BR112012013875B1

BR112012013875B1 - método in vitro para reprogramar células somáticas humanas ou de outros mamíferos para células tronco pluripotentes induzidas (células ips ou ipscs) e composição

Info

Publication number: BR112012013875B1
Application number: BR112012013875A
Authority: BR
Inventors: Person Anthony; Weissman Drew; Dahl Gary; Jendrisak Jerome; Meis Judith; Kariko Katalin
Original assignee: Person Anthony; Weissman Drew; Dahl Gary; Jendrisak Jerome; Meis Judith; Kariko Katalin
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2020-04-14
Also published as: SG181564A1; HUE047165T2; IL220219A0; US10006007B2; LT3287525T; KR20180081836A; JP2022185047A; BR112012013875A2; US20180265848A1; US8808982B2; SG10201408129XA; KR20230035422A; US11739300B2; JP7475406B2; EP3112467A1; CN102947450B; CN107090436B; JP2021078516A; US20140315988A1; AU2010328310B2

Abstract

preparações de rna compreendendo rna modificado purificado para reprogramar células. a presente invenção fornece composições e métodos para reprogramar células somáticas usando preparações de rna purificado compreendendo mrna de fita simples que codifica um fator de indução de célula ips. as preparações de rna purificado são preferencialmente substancialmente isentas de moléculas contaminantes de rna que: i) ativariam uma resposta imune nas células somáticas, ii) diminuiriam a expressão do mrna de fita simples nas céluas somáticas, e/ou iii) ativariam sensores de rna nas células somáticas. em certas modalidades, as preparações de rna purificado são substancialmente isentas de mrnas parciais, rnas de dupla fita, moléculas de rna não capeadas e/ou mrnas de fita simples de passagem.

Description

MÉTODO IN VITRO PARA REPROGRAMAR CÉLULAS SOMÁTICAS HUMANAS OU DE OUTROS MAMÍFEROS PARA CÉLULAS TRONCO PLURIPOTENTES INDUZIDAS (CÉLULAS IPS OU IPSCS) E COMPOSIÇÃO

O presente pedido reivindica prioridade do pedido provisório US 61/267.312, depositado em 7 de dezembro de 2009, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade.

O presente pedido reivindica prioridade também do pedido provisório US 11/990.646, depositado em 27 de março de 2009, que é uma entrada nafase nacional nos EUA do PCT/US06/32372, depositado em 21 de agosto de 2006, que reivindica prioridade do pedido provisório US 60/710.164, depositado em 23 de agosto de 2005, todos os quais estão aqui incorporados como referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições e métodos para alterar ou reprogramar o estado de diferenciação de células eucarióticas, incluindo células humanas ou outras células animais, contatando as células com preparações purificadas de RNA que compreendem ou consistem em uma ou mais moléculas de mRNA de fita simples diferentes que cada uma codifica um fator de reprogramação (por exemplo, um fator de indução de célula iPS). As moléculas de mRNA de fita simples preferencialmente compreendem pelo menos um nucleosídeo modificado (por exemplo, selecionado do grupo que consiste em uma pseudouridina (abreviada pela letra Grega “psi” ou “Ψ”), 5-metilcitosina (m⁵C), 5-metiluridina (m⁵U), 2'-O-metiluridina (Um ou m²’°U), 2-tiouridina (s²U), e N⁶-metiladenosina (m⁶A)) no lugar de pelo menos uma parte do nucleosídeo canônico não modificado correspondente (por exemplo, no lugar de substancialmente todos os nucleosídeos canônicos não modificados A, C, G, ou T). Além disso, as moléculas de mRNA de fita simples são preferencialmente purificadas para estar substancialmente isentas de moléculas de RNA contaminante que poderiam ativar uma resposta não pretendida e diminuir a expressão do mRNA de fita simples e/ou ativar sensores de RNA nas células. Em certas modalidades, as preparações de RNA purificado são preferencialmente substancialmente isentas de moléculas de RNA contaminantes que são: menores ou maiores do que as moléculas de mRNA de fita simples moléculas de comprimento total, dupla fita ou e/ou RNA não capeado.

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FUNDAMENTOS

Em 2006, foi reportado (Takahashi and Yamanaka 2006) que a introdução de genes que codificam quatro fatores de proteína (OCT4 (Octamer-4; POU classe 5 homeobox 1), SOX2 (SRY (região determinadora de sexo Y)-box 2), KLF4 (fator tipo Krueppel 4), e cMYC) em células somáticas diferenciadas de camundongos induziram aquelas células a se tornarem células-tronco pluripotentes, (referenciadas aqui como “células tronco pluripotentes induzidas,” “células iPS,” ou “iPSCs”). Após este relato original, células-tronco pluripotentes foram ainda induzidas por transformação das células somáticas humanas com genes que codificam os fatores de proteína humana semelhantes (OCT4, SOX2, KLF4, e c-MYC) (Takahashi et al. 2007), ou transformando células humanas somáticas com genes que codificam os fatores humanos OCT4 e SOX2 mais genes que codificam dois outros fatores humanos, NANOG e LIN28 (Lin-28 homólogo A) (Yu et al. 2007). Todos esses métodos utilizaram retrovírus ou lentivírus para integrar os genes que codificam os fatores de reprogramação em genomas de células transformadas e as células somáticas foram reprogramadas em células iPS somente durante um longo período de tempo (por exemplo, de uma semana).

A geração de células iPS a partir de células somáticas diferenciadas oferece grande promessa como um possível meio para tratamento de doenças através do transplante de células. A possibilidade de gerar células iPS a partir de células somáticas de pacientes individuais também pode permitir o desenvolvimento de terapias específicas do paciente com menos riscos devido a rejeição imunológica. Ainda, a geração de células iPS a partir de células somáticas específicas de doenças oferece promessa como um meio para estudar e desenvolver drogas pra tratar estados de doença específicos (Ebert et al. 2009, Lee et al. 2009, Maehr et al. 2009).

A liberação viral de genes que codificam fatores de reprogramação de proteína (ou “fatores iPSC”) fornece uma forma altamente eficiente de criar células iPS a partir de células somáticas, mas a integração de DNA exógeno no genoma, seja aleatório ou não aleatório, cria resultados não previsíveis e pode, por fim, levar ao câncer (Nakagawa et al. 2008). Novos relatos mostram que as células iPS podem ser criadas (em eficiência inferior) usando outros métodos que não requerem integração de genoma. Por exemplo, transfecções repetidas de

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3/141 plasmídeos de expressão contendo genes para OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC em fibroblastos embrionários de camundongo para gerar células iPS foram demonstradas (Okita et al. 2008). As células-tronco pluripotentes induzidas foram ainda geradas a partir de células somáticas humanas pela introdução de um plasmídeo que expressou genes que codificam OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG e LIN28 humanos (Yu et al. 2009). Outras abordagens bem sucedidas para gerar células iPS incluem tratar células somáticas com: fatores de reprogramação de proteína recombinantes (Zhou et al. 2009); adenovírus não integrantes (Stadtfeld et al. 2008); ou transposons piggyBac (Woltjen et al. 2009) para liberar fatores de reprogramação. Atualmente, a geração de células iPS usando essas técnicas de liberação nãovirais para liberar fatores reprogramação é extremamente ineficiente. Futuros métodos para gerar células iPS para potenciais aplicações clínicas precisam aumentar a velocidade e a eficiência da formação de células iPS, mantendo a integridade do genoma.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece composições e métodos reprogramação do estado de diferenciação de células eucarióticas, incluindo células humanas ou outras células animais, contatando as células com preparações purificadas de RNA que compreende ou consiste em uma ou mais moléculas de mRNA de fita simples diferentes que cada uma codifica um fator de reprogramação (por exemplo, um fator de indução de célula iPS). As moléculas de mRNA de fita simples purificadas preferencialmente compreendem pelo menos um nucleosídeo modificado (por exemplo, selecionado do grupo que consiste em uma pseudouridina (Ψ), 5metilcitosina (m⁵C), 5-metiluridina (m⁵U), 2'-O-metiluridina (Um ou m²’^-OU), 2-tiouridina (s²U), e N6-metiladenosina (m⁶A)) no lugar de pelo menos uma parte (por exemplo, incluindo substancialmente todos) dos nucleosídeos canônicos não modificados correspondentes dos nucleosídeos canônicos não modificados correspondentes A, C, G ou T. Além disso, as moléculas de mRNA de simples de fita são preferencialmente purificadas para estar substancialmente isentas de moléculas do RNA contaminante que poderiam ativar uma resposta não pretendida, diminuir a expressão do mRNA de fita simples e/ou ativar sensores de RNA nas células (por exemplo, enzimas dependentes de RNA de fita dupla) nas células. Em certas modalidades, as preparações de RNA purificado são preferencialmente substancialmente isentas de moléculas de RNA contaminantes que são: menores ou maiores do que as moléculas de mRNA de fita simples moléculas de comprimento total, dupla fita ou

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4/141 e/ou RNA não capeado. Em algumas modalidades preferenciais, a invenção fornece composições e métodos para reprogramação de células eucarióticas diferenciadas, incluindo células somáticas humanas ou de outros animais, contatando as células com preparações de RNA purificado compreendendo ou consistindo de uma ou mais moléculas de mRNA de fita simples diferentes que cada uma codifica um fator de indução de célula iPS.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para alterar o estado de diferenciação de uma célula somática que compreende: introduzir um mRNA que codifica um fator de indução de célula iPS em uma célula somática para gerar uma célula diferenciada reprogramada, em que o mRNA compreende pelo menos um 5-metilcitidina (ou outros modificados com base na descrição aqui).

Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos para reprogramar uma célula humana que apresenta um primeiro estado diferenciado ou fenótipo em uma célula que apresenta um segundo estado diferenciado ou fenótipo compreendendo: introduzir na célula que exibe um primeiro estado diferenciado uma preparação de RNA compreendendo moléculas de mRNA purificadas que codificam pelo menos um fator de reprogramação e cultura da célula nas condições em que a célula exibe um segundo estado diferenciado. Em certas modalidades, as moléculas de mRNA modificadas contém pelo menos um nucleosídeo modificado selecionado do grupo que consiste em pseudouridina ou 5-metilcitidina. Em certas modalidades, á célula e de um humano ou animal. Em outras modalidades, a preparação purificada de RNA: i) compreende primeiro mRNAs de fita simples que codificam um primeiro fator de indução de célula iPS, em que substancialmente todos os primeiros mRNAs completos de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcitidina, e ii) é substancialmente isendo de moléculas de RNA contaminante que são capazes de ativar sensores de RNA em dita célula somática. Em certas modalidades, as moléculas de RNA contaminantes são selecionadas do grupo que consiste em: mRNAs parciais de codificação de apenas uma parte de dito fator de indução de célula iPS, moléculas de RNA que são menores que o mRNA de comprimentos completos, moléculas de RNA que são maiores que o mRNA de comprimentos completos, moléculas de mRNA de dupla-fita e moléculas de moléculas de mRNA um-capped.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para reprogramar uma célula somática (por exemplo, desdiferenciar ou transdiferenciar) compreendendo: contatar

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5/141 uma célula somática com uma preparação de RNA purificada para gerar uma celual reprogramada, em que a preparação de RNA purificada: i) compreende primeiros mRNAs de fita simples que codificam um primeiro fator de indução de célula iPS, em que substancialmente todos os primeiros mRNAs completos de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo 5-metilcitidina, e ii) é substancialmente isento de moléculas contaminantes (por exemplo, Moléculas de RNA contaminantes) que são capazes de ativar os sensores de RNA na célula somática. Em modalidades particulares, as moléculas de RNA contaminantes compreendem: mRNAs parciais que codificam somente uma parte do fator de indução de célula iPS, mRNAs de fita simples run-on que codificam o fator de indução de célula iPS e codificam pelo menos uma parte adicional do fator de indução de célula iPS, moléculas de mRNA de fita dupla, e moléculas de mRNA un-capped. Em certas modalidades, os primeiros mRNAs de fita simples não codificam ainda uma parte adicional do primeiro fator de indução de célula iPS.

Em algumas modalidades, a célula reprogramada é uma célula desdiferenciada (por exemplo, célula-tronco ou célula tipo célula-tronco). Em outras modalidades, a célula reprogramada é uma célula transdiferenciada (por exemplo, uma célula de pele é reprogramada em uma célula neuronal, ou outro tipo de alteração). Em outras modalidades, os primeiros mRNAs de fita simples que codificam os primeiros completos fatores de indução de iPS (por exemplo, o mRNA codifica a sequência de codificação inteira para um fator de indução de iPS particular). Em outras modalidades, o outro contato compreende contatar a célula somática com um fator de crescimento e/ou citocina (por exemplo, após um período de tempo). Em outras modalidades, o outro contato compreende contatar a célula somática com um inibidor de resposta imune.

Em certas modalidades, todos ou quase todas de nuclesídeos uridina no primeiro mRNA de fita simples são substituídos por nucleosídeos de pseudouridina. Em outras modalidades, todos ou quase todos os nucleosídeos citidina no primeiro mRNA de fita simples são substituídos por nucleosídeos de 5-metilcitidina ou outra base mencionada aqui.

Em modalidades particulares, a presente invenção fornece métodos para gerar uma célula reprogramada compreendendo: contatar uma célula somática com uma preparação de RNA purificado para gerar uma célula reprogramada que é capaz de sobreviver em cultura por pelo menos 10 dias (por exemplo, pelo menos 10 dias, pelo menos 13 dias, pelo menos 16

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6/141 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 40 dias ou é capaz de formar uma linhagem celular), em que a preparação de RNA purificado compreende primeiros mRNAs de fita simples que codificam um fator de indução de célula iPS, e em que a maior parte dos primeiros mRNAs de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina.

Em certas modalidades, a preparação de RNA purificado é livre de uma quantidade de moléculas de RNA contaminante que poderiam ativar uma resposta imune na célula somática suficiente para impedir que uma célula reprogramada sobreviva pelo menos 10 dias em cultura (por exemplo, pelo menos 10 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 40 dias, ou mais). Em outras modalidades, as moléculas de RNA contaminante incluem: mRNAs parciais que codificam somente uma parte do fator de indução de célula iPS, mRNAs de fita simples run-on que codificam o fator de indução de célula iPS e codificam pelo menos uma parte adicional do fator de indução de célula iPS, moléculas de mRNA de fita dupla, e moléculas de mRNA un-capped e misturas das mesmas. Em certas modalidades, a célula reprogramada que é gerada é capaz de formar uma linhagem celular reprogramada. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado e livre de uma quantidade de moléculas de RNA contaminante que poderiam ativar uma resposta imune na célula somática suficiente para impedir a geração da linhagem celular reprogramada.

Em modalidades particulares, as moléculas de RNA contaminantes são selecionadas do grupo que consiste em: mRNAs parciais que codificam somente uma parte do fator de indução de célula iPS, mRNAs de fita simples run-on que codificam o fator de indução de célula iPS e codificam pelo menos uma parte adicional do fator de indução de célula iPS, moléculas de mRNA de fita dupla, e moléculas de mRNA un-capped e misturas das mesmas.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para gerar linhagem de células reprogramada compreendendo: a) contatar uma célula somática com uma preparação de RNA purificado para gerar uma célula reprogramada, em que uma preparação de RNA purificado compreende mRNAs que codificam um fator de indução de célula iPS, e em que a maioria dos mRNAs compreende pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina e, b) cultivar a célula desdiferenciada para gerar uma linhagem de células reprogramadas. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado é livre de uma quantidade de moléculas contaminantes que poderiam ativar uma resposta imune na

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7/141 célula somática suficiente para impedir a geração da linhagem celular reprogramada. Em certas modalidades, a resposta imune envolve ativação de sensores de RNA na célula somática.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para reprogramar uma célula somática compreendendo: contatar uma célula somática com uma preparação de RNA purificado para gerar uma célula reprogramada, em que a preparação de RNA purificado: i) compreende primeiros mRNAs de fita simples que codificam um primeiro fator de indução de célula iPS, emque substancialmente todos os primeiros mRNAs de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina, e ii) é substancialmente livre de: a) mRNAs parciais que codificam somente uma parte do primeiro fator de indução de célula iPS e b) moléculas de mRNA de fita dupla. Em outras modalidades, o primeiro mRNA de fita simples não codifica ainda uma parte adicional do primeiro fator de indução de célula iPS. Em modalidades particulares, o primeiro mRNA de fita simples completamente codifica o primeiro fator de indução de célula iPS. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado é ainda substancialmente livre (ou essencialmente livre ou virtualmente livre ou livre) de mRNAs run-on de fita simples que codifica o primeiro fator de indução de célula iPS e que codifica pelo menos uma parte adicional do primeiro fator de indução de célula iPS. Em outras modalidades, substancialmente todos os primeiros mRNAs completos de fita simples são 5' capeados. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado é ainda substancialmente livre de moléculas de mRNA uncapped. Em algumas modalidades, substancialmente todos os primeiros mRNAs de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina. Em modalidades adicionais, substancialmente todos os primeiros mRNAs de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina. Em outras modalidades, substancialmente todos os primeiros mRNAs de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e pelo menos um resíduo de 5metilcitidina.

Em certas modalidades, a preparação de RNA purificado compreende um reagente de transfecção. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado é obtida por purificação de HPLC de uma amostra de RNA que contém uma quantidade substancial dos mRNAs parciais e os mRNAs de fita dupla. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado é essencialmente livre de mRNAs parciais e os mRNAs run-on de fita simples. Em algumas

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8/141 modalidades, a preparação de RNA purificado é essencialmente livre ou virtualmente livre ou livre de moléculas de mRNA de fita dupla. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado é essencialmente livre ou virtualmente livre de moléculas de mRNA uncapped. Em algumas modalidades, substancialmente todos os primeiros mRNAs de fita simples são poliadenilados. Em outras modalidades, os mRNAs completos de fita simples são capped com 7-metilguanosina.

Em algumas modalidades, o primeiro fator de indução de célula iPS é selecionado do grupo que consiste em KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado: i) compreende ainda mRNAs de fita simples que codificam um segundo fator de indução de célula iPS, em que os segundos mRNAs de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina, e ii) é ainda substancialmente livre de: a) mRNAs parciais que codificam somente uma parte do segundo fator de indução de célula iPS, e b) mRNAs de fita dupla. Em outras modalidades, a preparação de RNA purificado é ainda substancialmente livre de mRNAs run-on de fita simples que codificam um segundo fator de indução de célula iPS e codificam pelo menos uma parte adicional do segundo fator de indução de célula iPS. Em algumas modalidades, o segundo fator de indução de célula iPS é selecionado do grupo que consiste em KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2. Em certas modalidades, a célula somática é um fibroblasto. Em outras modalidades, a célula reprogramada é uma célulatronco pluripotente. Em outras modalidades, a célula diferenciada expressa NANOG e TRA-160. Em algumas modalidades, a célula é in vitro. Em outras modalidades, a célula reside em cultura. Em modalidades particulares, a célula reside em meio condicionado MEF.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições compreendendo uma preparação de RNA purificado, em que a preparação de RNA purificado : i) compreende primeiros mRNAs de fita simples que codificam um primeiro fator de indução de célula iPS, em que os primeiros mRNAs de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina, e ii) é substancialmente livre de moléculas de RNA contaminante, que são capazes de ativar sensores de RNA em uma célula somática. Em certas modalidades, a presente invenção fornece composições compreendendo uma preparação de RNA purificado, em que a preparação de RNA purificado : i) compreende primeiros mRNAs de fita simples que codificam um primeiro fator de indução

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9/141 de célula iPS, em que os mRNAs completos de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina, e ii) é substancialmente livre de: a) mRNAs parciais que codificam somente uma parte do primeiro fator de indução de célula iPS, e b) RNA de dupla fita.

