。修飾されたキャップヌクレオチドを、一次RNA転写産物を含むキャッピングされていないRNA(もしくは5’-二リン酸を有するRNA)の5’端に結合した後、一次RNA転写産物を含むキャッピングされていないRNA(もしくは5’-二リン酸を有するRNA)に結合した該修飾されたキャップヌクレオチドの部分は本明細書において、「修飾されたキャップヌクレオシド」と呼ばれ得る(すなわち、結合したリン酸基に言及せずに)が、時々、「修飾されたキャップヌクレオチド」と呼ばれる。
「修飾されたヌクレオチドでキャッピングされたRNA」は、キャッピング酵素系と修飾されたキャップヌクレオチドとを用いて合成された、キャッピングされたRNA分子であり、この中で、その5’末端におけるキャップヌクレオチドは、修飾されたキャップヌクレオチドを、またはジヌクレオチドキャップアナログがキャップヌクレオチドにおける化学的修飾を含有する修飾されたジヌクレオチドキャップアナログを含有するインビトロでの転写反応において同時転写的に合成されるキャッピングされたRNAを含む。いくつかの実施態様において、修飾されたジヌクレオチドキャップアナログは、反逆方向キャップアナログまたはARCAである(Grudzien et al. 2004, Jemielity et al. 2003, Grudzien-Nogalska et al. 2007, Peng et al. 2002, Stepinski et al. 2001)。
「一次RNA」または「一次RNA転写産物」は、RNAポリメラーゼによってインビボまたはインビトロで合成されかつRNA分子がその最も5’のヌクレオチドの5’-炭素において三リン酸を有するRNA分子を意味する。
「RNA増幅反応」または「RNA増幅方法」は、試料における1または複数の所望のRNA配列に対応するRNAの量を増加させるための方法を意味する。例えば、いくつかの実施態様において、RNA増幅方法は、(a)所望のRNA分子にアニーリングする1つ以上のプライマーのRNA依存性DNAポリメラーゼ伸長によって1つ以上の所望のRNA分子と相補的な第一の鎖のcDNAを合成すること、(b)機能的RNAポリメラーゼプロモーターが結合するプロセスを用いて、第一の鎖のcDNAから二本鎖cDNAを合成すること、および(c)二本鎖DNAを、1つ以上の所望のRNA分子に対応するRNAが得られる転写条件下で該プロモーターに結合するRNAポリメラーゼと接触させることを含む。本発明の特定の実施態様と関連した別段の記載がない限り、本発明に従ったRNA増幅反応は、センスRNA(例えば、mRNAもしくは他の一次RNA転写産物の相補体ではなく、該mRNAもしくは他の一次RNA転写産物と同じ配列を有するRNA)を合成するRNA増幅反応を意味するセンスRNA増幅反応を意味する。本定義内に包含される、当該技術分野で公知のセンスRNA増幅反応には、Ozawaら(Ozawa et al. 2006)において、ならびに米国特許出願第20090053775号、第20050153333号、第20030186237号、第20040197802号、および第20040171041号において説明される、センスRNAを合成する方法が含まれるが、これらに限定されない。米国特許出願第20090053775号において説明されるRNA増幅方法は、1つ以上の細胞に由来する増幅されたRNAを得るための好ましい方法であり、該増幅されたRNAを次に、本発明の方法における使用のためのmRNAを生成するために用いる。
「ポリ-Aポリメラーゼ」(「PAP」)は、ほとんどの真核生物、原核生物、および真核生物性ウイルスにおいて見出される、ATPを選択的に用いて、AMP残基をRNAの3’ヒドロキシル化端に組み込むテンプレート非依存性RNAポリメラーゼを意味する。植物、動物、細菌、およびウイルスから研究されたPAP酵素はすべて、同じ全体的な反応を触媒し(Edmonds 1990)、高度に構造的に保存され(Gershon 2000)、ならびに、PAPが、AAUAAAポリアデニル化シグナルを認識するタンパク質から分離される場合、RNA分子の特定の配列または大きさに対する本質的な特異性を欠失するので(Wilusz and Shenk 1988)、種々の源のうちのいずれかに由来する精製された野生型および組換えPAP酵素は、本発明のために用いられることができる。いくつかの実施態様において、サッカロミセス由来の(例えば、出芽酵母由来の)PAP酵素をポリアデニル化のために用いて、1つ以上の修飾されたmRNAを含むかまたはそれからなる精製されたRNA調製物を作製し、該修飾されたmRNAの各々は、再プログラム化因子(例えば、iPS細胞誘導因子)をコードする。いくつかの実施態様において、大腸菌由来のPAP酵素をポリアデニル化に用いて、1つ以上の修飾されたmRNAを含むかまたはそれからなる精製されたRNA調製物を作製し、該修飾されたmRNAの各々は、再プログラム化因子(例えば、iPS細胞誘導因子)をコードする。
「再プログラム化因子」は、単独で、または他の因子もしくは条件との組み合わせで用いる場合、再プログラム化因子が導入されまたは発現する細胞の分化の状態の変化を生じるタンパク質、ポリぺプチド、または他の生体分子を意味する。本発明の方法のいくつかの好ましい実施態様において、再プログラム化因子は、細胞に導入されたmRNAによってコードされたタンパク質またはポリペプチドであり、それにより該mRNAが導入された細胞と比較して分化の変化した状態を呈する細胞を作製する。本発明の方法のいくつかの好ましい実施態様において、再プログラム化因子は転写因子である。本発明の方法において用いられる再プログラム化因子に関する一実施態様は、「iPS細胞誘導因子」である。
「iPS細胞誘導因子」または「iPSC誘導因子」は、単独で、または他の再プログラム化因子との組み合わせで用いて、体細胞からのiPS細胞の作製を生じるタンパク質、ポリペプチド、または他の生体分子である。iPS細胞誘導因子の例には、OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、NANOG、およびLIN28が挙げられる。iPS細胞誘導因子には、完全長のポリペプチド配列またはその生物学的に活性のある断片が含まれる。同様に、iPS細胞誘導因子をコードするmRNAは、完全長のポリペプチドまたはその生物学的に活性のある断片をコードし得る。例示的なiPS誘導因子についての配列をコードするmRNAを図25(KLF4およびLIN28)、図26(cMYCおよびNANOG)、および図27(OCT4およびSOX2)において示す。ある実施態様において、本発明は、これらの図に示される配列または類似の配列を採用し、これには、これらのmRNA配列に結合した、5’および3’UTR配列、コザック配列、IRES配列、キャップヌクレオチド、ならびに/または本明細書で説明される実験において用いられるポリ(A)配列のいずれかを呈するオリゴリボヌクレオチド、あるいは当該技術分野で一般的に公知でありかつ細胞における個々のmRNA分子の翻訳を最適化して、本明細書に説明される方法を達成するために細胞における該分子の安定性を改良する目的のために、これらのタンパク質をコードするmRNA配列に結合することによって、本明細書で用いられる配列の替わりに用いられることのできるオリゴリボヌクレオチドを追加的に含むmRNA分子が含まれる。
「分化」または「細胞内分化」は、特殊化の程度が低い状態の分化を呈する細胞または細胞種類(例えば、受精卵細胞、胚における細胞、または真核生物における細胞)が、より特殊化した状態の分化を呈する細胞または細胞種類となる天然の生物過程を意味する。生物学者、細胞生物学者、免疫学者、および発生学者を含む科学者は、種々の方法および基準を用いて、「細胞種類」、「分化した状態」、または「分化の状態」に従って異なる細胞を定義、説明、または分類する。一般に、細胞は、該細胞によって呈される1つ以上の表現型に基づいて、「細胞種類」、「分化した状態」、または「分化の状態」に関して定義、説明、または分類され、該表現型には、形状、生化学的もしくは代謝的な活性もしくは機能、(例えば、具体的な生体分子と反応する染色に基づいた)細胞中のもしくは(例えば、細胞表面上の具体的な生体分子と反応する1つ以上の抗体の結合に基づいた)細胞上のある生体分子の存在が含まれることができる。例えば、いくつかの実施態様において、異なる細胞種類は、細胞選別機または蛍光発色細胞選別機(FACS)機器を用いて特定および選別される。「分化」または「細胞の分化」は、培養物中の細胞にも生じ得る。
「再プログラム化」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞への1つ以上の再プログラム化因子の直接的な(例えば、細胞へのタンパク質またはポリペプチド再プログラム化因子の送達による)または間接的な(例えば、各々が再プログラム化因子をコードする1つ以上のmRNA分子を含む本発明の精製されたRNA調製物の送達による)送達および、分化の助けとなる条件(例えば、培地、温度、酸素およびCO2レベル、マトリックス、ならびに他の環境条件)の下で細胞を維持することに応答して生じる分化または細胞内分化を意味する。「再プログラム化」という用語は、本明細書で使用する場合、分化の特定の方向または経路を意味するまたは指すよう意図されておらず、自然において通常観察されるものよりも分化の方向または経路において進行するプロセスを排除しない。したがって、本発明の異なる実施態様において、「再プログラム化」は、以下のうちのいずれかおよびすべてを意味し含む:
(1)特殊化の程度がより低い状態の分化を呈する細胞または細胞種類(例えば、iPS細胞)に進む、より特殊化した状態の分化を呈する細胞または細胞種類(例えば、哺乳類線維芽細胞、ケラチノサイト、筋細胞、または神経細胞)の過程を意味する「脱分化」、
(2)別のより特殊化した状態の分化または細胞種類(例えば、線維芽細胞もしくはケラチノサイトから筋細胞へ)に進む、より特殊化した状態の分化を呈する細胞または細胞種類(例えば、哺乳類線維芽細胞、ケラチノサイト、または神経細胞)の過程を意味する「分化転換」、および
(3)(例えば1つ以上の再プログラム化因子に応答して)生物または培養物においてインビボで生じようとなかろうと、細胞がその天然の場所および環境に(例えば、胚または臓器に)存在した場合に本来期待されるであろう別の状態の分化または細胞種類に進む、任意の特定の状態の分化または細胞種類を呈する細胞の過程を意味する「再分化」または「期待される分化」または「自然分化」。
(1)特殊化の程度がより低い状態の分化を呈する細胞または細胞種類(例えば、iPS細胞)に進む、より特殊化した状態の分化を呈する細胞または細胞種類(例えば、哺乳類線維芽細胞、ケラチノサイト、筋細胞、または神経細胞)の過程を意味する「脱分化」、
(2)別のより特殊化した状態の分化または細胞種類(例えば、線維芽細胞もしくはケラチノサイトから筋細胞へ)に進む、より特殊化した状態の分化を呈する細胞または細胞種類(例えば、哺乳類線維芽細胞、ケラチノサイト、または神経細胞)の過程を意味する「分化転換」、および
(3)(例えば1つ以上の再プログラム化因子に応答して)生物または培養物においてインビボで生じようとなかろうと、細胞がその天然の場所および環境に(例えば、胚または臓器に)存在した場合に本来期待されるであろう別の状態の分化または細胞種類に進む、任意の特定の状態の分化または細胞種類を呈する細胞の過程を意味する「再分化」または「期待される分化」または「自然分化」。
(本発明の説明)
本発明は、ヒトまたは他の動物の細胞を含む真核細胞を、再プログラム化因子(例えば、iPS細胞誘導因子)を各々コードする1つ以上の異なる一本鎖mRNA分子を含むかそれからなる精製されたRNA調製物と接触させることによって、該細胞の分化の状態を再プログラム化するための組成物および方法を提供する。精製された一本鎖mRNA分子は好ましくは、プソイドウリジン(Ψ)、5-メチルシトシン(m5C)、5-メチルウリジン(m5U)、2’-O-メチルウリジン(Umまたはm2’-OU)、2-チオウリジン(s2U)、およびN6-メチルアデノシンを、対応する修飾されていないA、C、G、またはTの通常のヌクレオシドの対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部(例えば、実質的にすべてを含む)の替わりに含む。加えて、一本鎖mRNA分子は好ましくは、意図されていない応答を活性化させ、一本鎖mRNAの発現を低下させ、および/または細胞におけるRNAセンサーを活性化させるであろうRNA夾雑物分子が実質的にないよう精製される。ある実施態様において、精製されたRNA調製物は、完全長の一本鎖mRNA分子よりも短いかまたは長いか、二本鎖RNA、および/またはキャッピングされていないRNAであるRNA夾雑物分子が実質的にない。いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、ヒトまたは他の動物の体細胞を含む分化した真核細胞を、iPS細胞誘導因子を各々コードする1つ以上の異なる一本鎖mRNA分子を含むかまたはそれからなる精製されたRNA調製物と接触させることによって、該細胞を再プログラム化するための組成物および方法を提供する。
本発明は、ヒトまたは他の動物の細胞を含む真核細胞を、再プログラム化因子(例えば、iPS細胞誘導因子)を各々コードする1つ以上の異なる一本鎖mRNA分子を含むかそれからなる精製されたRNA調製物と接触させることによって、該細胞の分化の状態を再プログラム化するための組成物および方法を提供する。精製された一本鎖mRNA分子は好ましくは、プソイドウリジン(Ψ)、5-メチルシトシン(m5C)、5-メチルウリジン(m5U)、2’-O-メチルウリジン(Umまたはm2’-OU)、2-チオウリジン(s2U)、およびN6-メチルアデノシンを、対応する修飾されていないA、C、G、またはTの通常のヌクレオシドの対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部(例えば、実質的にすべてを含む)の替わりに含む。加えて、一本鎖mRNA分子は好ましくは、意図されていない応答を活性化させ、一本鎖mRNAの発現を低下させ、および/または細胞におけるRNAセンサーを活性化させるであろうRNA夾雑物分子が実質的にないよう精製される。ある実施態様において、精製されたRNA調製物は、完全長の一本鎖mRNA分子よりも短いかまたは長いか、二本鎖RNA、および/またはキャッピングされていないRNAであるRNA夾雑物分子が実質的にない。いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、ヒトまたは他の動物の体細胞を含む分化した真核細胞を、iPS細胞誘導因子を各々コードする1つ以上の異なる一本鎖mRNA分子を含むかまたはそれからなる精製されたRNA調製物と接触させることによって、該細胞を再プログラム化するための組成物および方法を提供する。
ある実施態様において、精製されたRNA調製物において用いられるmRNAは精製されて、実質的に、本質的に、または事実上すべてのRNA夾雑物を含む夾雑物を実質的に、本質的に、または事実上すべて除去する。本発明は、mRNAを精製するために用いられる精製方法に関して制限されず、本発明には、当該技術分野で公知の、または、該mRNAを精製して、該mRNAの意図された使用に干渉するRNA夾雑物を含む夾雑物を除去するために将来開発される、任意の方法の使用が含まれる。例えば、好ましい実施態様において、mRNAの精製は、細胞に対して毒性のある夾雑物を(例えば、細胞における生得的免疫応答を誘導することによって、または二本鎖RNAを含むRNA夾雑物の場合、RNA干渉(RNAi)を、例えばsiRNAもしくは長いRNAi分子を介して誘導することによって)および細胞におけるmRNAの翻訳を直接的にまたは間接的に低下させる夾雑物を除去する。いくつかの実施態様において、mRNAは、実施例に含む、本明細書に説明される方法を用いるHPLCによって精製される。ある実施態様において、mRNAは、C18で誘導体化したスチレン-ジビニルベンゼンコポリマーを含むポリマー樹脂基質に関して用いて精製され、酢酸トリエチルアミン(TEAA)イオン対形成剤が、mRNAを溶出して、それをRNA夾雑物から大きさ依存的な様式で分離するためにアセトニトリル勾配の使用とともに、カラムにおいて用いられ、いくつかの実施態様において、mRNA精製は、HPLCを用いて実施されるが、いくつかの他の実施態様において、重力フローカラムが精製に用いられる。いくつかの実施態様において、mRNAは、引用により本明細書に組み込まれる、Wiley-VCH, 2009によって刊行された、Douglas T. Gjerde, Lee Hoang, and David Hornbyによる「RNA Purification and Analysis」という表題の書籍において説明された方法を用いて精製される。いくつかの実施態様において、mRNA精製は、(例えば、約50℃未満の温度での、例えば、大気温での)非変性モードで実施される。いくつかの実施態様において、mRNA精製は、(約72℃を超える温度での)変性モードで実施される。もちろん、当業者は、変性温度が、精製されているmRNAの融解温度(Tm)、およびmRNAに混入するRNA、DNA、またはRNA/DNAハイブリッドの融解温度に依存することを知っている。いくつかの他の実施態様において、mRNAは、Mellits KH et al.(そのすべての内容が引用により本明細書に組み込まれるRemoval of double-stranded contaminants from RNA transcripts: synthesis of adenovirus VA RNA1 from a T7 vector. Nucleic Acids Research 18: 5401-5406, 1990)によって説明される通り精製される。これらの著者は、本発明の実施態様において用いられ得る、夾雑物を除去するための3工程精製を用いた。工程1は、7M尿素(変性条件)における8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法であった。主なRNAバンドをゲル切片から摘出し、非変性条件(無尿素)下での8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、主なバンドをゲル切片から回収した。さらなる精製を、二本鎖RNAを一本鎖RNAから分離するエタノール-塩緩衝液移動相を用いて、セルロースCF-11カラムにおいて実施し(Franklin RM. 1966. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55: 1504-1511; Barber R. 1966. Biochem. Biophys. Acta114:422; and Zelcer A et al. 1982. J. Gen. Virol. 59: 139-148、これらのすべては、引用により本明細書に組み込まれる)、最終的な精製工程は、セルロースクロマトグラフィーであった。いくつかの他の実施態様において、mRNAは、(例えば、それらのすべてが引用により本明細書に組み込まれる、Pays E. 1977. Biochem. J. 165: 237-245、Lewandowski LJ et al. 1971. J. Virol. 8: 809-812、Clawson GA and Smuckler EA. 1982. Cancer Research 42: 3228-3231、および/またはAndrews-Pfannkoch C et al. 2010. Applied and Environmental Microbiology 76: 5039-5045によって説明されるように)非変性条件下でまたはより高温でヒドロキシルアパタイト(HAP)カラムを用いて精製される。いくつかの他の実施態様において、mRNAは、(例えば、引用により本明細書に組み込まれる、インビトロでの転写反応を除去するためのEaston LE et al. 2010. RNA 16: 647-653によって説明されるように)非変性条件下で弱陰イオン交換液体クロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施態様において、mRNAは、先の方法または当該技術分野で公知のもしくは将来開発される別の方法のいずれかの組み合わせを用いて精製される。なおも別の実施態様において、本発明の組成物および方法において用いられるmRNAは、該mRNAを、1つ以上の夾雑物RNAまたは夾雑物核酸(例えば、DNAを含む)と特異的に作用する(例えば、消化する)が、所望のmRNAには作用しない(例えば、消化しない)酵素で処理することを含むプロセスを用いて精製される。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の組成物および方法において用いられるmRNAは、リボヌクレアーゼIII(RNaseIII)酵素(例えば、大腸菌RNaseIII)で処理することを含むプロセスを用いて精製され、次に、該mRNAは、RNaseIII消化産物とは別に精製される。本明細書のリボヌクレアーゼIII(RNaseIII)酵素は、約12塩基対よりも大きな二本鎖RNAを消化して、二本鎖RNA断片を支える酵素を意味する。いくつかの実施態様において、本発明の組成物および方法において用いられるmRNAは、該mRNAを、1つ以上の夾雑物RNAまたは夾雑物核酸(例えば、DNAを含む)を特異的に消化する1つ以上の他の酵素で処理することを含むプロセスを用いて精製される。
本発明は、プソイドウリジンもしくは修飾されたヌクレオシドを含むRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子療法ベクター、それらを含む遺伝子療法および遺伝子転写サイレンシング法、その免疫原性を低下させる方法、ならびにその合成方法を提供する。これらの修飾された配列は好ましくは、本明細書に説明される精製されたRNA調製物において存在する。
一実施態様において、本発明は、プソイドウリジン残基を含むメッセンジャーRNAを提供する。別の実施態様において、メッセンジャーRNAは、関心対象のタンパク質をコードする。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。別の実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質をコードするRNA分子を提供し、該RNA分子は、プソイドウリジン残基を含む。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンを含む、インビトロで転写されるRNA分子を提供する。別の実施態様において、本発明は、修飾されたヌクレオシドを含む、インビトロで転写されるRNA分子を提供する。
本明細書で提供されるように、本発明は、プソイドウリジンおよび/または修飾されたヌクレオシドを含む、インビトロで転写されるRNA分子を合成するための方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジン残基を含むメッセンジャーRNA分子を提供する。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のインビトロで転写されるRNA分子は、T7ファージRNAポリメラーゼによって合成される。別の実施態様において、該分子は、SP6ファージRNAポリメラーゼによって合成される。別の実施態様において、該分子は、T3ファージRNAポリメラーゼによって合成される。別の実施態様において、該分子は、先のポリメラーゼ類から選択されるポリメラーゼによって合成される。別の実施態様において、インビトロで転写されるRNA分子は、オリゴリボヌクレオチドである。別の実施態様において、インビトロで転写されるRNA分子は、ポリリボヌクレオチドである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む、インビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドを提供し、この中で、修飾されたヌクレオシドは、m5C、m5U、m6A、s2U、Ψ、または2’-O-メチル-Uである。別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む、インビトロで合成されたポリリボヌクレオチドを提供し、この中で、修飾されたヌクレオシドは、m5C、m5U、m6A、s2U、Ψ、または2’-O-メチル-Uである。
別の実施態様において、インビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドは、低分子ヘアピン型(sh)RNAである。別の実施態様において、インビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドは、低分子干渉RNA(siRNA)である。別の実施態様において、インビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の他の種類のオリゴリボヌクレオチドである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、機能的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施態様において、該RNA分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、RNzyme等のように、(例えば、転写サイレンシングにおいて)機能的タンパク質をコードすることなく機能する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、ポリ-A末端を含む。別の実施態様において、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、ポリ-A末端を含まない。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、m7GpppGキャップを含む。別の実施態様において、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、m7GpppGキャップを含まない。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、RNA、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含む。別の実施態様において、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子分子は、キャップ非依存性翻訳エンハンサーを含まない。別の実施態様において、キャップ非依存性翻訳エンハンサーは、タバコエッチ病ウイルス(TEV)のキャップ非依存性翻訳エンハンサーである。別の実施態様において、キャップ非依存性翻訳エンハンサーは、当該技術分野で公知の任意の他のキャップ非依存性翻訳エンハンサーである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、インビトロで合成されたポリリボヌクレオチド分子を含む遺伝子療法ベクターを提供し、この中で、ポリリボヌクレオチド分子は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、プソイドウリジンを含む。別の実施態様において、RNA分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、修飾済みのヌクレオシドを含む。別の実施態様において、RNA分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、インビトロで合成されたRNA分子またはオリゴリボヌクレオチドである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
「プソイドウリジン」は、別の実施態様において、m1acp3Ψ(1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイドウリジン)を指す。別の実施態様において、該用語は、m1Ψ(1-メチルプソイドウリジン)を指す。別の実施態様において、該用語は、Ψm(2’-O-メチルプソイドウリジン)を指す。別の実施態様において、該用語は、m5D(5-メチルジヒドロウリジン)を指す。別の実施態様において、該用語は、m3Ψ(3-メチルプソイドウリジン)を指す。別の実施態様において、該用語は、さらに修飾されていないプソイドウリジン部分を指す。別の実施態様において、該用語は、先のプソイドウリジンのいずれかの一リン酸、二リン酸、または三リン酸を指す。別の実施態様において、該用語は、当該技術分野で公知の任意の他のプソイドウリジンを指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、治療用オリゴリボヌクレオチドである。
別の実施態様において、本発明は、組換えタンパク質を対象に送達するための方法を提供し、該方法は、対象を、本発明のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、ポリリボヌクレオチド分子、または遺伝子療法ベクターと接触させ、それにより組換えタンパク質を対象に送達する工程を含む。
別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含み、かつsiRNAまたは低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をさらに含む、二本鎖RNA(dsRNA)分子を提供する。別の実施態様において、dsRNA分子は、長さ50ヌクレオチド超である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドは、siRNA配列内にある。別の実施態様において、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドは、siRNA配列の外側にある。別の実施態様において、1つ以上のプソイドウリジンおよび/または修飾されたヌクレオシド残基は、siRNA配列の内部および外側の両方に存在する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、siRNAまたはshRNAは、dsRNA分子において内部に含有される。別の実施態様において、siRNAまたはshRNAは、dsRNA分子の片方の末端に含有される。別の実施態様において、1つ以上のsiRNAまたはshRNAは、dsRNA分子の片方の末端に含有されるのに対し、別の1つ以上は、内部に含有される。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子(例えば、一本鎖RNA(ssRNA)分子またはdsRNA分子)の長さは、長さ30ヌクレオチド超である。別の実施態様において、RNA分子またはオリゴリボヌクレオチドは、長さ35ヌクレオチド超である。別の実施態様において、長さは、少なくとも40ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも45ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも55ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも60ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも60ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも80ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも90ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも100ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも120ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも140ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも160ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも180ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも200ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも250ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも300ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも350ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも400ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも450ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも500ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも600ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも700ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも800ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも900ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも1000ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも1100ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも1200ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも1300ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも1400ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも1500ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも1600ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも1800ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも2000ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも2500ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも3000ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも4000ヌクレオチドである。別の実施態様において、長さは、少なくとも5000ヌクレオチドである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のdsRNA分子は、インビトロでの転写によって製造される。別の実施態様において、インビトロでの転写の工程は、T7ファージRNAポリメラーゼを利用する。別の実施態様において、インビトロでの転写は、SP6ファージRNAポリメラーゼを利用する。別の実施態様において、インビトロでの転写は、先のポリメラーゼ類から選択されるRNAポリメラーゼを利用する。別の実施態様において、インビトロでの転写は、当該技術分野で公知の任意の他のRNAポリメラーゼを利用する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、dsRNA分子は、細胞酵素によって処理されて、siRNAまたはshRNAを生じることができる。別の実施態様において、細胞酵素は、エンドヌクレアーゼである。別の実施態様において、細胞酵素は、Dicerである。Dicerは、RNA干渉(RNAi)および、これらの遺伝子サイレンシング経路の特異性を決定する低分子RNAの生成による関連現象を開始する、RNaseIII-ファミリーヌクレアーゼである(Bernstein E, Caudy AA et al, Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001; 409(6818): 363-6)。別の実施態様において、細胞酵素は、dsRNA分子を開裂することのできる、当該技術分野で公知の任意の他の細胞酵素である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、dsRNA分子は、2のsiRNAまたはshRNAを含有する。別の実施態様において、dsRNA分子は、3のsiRNAまたはshRNAを含有する。別の実施態様において、dsRNA分子は、4つ以上のsiRNAまたはshRNAを含有する。別の実施態様において、siRNAおよび/またはshRNAは、細胞酵素によってdsRNA分子から遊離する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、本発明のdsRNA分子を投与することを含む、siRNAまたはshRNAを細胞に投与するための方法を提供し、この中で、細胞は、dsRNA分子を処理してsiRNAまたはshRNAを生じ、それによりsiRNAまたはshRNAを細胞に投与する。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子において修飾されるヌクレオシドは、ウリジン(U)である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、シチジン(C)である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、アデノシン(A)である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、グアノシン(G)である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物の修飾されたヌクレオシドは、m5C(5-メチルシチジン)である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、m5U(5-メチルウリジン)である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、m6A(N6-メチルアデノシン)である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、s2U(2-チオウリジン)である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、Ψ(プソイドウリジン)である。別の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、Um(2’-O-メチルウリジン)である。
他の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、mlA(l-メチルアデノシン)、m2A(2メチルアデノシン)、Am(2’-O-メチルアデノシン)、ms2mGA(2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン)、iGA(~イソペンテニルアデノシン)、mszi6A(2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン)、io6A(N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン)、ms2io6A(2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン)、g6A(N6-グリシニルカルバモイルアデノシン)、t6A(N6-トレオニルカルバモイルアデノシン)、ms2t6A(2-メチルチオ-N6-とレオニルカルバモイルアデノシン)、m6t6A(N6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン)、hn6A(N6ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン)、ms2hn6A(2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン)、Ar(p)(2’-O-リボシルアデノシン(リン酸))、I(イノシン)、m1I(l-メチルイノシン)、mlIm(l,2’-O-ジメチルイノシン)、m3C(3-メチルシチジン)、Cm(2’-O-メチルシチジン)、S2C(2チオシチジン)、ac4C(N4-アセチルシチジン)、f5C(5-ホルミルシチジン)、m5Cm(5,2’-O-ジメチルシチジン)、ac4Cm(N4-アセチル-2’-O-メチルシチジン)、k2C(リシジン)、m1G(l-メチルグアノシン)、m2G(N2-メチルグアノシン)、m7G(7-メチルグアノシン)、Gm(2’-O-メチルグアノシン)、m2
2G(N2,N2-ジメチルグアノシン)、m2Gm(N2,2’-O-ジメチルグアノシン)、m2
2Gm(N2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン)、Gr(p)(2’-O-リボシルグアノシン(リン酸))、yW(ワイブトシン)、o2yW(ペルオキシワイブトシン)、OHyW(ヒドロキシワイブトシン)、OHyW*(未修飾ヒドロキシワイブトシン)、imG(ワイオシン)、mimG(メチルワイオシン)、Q(ケウオシン)、oQ(エポキシケウオシン)、galQ(ガラクトシル-ケウオシン)、manQ(マンノシルケウオシン)、preQ0(7-シアノ-7-デアザグアノシン)、preQl(7-アミノメチル-7-デアザグアノシン)、G+(アルカエオシン(archaeosine))、D(ジヒドロウリジン)、m5Um(5,2’-O-ジメチルウリジン)、S4U(4-チオウリジン)、m5s2U(5-メチル-2-チオウリジン)、s2Um(2-チオ-2’-O-メチルウリジン)、acp3U(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン)、ho5U(5-ヒドロキシウリジン)、mo5U(5-メトキシウリジン)、cmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸)、mcmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル)、chm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン))、mchm5U(5(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル)、mcm5U(5-メトキシカルボニルメチルウリジン)、mcm5Um(5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチルウリジン)、mcm5s2U(5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン)、nm5s2U(5-アミノメチル-2-チオウリジン)、mnm5U(5-メチルアミノメチルウリジン)、mnm5s2U(5メチルアミノメチル-2-チオウリジン)、mnmse2U(5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン)、ncm5U(5-カルバモイルメチルウリジン)、ncm5Um(5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン)、cmnm5U(5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン)、cmnm5Um(5-カルボキシメチルアミノメチル-2’--メチルウリジン)、cmnm5s2U(5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン)、m6
2A(N6,N6-ジメチルアデノシン)、Im(2’-O-メチルイノシン)、m4C(N4-メチルシチジン)、m4Cm(N4,2’-O-ジメチルシチジン)、hm5C(5-ヒドロキシメチルシチジン)、m3U(3-メチルウリジン)、cm5U(5-カルボキシメチルウリジン)、m6Am(N6,2’-Oジメチルアデノシン)、m6
2Am(N6,N6,2’-O-トリメチルアデノシン)、m2,7G(N2,7-ジメチルグアノシン)、m2,2,7G(N2,N2,7-トリメチルグアノシン)、m3Um(3,2’-O-ジメチルウリジン)、m5D(5-メチルジヒドロウリジン)、f5Cm(5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン)、mlGm(l,2’-O-ジメチルグアノシン)、m1Am(1,2’-O-ジメチルアデノシン)、τm5U(5-タウリノメチルウリジン)、τm5s2U(5-タウリノメチル-2-チオウリジン)、imG-14(4-デメチルワイオシン)、imG2(イソワイオシン)、またはac6A(N6-アセチルアデノシン)である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、2つ以上の先の修飾の組み合わせを含む。別の実施態様において、RNA分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、先の修飾のうちの3つ以上の組み合わせを含む。別の実施態様において、RNA分子またはオリゴリボヌクレオチド分子は、先の修飾のうちの4つ以上の組み合わせを含む。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子における残基の0.1%~100%は修飾される(例えば、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシド塩基のいずれかの存在による)。別の実施態様において、残基の0.1%は修飾される。別の実施態様においては、0.2%である。別の実施態様において、分率は0.3%である。別の実施態様において、分率は0.4%である。別の実施態様において、分率は0.5%である。別の実施態様において、分率は0.6%である。別の実施態様において、分率は0.8%である。別の実施態様において、分率は1%である。別の実施態様において、分率は1.5%である。別の実施態様において、分率は2%である。別の実施態様において、分率は2.5%である。別の実施態様において、分率は3%である。別の実施態様において、分率は4%である。別の実施態様において、分率は5%である。別の実施態様において、分率は6%である。別の実施態様において、分率は8%である。別の実施態様において、分率は10%である。別の実施態様において、分率は12%である。別の実施態様において、分率は14%である。別の実施態様において、分率は16%である。別の実施態様において、分率は18%である。別の実施態様において、分率は20%である。別の実施態様において、分率は25%である。別の実施態様において、分率は30%である。別の実施態様において、分率は35%である。別の実施態様において、分率は40%である。別の実施態様において、分率は45%である。別の実施態様において、分率は50%である。別の実施態様において、分率は60%である。別の実施態様において、分率は70%である。別の実施態様において、分率は80%である。別の実施態様において、分率は90%である。別の実施態様において、分率は100%である。
別の実施態様において、分率は5%未満である。別の実施態様において、分率は3%未満である。別の実施態様において、分率は1%未満である。別の実施態様において、分率は2%未満である。別の実施態様において、分率は4%未満である。別の実施態様において、分率は6%未満である。別の実施態様において、分率は8%未満である。別の実施態様において、分率は10%未満である。別の実施態様において、分率は12%未満である。別の実施態様において、分率は15%未満である。別の実施態様において、分率は20%未満である。別の実施態様において、分率は30%未満である。別の実施態様において、分率は40%未満である。別の実施態様において、分率は50%未満である。別の実施態様において、分率は60%未満である。別の実施態様において、分率は70%未満である。
別の実施態様において、所与のヌクレオチドの残基(ウリジン、シチジン、グアノシン、またはアデニン)の0.1%は修飾される。別の実施態様において、ヌクレオチドの分率は0.2%である。別の実施態様において、分率は0.3%である。別の実施態様において、分率は0.4%である。別の実施態様において、分率は0.5%である。別の実施態様において、分率は0.6%である。別の実施態様において、分率は0.8%である。別の実施態様において、分率は1%である。別の実施態様において、分率は1.5%である。別の実施態様において、分率は2%である。別の実施態様において、分率は2.5%である。別の実施態様において、分率は3%である。別の実施態様において、分率は4%である。別の実施態様において、分率は5%である。別の実施態様において、分率は6%である。別の実施態様において、分率は8%である。別の実施態様において、分率は10%である。別の実施態様において、分率は12%である。別の実施態様において、分率は14%である。別の実施態様において、分率は16%である。別の実施態様において、分率は18%である。別の実施態様において、分率は20%である。別の実施態様において、分率は25%である。別の実施態様において、分率は30%である。別の実施態様において、分率は35%である。別の実施態様において、分率は40%である。別の実施態様において、分率は45%である。別の実施態様において、分率は50%である。別の実施態様において、分率は60%である。別の実施態様において、分率は70%である。別の実施態様において、分率は80%である。別の実施態様において、分率は90%である。別の実施態様において、分率は100%である。
別の実施態様において、所与のヌクレオチドの分率は、8%未満である。別の実施態様において、分率は10%未満である。別の実施態様において、分率は5%未満である。別の実施態様において、分率は3%未満である。別の実施態様において、分率は1%未満である。別の実施態様において、分率は2%未満である。別の実施態様において、分率は4%未満である。別の実施態様において、分率は6%未満である。別の実施態様において、分率は12%未満である。別の実施態様において、分率は15%未満である。別の実施態様において、分率は20%未満である。別の実施態様において、分率は30%未満である。別の実施態様において、分率は40%未満である。別の実施態様において、分率は50%未満である。別の実施態様において、分率は60%未満である。別の実施態様において、分率は70%未満である。
別の実施態様において、用語「リボヌクレオチド」、「オリゴリボヌクレオチド」、および「ポリリボヌクレオチド」は、少なくとも2の塩基‐糖‐リン酸のひと連なり組み合わせを指す。該用語には、別の実施態様において、糖部分がリボースであるヌクレオチドを含む化合物が含まれる。別の実施態様において、該用語には、骨格が修飾されたRNAおよびRNA誘導体の両方が含まれる。「ヌクレオチド」は、別の実施態様において、核酸ポリマーのモノマー単位を指す。RNAは、別の実施態様において、tRNA(転移RNA)、snRNA(低分子核RNA)、rRNA(リボソームRNA)、mRNA(伝令RNA)、アンチセンスRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、ミクロRNA(miRNA)、およびリボザイムの形態にあり得る。siRNAおよびmiRNAの使用は説明されている(Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491-96および該文献で引用される参考文献)。加えて、これらの形態のRNAは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であり得る。該用語には、別の実施態様において、他の種類の骨格だが同じ塩基を含有し得る人工核酸も含まれる。別の実施態様において、人工核酸は、PNA(ペプチド核酸)である。PNAは、ペプチド主鎖およびヌクレオチド塩基を含有し、別の実施態様において、DNA分子およびRNA分子の両方に結合することができる。別の実施態様において、該ヌクレオチドは、オキセタン修飾されている。別の実施態様において、該ヌクレオチドは、1つ以上のホスホジエステル結合のホスホロチオアート結合との置き換えによって修飾される。別の実施態様において、該人工核酸は、当該技術分野で公知の天然核酸のリン酸骨格の任意の他のバリアントを含有する。ホスホチオラート(phosphothiorate)核酸およびPNAは、当業者に公知であり、例えば、Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57~およびRaz NK et al Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84において説明される。核酸の製造および使用は、当業者に公知であり、例えば、Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds.およびMethods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareedにおいて説明される。各核酸誘導体は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」という用語は、25ヌクレオチド(nt)未満を含むひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、24ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、23ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、22ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、21ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、20ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、19ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、18ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、17ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。別の実施態様において、「オリゴリボヌクレオチド」は、16ヌクレオチド未満のひと連なりを指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、「ポリリボヌクレオチド」という用語は、25ヌクレオチド(nt)超を含むひと連なりを指す。別の実施態様において、「ポリリボヌクレオチド」は、26ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「ポリリボヌクレオチド」は、28ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、30ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、32ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、35ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、40ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、50ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、60ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、80ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、100ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、120ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、150ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、200ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、300ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、400ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、500ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、600ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、800ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、1000ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、1200ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、1400ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、1600ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、1800ヌクレオチド超のひと連なりを指す。別の実施態様において、「該用語」は、2000ヌクレオチド超のひと連なりを指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、哺乳類細胞を、組換えタンパク質をコードする、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより哺乳類細胞を誘導して関心対象のタンパク質を産生することを含む、哺乳類細胞を誘導して、関心対象のタンパク質を産生するための方法を提供する。別の実施態様において、関心対象のタンパク質は、組換えタンパク質である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