Em certas modalidades, a preparação de RNA purificado é ainda substancialmente livre de mRNAs run-on de fita simples que codifica o primeiro fator de indução de célula iPS e que codifica pelo menos uma parte adicional do primeiro fator de indução de célula iPS. Em algumas modalidades, a preparação de RNA purificado: i) ainda compreende segundos mRNAs de fita simples que codificam um segundo fator de indução de célula iPS, em que os segundos mRNAs completos de fita simples compreendem pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina, e ii) é substancialmente livre de: a) mRNAs parciais que codificam somente uma parte do segundo fator de indução de célula iPS, e b) mRNAs run-on de fita simples que codificam segundos primeiro fator de indução de célula iPS e codifica pelo menos uma parte adicional do segundo fator de indução de célula iPS.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições compreendendo um mRNA sintetizado in vitro que codifica o gene MYC, em que o mRNA sintetizado in vitro compreende pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5metilcistidina. Em certas modalidades, as composições são substancialmente livres de moléculas de RNA contaminante que são capazes de ativar sensores de RNA em uma célula somática.

Em modalidades particulares, a presente invenção fornece métodos para indução de uma célula mamífera para produzir a proteína MYC compreendendo: contatar uma célula mamífera com um mRNA sintetizado in vitro que codifica o gene MYC, em que o mRNA sintetizado in vitro compreende pelo menos um resíduo de pseudouridina e/ou pelo menos um resíduo de 5-metilcistidina, assim induzindo a célula mamífera a produzir a proteína MYC. Em outras modalidades, a célula mamífera é uma célula dendrítica. Em outras modalidades, a célula mamífera é uma célula alveolar, um astrócito, uma célula da micróglia, ou um neurônio.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratar um sujeito compreendendo contatar um sujeito com a proteína MYC que produz a célula mamífera descrita acima e aqui.

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Em modalidades adicionais, a presente invenção fornece métodos de sintetizar uma molécula de RNA transcrita in vitro que codifica o gene MYC compreendendo: combinar uma RNA polimerase isolada, uma sequência de ácido nucleico molde que codifica o gene MYG, nucleotídeos não modificados, e nucleotídeos pseudouridina ou 5-metilcistidina modificados sob condições de modo que uma molecuna de RNA transcrita in vitro que codifica o gene MYC é gerara que compreende pelo menos um resíduod e pseudouridina ou 5-metilcistidina.

Os experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da presente invenção demonstraram que as moléculas de mRNA podem ser administradas às células e induzir um processo de desdiferenciação para gerar células desdiferenciadas - incluindo células-tronco pluripotentes. Assim, a presente invenção fornece composições e métodos para gerar as células iPS. Surpreendentemente, a administração de mRNA pode fornecer gerações altamente eficientes de células iPS.

A presente invenção ainda fornece RNA, oligorribonucleotídeo, e moléculas de polirribonucleotídeos compreendendo pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, vetores de terapia gênica compreendendo os mesmos, métodos de sintetizar os mesmos, e métodos para a substituição de gene, terapia de gene, silenciamento de gene de transcrição, e a liberação de proteínas terapêuticas para o tecido in vivo, compreendendo as moléculas. A presente invenção ainda fornece métodos de redução da imunogenicidade de RNA, oligorribonucleotídeo, e moléculas de polirribonucleotídeos.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para desdiferenciar uma célula somática compreendendo: introduzir mRNA que codifica um ou mais fatores de indução de iPSC em uma célula somática para gerar uma célula desdiferenciada.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para desdiferenciar uma célula somática compreendendo: introduzir mRNA que codifica um ou mais fatores de indução de iPSC em uma célula somática e manter a célula sob condições em que a célula é viável e o mRNA que é introduzido na célula é traduzido em quantidade suficiente e por tempo suficiente para gerar uma célula desdiferenciada. Em algumas modalidades preferenciais, a célula desdiferenciada é uma célula-tronco pluripotente induzida (iPSC).

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para alterar o estado de desdiferenciação (ou estado desdiferenciado) de uma célula eucariótica compreendendo: introduzir mRNA que codifica um ou mais fatores de reprogramação em uma célula e manter

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11/141 a célula em condições em que a célula é viável e o mRNA que é introduzido na célula é traduzido em quantidade suficiente e por tempo suficiente para gerar uma célula que apresenta um estado alterado de diferenciação comparado à célula em que o mRNA foi introduzido.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para alterar o estado de desdiferenciação de uma célula eucariótica compreendendo: introduzir mRNA que codifica um ou mais fatores de reprogramação em uma célula e manter a célula em condições em que a célula é viável e o mRNA que é introduzido na célula é traduzido em quantidade suficiente e por tempo suficiente para gerar uma célula que apresenta um estado alterado de diferenciação comparado à célula em que o mRNA foi introduzido. Em algumas modalidades, o estado alterado de diferenciado é um estado desdiferenciado de diferenciação comparado à célula em que o mRNA foi introduzido. Por exemplo, em algumas modalidades, a célula que apresenta o estado alterado de diferenciação é uma célula-tronco pluripotente que é desdiferenciada comparada a uma célula somática em que o mRNA foi introduzido (por exemplo, uma célula somática que é diferenciada em um fibroblasto, um cardiomiócito, ou outro tipo celular diferenciado). Em algumas modalidades, a célula em que o mRNA é introduzido é uma célula somática de uma linhagem, fenótipo, ou função, e a célula que apresenta o estado alterado de diferenciação é uma célula somática que apresenta uma linhagem, fenótipo ou função que é diferente do que da célula em que o mRNA foi introduzido; assim, nestas modalidades, o método resulta em transdiferenciação (Graf and Enver 2009).

Os métodos da invenção não são limitados com relação a uma célula particular em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a célula em que o mRNA é introduzido é dericado de qualquer eucarioto multicelular. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a célula em que o mRNA é introduzido é selecionada de entre uma célula humana e outra célula animal. Embora o trabalho apresentado aqui foi realizado usando células de humanos ou outros animais, os requerentes ainda reivindicam que os métodos da presente invenção compreendendo reprogramar células humanas e animais por contatar as células com uma preparação de RNA purificado que consiste em uma ou mais moléculas de mRNA de fita simples purificadas, cada um dos quais codifica um fator de reprogramação de proteína (por exemplo, um fator de transcrição) ainda pertence à reprogramação de outras células eucarióticas (por exemplo, células de planta e células fúngicas). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a célula em

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12/141 que o mRNA é introduzido é uma célula normal que é de um organismo que é livre de uma doença conhecida. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a célula em que o mRNA é introduzido é uma célula de um organismo que tem uma doença conhecida. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a célula em que o mRNA é introduzido é uma célula que é livre de uma patologia conhecida. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a célula em que o mRNA é introduzido é uma célula que apresenta um estado de doença ou uma patologia conhecida (por exemplo, uma célula de câncer, ou uma célula beta pancreática que apresenta características propriedades metabólicas de uma célula diabética).

A invenção não é limitada ao uso de um tipo de célula específica (por exemplo, a um tipo de célula somática específica) em modalidades dos métodos compreendendo introduzir mRNA que codifica um ou mais fatores de indução de células iPSC para gerar uma célula desdiferenciada (por exemplo, uma célula iPS). Qualquer célula que é sujeita à desdiferenciação usado fatores de indução de célula iPS é contemplado. Ditas células incluem, entre outras, fibroblastos, queratinócitos, adipócitos, linfócitos, células T, células B, células mononucleares em sangue de cordão, células de mucosa oral, células hepáticas, HeLa, MCF-7 ou outras células de câncer. Em algumas modalidades, as células residem in vitro (por exemplo, em cultura) ou in vivo. Em algumas modalidades, quando gerado em cultura, um meio condicionado livre de célula (por exemplo, meio condicionado MEF) é usado. Conforme demostrado abaixo, dito meio fornecer geração melhorada de célula iPS. A invenção não é limitada, no entanto, às condições de cultura usadas. Qualquer condição de cultura ou meio agora conhecido ou posteriormente identificado como úteis para os métodos da invenção (por exemplo, para gerar células iPS a partir de células somáticas e manter ditas células) é contemplado para uso com a invenção. Por exemplo, embora não preferencial, em algumas modalidades do método, uma camada de célula alimentadora é usada ao invés de meio condicionado para cultivas as células que são tratadas usando o método.

Em algumas modalidades de qualquer um destes métodos, a etapa de introduzir mRNA compreende liberar o mRNA na célula (por exemplo, uma célula humana ou outra célula somática animal) com um um reagente de transfecção (por exemplo, reagente de transfecção TRANSIT™ mRNA, MirusBio, Madison, WI).

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No entanto, a invenção não é limitada pela natureza do método de transfecção utilizado. De fato, qualquer processo de transfecção conhecido, ou identificado no futuro que é capaz de liberar moléculas de mRNA nas células in vitro ou in vivo, é contemplado, incluindo métodos que liberam o mRNA nas células em cultura ou em um meio de suporte de vida, seja ditas células compreendem células isoladas ou células compreendendo um tecido ou órgão eucariótico, ou métodos que liberam o mRNA in vivo nas células em um organismo, como uma humana, animal, de planta ou fungo. Em algumas modalidades, o reagente de transfecção compreende um lipídeo (por exemplo, lipossomas, micelas, etc.). Em algumas modalidades, o reagente de transfecção compreende uma nanopartícula ou nanotubo. Em algumas modalidades, o reagente de transfecção compreende um composto catiônico (por exemplo, polietileno imina ou PEI). Em algumas modalidades, o método de transfecção usa uma corrente elétrica par liberar o mRNA na célula (por exemplo, por eletroporação). Em algumas modalidades, o método de transfecção usa um método de bolística para liberar o mRNA na célula (por exemplo, uma “pistola de gene” ou sistema de liberação de partícula biolística.)

Os dados apresentados aqui mostram que, com relação ao mRNA introduzido na célula, certas quantidades de mRNAs usados nos EXEMPLOS descritos aqui resultou em maior eficiência e indução mais rápida de células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas particulares usadas do que outras quantidades de mRNA. No entanto, os métodos da presente invenção não são limitados ao uso de uma quantidade específica de mRNA para introduzir na célula. Por exemplo, em algumas modalidades, um total de três doses, cada dose compreendendo 18 microgramas de cada um dos seis diferentes mRNAs, cada um codificando um fator humano de reprogramação diferente, foi usado para introduzir o mRNA em aproximadamente 3 x 10⁵ células de fibroblastos humanos em uma placa de 10 cm (por exemplo, liberada usando um reagente de transfecção contendo lipídeo), embora em outras modalidades, quantidades maiores ou menores de mRNAs foram usados para introduzir nas células.

A invenção não é limitada a uma forma química particular do mRNA usado, embora certas formas de mRNA podem produzir resultados mais eficientes. No entanto, em algumas modalidades preferenciais, o mRNA compreende pelo menos um nucleosídeo modificado (por exemplo, selecionado do grupo que consiste em um a pseudouridina (Ψ), 5-metilcitosina (m⁵C), 5-metiluridina (m⁵U), 2'-O-metiluridina (Um ou m²’°U), 2-tiouridina (s²U), e N⁶Petição 870180166239, de 21/12/2018, pág. 32/167

14/141 metiladenosina (m⁶A)) no lugar de pelo menos uma parte do nucleosídeo canônico não modificado correspondente (por exemplo, em algumas modalidades preferenciais, pelo menos um nucleosídeo modificado no lugar de substancialmente todos os nucleosídeos canônicos correspondentes não modificados A, C, G, ou T). Em algumas modalidades, o mRNA é poliadenilado. Em algumas modalidades preferenciais, o mRNA é prepared por poliadenilação de um RNA transcrito in vitro (IVT), o método compreendendo contatando o IVT RNA usando uma poli(A) polimerase (por exemplo, RNA polimerase de levedura ou poli(A) polimerase de E. coli). Em algumas modalidades, o mRNA é poliadenilado durante IVT usando um molde de DNA que codifica a cauda poli(A). Independentemente de se o RNA é poliadenilado usando uma poli(A) polimerase ou durante IVT de um molde de DNA, em algumas modalidades preferenciais, o mRNA compreende uma cauda poli-A (por exemplo, uma cauda poli-A contendo 50-200 nucleotídeos, por exemplo, preferencialmente 100-200, 150-200 nucleotídeos, ou mais do que 150 nucleotídeos), embora em algumas modalidades, uma cauda mais longa ou mais curta de poli-A é usada. Em algumas modalidades, o mRNA usado nos métodos é capped. Para maximizar a eficiência de expressão nas células, é preferencial que a maior parte das moléculas de mRNA contenham uma capa. Em algumas modalidades preferenciais, as moléculas de mRNA usadas nos métodos são sintetizados in vitro incubando o RNA primário não capeado na presença de enzima de capeamento. Em algumas modalidades preferenciais, o RNA primário usado na reação de enzima de capeamento é sintetizada por transcrição in vitro (IVT) de uma molécula de DNA que codifica o RNA a ser sintetizado. O DNA que codifica o RNA a ser sintetizado contém um promotor de RNA polimerase, ao qual, uma RNA polimerase se liga e inicia a transcrição do mesmo. Sabe-se ainda na técnica que as moléculas de mRNA geralmente contém regiões de sequência diferente localizadas antes do códon de início de tradução e após o códon de parada de tradução que não são traduzidas. Estas regiões, chamadas de cinco regiões prime não traduzidas (5' UTR) e três regiões prime não traduzidas (3' UTR), respectivamente, podem afetar a estabilidade do mRNA, a localização do mRNA, e a eficiência da tradução do mRNA ao qual estão unidos. Certos 5' e 3' UTRs, como aqueles para alfa e beta globinas são conhecidos por melhorar a estabilidade de mRNA e expressão de mRNAs. Assim, em algumas modalidades preferenciais, os mRNAs que codificam os fatores de reprogramação (por exemplo, fatores de indução de iPSC) apresentam 5' UTR e/ou 3' UTR que resulta em maior

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15/141 estabilidade de mRNA e maior expressão do mRNA nas células (por exemplo, uma alfa globina ou uma beta globina 5' UTR e/ou 3' UTR; por exemplo, um Xenopus ou alfa globina humana ou uma beta globina 5' UTR e/ou 3' UTR, ou, por exemplo, vírus tobacco etch (TEV) 5' UTR).

O IVT pode ser realizado usando qualquer RNA polimerase desde que a síntese do mRNA a partir do molde de DNA que codifica o RNA seja especificamente e suficientemente iniciada a partir de um promotor cognato de RNA polimerase respectivo e mRNA de comprimento completo seja obtido. Em algumas modalidades preferenciais, a RNA polimerase é selecionada de entre T7 RNA polimerase, SP6 RNA polimerase e T3 RNA polimerase. Em algumas outras modalidades, RNA capeado é sintetizado cotranscricionadamente usando um análogo dinucleotídeo capa na reação de IVT (por exemplo, usando um kit AMPLICAP™ T7 ou um kit de transcrição MESSAGEMAX™ T7 ARCACAPPED MESSAGE; EPICENTRE ou CellScript, Madison, WI, USA). Se o capeamento é realizado co-transcricionadamente, preferencialmente o análogo de dinucleotídeo capa é um análogo anti-reverso capa (ARCA). No entanto, o uso de uma reação separada de IVT, seguido por capeamento com um sistema de enzima de capeamento, que resulta em aproximadamente 100% do RNA sendo capeado, é preferenciado capeamento super cotranscricional, que tipicamente resulta em somente cerca de 80% do RNA sendo capeado. Assim, em algumas modalidades preferenciais, um alto percentual de moléculas de mRNA usadas em um método da presente invenção são capeados (por exemplo, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 95%, mais do que 98%, mais do que 99%, mais do que 99,5%, ou mais do que 99,9% da população de moléculas de mRNA são capeadas). Em algumas modalidades preferenciais, o mRNA usado nos métodos da presente invenção tem uma capa com uma estrutura cap1, significando que 2' hidroxil da ribose no penúltimo nucleotídeo com relação ao nucleotídeo capa é metilado. No entanto, em algumas modalidades, mRNA usado nos métodos tem uma capa com a estrutura cap0, significando que o 2' hidroxil da ribose no penúltimo nucleotídeo com relação ao nucleotídeo capa não é metilado. Com alguns, mas não todos os transcritos, a transfecção de células eucarióticas com mRNA contendo uma capa com uma estrutura cap1 resulta em um nível maior ou duração maior da expressão da proteína nas células transfectadas comparada à transfecção das mesmas células com o mesmo mRNA mas com uma capa contendo uma estrutura cap0. Em algumas modalidades, o mRNA usado nos

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16/141 métodos da presente invenção tem um nucleotídeo capa modificado. Em alguns experimentos realizados antes dos experimentos apresentados nos EXEMPLOS aqui, os presentes requerentes demonstraram que, quando 1079 ou IMR90 células de fibroblastos humanos foram transfectadas com OCT4 mRNA que continham uridina, ou pseudouridina no lugar de uridina, o mRNA contendo pseudouridina foi traduzido em um nível maior ou para uma duração maior do que o mRNA que continha uridina. Portanto, em algumas modalidades preferenciais, uma ou mais de todas as uridinas contidas nos mRNAs usados nos métodos da presente invenção são substituídos por pseudouridina (por exemplo, substituindo pseudouridina-5’-trifosfato na reação IVT para sintetizar o RNA no lugar de uridina-5’trifosfato). No entanto, em algumas modalidades, o mRNA usado nos métodos da invenção contém uridina e não contém pseudouridina. Em algumas modalidades preferenciais, o mRNA compreende pelo menos um nucleosídeo modificado (por exemplo, selecionado do grupo que consiste em uma pseudouridina (Ψ), 5-metilcitosina (m⁵C), 5-metiluridina (m⁵U), 2'-Ometiluridina (Um ou m²’°U), 2-tiouridina (s²U), e N⁶-metiladenosina (m⁶A)) no lugar de pelo menos uma parte do nucleosídeo canônico não modificado correspondente (por exemplo, no lugar de substancialmente todos os nucleosídeos canônicos não modificados correspondentes A, C, G ou T). Em algumas modalidades preferenciais, o mRNA compreende pelo menos um nucleosídeo modificado selecionado do grupo que consiste em uma pseudouridina (Ψ) e 5metilcitosina (m⁵C). Em algumas modalidades preferenciais, o mRNA compreende ambos pseudouridina (Ψ) e 5-metilcitosina (m⁵C). Além disso, para conseguir objetivos específicos, uma base de ácido nucleico, fração de açúcar, ou ligação internucleotídeo em um ou mais dos nucleotídeos do mRNA que é introduzido em uma célula eucariótica em qualquer um dos métodos da invenção pode compreender uma base de ácido nucleico modificada, fração de açúcar, ou ligação internucleotídeo.

A invenção também não é limitada com relação à fonte do mRNA que é liberado na célula eucariótica em qualquer um dos métodos da invenção. Em algumas modalidades, como aquelas descritas nos EXEMPLOS, o mRNA é sintetizado por uma transcrição in vitro de um modelo de DNA compreendendo um gene clonado em um vetor plasmídeo linearizado ou por uma transcrição in vitro de um molde de DNA que é sintetizado por PCR ou RT-PCR (ou seja, por IVT de um produto de amplificação de PCR), capeamento usando um sistema de enzima de capeamento ou por capeamento co-transcrição pela incorporação de um análogo de capa de

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17/141 dinucleotídeo (por exemplo, um ARCA) durante o IVT, e poliadenilação usando uma poli(A) polimerase. Em algumas modalidades preferenciais, o mRNA é sintetizado por IVT de um molde de DNA compreendendo um gene clonado em um vetor de plasmídeo linearizado ou um produto de amplificação de PCR ou RT-PCR, em que o molde de DNA codifica uma cauda 3'poli(A). Em algumas outras modalidades, o mRNA que é liberado na célula eucariótica em qualquer um dos métodos da invenção é derivado diretamente de uma célula ou uma amostra biológica. Por exemplo, em algumas modalidades, o mRNA derivado de uma célula ou amostra biológica é obtido por amplificação de mRNA da célula ou amostra biológica usando uma reação de amplificação de RNA, e capeamento do mRNA amplificado usando um sistema de enzima de capeamento ou por capeamento co-transcricional pela incorporação de um análogo de capa de dinucleotídeo (por exemplo, um ARCA) durante a IVT, e, se o mRNA amplificado não contém ainda uma cauda poli(A) codificada por molde, a reação de amplificação de RNA, poliadenilando o mRNA amplificado usando uma poli(A) polimerase.

Com relação aos métodos compreendendo introduzir mRNA que codifica um ou mais fatores de indução de célula iPS para gerar uma célula desdiferenciada (por exemplo, uma célula iPS), a invenção não é limitada pela natureza dos fatores de indução de célula iPS usados. Qualquer mRNA que codifica um ou mais fatores de indução de proteína agora conhecidos, ou posteriormente descobertos, que encontram uso na desdiferenciação, são contemplados para uso na presente invenção. Em algumas modalidades, um ou mais mRNAs que codificam para KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, ou SOX2 são empregados. Oct3/4 e certos elementos da família de gene Sox (Sox1, Sox2, Sox3, e Sox15) foram identificados como reguladores de transcrição envolvidos no processo de indução. Genes adicionais, no entanto, incluindo certos elementos da família Klf (Klf1, Klf2, Klf4, e Klf5), a família Myc (C-myc, L-myc, e N-myc), Nanog, e LIN28, foram identificados por aumentar a eficiência de indução. Qualquer um ou mais de tais fatores podem ser usados conforme desejados.

Enquanto as composições e os métodos da invenção podem ser usados para gerar células iPS, a invenção não é limitada a geração destas células. Por exemplo, em algumas modalidades, mRNA que codifica um ou mais fatores de reprogramação é introduzido na célula para gerar uma célula com um estado alterado de diferenciação comparado à célula em

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18/141 que o mRNA foi introduzido. Por exemplo, em algumas modalidades, mRNA que codifica um ou mais fatores de indução de célula iPS é usado para gerar uma célula desdiferenciada que não é uma célula iPSs. Ditas células encontram uso em pesquisa, triagem de droga, e outras aplicações.

Em algumas modalidades, a presente invenção ainda fornece métodos para empregar as células desdiferenciadas geradas pelos métodos acima. Por exemplo, ditas células encontram uso na pesquisa, triagem de droga, e aplicações terapêuticas em humanos ou outros animais. Por exemplo, em algumas modalidades, as células geradas encontram uso na identificação e caracterização de fatores de indução de célula iPS bem como outros fatores associados com diferenciação ou desdiferenciação . Em algumas modalidades, as células desdiferenciadas geradas são transplantadas em um organismo ou em um tecido que reside in vitro ou in vivo. Em algumas modalidades, um organismo, tecido ou sistema de cultura que aloja as células geradas é exposto a um composto teste e o efeito do composto teste nas células ou no organismo, tecido ou sistema de cultura é observado ou medido.

Em algumas outras modalidades, uma célula desdiferenciada gerada usando os métodos acima (por exemplo, uma célula iPS) é ainda tratada para gerar uma célula desdiferenciada que tem o mesmo estado de diferenciação ou tipo de célula comparado a uma célula somática da qual a célula desdiferenciada foi gerada. Em algumas outras modalidades, uma célula desdiferenciada gerada usando os métodos acima (por exemplo, uma célula iPS) é ainda tratada para gerar uma célula desdiferenciada que tem o mesmo estado de diferenciação ou tipo de célula comparado a uma célula somática da qual a célula desdiferenciada foi gerada. Em algumas modalidades, a célula diferenciada é gerada a partir da célula desdiferenciada (por exemplo, a célula iPS gerada) ao introduzir mRNA que codifica um ou mais fatores de reprogramação na célula iPS gerada durante um ou vários tratamentos e mantendo a célula em que o mRNA é introduzido nas condições em que a célula é viável e é diferenciada na célula que tem o estado alterado de diferenciação ou tipo de célula comparado à célula desdiferenciada gerada (por exemplo, a célula iPS gerada) na qual o mRNA que codifica um ou mais fatores de reprogramação é introduzido. Em algumas destas modalidades, a célula diferenciada gerada que tem o estado alterado de diferenciação é usado para pesquisa, triagem de droga, ou aplicações terapêuticas (por exemplo, em humanos ou outros animais). Por exemplo, as células diferenciadas geradas encontram uso na identificação e caracterização de

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19/141 fatores de reprogramação associados com diferenciação. Em algumas modalidades, as células diferenciadas geradas são transplantadas em um organismo ou em um tecido que reside in vitro ou in vivo. Em algumas modalidades, um organismo, tecido ou sistema de cultura que aloja as células geradas é exposto a um composto teste e o efeito do composto teste nas células ou no organismo, tecido ou sistema de cultura é observado ou medido. Em algumas modalidades preferenciais do método compreendendo introduzir mRNA que codifica um ou mais fatores de indução de iPSC em uma célula somática e manter a célula nas condições em que a célula é viável e o mRNA que é introduzido na célula é expresso em quantidade suficiente e por tempo suficiente para gerar uma célula desdiferenciada (por exemplo, em que a célula desdiferenciada é uma célula-tronco pluripotente induzida), o tempo suficiente para gerar uma célula desdiferenciada é menos do que uma semana. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 50 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 100 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 150 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 200 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 300 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 400 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 500 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs)

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20/141 por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 600 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 700 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 800 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 900 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Em algumas modalidades preferenciais deste método, a eficiência de reprogramação para geração de células desdiferenciadas é mais do que ou igual a 1000 células desdiferenciadas (por exemplo, iPSCs) por 3 x 10⁵ células de entrada em que o mRNA é introduzido. Assim, em algumas modalidades preferenciais, este método foi mais do que 2 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentivírus). Em algumas modalidades preferenciais, este método foi mais do que 5 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentivírus). Em algumas modalidades preferenciais, este método foi mais do que 10 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentivírus). Em algumas modalidades preferenciais, este método foi mais do que 20 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentivírus). Em algumas modalidades preferenciais, este método foi mais do que 25 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentivírus). Em algumas modalidades preferenciais, este método foi mais do que 30 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentivírus).

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Em algumas modalidades preferenciais, este método foi mais do que 35 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentivírus). Em algumas modalidades preferenciais, este método foi mais do que 40 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentivírus).

A presente invenção ainda fornece composições (sistemas, kits, misturas de reação, células, mRNA) usadas ou úteis nos métodos e/ou gerados pelos métodos descritos aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente invenção fornece um mRNA que codifica um fator de indução de célula iPS, o mRNA contendo pseudouridina no lugar de uridina.

A presente invenção ainda fornece composições compreendendo um reagente de transfecção e um mRNA que codifica um fator de indução de célula iPS (por exemplo, uma mistura de reagente de transfecção e mRNA). Em algumas modalidades, as composições compreendem mRNA que codifica uma pluralidade (por exemplo, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, ou 6) de fatores de indução de célula iPS, incluindo, entre outros, KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2.

As composições podem ainda compreender qualquer outro reagente ou componente suficiente, necessário ou útil para a prática de qualquer um dos métodos descritos aqui. Ditos reagentes ou componentes incluem, entre outros, reagentes de transfecção, meio de cultura (por exemplo, meio de condição MEF), células (por exemplo, células somáticas, células iPS), recipientes, caixas, tampões, inibidores (por exemplo, inibidores de RNase), marcadores (por exemplo, fluorescentes, luminescentes, radioativos, etc.), moléculas de controle positivo e/ou negativo, reagentes para gerar mRNA capeado, gelo seco ou outros refrigerantes, instruções para uso, equipamento de cultura de célula, equipamento de detecção /análise, e semelhantes.

Esta invenção fornece RNA, oligorribonucleotídeo, e moléculas de polirribonucleotídeos compreendendo pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, vetores de terapia gênica compreendendo os mesmos, métodos de terapia gênica e métodos de silenciamento de gene de transcrição compreendendo os mesmos, métodos de redução de imunogenicidade dos mesmos, e métodos de sintetizar os mesmos.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um RNA mensageiro compreendendo -um resíduo de pseudouridina. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de RNA que codifica uma proteína de interesse, dita molécula de RNA

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22/141 compreendendo um resíduo de pseudouridina. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de RNA transcrita in vitro, compreendendo a pseudouridina ou um nucleosídeo modificado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um oligorribonucleotídeo sintetizado in vitro, compreendendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, em que o nucleosídeo modificado é m⁵C, m⁵U, m⁶A, s²U, Ψ, ou 2'-Ometil-U. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um vetor de terapia gênica, compreendendo uma molécula de polinucleotídeo sintetizada in vitro, em que a molécula de poliribonucleotídeo compreende uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de RNA de dupla fita (dsRNA) contendo, como parte de sua sequência, uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado e outra compreendendo um siRNA ou shRNA. Em outra modalidade, a molécula de dsRNA é mais do que 50 nucleotídeos em comprimento. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para induzir uma célula mamífera a produzir uma proteína recombinante, compreendendo contatar uma célula mamífera com uma molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica a proteína recombinante, a molécula de RNA sintetizada in vitro compreendendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, assim, induzindo uma célula mamífera a produzir uma proteína recombinante.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar anemia em um sujeito, compreendendo contatar uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica eritropoetina, assim tratando anemia em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um vasoespasmo em um sujeito, compreendendo contatar uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica óxido nítrico sintase induzível (iNOS), assim tratando um vasoespasmo em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para melhorar uma taxa de sobrevida de uma célula em um sujeito, compreendendo contatar a célula com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica

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23/141 uma proteína de choque térmico, assim, melhorando uma taxa de sobrevida de uma célula em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para diminuir uma incidência de uma restenose de um vaso sanguíneo após um procedimento que aumenta o vaso sanguíneo, compreendendo contatar uma célula do vaso sanguíneo com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica uma proteína do choque térmico, assim reduzindo uma incidência de restenose em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar um crescimento de pelo a partir de um folículo piloso em um couro cabeludo de um sujeito, compreendendo contatar uma célula do couro cabeludo com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica uma telomerase ou uma proteína imunossupressora, assim aumentando um crescimento do pelo a partir de um folículo piloso.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de induzir a expressão de uma enzima com atividade antioxidante em uma célula, compreendendo contantar a célula com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica a enzima, assim induzindo a expressão de uma enzima com atividade antioxidante em uma célula.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar fibrose cística em um sujeito, compreendendo contatar uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica o Regulador de Condutância Transmembranar de fibrose cística (CFTR), assim tratando a fibrose cística em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar uma agamaglobulinemia ligada ao X em um sujeito, compreendendo contatar uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica uma tirosina quinase de Bruton, assim tratando uma agamaglobulinemia ligada ao X.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar uma adenosina deaminase grave combinada a imunodeficiência (ADA SCID) em um sujeito, compreendendo contatar uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro,

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24/141 a molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica uma ADA, assim tratando uma ADA SCID.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma proteína recombinante, compreendendo contatar um aparelho de tradução in vitro com um polirrubonucleotídeo sintetizado in vitro, o polirrubonucleotídeo sintetizado in vitro compreendendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, assim produzindo uma proteína recombinante.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um metido de sintetizar uma molécula de RNA transcrita in vitro compreendendo um nucleotídeo modificado com um nucleosídeo pseudouridina modificado, compreendendo contatar uma polimerase isolada com uma mistura de nucleotídeos não modificados e o nucleotídeo modificado.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um aparelho de transcrição in vitro, compreendendo: um nucleotídeo não modificado, um nucleotídeo contendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, e uma polimerase. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um kit de transcrição in vitro, compreendendo: um nucleotídeo não modificado, um nucleotídeo contendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, e uma polimerase. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As seguintes figuras formam parte da presente especificação e são incluídas para ainda demonstrar certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida por referência a uma ou mais destas figuras em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas aqui.

A Figura 1 mostra que mRNAs que codificam cada um dos seis fatores humanos de reprogramação, preparados conforme descritos nos EXEMPLOS, são traduzidos e localizados nas localizações subcelulares previstas após a transfecção em 1079 fibroblastos de recémnascidos humanos. 1079 fibroblastos humanos não tratados: Fotos A, E, I, M, Q, e U mostram imagens de contraste de fase de 1079 fibroblastos humanos não tratados que não foram transfectados com um mRNA que codifica um fator de reprogramação e fotos B, F, J, N, R, e V mostram imagens fluorescentes dos mesmos campos após as células terem sido coradas com um anticorpo específico para cada fator de reprogramação; estes resultados mostram que

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25/141 houve pouca ou nenhuma destas proteínas de fator de reprogramação endógenos em 1079 fibroblastos humanos não tratados. 1079 fibroblastos humanos tratados: Fotos C, G, K, O, S, e W mostram imagens de contraste de fase dos 1079 fibroblastos humanos que foram transfectados com um mRNA que codifica o fatore de reprogramação indicado, e fotos D, H, L, P, T, e X mostram imagens fluorescentes dos mesmos campos após as células terem sido coradas com um anticorpos específico para cada fator de reprogramação 24 horas após a transfecção. Estes resultados mostram que cada uma das proteínas de fator de reprogramação foi expressa nas 1079 células de fibroblasto humano 24 horas após a transfecção com os respectivos mRNAs que codificam o fator de reprogramação e que as proteínas do fator de reprogramação foram localizadas nos locais subcelulares previstos. A-T estão em ampliação de 20x. U-X estão em ampliação de 10x.

A Figura 2 mostra que mRNA que codifica fatores humanos de reprogramação (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2) produzem células iPS em células somáticas humanas. A Figura 2 mostra imagens decampo brilhante (A,C) e imunofluorescentes (B,D) de uma colônia de célula iPS em 12 dias após a transfecção final com mRNA que codifica fatores de reprogramação. A coloração NANOG é observada na colônia #1 (B, D). As imagens A e B estão em uma ampliação de 10x. C e D estão em uma ampliação de 20x.

A Figura 3 mostra que as colônias iPS derivadas de células somáticas humanas 1079 e IMR90 são positivas para NANOG e TRA-1-60. A Figura 3 mostra imagens de contraste de fase (A,D,G) e imunofluorescente (B,C,E,F,H,I) de colônias iPS derivadas de células 1079 (A, D) e células IMR90 (G). A mesma colônia iPS mostrada em (A) é positiva para ambos NANOG (B) e TRA-1-60 (C). A colônia iPS mostrada em (D) é positiva para NANOG (E) e positiva para TRA-1-60 (F). A colônia de iPS gerada a partir de fibroblastos IMR90 (G) é ainda positiva para ambos NANOG (H) e TRA-1-60 (I). Todas as imagens estão em uma ampliação de 20x.

A Figura 4 mostra que a formação rápida da colônia iPSC de eficiência melhorada é conseguida por transfectar as células com mRNA que codifica fatores de reprogramação em meio condicionado MEF. Acima de 200 colônias foram detectadas 3 dias após a transfecção final; na placa de 10 cm, as células IMR90 foram transfectadas três vezes com 36 pg de cada mRNA de reprogramação (ou seja, que codificam KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e

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SOX2). As colônias iPSC representativas são mostradas em ampliação de 4x (A, B), 10x (CE) e 20x (F). Oito dias após a transfecção final de mRNA com mRNAs que codifica os seis fatores de reprogramação, mais do que 1000 colônias iPSC foram contadas em células IMR90 transfectadas com 18 pg (G, I) ou 36 pg (H) de cada uma das seis mRNAs. As colônias representativas são mostradas em ampliação de 4x (G-H) e em ampliação de 10x (I).

A Figura 5 mostra que as colônias iPSC derivadas de 1079 e IMR90 são positivas para ambos NANOG e TRA-1-60. Oito dias após a transfecção final de mRNA com 36 pg de mRNA para cada um dos seis fatores de reprogramação, as colônias iPSC derivadas de 1079 (mostradas em A, D, e G) são positivas para NANOG (B, E, e H) e TRA-1-60 (C, F, e I).Oito dias após a transfecção final de mRNA com 18 pg (J-L) ou 36 pg (M-O) de mRNA para cada um dos seis fatores de reprogramação, colônias iPS derivadas de IMR90 são ainda positivas para NANOG (K, N) e TRA-1-60 (L, O).

Figura 6. Produção de TNF-α por MDDCs transfectados com RNA natural, demonstrando que RNA não modificado sintetizado in vitro e RNA bacteriano e RNA mitocondrial mamífero é altamente imunogênico, enquanto outros RNA mamíferos são fracamente imunogênicos. MDDCs humanos foram incubados com Lipofectin® isolado, ou complexado com R-848 (1 pg/ml), ou RNA (5 pg/ml) a partir de 293 células (RNAs total, nuclear e citoplasmático), coração de camundongo (poliA+ mRNA), RNA mitocondrial de plaqueta humana, tRNA bovino, tRNA bacteriano e RNA total (E. coli) com ou sem digestão de RNase. Após 8 h, TNF-α foi medido nos sobrenadantes por ELISA. Valores médios ± SEM são mostrados. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes.

Figura 7. A ativação dependente de TLR por RNA demonstra que modificação de m6A e s2U bloqueia a sinalização de TLR3, enquanto todas as modificações bloqueiam sinalização de TLR7 e TLR8, e que o RNA bacteriano menos modificado RNA e RNA transcrito in vitro não modificado ativa todos os três TLR. (A) Alíquotas (1 pg) de RNA 1571 transcrito in vitro sem (nenhum) ou com modificações de nucleosídeos m⁵C, m⁶A, Ψ, m⁵U ou S²U foram analisados em gel de agarose desnaturado seguido por coloração em brometo de etídio e iluminação UV. (B) células 293 que expressam TLR3, TLR7, TLR8 humanos e vetores de controle foram tratadas com Lipofectin® sozinha, Lipofectin®-R-848 (1 pg/ml) ou RNA (5 pg/ml). Os nucleosídeos modificados presentes em RNA-730 e RNA-1571 são notados. (C)

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27/141 CpG ODN-2006 (5 pg/ml), LPS (1,0 pg/ml) e RNA isolados foram obtidos a partir de fígado de rato, linhagem de célula de camundongo (TUBO) e baço humano (total), RNA mitocondrial de plaqueta humana, ou a partir de duas diferentes fontes de E. coli. Células 293hTLR9 serviram como controle. Após 8 h, IL-8 foi medido nos sobrenadantes por ELISA. Valores médios ± SEM são mostrados. Linhagens de células continham siRNA marcado com hTLR3 são indicados com asterisco. Os resultados são representativos de quatro experimentos independentes.

Figura 8. Produção de citocina por DC transfectado com RNA demonstra que todas as modificações bloqueiam a ativação de citocina gerou DC, enquanto somente as modificações de uridina bloquearam a ativação de DC derivado de sangue. MDDC gerado com GMCSF/IL-4 (A, C) ou GM-CSF/IFN-α MDDCs (B), e DC1 e DC2 primários (D) foram tratados por 8 a 16 h com Lipofectin® sozinha, Lipofectin®-R-848 (1 pg/ml) ou RNA (5 pg/ml). Os nucleosídeos modificados presentes em RNA-1571 são notados. TNF-α, IL-12(p70) e IFN-α foram medidos no sobrenadante por ELISA. Valores médios ± SEM são mostrados. Os resultados são representativos de 10 (A e C), 4 (B), e 6 (D) experimentos independentes. E. Ativação de DC por RNA. MDDC foram tratados por 20 h com Lipofectin® isolada ou complexada com 1 pg/ml poli(I):(C) ou R-848 como controles positivos (quadro superior) ou Lipofectin® complexada com o RNA indicado (5 pg/ml; quadro inferior). Os nucleosídeos modificados presentes em RNA-1886 são notados. A expressão de CD83, CD80, e HLA-DR foi determinada por citometria de fluxo.