「コードすること」は、別の実施態様において、関心対象のタンパク質をコードするRNA分子を指す。別の実施態様において、該RNA分子は、関心対象のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施態様において、1つ以上の他のタンパク質もコードされる。別の実施態様において、関心対象のタンパク質は、コードされる唯一のタンパク質である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、哺乳類細胞を、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドをさらに含む、組換えタンパク質をコードするインビトロで転写されるRNA分子と接触させ、それにより哺乳類細胞を誘導して、組換えタンパク質を産生することを含む、哺乳類細胞を誘導して、組換えタンパク質を産生する方法を提供する。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、同じ配列を有する修飾されていないRNA分子よりも効率的に、細胞において翻訳される。別の実施態様において、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、標的細胞によって翻訳される高まった能力を呈する。別の実施態様において、翻訳は、その修飾されていない対応物に対して2倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、3倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、5倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、7倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、10倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、15倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、20倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、50倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、100倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、200倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、500倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、1000倍ほど高まる。別の実施態様において、翻訳は、2000倍ほど高まる。別の実施態様において、倍数は10~1000倍である。別の実施態様において、倍数は10~100倍である。別の実施態様において、倍数は10~200倍である。別の実施態様において、倍数は10~300倍である。別の実施態様において、倍数は10~500倍である。別の実施態様において、倍数は20~1000倍である。別の実施態様において、倍数は30~1000倍である。別の実施態様において、倍数は50~1000倍である。別の実施態様において、倍数は100~1000倍である。別の実施態様において、倍数は200~1000倍である。別の実施態様において、翻訳は、任意の他の有意な量または量の範囲ほど高まる。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
翻訳効率を決定する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、コードされたリポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼもしくはウミシイタケ[本明細書の実施例]または緑色蛍光タンパク質[Wall AA, Phillips AM et al, Effective translation of thesecond cistron in two Drosophila dicistronic transcripts is determined by the absence of in-frame AUG codons in the first cistron. J Biol Chem 2005;280(30): 27670-8])の活性を測定すること、または翻訳されたタンパク質に組み込まれた放射性
標識を測定すること(Ngosuwan J, Wang NM et al, Roles of cytosolic Hsp70 and Hsp40 molecular chaperones in post-translational translocation of presecretory proteins into the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 2003;278(9): 7034-42)を含む。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。
標識を測定すること(Ngosuwan J, Wang NM et al, Roles of cytosolic Hsp70 and Hsp40 molecular chaperones in post-translational translocation of presecretory proteins into the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 2003;278(9): 7034-42)を含む。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。
本明細書に提供されるいくつかの発現研究において、翻訳を、Lipofectin(登録商標)(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)と複合体形成したRNAから測定し、マウスの尾静脈に注射した。脾臓溶解産物において、プソイドウリジン修飾したRNAは、修飾されていないRNAよりも優位に効率的に翻訳された(図17のB)。本明細書で利用される条件下で、本発明の形質移入ベースの方法の効率は、形質移入試薬が組織に浸透する能力と相関しており、該効果が脾細胞においてなぜ最も顕著であったかについての説明を提供する。脾臓血流は開放系であり、血液含有量は、リンパ球系細胞を含む赤脾髄要素および白脾髄要素と直接接触する。
別の実験において、インビトロでのリン酸化アッセイを、組換えヒトPKRおよびその基質であるeIF2αを用いて、キャッピングされたウミシイタケをコードするmRNA(0.5および0.05ng/μL)の存在下で実施した。プソイドウリジン(Ψ)を含有するmRNAは、PKRの自己リン酸化およびeIF2αのリン酸化の両方の欠失によって検出されるように、PKRを活性化しなかったのに対し、ヌクレオシド修飾のないRNAおよびm5C修飾のあるmRNAは、PKRを活性化した。リン酸化型eIF2αは、mRNA翻訳の開始を遮断することが公知であり、それゆえ、リン酸化の欠失は、別の実施態様において、プソイドウリジン(Ψ)を含有するmRNAの高まった翻訳を可能にする。
別の実施態様において、高まった翻訳は、細胞においてである(同じ配列を有する修飾されていないRNAの同じ細胞における翻訳との比較、実施例13~14)。別の実施態様において、高まった翻訳は、インビトロである(例えば、インビトロでの翻訳混合物または網状赤血球溶解産物における、実施例13~14)。別の実施態様において、高まった翻訳はインビボである(実施例13)。各場合において、高まった翻訳は、同じ配列を有する同じ条件下にある修飾されていないRNAに相対的である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、同じ配列を有する修飾されていないインビトロで合成されたRNA分子よりも有意に免疫原性が低い。別の実施態様において、修飾されたRNA分子は、その修飾されていない対応物よりも免疫原性が2倍低い。別の実施態様において、免疫原性は3倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は5倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は7倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は10倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は15倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は20倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は50倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は100倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は200倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は 500倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は1000倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は2000倍ほど低い。別の実施態様において、免疫原性は別の倍数差ほど低い。
別の実施態様において、「有意により低い免疫原性」は、免疫原性における検出可能な低下を指す。別の実施態様において、該用語は、免疫原性における倍数低下を指す(例えば、先に列挙された倍数低下のうちの1つ)。別の実施態様において、該用語は、有効量のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子が、検出可能な免疫応答を惹起することなく投与されることができるような低下を指す。別の実施態様において、該用語は、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子が、組換えタンパク質の発現を検出可能に低下させるのに十分な免疫応答を誘発することなく反復して投与されることができるような低下を指す。別の実施態様において、該低下は、組換えタンパク質の検出可能な発現を除去するのに十分な免疫応答を誘発することなく反復して投与されることのできるようなものである。
「有効量」のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、別の実施態様において、治療効果を発揮するのに十分な量を指す。別の実施態様において、該用語は、検出可能な量の組換えタンパク質の発現を誘発するのに十分な量を指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
本発明のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子の低下した免疫原性は、本明細書に示されている(実施例4~11)。
免疫原性を決定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、サイトカイン(例えば、IL-12、IFN-α、TNF-α、RANTES、MIP-lαもしくはβ、IL-6、IFN-β、またはIL-8、本明細書の実施例)の分泌を測定すること、樹状細胞活性化マーカー(例えば、CD83、HLA-DR、CD80、およびCD86、本明細書の実施例)の発現を測定すること、または適応性免疫応答のためのアジュバントとして作用する能力を測定することを含む。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、修飾されたヌクレオチドおよびその修飾されていない対応物の相対的な免疫原性は、修飾されていないヌクレオチドの所与の量と同じ程度まで先の応答のうちの1つを誘発するのに必要な修飾されたヌクレオチドの量を決定することによって決定される。例えば、修飾されたヌクレオチドが、修飾されていないヌクレオチドよりも2倍低い免疫原性である場合、修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないヌクレオチドよりも2倍低い免疫原性である。
別の実施態様において、修飾されたヌクレオチドおよびその修飾されていない対応物の相対的な免疫原性は、修飾されていないヌクレオチドの同じ量に対する、修飾されたヌクレオチドの投与に応答して分泌されたサイトカイン(例えば、IL-12、IFN-α、TNF-α、 RANTES、MIP-lαもしくはβ、IL-6、IFN-β、またはIL-8)の量を決定することによって決定される。例えば、修飾されていないヌクレオチドと比べて、サイトカインの半分が分泌されると、修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないヌクレオチドの2倍低い免疫原性である。別の実施態様において、刺激の背景レベルが、先の方法における免疫原性を算出する前に減算される。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法はさらに、接触の工程の前に、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子を形質移入試薬と混合することを含む。別の実施態様において、本発明の方法はさらに、形質移入試薬とともにRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子を投与することを含む。別の実施態様において、形質移入試薬は、陽イオン性脂質試薬である(実施例6)。
別の実施態様において、形質移入試薬は、脂質ベースの形質移入試薬である。別の実施態様において、形質移入試薬は、タンパク質ベースの形質移入試薬である。別の実施態様において、形質移入試薬は、ポリエチレンイミンベースの形質移入試薬である。別の実施態様において、形質移入試薬は、リン酸カルシウムである。別の実施態様において、形質移入試薬は、Lipofectin(登録商標)またはLipofectamine(登録商標)である。別の実施態様において、形質移入試薬は、当該技術分野で公知の任意の他の形質移入試薬である。
別の実施態様において、形質移入試薬は、リポソームを形成する。リポソームは、別の実施態様において、細胞内安定性を増大させ、取り込み効率を増大させ、生物活性を改良する。別の実施態様において、リポソームは、細胞膜を形成する脂質と類似した様式で配置された脂質から構成される中空の球状小胞である。リポソームは、別の実施態様において、水溶性化合物を捕捉するための内部水性空間を有し、大きさは直径0.05~数ミクロンに及ぶ。別の実施態様において、リポソームは、生物活性のある形態でRNAを細胞に送達することができる。
各種類の形質移入試薬は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法の標的細胞は、抗原提示細胞である。別の実施態様において、該細胞は動物細胞である。別の実施態様において、該細胞は樹状細胞である(実施例14)。別の実施態様において、該細胞は神経細胞である。別の実施態様において、該細胞は脳細胞である(実施例16)。別の実施態様において、該細胞は脾細胞である。別の実施態様において、該細胞はリンパ球系細胞である。別の実施態様において、該細胞は、肺細胞である(実施例16)。別の実施態様において、該細胞は皮膚細胞である。別の実施態様において、該細胞はケラチノサイトである。別の実施態様において、該細胞は内皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は星状細胞、小膠細胞、またはニューロンである(実施例16)。別の実施態様において、該細胞は肺胞細胞である(実施例16)。別の実施態様において、該細胞は、表面肺胞細胞である(実施例16)。別の実施態様において、該細胞は肺胞マクロファージである。別の実施態様において、該細胞は肺胞肺細胞である。別の実施態様において、該細胞は脈管内皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は間葉系細胞である。別の実施態様において、該細胞は上皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は造血細胞である。別の実施態様において、該細胞は、コロニー上皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は、肺上皮細胞である。別の実施態様において、該細胞は骨髄細胞である。
他の実施態様において、標的細胞は、クラウディウス細胞、ヘンゼン細胞、メルケル細胞、ミューラー細胞、パネート細胞、プルキンエ細胞、シュワン細胞、セルトリ細胞、好酸細胞、腺房細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、褐色もしくは白色α細胞、無軸索細胞、β細胞、莢膜細胞、セメント細胞、主細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、クロム親和性細胞、色素嫌性細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、δ細胞、ランゲルハンス細胞、濾胞樹状細胞、腸管クロム親和性細胞、脳室上衣細胞、上皮細胞、基底細胞、鱗状細胞、内皮細胞、移行細胞、赤芽球、赤血球、線維芽細胞、線維細胞、濾胞細胞、生殖細胞、配偶子、卵子、精子、卵母細胞、第一卵母細胞、第二卵母細胞、不動精子、精母細胞、第一精母細胞、第二精母細胞、生殖上皮、巨細胞、神経膠細胞、星状芽細胞、星状細胞、乏突起神経膠芽細胞、希突起神経膠細胞、神経膠芽細胞、杯状細胞、性腺刺激ホルモン分泌細胞、顆粒膜細胞、血球芽細胞、有毛細胞、肝芽細胞、肝細胞、硝子体細胞、間質細胞、傍糸球体細胞、ケラチノサイト、角膜実質細胞、レンマ細胞(lemmal cell)、白血球、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、リンパ芽球、Bリンパ芽球、Tリンパ芽球、リンパ球、Bリンパ球、Tリンパ球、ヘルパー誘導型Tリンパ球(helper induced T-lymphocyte)、Th1 Tリンパ球、Th2 Tリンパ球、ナチュラルキラー細胞、胸腺細胞、マクロファージ、クッパー細胞、肺胞マクロファージ、泡沫細胞、組織球、ルテイン細胞、リンパ球性幹細胞、リンパ系細胞、免疫幹細胞、大グリア細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、マスト細胞、髄芽細胞、巨核芽球、巨核球、メラニン芽細胞、メラニン形成細胞、メサンギウム細胞、中皮細胞、後骨髄球、単芽球、単球、胃腺頚粘液細胞、筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨髄球、骨髄性細胞、骨髄幹細胞、筋芽細胞、筋上皮細胞、筋線維芽細胞、神経芽細胞、神経上皮細胞、ニューロン、象牙芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、酸分泌細胞、傍濾胞細胞、傍黄体細胞、消化細胞、周細胞、末梢血単核球、クロム親和性細胞、支持細胞、松果体細胞、後葉グリア細胞、形質細胞、血小板、被蓋細胞、前赤芽球、前単球、前骨髄芽球、前骨髄球、前正赤芽球、幹細胞、セルトリ細胞、終末グリア細胞、または酵素原細胞である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
とりわけ、単一遺伝子障害、感染性疾患、後天性疾患、癌、およびこれらに類するものを含む種々の障害が、本発明の方法を採用することによって治療され得る。例示的な単一遺伝子障害には、アデノシンデアミナーゼ欠損症、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、血友病、慢性肉芽腫症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ファンコニー貧血、鎌状赤血球貧血、ゴーシェ病、ハンター症候群、X染色体連鎖性重症複合免疫不全症、およびこれらに類するものが含まれる。別の実施態様において、治療される障害は、下記に列挙されるタンパク質のうちの1を包含する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明の方法および組成物のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子によってコードされる組換えタンパク質は、エクト-ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼである。
別の実施態様において、組換えタンパク質は、エリスロポエチン(EPO)である。他の実施態様において、コードされる組換えタンパク質は、ABCA4、ABCD3、ACADM、AGL、AGT、ALDH4AI、ALPL、AMPD1、APOA2、AVSD1、BRCD2、C1QA、C1QB、C1QG、C8A、C8B、CACNA1S、CCV、CD3Z、CDC2L1、CHML、CHS1、CIAS1、CLCNKB、CMD1A、CMH2、CMM、COL11A1、COL8A2、COL9A2、CPT2、CRB1、CSE、CSF3R、CTPA、CTSK、DBT、DIO1、DISC1、DPYD、EKV、ENO1、ENO1P、EPB41、EPHX1、F13B、F5、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCHL、FH、FMO3、FMO4、FUCA1、FY、GALE、GBA、GFND、GJA8、GJB3、GLC3B、HF1、HMGCL、HPC1、HRD、HRPT2、HSD3B2、HSPG2、KCNQ4、KCS、KIF1B、LAMB3、LAMC2、LGMD1B、LMNA、LOR、MCKD1、MCL1、MPZ、MTHFR、MTR、MUTYH、MYOC、NB、NCF2、NEM1、NPHS2、NPPA、NRAS、NTRK1、OPTA2、PBX1、PCHC、PGD、PHA2A、PHGDH、PKLR、PKP1、PLA2G2A、PLOD、PPOX、PPT1、PRCC、PRG4、PSEN2、PTOS1、REN、RFX5、RHD、RMD1、RPE65、SCCD、SERPINC1、SJS1、SLC19A2、SLC2A1、SPG23、SPTA1、TAL1、TNFSF6、TNNT2、TPM3、TSHB、UMPK、UOX、UROD、USH2A、VMGLOM、VWS、WS2B、ABCB11、ABCG5、ABCG8、ACADL、ACP1、AGXT、AHHR、ALMS1、ALPP、ALS2、APOB、BDE、BDMR、BJS、BMPR2、CHRNA1、CMCWTD、CNGA3、COL3A1、COL4A3、COL4A4、COL6A3、CPSI、CRYGA、CRYGEP1、CYP1B1、CYP27A1、DBI、DES、DYSF、EDAR、EFEMPI、EIF2AK3、ERCC3、FSHR、GINGF、GLC1B、GPD2、GYPC、HADHA、HADHB、HOXD13、HPE2、IGKC、IHH、IRSI、ITGA6、KHK、KYNU、LCT、LHCGR、LSFC、MSH2、MSH6、NEB、NMTC、NPHP1、PAFAH1P1、PAX3、PAX8、PMS1、PNKD、PPH1、PROC、REG1A、SAG、SFTPB、SLC11A1、SLC3A1、SOS1、SPG4、SRD5A2、TCL4、TGFA、TMD、TPO、UGT1A@、UV24、WSS、XDH、ZAP70、ZFHX1B、ACAA1、AGS1、AGTR1、AHSG、AMT、ARMET、BBS3、BCHE、BCPM、BTD、CASR、CCR2、CCR5、CDL1、CMT2B、COL7A1、CP、CPO、CRV、CTNNB1、DEM、ETM1、FANCD2、FIH、FOXL2、GBE1、GLB1、GLC1C、GNAI2、GNATI、GP9、GPX1、HGD、HRG、ITIH1、KNG、LPP、LRS1、MCCCI、MDS1、MHS4、MITF、MLH1、MYL3、MYMY、OPA1、P2RY12、PBXP1、PCCB、POU1F1、PPARG、PROS1、PTHR1、RCA1、RHO、SCA7、SCLC1、SCN5A、SI、SLC25A20、SLC2A2、TF、TGFBR2、THPO、THRB、TKT、TM4SF1、TRH、UMPS、UQCRC1、USH3A、VHL、WS2A、XPC、ZNF35、ADH1B、ADH1C、AFP、AGA、AIH2、ALB、ASMD、BFHD、CNGA1、CRBM、DCK、DSPP、DTDP2、ELONG、ENAM、ETFDH、EVC、F11、FABP2、FGA、FGB、FGFR3、FGG、FSHMD1A、GC、GNPTA、GNRHR、GYPA、HCA、HCL2、HD、HTN3、HVBS6、IDUA、IF、JPD、KIT、KLKB1、LQT4、MANBA、MLLT2、MSX1、MTP、NR3C2、PBT、PDE6B、PEE1、PITX2、PKD2、QDPR、SGCB、SLC25A4、SNCA、SOD3、STATH、TAPVR1、TYS、WBS2、WFS1、WHCR、ADAMTS2、ADRB2、AMCN、AP3BI、APC、ARSB、B4GALT7、BHR1、C6、C7、CCAL2、CKN1、CMDJ、CRHBP、CSF1R、DHFR、DIAPH1、DTR、EOS、EPD、ERVR、F12、FBN2、GDNF、GHR、GLRA1、GM2A、HEXB、HSD17B4、ITGA2、KFS、LGMD1A、LOX、LTC4S、MAN2A1、MCC、MCCC2、MSH3、MSX2、NR3C1、PCSK1、PDE6A、PFBI、RASAI、SCZDI、SDHA、SGCD、SLC22A5、SLC26A2、SLC6A3、SM1、SMA@、SMN1、SMN2、SPINK5、TCOF1、TELAB1、TGFBI、ALDH5A1、ARG1、AS、ASSP2、BCKDHB、BF、C2、C4A、CDKN1A、COL10A1、COL11A2、CYP21A2、DYX2、EJM1、ELOVL4、EPM2A、ESR1、EYA4、F13A1、FANCE、GCLC、GJA1、GLYS1、GMPR、GSE、HCR、HFE、HLA-A、HLA-DPBI、HLA-DRA、HPFH、ICS1、IDDM1、IFNGR1、IGAD1、IGF2R、ISCW、LAMA2、LAP、LCA5、LPA、MCDR1、MOCS1、MUT、MYB、NEU1、NKS1、NYS2、OA3、ODDD、OFC1、PARK2、PBCA、PBCRA1、PDB1、PEX3、PEX6、PEX7、PKHD1、PLA2G7、PLG、POLH、PPAC、PSORS1、PUJO、RCD1、RDS、RHAG、RP14、RUNX2、RWS、SCA1、SCZD3、SIASD、SOD2、ST8、TAPl、TAP2、TFAP2B、TNDM、TNF、TPBG、TPMT、TULP1、WISP3、AASS、ABCB1、ABCB4、ACHE、AQP1、ASL、ASNS、AUTS1、BPGM、BRAF、C7orf2、CACNA2D1、CCM1、CD36、CFTR、CHORDOMA、CLCN1、CMH6、CMT2D、COL1A2、CRS、CYMD、DFNA5、DLD、DYT11、EEC1、ELN、ETV1、FKBP6、GCK、GHRHR、GHS、GLI3、GPDS1、GUSB、HLXB9、HOXA13、HPFH2、HRX、IAB、IMMP2L、KCNH2、LAMB1、LEP、MET、NCF1、NM、OGDH、OPN1SW、PEX1、PGAM2、PMS2、PON1、PPP1R3A、PRSS1、PTC、PTPN12、RP10、RP9、SERPINE1、SGCE、SHFM1、SHH、SLC26A3、SLC26A4、SLOS、SMAD1、TBXAS1、TWIST、ZWS1、ACHM3、ADRB3、ANK1、CA1、CA2、CCAL1、CLN8、CMT4A、CNGB3、COH1、CPP、CRH、CYP11B1、CYP11B2、DECR1、DPYS、DURS1、EBS1、ECA1、EGI、EXT1、EYA1、FGFR1、GNRH1、GSR、GULOP、HR、KCNQ3、KFM、KWE、LGCR、LPL、MCPH1、MOS、MYC、NAT1、NAT2、NBS1、PLAT、PLEC1、PRKDC、PXMP3、RP1、SCZD6、SFIPC、SGM1、SPG5A、STAR、TG、TRPS1、TTPA、VMD1、WRN、ABCA1、ABL1、ABO、ADAMTS13、AK1、ALAD、ALDH1A1、ALDOB、AMBP、AMCD1、ASS、BDMF、BSCL、C5、CDKN2A、CHAC、CLA1、CMD1B、COL5A1、CRAT、DBH、DNAI1、DYS、DYT1、ENG、FANCC、FBP1、FCMD、FRDA、GALT、GLDC、GNE、GSM1、GSN、HSD17B3、HSN1、IBM2、INVS、JBTS1、LALL、LCCS1、LCCS、LGMD2H、LMX1B、MLLT3、MROS、MSSE、NOTCH1、ORM1、PAPPA、PIP5K1B、PTCH、PTGS1、RLN1、RLN2、RMRP、ROR2、RPD1、SARDH、SPTLC1、STOM、TDFA、TEK、TMC1、TRIM32、TSC1、TYRP1、XPA、CACNB2、COL17Al、CUBN、CXCL12、CYP17、CYP2C19、CYP2C9、EGR2、EMX2、ERCC6、FGFR2、HK1、HPS1、IL2RA、LGI1、LIPA、MAT1A、MBL2、MKI67、MXI1、NODAL、OAT、OATL3、PAX2、PCBD、PEO1、PHYH、PNLIP、PSAP、PTEN、RBP4、RDPA、RET、SFTPA1、SFTPD、SHFM3、SIAL、THC2、TLX1、TNFRSF6、UFS、UROS、AA、ABCC8、ACAT1、ALX4、AMPD3、ANC、APOA1、APOA4、APOC3、ATM、BSCL2、BWS、CALCA、CAT、CCND1、CD3E、CD3G、CD59、CDKN1C、CLN2、CNTF、CPT1A、CTSC、DDB1、DDB2、DHCR7、DLAT、DRD4、ECB2、ED4、EVR1、EXT2、F2、FSHB、FTH1、G6PT1、G6PT2、GIF、HBB、HBBP1、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、HMBS、HND、HOMG2、HRAS、HVBS1、IDDM2、IGER、INS、JBS、KCNJ11、KCNJ1、KCNQ1、LDHA、LRP5、MEN1、MLL、MYBPC3、MYO7A、NNO1、OPPG、OPTB1、PAX6、PC、PDX1、PGL2、PGR、PORC、PTH、PTS、PVRL1、PYGM、RAG1、RAG2、ROM1、RRAS2、SAA1、SCA5、SCZD2、SDHD、SERPING1、SMPD1、TCIRG1、TCL2、TECTA、TH、TREH、TSG101、TYR、USH1C、VMD2、VRNI、WT1、WT2、ZNFl45、A2M、AAAS、ACADS、ACLS、ACVRL1、ALDH2、AMHR2、AOM、AQP2、ATD、ATP2A2、BDC、C1R、CD4、CDK4、CNA1、COL2A1、CYP27B1、DRPLA、ENUR2、FEOM1、FGF23、FPF、GNB3、GNS、HAL、HBP1、HMGA2、HMN2、HPD、IGF1、KCNA1、KERA、KRAS2、KRT1、KRT2A、KRT3、KRT4、KRT5、KRT6A、KRT6B、KRTHB6、LDHB、LYZ、MGCT、MPE、MVK、MYL2、OAP、PAH、PPKB、PRB3、PTPN11、PXR1、RLS、RSN、SAS、SAX1、SCA2、SCNN1A、SMAL、SPPM、SPSMA、TBX3、TBX5、TCF1、TPI1、TSC3、ULR、VDR、VWF、ATP7B、BRCA2、BRCD1、CLN5、CPB2、ED2、EDNRB、ENUR1、ERCC5、F10、F7、GJB2、GJB6、IPF1、MBS1、MCOR、NYS4、PCCA、RB1、RHOK、SCZD7、SGCG、SLC10A2、SLC25A15、STARP1、ZNF198、ACHM1、ARVD1、BCH、CTAA1、DAD1、DFNB5、EML1、GALC、GCH1、IBGC1、IGH@、IGHCgroup、IGHG1、IGHM、IGHR、IV、LTBP2、MCOP、MJD、MNG1、MPD1、MPS3C、MYH6、MYH7、NP、
NPC2、PABPN1、PSEN1、PYGL、RPGRIP1、SERPINA1、SERPINA3、SERPINA6、SLC7A7、SPG3A、SPTB、TCL1A、TGMI、TITF1、TMIP、TRA@、TSHR、USH1A、VP、ACCPN、AHO2、ANCR、B2M、BBS4、BLM、CAPN3、CDAN1、CDAN3、CLN6、CMH3、CYP19、CYP1A1、CYP1A2、DYX1、EPB42、ETFA、EYCL3、FAH、FBN1、FES、HCVS、HEXA、IVD、LCS1、LIPC、MY05A、OCA2、OTSC1、PWCR、RLBP1、SLC12A1、SPG6、TPM1、UBE3A、WMS、ABCC6、ALDOA、APRT、ATP2A1、BBS2、CARD15、CATM、CDH1、CETP、CHST6、CLN3、CREBBP、CTH、CTM、CYBA、CYLD、DHS、DNASE1、DPEP1、ERCC4、FANCA、GALNS、GAN、HAGH、HBA1、HBA2、HBHR、HBQ1、HBZ、HBZP、HP、HSD11B2、IL4R、LIPB、MC1R、MEFV、MHC2TA、MLYCD、MMVP1、PHKB、PHKG2、PKD1、PKDTS、PMM2、PXE、SALL1、SCA4、SCNN1B、SCNN1G、SLC12A3、TAT、TSC2、VDI、WT3、ABR、ACACA、ACADVL、ACE、ALDH3A2、APOH、ASPA、AXIN2、BCL5、BHD、BLMH、BRCA1、CACD、CCA1、CCZS、CHRNB1、CHRNE、CMT1A、COL1A1、CORD5、CTNS、EPX、ERBB2、G6PC、GAA、GALK1、GCGR、GFAP、GH1、GH2、GP1BA、GPSC、GUCY2D、ITGA2B、ITGB3、ITGB4、KRT10、KRT12、KRT13、KRT14、KRT14L1、KRT14L2、KRT14L3、KRT16、KRT16L1、KRT16L2、KRT17、KRT9、MAPT、MDB、MDCR、MGI、MHS2、MKS1、MPO、MYO15A、NAGLU、NAPB、NF1、NME1、P4HB、PAFAH1B1、PECAM1、PEX12、PHB、PMP22、PRKAR1A、PRKCA、PRKWNK4、PRP8、PRPF8、PTLAH、RARA、RCV1、RMSA1、RP17、RSS、SCN4A、SERPINF2、SGCA、SGSH、SHBG、SLC2A4、SLC4A1、SLC6A4、SMCR、SOST、SOX9、SSTR2、SYM1、SYNSI、TCF2、THRA、TIMP2、TOC、TOP2A、TP53、TRIM37、VBCH、ATP8B1、BCL2、CNSN、CORD1I、CYB5、DCC、F5F8D、FECH、FEO、LAMA3、LCFS2、MADH4、MAFD1、MC2R、MCL、MYP2、NPC1、SPPK、TGFBRE、TGIF、TTR、AD2、AMH、APOC2、APOE、ATHS、BAX、BCKDHA、BCL3、BFIC、C3、CACNA1A、CCO、CEACAM5、COMP、CRX、DBA、DDU、DFNA4、DLL3、DM1、DMWD、E11S、ELA2、EPOR、ERCC2、ETFB、EXT3、EYCLI、FTL、FUT1、FUT2、FUT6、GAMT、GCDH、GPI、GUSM、HB1、HCL1、HHC2、HHC3、ICAM3、INSR、JAK3、KLK3、LDLR、LHB、LIG1、LOH19CR1、LYL1、MAN2B1、MCOLN1、MDRV、MLLT1、NOTCH3、NPHS1、OFC3、OPA3、PEPD、PRPF31、PRTN3、PRX、PSG1、PVR、RYR1、SLC5A5、SLC7A9、STK11、TBXA2R、TGFB1、TNNI3、TYROBP、ADA、AHCY、AVP、CDAN2、CDPD1、CHED1、CHED2、CHRNA4、CST3、EDN3、EEGV1、FTLL1、GDF5、GNAS、GSS、HNF4A、JAG1、KCNQ2、MKKS、NBIA1、PCK1、PI3、PPCD、PPGB、PRNP、THBD、TOP1、AIRE、APP、CBS、COL6Al、COL6A2、CSTB、DCR、DSCR1、FPDMM、HLCS、HPE1、ITGB2、KCNE1、KNO、PRSS7、RUNX1、SOD1、TAM、ADSL、ARSA、BCR、CECR、CHEK2、COMT、CRYBB2、CSF2RB、CTHM、CYP2D6、CYP2D7P1、DGCR、DIA1、EWSR1、GGT1、MGCR、MN1、NAGA、NE2、OGS2、PDGFB、PPARA、PRODH、SCO2、SCZD4、SERPIND1、SLC5AI、SOXI0、TCN2、TIMP3、TST、VCF、ABCD1、ACTL1、ADFN、AGMX2、AHDS、AIC、AIED、AIH3、ALAS2、AMCD、AMELX、ANOP1、AR、ARAF1、ARSC2、ARSE、ARTS、ARX、ASAT、ASSP5、ATP7A、ATRX、AVPR2、BFLS、BGN、BTK、BZX、C1HR、CACNA1F、CALB3、CBBM、CCT、CDR1、CFNS、CGF1、CHM、CHR39C、CIDX、CLA2、CLCN5、CLS、CMTX2、CMTX3、CND、COD1、COD2、COL4A5、COL4A6、CPX、CVD1、CYBB、DCX、DFN2、DFN4、DFN6、DHOF、DIAPH2、DKC1、DMD、DSS、DYT3、EBM、EBP、ED1、ELK1、EMD、EVR2、F8、F9、FCP1、FDPSL5、FGD1、FGS1、FMR1、FMR2、G6PD、GABRA3、GATA1、GDI1、GDXY、GJB1、GK、GLA、GPC3、GRPR、GTD、GUST、HMS1、HPRT1、HPT、HTC2、HTR2C、HYR、IDS、IHG1、IL2RG、INDX、IP1、IP2、JMS、KAL1、KFSD、LICAM、LAMP2、MAA、MAFD2、MAOA、MAOB、MCF2、MCS、MEAX、MECP2、MF4、MGCI、MIC5、MID1、MLLT7、MLS、MRSD、MRX14、MRX1、MRX20、MRX2、MRX3、MRX40、MRXA、MSD、MTMI、MYCL2、MYPI、NDP、NHS、NPHLI、NROBI、NSX、NYSI、NYX、OAI、OASD、OCRL、ODTI、OFD1、OPA2、OPD1、OPEM、OPN1LW、OPN1MW、OTC、P3、PDHA1、PDR、PFC、PFKFB1、PGK1、PGK1P1、PGS、PHEX、PHKA1、PHKA2、PHP、PIGA、PLP1、POF1、POLA、POU3F4、PPMX、PRD、PRPSI、PRPS2、PRS、RCCP2、RENBP、RENS1、RP2、RP6、RPGR、RPS4X、RPS6KA3、RS1、S11、SDYS、SEDL、SERPINA7、SH2D1A、SHFM2、SLC25A5、SMAX2、SRPX、SRS、STS、SYN1、SYP、TAF1、TAZ、TBX22、TDD、TFE3、THAS、THC、TIMM8A、TIMP1、TKCR、TNFSF5、UBE1、UBE2A、WAS、WSN、WTS、WWS、XIC、XIST、XK、XM、XS、ZFX、ZIC3、ZNF261、ZNF41、ZNF6、AMELY、ASSP6、AZFI、AZF2、DAZ、GCY、RPS4Y、SMCY、SRY、ZFY、ABAT、AEZ、AFA、AFD1、ASAH1、ASD1、ASMT、CCAT、CECR9、CEPA、CLA3、CLN4、CSF2RA、CTSI、DF、DIH1、DWS、DYT2、DYT4、EBR3、ECT、EEF1A1L14、EYCL2、FANCB、GCSH、GCSL、GIP、GTS、HHG、HMI、HOAC、HOKPP2、HRPT1、HSD3B3、HTC1、HV1S、ICHQ、ICR1、ICR5、IL3RA、KAL2、KMS、KRT18、KSS、LCAT、LHON、LIMM、MANBB、MCPH2、MEB、MELAS、MIC2、MPFD、MS、MSS、MTATP6、MTCOI、MTCO3、MTCYB、MTND1、MTND2、MTND4、MTND5、MTND6、MTRNR1、MTRNR2、MTTE、MTTG、MTTI、MTTK、MTTL1、MTTL2、MTTN、MTTP、MTTS1、NAMSD、OCD1、OPD2、PCK2、PCLD、PCOS1、PFKM、PKD3、PRCA1、PRO1、PROP1、RBS、RFXAP、RP、SHOX、SLC25A6、SPG5B、STO、SUOX、THM、またはTTDである。各組換えタンパク質は、本発明の個別の実施態様を表す。
NPC2、PABPN1、PSEN1、PYGL、RPGRIP1、SERPINA1、SERPINA3、SERPINA6、SLC7A7、SPG3A、SPTB、TCL1A、TGMI、TITF1、TMIP、TRA@、TSHR、USH1A、VP、ACCPN、AHO2、ANCR、B2M、BBS4、BLM、CAPN3、CDAN1、CDAN3、CLN6、CMH3、CYP19、CYP1A1、CYP1A2、DYX1、EPB42、ETFA、EYCL3、FAH、FBN1、FES、HCVS、HEXA、IVD、LCS1、LIPC、MY05A、OCA2、OTSC1、PWCR、RLBP1、SLC12A1、SPG6、TPM1、UBE3A、WMS、ABCC6、ALDOA、APRT、ATP2A1、BBS2、CARD15、CATM、CDH1、CETP、CHST6、CLN3、CREBBP、CTH、CTM、CYBA、CYLD、DHS、DNASE1、DPEP1、ERCC4、FANCA、GALNS、GAN、HAGH、HBA1、HBA2、HBHR、HBQ1、HBZ、HBZP、HP、HSD11B2、IL4R、LIPB、MC1R、MEFV、MHC2TA、MLYCD、MMVP1、PHKB、PHKG2、PKD1、PKDTS、PMM2、PXE、SALL1、SCA4、SCNN1B、SCNN1G、SLC12A3、TAT、TSC2、VDI、WT3、ABR、ACACA、ACADVL、ACE、ALDH3A2、APOH、ASPA、AXIN2、BCL5、BHD、BLMH、BRCA1、CACD、CCA1、CCZS、CHRNB1、CHRNE、CMT1A、COL1A1、CORD5、CTNS、EPX、ERBB2、G6PC、GAA、GALK1、GCGR、GFAP、GH1、GH2、GP1BA、GPSC、GUCY2D、ITGA2B、ITGB3、ITGB4、KRT10、KRT12、KRT13、KRT14、KRT14L1、KRT14L2、KRT14L3、KRT16、KRT16L1、KRT16L2、KRT17、KRT9、MAPT、MDB、MDCR、MGI、MHS2、MKS1、MPO、MYO15A、NAGLU、NAPB、NF1、NME1、P4HB、PAFAH1B1、PECAM1、PEX12、PHB、PMP22、PRKAR1A、PRKCA、PRKWNK4、PRP8、PRPF8、PTLAH、RARA、RCV1、RMSA1、RP17、RSS、SCN4A、SERPINF2、SGCA、SGSH、SHBG、SLC2A4、SLC4A1、SLC6A4、SMCR、SOST、SOX9、SSTR2、SYM1、SYNSI、TCF2、THRA、TIMP2、TOC、TOP2A、TP53、TRIM37、VBCH、ATP8B1、BCL2、CNSN、CORD1I、CYB5、DCC、F5F8D、FECH、FEO、LAMA3、LCFS2、MADH4、MAFD1、MC2R、MCL、MYP2、NPC1、SPPK、TGFBRE、TGIF、TTR、AD2、AMH、APOC2、APOE、ATHS、BAX、BCKDHA、BCL3、BFIC、C3、CACNA1A、CCO、CEACAM5、COMP、CRX、DBA、DDU、DFNA4、DLL3、DM1、DMWD、E11S、ELA2、EPOR、ERCC2、ETFB、EXT3、EYCLI、FTL、FUT1、FUT2、FUT6、GAMT、GCDH、GPI、GUSM、HB1、HCL1、HHC2、HHC3、ICAM3、INSR、JAK3、KLK3、LDLR、LHB、LIG1、LOH19CR1、LYL1、MAN2B1、MCOLN1、MDRV、MLLT1、NOTCH3、NPHS1、OFC3、OPA3、PEPD、PRPF31、PRTN3、PRX、PSG1、PVR、RYR1、SLC5A5、SLC7A9、STK11、TBXA2R、TGFB1、TNNI3、TYROBP、ADA、AHCY、AVP、CDAN2、CDPD1、CHED1、CHED2、CHRNA4、CST3、EDN3、EEGV1、FTLL1、GDF5、GNAS、GSS、HNF4A、JAG1、KCNQ2、MKKS、NBIA1、PCK1、PI3、PPCD、PPGB、PRNP、THBD、TOP1、AIRE、APP、CBS、COL6Al、COL6A2、CSTB、DCR、DSCR1、FPDMM、HLCS、HPE1、ITGB2、KCNE1、KNO、PRSS7、RUNX1、SOD1、TAM、ADSL、ARSA、BCR、CECR、CHEK2、COMT、CRYBB2、CSF2RB、CTHM、CYP2D6、CYP2D7P1、DGCR、DIA1、EWSR1、GGT1、MGCR、MN1、NAGA、NE2、OGS2、PDGFB、PPARA、PRODH、SCO2、SCZD4、SERPIND1、SLC5AI、SOXI0、TCN2、TIMP3、TST、VCF、ABCD1、ACTL1、ADFN、AGMX2、AHDS、AIC、AIED、AIH3、ALAS2、AMCD、AMELX、ANOP1、AR、ARAF1、ARSC2、ARSE、ARTS、ARX、ASAT、ASSP5、ATP7A、ATRX、AVPR2、BFLS、BGN、BTK、BZX、C1HR、CACNA1F、CALB3、CBBM、CCT、CDR1、CFNS、CGF1、CHM、CHR39C、CIDX、CLA2、CLCN5、CLS、CMTX2、CMTX3、CND、COD1、COD2、COL4A5、COL4A6、CPX、CVD1、CYBB、DCX、DFN2、DFN4、DFN6、DHOF、DIAPH2、DKC1、DMD、DSS、DYT3、EBM、EBP、ED1、ELK1、EMD、EVR2、F8、F9、FCP1、FDPSL5、FGD1、FGS1、FMR1、FMR2、G6PD、GABRA3、GATA1、GDI1、GDXY、GJB1、GK、GLA、GPC3、GRPR、GTD、GUST、HMS1、HPRT1、HPT、HTC2、HTR2C、HYR、IDS、IHG1、IL2RG、INDX、IP1、IP2、JMS、KAL1、KFSD、LICAM、LAMP2、MAA、MAFD2、MAOA、MAOB、MCF2、MCS、MEAX、MECP2、MF4、MGCI、MIC5、MID1、MLLT7、MLS、MRSD、MRX14、MRX1、MRX20、MRX2、MRX3、MRX40、MRXA、MSD、MTMI、MYCL2、MYPI、NDP、NHS、NPHLI、NROBI、NSX、NYSI、NYX、OAI、OASD、OCRL、ODTI、OFD1、OPA2、OPD1、OPEM、OPN1LW、OPN1MW、OTC、P3、PDHA1、PDR、PFC、PFKFB1、PGK1、PGK1P1、PGS、PHEX、PHKA1、PHKA2、PHP、PIGA、PLP1、POF1、POLA、POU3F4、PPMX、PRD、PRPSI、PRPS2、PRS、RCCP2、RENBP、RENS1、RP2、RP6、RPGR、RPS4X、RPS6KA3、RS1、S11、SDYS、SEDL、SERPINA7、SH2D1A、SHFM2、SLC25A5、SMAX2、SRPX、SRS、STS、SYN1、SYP、TAF1、TAZ、TBX22、TDD、TFE3、THAS、THC、TIMM8A、TIMP1、TKCR、TNFSF5、UBE1、UBE2A、WAS、WSN、WTS、WWS、XIC、XIST、XK、XM、XS、ZFX、ZIC3、ZNF261、ZNF41、ZNF6、AMELY、ASSP6、AZFI、AZF2、DAZ、GCY、RPS4Y、SMCY、SRY、ZFY、ABAT、AEZ、AFA、AFD1、ASAH1、ASD1、ASMT、CCAT、CECR9、CEPA、CLA3、CLN4、CSF2RA、CTSI、DF、DIH1、DWS、DYT2、DYT4、EBR3、ECT、EEF1A1L14、EYCL2、FANCB、GCSH、GCSL、GIP、GTS、HHG、HMI、HOAC、HOKPP2、HRPT1、HSD3B3、HTC1、HV1S、ICHQ、ICR1、ICR5、IL3RA、KAL2、KMS、KRT18、KSS、LCAT、LHON、LIMM、MANBB、MCPH2、MEB、MELAS、MIC2、MPFD、MS、MSS、MTATP6、MTCOI、MTCO3、MTCYB、MTND1、MTND2、MTND4、MTND5、MTND6、MTRNR1、MTRNR2、MTTE、MTTG、MTTI、MTTK、MTTL1、MTTL2、MTTN、MTTP、MTTS1、NAMSD、OCD1、OPD2、PCK2、PCLD、PCOS1、PFKM、PKD3、PRCA1、PRO1、PROP1、RBS、RFXAP、RP、SHOX、SLC25A6、SPG5B、STO、SUOX、THM、またはTTDである。各組換えタンパク質は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、エリスロポエチンをコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより対象における貧血を治療することを含む、対象における貧血を治療するための方法を提供する。別の実施態様において、インビトロで合成されたRNA分子はさらに、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。別の実施態様において、細胞は、皮下組織細胞である。別の実施態様において、細胞は肺細胞である。別の実施態様において、細胞は線維芽細胞である。別の実施態様において、細胞はリンパ球系細胞である。別の実施態様において、細胞は平滑筋細胞である。別の実施態様において、細胞は、当該技術分野で公知の任意の他の種類の細胞である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)をコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより対象における血管攣縮を治療することを含む、対象における血管攣縮を治療するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象における細胞を、熱ショックタンパク質をコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより対象における細胞の生存率を改良することを含む、該細胞の生存率を改良するための方法を提供する。
別の実施態様において、生存率の改良された細胞は、虚血性細胞である。別の実施態様において、該細胞は、虚血性ではない。別の実施態様において、該細胞は、虚血性環境に曝露されている。別の実施態様において、該細胞は、環境ストレスに曝露されている。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、血管の細胞を、熱ショックタンパク質をコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより、対象における再狭窄の発生率を低下させることを含む、血管を拡大させる手順後に血管の再狭窄の発生率を低下させるための方法を提供する。
別の実施態様において、前記手順は、血管形成術である。別の実施態様において、前記手順は、血管を拡大させる当該技術分野で公知の任意の他の手順である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、対象の頭皮の細胞を、テロメラーゼまたは免疫抑制性タンパク質をコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより、毛包からの養毛を増加させることを含む、該頭皮における毛包からの発毛を増加させるための方法を提供する。
別の実施態様において、免疫抑制性タンパク質は、α-メラニン形成細胞刺激ホルモン(α-MSH)である。別の実施態様において、免疫抑制性タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)である。別の実施態様において、免疫抑制性タンパク質は、インスリン様増殖因子-I(IGF-I)である。別の実施態様において、免疫抑制性タンパク質は、当該技術分野で公知の任意の他の免疫抑制性タンパク質である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、細胞を、抗酸化活性を有する酵素をコード鵜sるインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより細胞における抗酸化活性を有する酵素の発現を誘導することを含む、細胞における抗酸化活性を有する酵素の発現を誘導する方法を提供する。