Figura 9. Ativação de DC por RNA demonstra que todas as modificações de nucleosídeo inibem a ativação de mediada por RNA. MDDC foram tratados por 20 h com Lipofectin® sozinha, Lipofectin®-R-848 (l pg/ml) ou RNA-1571, modificada conforme indicado (5 pg/ml). (A) CD83 e coloração HLA-DR. (B) os níveis de TNF-α nos sobrenadantes e a fluorescência média de CD80 e CD86 em resposta à incubação com RNA. O volume de meio foi aumentado 30 vezes para citometria de fluxo, conforme indicado pelo asterisco. Os dados são representativos de quatro experimentos independentes.

Figura 10. RNA-1571 capeado contendo diferentes quantidades (0, 1, 10, 50, 90, 99 e 100% de nucleosídeo modificado, em relação ao NTP correspondente não modificado) foram transcritos, e foi demonstrado que a modificação de somente alguns nucleosídeos resultou em uma inibição de ativação de DC. A. Todos os transcritos foram digeridos a monofosfatos e

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28/141 analisados por HPLC de fase reversa para determinar a quantidade relativa de incorporação de nucleosídeo modificado. Os perfis de absorbância representativa obtidos nas proporções indicadas (Ψ:ϋ) são mostrados. Os tempos de eluição são notados para 3'-monofosfatos de pseudouridina (Ψ), citidina (C), guanosina (G), uridina (ϋ), 7-metilguanosina (m7G) e adenosina (A). (B) O conteúdo de nucleosídeo modificado de RNA-1571. O percentual esperado de m⁶A, Ψ (pseudouridina), ou m⁵C in RNA-1571 foi calculado baseado na quantidade relativa de NTP modificado na reação de transcrição na composição de nucleosídeo de RNA-1571 (A: 505, U: 451, C: 273, G: 342). Os valores para o conteúdo de nucleosídeo modificado foram determinados com base na quantificação dos cromatogramas de HPLC. Notas: A: valores (%) para m⁶ATP, ΨΤΡ e m⁵CTP em relação a ATP, UTP e CTP, respectivamente. B: valroes para m⁶A, Ψ e m⁵C monofosfatos em relação a todos os NMPs. (C) MDDC foram transfectados com Lipofectin® complexado RNA -1571 capeado (5 pg/ml) contendo a quantidade indicada de m⁶A, Ψ ou m⁵C. Após 8 h, TNF-α foi medido nos sobrenadantes. Os dados são expressos como inibição relativa de TNF-α. Valores médios ± SEM obtidos em 3 experimentos independentes são mostrados.

Figura 11. Expressão de TNF-α por DCs transfectados com oligorribonucleotídeo demonstra que tão pouco quanto um nucleosídeo modificado reduz a ativação de DC. (A) Sequências de oligorribonucleotídeos (ORN) quimicamente sintetizados (ORN1-4) (SEQ ID NOs: 6-9) ou transcritos in vitro (ORN5-6) (SEQ ID NOs: 10-11) são mostrados. As posições de nucleosídeos modificados Um (2'-O-metiluridina), m⁵C e Ψ são destacados. MDDC humanos foram transfectados com Lipofectin® sozinha (meio), R-848 (1 pg/ml) ou

Lipofectin® complexada com RNA (5 pg/ml). Onde notado, as células foram tratadas com 2,5 pg/ml cicloheximida (CHX). (B). Após 8 h de incubação, TNF-α foi medido no sobrenadante. (C) RNA a partir das células foi analisado por Northern blot. Valores médios representativos ± SEM de 3 experimentos independentes são mostrados.

Figura 12. A. mRNA modificados Ψ não estimulam a produção de citocina próinflamatória in vivo. As amostras de soro (6 h após a injeção) foram analisadas por ELISA e revelou que 3 pg de mRNA não modificado induziu um nível maior de IFN-α do que fez 3 pg de Ψ-modificado mRNA (P < 0,001). Níveis de IFN-α induzidos por 3 pg de mRNA Ψmodificado foram semelhantes àqueles obtidos quando animais foram injetados com

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29/141 lipofectina não complexada. Os valores são expressos como a média ± s.e.m. (n = 3 ou 5 animais/grupo). B. Resultados semelhantes foram observados com TNF-α.

Figura 13. mRNA contendo pseudouridina (Ψ) não ativa PKR. Ψ: pseudouridina. Controle: RNA não modificado. m5C: mRNA com modificação m⁵C.

Figura 14. Expressão aumentada de luciferase a partir de mRNA contendo pseudouridina em lisado de reticulócito de coelho. Luc-Y: mRNA com modificação de pseudouridina; luc-C: RNA não modificado. Os dados são expressos por normalização de atividade de luciferase para RNA de luciferase não modificado.

Figura 15. Expressão aumentada de renilla a partir de mRNA contendo pseudouridina em células cultivadas. A. células 293. B. Murina primária, células dendríticas de camundongos derivadas de medula óssea. renilla-Y: mRNA com modificação de pseudouridina; renillaC:RNA não modificado.RNA foi modificado com m⁵C, m⁶A,and m⁵U conforme notado.

Figura 16. A. efeito aditivo de elementos 3' e 5' na eficiência de tradução de mRNA modificado Ψ. Células 293 foram transfectadas com mRNAs luciferase de vaga-lume convencionais e Ψ-modificado que tinham capa 5' (capLuc), 50 nt-long 3' poliA-cauda (TEVlucA50), ambos ou nenhum destes elementos (capTEVlucA50 e Luc, respectivamente). As células foram lisadas 4 h após e as atividades de luciferase medidas em alíquotas (1/20th) dos lisados totais. B. mRNA Ψ-modificado é mais estável do que mRNA não modificado. Células 293 transfectadas capTEVlucAn contendo nucleosídeos não modificados ou Ψmodificados foram lisados nos tempos indicados após a transfecção. Alíquotas (1/20th) dos lisados foram avaliadas para luciferase. Os erros padrões são muito pequenos para serem visualizados com barras de erros. C. Expressão de β-galactosidase é aumentada usando mRNA Ψ-modificado comparado com mRNA convencional. Células 293 semeadas em placas de 96 poços foram transfectadas com mRNAs complexados com lipofectina (0,25 pg/poço) que codifica β-galactosidase bacteriana (lacZ). Os transcritos tinham capa e 3' cauda poliA que tinha comprimento de 30 nt (caplacZ) ou comprimento de ~200 nt (caplacZ-An). Os constructos feitos usando nucleosídeos convencionais U ou Ψ foram testados. As células foram fixadas e coradas com com X-gal, 24 h após a transfecção. As imagens foram tomadas por microscopia invertida (amplificação de 40 e 100X) a partir dos poços representativos.

Figura 17. A. Expressão de renilla após injeção intracerebral do mRNA codificante modificado ou não modificado. Córtex de cérebro de rato foi injetado em 8 locais/animais. Um

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30/141 hemisfério foi injetado com RNA que codifica renilla capeado com modificação de pseudouridina (capRenilla-Y), enquanto que o hemisfério correspondente com RNA capeado com nenhuma modificação de nucleosídeo (capRenilla-C). Os dados de 2 animais (6 locais de injeção) são mostrados. BG; nível inferior de detecção do ensaio. B. mRNA Ψ-modificado liberado por via intravenosa é expresso no baço. i//mRNA complexado com lipofectina (0,3 pg capTEVlucAn/camundongo) foi administrado por injeção na veia da cauda. Os animais foram sacrificados em 2 e 4 h após a injeção e as atividades de luciferase foram medidas em alíquotas (l/l0th) dos órgãos homogeneizados em tampão de lise. Os valores representam as atividades de luciferase nos órgãos totais. C. mRNA Ψ-modificado apresenta maior estabilidade e tradução in vivo. capTEVlucAn complexado com lipofectina (0,3 pg/60 μΐ/animal) com ou sem Ψ modificações foi liberado i.v. aos camundongos. Os animais foram sacrificados em 1, 4 e 24 h após a injeção, e 1/2 de seus baços foi processado para medições de enzima luciferase (quadro a esquerda) e a outra metade para análise de RNA (quadro à direita). As atividades de luciferase foram medidas em alíquotas (1/5) do homogenado feito a partir de metade dos baços. Os valores plotados representam atividades de luciferase no baço total e são expressos como a média ± s.e.m. (n = 3 ou 4/ponto). D. Expressão de luciferase de vaga-lume após injeção intratraqueal de mRNA. capTEVluc-Y: RNA modificado capeado com pseudouridina que codifica luciferase de vaga-lume. CapTEVluc-C: RNA capeado com nenhuma modificação de nucleosídeo.

Figura 18. Produção de proteína é independente da quantidade de mRNA liberado por via intravenosa em camundongos. As quantidades indicadas de ácidos nucleicos complexados com lipofectina, mRNA capTEVlucAn com ou sem Ψ constituintes e DNA de plasmídeo pCMVluc em um volume de 60 pl/animal foram liberados por injeção i.v. em camundongos. Os animais injetados com mRNA ou DNA de plasmídeo foram sacrificados em 6 h ou 24 h após a injeção, respectivamente, e as atividades de luciferase foram medidas em alíquotas (1/10th) de seus baços homogeneizados em tampão de lise. O valor de cada animal é mostrado, e as linhas horizontais indicam a média; N.D., não detectável.

Figura 19. Expressão de luciferase de vaga-lume após liberação intratraqueal de mRNA codificante. mRNA foram complexados para lipofectin (ouPEI, conforme notado) e animais foram injetados com 0,3 ug de mRNA que codifica luciferase de vaga-lume com ou

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31/141 sem Ψ modificação, então sacrificados 3 horas depois. Os pulmões foram colhidos e homogeneizados e a atividade de luciferase foi medida em alíquotas dos órgãos lisados.

Figura 20. Ψ-modificado mRNA não inclui mediadores inflamatórios após liberação do pulmão. A indução de TNF-α e IFN-α em soro após liberação intratraqueal de mRNA que codifica luciferase não modificado ou mRNA Ψ-modificado. Os níveis séricos de TNF-α e IFN-α foram determinados por ELISA 24 horas após liberação de mRNA.

A Figura 21 mostra os resultados do Exemplo 35: mRNA que codifica Luciferase Firefly ou Renilla com as modificações indicadas foram complexados para lipofectina e liberados às células dendríticas murinas (A) e HEK293T (B). DC humanos foram transfectados com mRNA complexado com TransIT que codifica luciferase firefly ou renilla com as modificações indicadas (C). Os dados são expresso como alterações em vezes comparados ao mRNA não modificado.

A Figura 22 mostra os resultados do Exemplo 36: As reações de transcrição de T7 polimerase usadas para a geração do mRNA resulta em quantidades maiores de RNA do tamanho correto, mas ainda contém contaminantes. Isto é visualizado pela aplicação de RNA a uma coluna de HPLC de fase reversa que separa RNA baseado em tamanho sob condições desnaturantes. RNA Ψ-modificado TEV-luciferase-A51 foi aplicado a coluna de HPLC em 38% Tampão B e submetido a um gradiente linear de tampão B crescente para 55%. O perfil demonstrou ambos menor do que esperado e maior do que esperado de contaminantes.

A Figura 23 mostra os resultados do Exemplo 37: (A) mRNA que codifica EPO com as modificações indicadas e com ou sem purificação de HPLC foram liberados para níveis de DCs e EPO murinos nos sobrenadantes foram medidos 24 horas após . Enquanto mRNA m5C/'l'-inodiíicado teve o nível mais alto de tradução antes de purificação por HPLC, mRNA Ψ-modificado tem a maior tradução após purificação em HPLC. (B) DCs humanos foram transfectados com mRNA que codifica renilla com as modificações indicadas com ou sem purificação HPLC.

A Figura 24 mostra os resultados do Exemplo 38: (B) DCs humanos foram transfectados com RNA complexado a TransIT com as modificações indicadas com ou sem purificação HPLC. Níveis de IFN-α foram medidos após 24 horas. Aa purificação por HPLC aumentou a imunogenicidade de RNA não modificado, que é dependente da sequência,

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32/141 conforme outros RNAs não modificados tiveram níveis semelhantes de IFN-α ou níveis reduzidos após purificação por HPLC. RNA Ψ-modificado teve níveis não mensuráveis de IFN-α, semelhante aos DCs tratados com controle. (B) RNA Ψ-modificado antes (-) e após purificação por HPLC (P1 e P2) foi analisado para dsRNA usando dot blotting com um anticorpo monoclonal específico para dsRNA (J2). A purificação de RNA removeu a contaminação de dsRNA. (C) RNA Ψ-modificado que codifica fatores iPS são imunogênicos, que é removido por purificação por HPLC do RNA.

Figura 25 fornece uma sequência de codificação de mRNA para KLF4 (SEQ ID NO:12) e LIN28 (SEQ ID NO: 13).

Figura 26 fornece uma sequência de codificação de mRNA para cMYC (SEQ ID NO:14) e NANOG (SEQ ID NO: 15).

Figura 27 fornece uma sequência de codificação de mRNA para OCT4 (SEQ ID NO:16) e SOX2 (SEQ ID NO: 17).

A Figura 28 mostra que mRNA que codifica fatores humanos de reprogramação (KLF4, c-MYC, OCT4, e SOX2) produzem células iPS em células de queratinócitos humanos primárias. A Figura 28 mostra imagens de contraste de fase de células HEKn em 2 dias (A) e formação de colônia iPS em 11 dias (B) e 20 dias (C) após a transfecção final com mRNA que codifica 4 fatores de reprogramação. As imagens estão em uma ampliação de 10x.

A Figura 29 mostra que mRNA que codifica fatores humanos de reprogramação (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2) produzem células iPS em queratinócitos humanos que são positivos para marcadores de células iPS conhecidos. A Figura 29 mostra imagens de contraste de fase de colônias derivadas de células HEKn (A, D, e G). A mesma colônia iPS mostrada em (A) é positiva para ambos KLF4 (B) e LIN28 (C). A colônia iPS mostrada em (D) é positiva para SSEA4 (E) e positiva para TRA-1-60 (F). A colônia iPS mostrada em (G) é positiva para NANOG (H). Todas as imagens estão em uma ampliação de 20x.

A Figura 30 mostra aumentos na expressão de 3 mensagens associadas a iPS em células HEKn transfectadas com 4 mRNAs de reprogramação (KLF4, c-MYC, OCT4, e SOX2) que não incluem o fator de reprogramação NANOG. A expressão aumentada das mensagens foi detectada por qPCR e é normalizada á expressão GAPDH. O nível de

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33/141 expressão de cada mensagem é descrito em relação ao nível encontrado na linhagem de célula original.

DEFINIÇÕES

A presente invenção será compreendida e interpretada com base nos termos definidos abaixo.

Confome usado aqui substancialmente todos, em referência a mRNAs de fita simples completos que compreendem um resíduo pseudouridina ou 5-metilcitidina, significa que de todos os mRNAs de fita simples completos presentes em uma amostra, pelo menos 95% têm um resíduo pseudouridina ou 5 -metilcitidina ou ambos.

Confome usado aqui essencialmente todos, em referência a mRNAs de fita simples completos que compreendem um resíduo pseudouridina ou 5-metilcitidina, significa que de todos os mRNAs de fita simples completos presentes em uma amostra, pelo menos 99% têm ou um resíduo pseudouridina ou 5 -metilcitidina .

Confome usado aqui moléculas de RNA contaminantes são moléculas que compreendem resíduos de RNA e que podem, pelo menos parcialmente ativar uma resposta imunológica quando transfectado para uma célula (por exemplo, através da ativação de RNA como sensores de RNA proteína quinase dependentes (PKR), gene-I induzível de ácido retinoico (RIG-I), o receptor do tipo Toll (TLR) 3, TLR7, TLR8, e oligoadenilato sintetase (OAS), ou moléculas de RNA que podem pelo menos parcialmente ativar uma resposta de RNA interferente (RNAi) (por exemplo, incluindo uma resposta a moléculas grandes de RNA de fita dupla ou a moléculas pequenas de RNA fita dupla (siRNAs) nas células. Exemplos de moléculas de RNA contaminantes incluem entre outros, mRNAs parciais ou não de comprimento completo codificando apenas uma parte de um fator de reprogramação (por exemplo, um fator de indução de células iPS de comprimento não completo); mRNAs de fita simples que são maiores do que o mRNA de comprimento completo que codifica um fator de reprogramação (por exemplo, um fator de indução de células iPS), por exemplo, sem se vincular a uma teoria, “IVT run-on ou outros mecanismos; moléculas grandes ou pequenas de mRNA de fita dupla, e moléculas de mRNA não capeadas.

Confome usado aqui, uma preparação purificada de RNA é substancialmente livre de moléculas de RNA contaminantes (ou um determinado RNA contaminante citado), quando menos do que 0,5% do RNA total na preparação de RNA purificado é constituído por

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34/141 moléculas de RNA contaminantes (ou um RNA contaminante particularmente recitado). As quantidades e quantidades relativas de moléculas de mRNA não contaminantes e moléculas de RNA contaminantes (ou um RNA contaminante em particular) podem ser determinadas por HPLC ou outros métodos usados na técnica para separar e quantificar moléculas de RNA.

Confome usado aqui, uma preparação purificada de RNA é essencialmente livre de moléculas de RNA contaminantes (ou um RNA contaminante particular citado), quando menos de 1,0% do total de RNA na preparação de RNA purificado é constituído por moléculas de RNA contaminantes (ou um RNA contaminante particular). As quantidades e quantidades relativas de moléculas de mRNA não-contaminantes e moléculas de RNA contaminantes ((ou um RNA contaminante particular) pode ser determinada por HPLC ou outros métodos usados na técnica para separar e quantificar moléculas de RNA.

Confome usado aqui, uma preparação purificada de RNA é virtualmente livre de moléculas de RNA contaminantes (ou um RNA contaminante particular citado), quando menos do que 0,1% dos tota de RNA na preparação de RNA purificado é constituído por moléculas de RNA contaminantes (ou um RNA contaminante particular citado). As quantidades e quantidades relativas de moléculas não contaminantes de mRNA e moléculas de RNA contaminantes (ou um RNA contaminante particular) pode ser determinada por HPLC ou outros métodos usados na técnica para separar e quantificar moléculas de RNA.

Confome usado aqui, uma preparação purificada de RNA é livre de moléculas de RNA contaminantes (ou um determinado citado RNA contaminantes), quando menos de 0,01% do RNA total na preparação de RNA purificado é constituído por moléculas de RNA de contaminantes (ou uma particularmente citado RNA contaminante). As quantidades e quantidades relativas de moléculas não contaminantes de mRNA e moléculas de RNA de contaminantes (ou um contaminante de RNA em particular) pode ser determinada por HPLC ou outros métodos usados na técnica para separar e quantificar moléculas de RNA.