一実施態様において、該酵素はカタラーゼである。別の実施態様において、該酵素はグルタチオンペルオキシダーゼである。別の実施態様において、該酵素は、リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼである。別の実施態様において、該酵素は、スーパーオキシドジスムターゼ-1である。別の実施態様において、該酵素は、スーパーオキシドジスムターゼ-2である。別の実施態様において、該酵素は、当該技術分野で公知の抗酸化活性を有する任意の他の酵素である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)をコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより、対象における嚢胞性線維症を治療することを含む、対象における嚢胞性線維症を治療するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、ブルトン型チロシンキナーゼをコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより、X連鎖無ガンマグロブリン血症を治療することを含む、対象におけるX連鎖無ガンマグロブリン血症を治療するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、アデノシンデアミナーゼをコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それによりアデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全(ADA SCID)を治療することを含む、対象におけるADA SCIDを治療するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、対象の細胞を、エクト-ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼをコードするインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより皮膚の免疫応答性を低下させ、および皮膚の病態を改良することを含む、皮膚の免疫応答性を低下させ、および皮膚の病態を改良するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明のRNA分子またはリボヌクレオチド分子は、ナノ粒子に封入される。ナノ粒子封入のための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、BoseS, et al (Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type 3 Infection of Human Lung Epithelial Cells. J. Virol. 78:8146. 2004)、Dong Y et al. Poly(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials 26:6068. 2005)、Lobenberg R. et al (Improved body distribution of 14C-labelled AZT bound to nanoparticles in rats determined by radioluminography. J Drug Target 5:171. 1998)、Sakuma SR et al (Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilic polymeric chains in the gastrointestinal tract. Int J Pharm 177:161. 1999)、Virovic L et al. Novel delivery methodsfor treatment of viral hepatitis: an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005)、およびZimmermann E et al., Electrolyte-and pH-stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle (SLN) dispersions in artificial gastrointestinal media. Eur J Pharm Biopharm 52:203.2001)において説明される。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。
本発明の化合物の薬用量範囲の種々の実施態様を、本発明の方法において用いることができる。一実施態様において、該薬用量は、1~10μg/日の範囲にある。別の実施態様において、該薬用量は、2~10μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、3~10μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、5~10μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、2~20μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、3~20μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、5~20μg/日である。別の実施態様において、薬用量は、10~20μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、3~40μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、5~40μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、10~40μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、20~40μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、5~50μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、10~50μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、20~50μg/日である。一実施態様において、該薬用量は、1~100μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、2~100μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、3~100μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、5~100μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、10~100μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、20~100μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、40~100μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、60~100μg/日である。
別の実施態様において、該薬用量は、0.1μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、0.2μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、0.3μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、0.5μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、1μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、2 mg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、3μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、5μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、10μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、15μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、20μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、30μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、40μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、60μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、80μg/日である。別の実施態様において、該薬用量は、100μg/日である。
別の実施態様において、該薬用量は、10μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、20μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、30μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、40μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、60μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、80μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、100μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、150μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、200μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、300μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、400μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、600μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、800μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、1000μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、1.5mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、3mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、5mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、10mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、15mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、20mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、30mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、50mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、80mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、100mg/用量である。
別の実施態様において、該薬用量は、10~20μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、20~30μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、20~40μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、30~60μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、40~80μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、50~100μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、50~150μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、100~200μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、200~300μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、300~400μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、400~600μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、500~800μg//用量である。別の実施態様において、該薬用量は、800~1000μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、1000~1500μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、1500~2000μg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2~3mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2~5mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2~10mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2~20mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2~30mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2~50mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2~80mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、2~100mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、3~10mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、3~20mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、3~30mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、3~50mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、3~80mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、3~100mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、5~10mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、5~20mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、5~30mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、5~50mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、5~80mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、5~100mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、10~20mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、10~30mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、10~50mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、10~80mg/用量である。別の実施態様において、該薬用量は、10~100mg/用量である。
別の実施態様において、該薬用量は、日用量である。別の実施態様において、該薬用量は、週用量である。別の実施態様において、該薬用量は、月用量である。別の実施態様において、該薬用量は、年用量である。別の実施態様において、該用量は、一連の規定された数の用量における1である。別の実施態様において、該用量は、単回用量である。下記に説明されるように、別の実施態様において、本発明のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子の利点は、より少量の用量の使用を可能にする、該分子のより大きな効能である。
別の実施態様において、本発明は、インビトロでの翻訳用具をプソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで合成されたRNA分子と接触させ、それにより組換えタンパク質を産生することを含む、組換えタンパク質を産生するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、インビトロでの翻訳用具を、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで転写されるRNA分子と接触させ、それにより組換えタンパク質を産生することを含む、組換えタンパク質を産生するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、修飾されていないヌクレオチド、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含有するヌクレオチド、およびポリメラーゼを含むインビトロでの転写用具を提供する。別の実施態様において、本発明は、修飾されていないヌクレオチド、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含有するヌクレオチド、およびポリメラーゼを含むインビトロでの転写キットを提供する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、インビトロでの翻訳用具は、網状赤血球の溶解産物を含む。別の実施態様において、網状赤血球の溶解産物は、ウサギ網状赤血球溶解産物である。
別の実施態様において、本発明は、オリゴリボヌクレオチド分子またはRNA分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、オリゴリボヌクレオチド分子またはRNA分子の免疫原性を低下させることを含む、オリゴリボヌクレオチド分子またはRNA分子の免疫原性を低下させる方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、ポリリボヌクレオチド分子またはRNA分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、遺伝子療法ベクターの免疫原性を低下させる工程を含む、ポリリボヌクレオチド分子またはRNA分子を含む遺伝子療法ベクターの免疫原性を低下させる方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、ポリリボヌクレオチド分子またはRNA分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、遺伝子療法ベクターからのインビボでの翻訳を亢進する工程を含む、ポリリボヌクレオチド分子またはRNA分子を含む遺伝子療法ベクターからのインビボでの翻訳を亢進する方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、ポリリボヌクレオチド分子またはRNA分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、遺伝子療法ベクターによる組換えタンパク質の送達の効率性を高める工程を含む、ポリリボヌクレオチド分子またはRNA分子を含む遺伝子療法ベクターによる組換えタンパク質の送達の効率性を高める方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、ポリリボヌクレオチド分子またはRNA分子のヌクレオチドを、修飾されたヌクレオシドまたはプソイドウリジンを含有する修飾されたヌクレオチドと置き換え、それにより、遺伝子療法ベクターのインビボでの安定性を高める工程を含む、遺伝子療法ベクターのインビボでの安定性を高める方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、単離されたポリメラーゼを、修飾されていないヌクレオチドと修飾されたヌクレオチドとの混合物と接触させることを含む、プソイドウリジンヌクレオシドを含むインビトロで転写されるRNA分子を合成する方法を提供する(実施例5および10)。
別の実施態様において、本発明のインビトロでの転写方法は、動物細胞からの抽出物を利用する。別の実施態様において、該抽出物は、網状赤血球またはインビトロでの転写の類似の効率性を有する細胞に由来する。別の実施態様において、該抽出物は、当該技術分野で公知の任意の他の種類の細胞に由来する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
本発明のRNA分子またはオリゴリボヌクレオチド分子のうちのいずれも、別の実施態様において、本発明の方法のうちのいずれにおいても用いられ得る。
別の実施態様において、本発明は、抗原をミトコンドリア(mt)RNAとの組み合わせで投与することを含む、抗原に対する免疫応答を亢進する方法を提供する(実施例4および8)。
別の実施態様において、本発明は、本発明の方法によってRNA分子のヌクレオシドを修飾することを含む、樹状細胞(DC)を刺激するRNA分子の能力を低下させる方法を提供する(例えば、実施例参照)。
別の実施態様において、該DCは、DC1細胞である。別の実施態様において、該DCは、DC2細胞である。別の実施態様において、該DCは、DC1細胞またはDC2細胞のサブタイプである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明hあ、本発明の方法によってRNA分子のヌクレオシドを修飾することを含む、TLR3によるシグナル伝達を刺激するRNA分子の能力を低下させる方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、本発明の方法によるRNA分子のヌクレオシドを修飾することを含む、TLR7によるシグナル伝達を刺激するRNA分子の能力を低下させる方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、本発明の方法によるRNA分子のヌクレオシドを修飾することを含む、TLR8によるシグナル伝達を刺激するRNA分子の能力を低下させる方法を提供する。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子におけるヌクレオシド間結合またはヌクレオチド間結合のすべては、ホスホジエステルである。別の実施態様において、ヌクレオチド間結合は、主としてホスホジエステルである。別の実施態様において、ヌクレオチド間結合のほとんどは、ホスホロチオアートである。別の実施態様において、ヌクレオチド間結合のほとんどは、ホスホジエステルである。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、ホスホジエステルである、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子におけるヌクレオチド間結合の割合は、50%超である。別の実施態様において、該割合は10%超である。別の実施態様において、該割合は15%超である。別の実施態様において、該割合は20%超である。別の実施態様において、該割合は25%超である。別の実施態様において、該割合は30%超である。別の実施態様において、該割合は35%超である。別の実施態様において、該割合は40%超である。別の実施態様において、該割合は45%超である。別の実施態様において、該割合は55%超である。別の実施態様において、該割合は60%超である。別の実施態様において、該割合は65%超である。別の実施態様において、該割合は70%超である。別の実施態様において、該割合は75%超である。別の実施態様において、該割合は80%超である。別の実施態様において、該割合は85%超である。別の実施態様において、該割合は90%超である。別の実施態様において、該割合は95%超である。
別の実施態様において、本発明の方法は、RNA分子における修飾されたヌクレオシドの数、割合、または頻度を高めて、免疫原性を低下させまたは翻訳の効率を高めることを含む。本明細書で提供される場合(例えば、実施例参照)、RNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子における修飾された残基の数は、別の実施態様において、本発明において観察される効果の程度を決定する。
別の実施態様において、本発明は、対象を、組換えタンパク質をコードする、プソイドウリジンまたは別の修飾されたヌクレオシドをさらに含むインビトロで転写されるRNA分子と接触させ、それにより、該対象の細胞に該組換えタンパク質を導入することを含む、該対象の細胞に該組換えタンパク質を導入するための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシド塩基を含有するよう遺伝子療法ベクターを操作し、それにより、対象における遺伝子療法ベクターに応答してTNF-α産生を低下させる工程を含む、対象における該ベクターに応答してTNF-α産生を低下させるための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシド塩基を含有するよう遺伝子療法ベクターを操作し、それにより対象における遺伝子療法ベクターに応答してIL-12産生を低下させる工程を含む、対象における該ベクターに応答してIL-12産生を低下させるための方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、修飾されたヌクレオシドを遺伝子療法ベクターに導入し、それにより遺伝子療法ベクターの免疫原性を低下させることを含む、該遺伝子療法ベクターの免疫原性を低下させる方法を提供する。
本明細書で提供される場合、本発明の発見は、初代DCが、m5C修飾されたおよびm6A修飾されたRNAを認識する追加的なRNAシグナル伝達実体を有し、そのシグナル伝達が、U残基の修飾によって阻害されることを示す。
別の実施態様において、本発明のRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子の利点は、(DNAベースのベクターとは反対に)RNAが、ゲノムに組み込まないことである。別の実施態様において、利点は、RNA翻訳、それゆえコードされた産物の出現が瞬時であることである。別の実施態様において、利点は、mRNAから生じたタンパク質の量が、多かれ少なかれRNAを送達することによって調節されることができることである。別の実施態様において、利点は、精製されたプソイドウリジンまたは他の修飾されたRNA分子、オリゴリボヌクレオチド分子、もしくはポリリボヌクレオチド分子の反復された送達が、免疫応答を誘導しないのに対し、修飾されていないRNAの反復された送達が、RNAセンサーを通じてシグナル伝達経路を誘導し得ることである。
別の実施態様において、利点は、炎症性サイトカインの発生のない反復した送達を可能にする、免疫原性の欠失である。別の実施態様において、RNAの安定性は、エキソヌクレアーゼによる分解を低下させる環化によって高まる。
別の実施態様において、本発明は、自己RNA分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象に、TLR-3分子のアンタゴニストを投与し、それにより、自己RNA分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象を治療することを含む、該対象を治療する方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、自己RNA分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象に、TLR-7分子のアンタゴニストを投与し、それにより、自己RNA分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象を治療することを含む、該対象を治療する方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、自己RNA分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象に、TLR-8分子のアンタゴニストを投与し、それにより、自己RNA分子に対する免疫応答を含む疾患を有する対象を治療することを含む、該対象を治療する方法を提供する。
別の実施態様において、本発明は、自己RNA分子に対する免疫応答を含む疾患は、自己免疫疾患である。別の実施態様において、該疾患は、全身性エリテマトーデス(SLE)である。別の実施態様において、該疾患は、自己RNA分子に対する免疫応答を含む、当該技術分野で公知の別の疾患である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本発明は、本発明の方法を実施する上で利用される試薬を含むキットを提供する。別の実施態様において、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。
別の実施態様において、本発明は、実施例7において例証されるように、TLR-3、TLR-7、およびTLR-7受容体によるシグナル伝達を測定または研究するためのキットを提供する。
別の実施態様において、本発明の処置プロトコールは、治療的である。別の実施態様において、該プロトコールは予防的である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
一実施態様において、「細胞を接触させること」または「集団を接触させること」という表現は、直接的または間接的であり得る曝露の方法を指す。一方法において、このような接触は、微量注入法など、当該技術分野で周知の任意の手段を通じた、細胞の直接的な注入を含む。別の実施態様において、細胞への供給は、細胞を取り囲む培地における提供を介して、対象への投与を介して、または当該技術分野で公知の任意の経路を介してなど、間接的である。別の実施態様において、「接触させること」という用語は、本発明の分子が、処置を受けている対象に導入されることを意味し、該分子は、インビボでの細胞と接触させておかれる。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。
網状赤血球の頻度の定量化のためのおよびEPO生物活性を測定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ramos, AS et al (Biological evaluation of recombinant human erythropoietin in pharmaceutical products. Braz J Med Biol Res 36:1561)において説明されている。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。
本発明の組成物は、別の実施態様において、非経口的に、側癌性に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、膣内に、または腫瘍内になど、当業者に公知の任意の方法によって対象に投与されることができる。
本発明の方法および組成物の別の実施態様において、該組成物は経口的に投与され、したがって、経口投与に好適な形態で、すなわち、固形または液体の調製物として製剤化される。好適な固形経口調製物には、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤、およびこれらに類するものが含まれる。好適な液体経口製剤には、液剤、懸濁剤、分散剤、エマルション、油、およびこれらに類するものが挙げられる。本発明の別の実施態様において、活性成分は、カプセル中に製剤化される。本実施態様によると、本発明の組成物は、該活性化合物および不活性担体もしくは不活性希釈剤に加えて、硬質ゼラチン化カプセルを含む。
他の実施態様において、医薬組成物は、液体調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体製剤には、液剤、懸濁剤、分散剤、エマルション、油、およびこれらに類するものが含まれる。別の実施態様において、医薬組成物は、静脈内に投与され、したがって、静脈内投与に好適な形態で製剤化される。別の実施態様において、医薬組成物は、動脈内に投与され、したがって、動脈内投与に好適な形態で製剤化される。別の実施態様において、医薬組成物は、筋肉内投与され、したがって、筋肉内投与に好適な形態で製剤化される。
別の実施態様において、医薬組成物は、体表面に局所的に投与され、したがって、局所投与に好適な形態で製剤化される。好適な局所製剤には、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、ドロップ、およびこれらに類するものが含まれる。局所投与のために、該組成物またはその生理学的に耐容性のある誘導体は、医薬担体とともにまたはそれなしで、生理学的に許容し得る希釈剤中の液剤、懸濁剤、またはエマルションとして調製および適用される。
別の実施態様において、該組成物は、坐剤、例えば、直腸坐剤または尿道坐剤として投与される。別の実施態様において、該医薬組成物は、ペレットの皮下埋没によって投与される。別の実施態様において、ペレットは、薬剤の経時的な徐放のために備える。
別の実施態様において、活性化合物は、小胞、例えば、リポソームにおいて送達される(Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)、Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)、Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327参照、一般的には同書参照)。
本明細書で使用する場合、「医薬として許容し得る担体または希釈剤」は、当業者に周知である。該担体または希釈剤は、種々の実施態様において、固形製剤のための固形の担体もしくは希釈剤、液体製剤のための液体の担体もしくは希釈剤、またはこれらの混合物であり得る。
別の実施態様において、固形担体/希釈剤には、ゴム、デンプン(例えば、トウモロコシデンプン、あらかじめゼラチン化したデンプン)、糖(例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース)、セルロース性材料(例えば、微結晶性セルロース)、アクリラート(例えば、ポリメチルアクリラート)、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、滑石、またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
他の実施態様において、液体製剤のための医薬として許容し得る担体は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、エマルション、または油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチル等の駐車可能な有機エステルである。水性担体には、塩類溶液および緩衝媒体を含む、水、アルコール性/水性溶液、エマルション、または懸濁液が含まれる。油の例は、石油、動物、植物、または合成の起源の油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油である。
非経口ビヒクル(皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用)には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、ならびに不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および養分の補液、リンゲルデキストロースをベースにしたものなどの電解質の補液、ならびにこれらに類するものが含まれる。例は、界面活性剤および他の医薬として許容し得るアジュバントの添加を伴うまたは伴わない、水および油等の滅菌済み液体である。一般に、水、塩類溶液、水性デキストロース、および関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、好ましい液体担体であり、特に注射可能な溶液のためにそうである。油の例は、石油、動物、植物、もしくは合成の起源の油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油である。
別の実施態様において、前記組成物はさらに、結合剤(例えば、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン)、崩壊剤(例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化シリコン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーゴム、グリコール酸デンプンナトリウム)、種々のpHおよびイオン強度の緩衝剤(例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、表面への吸収を防止するためのアルブミンまたはゼラチン等の添加物、洗剤(例えば、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩)、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)、浸透増強剤、可溶化剤(例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール)、安定化剤(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、増粘剤(例えば、カルボマー、コロイド状二酸化シリコン、エチルセルロース、グアーゴム)、甘味料(例えば、アスパルターム、クエン酸)、保存料(例えば、Thimerosal、ベンジルアルコール、パラベン)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、流動酸(flow-acid)(例えば、コロイド状二酸化シリコン)、可塑化剤(例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル)、乳化剤(例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム)、ポリマーコーティング(例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン)、コーティングおよびフィルム形成剤(例えば、エチルセルロース、アクリラート、ポリメタクリラート)ならびに/あるいはアジュバントを含む。先の賦形剤の各々は、本発明の個別の実施態様を表す。
別の実施態様において、本明細書で提供される医薬組成物は、徐放性組成物、すなわち、化合物が15の投与後に経時的に放出される組成物である。徐放性または持効性組成物には、親油性デポー剤(例えば、脂肪酸、ワックス、油)における製剤が含まれる。別の実施態様において、該組成物は、即時放出型組成物、すなわち、化合物全体が投与直後に放出される組成物である。
別の実施態様において、本発明の分子は、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、またはポリプロリン等の水溶性ポリマーの共有結合によって修飾される。修飾された化合物は、対応する修飾されていない化合物よりも静脈内注射後の実質的に長い血中半減期を呈することが知られている(Abuchowski et al., 1981、Newmark et al., 1982、およびKatre et al., 1987)。また、このような修飾は、別の実施態様において、水溶液中の化合物の溶解度を高め、凝集を排除し、化合物の物理的および化学的安定性を亢進し、化合物の免疫原性および反応性を大きく低下させる。結果として、所望のインビボでの生物活性は、修飾されていない化合物よりもより低い頻度でまたは少量の用量で、このようなポリマー‐化合物アブダクツ(abduct)の投与によって達成され得る。
活性成分は、別の実施態様において、中和された医薬として許容し得る塩形態として組成物へと製剤化される。医薬として許容し得る塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸と、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、およびこれらの類似物のような有機酸と形成される酸付加塩(例えば、ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基とともに形成される)が含まれる。また、遊離カルボキシル基から形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化鉄等の無機塩基に、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、およびこれらに類するもののような有機塩基に由来し得る。
先の添加物、賦形剤、製剤、および投与方法の各々は、本発明の個別の実施態様を表す。
別段の記載がない限り、以下の実験プロトコールを、下記に提供される実施例において採用した。
(実施例1~3についての材料および方法)
細胞培養。
細胞培養。
ヒト新生児包皮線維芽細胞1079細胞(カタログ番号CRL-2097, ATCC, Manassas, VA)およびヒトIMR90細胞(カタログ番号CCL-186, ATCC)を、10%熱失活済みウシ胎仔血清(FBS, Hyclone Laboratories, Logan, UT)、2mMのGlutamax(Invitrogen)、0.1mMβ-メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)、およびペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を補充したAdvanced MEM培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)において培養した。すべての細胞を、37℃および5%CO2で増殖させた。いくつかの実験において、本明細書に説明された方法を用いて誘導されるヒトiPS細胞を、20%ノックアウト血清交換剤、0.1mMのL-グルタミン(すべてInvitrogen製)、0.1mMβ-メルカプトエタノール(Sigma)、および100ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(Invitrogen)を補充したDMEM/F12培地における0.1%ゼラチン(Millipore, Phillipsburg, NJ)であらかじめ被覆した10cmプレートにおける照射済みのマウス胚性線維芽細胞(MEF)(R&D Systems, Minneapolis, MN)において維持した。いくつかの実験において、本明細書に説明された方法を用いて誘導されるヒトiPS細胞を、すでに説明されたように(Xu et al. 2001)回収したMEF馴化培地において維持した。
ベクターの構築。KLF4、LIN28、NANOG、およびOCT4のオープンリーディングフレーム(ORF)のためのcDNAを、cDNAクローンからPCR増幅し(Open Biosystems, Huntsville, AL)、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの下流でプラスミドベクターへとクローン化し(Mackie 1988, Studier and Moffatt 1986)(例えば、種々のpBluescript(商標)ベクター, Agilent, La Jolla, CAまたはpGEM(商標)ベクター, Promega, Madison, WI)、配列決定した。SOX2のORFをcDNAクローンからPCR増幅し(Invitrogen)、c-MYCのORFをRT-PCRによって、HeLa細胞全RNAから単離した。SOX2およびc-MYCの両ORFも、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの下流のプラスミドベクターへとクローン化し、配列決定した。
(KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2)のヒトオープンリーディングフレームを含有する代替的なプラスミドベクターをpBluescriptIIへとクローン化した。これらのpBluescriptIIベクターを、先のオープンリーディングフレームをEcoRV(cMyc)またはEcoRV/SpeI(KLF4、LIN28、NANOG、OCT4、およびSOX2)部位へと、説明された5’および3’アフリカツメガエルβ-グロビン非翻訳領域の間で連結することによって構築した(Krieg and Melton 1984)。
mRNAの製造。T7 RNAポリメラーゼプロモーター含有プラスミドコンストラクト(pT7-KLF4, pT7-LIN28, pT7-c-MYC, pT7-OCT4, pT7-SOX2, or pT7-XBg-KLF4, pT7-XBg-LIN28, pT7-XBg-c-MYC, pT7-XBg-OCT4, and pT7-XBg-SOX2)をBamHIで線形化し、pT7-NANOGおよびpT7-XBg-NANOGをXbaIで線形化した。mSCRIPT(商標)mRNA製造システム(EPICENTREまたはCellScript, Madison, WI, USA)を用いて、5’キャップ1構造および3’ポリ(A)末端を有するmRNAを製造した(例えば、およそ150のA残基を有する)が、例外は、T7 RNAポリメラーゼインビトロ転写反応において、ウリジン-5’-三リン酸の替わりにプソイドウリジン-5’-三リン酸(TRILINK, San Diego, CA)を用いることであった。
mRNAの精製および分析。いくつかの実験的実施態様において、mRNAをHPLCによって精製し、カラム画分を回収し、mRNA画分を、において説明されるように、ならびに/または図22~図24に説明されおよび示されるように、免疫原性の精度について分析した。いくつかの実験的実施態様において、免疫原性をほとんどまたは全く呈さない1つ以上の再プログラム化因子をコードするmRNAを含むかまたはそれからなる精製されたRNA調製物を、ヒト体細胞をiPS細胞に再プログラム化するための実験に用いた。
MEFにおけるヒト体細胞の再プログラム化。
1079線維芽細胞を、0.1%ゼラチン(Millipore)であらかじめコーティングされた6ウェル皿の1×105個/ウェルで播種し、一晩増殖させた。1079線維芽細胞に、TransIT mRNA形質移入試薬(MirusBio, Madison, WI)を用いて、等量の各再プログラム化因子mRNA(KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2)を形質移入した。合計3回の形質移入を実施し、1回の形質移入を1日おきに実施し、培地を第一および第二の形質移入の翌日に交換した。第三の形質移入の翌日、細胞をトリプシン処理し、3.3×105個を、前日に7.5×105のMEFを播種した、0.1%ゼラチンであらかじめ被覆した10cmプレートへと1079中で播種した。形質移入した1079線維芽細胞をMEF上に播種した翌日、培地をiPS細胞培地に交換した。iPS細胞培地を毎日交換した。形質移入した細胞をMEF上に播種した8日後、MEF馴化培地を用いた。MEF馴化培地をすでに説明された通り回収した(Xu et al. 2001)。プレートを、倒立顕微鏡を用いて、iPS形態を有するコロニーの存在について毎日スクリーニングした。
MEF上の1079線維芽細胞およびIMR90線維芽細胞を再プログラム化するための代替的なプロトコールも用いた。MEFを、0.1%ゼラチンであらかじめ被覆した6ウェル皿の1.25×105個/ウェルに播種し、完全線維芽細胞培地において一晩インキュベートした。1079線維芽細胞またはIMR90線維芽細胞を、前日にMEFを播種した6ウェル皿の3×104個/ウェルで播種し、37℃/5%CO2で一晩増殖させた。次に、mScript Kitを用いて、以下のベクター(pT7-Xβg-KLF4、pT7-Xβg-LIN28、pT7-Xβg-c-MYC、pT7-Xβg-NANOG、pT7-Xβg-OCT4、およびpT7-Xβg-SOX2)からキャップ1/ポリアデニル化mRNAを生成し、これらの毎日の形質移入において用いた。6の再プログラム化mRNAをすべて、各mRNAの100ng/μLに希釈した。等モル濃度の各mRNAを、以下の変換因子を用いて互いに添加した(OCT4は、1に設定され、他のmRNAはすべて、各mRNA混合物における等モル濃度を得るために、以下のの変換係数によって乗じた。)。KLF=1.32、LIN28=0.58、c-MYC=1.26、NANOG=0.85、OCT4=1、およびSOX2=0.88。等モル量の各因子を得る為に、132μLのKLF4、58μLのLIN28、126μLのc-MYC、85μLのNANOG、100μLのOCT4、および88μLのSOX2のmRNA(各100ng/μL)を互いに添加するであろう。形質移入のための合計600μgの用量は、6の再プログラム化mRNAの各々の100ng(先のモル濃度変換を用いる)を用いたことを意味するであろう。Trans-IT mRNA形質移入試薬を用いて、これらのmRNA用量を形質移入した。すべての形質移入のために、mRNAプールを、添加物のないDMEM/F12培地に、または添加物のないAdvanced MEM培地のいずれかの250μLに添加した。5μLのmRNA刺激試薬および5μLのTransIT形質移入試薬を各チューブに添加し、室温で2分間インキュベートした後、形質移入混合物を、10%FBS+100ng/mLのhFGFbを有するAdvanced MEM培地または100ng/mLのhFGFbを含有するiPS培地のいずれかの2.5mLに添加した。形質移入を10~16日間毎日反復した。培地を各形質移入の4時間後に交換した。いくつかの実施態様において、最初の形質移入の5~8日間後に、細胞をトリプシン処理し、新鮮なMEFプレートに再度播種した。1079細胞を新鮮なMEFプレートに1/6または1/12で分けたのに対し、IMR90細胞を新鮮なMEFプレートに1/3または1/6で分けた。
MEF馴化培地におけるヒト体細胞の再プログラム化。1079繊維芽細胞またはIMR90線維芽細胞を、0.1%ゼラチンであらかじめ被覆した10cm皿(Millipore)あたり3×105個で播種し、一晩増殖させた。1079線維芽細胞またはIMR90線維芽細胞に等量の再プログラム化因子mRNA(KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2)を、TransIT mRNA形質移入試薬(MirusBio, Madison, WI)を用いて形質移入した。各形質移入のために、6μg、18μg、または36μgのいずれかの各再プログラム化mRNA(KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2)を10cm皿につき用いた。合計3回の形質移入を実施し、1回の形質移入を1日ごとに実施し、培地を第一および第二の形質移入の各翌日に交換した。すべての形質移入をMEF馴化培地において実施した。第三の形質移入の翌日、細胞をトリプシン処理し、0.1%ゼラチンであらかじめ被覆した新鮮な10cm皿(Millipore)に播種した。細胞を、実験の間MEF馴化培地において増殖させた。
類似の毎日のmRNA形質移入も、先の説において説明されたとおり実施したが、唯一の違いは、MEFをフィーダー層として用いず、MEF馴化培地のみを用いることであった。
免疫蛍光。1079細胞または1079由来のiPS細胞プレートをPBSで洗浄し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドにおいて室温で30分間固定した。次に、iPS細胞をPBSで3回、各洗浄に5分間洗浄した後、PBS+0.1%Triton X-100において3回洗浄した。次に、iPS細胞をブロッキング緩衝液(PBS+0.1%Triton、2%FBS、および1%BSA)において室温で1時間ブロッキングした。次に、細胞を、ブロッキング緩衝液中の1:500希釈における一次抗体(マウス抗ヒトOCT4カタログ番号sc-5279, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA、ウサギ抗ヒトNANOGカタログ番号3580、ウサギ抗ヒトKLF4カタログ番号4038、マウス抗ヒトLIN28カタログ番号5930、ウサギ抗ヒトc-MYCカタログ番号5605、ウサギ抗ヒトSOX2カタログ番号3579、およびマウス抗TRA-1-60、すべてCell Signaling Technology, Beverly, MA製)とともに室温で2時間インキュベートした。PBS+0.1%Triton X-100において5回洗浄した後、iPS細胞を、ブロッキング緩衝液中の1:1000希釈における抗ウサギAlexa Fluor 488抗体(カタログ番号4412, Cell Signaling Technology)、抗マウスFITC二次抗体(カタログ番号F5262, Sigma)、または抗マウスAlexa Fluor 555(カタログ番号4409, Cell Signaling Technology)とともに2時間インキュベートした。画像を、NIS-elementsソフトウェア(Nikon)を用いる2-メガピクセルモノクロデジタルカメラ(Nikon)を備えたNikon TS100F倒立顕微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)において撮影した。
(実施例1)