Os termos compreendendo, contendo, tendo, incluindo e inclusive devem ser interpretados como entre outros salvo indicação em contrário. Os termos um, uma e o/a e semelhantesreferentes no contexto da descrição da invenção e, especificamente, no contexto das reivindicações anexas, devem ser interpretados para cobrir tanto o singular e o plural, salvo indicação em contrário. A utilização de quaisquer e todos os exemplos ou linguagem exemplar (por exemplo, como) destina-se apenas para ilustrar aspectos ou modalidades da

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35/141 invenção, e não deve ser interpretado como limitando o escopo da mesma, a menos que reinvidicado em contrário

Com relacao à utilização da palavra derivado, como para um RNA (incluindo mRNA) ou um polipeptídeo que é “derivado” de uma amostra, amostra biológica, célula tumoral, ou semelhante, significa que o RNA ou polipeptídeo, ou estava presente na amostra, amostra biológica, célula tumoral, ou semelhante, ou foi feita utilizando o RNA na amostra, amostra biológica, célula tumoral, ou semelhante, por um processo como uma reação de transcrição in vitro, ou uma reação de amplificação de RNA, onde o RNA ou polipeptídeo ou é codificado por ou uma cópia de toda ou uma parte do RNA ou moléculas polipeptídicas na amostra original, amostra biológica, célula tumoral, ou semelhantes. A título de exemplo, dito RNA pode ser de uma transcrição in vitro ou uma reação de amplificação de RNA, com ou sem a clonagem de cDNA, em vez de ser obtida diretamente da amostra, amostra biológica, célula tumoral, ou semelhante contanto que o RNA original usado para a transcrição in vitro ou uma reação de amplificação de RNA tenha sido da amostra, amostra biológica, célula tumoral, ou semelhantes. Os termos amostra e amostra biológica são usados em seu sentido mais amplo e abrangem amostras ou espécimes obtidos a partir de qualquer fonte que contém ou pode conter células eucarióticas, incluindo as fontes biológicas e ambientais. Conforme usado aqui, o termo amostra quando usado para se referir a amostras biológicas obtidas a partir de organismos, inclui fluidos corporais (por exemplo, sangue, ou saliva), fezes, biópsias, esfregaços (por exemplo, os esfregaços bucais), células isoladas, exsudados, e semelhantes. Os organismos incluem fungos, plantas, animais e seres humanos. No entanto, estes exemplos não são para ser interpretados como limitando os tipos de amostras ou organismos que encontram utilização com a presente invenção. Além disso, a fim de executar a pesquisa ou estudar os resultados relacionados com a utilização de um método ou composição da invenção, em algumas modalidades, uma amostra ou amostra biológica compreende células fixadas, células tratadas, lisados celulares, e semelhantes. Em algumas modalidades como modalidades do método em que o mRNA é liberado em uma célula a partir de um organismo que tem uma doença conhecida ou em uma célula que apresenta um estado de doença ou de uma patologia conhecida, a amostra ou amostra biológica também compreende bactérias ou vírus.

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Confome usado aqui, o termo incubando e suas variantes significa contatando um ou mais componentes de uma reação com outro componente ou componentes, sob condições e por tempo suficiente de tal forma que um produto de reação desejado é formado.

Conforme usado aqui, um nucleosídeo consiste em uma base de ácido nucleico (por exemplo, as bases de ácido nucleioco canônicas: guanina (G), adenina (A), timina (T), uracila (U), e citosina (C)); ou uma base de ácido nucleico modificado (por exemplo, 5-metilcitosina (m⁵C)), que está covalentemente ligada a um açúcar pentose (por exemplo, ribose ou 2'desoxirribose), enquanto que nucleotídeo ou mononucleotídeo de um nucleosídeo que é fosforilado em um dos grupos hidroxila do açúcar pentose. Diz-se que moléculas lineares de ácidos nucleicos tem um “5' terminal” (extremidade 5') e um “3' terminal” (extremidade 3'), porque, exceto com relação ao capeamento ou adenilação (por exemplo, adenilação por uma ligase) mononucleotídeos são unidos em uma direcão através de uma ligação fosfodiéster para produzir oligonucleotídeos ou polinucleotídeos, de modo que um fosfato na extremidade 5 'de carbono de uma parte de açúcar do mononucleotídeo é unido a um oxigênio sobre a 3' de carbono da porção açúcar do seu mononucleotídeo vizinho. Portanto, uma extremidade de um oligonucleotídeo linear de fita simples ou polinucleotídeo ou um final de uma fita de um ácido nucleico linear de fita dupla (RNA ou DNA) é referido como extremidade 5' se seu fosfato em 5' não é unido ou ligado ao oxigênio do carbono 3' de uma molécula de açúcar mononucleotídeo, e como a extremidade 3'se o seu o oxigênio 3' não está associado a um 5' fosfato, que é unido a um açúcar de outro mononucleotídeo. Um nucleotídeo terminal, como aqui utilizado, é o nucleotídeo na posição final do terminal 3 'ou 5.'

A fim de realizar os objetivos específicos, uma base de ácido nucleico, porção de açúcar, ou ligação internucleosídeos (ou internucleotídica) em um ou mais dos nucleotídeos do mRNA que é introduzida em uma célula eucariótica, em qualquer dos métodos da invenção podem compreender uma base modificada, porção de açúcar, ou ligação internucleosídeos. Por exemplo, além dos outros nucleotídeos modificados aqui discutidos para a realização dos métodos da presente invenção, um ou mais dos nucleotídeos do mRNA podem também ter uma base de ácido nucleico modificado compreendendo ou consistindo de: xantina; aliaminouracila; aliamino-timidina; hipoxantina, 2-aminoadenina; 5-propinil uracila; 5-propinil citosina; 4-tiouracila; 6-tioguanina; uma aza ou desaza uracila; uma aza ou desaza timidina; uma aza ou desaza citosina; uma aza ou desaza adenina; ou uma aza ou desaza guanina, ou

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37/141 uma base de ácido nucleico que é derivatizada com uma parte de biotina, uma parte de digoxigenina, uma parte fluorescente ou quimioluminescente, uma parte de extinção ou alguma outra porção a fim de realizar um ou mais outros fins específicos; e/ou um ou mais dos nucleotídeos do mRNA pode ter uma parte de açúcar, como, entre outrosa: 2' fluoro--2'desoxirribose ou 2'-O-metil-ribose, que fornecem resistência a algums nucleases, ou 2'-amino2'-desoxirribose ou 2'-azido-2'-desoxirribose, que podem ser marcados fazendo-os reagir com visíveis, fluorescentes, infravermelho fluorescente ou outros corantes detectáveisou produtos químicos que têm uma parte química electrofílica, fotorreativa, alquinil, ou outra porção reativa.

Em algumas modalidades da invenção, um ou mais dos nucleotídeos do mRNA compreendem uma ligação internucleosídeos modificada, como um fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenato, ou uma ligação fosforodiselenato, que são resistentes a algumas nucleases, incluindo, um dinucleotídeo capa análogo (Grudzien -Nogalska et al. 2007) que é usado em uma reação IVT para capeamento co-transcricional do RNA, ou na cauda poli (A) (por exemplo, por incorporação de um nucleotídeo que tem as ligações fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenato, ou fosforodiselenato modificadas durante IVT do RNA ou, por exemplo, por incorporação de ATP que contém as ligações fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenato, ou fosforodiselenato modificadas em uma cauda poli (A) no RNA por poliadenilação usando uma poli (A) polimerase). A invenção não está limitada às bases modificadas de ácido nucleico, porções de açúcar, ou ligações internucleosídeos listados, que são apresentados para mostrar exemplos que podem ser utilizados para uma finalidade particular em um método.

Conforme aqui usado, um ácido nucleico ou um “polinucleotídeo” ou um oligonucleotídeo é uma sequência de nucleotídeos ligados covalentemente em que a posição 3' da porção do açúcar de um nucleotídeo é ligado por uma ligação fosfodiéster à posição 5' da porção do açúcar do nucleotídeo seguinte (isto é, uma ligação fosfodiéster 3 'para 5'), e onde os nucleotídeos estão ligados em sequência específica, isto é, uma ordem linear de nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou polinucleotídeo ou oligonucleotídeo consiste em ou inclui 2'-desoxirribonucleotídeos (DNA). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo consiste em ou inclui ribonucleotídeos (RNA).

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Os termos isolado ou purificado quando utilizados em relação a um ácido nucleico ou polinucleotídeo, como em RNA isolado ou RNA purificado refere-se a um ácido nucleico que é identificado e separado de pelo menos um contaminante com o qual é ordinariamente associado em sua origem. Assim, um ácido nucleico isolado ou purificado (por exemplo, DNA e RNA) está presente em uma forma ou configuração diferente daquela em que é encontrada na natureza, ou uma forma ou configuração diferente da que existia antes de ser submetido a um tratamento ou método de purificação. Por exemplo, uma dada sequência de DNA (por exemplo, um gene) é encontrada no cromossomo da célula hospedeira juntamente com outros genes, bem como proteínas estruturais e funcionais, e um RNA específico (por exemplo, um mRNA específico que codifica uma proteína específica), é encontrada na célula como uma mistura com numerosos outros RNAs e outros componentes celulares. O polipeptídeo isolado ou purificado ou ácido nucleico podem estar presentes na forma de fita simples ou de fita dupla.

Uma capa ou capa de nucleotídeos significa um nucleosídeo 5'-trifosfato que, sob condições de reação adequadas, é utilizado como um substrato por um sistema de enzima de capeamento e que é, assim, juntado à extremidade 5' de um RNA não capeado compreendendo transcritos primários de RNA ou de RNA tendo um 5'-difosfato. O nucleotídeo que juntou-se ao RNA é também referido como uma capa nucletídeo neste documento. Um capa nucletídeo é um nucleotídeo guanina que se une através da sua extremidade 5' à extremidade 5' de um transcrito primário de RNA. O RNA que tem o capa nucleotídeo unido a sua extremidade 5' é referido como RNA capeado ou transcrição de RNA capeada ou transcrição capeada”. Um nucleosídeo capeado comum é 7-metilguanosina ou N⁷metilguanosina (por vezes referido como capa padrão), que tem uma estrutura designada como m⁷G, caso em que o RNA capeado ou m⁷G-capeado RNA tem uma estrutura designada como m⁷G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3'), ou mais simplesmente, como m⁷GpppN1(pN) x ou m⁷G [5'] ppp [5'] N, em que o m⁷G representa capa 7-metilguanosina de nucleosídeo, ppp representa a ponte de trifosfato entre os carbonos 5' da capa de nucleosídeo e o primeiro nucleotídeo do transcrito primário de RNA, N1(pN)x-OH(3') representa o transcrito primário de RNA, dos quais N1 é o nucleotídeo mais 5', p representa um grupo fosfato, G representa um nucleosídeo guanosina, m⁷ representa o grupo metil na posição 7 da guanina, e [5'] indica a posição na qual o p se une à ribose do capa de nucleotídeos e o primeiro

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39/141 nucleosídeo da transcrição do mRNA (N). Além desta capa padrão, uma variedade de capa de ocorrência natural e de análogos sintéticos é conhecido na técnica. RNA que tem alguma capa de nucleotídeos é referido como RNA capeado. O RNA capeado pode ser de ocorrência natural a partir de uma amostra biológica, ou pode ser obtido por capeamento de RNA in vitro que tem um grupo trifosfato 5' ou RNA que tem um grupo difosfato 5' com um sistema de enzima de capeamento (por exemplo, sistema enzimático de capeamento de vaccinia ou sistema enzimático de capeamento de Saccharomyces cerevisiae). Alternativamente, o RNA capeado pode ser obtido por transcrição in vitro (IVT) de um molde de DNA que contém um promotor da RNA polimerase, em que, além do GTP, a reação IVT também contém uma capa dinucleotídeo análogo (por exemplo, uma capa análogo m⁷GpppG ou um N7-metil, 2'-O-metilGpppG ARCA capa análogo ou um N7-metil 3'-O-metil-GpppG ARCA capa análogo) usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, usando um AMPLICAP ™ T7 kit de capeamento ou um MESSAGEMAX™ T7 ARCA-CAPPED MESSAGE - Kit de Transcrição, Epicentro ou CellScript).

Capeamento de um transcrito primário de mRNA 5'-trifosforilado in vivo (ou usando um sistema de enzima de capeamento in vitro) ocorre através de várias etapas enzimáticas (Higman et al. 1992, Martin et ai. 1975, Myette e Niles, 1996).

As seguintes reações enzimáticas estão envolvidos no capeamento de mRNA eucariótico:

(1) RNA trifosfatase cliva o 5'-trifosfato de mRNA para um difosfato, pppN1 (p) Nx-

OH (3 ') ppN1 (pN) x-OH (3') + Pi; e, em seguida (2) RNA guaniltransferase catalisa união de GTP para o difosfato 5'-o mais 5 'dos nucleotídeos (N1) de mRNA, ppN1 (pN) x-OH (3 ') + GTP G (5') ppp (5 ') N1 (pN) x-OH (3') + PPi e, finalmente, (3) guanina-7-metiltransferase, utilizando S-adenosil-metionina (AdoMet) como um co-fator, catalisa a metilação do 7-nitrogênio da guanina no capa nucletídeo, G (5 ') ppp (5') N1 (pN) x-OH (3 ') + AdoMet M7G (5') ppp (5 ') N1 (pN) x-OH (3') + AdoHyc. RNA que resulta da ação da trifosfatase de RNA e atividades enzimáticas da RNA guaniltransferase, bem como de RNA que é adicionalmente metilado pela atividade enzimática da guanina-7metiltransferase, é aqui referida como 5' RNA capeado ou RNA capeado e um sistema enzimático de capeamento ou, mais simplesmente, um enzima de capeamento aqui

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40/141 significa qualquer combinação de um ou mais polipeptídeos com as atividades enzimáticas que resultam em RNA capeados. Sistemas de enzimas de capeamento, incluindo as formas clonadas de tais enzimas, têm sido identificadas e purificadas a partir de muitas fontes e são bem conhecidos na técnica (Banerjee 1980, Higman et al. 1992, Higman et al. 1994, Myette e Niles 1996, 1995 Shuman, Shuman 2001, Shuman et al. 1980, Wang et al. 1997). Qualquer sistema de enzima de capeamento, que pode converter RNA não capeado que tem um polifosfato de 5' para RNA capeado pode ser usado para fornecer um RNA capeado para qualquer uma das modalidades da presente invenção. Em algumas modalidades, o sistema de enzima de capeamento é um sistema enzimático de capeamento de poxvírus. Em algumas modalidades preferenciais, o sistema enzimático de capeamento é enzima de capeamento de vaccinia vírus. Em algumas modalidades, o sistema de enzima de capeamento é enzima de capeamento de Saccharomyces cerevisiae. Além disso, tendo em conta o fato de que os genes que codificam RNA trifosfatase, RNA guaniltransferase e guanina-7-metiltransferase de uma fonte pode complementar deleções de um ou todos esses genes a partir de outra fonte, o sistema enzimático de capeamento pode ser proveniente de uma fonte, ou uma ou mais das atividades RNA trifosfatase, RNA guaniltransferase, e/ou guanina-7-metiltransferase pode compreender um polipeptídeo a partir de uma fonte diferente.

Uma capa de nucleotídeo modificado da presente invenção significa uma capa de nucleotídeo onde o açúcar, a base de ácido nucleico, ou a ligação internucleosídeos é quimicamente modificado em comparação com a correspondente capa de 7-metilguanosina canônica de nucleotídeos. Exemplos de uma capa de nucleotídeo modificado incluem capa de nucleotídeos que compreende: (i) um modificado 2'-ou 3'-desoxiguanosina-5'-trifosfato (ou 2'guanina ou 3'-ácido desoxirribonucléico-5'-trifosfato) em que a posição 2'-, ou 3'-desoxi da porção açúcar desoxirribose é substituída por um grupo compreendendo um grupo amino, um grupo azido, um grupo flúor, um grupo metoxi, um grupo tiol (ou mercapto) ou um grupo metiltio (ou metilmercapto), ou (ii) um modificado de guanosina-5'-trifosfato, em que o oxigénio O⁶ da base guanina é metilado;. ou (iii) 3'-desoxiguanosina Por razões de clareza, deve ser entendido neste documento que um desoxiguanosina-5'-trifosfato alcoxi-substituído pode também ser referido como um O-alquil-substituído de guanosina-5'-trifosfato; a título de exemplo, mas sem limitação, (2'-metoxi-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato (2'-metoxi-2'dGTP) e 3'-metoxi-3'-desoxiguanosina-5'-trifosfato 3'-metoxi- 3'-dGTP) também pode ser aqui

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41/141 referido como 2'-O-metilguanosina-5'-trifosfato (2'-OMe-GTP) e 3'-O-metilguanosina-5'trifosfato (3'-OMe-GTP), respectivamente. Após adesão da capa nucleotídeo modificado para a extremidade-5'do RNA não capeado compreendendo transcritos primários de RNA (ou RNA possuindo um difosfato em 5'-), a porção dos capa nucleotídeos modificado que é unida à RNA não capeada compreendendo transcritos primários de RNA (ou RNA que têm um difosfato em 5'-) pode ser aqui referido como um capa nucleosídeo modificado (isto é, sem se referir aos grupos de fosfato aos quais está ligado), mas algumas vezes é referido como um “capa nucleotídeo modificado.

Um RNA capeado de nucletídeo modificado é uma molécula de RNA capeada que é sintetizada utilizando um sistema de enzima de capeamento e uma capa nucleotídeo modificada, onde o capa nucletídeo em seu terminal 5 'compreende uma capa nucletídeo modificada, ou um RNA capeado que é sintetizado co-transcricionalmente em uma reação de transcrição in vitro que contém uma capa de dinocleotídeo modificada análogo onde o capa de dinocleotídeo modificado contém a modificação química na capa nucletídeo. Em algumas modalidades, capa de dinocleotídeo modificado análogo é uma capa anti-reverso análogo ou ARCA (Grudzien et al. 2004 Jemielity, et al. 2003, Grudzien-Nogalska et al. 2007, Peng et al. 2002, Stepinski et al. 2001).

Um RNA primário ou transcrito de RNA primário significa uma molécula de RNA que é sintetizada por uma polimerase de RNA in vivo ou in vitro e que tem uma molécula de RNA trifosfato no carbono 5'-da sua maioria dos nucleotídeos 5 '

Uma reação de amplificação de RNA ou um método de amplificação de RNA significa um método para aumentar a quantidade de RNA correspondente a uma ou várias sequências desejadas de RNA em uma amostra. Por exemplo, em algumas modalidades, o método de amplificação de RNA compreende: (a) sintetizar a primeira fita cDNA complementar a um ou mais moléculas de RNA desejáveis por extensão de um mais iniciadores por DNA polimerase dependente de RNA que se anelam às moléculas de RNA desejadas; (b) sintetizar DNAc de fita dupla a partir da primeira fita de cDNA utilizando um processo onde um promotor de RNA polimerase funcional é unido a este, e (c) o contato do cDNA de fita dupla com uma RNA polimerase que se liga ao referido promotor sob condições de transcrição, através do qual o RNA correspondente a uma ou mais moléculas de RNA desejadas é obtido. A menos que indicado de outra forma relacionada à modalidade específica

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42/141 da invenção, uma reação de amplificação de RNA de acordo com a presente invenção significa uma reação de amplificação de RNA senso, o que significa uma reação de amplificação de RNA que sintetiza RNA senso (por exemplo, RNA tendo a mesma sequência de um mRNA ou outro transcrito primário de RNA, ao invés do complemento daquela sequência). As reações de amplificação de RNA senso conhecidas na técnica, que estão englobadas dentro desta definição incluem, entre outros, os métodos que sintetizam RNA senso descritos em Ozawa et al. (Ozawa et al 2006.) e nos Pedidos de Patente US 20090053775; 20050153333; 20030186237; 20040197802; e 20040171041. O método de amplificação de RNA descrito no Pedido de Patente US 20090053775 é um método preferido para a obtenção de RNA amplificados derivados de uma ou mais células, cujos RNA amplificados são então utilizados para fazer mRNA para utilização nos métodos da presente invenção.