本実施例は、KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2をコードするmRNAを用いた形質移入が、新生児包皮1079線維芽細胞における各個々のタンパク質産物の発現および適切な細胞レベル下局在を結果として生じたかどうかを決定するための試験を説明する。本実験において用いられたmRNAを、ウリジン-5’-三リン酸と置き換えるプソイドウリジン-5’-三リン酸を用いて調製した(Kariko et al. 2008)。1079の線維芽細胞に、6ウェル皿のウェルあたり4μgの各mRNAを形質移入し、免疫蛍光分析を形質移入24時間後に実施した。内在性KLF4、LIN28、NANOG、OCT4、およびSOX2タンパク質レベルは、形質移入されていない1079細胞において免疫蛍光によって検出不可能であった(図1:B、F、N、R、V)。c-MYCの内在性レベルは、形質移入されていない1079細胞において比較的高かった(Fig.1J)。転写因子KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2をコードするmRNAの形質移入はすべて、mRNA形質移入24時間後に、各タンパク質の主として核の局在を結果として生じた(図1:D、L、P、T、X)。細胞質mRNA結合タンパク質LIN28は、細胞質に局在した(図1:H)。
本実施例は、KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2をコードするmRNAを用いた形質移入が、新生児包皮1079線維芽細胞における各個々のタンパク質産物の発現および適切な細胞レベル下局在を結果として生じたかどうかを決定するための試験を説明する。本実験において用いられたmRNAを、ウリジン-5’-三リン酸と置き換えるプソイドウリジン-5’-三リン酸を用いて調製した(Kariko et al. 2008)。1079の線維芽細胞に、6ウェル皿のウェルあたり4μgの各mRNAを形質移入し、免疫蛍光分析を形質移入24時間後に実施した。内在性KLF4、LIN28、NANOG、OCT4、およびSOX2タンパク質レベルは、形質移入されていない1079細胞において免疫蛍光によって検出不可能であった(図1:B、F、N、R、V)。c-MYCの内在性レベルは、形質移入されていない1079細胞において比較的高かった(Fig.1J)。転写因子KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2をコードするmRNAの形質移入はすべて、mRNA形質移入24時間後に、各タンパク質の主として核の局在を結果として生じた(図1:D、L、P、T、X)。細胞質mRNA結合タンパク質LIN28は、細胞質に局在した(図1:H)。
(実施例2)
再プログラム化タンパク質の効率的なmRNA形質移入および適切な細胞レベル下局在を示したので、本実施例は、体細胞性線維芽細胞からのiPS細胞の生成のためのプロトコールの開発を説明する。等量(重量による)のKLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2のmRNAを1079線維芽細胞に3回(1日おきに1回)形質移入した。3回目の形質移入の翌日、細胞を、照射済みMEFフィーダー細胞へと播種し、iPS細胞培地において増殖させた。1079線維芽細胞を照射済みMEFに播種した6日後、2の推定iPS細胞コロニーは、3μgの各再プログラム化因子mRNA(KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, and
SOX2)を形質移入した10cmプレートにおいて明白となった。コロニーを、最後の形質移入の12日後まで増殖させておいた後、該コロニーを免疫蛍光分析のために固定した。内部細胞塊特異的マーカーNANOGは、iPS細胞コロニーが、真にiPSコロニーであるかどうかをアッセイするのにしばしば用いられる(Gonzalez et al. 2009、Huangfu et al. 2008)。12日間早く形質移入したmRNAから生じるNANOG発現は、mRNAの安定性および発現の期間に関する先行報告(Kariko et al. 2008)に基づいて無視できるであろう。NANOGについての染色は、2のiPS細胞コロニーの両方がNANOG陽性であることを示した(図2のB、D、および非表示)。iPS細胞コロニーの部分ではない周辺の線維芽細胞は、NANOG陰性であり、該線維芽細胞がiPS細胞へと再プログラムされないことを示唆した。
再プログラム化タンパク質の効率的なmRNA形質移入および適切な細胞レベル下局在を示したので、本実施例は、体細胞性線維芽細胞からのiPS細胞の生成のためのプロトコールの開発を説明する。等量(重量による)のKLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2のmRNAを1079線維芽細胞に3回(1日おきに1回)形質移入した。3回目の形質移入の翌日、細胞を、照射済みMEFフィーダー細胞へと播種し、iPS細胞培地において増殖させた。1079線維芽細胞を照射済みMEFに播種した6日後、2の推定iPS細胞コロニーは、3μgの各再プログラム化因子mRNA(KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, and
SOX2)を形質移入した10cmプレートにおいて明白となった。コロニーを、最後の形質移入の12日後まで増殖させておいた後、該コロニーを免疫蛍光分析のために固定した。内部細胞塊特異的マーカーNANOGは、iPS細胞コロニーが、真にiPSコロニーであるかどうかをアッセイするのにしばしば用いられる(Gonzalez et al. 2009、Huangfu et al. 2008)。12日間早く形質移入したmRNAから生じるNANOG発現は、mRNAの安定性および発現の期間に関する先行報告(Kariko et al. 2008)に基づいて無視できるであろう。NANOGについての染色は、2のiPS細胞コロニーの両方がNANOG陽性であることを示した(図2のB、D、および非表示)。iPS細胞コロニーの部分ではない周辺の線維芽細胞は、NANOG陰性であり、該線維芽細胞がiPS細胞へと再プログラムされないことを示唆した。
同じプロトコールを用いるその後の実験において、1079線維芽細胞およびヒトIMR90線維芽細胞の両方に、同じ再プログラム化mRNAを形質移入した。複数のコロニーを、形質移入した細胞を照射済みMEFに播種した4日後と同じだけ早く検出した。6μgの各mRNA(KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2)を6ウェル皿における形質移入において用いると、3の推定iPS細胞コロニーを、10cmプレートにおけるMEFに播種した後に両細胞株において後に検出した(図3)。NANOGの発現についてこれらのコロニーを分析することに加えて、完全に再プログラムされたiPS細胞のより厳密なマーカーであるTRA-1-60(Chan et al. 2009)も免疫蛍光分析に用いた。1079線維芽細胞から(図3のA~F)およびIMR90線維芽細胞から(図3のG~I)生じたiPSコロニーは、NANOGおよびTRA-1-60の両方について陽性であり、これらのコロニーが完全に再プログラムされたIII型iPS細胞コロニーであることを示した。6の再プログラム化因子をすべてコードするmRNAの3の形質移入と、MEFフィーダー細胞へ播種することとを含む本プロトコールは結果的に、発現プラスミドの形質移入による同じ再プログラム化因子の送達を含むプロトコールによって既に報告されたように(Aoi et al. 2008)、類似の再プログラム化効率(1×106の投入細胞あたり3~6のiPSコロニー)を生じた。
(実施例3)
本実施例は、分化した細胞を、mRNAを用いて再プログラム化する効率を改良するための試行を説明する。1つのアプローチにおいて、線維芽細胞培地ではなくMEF馴化培地において6つの再プログラム化因子をコードするmRNAを1079線維芽細胞またはIMR90線維芽細胞に3回(1日おきに1回)経いつ移入することと、次に、処理された1079線維芽細胞を処理後にMEFフィーダー層に播種するのではなくMEF馴化培地において増殖させることを含むプロトコールを用いた。利用される最高の形質移入用量時に(10cm皿あたり36μgの各再プログラム化因子)、208のiPS細胞コロニーを最終的な形質移入の3日後に検出した(図A~F)。興味深いことに、3日目の時点で6μgまたは18μgのいずれかの再プログラム化因子の各々を形質移入した皿においてiPS細胞コロニーを検出せず、18μgを上回る用量がこれらの条件下で、MEF馴化培地において3日間以内にiPS細胞コロニー形成が生じるために重要であることを示唆した。IMR90細胞は、さらにより多数のiPS細胞コロニーを示し、6つの再プログラム化因子mRNAの各々の3回の6μg用量を形質移入したプレートにおいて最後の形質移入の8日後に約200コロニーを、6つの再プログラム化因子mRNAの各々の18μgまたは36μg用量を3回形質移入したIMR90細胞において1000超のコロニーを有した(図4のG~I)。コロニーは、1079細胞における最終的な形質移入の3日後に可視であったのに対し、コロニーは、IMR90細胞における最終的な形質移入の6~7日後に可視となった。それゆえ、1079細胞由来のより成熟なコロニーは、より大きくかつより密であり、およびIMR90コロニーと比較して明視野画像においてより暗かった(図4)。36μgの各再プログラム化mRNAを3回形質移入した1079プレートにおけるコロニーはすべて、最終的なmRNA形質移入の8日後にNANOGおよびTRA-1-60の両方について陽性であった(図5のA~I)。より未熟なIMR90 iPSコロニーもすべて、NANOGおよびTRA-1-60の両方について陽性であった(図5のJ~O)が、より成熟な1079コロニーと比較してあまり密ではない該より未熟なIMR90 iPSコロニーの細胞性質により、両マーカーについてあまり頑強ではない染色を示した(図5のA~I)。MEF馴化培地における1079細胞またはIMR90細胞への該mRNAの送達を含む本プロトコールは、3×105の投入細胞あたり200~1000超のコロニーの再プログラム化効率を有していた。iPS細胞を誘導するための本プロトコールはより迅速であり、線維芽細胞培地におけるこれらの同じ6つの再プログラム化因子をコードするDNAプラスミドを線維芽細胞に形質移入することを含む公開されたプロトコールよりもほぼ2~3桁、より効率的であった(Aoi et al. 2008)。なおもさらに、本プロトコールは、6×105の投入細胞あたりおよそ57のiPS細胞コロニーを結果として生じる、1079新生児線維芽細胞への再プログラム化因子のレンチウイルス送達の公開されたデータに基づいたレンチウイルスを用いた再プログラム化因子の送達を含む公開されたプロトコール(Aoi et al. 2008)よりも7~40倍効率的であった。また、本プロトコールは、公開された方法よりも非常に迅速である。
本実施例は、分化した細胞を、mRNAを用いて再プログラム化する効率を改良するための試行を説明する。1つのアプローチにおいて、線維芽細胞培地ではなくMEF馴化培地において6つの再プログラム化因子をコードするmRNAを1079線維芽細胞またはIMR90線維芽細胞に3回(1日おきに1回)経いつ移入することと、次に、処理された1079線維芽細胞を処理後にMEFフィーダー層に播種するのではなくMEF馴化培地において増殖させることを含むプロトコールを用いた。利用される最高の形質移入用量時に(10cm皿あたり36μgの各再プログラム化因子)、208のiPS細胞コロニーを最終的な形質移入の3日後に検出した(図A~F)。興味深いことに、3日目の時点で6μgまたは18μgのいずれかの再プログラム化因子の各々を形質移入した皿においてiPS細胞コロニーを検出せず、18μgを上回る用量がこれらの条件下で、MEF馴化培地において3日間以内にiPS細胞コロニー形成が生じるために重要であることを示唆した。IMR90細胞は、さらにより多数のiPS細胞コロニーを示し、6つの再プログラム化因子mRNAの各々の3回の6μg用量を形質移入したプレートにおいて最後の形質移入の8日後に約200コロニーを、6つの再プログラム化因子mRNAの各々の18μgまたは36μg用量を3回形質移入したIMR90細胞において1000超のコロニーを有した(図4のG~I)。コロニーは、1079細胞における最終的な形質移入の3日後に可視であったのに対し、コロニーは、IMR90細胞における最終的な形質移入の6~7日後に可視となった。それゆえ、1079細胞由来のより成熟なコロニーは、より大きくかつより密であり、およびIMR90コロニーと比較して明視野画像においてより暗かった(図4)。36μgの各再プログラム化mRNAを3回形質移入した1079プレートにおけるコロニーはすべて、最終的なmRNA形質移入の8日後にNANOGおよびTRA-1-60の両方について陽性であった(図5のA~I)。より未熟なIMR90 iPSコロニーもすべて、NANOGおよびTRA-1-60の両方について陽性であった(図5のJ~O)が、より成熟な1079コロニーと比較してあまり密ではない該より未熟なIMR90 iPSコロニーの細胞性質により、両マーカーについてあまり頑強ではない染色を示した(図5のA~I)。MEF馴化培地における1079細胞またはIMR90細胞への該mRNAの送達を含む本プロトコールは、3×105の投入細胞あたり200~1000超のコロニーの再プログラム化効率を有していた。iPS細胞を誘導するための本プロトコールはより迅速であり、線維芽細胞培地におけるこれらの同じ6つの再プログラム化因子をコードするDNAプラスミドを線維芽細胞に形質移入することを含む公開されたプロトコールよりもほぼ2~3桁、より効率的であった(Aoi et al. 2008)。なおもさらに、本プロトコールは、6×105の投入細胞あたりおよそ57のiPS細胞コロニーを結果として生じる、1079新生児線維芽細胞への再プログラム化因子のレンチウイルス送達の公開されたデータに基づいたレンチウイルスを用いた再プログラム化因子の送達を含む公開されたプロトコール(Aoi et al. 2008)よりも7~40倍効率的であった。また、本プロトコールは、公開された方法よりも非常に迅速である。
(実施例4 天然RNA分子は樹状細胞を活性化させる分化能を呈する:材料および実験方法)
(プラスミドおよび試薬)
プラスミドpT7T3D-MART-1およびpUNO-hTLR3をATCC(Manassas, VA)およびInvivoGen(San Diego, CA)からそれぞれ得た。pTEVlucをDaniel Gallie博士(UC Riverside)から得、pT7-TEV(タバコエッチ病ウイルスゲノムRNAのリーダー配列)-ルシフェラーゼ-A50を含有し、Gallie, DR et al, 1995. The tobacco etch viral 5’ leader and poly(A) tail are functionally synergistic regulators of translation. Gene 165:233)に説明されている。pSVrenを、BamHIおよびNotI消化、末端充填(end-filling)、および再連結によるホタルルシフェラーゼコード配列の除去によって、p2luc(Grentzmann G, Ingram JA, et al, A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA 1998;4(4): 479-86)から生じた。
(プラスミドおよび試薬)
プラスミドpT7T3D-MART-1およびpUNO-hTLR3をATCC(Manassas, VA)およびInvivoGen(San Diego, CA)からそれぞれ得た。pTEVlucをDaniel Gallie博士(UC Riverside)から得、pT7-TEV(タバコエッチ病ウイルスゲノムRNAのリーダー配列)-ルシフェラーゼ-A50を含有し、Gallie, DR et al, 1995. The tobacco etch viral 5’ leader and poly(A) tail are functionally synergistic regulators of translation. Gene 165:233)に説明されている。pSVrenを、BamHIおよびNotI消化、末端充填(end-filling)、および再連結によるホタルルシフェラーゼコード配列の除去によって、p2luc(Grentzmann G, Ingram JA, et al, A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA 1998;4(4): 479-86)から生じた。
ヒトTLR3(nt703~722、受入番号:NM_003265)に対して20nt長相同のshRNAをコードする合成ODNを、プラスミドpSilencer 4.1-CMV-neo(Ambion, Austin, TX)へとまずクローニングすること、次に、NheI-HindIII切断およびpcDNA3.1(Invitrogen)の相応部位へのサブクローン化によって、ヒトTLR3特異的siRNAであるpTLR3-shを得た。LPS(大腸菌055:B5)を、Sigma Chemical Co, St. Louis, MOから得た。CpG ODN2006およびR-848をInvivoGenから得た。
(細胞および細胞培養)
ヒト胚性腎293細胞(ATCC)を、グルタミン(Invitrogen)および10%FCS(Hyclone, Ogden, UT)(完全培地)を補充したDMEMにおいて増殖させた。本明細書におけるすべての場合において、「293細胞」は、ヒト胚性腎(HEK)293細胞を指す。293-hTLR3細胞株を、293細胞をpUNO-hTLR3で形質転換することによって生じた。細胞株293-hTLR7、293-hTLR8、および293-hTLR9(InvivoGen)を、ブラスチシジン(10 μg/ml)(Invivogen)を補充した完全培地において増殖させた。細胞株293-ELAM-IucおよびTLR7-293(M. Lamphier, Eisai Research Institute, Andover MA)、ならびにTLR3-293細胞を、説明された通り培養した(Kariko et al, 2004, mRNA is anendogenous ligand for Toll-like receptor 3. J Biol Chem 279: 12542-12550)。
細胞株293、293-hTLR7、および293-hTLR8にpTLR3-shを安定して形質移入し、G-418(400 μg/ml)(Invitrogen)を用いて選択した。Neo耐性コロニーをスクリーニングし、ポリ(I):(C)に対するIL-8分泌の欠失として決定されるTLR3を発現しないもののみを、さらなる研究において用いた。白血球フェレーシス試料を、IRB認可プロトコールを通じてHIV未感染ボランティアから得た。
ヒト胚性腎293細胞(ATCC)を、グルタミン(Invitrogen)および10%FCS(Hyclone, Ogden, UT)(完全培地)を補充したDMEMにおいて増殖させた。本明細書におけるすべての場合において、「293細胞」は、ヒト胚性腎(HEK)293細胞を指す。293-hTLR3細胞株を、293細胞をpUNO-hTLR3で形質転換することによって生じた。細胞株293-hTLR7、293-hTLR8、および293-hTLR9(InvivoGen)を、ブラスチシジン(10 μg/ml)(Invivogen)を補充した完全培地において増殖させた。細胞株293-ELAM-IucおよびTLR7-293(M. Lamphier, Eisai Research Institute, Andover MA)、ならびにTLR3-293細胞を、説明された通り培養した(Kariko et al, 2004, mRNA is anendogenous ligand for Toll-like receptor 3. J Biol Chem 279: 12542-12550)。
細胞株293、293-hTLR7、および293-hTLR8にpTLR3-shを安定して形質移入し、G-418(400 μg/ml)(Invitrogen)を用いて選択した。Neo耐性コロニーをスクリーニングし、ポリ(I):(C)に対するIL-8分泌の欠失として決定されるTLR3を発現しないもののみを、さらなる研究において用いた。白血球フェレーシス試料を、IRB認可プロトコールを通じてHIV未感染ボランティアから得た。
(マウスDC作製)
マウスDCを、6~8週齢のC57BL/6マウスの脛骨および大腿骨から骨髄細胞を回収し、赤血球細胞を溶解することによって作製した。細胞を2mLのDMEM+10%FVSおよび20ng/mLのmuGM-CSF(R&D Systems)において106個/ウェルで6ウェルプレートに播種した。3日後、muGM-CSFを有する2mLの新鮮培地を添加した。6日後、2mLの培地/ウェルを回収し、細胞をペレットにし、muGM-CSFを有する新鮮培地に再懸濁した。培養7日後、muDCを収穫、洗浄した。
マウスDCを、6~8週齢のC57BL/6マウスの脛骨および大腿骨から骨髄細胞を回収し、赤血球細胞を溶解することによって作製した。細胞を2mLのDMEM+10%FVSおよび20ng/mLのmuGM-CSF(R&D Systems)において106個/ウェルで6ウェルプレートに播種した。3日後、muGM-CSFを有する2mLの新鮮培地を添加した。6日後、2mLの培地/ウェルを回収し、細胞をペレットにし、muGM-CSFを有する新鮮培地に再懸濁した。培養7日後、muDCを収穫、洗浄した。
(天然RNA)
ミトコンドリアを、分画溶解手順(ミトコンドリア単離キット;Pierce, Rockford, IL)を用いて、ペンシルバニア大学血液バンクから得た血小板から単離した。RNAをMaster Blaster(登録商標)(BioRad, Hercules, CA)によって、293細胞、未分画293細胞、ラット肝臓、マウス細胞株TUBO、および大腸菌のDH5α株の、精製されたミトコンドリア画分、細胞質画分、および核画分から単離した。ウシtRNA、コムギtRNA、酵母tRNA、大腸菌tRNA、マウス心臓由来のポリ(A)+ mRNA、およびポリ(I):(C)を、Sigmaから購入し、ヒト脾臓由来の全RNAおよび大腸菌RNAをAmbionから購入した。オリゴリボヌクレオチド-5’-一リン酸を化学的に合成した(Dharmacon, Lafayette, CO)。
ミトコンドリアを、分画溶解手順(ミトコンドリア単離キット;Pierce, Rockford, IL)を用いて、ペンシルバニア大学血液バンクから得た血小板から単離した。RNAをMaster Blaster(登録商標)(BioRad, Hercules, CA)によって、293細胞、未分画293細胞、ラット肝臓、マウス細胞株TUBO、および大腸菌のDH5α株の、精製されたミトコンドリア画分、細胞質画分、および核画分から単離した。ウシtRNA、コムギtRNA、酵母tRNA、大腸菌tRNA、マウス心臓由来のポリ(A)+ mRNA、およびポリ(I):(C)を、Sigmaから購入し、ヒト脾臓由来の全RNAおよび大腸菌RNAをAmbionから購入した。オリゴリボヌクレオチド-5’-一リン酸を化学的に合成した(Dharmacon, Lafayette, CO)。
一定分量のRNA試料を、Benzonaseヌクレアーゼの存在下でインキュベートした(1マイクロリットルあたり1マイクログラム(μg/μL)の5μLのRNAあたり1Uで1時間)。一定分量のRNA-730をアルカリホスファターゼ(New England Biolabs)で消化した。質の保証のために、RNA試料を、変性アガロース電気泳動法またはポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。Limulus Amebocyte Lysateゲル塊アッセイを用いたRNA調製物におけるLPSについてのアッセイは、1ミリリットルあたり3ピコグラム(pg/mL)の感度で陰性であった(University of Pennsylvania, Core Facility)。
(HPLC分析)
ヌクレオシド一リン酸を、HPLCを介して分離および可視化した。遊離ヌクレオシド3’-一リン酸を放出するために、5μgの一定分量のRNAを、10μLの50mM NaOAcおよび2mM EDTA緩衝液(pH4.5)における0.1UのRNase
T2(Invitrogen)を用いて一晩消化した後、試料を、Waters Symmetry C 18カラム(Waters, Milford, MA)を用いて、Agilent 1100 HPLCへと注入した。1mL/分の流速で、100%緩衝液A(30 mM KH2P04および10 mMリン酸テトラエチルアンモニウム[PicA試薬, Waters]、pH 6.0)から30%緩衝液B(アセトニトリル)への勾配を60分間かけて実施した。ヌクレオチドを、光ダイオードアレイを用いて254nmにおいて検出した。それがなにであるかを、保持時間及びスペクトルによって認証した。
ヌクレオシド一リン酸を、HPLCを介して分離および可視化した。遊離ヌクレオシド3’-一リン酸を放出するために、5μgの一定分量のRNAを、10μLの50mM NaOAcおよび2mM EDTA緩衝液(pH4.5)における0.1UのRNase
T2(Invitrogen)を用いて一晩消化した後、試料を、Waters Symmetry C 18カラム(Waters, Milford, MA)を用いて、Agilent 1100 HPLCへと注入した。1mL/分の流速で、100%緩衝液A(30 mM KH2P04および10 mMリン酸テトラエチルアンモニウム[PicA試薬, Waters]、pH 6.0)から30%緩衝液B(アセトニトリル)への勾配を60分間かけて実施した。ヌクレオチドを、光ダイオードアレイを用いて254nmにおいて検出した。それがなにであるかを、保持時間及びスペクトルによって認証した。
(樹状細胞アッセイ)
96ウェルプレートにおける樹状細胞(およそ1.1×105個/ウェル)をR-848、Lipofectin(登録商標)、またはLipofectin(登録商標)-RNAで1時間処理した後、培地を交換した。(別段の記載がない限り、)8時間の終了時に、細胞をRNA単離またはフローサイトメトリーのいずれかのために収穫したのに対し、回収された培地を、サイトカインELISAに供した。IL-12(p70)(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)、IFN-α、TNF-α、およびIL-8(Biosource International, Camarillo, CA)をサンドイッチELISAによって上清中で測定した。培養を三つ組または四つ組で実施し、二つ組で測定した。
96ウェルプレートにおける樹状細胞(およそ1.1×105個/ウェル)をR-848、Lipofectin(登録商標)、またはLipofectin(登録商標)-RNAで1時間処理した後、培地を交換した。(別段の記載がない限り、)8時間の終了時に、細胞をRNA単離またはフローサイトメトリーのいずれかのために収穫したのに対し、回収された培地を、サイトカインELISAに供した。IL-12(p70)(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)、IFN-α、TNF-α、およびIL-8(Biosource International, Camarillo, CA)をサンドイッチELISAによって上清中で測定した。培養を三つ組または四つ組で実施し、二つ組で測定した。
(ノザンブロット分析)
先に説明された通り、RNAを処置の後の8時間のインキュベーション後にMDDCから単離した。該当する場合、細胞を刺激30分前に、インキュベーションの全体の長さを通じて、2.5μg/mLのシクロヘキシミド(Sigma)で処理した。RNA試料を処理し、ATCCから得られたプラスミド(それぞれpE4およびpHcGAP)に由来するヒトTNF-αプローブおよびGAPDHプローブを用いて、説明される通り(Kariko et al. 2004、同書)ノザンブロット法において分析した。
先に説明された通り、RNAを処置の後の8時間のインキュベーション後にMDDCから単離した。該当する場合、細胞を刺激30分前に、インキュベーションの全体の長さを通じて、2.5μg/mLのシクロヘキシミド(Sigma)で処理した。RNA試料を処理し、ATCCから得られたプラスミド(それぞれpE4およびpHcGAP)に由来するヒトTNF-αプローブおよびGAPDHプローブを用いて、説明される通り(Kariko et al. 2004、同書)ノザンブロット法において分析した。
(結果)
異なる細胞のRNAサブタイプの免疫刺激能力を決定するために、RNAを、異なる細胞レベル下区画、すなわち、細胞質、核、およびミトコンドリアから単離した。これらのRNA画分、ならびに哺乳類源にすべて由来する全RNA、tRNA、およびポリA末端で選択されたmRNAをLipofectin(登録商標)と複合体形成し、MDDCに添加した。哺乳類の全RNA、核RNA、および細部質RNAはすべて、検出可能なTNF-α分泌によって立証されるように、MDDCを刺激したが、TNF-αレベルは、インビトロで合成されたmRNAによって誘導されるものよりも非常に低かった(図6)。その上、哺乳類tRNAは、TNF-αのいずれの検出可能なレベルも誘導しなかったが、ミトコンドリア(mt)RNAは、他の哺乳類RNAサブタイプよりも非常により多くのTNF-αを誘導した。細菌全RNAもMDDCの強力な活性化因子であり、対照的に、細菌tRNAは、低レベルのTNF-αしか誘導しなかった。他の源(酵母、コムギ胚、ウシ)由来のtRNAは、非刺激性であった。類似の結果が、他の哺乳類源由来のRNAを試験した時に観察された。RNA試料を、一本鎖RNAおよび二本鎖RNAを開裂するBenzonaseで消化すると、RNAシグナル伝達は、MDDCにおいて消滅し、TNF-α分泌が、該調製物におけるRNAによることを認証した。試験したRNA種類の活性化能力は、ヌクレオシド修飾の程度との負の相関を呈した。類似の結果は、サイトカインの生じる両方の種類のDCについて本実施例において説明された実験において得られた。
異なる細胞のRNAサブタイプの免疫刺激能力を決定するために、RNAを、異なる細胞レベル下区画、すなわち、細胞質、核、およびミトコンドリアから単離した。これらのRNA画分、ならびに哺乳類源にすべて由来する全RNA、tRNA、およびポリA末端で選択されたmRNAをLipofectin(登録商標)と複合体形成し、MDDCに添加した。哺乳類の全RNA、核RNA、および細部質RNAはすべて、検出可能なTNF-α分泌によって立証されるように、MDDCを刺激したが、TNF-αレベルは、インビトロで合成されたmRNAによって誘導されるものよりも非常に低かった(図6)。その上、哺乳類tRNAは、TNF-αのいずれの検出可能なレベルも誘導しなかったが、ミトコンドリア(mt)RNAは、他の哺乳類RNAサブタイプよりも非常により多くのTNF-αを誘導した。細菌全RNAもMDDCの強力な活性化因子であり、対照的に、細菌tRNAは、低レベルのTNF-αしか誘導しなかった。他の源(酵母、コムギ胚、ウシ)由来のtRNAは、非刺激性であった。類似の結果が、他の哺乳類源由来のRNAを試験した時に観察された。RNA試料を、一本鎖RNAおよび二本鎖RNAを開裂するBenzonaseで消化すると、RNAシグナル伝達は、MDDCにおいて消滅し、TNF-α分泌が、該調製物におけるRNAによることを認証した。試験したRNA種類の活性化能力は、ヌクレオシド修飾の程度との負の相関を呈した。類似の結果は、サイトカインの生じる両方の種類のDCについて本実施例において説明された実験において得られた。
これらの発見は、RNAの免疫原性が、ヌクレオシド修飾の程度によって影響され、より大きな程度の修飾は、免疫原性を低下させる傾向にあることを示す。
(実施例5 修飾されたヌクレオシド用いたRNA分子のインビトロでの合成:材料および実験方法)
(インビトロで転写されるRNA)
インビトロでの転写アッセイ(MessageMachineキットおよびMegaScriptキット; Ambion,)を用いて、以下の長いRNAを、説明される通りT7 RNAポリメラーゼ(RNAP)によって生じた(Kariko et al, 1998, Phosphate-enhanced transfection of cationic lipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta 1369, 320-334)(注記:テンプレートの名称は、カッコの中に示されており、RNAの名称中の数は長さを指定する):RNA-1866(Nde Iで線形化されたpTEVluc)は、ホタルルシフェラーゼをコードし、50nt長のポリA末端である。RNA-1571(Ssp Iで線形化されたpSVren)は、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする。RNA-730(Hind IIIで線形化されたpT7T3D-MART-l)は、ヒトメラノーマ抗原MART-Iをコードする。RNA-713(EcoR Iで線形化されたpTIT3D-MART-l)は、MART-1のアンチセンス配列に相応し、RNA497(Bgl IIで線形化されたpCMV-hTLR3)は、hTLR3の部分的5’断片をコードする。RNA分子の配列は、以下のとおりである:
RNA-I866:
ggaauucucaacacaacauauacaaaacaaacgaaucucaagcaaucaagcauucuacuucuauugcagcaauuuaaaucauuucuuuuaaagcaaaagcaauuuucugaaaauuuucaccauuuacgaacgauagccauggaagacgccaaaaacauaaagaaaggcccggcgccauucuauccucuagaggauggaaccgcuggagagcaacugcauaaggcuaugaagagauacgcccugguuccuggaacaauugcuuuuacagaugcacauaucgaggugaacaucacguacgcggaauacuucgaaauguccguucgguuggcagaagcuaugaaacgauaugggcugaauacaaaucacagaaucgucguaugcagugaaaacucucuucaauucuuuaugccgguguugggcgcguuauuuaucggaguugcaguugcgcccgcgaacgacauuuauaaugaacgugaauugcucaacaguaugaacauuucgcagccuaccguaguguuuguuuccaaaaagggguugcaaaaaauuuugaacgugcaaaaaaaauuaccaauaauccagaaaauuauuaucauggauucuaaaacggauuaccagggauuucagucgauguacacguucgucacaucucaucuaccucccgguuuuaaugaauacgauuuuguaccagaguccuuugaucgugacaaaacaauugcacugauaaugaauuccucuggaucuacuggguuaccuaaggguguggcccuuccgcauagaacugccugcgucagauucucgcaugccagagauccuauuuuuggcaaucaaaucauuccggauacugcgauuuuaaguguuguuccauuccaucacgguuuuggaauguuuacuacacucggauauuugauauguggauuucgagucgucuuaauguauagauuugaagaagagcuguuuuuacgaucccuucaggauuacaaaauucaaagugcguugcuaguaccaacccuauuuucauucuucgccaaaagcacucugauugacaaauacgauuuaucuaauuuacacgaaauugcuucugggggcgcaccucuuucgaaagaagucggggaagcgguugcaaaacgcuuccaucuuccagggauacgacaaggauaugggcucacugagacuacaucagcuauucugauuacacccgagggggaugauaaaccgggcgcggucgguaaaguuguuccauuuuuugaagcgaagguuguggaucuggauaccgggaaaacgcugggcguuaaucagagaggcgaauuaugugucagaggaccuaugauuauguccgguuauguaaacaauccggaagcgaccaacgccuugauugacaaggauggauggcuacauucuggagacauagcuuacugggacgaagacgaacacuucuucauaguugaccgcuugaagucuuuaauuaaauacaaaggauaucagguggcccccgcugaauuggaaucgauauuguuacaacaccccaacaucuucgacgcgggcguggcaggucuucccgacgaugacgccggugaacuucccgccgccguuguuguuuuggagcacggaaagacgaugacggaaaaagagaucguggauuacguggccagucaaguaacaaccgcgaaaaaguugcgcggaggaguuguguuuguggacgaaguaccgaaaggucuuaccggaaaacucgacgcaagaaaaaucagagagauccucauaaaggccaagaagggcggaaaguccaaauuguaaaauguaacucuagaggauccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaca(配列番号1)。
(インビトロで転写されるRNA)
インビトロでの転写アッセイ(MessageMachineキットおよびMegaScriptキット; Ambion,)を用いて、以下の長いRNAを、説明される通りT7 RNAポリメラーゼ(RNAP)によって生じた(Kariko et al, 1998, Phosphate-enhanced transfection of cationic lipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta 1369, 320-334)(注記:テンプレートの名称は、カッコの中に示されており、RNAの名称中の数は長さを指定する):RNA-1866(Nde Iで線形化されたpTEVluc)は、ホタルルシフェラーゼをコードし、50nt長のポリA末端である。RNA-1571(Ssp Iで線形化されたpSVren)は、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする。RNA-730(Hind IIIで線形化されたpT7T3D-MART-l)は、ヒトメラノーマ抗原MART-Iをコードする。RNA-713(EcoR Iで線形化されたpTIT3D-MART-l)は、MART-1のアンチセンス配列に相応し、RNA497(Bgl IIで線形化されたpCMV-hTLR3)は、hTLR3の部分的5’断片をコードする。RNA分子の配列は、以下のとおりである:
RNA-I866:
ggaauucucaacacaacauauacaaaacaaacgaaucucaagcaaucaagcauucuacuucuauugcagcaauuuaaaucauuucuuuuaaagcaaaagcaauuuucugaaaauuuucaccauuuacgaacgauagccauggaagacgccaaaaacauaaagaaaggcccggcgccauucuauccucuagaggauggaaccgcuggagagcaacugcauaaggcuaugaagagauacgcccugguuccuggaacaauugcuuuuacagaugcacauaucgaggugaacaucacguacgcggaauacuucgaaauguccguucgguuggcagaagcuaugaaacgauaugggcugaauacaaaucacagaaucgucguaugcagugaaaacucucuucaauucuuuaugccgguguugggcgcguuauuuaucggaguugcaguugcgcccgcgaacgacauuuauaaugaacgugaauugcucaacaguaugaacauuucgcagccuaccguaguguuuguuuccaaaaagggguugcaaaaaauuuugaacgugcaaaaaaaauuaccaauaauccagaaaauuauuaucauggauucuaaaacggauuaccagggauuucagucgauguacacguucgucacaucucaucuaccucccgguuuuaaugaauacgauuuuguaccagaguccuuugaucgugacaaaacaauugcacugauaaugaauuccucuggaucuacuggguuaccuaaggguguggcccuuccgcauagaacugccugcgucagauucucgcaugccagagauccuauuuuuggcaaucaaaucauuccggauacugcgauuuuaaguguuguuccauuccaucacgguuuuggaauguuuacuacacucggauauuugauauguggauuucgagucgucuuaauguauagauuugaagaagagcuguuuuuacgaucccuucaggauuacaaaauucaaagugcguugcuaguaccaacccuauuuucauucuucgccaaaagcacucugauugacaaauacgauuuaucuaauuuacacgaaauugcuucugggggcgcaccucuuucgaaagaagucggggaagcgguugcaaaacgcuuccaucuuccagggauacgacaaggauaugggcucacugagacuacaucagcuauucugauuacacccgagggggaugauaaaccgggcgcggucgguaaaguuguuccauuuuuugaagcgaagguuguggaucuggauaccgggaaaacgcugggcguuaaucagagaggcgaauuaugugucagaggaccuaugauuauguccgguuauguaaacaauccggaagcgaccaacgccuugauugacaaggauggauggcuacauucuggagacauagcuuacugggacgaagacgaacacuucuucauaguugaccgcuugaagucuuuaauuaaauacaaaggauaucagguggcccccgcugaauuggaaucgauauuguuacaacaccccaacaucuucgacgcgggcguggcaggucuucccgacgaugacgccggugaacuucccgccgccguuguuguuuuggagcacggaaagacgaugacggaaaaagagaucguggauuacguggccagucaaguaacaaccgcgaaaaaguugcgcggaggaguuguguuuguggacgaaguaccgaaaggucuuaccggaaaacucgacgcaagaaaaaucagagagauccucauaaaggccaagaagggcggaaaguccaaauuguaaaauguaacucuagaggauccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaca(配列番号1)。
RNA-1571:
ggcuagccaccaugacuucgaaaguuuaugauccagaacaaaggaaacggaugauaacugguccgcaguggugggccagauguaaacaaaugaauguucuugauucauuuauuaauuauuaugauucagaaaaacaugcagaaaaugcuguuauuuuuuuacaugguaacgcggccucuucuuauuuauggcgacauguugugccacauauugagccaguagcgcgguguauuauaccagaccuuauugguaugggcaaaucaggcaaaucugguaaugguucuuauagguuacuugaucauuacaaauaucuuacugcaugguuugaacuucuuaauuuaccaaagaagaucauuuuugucggccaugauuggggugcuuguuuggcauuucauuauagcuaugagcaucaagauaagaucaaagcaauaguucacgcugaaaguguaguagaugugauugaaucaugggaugaauggccugauauugaagaagauauugcguugaucaaaucugaagaaggagaaaaaaugguuuuggagaauaacuucuucguggaaaccauguugccaucaaaaaucaugagaaaguuagaaccagaagaauuugcagcauaucuugaaccauucaaagagaaaggugaaguucgucguccaacauuaucauggccucgugaaaucccguuaguaaaaggugguaaaccugacguuguacaaauuguuaggaauuauaaugcuuaucuacgugcaagugaugauuuaccaaaaauguuuauugaaucggacccaggauucuuuuccaaugcuauuguugaaggugccaagaaguuuccuaauacugaauuugucaaaguaaaaggucuucauuuuucgcaagaagaugcaccugaugaaaugggaaaauauaucaaaucguucguugagcgaguucucaaaaaugaacaaaugucgacgggggccccuaggaauuuuuuagggaagaucuggccuuccuacaagggaaggccagggaauuuucuucagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcuucaggucugggguagagacaacaacucccccucagaagcaggagccgauagacaaggaacuguauccuuuaacuucccucagaucacucuuuggcaacgaccccucgucacaauaaagauaggggggcaacuaaagggaucggccgcuucgagcagacaugauaagauacauugaugaguuuggacaaaccacaacuagaaugcagugaaaaaaaugcuuuauuugugaaauuugugaugcuauugcuuuauuuguaaccauuauaagcugcaauaaacaaguuaacaacaacaauugcauucauuuuauguuucagguucagggggaggugugggagguuuuuuaaagcaaguaaaaccucuacaaaugugguaaaaucgauaaguuuaaacagauccagguggcacuuuucggggaaaugugcgcggaaccccuauuuguuuauuuuucuaaauacauucaaauauguauccgcucaugagacaauaacccugauaaaugcuucaauaau(配列番号2)。
ggcuagccaccaugacuucgaaaguuuaugauccagaacaaaggaaacggaugauaacugguccgcaguggugggccagauguaaacaaaugaauguucuugauucauuuauuaauuauuaugauucagaaaaacaugcagaaaaugcuguuauuuuuuuacaugguaacgcggccucuucuuauuuauggcgacauguugugccacauauugagccaguagcgcgguguauuauaccagaccuuauugguaugggcaaaucaggcaaaucugguaaugguucuuauagguuacuugaucauuacaaauaucuuacugcaugguuugaacuucuuaauuuaccaaagaagaucauuuuugucggccaugauuggggugcuuguuuggcauuucauuauagcuaugagcaucaagauaagaucaaagcaauaguucacgcugaaaguguaguagaugugauugaaucaugggaugaauggccugauauugaagaagauauugcguugaucaaaucugaagaaggagaaaaaaugguuuuggagaauaacuucuucguggaaaccauguugccaucaaaaaucaugagaaaguuagaaccagaagaauuugcagcauaucuugaaccauucaaagagaaaggugaaguucgucguccaacauuaucauggccucgugaaaucccguuaguaaaaggugguaaaccugacguuguacaaauuguuaggaauuauaaugcuuaucuacgugcaagugaugauuuaccaaaaauguuuauugaaucggacccaggauucuuuuccaaugcuauuguugaaggugccaagaaguuuccuaauacugaauuugucaaaguaaaaggucuucauuuuucgcaagaagaugcaccugaugaaaugggaaaauauaucaaaucguucguugagcgaguucucaaaaaugaacaaaugucgacgggggccccuaggaauuuuuuagggaagaucuggccuuccuacaagggaaggccagggaauuuucuucagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcuucaggucugggguagagacaacaacucccccucagaagcaggagccgauagacaaggaacuguauccuuuaacuucccucagaucacucuuuggcaacgaccccucgucacaauaaagauaggggggcaacuaaagggaucggccgcuucgagcagacaugauaagauacauugaugaguuuggacaaaccacaacuagaaugcagugaaaaaaaugcuuuauuugugaaauuugugaugcuauugcuuuauuuguaaccauuauaagcugcaauaaacaaguuaacaacaacaauugcauucauuuuauguuucagguucagggggaggugugggagguuuuuuaaagcaaguaaaaccucuacaaaugugguaaaaucgauaaguuuaaacagauccagguggcacuuuucggggaaaugugcgcggaaccccuauuuguuuauuuuucuaaauacauucaaauauguauccgcucaugagacaauaacccugauaaaugcuucaauaau(配列番号2)。
RNA-730:
Gggaauuuggcccucgaggccaagaauucggcacgaggcacgcggccagccagcagacagaggacucucauuaaggaagguguccugugcccugacccuacaagaugccaagagaagaugcucacuucaucuaugguuaccccaagaaggggcacggccacucuuacaccacggcugaagaggccgcugggaucggcauccugacagugauccugggagucuuacugcucaucggcuguugguauuguagaagacgaaauggauacagagccuugauggauaaaagucuucauguuggcacucaaugugccuuaacaagaagaugcccacaagaaggguuugaucaucgggacagcaaagugucucuucaagagaaaaacugugaaccugugguucccaaugcuccaccugcuuaugagaaacucucugcagaacagucaccaccaccuuauucaccuuaagagccagcgagacaccugagacaugcugaaauuauuucucucacacuuuugcuugaauuuaauacagacaucuaauguucuccuuuggaaugguguaggaaaaaugcaagccaucucuaauaauaagucaguguuaaaauuuuaguagguccgcuagcaguacuaaucaugugaggaaaugaugagaaauauuaaauugggaaaacuccaucaauaaauguugcaaugcaugauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacugcggccgca(配列番号3)。
Gggaauuuggcccucgaggccaagaauucggcacgaggcacgcggccagccagcagacagaggacucucauuaaggaagguguccugugcccugacccuacaagaugccaagagaagaugcucacuucaucuaugguuaccccaagaaggggcacggccacucuuacaccacggcugaagaggccgcugggaucggcauccugacagugauccugggagucuuacugcucaucggcuguugguauuguagaagacgaaauggauacagagccuugauggauaaaagucuucauguuggcacucaaugugccuuaacaagaagaugcccacaagaaggguuugaucaucgggacagcaaagugucucuucaagagaaaaacugugaaccugugguucccaaugcuccaccugcuuaugagaaacucucugcagaacagucaccaccaccuuauucaccuuaagagccagcgagacaccugagacaugcugaaauuauuucucucacacuuuugcuugaauuuaauacagacaucuaauguucuccuuuggaaugguguaggaaaaaugcaagccaucucuaauaauaagucaguguuaaaauuuuaguagguccgcuagcaguacuaaucaugugaggaaaugaugagaaauauuaaauugggaaaacuccaucaauaaauguugcaaugcaugauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacugcggccgca(配列番号3)。
RNA-713
Gggaauaagcuugcggccgcaguuuuuuuuuuuuuuuuuuuuaucaugcauugcaacauuuauugauggaguuuucccaauuuaauauuucucaucauuuccucacaugauuaguacugcuagcggaccuacuaaaauuuuaacacugacuuauuauuagagauggcuugcauuuuuccuacaccauuccaaaggagaacauuagaugucuguauaaauucaagcaaaagugugagagaaauaauuucagcaugucucaggugucucgcuggcucuuaaggugaauaaggugguggugacuguucugcagagaguuucucauaagcagguggagcauugggaaccacagguucacaguuuuucucuugaagagacacuuugcugucccgaugaucaaacccuucuugugggcaucuucuuguuaaggcacauugagugccaacaugaagacuuuuauccaucaaggcucuguauccauuucgucuucuacaauaccaacagccgaugagcaguaagacucccaggaucacugucaggaugccgaucccagcggccucuucagccgugguguaagaguggccgugccccuucuugggguaaccauagaugaagugagcaucuucucuuggcaucuuguagggucagggcacaggacaccuuccuuaaugagaguccucugucugcuggcuggccgcgugccucgugccgaauu(配列番号4)。
Gggaauaagcuugcggccgcaguuuuuuuuuuuuuuuuuuuuaucaugcauugcaacauuuauugauggaguuuucccaauuuaauauuucucaucauuuccucacaugauuaguacugcuagcggaccuacuaaaauuuuaacacugacuuauuauuagagauggcuugcauuuuuccuacaccauuccaaaggagaacauuagaugucuguauaaauucaagcaaaagugugagagaaauaauuucagcaugucucaggugucucgcuggcucuuaaggugaauaaggugguggugacuguucugcagagaguuucucauaagcagguggagcauugggaaccacagguucacaguuuuucucuugaagagacacuuugcugucccgaugaucaaacccuucuugugggcaucuucuuguuaaggcacauugagugccaacaugaagacuuuuauccaucaaggcucuguauccauuucgucuucuacaauaccaacagccgaugagcaguaagacucccaggaucacugucaggaugccgaucccagcggccucuucagccgugguguaagaguggccgugccccuucuugggguaaccauagaugaagugagcaucuucucuuggcaucuuguagggucagggcacaggacaccuuccuuaaugagaguccucugucugcuggcuggccgcgugccucgugccgaauu(配列番号4)。
RNA-497:
Gggagacccaagcuggcuagcagucauccaacagaaucaugagacagacuuugccuuguaucuacuuuugggggggccuuuugcccuuugggaugcugugugcauccuccaccaccaagugcacuguuagccaugaaguugcugacugcagccaccugaaguugacucagguacccgaugaucuacccacaaacauaacaguguugaaccuuacccauaaucaacucagaagauuaccagccgccaacuucacaagguauagccagcuaacuagcuuggauguaggauuuaacaccaucucaaaacuggagccagaauugugccagaaacuucccauguuaaaaguuuugaaccuccagcacaaugagcuaucucaacuuucugauaaaaccuuugccuucugcacgaauuugacugaacuccaucucauguccaacucaauccagaaaauuaaaaauaaucccuuugucaagcagaagaauuuaaucacauua(配列番号5)。
Gggagacccaagcuggcuagcagucauccaacagaaucaugagacagacuuugccuuguaucuacuuuugggggggccuuuugcccuuugggaugcugugugcauccuccaccaccaagugcacuguuagccaugaaguugcugacugcagccaccugaaguugacucagguacccgaugaucuacccacaaacauaacaguguugaaccuuacccauaaucaacucagaagauuaccagccgccaacuucacaagguauagccagcuaacuagcuuggauguaggauuuaacaccaucucaaaacuggagccagaauugugccagaaacuucccauguuaaaaguuuugaaccuccagcacaaugagcuaucucaacuuucugauaaaaccuuugccuucugcacgaauuugacugaacuccaucucauguccaacucaauccagaaaauuaaaaauaaucccuuugucaagcagaagaauuuaaucacauua(配列番号5)。
修飾されたRNAを得るために、転写反応を、塩基性NTPのうちの1(または2)と、修飾されたヌクレオチド5-メチルシチジン、5-メチルウリジン、2-チオウリジン、N6-メチルアデノシン、またはプソイドウリジンの対応する三リン酸誘導体(複数可)との置き換えで組み立てた(TriLink, San Diego, CA)。各転写反応において、4のヌクレオチドすべてまたはそれらの誘導体は、7.5ミリモル濃度(mM)の濃度で存在した。選択された実験において、示されるように、6mMのm7GpppGキャップアナログ(New England BioLabs, Beverly, MA)もキャッピングされたRNAを得るために含まれた。ORN5およびORN6を、DNAオリゴデオキシヌクレオチドテンプレートおよびT7 RNAP(Silencer(登録商標)siRNA構築キット, Ambion)を用いて生じた。
(結果)
免疫原性に及ぼすヌクレオシド修飾の効果をさらに試験するために、インビトロでの系を、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを用いたRNA分子を製造するために開発した。4つのヌクレオチド三リン酸(NTP)のうちの1つまたは2つを、対応するヌクレオシド修飾されたNTPと置換するインビトロでの転写反応を実施した。長さ0.7~1.9kbに及びかつ修飾されたヌクレオシドのうちの0、1つ、または2つの種類のいずれかを含有する異なる一次配列を有するいくつかのRNAセットを転写した。修飾されたRNAは、変性ゲル電気泳動法における該RNAの移動度に関して該RNAの修飾されていない対応物とは区別できず、該RNAが、無傷であり、それ以外は修飾されていないことを示した(図7のA)。この手順は、T7、SP6、およびT3ファージポリメラーゼのうちのいずれかと効率よく作用し、それゆえ、広範な種々のRNAポリメラーゼに汎化可能である。
免疫原性に及ぼすヌクレオシド修飾の効果をさらに試験するために、インビトロでの系を、プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを用いたRNA分子を製造するために開発した。4つのヌクレオチド三リン酸(NTP)のうちの1つまたは2つを、対応するヌクレオシド修飾されたNTPと置換するインビトロでの転写反応を実施した。長さ0.7~1.9kbに及びかつ修飾されたヌクレオシドのうちの0、1つ、または2つの種類のいずれかを含有する異なる一次配列を有するいくつかのRNAセットを転写した。修飾されたRNAは、変性ゲル電気泳動法における該RNAの移動度に関して該RNAの修飾されていない対応物とは区別できず、該RNAが、無傷であり、それ以外は修飾されていないことを示した(図7のA)。この手順は、T7、SP6、およびT3ファージポリメラーゼのうちのいずれかと効率よく作用し、それゆえ、広範な種々のRNAポリメラーゼに汎化可能である。
これらの発見は、修飾されたヌクレオシドを用いたRNA分子の製造のための新規のインビトロでの系を提供する。
(実施例6 インビトロで転写されるRNAはヒトTLR3を刺激し、ヌクレオシド修飾は、RNAの免疫原性を低下させる:材料および実験方法)
すべてがTLR3特異的siRNAを発現する親293、293-hTLR7、および293-hTLR8細胞を、96ウェルプレートに播種し(5×104個/ウェル)、抗生物質なしで培養した。翌日、細胞をR-848または、Lipofectin(登録商標)(Invitrogen)と複合体形成したRNAに、説明されている通り曝露した(Kariko et al, 1998,同書)。RNAを1時間後に除去し、細胞をさらに完全培地において7時間インキュベートした。上清をIL-8測定のために回収した。
すべてがTLR3特異的siRNAを発現する親293、293-hTLR7、および293-hTLR8細胞を、96ウェルプレートに播種し(5×104個/ウェル)、抗生物質なしで培養した。翌日、細胞をR-848または、Lipofectin(登録商標)(Invitrogen)と複合体形成したRNAに、説明されている通り曝露した(Kariko et al, 1998,同書)。RNAを1時間後に除去し、細胞をさらに完全培地において7時間インキュベートした。上清をIL-8測定のために回収した。
(結果)
ヌクレオシドの修飾が、TLRのRNA仲介性活性化に影響するかどうかを決定するために、ヒトTLR3を発現するよう、ヒト胚性腎293細胞を安定して形質転換した。該細胞株を、Lipofectin(登録商標)と複合体形成したRNAで処理し、TLR活性化をインターロイキン(IL)-8放出によって10に示されるようにモニターした。いくつかの異なるRNA分子を試験した。修飾されていないインビトロで転写されるRNAは、高レベルのIL-8分泌を誘発した。しかし、対照的に、m6Aまたはs2Uヌクレオシド修飾を含有するRNAは、検出可能なIL-8分泌を誘導しなかった(図7のB)。試験した他のヌクレオシド修飾(すなわち、m5C、m5U、Ψ、およびm5C/Ψ)は、TLR3刺激に及ぼすより小さな抑制効果を有した(図7のB)。「Ψ」はプソイドウリジンを指す。
ヌクレオシドの修飾が、TLRのRNA仲介性活性化に影響するかどうかを決定するために、ヒトTLR3を発現するよう、ヒト胚性腎293細胞を安定して形質転換した。該細胞株を、Lipofectin(登録商標)と複合体形成したRNAで処理し、TLR活性化をインターロイキン(IL)-8放出によって10に示されるようにモニターした。いくつかの異なるRNA分子を試験した。修飾されていないインビトロで転写されるRNAは、高レベルのIL-8分泌を誘発した。しかし、対照的に、m6Aまたはs2Uヌクレオシド修飾を含有するRNAは、検出可能なIL-8分泌を誘導しなかった(図7のB)。試験した他のヌクレオシド修飾(すなわち、m5C、m5U、Ψ、およびm5C/Ψ)は、TLR3刺激に及ぼすより小さな抑制効果を有した(図7のB)。「Ψ」はプソイドウリジンを指す。
したがって、m5C、m5U、Ψ、およびm5C/Ψ等のヌクレオシド修飾は、TLR3シグナル伝達によって仲介されるように、RNAの免疫原性を低下させる。
(実施例7 インビトロで転写されるRNAはヒトTLR7およびTLR8を刺激し、ヌクレオシド修飾は、RNAの免疫原性を低下させる。)
293が、特異的TLR受容体に及ぼすRNAの効果を評価することに干渉する内在性TLR3を発現する可能性を試験するために、TLR3特異的低分子ヘアピン型(sh)RNA(siRNAとしても公知)を発現するプラスミドを細胞に安定して形質移入することによって、内在性TLR3の発現を293-TLR8細胞株から除去した。この細胞株は、ポリ(I):(C)、LPS、およびCpG含有オリゴデオキシヌクレオシド(ODN)に応答せず、TLR3、TLR4、およびTLR9の不在を示したが、ヒトTLR8の同族リガンドであるR-848に応答した(図7のB)ので、さらなる試験に用いた。TLR3の標的にされたshRNAを発現する293-hTLR8細胞(293-hTLR8 shRNA-TLR3細胞)に、インビトロで転写されるRNAを形質移入すると、該細胞は、多量のIL-8を分泌した。対照的に、ヌクレオシド修飾(m5C、m5U、Ψ、およびm5C/Ψ、S2U)のほとんどを含有するRNAは、刺激を除去した(陰性対照、すなわち空ベクター以下のIL-8産生)。m6A修飾は、様々な効果を有し、いくつかの場合、IL-8放出を除去し、他の場合、IL-8放出を低下させた(図7のB)。
293が、特異的TLR受容体に及ぼすRNAの効果を評価することに干渉する内在性TLR3を発現する可能性を試験するために、TLR3特異的低分子ヘアピン型(sh)RNA(siRNAとしても公知)を発現するプラスミドを細胞に安定して形質移入することによって、内在性TLR3の発現を293-TLR8細胞株から除去した。この細胞株は、ポリ(I):(C)、LPS、およびCpG含有オリゴデオキシヌクレオシド(ODN)に応答せず、TLR3、TLR4、およびTLR9の不在を示したが、ヒトTLR8の同族リガンドであるR-848に応答した(図7のB)ので、さらなる試験に用いた。TLR3の標的にされたshRNAを発現する293-hTLR8細胞(293-hTLR8 shRNA-TLR3細胞)に、インビトロで転写されるRNAを形質移入すると、該細胞は、多量のIL-8を分泌した。対照的に、ヌクレオシド修飾(m5C、m5U、Ψ、およびm5C/Ψ、S2U)のほとんどを含有するRNAは、刺激を除去した(陰性対照、すなわち空ベクター以下のIL-8産生)。m6A修飾は、様々な効果を有し、いくつかの場合、IL-8放出を除去し、他の場合、IL-8放出を低下させた(図7のB)。
本実施例および先行実施例の結果は、(a)天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有するRNA(すなわち、インビトロで転写されるRNA)が、ヒトTLR3、TLR7、およびTLR8を刺激し、(b)m6A、m5C、m5U、s2U、およびΨ等のヌクレオシド修飾は、単独でおよび組み合わせで、TLR3、TLR7、およびTLR8シグナル伝達によって仲介されるRNAの免疫原性を低下させることを示す。加えて、これらの結果は、特異的TLR受容体によるシグナル伝達を研究するための新規の系を提供する。
(実施例8 ヌクレオシド修飾は、TLR7およびTLR8シグナル伝達によって仲介されるRNAの免疫原性を低下させる。)
次のセットの実験は、TLR3、TLR7、およびTLR8を刺激する天然源から単離されたRNAの能力を試験した。異なる哺乳類種由来のRNAを先行実施例において説明されたTLR3、TLR7、およびTLR8を発現する293細胞株に形質移入した。哺乳類RNA試料のうちのいずれも、陰性対照レベルを上回るIL-8分泌を誘導しなかった。対照的に、2つの異なる大腸菌源から得られた細菌全RNAは、TLR8、TLR7、およびTLR8を形質移入した細胞において頑強なIL-8分泌を誘導したが、TLR9ではそうではなかった(図7のC)。LPSもメチル化されていないDNA(CpG ODN)(細菌RNA単離物における潜在的な夾雑物)も、試験されたTLR3、TLR7、またはTLR8を活性化しなかった。ヒト血小板から単離されたミトコンドリアRNAは、ヒトTLR8を刺激したが、TLR3もTLR7も刺激しなかった。
次のセットの実験は、TLR3、TLR7、およびTLR8を刺激する天然源から単離されたRNAの能力を試験した。異なる哺乳類種由来のRNAを先行実施例において説明されたTLR3、TLR7、およびTLR8を発現する293細胞株に形質移入した。哺乳類RNA試料のうちのいずれも、陰性対照レベルを上回るIL-8分泌を誘導しなかった。対照的に、2つの異なる大腸菌源から得られた細菌全RNAは、TLR8、TLR7、およびTLR8を形質移入した細胞において頑強なIL-8分泌を誘導したが、TLR9ではそうではなかった(図7のC)。LPSもメチル化されていないDNA(CpG ODN)(細菌RNA単離物における潜在的な夾雑物)も、試験されたTLR3、TLR7、またはTLR8を活性化しなかった。ヒト血小板から単離されたミトコンドリアRNAは、ヒトTLR8を刺激したが、TLR3もTLR7も刺激しなかった。
これらの結果は、修飾されていないインビトロで転写され、細菌性であるRNAが、TLR3、TLR7、およびTLR8の活性化因子であり、かつミトコンドリアRNAがTLR8を刺激することを示す。加えて、これらの結果は、RNAのヌクレオシド修飾が、TLR3、TLR7、およびTLR8を刺激するその能力を低下させるという発見を確認する。
(実施例9 ヌクレオシド修飾は、サイトカイン分泌およびDCによる活性化マーカー発現を誘導するRNAの能力を低下させる。)
(材料および実験方法)
(DC刺激アッセイ)
RNAを伴う20時間のインキュベーションの後、DCをCD83-フィコエリトリンmAb(Research Diagnostics Inc, Flanders, NJ)、HLA-DR-Cy5PE、およびCD80もしくはCD86-フルオレセインイソチオシアナートmAbで染色し、CellQuest(登録商標)ソフトウェアを用いるFACScalibur(登録商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)において分析した。細胞培養上清を20時間のインキュベーションの終了時に採集し、サイトカインELISAに供した。IL-12(p70)(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)、IFN-α、およびTNF-α(Biosource International, Camarillo, CA)のレベルを、ELISAによって上清中で測定した。培養を三つ組または四つ組で実施し、各試料を二つ組で測定した。
(材料および実験方法)
(DC刺激アッセイ)
RNAを伴う20時間のインキュベーションの後、DCをCD83-フィコエリトリンmAb(Research Diagnostics Inc, Flanders, NJ)、HLA-DR-Cy5PE、およびCD80もしくはCD86-フルオレセインイソチオシアナートmAbで染色し、CellQuest(登録商標)ソフトウェアを用いるFACScalibur(登録商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)において分析した。細胞培養上清を20時間のインキュベーションの終了時に採集し、サイトカインELISAに供した。IL-12(p70)(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)、IFN-α、およびTNF-α(Biosource International, Camarillo, CA)のレベルを、ELISAによって上清中で測定した。培養を三つ組または四つ組で実施し、各試料を二つ組で測定した。
(結果)
次の実験は、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオシドを含有するRNAが、サイトカインを産生するMDDCを刺激する能力を試験した。ヌクレオシド修飾は、5RNAが、GM-CSF/IL-4を生じるMDDCおよび(GMCSF)/IFN-αを生じるMDDCの両方によるTNF-αおよびIL-12分泌を誘導する能力を、たいていの場合、陰性対照以下のレベルに再現可能に低下させる(図8のAおよびB)。結果は、同じ塩基修飾を有するが、異なる一次配列および長さを有する他のセットのRNAが試験される場合、あるいはRNAが5’キャップ構造および/もしくは3’末端ポリA末端を添加することによって、または5’三リン酸部分を除去することによってさらに修飾される場合、類似していた。異なる長さおよび配列のRNAは、DCから変動する量のTNF-αを誘導し、典型的には2倍未満の差であった(図8のC)。
次の実験は、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオシドを含有するRNAが、サイトカインを産生するMDDCを刺激する能力を試験した。ヌクレオシド修飾は、5RNAが、GM-CSF/IL-4を生じるMDDCおよび(GMCSF)/IFN-αを生じるMDDCの両方によるTNF-αおよびIL-12分泌を誘導する能力を、たいていの場合、陰性対照以下のレベルに再現可能に低下させる(図8のAおよびB)。結果は、同じ塩基修飾を有するが、異なる一次配列および長さを有する他のセットのRNAが試験される場合、あるいはRNAが5’キャップ構造および/もしくは3’末端ポリA末端を添加することによって、または5’三リン酸部分を除去することによってさらに修飾される場合、類似していた。異なる長さおよび配列のRNAは、DCから変動する量のTNF-αを誘導し、典型的には2倍未満の差であった(図8のC)。
次に、前記アッセイを、一次DC1およびDC2に関して実施した。一次単球様(DCI、BDCA1+)および形質細胞様(DC2、BDCA4+)DCを、末梢血から精製した。両細胞種類は、R-848に曝露するとTNF-αを産生したが、DC1のみが、非常に低レベルでポリ(I):(C)に応答し、DC2におけるTLR3活性の不在を示した。インビトロでの転写産物の形質移入は、DC1およびDC2の両方においてTNF-αの分泌を誘導したのに対し、m5U、Ψ、またはs2Uにより修飾された転写産物は、刺激性ではなかった(図8のD)。サイトカインを生じるDCとは対照的に、RNAのm5Cおよびm6A修飾は、一次DC1およびDC2におけるその刺激性能力を低下させなかった。単一の種類の修飾を有するRNA分子(m6A+Ψ)は、強力なサイトカイン誘導因子であった。したがって、ウリジン修飾は、初代DCにおけるインシスのRNA分子に及ぼす優性抑制効果を発揮した。これらの結果は、試験したすべてのドナーの間で一致した。
これらの発見は、インビトロで転写されるRNAが、DCによるサイトカイン産生を刺激することを示す。加えて、DC2がTLR3もTLR8も発現せず、かつRNAのm5Cおよびm6A修飾がTLR7に関するその刺激能力を低下させたので、これらの発見は、一次DCが、m5Cおよびm6Aにより修飾されたRNAを認識し、かつそのシグナル伝達がU残基の修飾によって阻害されるさらなるRNAシグナル伝達実体を有することを示す。
さらなる免疫原性表示因子として、CD80、CD83、CD86およびMHCクラスII分子の細胞表面発現、ならびにTNF-αの分泌を、RNA-1571およびその修飾されたバージョンで処理したMDDCのFACS分析によって測定した。プソイドウリジンおよび修飾されたヌクレオシド(m5C、m6A、s2U、およびm6A/Ψ)は、これらのマーカーを低下させ(図9)、先行知見を確認した。
要約すると、DCを成熟するように誘導して、サイトカインを分泌させるRNAの能力は、DCのサブタイプに、およびRNA中に存在するヌクレオシド修飾の特徴に依存する。増大する量の修飾は、RNAの免疫原性を低下させる。
(実施例10 RNA仲介性免疫刺激の抑制は、RNA中に存在する修飾されたヌクレオシドの数に比例する。)
(材料および実験方法)
(ヒトDC)
サイトカインを生じるDCのために、単球を不連続Percoll勾配遠心法によって末梢血単核球から精製した。低密度画分(単球が豊富)を、CD2、CD16、CD19、およびCD56に特異的な磁気ビーズ(Dynal, Lake Success, NY)を用いて、B細胞、T細胞、およびNK細胞から枯渇させ、抗CD14(95%超)または抗CD11c(98%超)モノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによって決定されるように、高度に精製された単球を生じた。
(材料および実験方法)
(ヒトDC)
サイトカインを生じるDCのために、単球を不連続Percoll勾配遠心法によって末梢血単核球から精製した。低密度画分(単球が豊富)を、CD2、CD16、CD19、およびCD56に特異的な磁気ビーズ(Dynal, Lake Success, NY)を用いて、B細胞、T細胞、およびNK細胞から枯渇させ、抗CD14(95%超)または抗CD11c(98%超)モノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによって決定されるように、高度に精製された単球を生じた。
未熟なDCを生じるために、単球由来のDC(MDDC)の作製のために、説明された通り(Weissman, D et al, 2000. J Immunol 165: 4710-4717)、精製された単球を、AIM V培地(Invitrogen)におけるGM-CSF(50ng/mL)+IL-4(100ng/mL)(R & D Systems, Minneapolism
MN)を補充したAIM V無血清培地(Life Technologies)において培養した。また、DCを、GM-CSF(50ng/mL)+IFN-α(1,000V/mL)による処置(R & D Systems)によって生じさせ、IFN-αMDDCを得た(Santini et al., 2000. Type I interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity in vitro and in Hu
-PBL-SCID mice. J Exp Med 191: 1777-178)。
MN)を補充したAIM V無血清培地(Life Technologies)において培養した。また、DCを、GM-CSF(50ng/mL)+IFN-α(1,000V/mL)による処置(R & D Systems)によって生じさせ、IFN-αMDDCを得た(Santini et al., 2000. Type I interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity in vitro and in Hu
-PBL-SCID mice. J Exp Med 191: 1777-178)。
一次骨髄DCおよび形質細胞様DC(DC1およびDC2)を、BDCA-lおよびBDCA-4細胞単離キット(Miltenyi Biotec Auburn, CA)をそれぞれ用いて、末梢血から得た。
(結果)
これまで、利用されたヌクレオシドにより修飾されたRNAのほとんどは、RNAにおける全ヌクレオチドのおよそ25%を生じる修飾のうちの1種類を含有した(例えば、すべてウリジン塩基)。本明細書で利用される条件下で免疫原性を低下させるのに十分である特定の修飾されたヌクレオシドの最小頻度を規定するために、制限された数の修飾されたヌクレオシドを有するRNA分子を生じさせた。第一のセットの実験において、RNAを、m6A、Ψ(プソイドウリジン)、またはm5Cとそれらの対応する修飾されていないNTPとの変動する比の存在下で、インビトロで転写した。修飾されたヌクレオシドリン酸のRNAへの組み込み量は、転写反応において含有される比と比例することが期待され、なぜなら、T7 RNAPで得られたRNA収量は、該酵素が、m6A、Ψ、またはm5CのNTPを、塩基性NTPとほぼ同程度効率的に利用することを示したからである。この期待を確認するために、50:50の比におけるUTP:Ψの存在下で転写されたRNAを消化し、ほぼ50:50の比でUMPおよびΨを含有することを発見した(図10のA)。
これまで、利用されたヌクレオシドにより修飾されたRNAのほとんどは、RNAにおける全ヌクレオチドのおよそ25%を生じる修飾のうちの1種類を含有した(例えば、すべてウリジン塩基)。本明細書で利用される条件下で免疫原性を低下させるのに十分である特定の修飾されたヌクレオシドの最小頻度を規定するために、制限された数の修飾されたヌクレオシドを有するRNA分子を生じさせた。第一のセットの実験において、RNAを、m6A、Ψ(プソイドウリジン)、またはm5Cとそれらの対応する修飾されていないNTPとの変動する比の存在下で、インビトロで転写した。修飾されたヌクレオシドリン酸のRNAへの組み込み量は、転写反応において含有される比と比例することが期待され、なぜなら、T7 RNAPで得られたRNA収量は、該酵素が、m6A、Ψ、またはm5CのNTPを、塩基性NTPとほぼ同程度効率的に利用することを示したからである。この期待を確認するために、50:50の比におけるUTP:Ψの存在下で転写されたRNAを消化し、ほぼ50:50の比でUMPおよびΨを含有することを発見した(図10のA)。
修飾されたヌクレオシド含有量の増加するRNA分子をMDDCへと形質移入し、TNF-α分泌を評価した。各修飾(m6A、Ψ、およびm5C)は、修飾された塩基の各分に比例してTNF-α分泌を阻害した。最少量の試験された修飾された塩基(0.2~0.4%、1571nt分子あたり3~6の修飾されたヌクレオシドに相応)でさえ、サイトカイン分泌を測定可能に阻害するのに十分であった(図10のB)。1.7~3.2%の修飾されたヌクレオシドレベルのRNA(分子あたり14~29修飾)は、TNF-α発現の誘導における50%低下を呈した、TLRを発現する293細胞において、より高い割合(2.5%)の修飾されたヌクレオシド含有量は、RNA仲介性シグナル伝達事象を阻害するのに必要であった。
したがって、プソイドウリジンおよび修飾されたヌクレオシドは、少量の各分の残基として存在する場合でさえ、RNA分子の免疫原性を低下させる。
追加的な実験において、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する21マーのオリゴリボヌクレオチド(ORN)を合成し、この中で、修飾されたヌクレオシド(m5C、Ψ、または2’-O-メチル-U[Um])を、特定の位置において置換した(図11のA)。修飾されていないORNがTNF-α分泌を誘導したのに対し、この効果は、単一のヌクレオシド修飾の存在によって消滅した(図11のB)。類似の結果は、TLR3を標的とするsiRNAを発現するTLR-7およびTLR-8で形質転換された293細胞を用いて得られた。
先の結果は、先の21マーのORN(ORN1)および31マーのインビトロで合成された転写産物(ORN5およびORN6)の両方を用いるノザンブロットアッセイによって、MDDCにおけるTNF-αmRNAレベルを測定することによって確認された。該シグナルを増幅するために、選択されたmRNAの分解を遮断するシクロヘキシミドをいくつかの試料に、図に示されるように添加した。修飾されていないODNは、TNF-αmRNAレベルを増大させたのに対し、単一の修飾されたヌクレオシドを含有するORNは、有意により低い刺激性であり、ORN2-Umは、TNF-α産生の最大の低下を呈した(図11のC)。類似の結果は、マウスマクロファージ様RAW細胞において、およびヒトDCにおいて観察された。
要約すると、試験された修飾物の各々(m6A、m5C、m5U、s2U、Ψ、および2’-O-メチル)は、残基の小さな割合として存在する場合でさえ、RNA仲介性免疫刺激を抑制した。さらなる抑制は、修飾されたヌクレオシドの比が増大する場合に観察された。
(実施例11 RNAのプソイドウリジン修飾は、インビボでのその免疫原性を低下させる。)
RNAのインビボでの免疫原性に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、0.25μgのRNAをLipofectin(登録商標)に複合体形成し、マウスに気管内注射し、マウスから24時間後に採血し、TNF-αおよびIFN-αの循環レベルを血清試料からアッセイした。キャッピングされたプソイドウリジンにより修飾されたmRNAは、修飾されていないmRNAによって誘発されるよりも有意により少ないTNF-αおよびIFN-αmRNAを誘導した(図12のA~B)。
RNAのインビボでの免疫原性に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、0.25μgのRNAをLipofectin(登録商標)に複合体形成し、マウスに気管内注射し、マウスから24時間後に採血し、TNF-αおよびIFN-αの循環レベルを血清試料からアッセイした。キャッピングされたプソイドウリジンにより修飾されたmRNAは、修飾されていないmRNAによって誘発されるよりも有意により少ないTNF-αおよびIFN-αmRNAを誘導した(図12のA~B)。
これらの結果は、プソイドウリジンにより修飾されたmRNAが、修飾されていないRNAよりもインビボで有意により小さな免疫原性であるというさらなる証拠を提供する。
(実施例12 プソイドウリジン含有RNAは、PRKを活性化させる能力の低下を呈する。)
(材料および実験方法)
(PKRリン酸化アッセイ)
一定分量の活性化型PKRアガロース(Upstate)をマグネシウム/ATPカクテル(Upstate)、キナーゼ緩衝液、および[γ32P]ATP混合物、およびRNA分子の存在下で30℃で30分間インキュベートした。修飾されていないRNAおよびヌクレオシド修飾を有するRNA(m5C、プソイドウリジン、m6A、m5U)ならびに二本鎖RNAを試験した。ヒト組換えeIF2a(BioSource)を添加し、試料をさらに30℃で5分間インキュベートした。反応を、還元剤を有するNuPage
LDS試料緩衝液を添加することによって停止し、70℃で10分間変性させ、10%PAGEにおいて分析した。ゲルを乾燥させ、フィルムに露光した。PKR活性化因子であるヘパリン(1U/μL)を陽性対照として用いた。
(材料および実験方法)
(PKRリン酸化アッセイ)
一定分量の活性化型PKRアガロース(Upstate)をマグネシウム/ATPカクテル(Upstate)、キナーゼ緩衝液、および[γ32P]ATP混合物、およびRNA分子の存在下で30℃で30分間インキュベートした。修飾されていないRNAおよびヌクレオシド修飾を有するRNA(m5C、プソイドウリジン、m6A、m5U)ならびに二本鎖RNAを試験した。ヒト組換えeIF2a(BioSource)を添加し、試料をさらに30℃で5分間インキュベートした。反応を、還元剤を有するNuPage
LDS試料緩衝液を添加することによって停止し、70℃で10分間変性させ、10%PAGEにおいて分析した。ゲルを乾燥させ、フィルムに露光した。PKR活性化因子であるヘパリン(1U/μL)を陽性対照として用いた。
(結果)
プソイドウリジン含有mRNAが、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)を活性化させるかどうかを決定するために、インビトロでのリン酸化アッセイを、組換えヒトPKRおよびその基質であるeIF2α(真核生物翻訳開始因子2α)を用いて、ウミシイタケをコードするキャッピングされたmRNA(0.5および0.05ng/μL)の存在下で実施した。プソイドウリジン(Ψ)を含有するmRNAは、PKRの自己リン酸化およびeIF2αのリン酸化の両方の欠失によって検出されるように、PKRを活性化しなかったのに対し、ヌクレオシド修飾を有さないRNAおよびm5C修飾を有するmRNAはPKRを活性化した(図13)。したがって、プソイドウリジン修飾は、RNA免疫原性を低下させる。
プソイドウリジン含有mRNAが、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)を活性化させるかどうかを決定するために、インビトロでのリン酸化アッセイを、組換えヒトPKRおよびその基質であるeIF2α(真核生物翻訳開始因子2α)を用いて、ウミシイタケをコードするキャッピングされたmRNA(0.5および0.05ng/μL)の存在下で実施した。プソイドウリジン(Ψ)を含有するmRNAは、PKRの自己リン酸化およびeIF2αのリン酸化の両方の欠失によって検出されるように、PKRを活性化しなかったのに対し、ヌクレオシド修飾を有さないRNAおよびm5C修飾を有するmRNAはPKRを活性化した(図13)。したがって、プソイドウリジン修飾は、RNA免疫原性を低下させる。
(実施例13 プソイドウリジンおよびm5Cを含有するRNAからのタンパク質のインビトロでの翻訳の亢進)
(材料および実験方法)
(ウサギ網状赤血球溶解産物におけるmRNAのインビトロでの翻訳)
インビトロでの翻訳を、ウサギ網状赤血球溶解産物において実施した(Promega, Madison WI)。9μLの一定分量の溶解産物に1μL(1μg)のmRNAを補充し、30℃で60分間インキュベートした。1μLの一定分量をホタルおよびウミシイタケアッセイ系(Promega, Madison WI)、ならびにLUMAT LB950ルミノメーター(Berthold/EG&G Wallac, Gaithersburg, MD)を用いた10秒間の測定時間の分析のために取り出した。
(材料および実験方法)
(ウサギ網状赤血球溶解産物におけるmRNAのインビトロでの翻訳)
インビトロでの翻訳を、ウサギ網状赤血球溶解産物において実施した(Promega, Madison WI)。9μLの一定分量の溶解産物に1μL(1μg)のmRNAを補充し、30℃で60分間インキュベートした。1μLの一定分量をホタルおよびウミシイタケアッセイ系(Promega, Madison WI)、ならびにLUMAT LB950ルミノメーター(Berthold/EG&G Wallac, Gaithersburg, MD)を用いた10秒間の測定時間の分析のために取り出した。
(結果)
RNA翻訳効率に及ぼすプソイドウリジン修飾のインビトロでの効果を決定するためにホタルルシフェラーゼをコードしプソイドウリジンで修飾されたキャッピングされていないmRNA(0.1μg/μL)をウサギ網状赤血球溶解産物において30℃で1時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を決定した。プソイドウリジンを含有するmRNAを、ウサギ網状赤血球溶解産物におけるプソイドウリジンを有さないRNAよりも2倍超効率的に翻訳したが、コムギ抽出物においても大腸菌溶解産物においてもそうならず(図14)、プソイドウリジン修飾が、RNA翻訳効率を高めることを示した。類似の結果を、m5Cにより修飾されたRNAを用いて得た。ポリA末端をプソイドウリジン含有mRNAに付加すると、翻訳効率のさらに10倍の増加を観察した(実施例10)。
RNA翻訳効率に及ぼすプソイドウリジン修飾のインビトロでの効果を決定するためにホタルルシフェラーゼをコードしプソイドウリジンで修飾されたキャッピングされていないmRNA(0.1μg/μL)をウサギ網状赤血球溶解産物において30℃で1時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を決定した。プソイドウリジンを含有するmRNAを、ウサギ網状赤血球溶解産物におけるプソイドウリジンを有さないRNAよりも2倍超効率的に翻訳したが、コムギ抽出物においても大腸菌溶解産物においてもそうならず(図14)、プソイドウリジン修飾が、RNA翻訳効率を高めることを示した。類似の結果を、m5Cにより修飾されたRNAを用いて得た。ポリA末端をプソイドウリジン含有mRNAに付加すると、翻訳効率のさらに10倍の増加を観察した(実施例10)。
したがって、プソイドウリジンおよびm5Cによる修飾は、RNA翻訳効率を高め、プソイドウリジン含有mRNAへのポリA末端の付加は、翻訳効率をさらに高める。
(実施例14 培養細胞におけるプソイドウリジン含有RNAからのタンパク質の翻訳の亢進)
(材料および実験方法)
(細胞における翻訳アッセイ)
96ウェルを有するプレートに、ウェルあたり5×104個で形質移入の1日前に播種した。Lipofectin(登録商標)-mRNA複合体を構築し、培地を除去した後に細胞単層に直接添加した(ウェルあたり50μLにおける0.2μgのmRNA‐0.8μgのリポフェクチン)。細胞を形質移入混合物とともに37℃、5%CO2インキュベーターにおいて1時間インキュベートした後、該混合物を、10%FCSを含有する新鮮なあらかじめ加温した培地と交換した後、細胞を先の実施例において説明される通り分析した。
(材料および実験方法)
(細胞における翻訳アッセイ)
96ウェルを有するプレートに、ウェルあたり5×104個で形質移入の1日前に播種した。Lipofectin(登録商標)-mRNA複合体を構築し、培地を除去した後に細胞単層に直接添加した(ウェルあたり50μLにおける0.2μgのmRNA‐0.8μgのリポフェクチン)。細胞を形質移入混合物とともに37℃、5%CO2インキュベーターにおいて1時間インキュベートした後、該混合物を、10%FCSを含有する新鮮なあらかじめ加温した培地と交換した後、細胞を先の実施例において説明される通り分析した。
(結果)
培養された細胞におけるRNA翻訳に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、293細胞に、リポータータンパク質ウミシイタケをコードするインビトロで転写されヌクレオシドで修飾され、キャッピングされたmRNAを形質移入した。細胞を形質移入の開始3時間後に溶解し、ウミシイタケのレベルを酵素アッセイによって測定した。293細胞において、プソイドウリジンによりおよびm5Cにより修飾されたDNAは、修飾されていないmRNAよりもそれぞれほぼ10倍および4倍効率的に翻訳された(図15のA)。
培養された細胞におけるRNA翻訳に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、293細胞に、リポータータンパク質ウミシイタケをコードするインビトロで転写されヌクレオシドで修飾され、キャッピングされたmRNAを形質移入した。細胞を形質移入の開始3時間後に溶解し、ウミシイタケのレベルを酵素アッセイによって測定した。293細胞において、プソイドウリジンによりおよびm5Cにより修飾されたDNAは、修飾されていないmRNAよりもそれぞれほぼ10倍および4倍効率的に翻訳された(図15のA)。
次に、本実験を、一次骨髄由来マウスDCを用いて実施し、この場合、細胞を形質移入の3時間後および8時間後に溶解した。プソイドウリジン修飾を含有するRNAは、修飾されていないRNAよりも15~30倍効率的に翻訳された(図15のB)。
類似の発現結果を、ヒトDCおよび他の一次細胞ならびに、CHO細胞およびマウスマクロファージ様RAW細胞を含む確立された細胞株を用いて得た。すべての細胞種類において、プソイドウリジン修飾は、試験された修飾の最大の亢進を生じた。
したがって、プソイドウリジン修飾は、異なる種類の専門抗原提示細胞および非専門抗原提示細胞を含む、試験されたすべての細胞種類におけるRNA翻訳効率を増大させ、プソイドウリジン修飾が、RNA翻訳の効率を高めるというさらなる証拠を提供した。
(実施例15 5’要素および3’要素は、哺乳類細胞におけるΨmRNAの翻訳を亢進する。)
プソイドウリジン修飾による翻訳の亢進に及ぼす追加的なRNA構造要素の効果を試験するために、以下の修飾、すなわち1)独特な5’非翻訳配列(TEV、キャッピング非依存性翻訳エンハンサー)、2)キャッピング、および3)ポリA末端の組み合わせを含有する、ホタルルシフェラーゼをコードする1セットのΨmRNAを合成した。ΨmRNAまたは従来のmRNAの翻訳を亢進するこれらの修飾の能力を評価した(図16のA)。これらの構造要素は、従来型およびΨmRNAの両方の翻訳効率性を追加的に亢進し、ΨmRNAは、全コンストラクトからのより多量のタンパク質製造を呈した。
プソイドウリジン修飾による翻訳の亢進に及ぼす追加的なRNA構造要素の効果を試験するために、以下の修飾、すなわち1)独特な5’非翻訳配列(TEV、キャッピング非依存性翻訳エンハンサー)、2)キャッピング、および3)ポリA末端の組み合わせを含有する、ホタルルシフェラーゼをコードする1セットのΨmRNAを合成した。ΨmRNAまたは従来のmRNAの翻訳を亢進するこれらの修飾の能力を評価した(図16のA)。これらの構造要素は、従来型およびΨmRNAの両方の翻訳効率性を追加的に亢進し、ΨmRNAは、全コンストラクトからのより多量のタンパク質製造を呈した。
次に、率的なホタルルシフェラーゼΨmRNAコンストラクトであるcapTEVlucA50(TEV、キャッピング、および伸長したポリ(A)末端を含有)からのタンパク質発現の能力を、293細胞において、24時間にわたって検査した(図16のB)。ΨmRNAは、試験された時点ごとにより多量のタンパク質を製造し、等価の従来のmRNAコンストラクトよりも持続的なルシフェラーゼ発現を与え、Ψ修飾がmRNAを安定化させることを示した。
mRNAのΨ修飾が、哺乳類細胞における翻訳効率性をインサイツで改良したかどうかを試験するために、伸長したポリA末端(An)を有するかまたは有さない、かつβ-ガラクトシダーゼ(lacZ)をコードするcaplacZ-ΨmRNAコンストラクトを生成し、これを用いて、293細胞に形質移入した。mRNA送達の24時間後、β-ガラクトシダーゼレベルの有意な増大を、X-gal可視化法によって、caplacZおよびcaplacZ-Anの両方において、対応する対照(従来型)転写産物と比較して検出した(図16のC)。この傾向は、β-ガラクトシダーゼの検出可能なレベルを発現する細胞数かまたは個々の細胞におけるシグナルの程度のいずれかを分析する場合に観察された。
(実施例13)
(プソイドウリジン含有RNAからのインビボでのタンパク質の翻訳の亢進:材料および実験方法)
(脳内RNA注射)
すべての動物手順は、実験動物の取り扱いおよび使用についてのNIHの指針に準拠し、機関の動物の取り扱いおよび使用委員会によって認可された。雄のウィスター系ラット(Charles River Laboratories, Wilmington,
MA)をペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射(60mg/体重kg)によって麻酔した。頭部を定位フレームに置き、8つの等間隔に空いた直径1.5mmのばり孔を両側に作製し(ブレグマに対する座標:前部/後部+3、0、-3、-6mm、側部±2.5mm)、硬膜を無処置のままにした。脳内注射を、大きなプローブホルダーおよび定位アームに固定された30ゲージ、1インチの滅菌針(Beckton 25 Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)を有する25μLの注射器(Hamilton, Reno, NV)を用いて実施した。注射器中の空気の空間を回避するために、針ハブに55μL複合体を充填した後、針を装着し、試料の残りを、針を通じて引き抜いた。注射深度(2mm)を、硬膜の表面に対して決定し、4μLの複合体(32ngのmRNA)を単回の急速投与注入において投与した。3時間後、ラットをハロタンで安楽死させ、脳を、冷蔵しておいたリン酸緩衝塩類溶液へと取り出した。
(プソイドウリジン含有RNAからのインビボでのタンパク質の翻訳の亢進:材料および実験方法)
(脳内RNA注射)
すべての動物手順は、実験動物の取り扱いおよび使用についてのNIHの指針に準拠し、機関の動物の取り扱いおよび使用委員会によって認可された。雄のウィスター系ラット(Charles River Laboratories, Wilmington,
MA)をペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射(60mg/体重kg)によって麻酔した。頭部を定位フレームに置き、8つの等間隔に空いた直径1.5mmのばり孔を両側に作製し(ブレグマに対する座標:前部/後部+3、0、-3、-6mm、側部±2.5mm)、硬膜を無処置のままにした。脳内注射を、大きなプローブホルダーおよび定位アームに固定された30ゲージ、1インチの滅菌針(Beckton 25 Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)を有する25μLの注射器(Hamilton, Reno, NV)を用いて実施した。注射器中の空気の空間を回避するために、針ハブに55μL複合体を充填した後、針を装着し、試料の残りを、針を通じて引き抜いた。注射深度(2mm)を、硬膜の表面に対して決定し、4μLの複合体(32ngのmRNA)を単回の急速投与注入において投与した。3時間後、ラットをハロタンで安楽死させ、脳を、冷蔵しておいたリン酸緩衝塩類溶液へと取り出した。
(マウス尾静脈へのRNAの注射)
雌のBALB/cマウス(Charles River Laboratories)の尾静脈に、60μLのLipofectin(登録商標)と複合体形成したRNA(0.26μg)を注射した(急速投与)。臓器を摘出し、微量遠心チューブにおいてルシフェラーゼまたはウミシイタケ溶解緩衝液において練和棒を用いて均質化した。均質液を遠心分離し、上清を活性について分析した。
雌のBALB/cマウス(Charles River Laboratories)の尾静脈に、60μLのLipofectin(登録商標)と複合体形成したRNA(0.26μg)を注射した(急速投与)。臓器を摘出し、微量遠心チューブにおいてルシフェラーゼまたはウミシイタケ溶解緩衝液において練和棒を用いて均質化した。均質液を遠心分離し、上清を活性について分析した。
(RNAの肺への送達)
ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(20mg/kg)を用いて、雌のBALB/cマウスを麻酔した。小さな切開を気管近くの皮膚に作製した。気管を露出させると、501-11のLipofectin(登録商標)と複合体形成したRNA(0.2μg)を肺に向かう気管の中へと点滴した。切開を閉鎖し、動物を回復させておいた。RNA送達の3時間後、マウスを頸椎脱離により屠殺し、肺を摘出し、ルシフェラーゼまたはウミシイタケ溶解緩衝液(250μL)において均質化し、活性についてアッセイした。異なるセットの動物において、血液試料(100μL/個体)を尾静脈から回収し、凝血させ、遠心分離した。血清画分を用いて、先の実施れにおいて説明したとおり、マウス特異的抗体を用いたELISAによって、TNFおよびIFNαのレベルを決定した。
ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(20mg/kg)を用いて、雌のBALB/cマウスを麻酔した。小さな切開を気管近くの皮膚に作製した。気管を露出させると、501-11のLipofectin(登録商標)と複合体形成したRNA(0.2μg)を肺に向かう気管の中へと点滴した。切開を閉鎖し、動物を回復させておいた。RNA送達の3時間後、マウスを頸椎脱離により屠殺し、肺を摘出し、ルシフェラーゼまたはウミシイタケ溶解緩衝液(250μL)において均質化し、活性についてアッセイした。異なるセットの動物において、血液試料(100μL/個体)を尾静脈から回収し、凝血させ、遠心分離した。血清画分を用いて、先の実施れにおいて説明したとおり、マウス特異的抗体を用いたELISAによって、TNFおよびIFNαのレベルを決定した。
(結果)
インビボでのRNA翻訳に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、ラット脳の各半球に、ウミシイタケをコードするキャッピングされたプソイドウリジンにより修飾されたRNAかまたは修飾されていないRNAのいずれかを注射し、RNA翻訳を測定した。プソイドウリジンにより修飾されたRNAは、修飾されていないRNAよりも有意に効率的に翻訳された(図17のA)。
インビボでのRNA翻訳に及ぼすプソイドウリジン修飾の効果を決定するために、ラット脳の各半球に、ウミシイタケをコードするキャッピングされたプソイドウリジンにより修飾されたRNAかまたは修飾されていないRNAのいずれかを注射し、RNA翻訳を測定した。プソイドウリジンにより修飾されたRNAは、修飾されていないRNAよりも有意に効率的に翻訳された(図17のA)。
次に、発現試験をマウスにおいて実施した。内在性哺乳類酵素がホタルルシフェラーゼをコードするmRNAの検出に干渉しないので、該mRNAを用いた。転写産物(修飾されていないmRNAおよびΨmRNA)をキャッピング、TEV(capTEVA50)および伸長した(-200nt)ポリ(A)末端とともに構築した。0.25μgのRNA Lipofectin(登録商標)と複合体形成したものをマウスに注射した(静脈内(i.v.)尾静脈)。ある範囲の臓器をルシフェラーゼ活性について調査し、最適な測定部位を決定した。0.3μgのcapTEVlucAnΨmRNAの投与は、脾臓において高いルシフェラーゼ発現を、骨髄において中程度の発現を誘導したが、肺、肝臓、心臓、腎臓、または脳において発現をほとんど誘導しなかった(図17のB)。その後の試験において、脾臓を試験した。
従来型およびΨmRNA(0.015mg/kg、0.3μg/個体を静脈内付与)の翻訳効率を次に、経時的な実験において比較した。ルシフェラーゼ活性は、従来型またはΨmRNAのいずれかの投与の1時間後で容易に検出可能であり、4時間後でピークになり、24時間後まで低下したが、すべての時刻において、ΨmRNAを与えられた動物において実質的により大きかった(図17のC、左のパネル)。24時間まで、ΨmRNAを注射された同bつのみが、検出可能な脾臓ルシフェラーゼ活性を示した(背景を4倍上回る)。ウミシイタケルシフェラーゼをコードするmRNA(Ψ修飾を有するまたは有さないcapRen)を、ホタルルシフェラーゼの替わりに動物に注射すると、または単離されたマウス脾細胞を培養物中のmRNAに曝露すると、発現の類似の相対的なパターン(修飾されたmRNAと修飾されていないmRNAの間)を得た。
次の実験において、0.25μgのmRNA‐Lipofectin(登録商標)をマウス肺に気管内注射によって送達した。プソイドウリジンにより修飾されたキャッピングされたRNAは、プソイドウリジン修飾を有さないキャッピングされたRNAよりも効率的に翻訳された(図17のD)。
したがって、プソイドウリジン修飾は、培養された細胞においてインビトロでのRNA翻訳効率を、およびインビボでの複数の動物モデルにおいて、および複数の投与経路によって高め、RNA翻訳の効率を高める手段としてのその広範な適用を示す。
(実施例17 プソイドウリジン修飾は、インビボでの安定性を亢進する。)
先の実施例由来の動物における注射1時間後および4時間後の脾臓RNAのノザン分析は、投与されたmRNAが、その無処置かつ部分的に分解された形態で、容易に検出可能であることを明らかにした(図17のC、右のパネル)。対照的に、24時間で、修飾されていないcapTEVlucAn mRNAは、検出レベルを下回ったのに対し、capTEVlucAnΨmRNAは、部分的に分解されたが、なおも明らかに検出可能であった。したがって、ΨmRNAは、対照のmRNAよりもインビボにおいてより安定して保存されている。
先の実施例由来の動物における注射1時間後および4時間後の脾臓RNAのノザン分析は、投与されたmRNAが、その無処置かつ部分的に分解された形態で、容易に検出可能であることを明らかにした(図17のC、右のパネル)。対照的に、24時間で、修飾されていないcapTEVlucAn mRNAは、検出レベルを下回ったのに対し、capTEVlucAnΨmRNAは、部分的に分解されたが、なおも明らかに検出可能であった。したがって、ΨmRNAは、対照のmRNAよりもインビボにおいてより安定して保存されている。
インビボでのタンパク質産生が、静脈内送達されたmRNAの濃度に定量的に依存するかどうかを試験するために、mRNAをマウスに0.015~0.150mg/kg(個体あたり0.3~3.0μgのcapTEVlucAn)で投与し、脾臓を先に説明した通り6時間後に分析した。ルシフェラーゼ
発現は、注射されたRNAの量と(図18)各濃度において定量的に相関した。
発現は、注射されたRNAの量と(図18)各濃度において定量的に相関した。
これらの発見は、実施例15の結果を確認し、ΨmRNAが、修飾されていないRNAよりも安定であることを示す。Ψ-mRNAのさらなる免疫原性は、先に本明細書に説明されたように、修飾されていないRNAよりも低かった(図12および図17のC、右のパネル)。
実施例16~17を要約すると、インビトロで観察された、従来のmRNAと比較したΨ-mRNAの3の利点(翻訳の亢進、安定性の増大、および免疫原性の低下)は、インビボでも観察される。
(実施例18 気道を介して送達されたΨmRNAは、静脈内投与されたmRNAと同様に挙動する。)
吸入によって送達されるΨmRNAの能力を試験するために、ホタルルシフェラーゼをコードするLipofectin(登録商標)とまたはPEIと複合体形成されたmRNAをマウスに気管内経路によって送達し、この中で、針を気管に配置し、mRNA溶液を肺へと噴霧した。静脈内送達と同様に、有意により大きなルシフェラーゼ発現は、修飾されていないmRNAと比較してΨmRNAを用いて観察された(図19)が、静脈内経路と比較して気管内経路を用いて有意により少量のタンパク質が産生された。気管内経路によって投与された修飾されていないmRNAは、ビヒクル対照と比較して有意により高濃度の炎症性サイトカイン(IFN-αおよびTNF-α)を伴った。
吸入によって送達されるΨmRNAの能力を試験するために、ホタルルシフェラーゼをコードするLipofectin(登録商標)とまたはPEIと複合体形成されたmRNAをマウスに気管内経路によって送達し、この中で、針を気管に配置し、mRNA溶液を肺へと噴霧した。静脈内送達と同様に、有意により大きなルシフェラーゼ発現は、修飾されていないmRNAと比較してΨmRNAを用いて観察された(図19)が、静脈内経路と比較して気管内経路を用いて有意により少量のタンパク質が産生された。気管内経路によって投与された修飾されていないmRNAは、ビヒクル対照と比較して有意により高濃度の炎症性サイトカイン(IFN-αおよびTNF-α)を伴った。
したがって、ΨmRNAは、生得的免疫応答を活性化させることなく吸入によって送達されることができる。
(実施例19 EPO-ΨmRNAの293細胞への送達)
ΨmRNAを、ヒトEPOcDNAを含有するプラスミドから作製した。0.25μgのEPO-ΨmRNAを106の培養された293細胞へと形質移入し、600mU/mL超のEPOタンパク質を産生した。したがって、本発明の修飾されたRNA分子は、組換えタンパク質を細胞に送達する上で効果的である。
ΨmRNAを、ヒトEPOcDNAを含有するプラスミドから作製した。0.25μgのEPO-ΨmRNAを106の培養された293細胞へと形質移入し、600mU/mL超のEPOタンパク質を産生した。したがって、本発明の修飾されたRNA分子は、組換えタンパク質を細胞に送達する上で効果的である。
(実施例20 EPOをコードする改良されたΨmRNAコンストラクトの調製)
(材料および実験方法)