A poli-A polimerase (PAP) significa um modelo independente de RNA polimerase encontrado na maioria dos eucariontes, procariontes, eucariontes e vírus que, seletivamente, usam ATP para incorporar resíduos AMP para extremidades 3'-hidroxiladas do RNA. Visto que as enzimas PAP que têm sido estudadas a partir de plantas, animais, bactérias e vírus todas catalisam a mesma reação global (Edmonds 1990) são altamente conservadas estruturalmente (Gershon 2000) e não têm especificidade intrínseca para sequências particulares ou tamanhos de moléculas de RNA se a PAP é separada das proteínas que reconhecem sinais de poliadenilação AAUAAA (Wilusz e Shenk, 1988), enzimas purificadas PAP do tipo selvagem e recombinante a partir de qualquer um de uma variedade de fontes podem ser utilizadas para a presente invenção. Em algumas modalidades, um enzima PAP de Saccharomyces (por exemplo, a partir de S. cerevisiae) é usada para poliadenilação para fazer preparações de RNA purificado compreendendo ou consistindo em um ou mais mRNA modificados, cada um dos quais codifica um fator de reprogramação (por exemplo, uma fator de indução de células iPS). Em algumas modalidades, uma enzima PAP de E. coli é utilizada para poliadenilação para fazer preparações de RNA purificado compreendendo ou consistindo em um ou mais mRNAs modificados, cada um dos quais codifica um fator de reprogramação (por exemplo, um fator de indução de células iPS).

Um fator de reprogramação significa uma proteína, polipeptídeo, ou outra biomolécula que, quando usada sozinha ou em combinação com outros fatores ou condições,

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43/141 provoca uma alteração no estado de diferenciação de uma célula na qual o fator de reprogramação é introduzido ou expresso. Em algumas modalidades preferenciais dos métodos da presente invenção, o fator de reprogramação é uma proteína ou polipeptídeo que é codificado por um mRNA que é introduzido em uma célula, gerando assim uma célula que apresenta um estado alterado de diferenciação em comparação com a célula na qual o mRNA foi introduzido. Em algumas modalidades preferenciais dos métodos da presente invenção, o fator de reprogramação é um fator de transcrição. Uma modalidade de um fator de reprogramação utilizada em um método da presente invenção é um fator de indução de células iPS.

Um fator de indução de células iPS ou fator de indução iPSC é uma proteína, polipeptídeo, ou outra biomolécula que, quando usada sozinha ou em combinação com outros fatores de reprogramação, causa a geração de células iPS a partir de células somáticas. Exemplos de fatores de indução de células iPS incluem OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG e LIN28. Fatores de indução de células iPS incluem sequências de polipeptídeos de comprimento total ou seus fragmentos biologicamente ativos. Da mesma forma um mRNA que codifica um fator de indução de células iPS pode codificar um polipeptídeo de comprimento completo ou fragmentos biologicamente ativos. O mRNA que codifica para sequência de exemplares de fatores iPS de indução são mostrados nas Figuras 25 (KLF4 e LIN28), 26 (c-myc e NANOG), e 27 (OCT4 e SOX2). Em certas modalidades, a presente invenção emprega as sequências ou sequências semelhantes mostradas nestas figuras, incluindo moléculas de mRNA que compreendem adicionalmente, unidos a estas sequências de mRNA, oligorribonucleotídeos que exibem quaisquer uma das sequências 5'e 3' UTR, sequências Kozak, as sequências de IRES, capa nucleotídeos, e/ou sequências poli (A) utilizadas nas experiências aqui descritas, ou que são geralmente conhecidos na técnica e que podem ser usados no lugar daqueles aqui utilizado, ligando-os a estas sequências de proteínas codificadoras de mRNA com a finalidade de otimizar a tradução das moléculas de mRNA respectivas nas células e melhorar a sua estabilidade na célula, a fim de realizar os métodos aqui descritos.

Diferenciação ou diferenciação celular significa o processo biológico que ocorre naturalmente pelo qual uma célula que apresenta um estado menos especializado de diferenciação ou tipo de célula (por exemplo, uma célula do ovo fertilizado, uma célula em um

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44/141 embrião, ou uma célula de um organismo eucariótico) torna-se uma célula que apresenta um estado mais especializado de diferenciação ou do tipo de célula. Os cientistas, incluindo biólogos, biólogos celulares, imunologistas, e embriologistas, usam uma variedade de métodos e critérios para definir, descrever ou categorizar células diferentes de acordo com o seu tipo de célula, “estado diferenciado, ou estado de diferenciação. Em geral, uma célula é definida, descrita, ou categorizada em relação ao seu tipo de célula, “estado diferenciado, ou estado de diferenciação. baseado em um ou mais fenótipos exibidos por essa célula, tais fenótipos podem incluir forma, uma atividade ou função metabólica ou bioquímica, a presença de biomoléculas determinadas na célula (por exemplo, com base em coloração que reagem com biomoléculas específicas), ou sobre a célula (por exemplo, com base na ligação de um ou mais anticorpos que reagem com biomoléculas específicas sobre a superfície da célula). Por exemplo, em algumas modalidades, diferentes tipos de células são identificados e classificados usando um classificador de células ou equipamento classificador de células ativado por fluorescência (FACS).Diferenciação ou diferenciação celular pode também ocorrer a células em cultura.

O termo reprogramação, como aqui utilizado, significa a diferenciação ou de diferenciação celular que ocorre em resposta a entrega de um ou mais fatores de reprogramação para dentro da célula, diretamente (por exemplo, pela entrega de fatores de reprogramação proteínas ou polipeptídeos para dentro da célula) ou indiretamente (por exemplo, por distribuição da preparação de RNA purificado da presente invenção que compreende uma ou mais moléculas de mRNA, cada uma das quais codifica um fator de reprogramação) e mantendo as células em condições (por exemplo, meio, temperatura, oxigénio e os níveis de CO2, matriz e outras condições ambientais) que são favoráveis para a diferenciação. O termo reprogramação quando aqui utilizado não pretende significar ou referir-se a uma direção ou rota de diferenciação específica (por exemplo, a partir de um tipo de célula menos especializado para um tipo de célula mais especializado) e não exclui processos que procedem em uma direção ou rota de diferenciação do que o que normalmente se observa na natureza. Assim, em modalidades diferentes da presente invenção, reprogramação significa e inclui quaisquer e todos dos seguintes:

(1) Desdiferenciação, significa um processo de uma célula que apresenta um estado mais especializado de diferenciação ou tipo de célula (por exemplo, um fibroblasto de

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45/141 mamífero, um queratinócito, uma célula muscular, ou uma célula neural) indo para uma célula que apresenta uma estado menos especializado de diferenciação ou do tipo de células (por exemplo, uma célula iPS);

(2) Transdiferenciação, significa um processo de uma célula que apresenta um estado mais especializados de diferenciação ou do tipo de células (por exemplo, um fibroblasto de mamífero, um queratinócito, ou uma célula neural) indo para outro estado mais especializado de diferenciação ou do tipo de célula (por exemplo, a partir de um fibroblasto ou queratinócitos para uma célula muscular) e (3) Rediferenciação ou diferenciação esperada ou diferenciação natural , significa, um processo de uma célula que exibe todo o estado particular de diferenciação ou tipo de célula indo para outro estado de diferenciação ou tipo de célula, como seria esperado na natureza, se a célula estava presente no seu lugar natural e ambiente (por exemplo, em um embrião ou um organismo), se o referido processo ocorre in vivo em um organismo ou em cultura (por exemplo, em resposta a um ou mais fatores de reprogramação).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece composições e métodos para reprogramar o estado de diferenciação de células eucarióticas, incluindo células humanas ou de outras células animais, por contato das células com preparações purificadas de RNA compreendendo ou consistindo em um ou mais diferentes moléculas de mRNA fita simples que cada uma codifica um fator de reprogramação (por exemplo, um fator de indução de células iPS). As moléculas de mRNA de fita simples purificadas preferencialmente compreendem pelo menos um nucleosídeo modificado selecionado do grupo consistindo de uma pseudouridina (Ψ), 5-metilcitosina (m⁵C), 5-metiluridina (m⁵U), 2'-O- metiluridina (Um ou m²'^-° U), 2-tiouridina (s²U), e N⁶metiladenosina (m⁶A) no lugar de pelo menos uma parte (por exemplo, incluindo substancialmente todos) os nucleosídeo canônico correspondentes não modificados dos nucleosídeos canônicos não modificados A, C, G, ou T. Além disso, as moléculas de mRNA de fita simples são de preferência purificadas para serem substancialmente livres de moléculas de RNA contaminantes que poderiam ativar uma resposta indesejada, diminuir a expressão do mRNA de fita simples, e/ou ativar sensores de RNA nas células. Em certas modalidades, as preparações purificadas de RNA são substancialmente livres de moléculas de RNA contaminantes que são: curtas ou mais longas do que as moléculas de mRNA comprimento

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46/141 total de fita simples, de cadeia dupla, e/ou RNA não capeado. Em algumas modalidades preferenciais, a invenção proporciona composições e métodos para reprogramação diferenciada das células eucarióticas, incluindo células humanas ou outras somáticas animais, por contato das células com preparações purificadas de RNA compreendendo ou consistindo em um ou mais diferentes moléculas de mRNA fita simples que codificam cada uma fator de indução de células iPS.

Em certas modalidades o mRNA utilizado nas preparações purificadas de RNA é purificado para remover substancialmente, essencialmente, ou virtualmente todos os contaminantes, incluindo substancialmente, essencialmente, ou virtualmente todos os contaminantes de RNA. A presente invenção não está limitada no que diz respeito aos métodos de purificação usados para purificar o mRNA, e a invenção inclui a utilização de qualquer método que é conhecido na técnica ou a ser desenvolvido no futuro, a fim de purificar o mRNA e remover os contaminantes, incluindo RNA contaminantes, que interferem com o uso pretendido do mRNA. Por exemplo, em modalidades preferenciais, a purificação do mRNA remove os contaminantes que são tóxicos para as células (por exemplo, através da indução de uma resposta imune inata nas células, ou, no caso dos contaminantes de RNA de fita dupla compreendendo RNA, através da indução de RNA de interferência (RNAi), por exemplo, através de siRNA ou moléculas longas RNAi) e contaminantes que direta ou indiretamente diminuem a tradução do mRNA em células). Em algumas modalidades, o mRNA é purificado por HPLC utilizando um método aqui descrito, incluído nos Exemplos. Em certas modalidades, o mRNA é purificado utilizando um substrato de resina polimérica compreendendo um copolímero de estireno-divinilbenzeno derivatizado C18 e um acetato de trietilamina (TEAA) agente de emparelhamento de íons usado no tampão da coluna, juntamente com a utilização de um gradiente de acetonitrila para eluir o mRNA e separá-lo a partir dos RNA contaminantes dependente do tamanho, em algumas modalidades, a purificação de mRNA é realizada utilizando HPLC, mas em algumas outras modalidades uma coluna de fluxo de gravidade é usada para a purificação. Em algumas modalidades, o mRNA é purificado utilizando um método descrito no livro intitulado RNA Purification and Analysis” by Douglas T. Gjerde, Lee Hoang, and David Hornby, publicado by Wiley-VCH, 2009, aqui incorporada como referência. Em algumas modalidades, a purificação de mRNA é efetuada de um modo não desnaturante (por exemplo, a uma temperatura inferior a cerca de 50 graus C,

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47/141 por exemplo, à temperatura ambiente). Em algumas modalidades, a purificação de mRNA é efetuada de um modo parcialmente desnaturante (por exemplo, a uma temperatura inferior a cerca de 50 graus C e 72 graus C). Em algumas modalidades, a purificação de mRNA é efetuada em modo de desnaturação (por exemplo, a uma temperatura maior do que cerca de 72 graus C). Claro que, aqueles com conhecimento na técnica saberão que a temperatura de desnaturação depende da temperatura de fusão (Tm) do mRNA que será purificado, bem como sobre as temperaturas de fusão de RNA, DNA, ou híbridos RNA/DNA que contaminam o mRNA. Em outras modalidades, o mRNA é purificado como descrito por Mellits KH et al. (Removal of double-stranded contaminants from RNA transcripts: synthesis of adenovirus VA RNA1 from a T7 vector. Nucleic Acids Research 18: 5401-5406, 1990, Nucleic Acids Research 18:. 5401-5406, 1990, aqui incorporada como referência na sua totalidade). Esses autores utilizaram uma purificação de três etapas para remover os contaminantes que podem ser utilizados em modalidades da presente invenção. Passo 1 foi eletroforese em gel de 8% de poliacrilamida em ureia 7M (condições de desnaturação ). A banda principal foi excisada do RNA a partir da fatia de gel e submetida a eletroforese em gel de poliacrilamida 8% sob condições não desnaturantes (sem ureia) e a banda principal recuperada a partir da fatia de gel. A purificação adicional foi realizada em uma coluna de celulose CF-11 utilizando uma fase móvel de tampão de etanol-sal que separa RNA fita dupla do RNA de fita simples (RM Franklin 1966 Proc Natl Acad Sei EUA 55: 1504-1511; Barber .R. 1966 Biochem Biophys Acta 114:422; e Zelcer A et al 1982 J. Gen. Virol 59: 139-148, todos os quais são aqui incorporados como referência) e a etapa de purificação final foi cromatografia de celulose . Em algumas outras modalidades o mRNA é purificado usando uma coluna de hidroxilapatite (HAP), seja sob condições não desnaturantes ou a temperaturas mais elevadas (por exemplo, como descrito por Pays E. 1977 Biochem J. 165:.. 237-245; Lewandowski LJ et al 1971 J. Virol 8: 809-812; Clawson GA e EA Smuckler 1982 Cancer Research 42: 3228-3231, e/ou Andrews-Pfannkoch C et al 2010 Applied and Environmental Microbiology 76: 5039 -..5045, todas as quais são aqui incorporadas como referência). Em algumas outras modalidades, o mRNA é purificado por cromatografia líquida de troca aniônica fraca sob condições não desnaturantes (por exemplo, como descrito por Easton LE et al. 2010. RNA 16: 647-653 to clean up in vitro transcription reactions, aqui incorporada como referência). Em outras modalidades, o mRNA é purificado usando uma combinação de qualquer um dos métodos

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48/141 acima ou outro método conhecido na técnica ou a ser desenvolvido no futuro. Em ainda outra modalidade o mRNA utilizado nas composições e métodos da presente invenção é purificado utilizando um processo que compreende o tratamento do mRNA com uma enzima que atua especificamente (por exemplo, digere) um ou mais RNA contaminantes ou ácidos nucleicos contaminantes (por exemplo, incluindo DNA), mas que não atua sobre (por exemplo, não digere) o mRNA desejado. Por exemplo, em algumas modalidades, o mRNA utilizado nas composições e métodos da presente invenção é purificado utilizando um processo que compreende o tratamento do mRNA com uma enzima de ribonuclease III (RNase III) (por exemplo, E. coli RNase III) e do mRNA purifica-se então longe dos produtos de digestão RNase III. A enzima III ribonuclease (RNase III) aqui significa uma enzima que digere os RNA fita dupla superiores a cerca de doze pares de bases para a margem de fragmentos de RNA de fita dupla. Em algumas modalidades, o mRNA utilizados nas composições e métodos da presente invenção é purificado utilizando um processo que compreende o tratamento do mRNA com um ou mais outras enzimas que digerem especificamente um ou mais RNAs contaminantes ou ácidos nucleicos contaminantes (por exemplo, incluindo DNA).

Esta invenção fornece o RNA, oligoribonucleotídeo, e as moléculas poliribonucleotídeas, que compreendem pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, os vetores de terapia gênica compreendendo os mesmos, métodos de terapia gênica e métodos de silenciamento de transcrição de genes compreendendo os mesmos, os métodos de redução de uma imunogenicidade da mesma, e os métodos de síntese dos mesmos. Estas sequências modificadas estão de preferência presentes nas preparações purificadas de RNA aqui descritos.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um RNA mensageiro que compreende um resíduo pseudouridina. Em outra modalidade, o RNA mensageiro codifica uma proteína de interesse. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de RNA que codifica uma proteína de interesse, esta molécula de RNA molécula compreendendo um resíduo pseudouridina. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de RNA transcrita in vitro, compreendendo uma pseudouridina. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de RNA transcrita in vitro, compreendendo um nucleosídeo modificado.

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Conforme fornecido aqui, a presente invenção fornece métodos para sintetizar moléculas de RNA transcrita in vitro, compreendendo pseudouridina e/ou nucleosídeos modificados. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de RNA mensageiro que compreende um resíduo pseudouridina.

Em outra modalidade, moléculas de RNA transcritas in vitro dos métodos e composições da presente invenção é sintetizada por RNA polimerase do fago T7 . Em outra modalidade, sintetizada por RNA polimerase do fago SP6. Em outra modalidade, sintetizada por RNA polimerase do fago T3. Em outra modalidade, a molécula é sintetizada por uma polimerase selecionada a partir das polimerases acima. Em outra modalidade, a molécula de RNA transcrita in vitro é um oligoribonucleotídeo. Em outra modalidade, a molécula de RNA transcrita in vitro é um poliribonucleotídeo. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um oligoribonucleotídeo sintetizado in vitro, compreendendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, onde o nucleosídeo modificado é m⁵C, m⁵U, m⁶A, s²U, Ψ, ou 2'-Ometil-U. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um poliribonucleotídeo sintetizado, compreendendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, onde o nucleosídeo modificado é m⁵C, m⁵U, m⁶A, s²U, Ψ, ou 2'-O-metil-U.

Em outra modalidade, o oligoribonucleotídeo sintetizado in vitro ou poliribonucleotídeo é (sh) RNA short hairspin.. Em outra modalidade, o oligoribonucleotídeo sintetizado in vitro é um RNA de pequena interferência (siRNA). Em outra modalidade, o oligoribonucleotídeo sintetizado in vitro é qualquer outro tipo de oligoribonucleotídeo conhecidos na técnica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, uma molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo dos métodos e composições da presente invenção compreende ainda uma estrutura de leitura aberta que codifica uma proteína funcional. Em outra modalidade, a molécula de RNA ou funções de molécula de oligoribonucleotídeo sem codificar uma proteína funcional (por exemplo, no silenciamento transcricional), como um RNzyme, etc. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a molécula de RNA, oligorribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo compreende ainda uma cauda poli-A. Em outra modalidade, a molécula de

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RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo não inclui uma cauda poli-A. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo compreende ainda uma capa m7GpppG. Em outra modalidade, a molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo não inclui uma capa de m7GpppG. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo compreende ainda uma capa independente melhorador da tradução. Em outra modalidade, a molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo não inclui uma capa independente potenciador de tradução. Em outra modalidade, a capa independente potenciador de tradução é um vírus de tabaco etch (TEV)-cap independente potenciador de tradução. Em outra modalidade, a capa independente potenciador de tradução é qualquer outro capa independente potenciador de tradução conhecidos na técnica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um vetor de terapia gênica, compreendendo uma molécula polirubonucleotídeo sintetizado in vitro, onde a molécula polirubonucleotídeo compreende uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado.