EPOコード配列を、制限酵素技術を用いてクローン化し、2の新たなプラスミド、すなわち、pTEV-EPOおよびpT7TS-EPOを作製し、これらをEPO-ΨmRNA産生のためのテンプレートとして用いる。EPO-ΨmRNAをこれらのテンプレートから、インビトロでの転写(MessageMachine(登録商標)およびMegaScript(登録商標)キット;Ambion,)によって、ヌクレオシドを等モル濃度(7.5mM)の濃度で組み込むT7 RNAポリメラーゼ(RNAP)を用いて製造した。ヌクレオシド修飾を組み込むために、Ψ三リン酸(TriLink, San Diego, CA)は、転写反応においてUTPと置き換わる。ΨmRNAのキャッピングを確認するために、不可逆的キャッピングアナログである6mMの3’-O-Mem7GpppG(New England BioLabs, Beverly, MA)も含む。ΨmRNAは、30℃で3~24時間混合した~1.5μg/μLのRNA、5mMのATP、および60U/μLの酵母ポリ(A)ポリメラーゼ(USB, Cleveland, OH)の反応物においてポリ(A)末端化されている。ΨmRNAの質を、変性アガロースゲル電気泳動法によって評価する。3pg/mLの感度を有するLimulus Amebocyte Lysateゲル塊アッセイを用いるmRNA調製物におけるLPSについてのアッセイも実施する。
(材料および実験方法)
EPOコード配列を、制限酵素技術を用いてクローン化し、2の新たなプラスミド、すなわち、pTEV-EPOおよびpT7TS-EPOを作製し、これらをEPO-ΨmRNA産生のためのテンプレートとして用いる。EPO-ΨmRNAをこれらのテンプレートから、インビトロでの転写(MessageMachine(登録商標)およびMegaScript(登録商標)キット;Ambion,)によって、ヌクレオシドを等モル濃度(7.5mM)の濃度で組み込むT7 RNAポリメラーゼ(RNAP)を用いて製造した。ヌクレオシド修飾を組み込むために、Ψ三リン酸(TriLink, San Diego, CA)は、転写反応においてUTPと置き換わる。ΨmRNAのキャッピングを確認するために、不可逆的キャッピングアナログである6mMの3’-O-Mem7GpppG(New England BioLabs, Beverly, MA)も含む。ΨmRNAは、30℃で3~24時間混合した~1.5μg/μLのRNA、5mMのATP、および60U/μLの酵母ポリ(A)ポリメラーゼ(USB, Cleveland, OH)の反応物においてポリ(A)末端化されている。ΨmRNAの質を、変性アガロースゲル電気泳動法によって評価する。3pg/mLの感度を有するLimulus Amebocyte Lysateゲル塊アッセイを用いるmRNA調製物におけるLPSについてのアッセイも実施する。
(結果)
EPO-ΨmRNAの近位の3’非翻訳領域(3’UTR)は、遍在性タンパク質であるエリスロポエチンmRNA結合タンパク質(ERBP)との特異的な会合によってEPOmRNAを安定化させる新生EPOmRNA由来の約90nt長のピリミジンの多い安定化要素を保存する。EPO-ΨmRNAの安定性を最大化するために、2の変更をEPOプラスミドに組み込み、転写されたmRNAの安定性および翻訳効率を改良する:1)タバコエッチ病ウイルス(TEV)の5’UTR配列をEPOコード配列の上流に組み込み、pTEV-EPOを生じる。2)プラスミドpT7TS-EPOを生じ、この中で、EPOcDNAは、アフリカツメガエルβグロビンmRNAの5’および3’UTRに対応する配列によって隣接される。
EPO-ΨmRNAの近位の3’非翻訳領域(3’UTR)は、遍在性タンパク質であるエリスロポエチンmRNA結合タンパク質(ERBP)との特異的な会合によってEPOmRNAを安定化させる新生EPOmRNA由来の約90nt長のピリミジンの多い安定化要素を保存する。EPO-ΨmRNAの安定性を最大化するために、2の変更をEPOプラスミドに組み込み、転写されたmRNAの安定性および翻訳効率を改良する:1)タバコエッチ病ウイルス(TEV)の5’UTR配列をEPOコード配列の上流に組み込み、pTEV-EPOを生じる。2)プラスミドpT7TS-EPOを生じ、この中で、EPOcDNAは、アフリカツメガエルβグロビンmRNAの5’および3’UTRに対応する配列によって隣接される。
加えて、これらのプラスミドテンプレートからのΨmRNAの製造中のポリ(A)末端の長さは、ポリ(A)ポリメラーゼ反応のインキュベーション時間を延長することによって伸長する。より長いポリ(A)末端は、ΨmRNAが翻訳中に分解する速度を低下させる。
これらの改良は結果的に、インビボでの翻訳効率の亢進を生じ、最終産物の治療的用量を最小化する。
(実施例21 EPOmRNAコンストラクトからのタンパク質製造のインビトロでの分析)
(材料および実験方法)
(哺乳類細胞の調製)
ヒト胚性腎293細胞(ATCC)を、グルタミン(Invitrogen)および10%FCS(Hyclone, Odgen, UT)を補充したDMEM(完全培地)において増殖させる。白血球フェレーシス試料を、IRBの認可したプロトコールを通じてHIV非感染ボランティアから得る。DCを先に説明される通り製造し、AIM V培地(登録商標)(Invitrogen)におけるGM-CSF(50ng/mL)+IL-4(100ng/mL)(R & D Systems)とともに培養した。
(材料および実験方法)
(哺乳類細胞の調製)
ヒト胚性腎293細胞(ATCC)を、グルタミン(Invitrogen)および10%FCS(Hyclone, Odgen, UT)を補充したDMEM(完全培地)において増殖させる。白血球フェレーシス試料を、IRBの認可したプロトコールを通じてHIV非感染ボランティアから得る。DCを先に説明される通り製造し、AIM V培地(登録商標)(Invitrogen)におけるGM-CSF(50ng/mL)+IL-4(100ng/mL)(R & D Systems)とともに培養した。
マウス脾細胞およびDCを、公開された手順によって得る。簡潔には、BALB/cマウス由来の脾臓を無菌的に摘出し、完全培地中でピンセットで細かくする。組織断片を重力によって沈降させ、単一の細胞懸濁液を洗浄し、AKC溶解緩衝液(Sigma)で溶解する。マウスDCは、6~9週齢のBALB/cマウスの大腿骨および脛骨から回収された骨髄細胞に由来する。細胞を、10%FCS(Invitrogen)および50ng/mLのmuGM-CSF(R&D)を含有するDMEMにおいて培養し、7日後に使用する。
(細胞の形質移入ならびにEPOおよび炎症誘発性サイトカインの検出)
形質移入を、脾臓およびインビトロでの細胞発現のための有効な送達方法である、リン酸緩衝液の存在下でのLipofectinを用いた形質移入を実施する。EPO-ΨmRNA(0.25μg/ウェル;100,000個)を各細胞種類に三つ組で1時間添加し、上清を新鮮培地と交換する。24時間後、上清をEPO、IFN-αもしくはβ、およびTNF-αのELISA測定のために回収する。
形質移入を、脾臓およびインビトロでの細胞発現のための有効な送達方法である、リン酸緩衝液の存在下でのLipofectinを用いた形質移入を実施する。EPO-ΨmRNA(0.25μg/ウェル;100,000個)を各細胞種類に三つ組で1時間添加し、上清を新鮮培地と交換する。24時間後、上清をEPO、IFN-αもしくはβ、およびTNF-αのELISA測定のために回収する。
(結果)
ΨmRNA翻訳効率の亢進に及ぼす独特なUTRの影響を評価するために、長いポリ(A)末端を有する各改良物(5’ TEV要素、β-グロビン5’および3’UTR)を含有するまたは含有しないEPO-ΨmRNAを、インビトロでのタンパク質製造および対照としての従来のヌクレオシドを含有するEPOmRNAを用いるインビトロでの免疫活性化について試験する。各mRNAからのタンパク質製造の効率を、哺乳類細胞株(HEK293、CHO)、ヒトおよびマウス一次DC、並びに脾細胞において、各mRNAについて評価する。すべての細胞種類において製造された全EPOおよび一次細胞における免疫原性(上清と会合した炎症誘発性サイトカイン)の測定を評価する。(1つ以上の細胞種類における)高いEPO製造と低いサイトカイン誘発との最適な組み合わせを示すmRNAコンストラクトをその後の研究に用いる。EPO-ΨmRNAの5’および3’UTRならびにより長いポリ(A)末端の改良は結果的に、翻訳効率におけるおよそ2~10倍の亢進を生じる。
ΨmRNA翻訳効率の亢進に及ぼす独特なUTRの影響を評価するために、長いポリ(A)末端を有する各改良物(5’ TEV要素、β-グロビン5’および3’UTR)を含有するまたは含有しないEPO-ΨmRNAを、インビトロでのタンパク質製造および対照としての従来のヌクレオシドを含有するEPOmRNAを用いるインビトロでの免疫活性化について試験する。各mRNAからのタンパク質製造の効率を、哺乳類細胞株(HEK293、CHO)、ヒトおよびマウス一次DC、並びに脾細胞において、各mRNAについて評価する。すべての細胞種類において製造された全EPOおよび一次細胞における免疫原性(上清と会合した炎症誘発性サイトカイン)の測定を評価する。(1つ以上の細胞種類における)高いEPO製造と低いサイトカイン誘発との最適な組み合わせを示すmRNAコンストラクトをその後の研究に用いる。EPO-ΨmRNAの5’および3’UTRならびにより長いポリ(A)末端の改良は結果的に、翻訳効率におけるおよそ2~10倍の亢進を生じる。
(実施例22 EPO製造の特徴づけおよびEPO-ΨmRNAに対するインビボでの生物学的応答)
(材料および実験方法)
(EPO-ΨmRNAのマウスへの投与)
本明細書に説明される動物研究はすべて、実験動物のトリ圧秋および使用についてのNIHの指針、ならびにペンシルバニア大学の機関動物の取り扱いおよび使用委員会によって認可される。雌のBALB/cマウス(実験条件に付きn=5、6週齢、18~23g、Charles River Laboratories)を、N2OおよびO2(70:30)の混合物における3.5%ハロタンを用いて麻酔した後、ハロタンを1%に低あkさせ、麻酔を、鼻用マスクを用いて維持する。該手順を通じて、動物の体温を、37℃に加温した加温パッドを用いて維持する。EPO-ΨmRNA-リポフェクチン複合体(60μLの最終的な容積における変動する量の核酸と1μLのリポフェクチンとを混合することによって構築)を側部尾静脈に注射する。血液試料を、経時試験間、mRNA注射後3日間、1日3回、用量反応試験において1つの最適な時点で、および網状赤血球増加症についての試験において2~6日後に毎日回収する。
(材料および実験方法)
(EPO-ΨmRNAのマウスへの投与)
本明細書に説明される動物研究はすべて、実験動物のトリ圧秋および使用についてのNIHの指針、ならびにペンシルバニア大学の機関動物の取り扱いおよび使用委員会によって認可される。雌のBALB/cマウス(実験条件に付きn=5、6週齢、18~23g、Charles River Laboratories)を、N2OおよびO2(70:30)の混合物における3.5%ハロタンを用いて麻酔した後、ハロタンを1%に低あkさせ、麻酔を、鼻用マスクを用いて維持する。該手順を通じて、動物の体温を、37℃に加温した加温パッドを用いて維持する。EPO-ΨmRNA-リポフェクチン複合体(60μLの最終的な容積における変動する量の核酸と1μLのリポフェクチンとを混合することによって構築)を側部尾静脈に注射する。血液試料を、経時試験間、mRNA注射後3日間、1日3回、用量反応試験において1つの最適な時点で、および網状赤血球増加症についての試験において2~6日後に毎日回収する。
(フローサイトメトリーによる網状赤血球の決定)
血液試料を、Retic-COUNT試薬(BD Diagnostics)を用いて染色し、データ事象を、FACScanフローサイトメーターにおいて獲得する。赤血球(RBC)を、順方向および側方の散乱特性によって選択し、チアゾールオレンジの取り込みについて分析する。Retic-COUNT試薬で染色した細胞を蛍光により検出し、網状赤血球を全RBCの割合として表す。少なくとも50,000の事象を試料あたり計数する。
血液試料を、Retic-COUNT試薬(BD Diagnostics)を用いて染色し、データ事象を、FACScanフローサイトメーターにおいて獲得する。赤血球(RBC)を、順方向および側方の散乱特性によって選択し、チアゾールオレンジの取り込みについて分析する。Retic-COUNT試薬で染色した細胞を蛍光により検出し、網状赤血球を全RBCの割合として表す。少なくとも50,000の事象を試料あたり計数する。
(結果)
EPOをコードするmRNAに応答して生物学的に機能のあるヒトEPOタンパク質(hEPO)の製造を最適化するために、以下の試験を実施する:
(EPO-ΨmRNAの単回注射後のEPO製造の時間経過)
1μgのEPO-ΨmRNAの静脈内投与後、ELISAによるEPO-ΨmRNA投与1~96時間後にhEPOを連続的に測定し、血清中のEPOタンパク質の半減期を決定する。この半減期は、EPOタンパク質の半減期およびEPO-ΨmRNAの機能的半減期の両方の結果である。EPO-ΨmRNA投与後のEPOタンパク質を測定するための結果として生じる最適な時点をその後の試験に利用する。
EPOをコードするmRNAに応答して生物学的に機能のあるヒトEPOタンパク質(hEPO)の製造を最適化するために、以下の試験を実施する:
(EPO-ΨmRNAの単回注射後のEPO製造の時間経過)
1μgのEPO-ΨmRNAの静脈内投与後、ELISAによるEPO-ΨmRNA投与1~96時間後にhEPOを連続的に測定し、血清中のEPOタンパク質の半減期を決定する。この半減期は、EPOタンパク質の半減期およびEPO-ΨmRNAの機能的半減期の両方の結果である。EPO-ΨmRNA投与後のEPOタンパク質を測定するための結果として生じる最適な時点をその後の試験に利用する。
(EPO-ΨmRNAの単回注射後のEPO製造の用量反応)製造されるEPOタンパク質の量と投与されるEPO-ΨmRNAの量の間の相関を決定するために、増大する濃度のEPO-ΨmRNA(0.01~1μg/個体)を投与し、最適な時点でEPOを測定する。
(hEPO製造と網状赤血球増加症の間の関連性)EPO活性の生物学的な相関に及ぼすEPO-ΨmRNAの効果を測定するために、フローサイトメトリーを用いて、血液中の網状赤血球頻度を決定する。フローサイトメトリーは、3%未満の変動の係数を有する。マウスは、単回用量のEPO-ΨmRNAを受容し、血液をマウスから2~6日後に回収する。EPO-ΨmRNA用量と網状赤血球頻度の間の関連性を次に、最大網状赤血球増加症の時点で評価する。網状赤血球計数における少なくとも5%の増加をもたらすEPO-ΨmRNAの用量をその後の研究に用いる。概算された50mU/mLのマウスにおける血清hEPO濃度および/または概算された5%の網状赤血球頻度の増加を得る。
(実施例23 EPO-ΨmRNAに対する免疫応答のインビボでの測定)
(材料および実験方法)
(血漿中のサイトカインの検出)
リポフェクチンと複合体形成したmRNAの7回の毎日の投与の間および後の異なる時点で回収された血液から得られた血清試料を、ELISAキットを用いてマウスIFN-α、TNF-α、およびIL-12について分析する。
(材料および実験方法)
(血漿中のサイトカインの検出)
リポフェクチンと複合体形成したmRNAの7回の毎日の投与の間および後の異なる時点で回収された血液から得られた血清試料を、ELISAキットを用いてマウスIFN-α、TNF-α、およびIL-12について分析する。
(ノザンブロット分析)
脾臓から単離された一定分量の(2.0μg)のRNA試料を、1.4%のアガロースゲル電気泳動法によって分離し、帯電したメンブレンに転移させ(Schleicher
and Schuell)、MiracleHyb(登録商標)(Stratagene)においてハイブリッド形成する。メンブレンをTNF-α、下流のIFNシグナル伝達分子(例えば、IRF7、IL-12 p35およびp40、ならびにGAPDH)、ならびに免疫活性化に関する他のマーカーについて調べる。すべてのプローブの特異性を配列決定によって確認する。メンブレンを調べるために、ランダムプライム標識キット(Roche)をとともにRedivue[α-32P]dCTP(登録商標)(Amersham)を用いて、50ngのDNAを標識する。ハイブリッド形成したメンブレンを、-70℃でMS増感剤スクリーンを用いて、Kodak BioMax MSフィルムに露光する。
脾臓から単離された一定分量の(2.0μg)のRNA試料を、1.4%のアガロースゲル電気泳動法によって分離し、帯電したメンブレンに転移させ(Schleicher
and Schuell)、MiracleHyb(登録商標)(Stratagene)においてハイブリッド形成する。メンブレンをTNF-α、下流のIFNシグナル伝達分子(例えば、IRF7、IL-12 p35およびp40、ならびにGAPDH)、ならびに免疫活性化に関する他のマーカーについて調べる。すべてのプローブの特異性を配列決定によって確認する。メンブレンを調べるために、ランダムプライム標識キット(Roche)をとともにRedivue[α-32P]dCTP(登録商標)(Amersham)を用いて、50ngのDNAを標識する。ハイブリッド形成したメンブレンを、-70℃でMS増感剤スクリーンを用いて、Kodak BioMax MSフィルムに露光する。
(組織病理)
EPO-ΨmRNAで処理したマウスならびに陽性対照および陰性対照で処理したマウス由来の脾臓を収集し、固定し、切片作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色し、免疫活性化の徴候について獣医病理学者によって検討した。
EPO-ΨmRNAで処理したマウスならびに陽性対照および陰性対照で処理したマウス由来の脾臓を収集し、固定し、切片作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色し、免疫活性化の徴候について獣医病理学者によって検討した。
(結果)
本発明のRNA分子の免疫原性の低下を確認するために、マウス(n=5)は、日用量のEPO-ΨmRNAを7日間受容した後、血清サイトカイン濃度、炎症性タンパク質をコードするmRNAの脾臓発現、および病理検査によって示されるような、免疫仲介性有害事象について評価する。投与される最大用量は、先に決定されるように、3μgまたは、単回有効量の5倍である。修飾されていないmRNAおよびLipofectin(登録商標)単独をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いる。
本発明のRNA分子の免疫原性の低下を確認するために、マウス(n=5)は、日用量のEPO-ΨmRNAを7日間受容した後、血清サイトカイン濃度、炎症性タンパク質をコードするmRNAの脾臓発現、および病理検査によって示されるような、免疫仲介性有害事象について評価する。投与される最大用量は、先に決定されるように、3μgまたは、単回有効量の5倍である。修飾されていないmRNAおよびLipofectin(登録商標)単独をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いる。
これらの試験は、本発明のRNA分子の免疫原性の低下を確認する。
(実施例24)
(EPO-ΨmRNA送達方法のさらなる改良)
(ナノ粒子複合体形成)
ポリマーおよびΨmRNA溶液を混合して、複合体を形成する。種々の製剤条件を試験し最適化する:(1)22nm未満のポリエチレンイミン(PEI)/mRNA複合体を、25容積のmRNAを水中の1容積のPEIに、15分間混合せずに添加することによって作製する。(2)12×150nmの平均寸法を有する桿状ポリ-L-リシン-ポリエチレングリコール(PLL-PEG)を、9容積のmRNAを、酢酸対イオン緩衝液における1容積のCK30-PEG10kにボルテックスをかけながらの緩徐な添加によって合成する。(3)生分解性遺伝子担体ポリマーの合成のために、無水ポリアスパラギン酸コエチレングリコール(PAE)を、無水N-(ベンジルオキシカルボニル)無水L-アスパラギン酸およびエチレングリコールの開環重縮合によって合成する。次に、アスパラギン酸の枝分かれしたアミンを脱保護し、塩化水素による酸性化によってプロトン化し、mRNAと縮合する。(4)ナノ粒子の最後の発生のために、酢酸アンモニウムとしての一定分量のストックのCK30PEG10k(1.25mL;6.4mg/mL)をシリコン処理したエッペンドルフチューブに加える。次に、mRNAをCK30PEG10k(11.25mLの無RNaseH2Oにおける2.5mg)に1~2分間かけて緩徐に添加する。15分後、無RNaseH2Oにおいて1:2に希釈する。
(EPO-ΨmRNA送達方法のさらなる改良)
(ナノ粒子複合体形成)
ポリマーおよびΨmRNA溶液を混合して、複合体を形成する。種々の製剤条件を試験し最適化する:(1)22nm未満のポリエチレンイミン(PEI)/mRNA複合体を、25容積のmRNAを水中の1容積のPEIに、15分間混合せずに添加することによって作製する。(2)12×150nmの平均寸法を有する桿状ポリ-L-リシン-ポリエチレングリコール(PLL-PEG)を、9容積のmRNAを、酢酸対イオン緩衝液における1容積のCK30-PEG10kにボルテックスをかけながらの緩徐な添加によって合成する。(3)生分解性遺伝子担体ポリマーの合成のために、無水ポリアスパラギン酸コエチレングリコール(PAE)を、無水N-(ベンジルオキシカルボニル)無水L-アスパラギン酸およびエチレングリコールの開環重縮合によって合成する。次に、アスパラギン酸の枝分かれしたアミンを脱保護し、塩化水素による酸性化によってプロトン化し、mRNAと縮合する。(4)ナノ粒子の最後の発生のために、酢酸アンモニウムとしての一定分量のストックのCK30PEG10k(1.25mL;6.4mg/mL)をシリコン処理したエッペンドルフチューブに加える。次に、mRNAをCK30PEG10k(11.25mLの無RNaseH2Oにおける2.5mg)に1~2分間かけて緩徐に添加する。15分後、無RNaseH2Oにおいて1:2に希釈する。
(気管内送達)
マウスを麻酔チャンバーにおける3%ハロタン(70%N2O+30%O2)で麻酔し、鼻用円錐体を用いて操作の間、1%ハロタン(70%N2O+30%O2)で維持する。気管を露出させ、50μLのmRNA複合体を150μの気体とともに肺へと気管を通じて、27G1/2’’針を有する250μLのハミルトン注射器(Hamilton,
Reno, NV)を用いて注入する。
マウスを麻酔チャンバーにおける3%ハロタン(70%N2O+30%O2)で麻酔し、鼻用円錐体を用いて操作の間、1%ハロタン(70%N2O+30%O2)で維持する。気管を露出させ、50μLのmRNA複合体を150μの気体とともに肺へと気管を通じて、27G1/2’’針を有する250μLのハミルトン注射器(Hamilton,
Reno, NV)を用いて注入する。
(結果)
気管内(i.t.)経路を介して投与されるΨmRNAの送達および発現の効率性を改良するために、ΨmRNAをナノ粒子に封入する。ナノ粒子包装は、ポリ-L-リシンおよびポリエチレングリコールを含む化学物質を用いて、(例えば)DNAを濃縮し、核膜孔よりも小さな粒子へと該DNAを封入することを包含する。RNAを4の異なるナノ粒子製剤(PEI、PLL、PAE、およびCK30PEG10k)へと包装し、ΨmRNA送達の効率性を、ルシフェラーゼをコードするΨmRNAと比較し、(Luc-ΨmRNA)と比較する。送達動態および用量反応を次に、EPO-ΨmRNAを用いて特徴づける。
気管内(i.t.)経路を介して投与されるΨmRNAの送達および発現の効率性を改良するために、ΨmRNAをナノ粒子に封入する。ナノ粒子包装は、ポリ-L-リシンおよびポリエチレングリコールを含む化学物質を用いて、(例えば)DNAを濃縮し、核膜孔よりも小さな粒子へと該DNAを封入することを包含する。RNAを4の異なるナノ粒子製剤(PEI、PLL、PAE、およびCK30PEG10k)へと包装し、ΨmRNA送達の効率性を、ルシフェラーゼをコードするΨmRNAと比較し、(Luc-ΨmRNA)と比較する。送達動態および用量反応を次に、EPO-ΨmRNAを用いて特徴づける。
(実施例25 組換え熱ショックタンパク質をコードする修飾されたmRNAの頸動脈への送達による再狭窄の予防)
(材料および実験方法)
(実験設計)
バルーン血管形成術とほぼ同時に動脈内注射によってラットの頸動脈にRNAを投与し、その後、血流を回復させる。ラットを注射3時間後に屠殺し、頸動脈切片を摘出し、脈管内皮細胞を収集および均質化し、ルシフェラーゼ活性を先の実施例において説明される通り決定する。
(材料および実験方法)
(実験設計)
バルーン血管形成術とほぼ同時に動脈内注射によってラットの頸動脈にRNAを投与し、その後、血流を回復させる。ラットを注射3時間後に屠殺し、頸動脈切片を摘出し、脈管内皮細胞を収集および均質化し、ルシフェラーゼ活性を先の実施例において説明される通り決定する。
(結果)
ルシフェラーゼをコードする、プソイドウリジンにより修飾されたRNAを、ラット頸動脈に投与する。3時間後、RNAを送達部位で検出することができるが、隣接部位では検出できない。
ルシフェラーゼをコードする、プソイドウリジンにより修飾されたRNAを、ラット頸動脈に投与する。3時間後、RNAを送達部位で検出することができるが、隣接部位では検出できない。
次に、本プロトコールを用いて、熱ショックタンパク質、例えばHSP70、増殖因子(例えば、血小板由来増殖因子(PDGF))、血管内皮増殖因子(V-EGF)、もしくはインスリン様増殖因子(IGF)、または増殖因子のシグナル伝達を下方制御もしくは拮抗するタンパク質、をコードする修飾されたRNAの送達による、動物再狭窄モデルにおけるバルーン血管形成術後の血管の再狭窄を予防する。修飾されたRNAの投与は、再狭窄の発生率を低下させる。
(実施例26 CFTRをコードする修飾されたmRNA分子の呼吸上皮への送達による嚢胞性線維症の治療)
CFTRをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAを、実施例16において説明される通り、嚢胞性線維症動物モデルの肺に送達し、該疾患に及ぼすその効果を、Scholte BJ, et al(Animal models of cystic fibrosis. J Cyst Fibros 2004; 3 Suppl2: 183-90)またはCopreni E, et al(Lentivirus-mediated gene transfer to the respiratory epithelium: a promising approach to gene therapy of cystic fibrosis. GeneTher 2004; 11 Suppl 1: S67-75)において説明される通り評価した。RNAの投与は、嚢胞性線維症を寛解させる。
CFTRをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAを、実施例16において説明される通り、嚢胞性線維症動物モデルの肺に送達し、該疾患に及ぼすその効果を、Scholte BJ, et al(Animal models of cystic fibrosis. J Cyst Fibros 2004; 3 Suppl2: 183-90)またはCopreni E, et al(Lentivirus-mediated gene transfer to the respiratory epithelium: a promising approach to gene therapy of cystic fibrosis. GeneTher 2004; 11 Suppl 1: S67-75)において説明される通り評価した。RNAの投与は、嚢胞性線維症を寛解させる。
追加的な実験において、本発明の修飾されたmRNA分子を用いて、肺に、治療価値のある他の組換えタンパク質を、例えば、RNAを送達する吸入器を介して送達する。
(実施例27 ADAをコードする修飾されたmRNA分子の造血細胞への送達によるXLAの治療)
ADAをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAをX連鎖無ガンマグロブリン血症の造血細胞に送達し、該疾患に及ぼすその効果をTanaka M, Gunawan F, et al, Inhibition of heart transplant injury and graft coronaryartery disease after prolonged organ ischemia by selective protein kinase C regulators. J Thorac Cardiovasc Surg 2005;129(5): 1160-7またはZonta S, Lovisetto F, et al, Uretero-neocystostomy in a swine model of kidney transplantation: a new technique. J Surg Res. 2005 Apr;124(2):250-5において説明される通り評価する。
RNAの投与は、XLAを改良することが見いだされている。
ADAをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAをX連鎖無ガンマグロブリン血症の造血細胞に送達し、該疾患に及ぼすその効果をTanaka M, Gunawan F, et al, Inhibition of heart transplant injury and graft coronaryartery disease after prolonged organ ischemia by selective protein kinase C regulators. J Thorac Cardiovasc Surg 2005;129(5): 1160-7またはZonta S, Lovisetto F, et al, Uretero-neocystostomy in a swine model of kidney transplantation: a new technique. J Surg Res. 2005 Apr;124(2):250-5において説明される通り評価する。
RNAの投与は、XLAを改良することが見いだされている。
(実施例28 免疫調節性タンパク質をコードする修飾されたmRNA分子の移植片部位への送達による臓器拒絶の予防)
サイトカイン、ケモカイン、またはインターフェロンIS(例えば、IL-4、IL-13、IL-I0、またはTGF-β)をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAを、臓器移植片拒絶動物モデルの移植片部位に送達し、拒絶の発生率に及ぼすその効果をYu PW, Tabuchi R S et al, Sustained correction of B-cell development and function in a murine model of X-linked agammaglobulinemia (XLA) using retroviral-mediated gene transfer. Blood. 2004 104(5): 1281-90またはSatoh M, Mizutani A et al, X-linked immunodeficient mice spontaneously produce lupus-related anti20 RNA helicase A autoantibodies, but are resistant to pristane-induced lupus. Int Immunol 2003, 15(9):1117-24において説明される通り評価する。RNAの投与は、移植片拒絶の発生率を低下させる。
サイトカイン、ケモカイン、またはインターフェロンIS(例えば、IL-4、IL-13、IL-I0、またはTGF-β)をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAを、臓器移植片拒絶動物モデルの移植片部位に送達し、拒絶の発生率に及ぼすその効果をYu PW, Tabuchi R S et al, Sustained correction of B-cell development and function in a murine model of X-linked agammaglobulinemia (XLA) using retroviral-mediated gene transfer. Blood. 2004 104(5): 1281-90またはSatoh M, Mizutani A et al, X-linked immunodeficient mice spontaneously produce lupus-related anti20 RNA helicase A autoantibodies, but are resistant to pristane-induced lupus. Int Immunol 2003, 15(9):1117-24において説明される通り評価する。RNAの投与は、移植片拒絶の発生率を低下させる。
(実施例29 修飾されたmRNAの身体組織への送達によるニーマン・ピック病、ムコ多糖症、および他の先天性代謝障害の治療)
スフィンゴミエリナーゼをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAをニーマン・ピック病A型およびB型動物モデルの肺、脳、または他の組織に送達し、該疾患に及ぼすその効果をPassini MA, Macauley SL, et al, AAV vector-mediated correction of brain pathology in a mouse model of Niemann-Pick A disease. Mol Ther 2005;11(5): 754-62またはBuccoliero R, Ginzburg L, et al, Elevation of lung surfactant phosphatidylcholine in mouse models of Sandhoff and of Niemann-Pick A disease. J Inherit Metab Dis 2004;27(5): 641-8において説明される通り評価する。RNAの投与は、該疾患を改良することが見いだされている。
スフィンゴミエリナーゼをコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAをニーマン・ピック病A型およびB型動物モデルの肺、脳、または他の組織に送達し、該疾患に及ぼすその効果をPassini MA, Macauley SL, et al, AAV vector-mediated correction of brain pathology in a mouse model of Niemann-Pick A disease. Mol Ther 2005;11(5): 754-62またはBuccoliero R, Ginzburg L, et al, Elevation of lung surfactant phosphatidylcholine in mouse models of Sandhoff and of Niemann-Pick A disease. J Inherit Metab Dis 2004;27(5): 641-8において説明される通り評価する。RNAの投与は、該疾患を改良することが見いだされている。
α-L-イズロニダーゼ、イズロナート-2-スルファターゼ、または関連酵素をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAを、ムコ多糖症動物モデルの身体組織に送達し、該疾患に及ぼすその効果をSimonaro CM, D’Angelo M, et al, Joint and bone disease in mucopolysaccharidoses VI and VII: identification of new therapeutic targets and biomarkers using animal models. Pediatr Res 2005;57(5 Pt 1): 701-7またはMcGlynn R, Dobrenis K, et al, Differential subcellular localization of cholesterol, gangliosides, and glycosaminoglycans in murine models of mucopolysaccharide storage disorders. J Comp Neurol 2004 20;480(4): 415-26において説明される通り評価する。RNAの投与は、該疾患を寛解させる。
追加的な実験において、本発明の修飾されたmRNA分子を用いて、凝固因子を提供する(例えば、血友病者用)。追加的な実験において、本発明の修飾されたmRNA分子を用いて、ゴーシェを治療するための酸-b-グルコシダーゼを提供する。追加的な実験において、本発明の修飾されたmRNA分子を用いて、ファブリ病(Fabry’s disease)を治療するためにα-ガラクトシダーゼを提供する。追加的な実験において、本発明の修飾されたmRNA分子を用いて、感染性疾患の治療のためにサイトカインを提供する。
追加的な実験において、本発明の修飾されたmRNA分子を用いて、例えば、ABCA4、ABCD3、ACADM、AGL、AGT、ALDH4Al、ALPL、AMPD1、APOA2、AVSD1、BRCD2、C1QA、C1QB、C1QG、C8A、C8B、CACNA1S、CCV、CD3Z、CDC2L1、CHML、CHS1、CIAS1、CLCNKB、CMD1A、CMH2、CMM、COL11AI、COL8A2、COL9A2、CPT2、CRB1、CSE、CSF3R、CTPA、CTSK、DBT、DIO1、DISC1、DPYD、EKV、ENO1、ENO1P、EPB41、EPHX1、F13B、F5、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCHL、FH、FMO3、FMO4、FUCA1、FY、GALE、GBA、GFND、GJA8、GJB3、GLC3B、HF1、HMGCL、HPC1、HRD、HRPT2、HSD3B2、HSPG2、KCNQ4、KCS、KIF1B、LAMB3、LAMC2、LGMD1B、LMNA、LOR、MCKD1、MCL1、MPZ、MTHFR、MTR、MUTYH、MYOC、NB、NCF2、NEM1、NPHS2、NPPA、NRAS、NTRK1、OPTA2、PBX1、PCHC、PGD、PHA2A、PHGDH、PKLR、PKP1、PLA2G2A、PLOD、PPOX、PPT1、PRCC、PRG4、PSEN2、PTOS1、REN、RFX5、RHD、RMD1、RPE65、SCCD、SERPINC1、SJS1、SLC19A2、SLC2A1、SPG23、SPTA1、TAL1、TNFSF6、TNNT2、TPM3、TSHB、UMPK、UOX、UROD、USH2A、VMGLOM、VWS、WS2B、ABCB11、ABCG5、ABCG8、ACADL、ACP1、AGXT、AHHR、ALMS1、ALPP、ALS2、APOB、BDE、BDMR、BJS、BMPR2、CHRNA1、CMCWTD、CNGA3、COL3A1、COL4A3、COL4A4、COL6A3、CPS1、CRYGA、CRYGEP1、CYP1B1、CYP27A1、DBI、DES、DYSF、EDAR、EFEMP1、EIF2AK3、ERCC3、FSHR、GINGF、GLC1B、GPD2、GYPC、HADHA、HADHB、HOXD13、HPE2、IGKC、IHH、IRS1、ITGA6、KHK、KYNU、LCT、LHCGR、LSFC、MSH2、MSH6、NEB、NMTC、NPHP1、PAFAH1P1、PAX3、PAX8、PMS1、PNKD、PPH1、PROC、REGIA、SAG、SFTPB、SLC11A1、SLC3Al、SOS1、SPG4、SRD5A2、TCL4、TGFA、TMD、TPO、UGT1A@、UV24、WSS、XDH、ZAP70、ZFHX1B、ACAA1、AGS1、AGTR1、AHSG、AMT、ARMET、BBS3、BCHE、BCPM、BTD、CASR、CCR2、CCR5、CDL1、CMT2B、COL7A1、CP、CPO、CRY、CTNNB1、DEM、ETM1、FANCD2、F1H、FOXL2、GBE1、GLB1、GLC1C、GNAI2、GNAT1、GP9、GPX1、HGD、HRG、ITIH1、KNG、LPP、LRS1、MCCC1、MDS1、MHS4、MITF、MLH1、MYL3、MYMY、OPA1、P2RY12、PBXPI、PCCB、POU1FI、PPARG、PROS1、PTHR1、RCA1、RHO、SCA7、SCLC1、SCN5A、SI、SLC25A20、SLC2A2、TF、TGFBR2、THPO、THRB、TKT、TM4SF1、TRH、UMPS、UQCRC1、USH3A、VHL、WS2A、XPC、ZNF35、ADH1B、ADH1C、AFP、AGA、AIH2、ALB、ASMD、BFHD、CNGA1、CRBM、DCK、DSPP、DTDP2、ELONG、ENAM、ETFDH、EVC、F11、FABP2、FGA、FGB、FGFR3、FGG、FSHMD1A、GC、GNPTA、GNRHR、GYPA、HCA、HCL2、HD、HTN3、HVBS6、IDUA、IF、JPD、KIT、KLKB1、LQT4、MANBA、MLLT2、MSX1、MTP、NR3C2、PBT、PDE6B、PEE1、PITX2、PKD2、QDPR、SGCB、SLC25A4、SNCA、SOD3、STATH、TAPVR1、TYS、WBS2、WFS1、WHCR、ADAMTS2、ADRB2、AMCN、AP3BI、APC、ARSB、B4GALT7、BHR1、C6、C7、CCAL2、CKN1、CMDJ、CRHBP、CSF1R、DHFR、DIAPH1、DTR、EOS、EPD、ERVR、F12、FBN2、GDNF、GHR、GLRA1、GM2A、HEXB、HSD17B4、ITGA2、KFS、LGMD1A、LOX、LTC4S、MAN2A1、MCC、MCCC2、MSH3、MSX2、NR3C1、PCSK1、PDE6A、PFBI、RASA1、SCZD1、SDHA、SGCD、SLC22A5、SLC26A2、SLC6A3、SM1、SMA@、SMN1、SMN2、SPINK5、TCOF1、TELAB1、TGFBI、ALDH5Al、ARG1、AS、ASSP2、BCKDHB、BF、C2、C4A、CDKN1A、COL10A1、COL11A2、CYP21A2、DYX2、EJM1、ELOVL4、EPM2A、ESR1、EYA4、F13A1、FANCE、GCLC、GJA1、GLYS1、GMPR、GSE、HCR、HFE、HLA-A、HLA-DPB1、HLA-DRA、HPFH、ICS1、IDDM1、IFNGR1、IGAD1、IGF2R、ISCW、LAMA2、LAP、LCA5、LPA、MCDR1、MOCS1、MUT、MYB、NEU1、NKS1、NYS2、OA3、OODD、OFC1、PARK2、PBCA、PBCRA1、PDB1、PEX3、PEX6、PEX7、PKHD1、PLA2G7、PLG、POLH、PPAC、PSORS1、PUJO、RCD1、RDS、RHAG、RP14、RUNX2、RWS、SCA1、SCZD3、SIASD、SOD2、ST8、TAP1、TAP2、TFAP2B、TNDM、TNF、TPBG、TPMT、TULP1、WISP3、AASS、ABCB1、ABCB4、ACHE、AQP1、ASL、ASNS、AUTS1、BPGM、BRAF、C7orf2、CACNA2D1、CCM1、CD36、CFTR、CHORDOMA、CLCN1、CMH6、CMT2D、COL1A2、CRS、CYMD、DFNA5、DLD、DYT11、EEC1、ELN、ETV1、FKBP6、GCK、GHRHR、GHS、GLI3、GPDS1、GUSB、HLXB9、HOXA13、HPFH2、HRX、IAB、IMMP2L、KCNH2、LAMB1、LEP、MET、NCF1、NM、OGDH、OPN1SW、PEX1、PGAM2、PMS2、PON1、PPP1R3A、PRSS1、PTC、PTPN12、RP10、RP9、SERPINE1、SGCE、SHFM1、SHH、SLC26A3、SLC26A4、SLOS、SMAD1、TBXAS1、TWIST、ZWS1、ACHM3、ADRB3、ANKI、CA1、CA2、CCAL1、CLN8、CMT4A、CNGB3、COH1、CPP、CRH、CYP11B1、CYP11B2、DECR1、DPYS、DURS1、EBS1、ECA1、EGI、EXT1、EYA1、FGFR1、GNRH1、GSR、GULOP、HR、KCNQ3、KFM、KWE、LGCR、LPL、MCPH1、MOS、MYC、NAT1、NAT2、NBS1、PLAT、PLEC1、PRKDC、PXMP3、RP1、SCZD6、SFTPC、SGM1、SPG5A、STAR、TG、TRPS1、TTPA、VMD1、WRN、ABCA1、ABL1、ABO、ADAMTS13、AK1、ALAD、ALDH1A1、ALDOB、AMBP、AMCD1、ASS、BDMF、BSCL、C5、CDKN2A、CHAC、CLA1、CMD1B、COL5A1、CRAT、DBH、DNAI1、DYS、DYT1、ENG、FANCC、FBP1、FCMD、FRDA、GALT、GLDC、GNE、GSM1、GSN、HSD17B3、HSN1、IBM2、INVS、JBTS1、LALL、LCCS1、LCCS、LGMD2H、LMX1B、MLLT3、MROS、MSSE、NOTCH1、ORM1、PAPPA、PIP5K1B、PTCH、PTGS1、RLN1、RLN2、RMRP、ROR2、RPD1、SARDH、SPTLC1、STOM、TDFA、TEK、TMC1、TRIM32、TSC1、TYRP1、XPA、CACNB2、COLl7A1、CUBN、CXCL12、CYP17、CYP2C19、CYP2C9、EGR2、EMX2、ERCC6、FGFR2、HK1、HPSI、IL2RA、LGI1、LIPA、MAT1A、MBL2、MKI67、MXI1、NODAL、OAT、OATL3、PAX2、PCBD、PEO1、PHYH、PNL1P、PSAP、PTEN、RBP4、RDPA、RET、SFTPA1、SFTPD、SHFM3、SIAL、THC2、TLX1、TNFRSF6、UFS、UROS、AA、ABCC8、ACAT1、ALX4、AMPD3、ANC、APOA1、APOA4、APOC3、ATM、BSCL2、BWS、CALCA、CAT、CCND1、CD3E、CD3G、CD59、CDKN1C、CLN2、CNTF、CPT1A、CTSC、DDB1、DDB2、DHCR7、DLAT、DRD4、ECB2、ED4、EVR1、EXT2、F2、FSHB、FTH1、G6PT1、G6PT2、GIF、HBB、HBBP1、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、HMBS、HND、HOMG2、HRAS、HVBS1、IDDM2、IGER、INS、JBS、KCNJ11、KCNJ1、KCNQ1、LDHA、LRP5、MEN1、MLL、MYBPC3、MYO7A、NNO1、OPPG、OPTB1、PAX6、PC、PDX1、PGL2、PGR、PORC、PTH、PTS、PVRL1、PYGM、RAG1、RAG2、ROM1、RRAS2、SAA1、SCA5、SCZD2、SDHD、SERPING1、SMPD1、TCIRG1、TCL2、TECTA、TH、TREH、TSG101、TYR、USH1C、VMD2、VRN1、WT1、WT2、ZNF145、A2M、AAAS、ACADS、ACLS、ACVRL1、ALDH2、AMHR2、AOM、AQP2、ATD、ATP2A2、BDC、C1R、CD4、CDK4、CNA1、COL2A1、CYP27B1、DRPLA、ENUR2、FEOM1、FGF23、FPF、GNB3、GNS、HAL、HBP1、HMGA2、HMN2、HPD、IGF1、KCNA1、KERA、KRAS2、KRT1、KRT2A、KRT3、KRT4、KRT5、KRT6A、KRT6B、KRTHB6、LDHB、LYZ、MGCT、MPE、MVK、MYL2、OAP、PAH、PPKB、PRB3、PTPN11、PXR1、RLS、RSN、SAS、SAX1、SCA2、SCNN1A、SMAL、SPPM、SPSMA、TBX3、TBX5、TCF1、TPI1、TSC3、ULR、VDR、VWF、ATP7B、BRCA2、BRCD1、CLN5、CPB2、ED2、EDNRB、ENUR1、ERCC5、F10、F7、GJB2、GJB6、IPF1、MBS1、MCOR、NYS4、PCCA、RB1、RHOK、SCZD7、SGCG、SLC10A2、SLC25A15、STARP1、ZNFl98、ACHM1、ARVDI、BCH、CTAA1、DAD1、DFNB5、EML1、GALC、GCH1、IBGC1、IGH@、IGHCgroup、IGHG1、IGHM、IGHR、IV、LTBP2、MCOP、MJD、MNG1MPD1、MPS3C、MYH6、MYH7、NP、NPC2、PABN1、PSEN1PYGL、RPGRIP1、
SERPINA1、SERPINA3、SERPINA6、SLC7A7、SPG3A、SPTB、TCL1A、TGMI、TITF1、TMIP、TRA@、TSHR、USH1A、VP、ACCPN、AHO2、ANCR、B2M、BBS4、BLM、CAPN3、CDAN1、CDAN3、CLN6、CMH3、CYP19、CYP1A1、CYP1A2、DYX1、EPB42、ETFA、EYCL3、FAH、FBN1、FES、HCVS、HEXA、IVD、LCS1、LIPC、MYO5A、OCA2、OTSC1、PWCR、RLBP1、SLC12A1、SPG6、TPM1、UBE3A、WMS、ABCC6、ALDOA、APRT、ATP2A1、BBS2、CARD15、CATM、CDH1、CETP、CHST6、CLN3、CREBBP、CTH、CTM、CYBA、CYLD、DHS、DNASE1、DPEP1、ERCC4、FANCA、GALNS、GAN、HAGH、HBA1、HBA2、HBHR、HBQ1、HBZ、HBZP、HP、HSD11B2、IL4R、LIPB、MC2R、MEFV、MHC2TA、MLYCD、MMVP1、PHKB、PHKG2、PKD1、PKDTS、PMM2、PXE、SALL1、SCA4、SCNN1B、SCNN1G、SLC12A3、TAT、TSC2、VDI、WT3、ABR、ACACA、ACADVL、ACE、ALDH3A2、APOH、ASPA、AXIN2、BCL5、BHD、BLMH、BRCA1、CACD、CCA1、CCZS、CHRNB1、CHRNE、CMT1A、COL1A1、CORD5、CTNS、EPX、ERBB2、G6PC、GAA、GALK1、GCGR、GFAP、GH1、GH2、GP1BA、GPSC、GUCY2D、ITGA2B、ITGB3、ITGB4、KRT10、KRT12、KRT13、KRT14、KRT14L1、KRT14L2、KRT14L3、KRT16、KRT16L1、KRT16L2、KRT17、KRT9、MAPT、MDB、MDCR、MGI、MHS2、MKS1、MPO、MYO15A、NAGLU、NAPB、NF1、NME1、P4HB、PAFAH1B1、PECAM1、PEX12、PHB、PMP22、PRKAR1A、PRKCA、PRKWNK4、PRP8、PRPF8、PTLAH、RARA、RCV1、RMSA1、RP17、RSS、SCN4A、SERPINF2、SGCA、SGSH、SHBG、SLC2A4、SLC4A1、SLC6A4、SMCR、SOST、SOX9、SSTR2、SYM1、SYNS1、TCF2、THRA、TIMP2、TOC、TOP2A、TP53、TRIM37、VBCH、ATP8B1、BCL2、CNSN、CORD1、CYB5、DCC、F5F8D、FECH、PEO、LAMA3、LCFS2、MADH4、MAFD1、MC2R、MCL、MYP2、NPC1、SPPK、TGFBRE、TGIF、TTR、AD2、AMH、APOC2、APOE、ATHS、BAX、BCKDHA、BCL3、BFIC、C3、CACNA1A、CCO、CEACAM5、COMP、CRX、DBA、DDU、DFNA4、DLL3、DM1、DMWD、E11S、ELA2、EPOR、ERCC2、ETFB、EXT3、EYCL1、FTL、FUT1、FUT2、FUT6、GAMT、GCDH、GPI、GUSM、HB1、HCL1、HHC2、HHC3、ICAM3、INSR、JAK3、KLK3、LDLR、LHB、LIG1、LOH19CR1、LYL1、MAN2B1、MCOLN1、MDRV、MLLT1、NOTCH3、NPHS1、OFC3、OPA3、PEPD、PRPF31、PRTN3、PRX、PSG1、PVR、RYR1、SLC5A5、SLC7A9、STK11、TBXA2R、TGFB1、TNNI3、TYROBP、ADA、AHCY、AVP、CDAN2、CDPD1、CHED1、CHED2、CHRNA4、CST3、EDN3、EEGV1、FTLL1、GDF5、GNAS、GSS、HNF4A、JAG1、KCNQ2、MKKS、NBIA1、PCK1、PI3、PPCD、PPGB、PRNP、THBD、TOP1、AIRE、APP、CBS、COL6A1、COL6A2、CSTB、DCR、DSCR1、FPDMM、HLCS、HPE1、ITGB2、KCNE1、KNO、PRSS7、RUNX1、SOD1、TAM、ADSL、ARSA、BCR、CECR、CHEK2、COMT、CRYBB2、CSF2RB、CTHM、CYP2D6、CYP2D7P1、DGCR、DIA1、EWSR1、GGT1、MGCR、MN1、NAGA、NF2、OGS2、PDGFB、PPARA、PRODH、SCO2、SCZD4、SERPIND1、SLC5A1、SOX10、TCN2、TIMP3、TST、VCF、ABCD1、ACTL1、ADFN、AGMX2、AHDS、AIC、AIED、AIH3、ALAS2、AMCD、AMELX、ANOP1、AR、ARAF1、ARSC2、ARSE、ARTS、ARX、ASAT、ASSP5、ATP7A、ATRX、AVPR2、BFLS、BGN、BTK、BZX、C1HR、CACNA1F、CALB3、CBBM、CCT、CDR1、CFNS、CGF1、CHM、CHR39C、CIDX、CLA2、CLCN5、CLS、CMTX2、CMTX3、CND、COD1、COD2、COL4A5、COL4A6、CPX、CVD1、CYBB、DCX、DFN2、DFN4、DFN6、DHOF、DIAPH2、DKC1、DMD、DSS、DYT3、EBM、EBP、ED1、ELK1、EMD、EVR2、F8、F9、FCP1、FDPSL5、FGD1、FGS1、FMR1、FMR2、G6PD、GABRA3、GATA1、GDI1、GDXY、GJB1、GK、GLA、GPC3、GRPR、GTD、GUST、HMS1、HPRT1、HPT、HTC2、HTR2C、HYR、IDS、IHG1、IL2RG、INDX、IP1、IP2、JMS、KAL1、KFSD、L1CAM、LAMP2、MAA、MAFD2、MAOA、MAOB、MCF2、MCS、MEAX、MECP2、MF4、MGC1、MIC5、MID1、MLLT7、MLS、MRSD、MRX14、MRX1、MRX20、MRX2、MRX3、MRX40、MRXA、MSD、MTM1、MYCL2、MYP1、NDP、NHS、NPHL1、NR0B1、NSX、NYS1、NYX、OA1、OASD、OCRL、ODT1、OFD1、OPA2、OPD1、OPEM、OPN1LW、OPN1MW、OTC、P3、PDHA1、PDR、PFC、PFKFB1、PGK1、PGK1P1、PGS、PHEX、PHKA1、PHKA2、PHP、PIGA、PLP1、POF1、POLA、POU3F4、PPMX、PRD、PRPS1、PRPS2、PRS、RCCP2、RENBP、RENS1、RP2、RP6、RPGR、RPS4X、RPS6KA3、RS1、S11、SDYS、SEDL、SERPINA7、SH2D1A、SHFM2、SLC25A5、SMAX2、SRPX、SRS、STS、SYN1、SYP、TAF1、TAZ、TBX22、TDD、TFE3、THAS、THC、TIMM8A、TIMP1、TKCR、TNFSF5、UBE1、UBE2A、WAS、WSN、WTS、WWS、XIC、XIST、XK、XM、XS、ZFX、ZIC3、ZNF261、ZNF41、ZNF6、AMELY、ASSP6、AZF1、AZF2、DAZ、GCY、RPS4Y、SMCY、SRY、ZFY、ABAT、AEZ、AFA、AFD1、ASAH1、ASD1、ASMT、CCAT、CECR9、CEPA、CLA3、CLN4、CSF2RA、CTS1、DF、DIH1、DWS、DYT2、DYT4、EBR3、ECT、EEF1A1L14、EYCL2、FANCB、GCSH、GCSL、GIP、GTS、HHG、HMI、HOAC、HOKPP2、HRPT1、HSD3B3、HTC1、HV1S、ICHQ、ICR1、ICR5、IL3RA、KAL2、KMS、KRT18、KSS、LCAT、LHON、LIMM、MANBB、MCPH2、MEB、MELAS、MIC2、MPFD、MS、MSS、MTATP6、MTCO1、MTCO3、MTCYB、MTND1、MTND2、MTND4、MTND5、MTND6、MTRNR1、MTRNR2、MTTE、MTTG、MTTI、MTTK、MTTL1、MTTL2、MTTN、MTTP、MTTS1、NAMSD、OCD1、OPD2、PCK2、PCLD、PCOS1、PFKM、PKD3、PRCA1、PRO1、PROP1、RBS、RFXAP、RP、SHOX、SLC25A6、SPG5B、STO、SUOX、THM、またはTTDをコードするmRNA分子の投与によって、代謝に関する他の先天的な障害を修正する。