Em outra modalidade, uma molécula de RNA, oligorubonucleotídeo, ou polirubonucleotídeo dos métodos e composições da presente invenção compreende uma pseudouridina. Em outra modalidade, a molécula de RNA ou molécula oligorubonucleotídeo compreende um nucleosídeo modificado. Em outra modalidade, a molécula de RNA ou molécula oligorubonucleotídeo é uma molécula de RNA sintetizada in vitro ou um oligoribonucleotídeo. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Pseudouridina refere-se, em outra modalidade, a m¹acp³T (1-metil-3-(3-amino-3carboxipropil) pseudouridina. Em outra modalidade, o termo refere-se a m¹T (1 metilpseudouridina) Em outra modalidade, o termo refere-se a Tm (2'-O-metilpseudouridina. Em outra modalidade, o termo refere-se a m⁵D (5-metilldiidrouridina). Em outra modalidade, o termo refere-se a m³T (3-metilpseudouridina). Em outra modalidade, o termo refere-se a uma parte pseudouridina que não é mais modificada. Em outra modalidade, o termo refere-se a um monofosfato, difosfato ou trifosfato de qualquer uma das pseudouridinas acima. Em outra

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51/141 modalidade, o termo refere-se a qualquer outra pseudouridina conhecida na técnica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, uma molécula de RNA, de oligoribonucleotídeo, ou de poliribonucleotídeo dos métodos e composições da presente invenção é um oligoribonucleotídeo terapêutico.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a liberação de uma proteína recombinante a um sujeito, o método compreendendo a etapa de contato do sujeito com uma molécula de RNA, de oligoribonucleotídeo ou poliribonucleotídeo ou um vetor de terapia gênica da presente invenção, assim proporcionando uma proteína recombinante a um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de RNA dupla fita (dsRNA) compreendendo uma pseudouridina ou um nuclosídeo modificado e compreendendo ainda um siRNA ou RNA curto hairpin (shRNA). Em outra modalidade, a molécula de dsRNA é maior do que 50 nucleotídeos em comprimento. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a pseudouridina ou um nucleosídeo modificado está dentro da sequência de siRNA. Em outra modalidade, a pseudouridina ou um nucleosídeo modificado está fora da sequência siRNA. Em outra modalidade, uma ou mais pseudouridinas e/ou um resíduo de nucleosídeo modificado estão presentes tanto dentro como fora da sequência siRNA. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, o siRNA ou shRNA está contido internamente na molécula dsRNA. Em outra modalidade, o siRNA ou shRNA está contido em uma extremidade da molécula de dsRNA. Em outra modalidade, um ou mais siRNA ou shRNA estão contidos em uma extremidade da molécula de dsRNA enquanto outra um mais estão contidos internamente. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, o comprimento de um RNA, mólecula de oligoribonucleotídeo ou poliribonucleotídeo (por exemplo, um RNA de fita simples (ssRNA) ou molécula de dsRNA) dos métodos e composições da presente invenção é maior do que 30 nucleotídeos em comprimento. Em outra modalidade, a molécula de RNA ou oligoribonucleotídeo é maior do que 35 nucleotídeos em comprimento. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 40 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 45 nucleotídeos. Em outra

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52/141 modalidade, o comprimento é pelo menos 55 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 60 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 60 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 80 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 90 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 100 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 120 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 140 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 160 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 180 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 200 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 250 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 300 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 350 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 400 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 450 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 500 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 600 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 700 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 800 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 900 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 1000 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é de pelo menos 1100 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 1200 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 1300 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é de pelo menos 1400 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 1500 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é de pelo menos 1600 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é de pelo menos 1800 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 2000 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 2500 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 3000 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é de pelo menos 4000 nucleotídeos. Em outra modalidade, o comprimento é pelo menos 5000 nucleotídeos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, uma molécula de dsRNA dos métodos e composições da presente invenção é fabricado por transcrição in vitro. Em outra modalidade, a etapa para transcrição in vitro utiliza RNA polimerase do fago T7. Em outra modalidade, a transcrição in

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53/141 vitro utiliza RNA polimerase do fago SP6. Em outra modalidade, a transcrição in vitro utiliza RNA polimerase do fago T3. Em outra modalidade, a transcrição in vitro utiliza uma RNA polimerase selecionada a partir das polimerases acima. Em outra modalidade, a transcrição in vitro utiliza qualquer outra RNA polimerase conhecida na técnica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a molécula de dsRNA é capaz de ser processada por uma enzima celular para produzir o siRNA ou shRNA. Em outra modalidade, a enzima celular é uma endonuclease. Em outra modalidade, a enzima celular é Dicer. Dicer é uma nuclease da família RNase III que inicia o RNA interferente(RNAi) e fenômenos ligados pela geração dos pequenos RNAs que determinam a especificidade destas vias de silenciamento de genes ((Bernstein E, Caudy AA et al, Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001; 409(6818): 363-6). Em outra modalidade, a enzima celular é qualquer outra enzima celular conhecida na técnica que é capaz de clivar uma molécula de dsRNA. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a molécula de dsRNA contém dois siRNA ou shRNA. Em outra modalidade, a molécula de dsRNA contém três siRNA ou shRNA. Em outra modalidade, a molécula de dsRNA contém mais do que três siRNA ou shRNA. Em outra modalidade, o siRNA e/ou shRNA são liberados a partir da molécula de dsRNA por uma enzima celular. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a administração de uma siRNA ou shRNA a uma célula, compreendendo a administração de uma molécula de dsRNA da presente invenção, onde a célula processa a molécula dsRNA para se obter o siRNA ou shRNA, assim, administrando um siRNA ou shRNA a uma célula.

Em outra modalidade, o nucleosídeo que é modificado em uma molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, poliribonucleotídeo dos métodos e composições da presente invenção é uridina (U). Em outra modalidade, o nucleosídeo modificado é citidina (C). Em outra modalidade, o nucleosídeo modificado é de adenosina (A). Em outra modalidade o nucleosídeo modificado é guanosina (G). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, o nucleosídeo modificado dos métodos e composições da presente invenção é m⁵C (5-metilcitidina). Em outra modalidade, o nucleosídeo modificado é

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54/141 m⁵U (5-metiluridina). Em outra modalidade, o nucleosídeo modificado é m⁶A (N⁶metiladenosina). Em outra modalidade, o nucleosídeo modificado é s²U (2-tiouridina). Em outra modalidade nucleosídeo modificado é Ψ (pseudouridina). Em outra modalidade, o nucleosídeo modificado é Um (2'-O-metiluridina).

Em outras modalidades, o nucleosídeo modificado é m^lA (l-metiladenosina); m²A (2metiladenosina); Am(2'-O-metiladenosina); ms²m^GA (2-metiltio-N⁶-metiladenosina); i^GA(~isopenteniladenosina); ms^zi6A (2-metiltio-N⁶isopenteniladenosina); io⁶A (N⁶-(cishidroxiisopentenil)adenosina); ms²io⁶A (2-metiltio-N^6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina); g⁶A /KT⁶ ítI 1 m rn I po tT> n m /-\i lar! on z\ci tio)· 4-⁶ A /NT⁶ 4·τ*ο/\η ·1 c* q τ4λ q m /xi l n /4 on rtcmoV m c ²+⁶ A í m ofi l Ή i~x NT⁶ (n -gliciiiilcaibamoiladeiiosiiia); t a (n -iieonilcaibamoiladenosina); ms t a (2-metiltio-N Ιτολιί 1 1 no τ4λ q m /-μ 1 n /4 on r\ci noY m ⁶ /⁶ A /NT⁶ m ofi 1 AT^ d/4on/\ci no)· tan⁶A /^NT⁶ tIeoni1caIbamoiladenosina); m t a (n -meti1-N -tIeonilcaIbamoiladenosina); iin a(n hidroxinorvalilcarbamoiladenosina); ms²hn⁶A (2-metiltio-N⁶-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2'-O-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); m¹I (l-metilinosina); m^lIm (l,2'-O-dimetilinosina); m³C (3-metilcitidina); Cm (2'-O-metilcitidina); S²C (2tiocitidina); ac⁴C (N⁴-acetilcitidina); f5C (5-formilcitidina); m⁵Cm (5,2'-O-dimetilcitidina); ac⁴Cm (N⁴-acetil-2'-O-metilcitidina); k²C (lisidina); m¹G (l-metilguanosina); m²G (N²metilguanosina); m⁷G (7-metilguanosina); Gm (2'-O-metilguanosina); m²2G (N²,N²dimetilguanosina); m²Gm (N²,2'-O-dimetilguanosina); m²2Gm (N²,N²,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-O-ribosilguanosina (fosfato)); iW (wibutosina); o2iW (peroxiwibutosina); OHiW (hidroxiwibutosina); OHiW* (hidroxiwibutosina submodificada); imG (wiosina); mimG (metilwiosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galactosil-queuosina); manQ (mannosilqueuosina); preQo (7-ciano-7-deazaguanosina); preQl (7-aminometil-7deazaguanosina); G+ (archaeosine); D (dihidrouridina); m⁵Um (5,2'-O-dimetiluridina); S⁴U (4tiouridina); m⁵s²U (5-metil-2-tiouridina); s²Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp³U (3-(3-amino3-carboxipropil)uridina); ho⁵U (5-hidroxiuridina); mo⁵U (5-metoxiuridina); cmo⁵U (uridina ácido 5-oxiacetico); mcmo⁵U (ester metil do ácido uridina 5-oxiacético); chm⁵U (5(carboxihidroximetil)uridina)); mchm⁵U (5(carboxihidroximetil)uridina ester metil); mcm⁵U (5-metoxicarbonilmetiluridina); mcm⁵Um (5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina);

mcm⁵s²U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina); nm⁵s²U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm⁵U (5-metilaminometiluridina); mnm⁵s²U (5-metilaminometil-2-tiouridina); mnmse²U (5metilaminometil-2-selenouridina); ncm⁵U (5-carbamoilmetiluridina); ncm⁵Um (5carbamoilmetil-2'-O-metiluridina); cmnm⁵U (5-carboximetilaminometiluridina); cmnm⁵Um

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55/141 (5-carboximetilaminometil-2'--metiluridina); cmnm⁵s²U (5-carboximetilaminometil-2tiouridina); m⁶2A (N6,N6-dimetiladenosina); Im (2'-O-metilinosina); m⁴C (N⁴-metilcitidina); m⁴Cm (N⁴,2'-O-dimetilcitidina); hm⁵C (5-hidroximeti1citidina); m³U (3-metiluridina); cm⁵U (5-carboximetiluridina); m⁶Am (N⁶,2'-Odimetiladenosina); m⁶2Am (N⁶,N⁶, 2'-Otrimetiladenosina); m^2,7G(N²,7-dimetilguanosina); m^2,2,7G (N²,N²,7-tnmetilguanosma); m³Um (3,2'-O-dimetiluridina); m⁵D (5-metildihidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-O-meti1citidina); m^lGm (1,2'-O-dimetilguanosina); m¹Am (1,2'-O-dimetiladenosina); im⁵U (5taurinometiluridina); Tm5s2U (5-taurinometi1-2-tiouridina)); imG-14 (4-demetilwiosina); imG2 (isowiosina); or ac⁶A (N⁶-acetiladenosina). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, uma molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo dos métodos e composições da presente invenção compreende uma combinação de duas ou mais das modificações acima. Em outra modalidade, a molécula de RNA ou molécula oligorubonucleotídeo compreende uma combinação de 3 ou mais das modificações acima. Em outra modalidade, a molécula de RNA ou molécula oligorubonucleotídeo compreende uma combinação de mais de 3 das modificações acima. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, entre 0,1% e 100% dos resíduos na molécula de RNA, oligoribonucleotídeos, poliribonucleotídeos dos métodos e composições da presente invenção são modificados (por exemplo, quer pela presença de pseudouridina ou uma base nucleosídica modificada Em outra modalidade, 0,1% dos resíduos são modificados. Em outra modalidade, 0,2%. Em outra modalidade, a fração é de 0,3%. Em outra modalidade, a fração é de 0,4%. Em outra modalidade, a fração é de 0,5%. Em outra modalidade, a fração é de 0,6%. Em outra modalidade, a fração é de 0,8%. Em outra modalidade, a fração é de 1%. Em outra modalidade, a fração é de 1,5%. Em outra modalidade, a fração é de 2%. Em outra modalidade, a fração é de 2,5%. Em outra modalidade, a fração é de 3%. Em outra modalidade, a fração é de 4%. Em outra modalidade, a fração é de 5%. Em outra modalidade, a fração é de 6%. Em outra modalidade, a fração é de 8%. Em outra modalidade, a fração é de 10%. Em outra modalidade, a fração é de 12%. Em outra modalidade, a fração é de 14%. Em outra modalidade, a fração é de 16%. Em outra modalidade, a fração é de 18%. Em outra modalidade, a fração é de 20%. Em outra modalidade, a fração é de 25%. Em outra

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56/141 modalidade, a fração é de 30%. Em outra modalidade, a fração é de 35%. Em outra modalidade, a fração éde modalidade, a fração éde modalidade, a fração éde

40%. Em outra modalidade,

50%. Em outra modalidade,

70%. Em outra modalidade, a fração é de 45%. Em outra a fração é de 60%. Em outra a fração é de 80%. Em outra modalidade, a fração é de 90%. Em outra modalidade, a fração é de 100%.

Em outra modalidade, a fração é inferior a 5%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 3%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 1%. Em outra modalidade, a fraçãoé inferior a 2%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 4%. Em outra modalidade, a fraçãoé inferior a 6%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 8%. Em outra modalidade, a fraçãoé inferior a 10%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 12%. Em outra modalidade,a fração é inferior a 15%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 20%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 30%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 40%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 50%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 60%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 70%.

Em outra modalidade, 0,1% dos resíduos de um dado nucleotídeo (uridina, citidina, guanosina, ou adenina) são modificados. Em outra modalidade, a fração do nucleotídeo é de 0,2%. Em outra modalidade, a fração é de 0,3%. Em outra modalidade, a fração é de 0,4%. Em outra modalidade, a fração é de 0,5%. Em outra modalidade, a fração é de 0,6%. Em outra modalidade, a fração modalidade, a fração modalidade, a fração é de 0,8%. Em outra é de 1,5%. Em outra é de 2,5%. Em outra modalidade, a fração modalidade, a fração modalidade, a fração é de 1%. Em outra é de 2%. Em outra é de 3%. Em outra modalidade, a fração é de 4%. Em outra modalidade, a fração é de 5%. Em outra modalidade, a fração é de 6%. Em outra modalidade, a fração é de 8%. Em outra modalidade, a fração é de

10%. Em outra modalidade, a fração é de 12%. Em outra modalidade, a fração é de 14%. Em outra modalidade, a fração é de 16%. Em outra modalidade, a fração é de 18%. Em outra modalidade, a fração éde modalidade, a fração éde modalidade, a fração éde modalidade, a fração éde modalidade, a fração éde

20%. Em outra modalidade,

30%. Em outra modalidade,

40%. Em outra modalidade,

50%. Em outra modalidade,

70%. Em outra modalidade, a fração é de 25%. Em outra a fração é de 35%. Em outra a fração é de 45%. Em outra a fração é de 60%. Em outra a fração é de 80%. Em outra modalidade, a fração é de 90%. Em outra modalidade, a fração é de 100%.

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Em outra modalidade, a fração de dado nucleotídeo é inferior a 8%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 10%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 5%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 3%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 1%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 2%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 4%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 6%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 12%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 15%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 20%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 30%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 40%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 50%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 60%. Em outra modalidade, a fração é inferior a 70%.

Em outra modalidade, os termos “ribonucleotídeo,” “oligorribonucleotídeo“, e poliribonucleotídeo referem-se a uma sequência de pelo menos 2 combinações de bases de açúcar-fosfato. O termo inclui, em outra modalidade, os compostos compreendendo os nucleotídeos em que a porção de açúcar é a ribose. Em outra modalidade, o termo inclui RNA e derivados de RNA em que a espinha dorsal é modificada. Nucleotídeos refere-se, em outra modalidade, às unidades monoméricas de polímeros de ácido nucleico. RNA pode ser, Em outra modalidade, sob a forma de um tRNA (RNA de transferência), snRNA (RNA nuclear pequeno), rRNA (RNA ribossomal), o mRNA (RNA mensageiro), RNA anti-senso, RNA pequeno interferente (siRNA), micro RNA (miRNA) e ribozimas. A utilização de siRNA e miRNA tem sido descrita (Caudy AA et ai,Genes e Devel 16: 2491-96 e referências aqui citadas). Além disso, estas formas de RNA podem ser fita simples, dupla, tripla, quádrupla. O termo também inclui, em outra modalidade, ácidos nucleicos artificiais que podem conter outros tipos de espinhas dorsais, mas as mesmas bases. Em outra modalidade, o ácido nucleico é um PNA artificial (ácido nucleico peptídico). PNA conter as espinhas dorsais de peptídeos e bases de nucleotídeos e são capazes de se ligar, em outra modalidade, tanto a moléculas de DNA quanto a de RNA. Em outra modalidade, o nucleotídeo é oxetano modificado. Em outra modalidade, o nucleotídeo é modificado por substituição de uma ou mais ligações fosfodiéster com uma ligação fosforotioato. Em outra modalidade, o ácido nucleico artificial contém qualquer outra variante da estrutura de fosfato de ácidos nucleicos nativos conhecidos na técnica. A utilização de ácidos nucleicos e fosfotioratos e PNA são conhecidos dos especialistas na técnica, e são descritos em, por exemplo, Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57 ~ e Raz NK et ai Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84. A produção e

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58/141 utilização de ácidos nucleicos é conhecida dos especialistas na técnica e está descrita, por exemplo, em Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds. and Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareed. . Cada derivado de ácido nucleico representa uma modalidade separada da presente invenção

Em outra modalidade, o termo oligorribonucleotídeo refere-se a uma cadeia que compreende menos de 25 nucleotídeos(nt). Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 24 nucleotídeos. Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 23 nucleotídeos. Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 22 nucleotídeos. Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 21 nucleotídeos. Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 20 nucleotídeos. Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 19 nucleotídeos. Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 18 nucleotídeos. Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 17 nucleotídeos. Em outra modalidade, “oligoribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de menos de 16 nucleotídeos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, o termo “poliribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia que compreende mais de 25 nucleotídeos (nt). Em outra modalidade, “poliribonucleotídeo” referese a uma cadeia de mais de 26 nucleotídeos. Em outra modalidade, “poliribonucleotídeo” refere-se a uma cadeia de mais de 28 nucleotídeos. Em outra modalidade o termo refere-se a uma sequência de mais de 30 nucleotídeos. Em outra modalidade, o termo refere-se a uma

sequência

de

mais

de

32

nucleotídeos.

Em

outra

modalidade,

o

termo

refere-se

a

uma

sequência

de

mais

de

35

nucleotídeos.

Em

outra

modalidade,

o

termo

refere-se

a

uma

sequência

de

mais

de

40

nucleotídeos.

Em

outra

modalidade,

o

termo

refere-se

a

uma

sequência

de

mais

de

50

nucleotídeos.

Em

outra

modalidade,

o

termo

refere-se

a

uma

sequência

de

mais

de

60

nucleotídeos.

Em

outra

modalidade,

o

termo

refere-se

a

uma

sequência

de

mais

de

80

nucleotídeos.

Em

outra

modalidade,

o

termo

refere-se

a

uma

sequência

de

mais

de

100 nucleotídeos.

Em

outra modalidade,

o

termo

refere-se

a

uma

sequência

de

mais

de

120 nucleotídeos.

Em

outra modalidade,

o

termo

refere-se

a

uma

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59/141 sequência de mais de150 nucleotídeos. Em outra modalidade, o termo refere-se a uma sequência de mais de 200 nucleotídeos.Em sequência de mais de 300 nucleotídeos.Em sequência de mais de 400 nucleotídeos.Em outra modalidade, o termo refere-se a uma outra modalidade, o termo refere-se a uma outra modalidade, o termo refere-se a uma sequência de mais de

500 nucleotídeos.

Em outra modalidade, o termo refere-se a uma sequência de mais 600 nucleotídeos. Em outra modalidade, o termo refere-se a uma sequência de mais de 800 nucleotídeos. sequência de mais de 1000 nucleotídeos. sequência de mais de 1200 nucleotídeos. sequência de mais de 1400 nucleotídeos. sequência de mais de 1600 nucleotídeos. sequência de mais de1800 nucleotídeos.

Em outra modalidade, o termo refere-se a uma Em outra modalidade, o termo refere-se a uma

Em outra modalidade, o termo refere-se a uma

Em outra modalidade, o termo refere-se a uma sequência de mais de 2000 nucleotídeos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para induzir uma célula de mamífero a produzir uma proteína de interesse, compreendendo o contato da célula de mamífero com uma molécula de RNA sintetizada in vitro que codifica a proteína recombinante, molécula de RNA sintetizada in vitro compreende um pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, induzindo assim uma célula de mamífero a produzir uma proteína de interesse. Em outra modalidade, a proteína de interesse é uma proteína recombinante. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Codificação refere-se, em outra modalidade, a uma molécula de RNA que codifica a proteína de interesse. Em outra modalidade, a molécula de RNA compreende uma estrutura de leitura aberta que codifica a proteína de interesse. Em outra modalidade, uma ou mais proteínas também são codificadas. Em outra modalidade, a proteína de interesse é a única proteína codificada. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para induzir uma célula de mamífero a produzir uma proteína recombinante, compreendendo o contato da célula de mamífero com uma molécula de RNA transcrita in vitro que codifica a proteína recombinante, a molécula de RNA transcrita in vitro compreende ainda uma pseudouridina ou um

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60/141 nucleosídeo modificado, induzindo uma célula de mamífero a produzir uma proteína recombinante.