SERPINA1、SERPINA3、SERPINA6、SLC7A7、SPG3A、SPTB、TCL1A、TGMI、TITF1、TMIP、TRA@、TSHR、USH1A、VP、ACCPN、AHO2、ANCR、B2M、BBS4、BLM、CAPN3、CDAN1、CDAN3、CLN6、CMH3、CYP19、CYP1A1、CYP1A2、DYX1、EPB42、ETFA、EYCL3、FAH、FBN1、FES、HCVS、HEXA、IVD、LCS1、LIPC、MYO5A、OCA2、OTSC1、PWCR、RLBP1、SLC12A1、SPG6、TPM1、UBE3A、WMS、ABCC6、ALDOA、APRT、ATP2A1、BBS2、CARD15、CATM、CDH1、CETP、CHST6、CLN3、CREBBP、CTH、CTM、CYBA、CYLD、DHS、DNASE1、DPEP1、ERCC4、FANCA、GALNS、GAN、HAGH、HBA1、HBA2、HBHR、HBQ1、HBZ、HBZP、HP、HSD11B2、IL4R、LIPB、MC2R、MEFV、MHC2TA、MLYCD、MMVP1、PHKB、PHKG2、PKD1、PKDTS、PMM2、PXE、SALL1、SCA4、SCNN1B、SCNN1G、SLC12A3、TAT、TSC2、VDI、WT3、ABR、ACACA、ACADVL、ACE、ALDH3A2、APOH、ASPA、AXIN2、BCL5、BHD、BLMH、BRCA1、CACD、CCA1、CCZS、CHRNB1、CHRNE、CMT1A、COL1A1、CORD5、CTNS、EPX、ERBB2、G6PC、GAA、GALK1、GCGR、GFAP、GH1、GH2、GP1BA、GPSC、GUCY2D、ITGA2B、ITGB3、ITGB4、KRT10、KRT12、KRT13、KRT14、KRT14L1、KRT14L2、KRT14L3、KRT16、KRT16L1、KRT16L2、KRT17、KRT9、MAPT、MDB、MDCR、MGI、MHS2、MKS1、MPO、MYO15A、NAGLU、NAPB、NF1、NME1、P4HB、PAFAH1B1、PECAM1、PEX12、PHB、PMP22、PRKAR1A、PRKCA、PRKWNK4、PRP8、PRPF8、PTLAH、RARA、RCV1、RMSA1、RP17、RSS、SCN4A、SERPINF2、SGCA、SGSH、SHBG、SLC2A4、SLC4A1、SLC6A4、SMCR、SOST、SOX9、SSTR2、SYM1、SYNS1、TCF2、THRA、TIMP2、TOC、TOP2A、TP53、TRIM37、VBCH、ATP8B1、BCL2、CNSN、CORD1、CYB5、DCC、F5F8D、FECH、PEO、LAMA3、LCFS2、MADH4、MAFD1、MC2R、MCL、MYP2、NPC1、SPPK、TGFBRE、TGIF、TTR、AD2、AMH、APOC2、APOE、ATHS、BAX、BCKDHA、BCL3、BFIC、C3、CACNA1A、CCO、CEACAM5、COMP、CRX、DBA、DDU、DFNA4、DLL3、DM1、DMWD、E11S、ELA2、EPOR、ERCC2、ETFB、EXT3、EYCL1、FTL、FUT1、FUT2、FUT6、GAMT、GCDH、GPI、GUSM、HB1、HCL1、HHC2、HHC3、ICAM3、INSR、JAK3、KLK3、LDLR、LHB、LIG1、LOH19CR1、LYL1、MAN2B1、MCOLN1、MDRV、MLLT1、NOTCH3、NPHS1、OFC3、OPA3、PEPD、PRPF31、PRTN3、PRX、PSG1、PVR、RYR1、SLC5A5、SLC7A9、STK11、TBXA2R、TGFB1、TNNI3、TYROBP、ADA、AHCY、AVP、CDAN2、CDPD1、CHED1、CHED2、CHRNA4、CST3、EDN3、EEGV1、FTLL1、GDF5、GNAS、GSS、HNF4A、JAG1、KCNQ2、MKKS、NBIA1、PCK1、PI3、PPCD、PPGB、PRNP、THBD、TOP1、AIRE、APP、CBS、COL6A1、COL6A2、CSTB、DCR、DSCR1、FPDMM、HLCS、HPE1、ITGB2、KCNE1、KNO、PRSS7、RUNX1、SOD1、TAM、ADSL、ARSA、BCR、CECR、CHEK2、COMT、CRYBB2、CSF2RB、CTHM、CYP2D6、CYP2D7P1、DGCR、DIA1、EWSR1、GGT1、MGCR、MN1、NAGA、NF2、OGS2、PDGFB、PPARA、PRODH、SCO2、SCZD4、SERPIND1、SLC5A1、SOX10、TCN2、TIMP3、TST、VCF、ABCD1、ACTL1、ADFN、AGMX2、AHDS、AIC、AIED、AIH3、ALAS2、AMCD、AMELX、ANOP1、AR、ARAF1、ARSC2、ARSE、ARTS、ARX、ASAT、ASSP5、ATP7A、ATRX、AVPR2、BFLS、BGN、BTK、BZX、C1HR、CACNA1F、CALB3、CBBM、CCT、CDR1、CFNS、CGF1、CHM、CHR39C、CIDX、CLA2、CLCN5、CLS、CMTX2、CMTX3、CND、COD1、COD2、COL4A5、COL4A6、CPX、CVD1、CYBB、DCX、DFN2、DFN4、DFN6、DHOF、DIAPH2、DKC1、DMD、DSS、DYT3、EBM、EBP、ED1、ELK1、EMD、EVR2、F8、F9、FCP1、FDPSL5、FGD1、FGS1、FMR1、FMR2、G6PD、GABRA3、GATA1、GDI1、GDXY、GJB1、GK、GLA、GPC3、GRPR、GTD、GUST、HMS1、HPRT1、HPT、HTC2、HTR2C、HYR、IDS、IHG1、IL2RG、INDX、IP1、IP2、JMS、KAL1、KFSD、L1CAM、LAMP2、MAA、MAFD2、MAOA、MAOB、MCF2、MCS、MEAX、MECP2、MF4、MGC1、MIC5、MID1、MLLT7、MLS、MRSD、MRX14、MRX1、MRX20、MRX2、MRX3、MRX40、MRXA、MSD、MTM1、MYCL2、MYP1、NDP、NHS、NPHL1、NR0B1、NSX、NYS1、NYX、OA1、OASD、OCRL、ODT1、OFD1、OPA2、OPD1、OPEM、OPN1LW、OPN1MW、OTC、P3、PDHA1、PDR、PFC、PFKFB1、PGK1、PGK1P1、PGS、PHEX、PHKA1、PHKA2、PHP、PIGA、PLP1、POF1、POLA、POU3F4、PPMX、PRD、PRPS1、PRPS2、PRS、RCCP2、RENBP、RENS1、RP2、RP6、RPGR、RPS4X、RPS6KA3、RS1、S11、SDYS、SEDL、SERPINA7、SH2D1A、SHFM2、SLC25A5、SMAX2、SRPX、SRS、STS、SYN1、SYP、TAF1、TAZ、TBX22、TDD、TFE3、THAS、THC、TIMM8A、TIMP1、TKCR、TNFSF5、UBE1、UBE2A、WAS、WSN、WTS、WWS、XIC、XIST、XK、XM、XS、ZFX、ZIC3、ZNF261、ZNF41、ZNF6、AMELY、ASSP6、AZF1、AZF2、DAZ、GCY、RPS4Y、SMCY、SRY、ZFY、ABAT、AEZ、AFA、AFD1、ASAH1、ASD1、ASMT、CCAT、CECR9、CEPA、CLA3、CLN4、CSF2RA、CTS1、DF、DIH1、DWS、DYT2、DYT4、EBR3、ECT、EEF1A1L14、EYCL2、FANCB、GCSH、GCSL、GIP、GTS、HHG、HMI、HOAC、HOKPP2、HRPT1、HSD3B3、HTC1、HV1S、ICHQ、ICR1、ICR5、IL3RA、KAL2、KMS、KRT18、KSS、LCAT、LHON、LIMM、MANBB、MCPH2、MEB、MELAS、MIC2、MPFD、MS、MSS、MTATP6、MTCO1、MTCO3、MTCYB、MTND1、MTND2、MTND4、MTND5、MTND6、MTRNR1、MTRNR2、MTTE、MTTG、MTTI、MTTK、MTTL1、MTTL2、MTTN、MTTP、MTTS1、NAMSD、OCD1、OPD2、PCK2、PCLD、PCOS1、PFKM、PKD3、PRCA1、PRO1、PROP1、RBS、RFXAP、RP、SHOX、SLC25A6、SPG5B、STO、SUOX、THM、またはTTDをコードするmRNA分子の投与によって、代謝に関する他の先天的な障害を修正する。
(実施例30 iNOSをコードする修飾されたmRNA分子の身体組織への送達による血管攣縮の治療)
誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAを、血管攣縮動物モデル(例えば、くも膜下出血)の血管内皮に送達し、該疾患に及ぼすその効果を、Pradilla G, Wang PP, et al, Prevention of vasospasm by anti-CD11/CD18 monoclonal antibody therapy following subarachnoid hemorrhage in rabbits. J Neurosurg 2004;101(1): 88-92またはPark S, Yamaguchi M, et al, Neurovascular protection reduces early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Stroke 2004;35(10): 2412-7において説明される通り評価する。RNAの投与は、該疾患を寛解させる。
誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたRNAを、血管攣縮動物モデル(例えば、くも膜下出血)の血管内皮に送達し、該疾患に及ぼすその効果を、Pradilla G, Wang PP, et al, Prevention of vasospasm by anti-CD11/CD18 monoclonal antibody therapy following subarachnoid hemorrhage in rabbits. J Neurosurg 2004;101(1): 88-92またはPark S, Yamaguchi M, et al, Neurovascular protection reduces early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Stroke 2004;35(10): 2412-7において説明される通り評価する。RNAの投与は、該疾患を寛解させる。
(実施例31 免疫抑制性タンパク質をコードする修飾されたmRNAの送達による発毛の修復)
テロメラーゼまたは免疫抑制性タンパク質(例えば、α-MSH、TGF-β1、またはIGF-I)をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたmRNAを、Jiang J, Tsuboi R, et al, Topical application of ketoconazole stimulates hair growth in C3H/HeN mice. J Dermatol 2005;32(4): 243-7またはMcElwee KJ, Freyschmidt-Paul P, et al, Transfer of CD8(+) cells induces localized hair loss whereas CD4(+)/CD25(-) cells promote systemic alopecia areata and CD4(+)/CD25(+) cells blockade disease onset in the C3H/HeJ mouse model. J Invest Dermatol2005;124(5): 947-57において説明される通り評価する。RNA投与は、発毛を修復させる。
テロメラーゼまたは免疫抑制性タンパク質(例えば、α-MSH、TGF-β1、またはIGF-I)をコードするプソイドウリジンによりまたはヌクレオシドにより修飾されたmRNAを、Jiang J, Tsuboi R, et al, Topical application of ketoconazole stimulates hair growth in C3H/HeN mice. J Dermatol 2005;32(4): 243-7またはMcElwee KJ, Freyschmidt-Paul P, et al, Transfer of CD8(+) cells induces localized hair loss whereas CD4(+)/CD25(-) cells promote systemic alopecia areata and CD4(+)/CD25(+) cells blockade disease onset in the C3H/HeJ mouse model. J Invest Dermatol2005;124(5): 947-57において説明される通り評価する。RNA投与は、発毛を修復させる。
(実施例32 siRNAを含有する変化したヌクレオシドを有するインビトロで転写されるRNA分子の合成)
プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含みかつ、低分子干渉RNA(siRNA)または低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をさらに含む二本鎖RNA(dsRNA)分子を、以下の手順によって合成する:ウリジンまたは1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含有する所望の配列と相補的なRNA鎖を、実施例5において説明される通り、インビトロでの転写によって(例えば、T7、SP6、またはT3ファージRNAポリメラーゼによって)合成する。二本鎖RNA分子は、免疫原性の低下を呈する。他の実験において、二本鎖RNA分子を細胞酵素によって加工されるよう設計し、所望のsiRNAまたはshRNAを生じる。数百のヌクレオチドの二本鎖RNA分子は容易に合成されるので、また、各二本鎖RNAは、いくつかのsiRNA分子またはshRNA分子を含有して、複数のsiRNAまたはshRNAの単一の標的細胞への送達を容易にするように設計され得る。
プソイドウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含みかつ、低分子干渉RNA(siRNA)または低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をさらに含む二本鎖RNA(dsRNA)分子を、以下の手順によって合成する:ウリジンまたは1つ以上の修飾されたヌクレオシドを含有する所望の配列と相補的なRNA鎖を、実施例5において説明される通り、インビトロでの転写によって(例えば、T7、SP6、またはT3ファージRNAポリメラーゼによって)合成する。二本鎖RNA分子は、免疫原性の低下を呈する。他の実験において、二本鎖RNA分子を細胞酵素によって加工されるよう設計し、所望のsiRNAまたはshRNAを生じる。数百のヌクレオチドの二本鎖RNA分子は容易に合成されるので、また、各二本鎖RNAは、いくつかのsiRNA分子またはshRNA分子を含有して、複数のsiRNAまたはshRNAの単一の標的細胞への送達を容易にするように設計され得る。
(実施例33 siRNAを送達するための変化したヌクレオシドを有するインビトロで転写されるRNA分子の使用)
先行実施例の二本鎖RNA分子を、形質移入試薬(例えば、陽イオン性形質移入試薬、脂質系形質移入試薬、タンパク質系形質移入試薬、ポリエチレンイミン系形質移入試薬、またはリン酸カルシウム)と複合体形成させ、関心対象の標的細胞に送達する。標的細胞の表面中のまたは表面上の酵素は、二本鎖RNAを所望のsiRNA分子またはshRNA分子(いずれも複数可)に分解する。本方法は、siRNA配列またはshRNA配列(いずれも複数可)に対応する1つ以上の細胞遺伝子の転写を効果的に停止させる。
先行実施例の二本鎖RNA分子を、形質移入試薬(例えば、陽イオン性形質移入試薬、脂質系形質移入試薬、タンパク質系形質移入試薬、ポリエチレンイミン系形質移入試薬、またはリン酸カルシウム)と複合体形成させ、関心対象の標的細胞に送達する。標的細胞の表面中のまたは表面上の酵素は、二本鎖RNAを所望のsiRNA分子またはshRNA分子(いずれも複数可)に分解する。本方法は、siRNA配列またはshRNA配列(いずれも複数可)に対応する1つ以上の細胞遺伝子の転写を効果的に停止させる。
(実施例34 RNA免疫原性および翻訳効率に及ぼす追加的なヌクレオシド修飾の効果の試験)
追加のヌクレオシド修飾を、実施例5および10において先に説明された方法を用いて、インビトロで転写されるRNAへと導入し、免疫原性翻訳効率に及ぼすその効果を、実施例4~11および12~18においてそれぞれ説明される通り試験する。ある追加的な修飾は、免疫原性を低下させ、翻訳を亢進することが見いだされている。これらの修飾は、本発明の方法および組成物の追加的な実施態様である。
追加のヌクレオシド修飾を、実施例5および10において先に説明された方法を用いて、インビトロで転写されるRNAへと導入し、免疫原性翻訳効率に及ぼすその効果を、実施例4~11および12~18においてそれぞれ説明される通り試験する。ある追加的な修飾は、免疫原性を低下させ、翻訳を亢進することが見いだされている。これらの修飾は、本発明の方法および組成物の追加的な実施態様である。
試験される修飾には、例えば、mlA、m2A、Am、ms2m6A、i6A、ms2i6A、io6A、ms2i06A、g6A、t6A、ms2t6A、m6t6A、hn6A、ms2hn6A、Ar(p)、I、m1I、mlIm、m3C、Cm、S2C、ac4C、f5c、m5Cm、ac4Cm、k2c、m1G、m2G、m7G、Gm、m2
2G、m2Gm、m2
2Gm、Gr(p)、yW、o2yW、OHyW、OHyW*、imG、mimG、Q、oQ、galQ、manQ、preQ0、preQ1、G+、D、m5Um’,m1Ψ、Ψm、S4U、・m5s2U’、S2Um、’acp3U・、ho5u.、mo5U・、cmo5U・、mcmo5U、chm5U、mchm5U・、mcm5U、mcm5Um、mcm5s2U、nm5s2U、mnm5U、mnm5s2U、mnm5se2U、ncm5U、ncm5Um、cmnm5U、cmnm5Um、cmnm5s2U、m6
2A、Im、m4C、m4Cm、hm5C、m3U、m1acp3Ψ、cm5U、m6Am、m6
2Am、m2,7G、m2,2,7G、m3Um、m5D、m3Ψ、f5Cm、mlGm、mlAm、τm5U、τm5s2U、imG-14、imG2、およびac6Aが含まれる。
(実施例35~38についての材料および方法)
(RNAのHPLC精製):T7ポリメラーゼ転写によって製造されるmRNAを、アルキル化非多孔性ポリスチレン-ジビニルベンゼン(PS-DVB)コポリマーミクロスフェア(2.1μm)(21mm×100mmカラム)のカラムマトリックス、およびアセトニトリル勾配を有する酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)の緩衝液系を用いるHPLCによって精製した。緩衝液Aは、0.1MのTEAAを含有し、緩衝液Bは、0.1MのTEAAおよび25%アセトニトリルを含有した。カラムを緩衝液A中の38%緩衝液Bで平衡化し、RNAを負荷し、次に55%緩衝液Bまでの線形勾配を用いて5mL/分で30分間にわたって流した。所望のピークに対応する画分を回収した。RNA分析を同じカラムマトリックスおよび緩衝液系を用いて実施したが、1.0mL/分における7.8mm×50mmのカラムおよび25分間の勾配時間を用いた。
(RNAのHPLC精製):T7ポリメラーゼ転写によって製造されるmRNAを、アルキル化非多孔性ポリスチレン-ジビニルベンゼン(PS-DVB)コポリマーミクロスフェア(2.1μm)(21mm×100mmカラム)のカラムマトリックス、およびアセトニトリル勾配を有する酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)の緩衝液系を用いるHPLCによって精製した。緩衝液Aは、0.1MのTEAAを含有し、緩衝液Bは、0.1MのTEAAおよび25%アセトニトリルを含有した。カラムを緩衝液A中の38%緩衝液Bで平衡化し、RNAを負荷し、次に55%緩衝液Bまでの線形勾配を用いて5mL/分で30分間にわたって流した。所望のピークに対応する画分を回収した。RNA分析を同じカラムマトリックスおよび緩衝液系を用いて実施したが、1.0mL/分における7.8mm×50mmのカラムおよび25分間の勾配時間を用いた。
(カラム画分からのRNA単離):回収された画分を組み合わせ、第一のこれらのRNA含有量を、30Kメンブレン(Millipore)を有するAmicon Ultra-15遠心分離フィルターユニットを用いて濃縮した。フィルター装置に15mL試料を充填し、スウィングバケット回転機を用いるThermo Scientific Sorvall ST16R遠心分離機において、4,000×gで10分間(4℃)回転させた。これらの条件下で、約98%の溶媒容積を除去することができる。回収された画分は15mL超の容積を有すると、フィルターユニットを、追加的なカラム画分で充填し、RNAがすべて1本のチューブに収まるまで、再度遠心分離することによって再利用した。濃縮されたRNAから塩および溶媒を除去するために、ヌクレアーゼ非含有水を添加し(最大15mL)、フィルター装置を再度回転させた。「洗浄する」過程を、アセトニトリルの濃度が0.001%未満になるまで反復した。脱塩した無溶媒試料をフィルター装置から取り出し、RNAをNaOAc(0.3M、pH5.5)、イソプロパノール(1容積)、およびグリコーゲン(3μL)において-20℃で一晩沈殿させることによって回収した。沈殿したRNAを回収し、氷冷75%エタノールで2回洗浄し、水中で再構成した。
(二本鎖RNAドットブロット):RNA(25~100ng)をニトロセルロースメンブレンにブロットし、乾燥させておき、0.05%Tween-20(TBS-T)を補充したTBS緩衝液における5%無脂肪乾燥乳でブロッキングし、二本鎖RNA特異的mAb J2またはK1(English & Scientific Consulting)とともに60分間インキュベートした。メンブレンをTBS-Tで6回洗浄した後、HRP抱合型ロバ抗マウス抗体(Jackson Immunology)と反応させた。6回洗浄した後、二本鎖RNAを、SuperSignal West Pico
Chemiluminescent基質(Pierce)の添加により検出し、画像をFujifilm LAS1000デジタル画像化システムにおいて30秒間~2分間捕捉した。
Chemiluminescent基質(Pierce)の添加により検出し、画像をFujifilm LAS1000デジタル画像化システムにおいて30秒間~2分間捕捉した。
(樹状細胞の作製):単球フェレーシス試料を、IRB認可のプロトコールを通じて正常なボランティアから得た。AIM V培地(Invitrogen)において単球をGM-CSF(50ng/mL)+IL-4(100ng/mL)で7日間処置することによって、ヒトDCを製造した。3日後および6日後に、サイトカインを有する50%容積の新鮮培地を添加した。
マウスDCを、Balb/cマウスから骨髄単核細胞を単離し、マウスGM-CSF(20ng/mL、Peprotech)を補充したRPMI+10%FBS培地において培養することによって作製した。3日後および6日後に、GM-CSFを有する50%容積の新鮮培地を添加した。非接着性細胞を培養7日後に用いた。
(RNAのリポフェクチン複合体形成):ストックリン酸緩衝液を無血清DMEMに添加し、20mMリン酸カリウムおよび100ng/mLのBSA、pH6.4の終濃度を与えた。96ウェルプレートのうちの3ウェルについては、リポフェクチンと複合体形成したRNAを以下の比で調製した:2.4μLのリポフェクチンを、リン酸緩衝液を有する21.3μLの無血清DMEM培地に添加し、室温で10分間インキュベートした。次に、9.9μLの無血清DMEMにおける0.75μgのRNAを添加し、混合物を室温でさらに10分間インキュベートした。最後に、116.4mLの無血清DMEMを添加して、最終容積を150mLにした。混合物をボルテックスにかけた。
(RNAのTransIT複合体形成):96ウェルプレートの各ウェルについて、0.25μgのRNAを17.3μLの無血清DMEMに氷上で添加した。TransIT
mRNA試薬(0.3μL)をボルテックスにかけながら添加した後、0.2μLのmRNA押し上げ(boost)試薬を添加し、ボルテックスにかけた。複合体形成したRNAを形成の5分以内に添加した。
mRNA試薬(0.3μL)をボルテックスにかけながら添加した後、0.2μLのmRNA押し上げ(boost)試薬を添加し、ボルテックスにかけた。複合体形成したRNAを形成の5分以内に添加した。
(細胞の形質移入):リポフェクチンと複合体形成したRNAのために、50μL(0.25μgRNA/ウェル)をウェルあたり5×105個の細胞に直接添加した。形質移入した細胞を5%CO2インキュベーターにおいて37℃で1時間インキュベートした。リポフェクチン-RNA混合物を取り出し、200μLのあらかじめ加温しておいた血清含有培地と交換した。TransITと複合体形成したRNAについて、17μLの複合体を、200μLの血清含有培地におけるウェルあたり5×105個の細胞に添加した。形質移入の3~24時間後、細胞を特異的溶解培地において溶解し、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼ活性をルミノメーターにおいて特異的な基質を用いて測定した。
(RNA免疫原性分析):96ウェルプレートにおけるDC(マウスまたはヒト)(5×105個/ウェル)を培地、またはリポフェクチンもしくはTransITと複合体形成したRNAで処理した。上清を24時間後に収集し、分析に供した。IFN-α(TransITにより送達されるRNA)またはTNF-α(リポフェクチンにより送達されるRNA)(Biosource International, Camarillo, CA)のレベルを、ELISAによって上清中で測定した。培養を三つ組ないし四つ組で実施し、二つ組で測定した。
(実施例35)
本実施例は、Ψ、m5C、およびΨ/m5Cにより修飾されたmRNAの配列および翻訳の細胞種類依存性を、修飾されていない(U)RNAに対して検討する。示された修飾を有する、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼをコードするmRNAを、リポフェクチンと複合体形成させ、マウス樹状細胞(A)およびHEK293T細胞(B)に送達した。ヒトDCに、TransITと複合体形成した示された修飾を有する、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼをコードするmRNAを形質移入した(C)。データは、RNAの配列および該RNAを翻訳する細胞の種類に応じて、最適な修飾が変動することを示す。該データは、修飾されたヌクレオシドの組み込みによって生じた亢進が、形質移入された細胞株と比較して一次細胞について実質的に大きいことも示す。溶解した細胞における酵素活性を、特異的な基質および生じた光の測定をルミノメーターにおいて用いて測定し、修飾されていない(U)RNAと比較した倍数増加として表した。
本実施例は、Ψ、m5C、およびΨ/m5Cにより修飾されたmRNAの配列および翻訳の細胞種類依存性を、修飾されていない(U)RNAに対して検討する。示された修飾を有する、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼをコードするmRNAを、リポフェクチンと複合体形成させ、マウス樹状細胞(A)およびHEK293T細胞(B)に送達した。ヒトDCに、TransITと複合体形成した示された修飾を有する、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼをコードするmRNAを形質移入した(C)。データは、RNAの配列および該RNAを翻訳する細胞の種類に応じて、最適な修飾が変動することを示す。該データは、修飾されたヌクレオシドの組み込みによって生じた亢進が、形質移入された細胞株と比較して一次細胞について実質的に大きいことも示す。溶解した細胞における酵素活性を、特異的な基質および生じた光の測定をルミノメーターにおいて用いて測定し、修飾されていない(U)RNAと比較した倍数増加として表した。
(実施例36)
mRNAの作製に用いられるファージポリメラーゼ転写反応は、正確な大きさの多量のRNAを結果的に生じるが、夾雑物も含有する。このことは、RNAを変性条件下で大きさに基づいて分離する逆相HPLCカラムにRNAを適用することによって可視化される。Y修飾されたTEV-ルシフェラーゼ-A51 RNAをHPLCカラムに、38%緩衝液Bにおいて適用し、緩衝液Bを55%まで増大させる線形勾配に供した。特性は、期待されるよりも小さく、かつ予期される夾雑物よりも大きいことを示した。これらの結果を図22に示す。
mRNAの作製に用いられるファージポリメラーゼ転写反応は、正確な大きさの多量のRNAを結果的に生じるが、夾雑物も含有する。このことは、RNAを変性条件下で大きさに基づいて分離する逆相HPLCカラムにRNAを適用することによって可視化される。Y修飾されたTEV-ルシフェラーゼ-A51 RNAをHPLCカラムに、38%緩衝液Bにおいて適用し、緩衝液Bを55%まで増大させる線形勾配に供した。特性は、期待されるよりも小さく、かつ予期される夾雑物よりも大きいことを示した。これらの結果を図22に示す。
(実施例37)
HPLC精製は、すべての種類の修飾されたまたは修飾されていないRNAの翻訳を増加させるが、Ψ修飾されたmRNAは最良に翻訳される。本結果を図23に示す:(A)示された修飾を有しかつHPLC精製を伴うまたは伴わない、EPOをコードするmRNAを、マウスDCに送達し、上清中のEPOレベルを24時間後に測定した。m5C/Y修飾されたmRNAは、HPLC精製の前に最高レベルの翻訳を有していたが、Ψ修飾されたmRNAは、HPLC精製後に最高の翻訳レベルを有していた。(B)ヒトDCに、HPLC精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有する、ウミシイタケをコードするmRNAを形質移入した。マウスDCおよびEPOmRNAと同様に、HPLC精製後に、Y修飾されたmRNAは、最高レベルの翻訳を有していた。
HPLC精製は、すべての種類の修飾されたまたは修飾されていないRNAの翻訳を増加させるが、Ψ修飾されたmRNAは最良に翻訳される。本結果を図23に示す:(A)示された修飾を有しかつHPLC精製を伴うまたは伴わない、EPOをコードするmRNAを、マウスDCに送達し、上清中のEPOレベルを24時間後に測定した。m5C/Y修飾されたmRNAは、HPLC精製の前に最高レベルの翻訳を有していたが、Ψ修飾されたmRNAは、HPLC精製後に最高の翻訳レベルを有していた。(B)ヒトDCに、HPLC精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有する、ウミシイタケをコードするmRNAを形質移入した。マウスDCおよびEPOmRNAと同様に、HPLC精製後に、Y修飾されたmRNAは、最高レベルの翻訳を有していた。
(実施例38)
Ψ、m5C、およびΨ/m5C修飾されたmRNAは、HPLC精製を伴う対照レベルまで低下する低レベルの免疫原性を有する。本結果を図24に示す:(A)ヒトDCに、HPLC精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有するTransITと複合体形成したRNAを形質移入した。IFN-αレベルを24時間後に測定した。HPLC精製は、修飾されていないRNAの免疫原性を高め、このことは、他の修飾されていないRNAが、類似のレベルのIFN-αまたは低下したレベルを有していたので、該配列に依存している。Ψ修飾されたRNAは、対照処置されたDCと類似の、測定不可能なレベルのIFN-αを有していた。(B)HPLC精製前(-)および後のΨ修飾されたRNA(P1およびP2)を、二本鎖RNAに特異的なモノクローナル抗体によるドットブロット法を用いて、二本鎖RNAについて分析した(J2)。RNAの精製は、二本鎖RNAの夾雑物を除去した。(C)iPS因子をコードするΨ修飾されたRNAは、免疫原性であり、RNAのHPLC精製によって除去される。
Ψ、m5C、およびΨ/m5C修飾されたmRNAは、HPLC精製を伴う対照レベルまで低下する低レベルの免疫原性を有する。本結果を図24に示す:(A)ヒトDCに、HPLC精製を伴うまたは伴わない、示された修飾を有するTransITと複合体形成したRNAを形質移入した。IFN-αレベルを24時間後に測定した。HPLC精製は、修飾されていないRNAの免疫原性を高め、このことは、他の修飾されていないRNAが、類似のレベルのIFN-αまたは低下したレベルを有していたので、該配列に依存している。Ψ修飾されたRNAは、対照処置されたDCと類似の、測定不可能なレベルのIFN-αを有していた。(B)HPLC精製前(-)および後のΨ修飾されたRNA(P1およびP2)を、二本鎖RNAに特異的なモノクローナル抗体によるドットブロット法を用いて、二本鎖RNAについて分析した(J2)。RNAの精製は、二本鎖RNAの夾雑物を除去した。(C)iPS因子をコードするΨ修飾されたRNAは、免疫原性であり、RNAのHPLC精製によって除去される。
(実施例39~41についての材料および方法)
(細胞培養)新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)細胞(Invitrogen)を、ケラチノサイト増殖栄養補助剤およびペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を補充したEpiLife培地において培養した。すべての細胞を37℃および5%CO2において増殖させた。本明細書に説明される方法を用いて誘導されるヒトiPS細胞を、hESC限定マトリゲルマトリックス(BD Biosciences)で被覆した6ウェルプレートに、形質移入後に転移させた。
(細胞培養)新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)細胞(Invitrogen)を、ケラチノサイト増殖栄養補助剤およびペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を補充したEpiLife培地において培養した。すべての細胞を37℃および5%CO2において増殖させた。本明細書に説明される方法を用いて誘導されるヒトiPS細胞を、hESC限定マトリゲルマトリックス(BD Biosciences)で被覆した6ウェルプレートに、形質移入後に転移させた。
(ベクターの構築)一般的に実施例1~3と同じ。
(mRNAの製造)一般的に実施例1~3と同じ。
(mRNA精製および分析)いくつかの実験的実施態様において、mRNAをHPLCによって精製し、カラム画分を回収し、mRNA画分を「実施例35~38についての材料および方法」において説明されるように、ならびに/または図22~図24について説明されおよび示されるように、免疫原性の純度について分析した。いくつかの好ましい実験的実施態様において、免疫原性をほとんどまたは全く呈さない1つ以上の再プログラム化因子をコードするmRNAを含むかまたはそれからなる精製されたRNA調製物を、ヒト体細胞をiPS細胞に再プログラム化するための実験に用いた。
(一次ケラチノサイトの再プログラム化)HEKn細胞を、EpiLife培地において6ウェル皿の1×105個/ウェルで播種し、一晩増殖させた。細胞に等量の各プログラム化因子mRNA(KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2)、または該因子のサブセットを、TransIT(商標)mRNA形質移入試薬(MirusBio, Madison, WI)を用いて形質移入した。3回の形質移入を1日おきに、培地交換を毎日実施した。第三の形質移入の翌日、細胞をトリプシン処理し、マトリゲルで被覆した6ウェルプレートへと、mTeSR1培地(StemCell Technologies)において播種した。mTeSR細胞培地を毎日交換した。細胞を37℃、5%CO2で維持した。プレートを、倒立顕微鏡を用いて形態変化についてスクリーニングした。
HENn細胞を、等量の各再プログラム化因子mRNAを用いた電気穿孔法による単回の形質移入によっても再プログラム化した。細胞を、マトリゲルを被覆したプレートに、6ウェル皿あたり1×105個または10cm皿あたり7.5×105個の密度で、毎日交換するmTeSR1培地において直接播種した。
(免疫蛍光)一般的に実施例1~3と同じ。
(定量的RT-PCR(qPCR))細胞RNAを、標準的な方法および等量の細胞RNA由来のオリゴd(T)21プライマーを用いて逆転写した。3つのメッセージを遺伝子特異的プライマーならびに、SYBRグリーン検出およびGAPDH標準化を用いるリアルタイムPCRを用いて増幅した。発現レベルを、元のHEKn細胞株における発現レベルに関して決定し、周期閾値(CT)レベルの変化として表した。
(実施例39)
本実施例は、体細胞ケラチノサイトからのiPS細胞の作製のためのプロトコールの開発を説明する。等量(重量による)のKLF4、c-MYC、OCT4、およびSOX2のmRNAをHEKn細胞に3回(1日おきに1回)、TransIT(商標)mRNA試薬を用いて形質移入した。培地を毎日交換した。第三の形質移入の翌日、細胞をマトリゲルで被覆した皿に播種し、TeSR1細胞培地において増殖させた。第一の形質移入の11日後までに、再プログラム化した細胞の形態が現れ始めた(図28)。
本実施例は、体細胞ケラチノサイトからのiPS細胞の作製のためのプロトコールの開発を説明する。等量(重量による)のKLF4、c-MYC、OCT4、およびSOX2のmRNAをHEKn細胞に3回(1日おきに1回)、TransIT(商標)mRNA試薬を用いて形質移入した。培地を毎日交換した。第三の形質移入の翌日、細胞をマトリゲルで被覆した皿に播種し、TeSR1細胞培地において増殖させた。第一の形質移入の11日後までに、再プログラム化した細胞の形態が現れ始めた(図28)。
(実施例40)
本実施例は、等量のKLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2のmRNAを用いた一次ケラチノサイトの形質移入から結果として生じる細胞の特徴づけを説明する。100万個のHEKn細胞に5マイクログラムの各mRNAを用いて1回電気穿孔し、mTeSR1細胞培地においてマトリゲルで被覆した10cm皿へ播種した。形質移入の15日後、細胞を免疫蛍光分析のために固定した。結果として生じるコロニーは、iPSマーカーKLF4、LIN28、SSEA4、TRA-1-60、およびNANOGについて陽性であった(図29)。
本実施例は、等量のKLF4、LIN28、c-MYC、NANOG、OCT4、およびSOX2のmRNAを用いた一次ケラチノサイトの形質移入から結果として生じる細胞の特徴づけを説明する。100万個のHEKn細胞に5マイクログラムの各mRNAを用いて1回電気穿孔し、mTeSR1細胞培地においてマトリゲルで被覆した10cm皿へ播種した。形質移入の15日後、細胞を免疫蛍光分析のために固定した。結果として生じるコロニーは、iPSマーカーKLF4、LIN28、SSEA4、TRA-1-60、およびNANOGについて陽性であった(図29)。
(実施例41)
本実施例は、一次ケラチノサイトと等量のKLF4、c-MYC、OCT4、およびSOX2のmRNAを用いて再プログラム化されたケラチノサイトの間の発現の差を説明する。7.5×105のHEKn細胞に3または5マイクログラムの各mRNAを1回電気穿孔し、マトリゲルで被覆した10cm皿にmTeSR1培地中で播種した。培地を毎日交換した。形質移入の13日後、細胞を新鮮に被覆したマトリゲルプレートに転移させた。形質移入の21日後、全細胞RNAを、形質移入していないHEKn細胞および2のウェルの再プログラム化された細胞から精製した。等量の各細胞rNAをcDNAに変換し、qPCRによって分析した。増加したレベルのNANOG、CRIPTO、およびREX1を、メッセージ特異的プライマーを用いるqPCRによって検出した(図30)。これら3つのメッセージは、iPS細胞において上昇することが示されている(Aasen T etal. 2008. Nature Biotech 26: 1276)。これらの因子のいずれも、形質移入によって細胞に導入されず、それゆえ、発現の変化は、導入された再プログラム化因子の影響による。
本実施例は、一次ケラチノサイトと等量のKLF4、c-MYC、OCT4、およびSOX2のmRNAを用いて再プログラム化されたケラチノサイトの間の発現の差を説明する。7.5×105のHEKn細胞に3または5マイクログラムの各mRNAを1回電気穿孔し、マトリゲルで被覆した10cm皿にmTeSR1培地中で播種した。培地を毎日交換した。形質移入の13日後、細胞を新鮮に被覆したマトリゲルプレートに転移させた。形質移入の21日後、全細胞RNAを、形質移入していないHEKn細胞および2のウェルの再プログラム化された細胞から精製した。等量の各細胞rNAをcDNAに変換し、qPCRによって分析した。増加したレベルのNANOG、CRIPTO、およびREX1を、メッセージ特異的プライマーを用いるqPCRによって検出した(図30)。これら3つのメッセージは、iPS細胞において上昇することが示されている(Aasen T etal. 2008. Nature Biotech 26: 1276)。これらの因子のいずれも、形質移入によって細胞に導入されず、それゆえ、発現の変化は、導入された再プログラム化因子の影響による。
(実施例42 mRNAを用いた細胞の分化転換)
細胞は、本明細書に説明された精製されたmRNA調製物、または本明細書に説明された修飾されたmRNA、または本明細書に説明された修飾されたmRNAを含有する精製されたmRNA調製物を用いて分化転換することができる。本実施例において、少なくとも1つのプソイドウリジンまたは1つの5-メチルシチジンを有するOCT4mRNAを含有する精製されたRNA調製物を採用する。このような精製されたかつ修飾されたOCT4mRNAを、Szabo et al.(Nature 468: 521-528, 2010, 本明細書で完全に示されたかのようにそのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれる)およびRacila et al.(Gene Therapy, 1-10, 2010, 本明細書で完全に示されたかのようにそのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれる)によって説明されるプロトコールにおけるOCT4をコードするベクターと置き換える。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたRNA調製物は、OCT4mRNAを含むかまたはそれからなり、この中で、ウリジンヌクレオシドはすべて、プソイドウリジンヌクレオシドによって置き換えられる。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたRNA調製物は、OCT4mRNAを含むかまたはそれからなり、この中で、シチジンヌクレオシドはすべて、5-メチルシチジンヌクレオシドによって置き換えられる。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたRNA調製物は、OCT4mRNAを含むかまたはそれからなり、この中で、ウリジンヌクレオシドはすべてプソイドウリジンヌクレオシドによって置き換えられ、シチジンヌクレオシドはすべて、5-メチルシチジンヌクレオシドによって置き換えられる。好ましい実施態様において、夾雑しているRNAがないようOCT4mRNAを精製する。Racillaらの参考文献は、ヒトケラチノサイトが、代替的な分化経路に再度向けられることによって分化転換したシステムを説明する。特に、ヒト皮膚ケラチノサイトの転写因子OCT4による一過性の形質移入を採用した。2日後、これらの形質移入した細胞は、内在性胚性遺伝子の発現を示し、ゲノムメチル化の低下を示した。このような細胞をニューロン細胞種類および収縮性間葉系細胞種類へと変換することができることが示された。
細胞は、本明細書に説明された精製されたmRNA調製物、または本明細書に説明された修飾されたmRNA、または本明細書に説明された修飾されたmRNAを含有する精製されたmRNA調製物を用いて分化転換することができる。本実施例において、少なくとも1つのプソイドウリジンまたは1つの5-メチルシチジンを有するOCT4mRNAを含有する精製されたRNA調製物を採用する。このような精製されたかつ修飾されたOCT4mRNAを、Szabo et al.(Nature 468: 521-528, 2010, 本明細書で完全に示されたかのようにそのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれる)およびRacila et al.(Gene Therapy, 1-10, 2010, 本明細書で完全に示されたかのようにそのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれる)によって説明されるプロトコールにおけるOCT4をコードするベクターと置き換える。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたRNA調製物は、OCT4mRNAを含むかまたはそれからなり、この中で、ウリジンヌクレオシドはすべて、プソイドウリジンヌクレオシドによって置き換えられる。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたRNA調製物は、OCT4mRNAを含むかまたはそれからなり、この中で、シチジンヌクレオシドはすべて、5-メチルシチジンヌクレオシドによって置き換えられる。これらの方法の各々の一実施態様において、精製されたRNA調製物は、OCT4mRNAを含むかまたはそれからなり、この中で、ウリジンヌクレオシドはすべてプソイドウリジンヌクレオシドによって置き換えられ、シチジンヌクレオシドはすべて、5-メチルシチジンヌクレオシドによって置き換えられる。好ましい実施態様において、夾雑しているRNAがないようOCT4mRNAを精製する。Racillaらの参考文献は、ヒトケラチノサイトが、代替的な分化経路に再度向けられることによって分化転換したシステムを説明する。特に、ヒト皮膚ケラチノサイトの転写因子OCT4による一過性の形質移入を採用した。2日後、これらの形質移入した細胞は、内在性胚性遺伝子の発現を示し、ゲノムメチル化の低下を示した。このような細胞をニューロン細胞種類および収縮性間葉系細胞種類へと変換することができることが示された。
Szaboらの参考文献は、多能性を確立することなくヒト皮膚線維芽細胞から直接、造血の運命にある前駆細胞および成熟細胞を作製する能力を示した。特に、OCT4により活性化される造血転写因子の異所性発現は、特異的サイトカイン処理とともに、全白血球マーカーCD45を発現する細胞の発生を可能にした。これらの独特な線維芽細胞由来の細胞は、顆粒球性、単球性、巨核球性、および赤血球系の系列を生じ、インビボでの生着能力を示した。
OCT4の使用のほかに、また、これらのプロトコールは両方とも、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、PDGF-BB、幹細胞因子(SCF)、およびFMS様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)など、サイトカインまたは増殖因子を採用した。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、IL-3、IL-6、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インスリン様増殖因子2(IGFII)、および骨誘導因子4(BMP-4)など、他の増殖因子およびサイトカインを用いることができた。そういうものとして、ある実施態様において、RacillaらまたはSzaboらのプロトコールは、先に列挙された増殖因子またはサイトカインの使用とともに、修飾されたOCT4mRNA(例えば、プソイドウリジンにより修飾されたおよび/または5-メチルシチジンにより修飾された)の置換を用いて反復される。いくつかの実施態様において、該細胞を、使用されるサイトカインおよび/または増殖因子タンパク質と接触させる。いくつかの他の実施態様において、細胞を、分化転換プロトコールにおいて用いられるサイトカインおよび/または増殖因子のうちの1つ以上をコードする修飾されたmRNA(例えば、本出願において説明されるような修飾されたmRNA、例えば、プソイドウリジンにより修飾されたおよび/または5-メチルシチジンにより修飾されたもの)と接触させる。本明細書から、本発明には、第一の状態の分化または表現型から第二の状態の分化または表現型を有する細胞へと分化転換するために、ヒトまたは動物の細胞を、再プログラム化因子をコードするmRNAを含むかまたはそれからなる精製されたRNA調製物と接触させることが含まれることは明確である。
(付記事項)
なお、以下の(1)および(2)の発明も、本願発明の範疇である。
なお、以下の(1)および(2)の発明も、本願発明の範疇である。
(1)ヒトまたは他の哺乳類の体細胞を、人工多能性幹細胞(iPS細胞又はiPSC)へと、再プログラム化するためのインビトロの方法であって、
ヒトまたは他の哺乳類の体細胞に、精製されたRNA調製物を導入することを包含し、
前記RNA調製物は、A)インビトロで合成されたmRNA分子と、B)形質移入試薬とを含み、
A)前記インビトロで合成されたmRNA分子は、
1)OCT4、SOX2、KLF4及びMYC、
2)OCT4、SOX2、KLF4、MYC及びLIN28、
3)OCT4、SOX2、KLF4、MYC及びNANOG、又は
4)OCT4、SOX2、KLF4、MYC、LIN28及びNANOG
であるiPSC誘導因子であって、前記A)~D)における前記MYCが、c-MYC、l-MYC、およびN-MYCから選択されるiPSC誘導因子をコードしており、
前記RNA調製物を複数日において前記体細胞に反復して導入し、当該体細胞を培養状態及び培地において維持し、前記体細胞は生存可能であり、かつ、前記体細胞に導入される前記mRNA分子は、前記導入後に、iPS細胞の形態特性及びマーカーの特性の発現を有し、かつ培地中で生存するiPS細胞群が生成されるように発現し、
前記インビトロで合成されたmRNA分子は、
(a)以下を含んでおり、
(i)グアノシン;
(ii)アデノシン;
(iii)シチジン;
(iv)対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、さらに修飾されていないプソイドウリジン(Ψ)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、5-メチルウリジン(m5U)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、5-メトキシウリジン(mo5U)、および対応する修飾されていないヌクレオシドウリジンの少なくとも一部分の代わりに、2-チオウリジン(S2U)、および対応する修飾されていないヌクレオシドシチジンの少なくとも一部分の代わりに、5-メチルシチジン(m5C)からなる群から選択される、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド;
(v)5’キャップ;及び
(vi)3’ポリ(A)末端、かつ、
(b)生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く少なくとも1つの精製工程を用いて精製されており、
前記精製されたRNA調製物が、前記体細胞に対する生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性ではないことは、前記精製されたRNA調製物で形質移入されたヒトまたはネズミ単球由来樹状細胞(MDDC)によるINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの分泌量が増加しないこと、すなわち、前記インビトロで合成されたmRNA分子を含まないネガティブコントロールで形質移入されたMDDCによるINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカイン分泌量の平均+標準誤差(SEM)よりもINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの分泌量が増加しない点で優れていることを測定する、インビトロMDDC免疫原性分析を用いて決定することが可能である、方法であって、
前記精製工程は、
以下のa)ならびにb)
a)HPLCまたは重力フローカラム精製を用いた前記mRNA分子の精製:ならびに
b)短鎖のRNaseIII消化産物が生成されるように、リボヌクレアーゼIII(RNaseIII)酵素を用いて前記mRNA分子を処理すること、および前記mRNA分子から、前記短鎖のRNaseIII消化産物を除去すること
からなる群から選択される少なくとも一つの方法を包含している、方法。
ヒトまたは他の哺乳類の体細胞に、精製されたRNA調製物を導入することを包含し、
前記RNA調製物は、A)インビトロで合成されたmRNA分子と、B)形質移入試薬とを含み、
A)前記インビトロで合成されたmRNA分子は、
1)OCT4、SOX2、KLF4及びMYC、
2)OCT4、SOX2、KLF4、MYC及びLIN28、
3)OCT4、SOX2、KLF4、MYC及びNANOG、又は
4)OCT4、SOX2、KLF4、MYC、LIN28及びNANOG
であるiPSC誘導因子であって、前記A)~D)における前記MYCが、c-MYC、l-MYC、およびN-MYCから選択されるiPSC誘導因子をコードしており、
前記RNA調製物を複数日において前記体細胞に反復して導入し、当該体細胞を培養状態及び培地において維持し、前記体細胞は生存可能であり、かつ、前記体細胞に導入される前記mRNA分子は、前記導入後に、iPS細胞の形態特性及びマーカーの特性の発現を有し、かつ培地中で生存するiPS細胞群が生成されるように発現し、
前記インビトロで合成されたmRNA分子は、
(a)以下を含んでおり、
(i)グアノシン;
(ii)アデノシン;
(iii)シチジン;
(iv)対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、さらに修飾されていないプソイドウリジン(Ψ)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、5-メチルウリジン(m5U)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、5-メトキシウリジン(mo5U)、および対応する修飾されていないヌクレオシドウリジンの少なくとも一部分の代わりに、2-チオウリジン(S2U)、および対応する修飾されていないヌクレオシドシチジンの少なくとも一部分の代わりに、5-メチルシチジン(m5C)からなる群から選択される、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド;
(v)5’キャップ;及び
(vi)3’ポリ(A)末端、かつ、
(b)生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く少なくとも1つの精製工程を用いて精製されており、
前記精製されたRNA調製物が、前記体細胞に対する生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性ではないことは、前記精製されたRNA調製物で形質移入されたヒトまたはネズミ単球由来樹状細胞(MDDC)によるINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの分泌量が増加しないこと、すなわち、前記インビトロで合成されたmRNA分子を含まないネガティブコントロールで形質移入されたMDDCによるINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカイン分泌量の平均+標準誤差(SEM)よりもINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの分泌量が増加しない点で優れていることを測定する、インビトロMDDC免疫原性分析を用いて決定することが可能である、方法であって、
前記精製工程は、
以下のa)ならびにb)
a)HPLCまたは重力フローカラム精製を用いた前記mRNA分子の精製:ならびに
b)短鎖のRNaseIII消化産物が生成されるように、リボヌクレアーゼIII(RNaseIII)酵素を用いて前記mRNA分子を処理すること、および前記mRNA分子から、前記短鎖のRNaseIII消化産物を除去すること
からなる群から選択される少なくとも一つの方法を包含している、方法。
(2)ヒトまたは他の哺乳類の体細胞を、人工多能性幹細胞(iPS細胞又はiPSC)へと、再プログラム化するためのインビトロの方法であって、
ヒトまたは他の哺乳類の体細胞に、精製されたRNA調製物を導入することを包含し、
前記RNA調製物は、A)インビトロで合成されたmRNA分子と、B)形質移入試薬とを含み、
A)前記インビトロで合成されたmRNA分子は、
1)OCT4、SOX2、KLF4及びMYC、
2)OCT4、SOX2、KLF4、MYC及びLIN28、
3)OCT4、SOX2、KLF4、MYC及びNANOG、又は
4)OCT4、SOX2、KLF4、MYC、LIN28及びNANOG
であるiPSC誘導因子であって、前記A)~D)における前記MYCが、c-MYC、l-MYC、およびN-MYCから選択されるiPSC誘導因子をコードしており、
前記RNA調製物を複数日において前記体細胞に反復して導入し、当該体細胞を培養状態及び培地において維持し、前記体細胞は生存可能であり、かつ、前記体細胞に導入される前記mRNA分子は、前記導入後に、iPS細胞の形態特性及びマーカーの特性の発現を有し、かつ培地中で生存するiPS細胞群が生成されるように発現し、
前記インビトロで合成されたmRNA分子は、
(a)以下を含んでおり、
(i)グアノシン;
(ii)アデノシン;
(iii)シチジン;
(iv)対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、さらに修飾されていないプソイドウリジン(Ψ)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、5-メチルウリジン(m5U)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、5-メトキシウリジン(mo5U)、および対応する修飾されていないヌクレオシドウリジンの少なくとも一部分の代わりに、2-チオウリジン(S2U)、および対応する修飾されていないヌクレオシドシチジンの少なくとも一部分の代わりに、5-メチルシチジン(m5C)からなる群から選択される、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド;
(v)5’キャップ;及び
(vi)3’ポリ(A)末端、かつ、
(b)生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く少なくとも1つの精製工程を用いて精製されており、
前記精製されたRNA調製物が、前記体細胞に対する生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性ではないことは、前記精製されたRNA調製物で形質移入されたヒトまたはネズミ単球由来樹状細胞(MDDC)によるINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの分泌量が増加しないこと、すなわち、前記インビトロで合成されたmRNA分子を含まないネガティブコントロールで形質移入されたMDDCによるINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカイン分泌量の平均+標準誤差(SEM)よりもINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの分泌量が増加しない点で優れていることを測定する、インビトロMDDC免疫原性分析を用いて決定することが可能である、方法であって、
前記インビトロで合成された、修飾されたmRNA分子は、実質的にすべての、対応する修飾されていないシチジンヌクレオシドの代わりに、5-メチルシチジン(m5C)修飾されたヌクレオシドを含んでいる、方法。
ヒトまたは他の哺乳類の体細胞に、精製されたRNA調製物を導入することを包含し、
前記RNA調製物は、A)インビトロで合成されたmRNA分子と、B)形質移入試薬とを含み、
A)前記インビトロで合成されたmRNA分子は、
1)OCT4、SOX2、KLF4及びMYC、
2)OCT4、SOX2、KLF4、MYC及びLIN28、
3)OCT4、SOX2、KLF4、MYC及びNANOG、又は
4)OCT4、SOX2、KLF4、MYC、LIN28及びNANOG
であるiPSC誘導因子であって、前記A)~D)における前記MYCが、c-MYC、l-MYC、およびN-MYCから選択されるiPSC誘導因子をコードしており、
前記RNA調製物を複数日において前記体細胞に反復して導入し、当該体細胞を培養状態及び培地において維持し、前記体細胞は生存可能であり、かつ、前記体細胞に導入される前記mRNA分子は、前記導入後に、iPS細胞の形態特性及びマーカーの特性の発現を有し、かつ培地中で生存するiPS細胞群が生成されるように発現し、
前記インビトロで合成されたmRNA分子は、
(a)以下を含んでおり、
(i)グアノシン;
(ii)アデノシン;
(iii)シチジン;
(iv)対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、さらに修飾されていないプソイドウリジン(Ψ)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、5-メチルウリジン(m5U)、対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの少なくとも一部分の代わりに、5-メトキシウリジン(mo5U)、および対応する修飾されていないヌクレオシドウリジンの少なくとも一部分の代わりに、2-チオウリジン(S2U)、および対応する修飾されていないヌクレオシドシチジンの少なくとも一部分の代わりに、5-メチルシチジン(m5C)からなる群から選択される、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド;
(v)5’キャップ;及び
(vi)3’ポリ(A)末端、かつ、
(b)生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く少なくとも1つの精製工程を用いて精製されており、
前記精製されたRNA調製物が、前記体細胞に対する生得的免疫応答を誘導することによる前記体細胞に対する免疫原性および毒性ではないことは、前記精製されたRNA調製物で形質移入されたヒトまたはネズミ単球由来樹状細胞(MDDC)によるINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの分泌量が増加しないこと、すなわち、前記インビトロで合成されたmRNA分子を含まないネガティブコントロールで形質移入されたMDDCによるINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカイン分泌量の平均+標準誤差(SEM)よりもINF-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの分泌量が増加しない点で優れていることを測定する、インビトロMDDC免疫原性分析を用いて決定することが可能である、方法であって、
前記インビトロで合成された、修飾されたmRNA分子は、実質的にすべての、対応する修飾されていないシチジンヌクレオシドの代わりに、5-メチルシチジン(m5C)修飾されたヌクレオシドを含んでいる、方法。
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Claims (23)
- インビトロに存在する哺乳類細胞を誘導して組換えタンパク質を産生する方法であって、
前記組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、インビトロで合成されたmRNAの調製物と、前記哺乳類細胞とを接触させる工程を包含し、
前記インビトロで合成されたmRNAは、インビトロで転写(IVT)することにより得られ、Ψ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)又は修飾された核酸塩基を含むΨ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)を含み、かつ
前記インビトロで合成されたmRNAの調製物は、生得的免疫応答を誘導することによる前記細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く精製工程を用いて精製されており、
前記RNA夾雑物分子は、二本鎖RNA夾雑物分子を含み、
前記mRNAが精製されていることは、前記精製されたインビトロで合成されたmRN
A分子の調製物で形質移入された樹状細胞によるIFN-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの測定不可能な分泌と、精製されていないインビトロで合成されたmRNAの調製物で形質移入された樹状細胞による前記サイトカインの測定可能な分泌とを比較することにより決定される、方法。 - 前記精製されたインビトロで合成されたmRNAの調製物中の全RNAの0.01%未満が、2本鎖RNA夾雑物分子からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記精製工程の結果、前記インビトロで合成されたmRNAの調製物は、前記組換えタンパク質の検出可能な発現を除去するのに十分な免疫応答を誘発することなく、反復して投与されることができる、または、前記インビトロで合成されたmRNAの調製物は、炎症性サイトカインの発生しない反復した送達が可能なように、免疫原性が欠失している、請求項1または2に記載の方法。
- 前記インビトロで合成されたmRNAは、
A.ポリA末端;
B.5’キャップまたはキャップ非依存性翻訳エンハンサー;または
C.シチジンの代わりの、修飾されたヌクレオシドである5-メチルシチジン(m5C)
を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記精製工程は、
A.HPLCまたは重力フローカラム精製を用いた前記インビトロで合成されたmRNAの調製物の精製;および/または
B.短鎖のリボヌクレアーゼIII(RNaseIII)消化産物が生成されるように、RNaseIII酵素を用いて前記インビトロで合成されたmRNAの調製物を処理すること、および前記mRNAの調製物から、前記短鎖のRNaseIII消化産物を除去するように精製すること
を含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記インビトロで合成されたmRNAによりコードされる前記組換えタンパク質は、エリスロポエチン(EPO);ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、細菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)、および緑色蛍光タンパク質(GFP)から選択される検出酵素;MYCおよびSRYまたはMCOPから選択される転写調節因子;血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)、インスリン様増殖因子(IGF)、α-メラニン形成細胞刺激ホルモン(α-MSH)、インスリン様増殖因子-I(IGF-I)、IL-4、IL-13、およびIL-10からなる群より選択される増殖因子またはサイトカイン;誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS);嚢胞性線維症幕貫通コンダクタンス調節因子(CFTR);カタラーゼ、リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ-1、およびスーパーオキシドジスムターゼ-2から選択される抗酸化活性を有する酵素;ブルトン型チロシンキナーゼ;アデノシンデアミナーゼ;エクト-ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ;ABCA4;ABCD3;ACADM;AGL;AGT;ALDH4Al;ALPL;AMPD1;APOA2;AVSD1;BRCD2;C1QA;C1QB;C1QG;C8A;C8B;CACNA1S;CCV;CD3Z;CDC2L1;CHML;CHS1;CIAS1;CLCNKB;CMD1A;CMH2;CMM;COL11A1;COL8A2;COL9A2;CPT2;CRB1;CSE;CSF3R;CTPA;CTSK;DBT;DIO1;DISC1;DPYD;EKV;ENO1;ENO1P;EPB41;EPHX1;F13B;F5;FCGR2A;FCGR2B;FCGR3A;FCHL;FH;FMO3;FMO4;FUCA1;FY;GALE;GBA;GFND;GJA8;GJB3;GLC3B;HF1;HMGCL;HPC1;HRD;HRPT2;HSD3B2;HSPG2;KCNQ4;KCS;KIF1B;LAMB3;LAMC2;LGMD1B;LMNA;LOR;MCKD1;MCL1;MPZ;MTHFR;MTR;MUTYH;MYOC;NB;NCF2;NEM1;NPHS2;NPPA;NRAS;NTRK1;OPTA2;PBX1;PCHC;PGD;PHA2A;PHGDH;PKLR;PKP1;PLA2G2A;PLOD;PPOX;PPT1;PRCC;PRG4;PSEN2;PTOS1;REN;RFX5;RHD;RMD1;RPE65;SCCD;SERPINC1;SJS1;SLC19A2;SLC2A1;SPG23;SPTA1;TAL1;TNFSF6;TNNT2;TPM3;TSHB;UMPK;UOX;UROD;USH2A;VMGLOM;VWS;WS2B;ABCB11;ABCG5;ABCG8;ACADL;ACP1;AGXT;AHHR;ALMS1;ALPP;ALS2;APOB;BDE;BDMR;BJS;BMPR2;CHRNA1;CMCWTD;CNGA3;COL3A1;COL4A3;COL4A4;COL6A3;CPS1;CRYGA;CRYGEP1;CYP1B1;CYP27A1;DBI;DES;DYSF;EDAR;EFEMP1;EIF2AK3;ERCC3;FSHR;GINGF;GLC1B;GPD2;GYPC;HADHA;HADHB;HOXD13;HPE2;IGKC;IHH;IRS1;ITGA6;KHK;KYNU;LCT;LHCGR;LSFC;MSH2;MSH6;NEB;NMTC;NPHP1;PAFAH1P1;PAX3;PAX8;PMS1;PNKD;PPH1;PROC;REG1A;SAG;SFTPB;SLC11A1;SLC3Al;SOS1;SPG4;SRD5A2;TCL4;TGFA;TMD;TPO;UGT1A;UV24;WSS;XDH;ZAP70;ZFHX1B;ACAA1;AGS1;AGTR1;AHSG;AMT;ARMET;BBS3;BCHE;BCPM;BTD;CASR;CCR2;CCR5;CDL1;CMT2B;COL7A1;CP;CPO;CRV;CTNNB1;DEM;ETM1;FANCD2;FIH;FOXL2;GBE1;GLB1;GLC1C;GNAI2;GNAT1;GP9;GPX1;HGD;HRG;ITIH1;KNG;LPP;LRS1;MCCC1;MDS1;MHS4;MITF;MLH1;MYL3;MYMY;OPA1;P2RY12;PBXP1;PCCB;POU1FI;PPARG;PROS1;PTHR1;RCA1;RHO;SCA7;SCLC1;SCN5A;SI;SLC25A20;SLC2A2;TF;TGFBR2;THPO;THRB;TKT;TM4SF1;TRH;UMPS;UQCRC1;USH3A;VHL;WS2A;XPC;ZNF35;ADH1B;ADH1C;AFP;AGA;AIH2;ALB;ASMD;BFHD;CNGA1;CRBM;DCK;DSPP;DTDP2;ELONG;ENAM;ETFDH;EVC;F11;FABP2;FGA;FGB;FGFR3;FGG;FSHMD1A;GC;GNPTA;GNRHR;GYPA;HCA;HCL2;HD;HTN3;HVBS6;IDUA;IF;JPD;KIT;KLKB1;LQT4;MANBA;MLLT2;MSX1;MTP;NR3C2;PBT;PDE6B;PEE1;PITX2;PKD2;QDPR;SGCB;SLC25A4;SNCA;SOD3;STATH;TAPVR1;TYS;WBS2;WFS1;WHCR;ADAMTS2;ADRB2;AMCN;AP3BI;APC;ARSB;B4GALT7;BHR1;C6;C7;CCAL2;CKN1;CMDJ;CRHBP;CSF1R;DHFR;DIAPH1;DTR;EOS;EPD;ERVR;F12;FBN2;GDNF;GHR;GLRA1;GM2A;HEXB;HSD17B4;ITGA2;KFS;LGMD1A;LOX;LTC4S;MAN2A1;MCC;MCCC2;MSH3;MSX2;NR3C1;PCSK1;PDE6A;PFBI;RASA1;SCZD1;SDHA;SGCD;SLC22A5;SLC26A2;SLC6A3;SM1;SMA;SMN1;SMN2;SPINK5;TCOF1;TELAB1;TGFBI;ALDH5A1;ARG1;AS;ASSP2;BCKDHB;BF;C2;C4A;CDKN1A;COL10A1;COL11A2;CYP21A2;DYX2;EJM1;ELOVL4;EPM2A;ESR1;EYA4;F13A1;FANCE;GCLC;GJA1;GLYS1;GMPR;GSE;HCR;HFE;HLA-A;HLA-DPB1;HLA-DRA;HPFH;ICS1;IDDM1;IFNGR1;IGAD1;IGF2R;ISCW;LAMA2;LAP;LCA5;LPA;MCDR1;MOCS1;MUT;MYB;NEU1;NKS1;NYS2;OA3;ODDD;OFC1;PARK2;PBCA;PBCRA1;PDB1;PEX3;PEX6;PEX7;PKHD1;PLA2G7;PLG;POLH;PPAC;PSORS1;PUJO;RCD1;RDS;RHAG;RP14;RUNX2;RWS;SCA1;SCZD3;SIASD;SOD2;ST8;TAP1;TAP2;TFAP2B;TNDM;TNF;TPBG;TPMT;TULP1;WISP3;AASS;ABCB1;ABCB4;ACHE;AQP1;ASL;ASNS;AUTS1;BPGM;BRAF;C7orf2;CACNA2D1;CCM1;CD36;CFTR;CHORDOMA;CLCN1;CMH6;CMT2D;COL1A2;CRS;CYMD;DFNA5;DLD;DYT11;EEC1;ELN;ETV1;FKBP6;GCK;GHRHR;GHS;GLI3;GPDS1;GUSB;HLXB9;HOXA13;HPFH2;HRX;IAB;IMMP2L;KCNH2;LAMB1;LEP;MET;NCF1;NM;OGDH;OPN1SW;PEX1;PGAM2;PMS2;PON1;PPP1R3A;PRSS1;PTC;PTPN12;RP10;RP9;SERPINE1;SGCE;SHFM1;SHH;SLC26A3;SLC26A4;SLOS;SMAD1;TBXAS1;TWIST;ZWS1;ACHM3;ADRB3;ANK1;CA1;CA2;CCAL1;CLN8;CMT4A;CNGB3;COH1;CPP;CRH;CYP11B1;CYP11B2;DECR1;DPYS;DURS1;EBS1;ECA1;EGI;EXT1;EYA1;FGFR1;GNRH1;GSR;GULOP;HR;KCNQ3;KFM;KWE;LGCR;LPL;MCPH1;MOS;MYC;NAT1;NAT2;NBS1;PLAT;PLEC1;PRKDC;PXMP3;RP1;SCZD6;SFTPC;SGM1;SPG5A;STAR;TG;TRPS1;TTPA;VMD1;WRN;ABCA1;ABL1;ABO;ADAMTS13;AK1;ALAD;ALDH1A1;ALDOB;AMBP;AMCD1;ASS;BDMF;BSCL;C5;CDKN2A;CHAC;CLA1;CMD1B;COL5A1;CRAT;DBH;DNAI1;DYS;DYT1;ENG;FANCC;FBP1;FCMD;FRDA;GALT;GLDC;GNE;GSM1;GSN;HSD17B3;HSN1;IBM2;INVS;JBTS1;LALL;LCCS1;LCCS;LGMD2H;LMX1B;MLLT3;MROS;MSSE;NOTCH1;ORM1;PAPPA;PIP5K1B;PTCH;PTGS1;RLN1;RLN2;RMRP;ROR2;RPD1;SARDH;SPTLC1;STOM;TDFA;TEK;TMC1;TRIM32;TSC1;TYRP1;XPA;CACNB2;COLl7A1;CUBN;CXCL12;CYP17;CYP2C19;CYP2C9;EGR2;EMX2;ERCC6;FGFR2;HK1;HPSI;IL2RA;LGI1;LIPA;MAT1A;MBL2;MKI67;MXI1;NODAL;OAT;OATL3;PAX2;PCBD;PEO1;PHYH;PNLIP;PSAP;PTEN;RBP4;RDPA;RET;SFTPA1;SFTPD;SHFM3;SIAL;THC2;TLX1;TNFRSF6;UFS;UROS;AA;ABCC8;ACAT1;ALX4;AMPD3;ANC;APOA1;APOA4;APOC3;ATM;BSCL2;BWS;CALCA;CAT;CCND1;CD3E;CD3G;CD59;CDKN1C;CLN2;CNTF;CPT1A;CTSC;DDB1;DDB2;DHCR7;DLAT;DRD4;ECB2;ED4;EVR1;EXT2;F2;FSHB;FTH1;G6PT1;G6PT2;GIF;HBB;HBBP1;HBD;HBE1;HBG1;HBG2;HMBS;HND;HOMG2;HRAS;HVBS1;IDDM2;IGER;INS;JBS;KCNJ11;KCNJ1;KCNQ1;LDHA;LRP5;MEN1;MLL;MYBPC3;MYO7A;NNO1;OPPG;OPTB1;PAX6;PC;PDX1;PGL2;PGR;PORC;PTH;PTS;PVRL1;PYGM;RAG1;RAG2;ROM1;RRAS2;SAA1;SCA5;SCZD2;SDHD;SERPING1;SMPD1;TCIRG1;TCL2;TECTA;TH;TREH;TSG101;TYR;USH1C;VMD2;VRNI;WT1;WT2;ZNF145;A2M;AAAS;ACADS;ACLS;ACVRL1;ALDH2;AMHR2;AOM;AQP2;ATD;ATP2A2;BDC;C1R;CD4;CDK4;CNA1;COL2A1;CYP27B1;DRPLA;ENUR2;FEOM1;FGF23;FPF;GNB3;GNS;HAL;HBP1;HMGA2;HMN2;HPD;IGF1;KCNA1;KERA;KRAS2;KRT1;KRT2A;KRT3;KRT4;KRT5;KR
T6A;KRT6B;KRTHB6;LDHB;LYZ;MGCT;MPE;MVK;MYL2;OAP;PAH;PPKB;PRB3;PTPN11;PXR1;RLS;RSN;SAS;SAX1;SCA2;SCNN1A;SMAL;SPPM;SPSMA;TBX3;TBX5;TCF1;TPI1;TSC3;ULR;VDR;VWF;ATP7B;BRCA2;BRCD1;CLN5;CPB2;ED2;EDNRB;ENUR1;ERCC5;F10;F7;GJB2;GJB6;IPF1;MBS1;MCOR;NYS4;PCCA;RB1;RHOK;SCZD7;SGCG;SLC10A2;SLC25A15;STARP1;ZNFl98;ACHM1;ARVDI;BCH;CTAA1;DAD1;DFNB5;EML1;GALC;GCH1;IBGC1;IGH;IGHCgroup;IGHG1;IGHM;IGHR;IV;LTBP2;MJD;MNG1;MPD1;MPS3C;MYH6;MYH7;NP;NPC2;PABN1;PSEN1;PYGL;RPGRIP1;SERPINA1;SERPINA3;SERPINA6;SLC7A7;SPG3A;SPTB;TCL1A;TGMI;TITF1;TMIP;TRA;TSHR;USH1A;VP;ACCPN;AHO2;ANCR;B2M;BBS4;BLM;CAPN3;CDAN1;CDAN3;CLN6;CMH3;CYP19;CYP1A1;CYP1A2;DYX1;EPB42;ETFA;EYCL3;FAH;FBN1;FES;HCVS;HEXA;IVD;LCS1;LIPC;MYO5A;OCA2;OTSC1;PWCR;RLBP1;SLC12A1;SPG6;TPM1;UBE3A;WMS;ABCC6;ALDOA;APRT;ATP2A1;BBS2;CARD15;CATM;CDH1;CETP;CHST6;CLN3;CREBBP;CTH;CTM;CYBA;CYLD;DHS;DNASE1;DPEP1;ERCC4;FANCA;GALNS;GAN;HAGH;HBA1;HBA2;HBHR;HBQ1;HBZ;HBZP;HP;HSD11B2;IL4R;LIPB、MC1R;MEFV;MHC2TA;MLYCD;MMVP1;PHKB;PHKG2;PKD1;PKDTS;PMM2;PXE;SALL1;SCA4;SCNN1B;SCNN1G;SLC12A3;TAT;TSC2;VDI;WT3;ABR;ACACA;ACADVL;ACE;ALDH3A2;APOH;ASPA;AXIN2;BCL5;BHD;BLMH;BRCA1;CACD;CCA1;CCZS;CHRNB1;CHRNE;CMT1A;COL1A1;CORD5;CTNS;EPX;ERBB2;G6PC;GAA;GALK1;GCGR;GFAP;GH1;GH2;GP1BA;GPSC;GUCY2D;ITGA2B;ITGB3;ITGB4;KRT10;KRT12;KRT13;KRT14;KRT14L1;KRT14L2;KRT14L3;KRT16;KRT16L1;KRT16L2;KRT17;KRT9;MAPT;MDB;MDCR;MGI;MHS2;MKS1;MPO;MYO15A;NAGLU;NAPB;NF1;NME1;P4HB;PAFAH1B1;PECAM1;PEX12;PHB;PMP22;PRKAR1A;PRKCA;PRKWNK4;PRP8;PRPF8;PTLAH;RARA;RCV1;RMSA1;RP17;RSS;SCN4A;SERPINF2;SGCA;SGSH;SHBG;SLC2A4;SLC4A1;SLC6A4;SMCR;SOST;SOX9;SSTR2;SYM1;SYNS1;TCF2;THRA;TIMP2;TOC;TOP2A;TP53;TRIM37;VBCH;ATP8B1;BCL2;CNSN;CORD1;CYB5;DCC;F5F8D;FECH;FEO;LAMA3;LCFS2;MADH4;MAFD1;MC2R;MCL;MYP2;NPC1;SPPK;TGFBRE;TGIF;TTR;AD2;AMH;APOC2;APOE;ATHS;BAX;BCKDHA;BCL3;BFIC;C3;CACNA1A;CCO;CEACAM5;COMP;CRX;DBA;DDU;DFNA4;DLL3;DM1;DMWD;E11S;ELA2;EPOR;ERCC2;ETFB;EXT3;EYCL1;FTL;FUT1;FUT2;FUT6;GAMT;GCDH;GPI;GUSM;HB1;HCL1;HHC2;HHC3;ICAM3;INSR;JAK3;KLK3;LDLR;LHB;LIG1;LOH19CR1;LYL1;MAN2B1;MCOLN1;MDRV;MLLT1;NOTCH3;NPHS1;OFC3;OPA3;PEPD;PRPF31;PRTN3;PRX;PSG1;PVR;RYR1;SLC5A5;SLC7A9;STK11;TBXA2R;TGFB1;TNNI3;TYROBP;ADA;AHCY;AVP;CDAN2;CDPD1;CHED1;CHED2;CHRNA4;CST3;EDN3;EEGV1;FTLL1;GDF5;GNAS;GSS;HNF4A;JAG1;KCNQ2;MKKS;NBIA1;PCK1;PI3;PPCD;PPGB;PRNP;THBD;TOP1;AIRE;APP;CBS;COL6A1;COL6A2;CSTB;DCR;DSCR1;FPDMM;HLCS;HPE1;ITGB2;KCNE1;KNO;PRSS7;RUNX1;SOD1;TAM;ADSL;ARSA;BCR;CECR;CHEK2;COMT;CRYBB2;CSF2RB;CTHM;CYP2D6;CYP2D7P1;DGCR;DIA1;EWSR1;GGT1;MGCR;MN1;NAGA;NF2;OGS2;PDGFB;PPARA;PRODH;SCO2;SCZD4;SERPIND1;SLC5A1;SOX10;TCN2;TIMP3;TST;VCF;ABCD1;ACTL1;ADFN;AGMX2;AHDS;AIC;AIED;AIH3;ALAS2;AMCD;AMELX;ANOP1;AR;ARAF1;ARSC2;ARSE;ARTS;ARX;ASAT;ASSP5;ATP7A;ATRX;AVPR2;BFLS;BGN;BTK;BZX;C1HR;CACNA1F;CALB3;CBBM;CCT;CDR1;CFNS;CGF1;CHM;CHR39C;CIDX;CLA2;CLCN5;CLS;CMTX2;CMTX3;CND;COD1;COD2;COL4A5;COL4A6;CPX;CVD1;CYBB;DCX;DFN2;DFN4;DFN6;DHOF;DIAPH2;DKC1;DMD;DSS;DYT3;EBM;EBP;ED1;ELK1;EMD;EVR2;F8;F9;FCP1;FDPSL5;FGD1;FGS1;FMR1;FMR2;G6PD;GABRA3;GATA1;GDI1;GDXY;GJB1;GK;GLA;GPC3;GRPR;GTD;GUST;HMS1;HPRT1;HPT;HTC2;HTR2C;HYR;IDS;IHG1;IL2RG;INDX;IP1;IP2;JMS;KAL1;KFSD;L1CAM;LAMP2;MAA;MAFD2;MAOA;MAOB;MCF2;MCS;MEAX;MECP2;MF4;MGC1;MIC5;MID1;MLLT7;MLS;MRSD;MRX14;MRX1;MRX20;MRX2;MRX3;MRX40;MRXA;MSD;MTM1;MYCL2;MYP1;NDP;NHS;NPHL1;NR0B1;NSX;NYS1;NYX;OA1;OASD;OCRL;ODT1;OFD1;OPA2;OPD1;OPEM;OPN1LW;OPN1MW;OTC;P3;PDHA1;PDR;PFC;PFKFB1;PGK1;PGK1P1;PGS;PHEX;PHKA1;PHKA2;PHP;PIGA;PLP1;POF1;POLA;POU3F4;PPMX;PRD;PRPS1;PRPS2;PRS;RCCP2;RENBP;RENS1;RP2;RP6;RPGR;RPS4X;RPS6KA3;RS1;S11;SDYS;SEDL;SERPINA7;SH2D1A;SHFM2;SLC25A5;SMAX2;SRPX;SRS;STS;SYN1;SYP;TAF1;TAZ;TBX22;TDD;TFE3;THAS;THC;TIMM8A;TIMP1;TKCR;TNFSF5;UBE1;UBE2A;WAS;WSN;WTS;WWS;XIC;XIST;XK;XM;XS;ZFX;ZIC3;ZNF261;ZNF41;ZNF6;AMELY;ASSP6;AZF1;AZF2;DAZ;GCY;RPS4Y;SMCY;ZFY;ABAT;AEZ;AFA;AFD1;ASAH1;ASD1;ASMT;CCAT;CECR9;CEPA;CLA3;CLN4;CSF2RA;CTS1;DF;DIH1;DWS;DYT2;DYT4;EBR3;ECT;EEF1A1L14;EYCL2;FANCB;GCSH;GCSL;GIP;GTS;HHG;HMI;HOAC;HOKPP2;HRPT1;HSD3B3;HTC1;HV1S;ICHQ;ICR1;ICR5;IL3RA;KAL2;KMS;KRT18;KSS;LCAT;LHON;LIMM;MANBB;MCPH2;MEB;MELAS;MIC2;MPFD;MS;MSS;MTATP6;MTCO1;MTCO3;MTCYB;MTND1;MTND2;MTND4;MTND5;MTND6;MTRNR1;MTRNR2;MTTE;MTTG;MTTI;MTTK;MTTL1;MTTL2;MTTN;MTTP;MTTS1;NAMSD;OCD1;OPD2;PCK2;PCLD;PCOS1;PFKM;PKD3;PRCA1;PRO1;PROP1;RBS;RFXAP;RP;SHOX;SLC25A6;SPG5B;STO;SUOX;THM;およびTTDからなる群より選択される、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記哺乳類細胞は、抗原提示細胞、樹状細胞、マクロファージ、神経細胞、脳細胞、星状細胞、小グリア細胞、ニューロン、脾臓細胞、リンパ球系細胞、肺細胞、肺上皮細胞、皮膚細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、肺胞細胞、肺胞マクロファージ、表面肺胞細胞、脈管内皮細胞、間葉系細胞、上皮細胞、コロニー上皮細胞、造血細胞、骨髄細胞、クラウディウス細胞、ヘンゼン細胞、メルケル細胞、ミューラー細胞、パネート細胞、プルキンエ細胞、シュワン細胞、セルトリ細胞、好酸細胞、腺房細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、褐色もしくは白色α細胞、無軸索細胞、β細胞、莢膜細胞、セメント細胞、主細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、クロム親和性細胞、色素嫌性細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、δ細胞、ランゲルハンス細胞、濾胞樹状細胞、腸管クロム親和性細胞、脳室上衣細胞、基底細胞、鱗状細胞、移行細胞、赤芽球、赤血球、線維芽細胞、線維細胞、濾胞細胞、生殖細胞、配偶子、卵子、精子、卵母細胞、第一卵母細胞、第二卵母細胞、不動精子、精母細胞、第一精母細胞、第二精母細胞、生殖上皮、巨細胞、神経膠細胞、星状芽細胞、乏突起神経膠芽細胞、希突起神経膠細胞、神経膠芽細胞、杯状細胞、性腺刺激ホルモン分泌細胞、顆粒膜細胞、血球芽細胞、有毛細胞、肝芽細胞、肝細胞、硝子体細胞、間質細胞、傍糸球体細胞、ケラチノサイト、角膜実質細胞、レンマ細胞(lemmal cell)、)、白血球、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、リンパ芽球、Bリンパ芽球、Tリンパ芽球、リンパ球、Bリンパ球、Tリンパ球、ヘルパー誘導型Tリンパ球(helper induced T-lymphocyte)、Th1 Tリンパ球、Th2 Tリンパ球、ナチュラルキラー細胞、胸腺細胞、クッパー細胞、肺胞マクロファージ、泡沫細胞、組織球、ルテイン細胞、リンパ球性幹細胞、リンパ系細胞、免疫幹細胞、大グリア細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、マスト細胞、髄芽細胞、巨核芽球、巨核球、メラニン芽細胞、メラニン形成細胞、メサンギウム細胞、中皮細胞、後骨髄球、単芽球、単球、胃腺頚粘液細胞、筋芽細胞、筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨髄球、骨髄性細胞、骨髄幹細胞、筋芽細胞、筋上皮細胞、筋線維芽細胞、神経芽細胞、神経上皮細胞、ニューロン、象牙芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、酸分泌細胞、傍濾胞細胞、傍黄体細胞、消化細胞、周細胞、末梢血単核球、褐色細胞、支持細胞、松果体細胞、下垂体細胞、形質細胞、血小板、被蓋細胞、前赤芽球、前単球、前骨髄芽球、前骨髄球、前正赤芽球、網状赤血球、幹細胞、セルトリ細胞、終末グリア細胞、または酵素原細胞である、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子療法において、インビトロに存在する哺乳類細胞に組換えタンパク質を産生させる医薬の調製における、インビトロで合成されたmRNAの調製物の使用であって、
前記インビトロで合成されたmRNAは、前記組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、インビトロで転写(IVT)することにより得られ、Ψ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)又は修飾された核酸塩基を含むΨ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)を含み、
前記インビトロで合成されたmRNAの調製物は、生得的免疫応答を誘導することによる前記細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く精製工程を用いて精製されており、
前記RNA夾雑物分子は、二本鎖RNA夾雑物分子を含み、
前記mRNAが精製されていることは、前記精製されたインビトロで合成されたmRN
A分子の調製物で形質移入された樹状細胞によるIFN-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの測定不可能な分泌と、精製されていないインビトロで合成されたmRNAの調製物で形質移入された樹状細胞による前記サイトカインの測定可能な分泌とを比較することにより決定される、使用。 - 前記組換えタンパク質は、エリスロポエチン(EPO);ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、細菌β-ガラクトシダーゼ(lacZ)、および緑色蛍光タンパク質(GFP)から選択される検出酵素;MYCおよびSRYまたはMCOPから選択される転写調節因子;血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)、インスリン様増殖因子(IGF)、α-メラニン形成細胞刺激ホルモン(α-MSH)、インスリン様増殖因子-I(IGF-I)、IL-4、IL-13、およびIL-10からなる群より選択される増殖因子またはサイトカイン;誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS);嚢胞性線維症幕貫通コンダクタンス調節因子(CFTR);カタラーゼ、リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ-1、およびスーパーオキシドジスムターゼ-2から選択される抗酸化活性を有する酵素;ブルトン型チロシンキナーゼ;アデノシンデアミナーゼ;エクト-ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ;ABCA4;ABCD3;ACADM;AGL;AGT;ALDH4Al;ALPL;AMPD1;APOA2;AVSD1;BRCD2;C1QA;C1QB;C1QG;C8A;C8B;CACNA1S;CCV;CD3Z;CDC2L1;CHML;CHS1;CIAS1;CLCNKB;CMD1A;CMH2;CMM;COL11A1;COL8A2;COL9A2;CPT2;CRB1;CSE;CSF3R;CTPA;CTSK;DBT;DIO1;DISC1;DPYD;EKV;ENO1;ENO1P;EPB41;EPHX1;F13B;F5;FCGR2A;FCGR2B;FCGR3A;FCHL;FH;FMO3;FMO4;FUCA1;FY;GALE;GBA;GFND;GJA8;GJB3;GLC3B;HF1;HMGCL;HPC1;HRD;HRPT2;HSD3B2;HSPG2;KCNQ4;KCS;KIF1B;LAMB3;LAMC2;LGMD1B;LMNA;LOR;MCKD1;MCL1;MPZ;MTHFR;MTR;MUTYH;MYOC;NB;NCF2;NEM1;NPHS2;NPPA;NRAS;NTRK1;OPTA2;PBX1;PCHC;PGD;PHA2A;PHGDH;PKLR;PKP1;PLA2G2A;PLOD;PPOX;PPT1;PRCC;PRG4;PSEN2;PTOS1;REN;RFX5;RHD;RMD1;RPE65;SCCD;SERPINC1;SJS1;SLC19A2;SLC2A1;SPG23;SPTA1;TAL1;TNFSF6;TNNT2;TPM3;TSHB;UMPK;UOX;UROD;USH2A;VMGLOM;VWS;WS2B;ABCB11;ABCG5;ABCG8;ACADL;ACP1;AGXT;AHHR;ALMS1;ALPP;ALS2;APOB;BDE;BDMR;BJS;BMPR2;CHRNA1;CMCWTD;CNGA3;COL3A1;COL4A3;COL4A4;COL6A3;CPS1;CRYGA;CRYGEP1;CYP1B1;CYP27A1;DBI;DES;DYSF;EDAR;EFEMP1;EIF2AK3;ERCC3;FSHR;GINGF;GLC1B;GPD2;GYPC;HADHA;HADHB;HOXD13;HPE2;IGKC;IHH;IRS1;ITGA6;KHK;KYNU;LCT;LHCGR;LSFC;MSH2;MSH6;NEB;NMTC;NPHP1;PAFAH1P1;PAX3;PAX8;PMS1;PNKD;PPH1;PROC;REG1A;SAG;SFTPB;SLC11A1;SLC3Al;SOS1;SPG4;SRD5A2;TCL4;TGFA;TMD;TPO;UGT1A;UV24;WSS;XDH;ZAP70;ZFHX1B;ACAA1;AGS1;AGTR1;AHSG;AMT;ARMET;BBS3;BCHE;BCPM;BTD;CASR;CCR2;CCR5;CDL1;CMT2B;COL7A1;CP;CPO;CRV;CTNNB1;DEM;ETM1;FANCD2;FIH;FOXL2;GBE1;GLB1;GLC1C;GNAI2;GNAT1;GP9;GPX1;HGD;HRG;ITIH1;KNG;LPP;LRS1;MCCC1;MDS1;MHS4;MITF;MLH1;MYL3;MYMY;OPA1;P2RY12;PBXP1;PCCB;POU1FI;PPARG;PROS1;PTHR1;RCA1;RHO;SCA7;SCLC1;SCN5A;SI;SLC25A20;SLC2A2;TF;TGFBR2;THPO;THRB;TKT;TM4SF1;TRH;UMPS;UQCRC1;USH3A;VHL;WS2A;XPC;ZNF35;ADH1B;ADH1C;AFP;AGA;AIH2;ALB;ASMD;BFHD;CNGA1;CRBM;DCK;DSPP;DTDP2;ELONG;ENAM;ETFDH;EVC;F11;FABP2;FGA;FGB;FGFR3;FGG;FSHMD1A;GC;GNPTA;GNRHR;GYPA;HCA;HCL2;HD;HTN3;HVBS6;IDUA;IF;JPD;KIT;KLKB1;LQT4;MANBA;MLLT2;MSX1;MTP;NR3C2;PBT;PDE6B;PEE1;PITX2;PKD2;QDPR;SGCB;SLC25A4;SNCA;SOD3;STATH;TAPVR1;TYS;WBS2;WFS1;WHCR;ADAMTS2;ADRB2;AMCN;AP3BI;APC;ARSB;B4GALT7;BHR1;C6;C7;CCAL2;CKN1;CMDJ;CRHBP;CSF1R;DHFR;DIAPH1;DTR;EOS;EPD;ERVR;F12;FBN2;GDNF;GHR;GLRA1;GM2A;HEXB;HSD17B4;ITGA2;KFS;LGMD1A;LOX;LTC4S;MAN2A1;MCC;MCCC2;MSH3;MSX2;NR3C1;PCSK1;PDE6A;PFBI;RASA1;SCZD1;SDHA;SGCD;SLC22A5;SLC26A2;SLC6A3;SM1;SMA;SMN1;SMN2;SPINK5;TCOF1;TELAB1;TGFBI;ALDH5A1;ARG1;AS;ASSP2;BCKDHB;BF;C2;C4A;CDKN1A;COL10A1;COL11A2;CYP21A2;DYX2;EJM1;ELOVL4;EPM2A;ESR1;EYA4;F13A1;FANCE;GCLC;GJA1;GLYS1;GMPR;GSE;HCR;HFE;HLA-A;HLA-DPB1;HLA-DRA;HPFH;ICS1;IDDM1;IFNGR1;IGAD1;IGF2R;ISCW;LAMA2;LAP;LCA5;LPA;MCDR1;MOCS1;MUT;MYB;NEU1;NKS1;NYS2;OA3;ODDD;OFC1;PARK2;PBCA;PBCRA1;PDB1;PEX3;PEX6;PEX7;PKHD1;PLA2G7;PLG;POLH;PPAC;PSORS1;PUJO;RCD1;RDS;RHAG;RP14;RUNX2;RWS;SCA1;SCZD3;SIASD;SOD2;ST8;TAP1;TAP2;TFAP2B;TNDM;TNF;TPBG;TPMT;TULP1;WISP3;AASS;ABCB1;ABCB4;ACHE;AQP1;ASL;ASNS;AUTS1;BPGM;BRAF;C7orf2;CACNA2D1;CCM1;CD36;CFTR;CHORDOMA;CLCN1;CMH6;CMT2D;COL1A2;CRS;CYMD;DFNA5;DLD;DYT11;EEC1;ELN;ETV1;FKBP6;GCK;GHRHR;GHS;GLI3;GPDS1;GUSB;HLXB9;HOXA13;HPFH2;HRX;IAB;IMMP2L;KCNH2;LAMB1;LEP;MET;NCF1;NM;OGDH;OPN1SW;PEX1;PGAM2;PMS2;PON1;PPP1R3A;PRSS1;PTC;PTPN12;RP10;RP9;SERPINE1;SGCE;SHFM1;SHH;SLC26A3;SLC26A4;SLOS;SMAD1;TBXAS1;TWIST;ZWS1;ACHM3;ADRB3;ANK1;CA1;CA2;CCAL1;CLN8;CMT4A;CNGB3;COH1;CPP;CRH;CYP11B1;CYP11B2;DECR1;DPYS;DURS1;EBS1;ECA1;EGI;EXT1;EYA1;FGFR1;GNRH1;GSR;GULOP;HR;KCNQ3;KFM;KWE;LGCR;LPL;MCPH1;MOS;MYC;NAT1;NAT2;NBS1;PLAT;PLEC1;PRKDC;PXMP3;RP1;SCZD6;SFTPC;SGM1;SPG5A;STAR;TG;TRPS1;TTPA;VMD1;WRN;ABCA1;ABL1;ABO;ADAMTS13;AK1;ALAD;ALDH1A1;ALDOB;AMBP;AMCD1;ASS;BDMF;BSCL;C5;CDKN2A;CHAC;CLA1;CMD1B;COL5A1;CRAT;DBH;DNAI1;DYS;DYT1;ENG;FANCC;FBP1;FCMD;FRDA;GALT;GLDC;GNE;GSM1;GSN;HSD17B3;HSN1;IBM2;INVS;JBTS1;LALL;LCCS1;LCCS;LGMD2H;LMX1B;MLLT3;MROS;MSSE;NOTCH1;ORM1;PAPPA;PIP5K1B;PTCH;PTGS1;RLN1;RLN2;RMRP;ROR2;RPD1;SARDH;SPTLC1;STOM;TDFA;TEK;TMC1;TRIM32;TSC1;TYRP1;XPA;CACNB2;COLl7A1;CUBN;CXCL12;CYP17;CYP2C19;CYP2C9;EGR2;EMX2;ERCC6;FGFR2;HK1;HPSI;IL2RA;LGI1;LIPA;MAT1A;MBL2;MKI67;MXI1;NODAL;OAT;OATL3;PAX2;PCBD;PEO1;PHYH;PNLIP;PSAP;PTEN;RBP4;RDPA;RET;SFTPA1;SFTPD;SHFM3;SIAL;THC2;TLX1;TNFRSF6;UFS;UROS;AA;ABCC8;ACAT1;ALX4;AMPD3;ANC;APOA1;APOA4;APOC3;ATM;BSCL2;BWS;CALCA;CAT;CCND1;CD3E;CD3G;CD59;CDKN1C;CLN2;CNTF;CPT1A;CTSC;DDB1;DDB2;DHCR7;DLAT;DRD4;ECB2;ED4;EVR1;EXT2;F2;FSHB;FTH1;G6PT1;G6PT2;GIF;HBB;HBBP1;HBD;HBE1;HBG1;HBG2;HMBS;HND;HOMG2;HRAS;HVBS1;IDDM2;IGER;INS;JBS;KCNJ11;KCNJ1;KCNQ1;LDHA;LRP5;MEN1;MLL;MYBPC3;MYO7A;NNO1;OPPG;OPTB1;PAX6;PC;PDX1;PGL2;PGR;PORC;PTH;PTS;PVRL1;PYGM;RAG1;RAG2;ROM1;RRAS2;SAA1;SCA5;SCZD2;SDHD;SERPING1;SMPD1;TCIRG1;TCL2;TECTA;TH;TREH;TSG101;TYR;USH1C;VMD2;VRNI;WT1;WT2;ZNF145;A2M;AAAS;ACADS;ACLS;ACVRL1;ALDH2;AMHR2;AOM;AQP2;ATD;ATP2A2;BDC;C1R;CD4;CDK4;CNA1;COL2A1;CYP27B1;DRPLA;ENUR2;FEOM1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前記インビトロで合成されたmRNAは、インビトロで転写(IVT)することにより得られ、Ψ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)又は修飾された核酸塩基を含むΨ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)を含み、かつ
前記インビトロで合成されたmRNAの調製物は、生得的免疫応答を誘導することによる前記細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く精製工程を用いて精製されており、
前記RNA夾雑物分子は、二本鎖RNA夾雑物分子を含み、
前記mRNAが精製されていることは、前記精製されたインビトロで合成されたmRN
A分子の調製物で形質移入された樹状細胞によるIFN-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの測定不可能な分泌と、精製されていないインビトロで合成されたmRNAの調製物で形質移入された樹状細胞による前記サイトカインの測定可能な分泌とを比較することにより決定され、
前記遺伝子療法は、前記インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物を対象に投与することを含む、遺伝子療法において使用する、インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物。 - 前記精製されたインビトロで合成されたmRNAの調製物中の全RNAの0.01%未満が、2本鎖RNA夾雑物分子からなる、請求項8または9に記載の使用。
- 前記精製工程の結果、前記インビトロで合成されたmRNAの調製物は、組換えタンパク質の検出可能な発現を除去するのに十分な免疫応答を誘発することなく、反復して投与されることができる、または、前記インビトロで合成されたmRNAの調製物は、炎症性サイトカインの発生しない反復した送達が可能なように、免疫原性が欠失している、請求項8、9、または11に記載の使用。
- 前記精製工程は、
A.HPLCまたは重力フローカラム精製を用いた前記インビトロで合成されたmRNAの調製物の精製;および/または
B.短鎖のリボヌクレアーゼIII(RNaseIII)消化産物が生成されるように、RNaseIII酵素を用いて前記インビトロで合成されたmRNAの調製物を処理すること、および前記mRNAの調製物から、前記短鎖のRNaseIII消化産物を除去するように精製すること
を含む、請求項8、9、11、または12に記載の使用。 - 前記インビトロで合成されたmRNAは、5-メチルシチジン(m5C)をさらに含む、請求項8、9、11、12、または13に記載の使用。
- 前記免疫原性は、さらに、IL-12、IFN-α、TNF-α、RANTES、MIP-lα、MIP-lβ、IL-6、IFN-β、または、IL-8の分泌の測定によって決定される、請求項8に記載の使用。
- 前記免疫原性は、好ましくは、IL-12、IFN-α、TNF-α、RANTES、MIP-lα、MIP-lβ、IL-6、IFN-β、または、IL-8であるサイトカインの分泌の測定によって決定される、請求項8に記載の使用。
- 哺乳類細胞の免疫原性を欠失させる、インビトロで合成されたmRNA分子の精製された調製物を含む医薬組成物の製造方法であって、
前記インビトロで合成されたmRNAは、インビトロで転写(IVT)することにより得られ、Ψ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)又は修飾された核酸塩基を含むΨ(5-β-D-リボフラノシルウラシル)を含み、かつ
生得的免疫応答を誘導することによる前記細胞に対する免疫原性および毒性のRNA夾雑物分子を取り除く工程を用いて、前記インビトロで合成されたmRNAの調製物を精製する精製工程を含み、
前記RNA夾雑物分子は、二本鎖RNA夾雑物分子を含み、
前記mRNAが精製されていることは、前記精製されたインビトロで合成されたmRN
A分子の調製物で形質移入された樹状細胞によるIFN-αサイトカインまたはTNF-αサイトカインの測定不可能な分泌と、精製されていないインビトロで合成されたmRNAの調製物で形質移入された樹状細胞による前記サイトカインの測定可能な分泌とを比較することにより決定される、製造方法。 - 前記精製されたインビトロで合成されたmRNAの調製物中の全RNAの0.01%未満が、2本鎖RNA夾雑物分子からなる、請求項10に記載の、遺伝子療法において使用する、インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物。
- 前記精製工程の結果、前記インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物は、組換えタンパク質の検出可能な発現を除去するのに十分な免疫応答を誘発することなく、投与されることができる、または、前記インビトロで合成されたmRNAは、炎症性サイトカインの発生しない送達が可能なように、免疫原性が欠失している、請求項10または18に記載の、遺伝子療法において使用する、インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物。
- 前記精製工程は、
A.HPLCまたは重力フローカラム精製を用いた前記インビトロで合成されたmRNAの調製物の精製;および/または
B.短鎖のリボヌクレアーゼIII(RNaseIII)消化産物が生成されるように、RNaseIII酵素を用いて前記インビトロで合成されたmRNAの調製物を処理すること、および前記mRNAの調製物から、前記短鎖のRNaseIII消化産物を除去するように精製すること
を含む、請求項10、18または19に記載の、遺伝子療法において使用する、インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物。 - 前記インビトロで合成されたmRNAは、5-メチルシチジン(m5C)をさらに含む、請求項10、18、19、または20に記載の、遺伝子療法において使用する、インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物。
- 前記免疫原性は、さらに、IL-12、IFN-α、TNF-α、RANTES、MIP-lα、MIP-lβ、IL-6、IFN-β、または、IL-8の分泌の測定によって決定される、請求項10に記載の、遺伝子療法において使用する、インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物。
- 前記免疫原性は、好ましくは、IL-12、IFN-α、TNF-α、RANTES、MIP-lα、MIP-lβ、IL-6、IFN-β、または、IL-8であるサイトカインの分泌の測定によって決定される、請求項10に記載の、遺伝子療法において使用する、インビトロで合成されたmRNAの精製された調製物。
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