Em outra modalidade, uma molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo dos métodos e composições da presente invenção é traduzida na célula mais eficientemente do que uma molécula de RNA não modificada com a mesma sequência. Em outra modalidade, a molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou, poliribobonucleotídeo exibe maior capacidade para ser traduzido por uma célula alvo. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 2 vezes em relação ao seu homólogo não modificado. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 3 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 5 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 7 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 10 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 15 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 20 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 50 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 100 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 200 vezes. Em outra modalidade, a tradução é reforçada por um fator de 500 vezes. Em outra modalidade, a tradução é melhorada por um fator de 1000 vezes. Em outra modalidade, a tradução é reforçada por um fator de 2000 vezes. Em outra modalidade, o fator é 10-1000 vezes. Em outra modalidade, o fator é 10-100- vezes. Em outra modalidade, o fator é 10-200 vezes. Em outra modalidade, o fator é 10-300 vezes. Em outra modalidade, o fator é 10-500 vezes. Em outra modalidade, o fator é 20-1000 vezes. Em outra modalidade, o fator é 30-1000 vezes. Em outra modalidade, o fator é 50-1000 vezes. Em outra modalidade, o fator é 1001000 vezes. Em outra modalidade, o fator é 200-1000 vezes. Em outra modalidade, a tradução é reforçada por qualquer quantidade significativa ou gama de valores. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Métodos de determinação da eficiência da tradução são bem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, medição da atividade de uma proteína repórter codificada (por exemplo, luciferase ou renilla ou [exemplos aqui] ou proteína verde fluorescente [[Wall AA, Phillips AM et al, Effective translation of the second cistron in two Drosophila dicistronic transcripts is determined by the absence of in-frame AUG codons in the first cistron. J Biol Chem 2005;280(30): 27670-8]), ou medindo marcação radioativa incorporada no proteína

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61/141 traduzida (Ngosuwan J, Wang NM et al, Roles of cytosolic Hsp70 and Hsp40 molecular chaperones in post-chaperones moleculars in post-translational translocation of presecretory proteins into the endoplasmic reticulum J Biol Chem 2003; 278 (9):. 7034-42). Cada método representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em alguns estudos de expressão aqui proporcionados, a tradução foi medida a partir de RNA complexado com Lipofectin ® (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA) e injetado na veia da cauda de ratos. Nos lisados de baço, RNA pseudouridina modificado foi traduzido significativamente mais eficientemente do que RNA não modificado (Figura 17B). Sob as condições utilizadas aqui, a eficiência de transfecção à base de métodos da presente invenção está correlacionada com a capacidade do reagente de transfecção para penetrar nos tecidos, proporcionando uma explicação para o efeito mais pronunciado em células do baço. Fluxo sanguíneo esplênico é um sistema aberto, com conteúdo de sangue diretamente em contato com elementos de polpa vermelha e branca, incluindo as células linfoides.

Em outro experimento, ensaios de fosforilação in vitro foram realizados usando PKR humano recombinante e seu substrato, eIF2a na presença de mRNA codificante para renilla capeado (0,5 e 0,05 ng/uL). mRNA contendo pseudouridina (Ψ) não ativou PKR, como detectado pela falta tanto de auto-fosforilação da PKR como da fosforilação de e!F2u, enquanto RNA sem modificação de nucleosídeos e mRNA com modificação m5C ativava PKR. efF2u fosforilado é conhecido por bloquear a iniciação da tradução do mRNA, portanto, a falta de fosforilação permite, em outra modalidade aumento da tradução, o mRNA contendo pseudouridina (Ψ).

Em outra modalidade, a tradução melhorada é em uma célula (em relação à tradução na mesma célula de uma molécula de RNA não modificado com a mesma sequência; Exemplos 13-14). Em outra modalidade, a tradução é melhorada in vitro (por exemplo, em uma mistura de tradução in vitro ou um lisado de reticulócitos. Exemplos 13-14 Em outra modalidade, a tradução é melhorada in vivo (Exemplo 13) Em cada caso, a tradução melhorada. é relativa a uma molécula de RNA não modificado com a mesma sequência, sob as mesmas condições. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a molécula de RNA, oligoribonucleotídeo ou poliribonucleotídeo dos métodos e composições da presente invenção é significativamente menos imunogênica do que uma molécula de RNA não modificado sintetizada in vitro com a

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62/141 mesma sequência. Em outra modalidade, a molécula de RNA modificado é 2-vezes menos imunogênica do que o seu homólogo não modificado. Em outra modalidade, a imunogenicidade é reduzida por um fator de três vezes. Em outra modalidade, a imunogenicidade é reduzida por um fator de 5 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 7 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 10 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 15 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 20 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 50 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 100 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 200 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 500 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 1000 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um fator de 2000 vezes. Em outra modalidade,a imunogenicidade é reduzida por um outro fator diferente.

Em outra modalidade, significativamente menos imunogênico refere-se a uma diminuição detectável em imunogenicidade. Em outra modalidade, o termo refere-se a uma diminuição de vezes na imunogenicidade (por exemplo, um dos fatores de dimunição enumerados acima). Em outra modalidade, o termo refere-se a uma diminuição tal de modo que uma quantidade eficaz da molécula de RNA, oligoribonucleotídeo, ou poliribonucleotídeo pode ser administrada sem desencadear uma resposta detectável imune. Em outra modalidade, o termo refere-se a uma diminuição de tal modo que molécula de RNA, de oligoribonucleotídeo, ou de poliribonucleotídeo, pode ser repetidamente administrada sem induzir uma resposta imune suficiente para reduzir de forma detectável a expressão da proteína recombinante. Em outra modalidade, a diminuição é tal que uma molécula de RNA, de oligoribonucleotídeo, ou de poliribonucleotídeo, pode ser, repetidamente administrada sem induzir uma resposta imune suficiente para eliminar a expressão detectável da proteína recombinante.

Quantidade eficaz de uma molécula de RNA, de oligoribonucleotídeo, ou de poliribonucleotídeo, refere-se, em outra modalidade, a uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapêutico. Em outra modalidade, o termo refere-se a uma quantidade suficiente

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63/141 para elicitar a expressão de uma quantidade detectável da proteína recombinante. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Imunogenicidade reduzida de moléculas de RNA, oligoribonucleotídeo, e poliribonucleotídeo da presente invenção é aqui demonstrado (Exemplos 4-11).

Métodos de determinação da imunogenicidade são bem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo medição da secreção de citocinas (por exemplo, IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MlP-Ια ou β, IL-6, IFN-β, ou IL-8; Exemplos aqui), medindo a expressão de marcadores de ativação DC ( por exemplo, CD83, HLA-DR, CD80 e CD86; Exemplos aqui), ou medindo a capacidade para atuar como um adjuvante para uma resposta imune adaptativa. Cada método representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a imunogenicidade relativa do nucleotídeo modificado e sua contraparte não modificado são determinados através da determinação da quantidade do nucleotídeo modificado necessária para elicitar uma das respostas acima, do mesmo grau como uma determinada quantidade do nucleotídeo não modificado. Por exemplo, se o dobro de nucleotídeos modificados é necessário para elicitar a mesma resposta, então o nucleotídeo modificado é duas vezes menos imunogênico do que o nucleotídeo não modificado.

Em outra modalidade, a imunogenicidade relativa do nucleotídeo modificado e sua contraparte não modificada são determinadas por determinação da quantidade de citocina (por exemplo, IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MlP-Ια ou β, IL-6, IFN -β, ou IL-8) secretada em resposta à administração do nucleotídeo modificado, em relação à mesma quantidade do nucleotídeo não modificado. Por exemplo, se um meio, como muito, de citocina é secretado, então o nucleotídeo modificado é duas vezes menos imunogênico do que o nucleotídeo não modificado. Em outra modalidade, os níveis de background de estimulação são subtraídos antes de calcular a imunogenicidade nos métodos acima. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, um método da presente invenção compreende ainda a mistura de moléculas de RNA, de oligoribonucleotídeo, ou de poliribonucleotídeo com um reagente de transfecção antes da etapa de contato. Em outra modalidade, um método da presente invenção compreende ainda a administração de moléculas de RNA, de oligoribonucleotídeo, ou de poliribonucleotídeo juntamente com o reagente de transfecção. Em outra modalidade o reagente de transfecção é um reagente lipídeo catiônico (Exemplo 6).

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Em outra modalidade, o reagente de transfecção é um reagente de transfecção baseado em lipídeo. Em outra forma de realização, o reagente de transfecção é um reagente de transfecção à base de proteínas. Em outra forma de realização, o reagente de transfecção é um reagente de transfecção polietilenoimina com base. Em outra modalidade, o reagente de transfecção é o fosfato de cálcio. Em outra modalidade, o reagente de transfecção é Lipofectin® ou Lipofectamina®. Em outra modalidade, o reagente de transfecção é qualquer outro reagente de transfecção conhecido na técnica.

Em outra modalidade, o reagente de transfecção forma um lipossoma. Lipossomas, em outra modalidade, aumentam a estabilidade intracelular, aumentam a eficiência de absorção e melhoram a atividade biológica. Em outra modalidade, os lipossomas são vesículas esféricas ocas compostas de lipídeos em arranjo similar àqueles lipídeos que formam a membrana celular. Eles possuem, em outra modalidade, um espaço interno aquoso para captura de compostos solúveis em água e variam em tamanho de 0,05 a vários mícrons de diâmetro. Em outra modalidade, os lipossomas podem entregar RNA às células em uma forma biologicamente ativa.

Cada tipo de reagente de transfecção representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade a célula-alvo dos métodos da presente invenção é um célula apresentadora de antígenos. Em outra modalidade, a célula é uma célula animal. Em outra modalidade, a célula é uma célula dendrítica (Exemplo 14). Em outra modalidade, a célula é uma célula neural. Em outra modalidade, a célula é uma célula do cérebro (Exemplo 16). Em outra modalidade, a célula é uma célula do baço. Em outra modalidade, a célula é uma célula linfoide. Em outra modalidade, a célula é uma célula de pulmão (Exemplo 16). Em outra modalidade, a célula é uma célula de pele. Em outra modalidade, a célula é um queratinócito. Em outra modalidade, a célula é uma célula endotelial. Em outra modalidade, a célula é um astrócito, uma célula microglial, ou um neurônio (Exemplo 16). Em outra modalidade, a célula é uma célula alveolar (Exemplo 16). Em outra modalidade, a célula é uma célula alveolar de superfície (Exemplo 16). Em outra modalidade, a célula é um macrófago alveolar. Em outra modalidade, a célula é um pneumócito alveolar. Em outra modalidade, a célula é uma célula endotelial vascular. Em outra modalidade, a célula é uma célula mesenquimal. Em outra modalidade, a célula é uma célula epitelial. Em outra modalidade, a célula é uma célula

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65/141 hematopoiética. Em outra modalidade, a célula é a célula do epitélio do cólon. Em outra modalidade, a célula é uma célula do epitélio do pulmão. Em outra modalidade, a célula é uma célula de medula óssea.

Em outras modalidades, a célula alvo é uma célula de Claudius, célula Hensen, célula de Merkel, célula Muller, célula Paneth, célula de Purkinje, células de Schwann, célula de Sertoli, célula acidófila, célula acinar, adipoblasto, adipócitos, célula alfa branca ou marrom, células amácrinas, célula beta, célula capsular, cementocito, célula principal, condroblasto, condrócitos, células cromafins, célula cromofóbica, corticotrófico, células delta, células de Langerhans, células dendríticas foliculares, células enterocromafínicas, ependimócitos, células epiteliais, células basais, células escamosas, célula endotelial, células de transição, eritroblastos, eritrócitos, fibroblastos, fibrocito, célula folicular, células germinativas, gametas, óvulo, espermatozóide, óvulo, ovócito primário, oócito secundário, espermátides, espermatócitos, espermatócito primário, espermatócito secundário, epitélio germinativo, células gigantes, células gliais, astroblasto, astrócitos, oligodendroblasto, oligodendrócitos, glioblasto, células caliciformes, gonadotróficos, células granulosas, hemocitoblastos, células ciliadas, hepatoblastos, hepatócitos, células, hialocito intersticial, célula justaglomerular, queratinócitos, ceratócitos, células lemmal, leucócitos, granulócitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, linfoblasto, B-linfoblasto, T-linfoblasto, linfócitos, B-linfócitos, de linfócitos T, induzida auxiliar de linfócitos T, células Th1 de linfócitos T, linfócitos T Th2, células natural killer, timócitos, macrófagos, célula Kupffer, macrófago alveolar, célula de espuma, histiócitos, célula lútea, células-tronco linfoides, células linfoides, células-tronco linfoide, células macrogliais, mamotroficos, mastócitos, meduloblastos, megacarioblastos, megacariócitos, melanoblasto, célula melanócito mesangial, célula mesotelial, metamielocito, monoblasto, monócitos, células de mucosa de pescoço, células musculares, células musculares cardíacas, células do músculo esquelético, células musculares lisas, mielócito, célula mielóide, células-tronco mielóides, mioblastos, células mioepiteliais, miofibroblasto, neuroblastos, células neuroepiteliais, neurônio, odontoblástica, osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, célula oxíntica, células parafoliculares, célula paraluteal, célula péptica, pericito, células mononucleares do sangue periférico, célula, ferocromocita falangeana, pinalocito, pituicito, célula de plasma, plaquetas, podócitos, preritroblasto, promonocitoe, promieloblasto, promielocito, pronormoblasto, reticulócitos, células epiteliais pigmentares da retina,

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66/141 retinoblasto, pequenas células, somatotrófico, células-tronco, células sustentaculares, célula teloglial, ou célula zimogênica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Uma variedade de distúrbios pode ser tratada através do emprego de métodos da presente invenção, incluindo, entre outros, desordens monogênicas, doenças infecciosas, doenças adquiridas, câncer, e semelhantes. Exemplos de distúrbios monogênicos incluem deficiência de ADA, fibrose cística, hipercolesterolemia familiar, hemofilia, a doença de granulomatose crônica, distrofia muscular de Duchenne, anemia de Fanconi, anemia falciforme, doença de Gaucher, síndrome de Hunter, SCID ligada ao X, e semelhantes. Em outra modalidade, o distúrbio tratado envolve uma das proteínas listadas abaixo. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a proteína recombinante codificada por um RNA, oligoribonucleotídeo, ou molécula poliribonucleotídeoa dos métodos e composições da presente invenção é ecto nuclesideo-trifosfato difosfohidrolase.

Em outra modalidade, a proteína recombinante é a eritropoietina (EPO). Em outras modalidades, a proteína codificada recombinante é ABCA4; ABCD3; ACADM; AGL; AGT; ALDH4AI; ALPL; AMPD1; APOA2; AVSD1; BRCD2; C1QA; C1QB; C1QG; C8A; C8B; CACNA1S; CCV; CD3Z; CDC2L1; CHML; CHS1; CIAS1; CLCNKB; CMD1A; CMH2; CMM; COL11A1; COL8A2; COL9A2; CPT2; CRB1; CSE; CSF3R; CTPA; CTSK; DBT; DIO1; DISC1; DPYD;EKV; ENO1; ENO1P; EPB41; EPHX1; F13B; F5; FCGR2A;

FCGR2B; FCGR3A; FCHL; FH; FMO3; FMO4; FUCA1; FY; GALE; GBA; GFND; GJA8; GJB3; GLC3B; HF1; HMGCL; HPC1; HRD; HRPT2; HSD3B2; HSPG2; KCNQ4; KCS; KIF1B; LAMB3; LAMC2; LGMD1B; LMNA; LOR; MCKD1; MCL1; MPZ; MTHFR; MTR; MUTYH; MYOC; NB; NCF2; NEM1; NPHS2; NPPA; NRAS; NTRK1; OPTA2; PBX1; PCHC; PGD; PHA2A; PHGDH; PKLR; PKP1; PLA2G2A; PLOD; PPOX; PPT1; PRCC; PRG4; PSEN2; PTOS1; REN; RFX5; RHD; RMD1; RPE65; SCCD; SERPINC1; SJS1; SLC19A2; SLC2A1; SPG23; SPTA1; TAL1; TNFSF6; TNNT2; TPM3; TSHB; UMPK; UOX; UROD; USH2A; VMGLOM; VWS; WS2B; ABCB11; ABCG5; ABCG8; ACADL; ACP1; AGXT; AHHR; ALMS1; ALPP; ALS2; APOB; BDE; BDMR; BJS; BMPR2; CHRNA1; CMCWTD; CNGA3; COL3A1; COL4A3; COL4A4; COL6A3; CPSI; CRYGA; CRYGEP1; CYP1B1; CYP27A1; DBI; DES; DYSF; EDAR; EFEMPI; EIF2AK3;

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ERCC3; FSHR; GINGF; GLC1B; GPD2; GYPC; HADHA; HADHB; HOXD13; HPE2; IGKC; IHH; IRSI; ITGA6; KHK; KYNU; LCT; LHCGR; LSFC; MSH2; MSH6; NEB; NMTC; NPHP1; PAFAH1P1; PAX3; PAX8; PMS1; PNKD; PPH1; PROC; REG1A; SAG; SFTPB; SLC11A1; SLC3A1; SOS1; SPG4; SRD5A2; TCL4; TGFA; TMD; TPO; UGT1A@; UV24; WSS; XDH; ZAP70; ZFHX1B; ACAA1; AGS1; AGTR1; AHSG; AMT; ARMET; BBS3; BCHE; BCPM; BTD; CASR; CCR2; CCR5; CDL1; CMT2B; COL7A1; CP; CPO; CRV; CTNNB1; DEM; ETM1; FANCD2; FIH; FOXL2; GBE1; GLB1; GLC1C; GNAI2; GNATI; GP9; GPX1; HGD; HRG; ITIH1; KNG; LPP; LRS1; MCCCI; MDS1; MHS4; MITF; MLH1; MYL3; MYMY; OPA1; P2RY12; PBXP1; PCCB; POU1F1; PPARG; PROS1; PTHR1; RCA1; RHO; SCA7; SCLC1; SCN5A; SI; SLC25A20; SLC2A2; TF; TGFBR2; THPO; THRB; TKT; TM4SF1; TRH; UMPS; UQCRC1; USH3A; VHL; WS2A; XPC; ZNF35; ADH1B; ADH1C; AFP; AGA; AIH2; ALB; ASMD; BFHD; CNGA1; CRBM; DCK; DSPP; DTDP2; ELONG; ENAM; ETFDH; EVC; F11; FABP2; FGA; FGB; FGFR3; FGG; FSHMD1A; GC; GNPTA; GNRHR; GYPA; HCA; HCL2; HD; HTN3; HVBS6; IDUA; IF; JPD; KIT; KLKB1; LQT4; MANBA; MLLT2; MSX1; MTP; NR3C2; PBT; PDE6B; PEE1; PITX2; PKD2; QDPR; SGCB; SLC25A4; SNCA; SOD3; STATH; TAPVR1; TYS; WBS2; WFS1; WHCR; ADAMTS2; ADRB2; AMCN; AP3BI; APC; ARSB; B4GALT7; BHR1; C6; C7; CCAL2; CKN1; CMDJ; CRHBP; CSF1R; DHFR; DIAPH1; DTR; EOS; EPD; ERVR; F12; FBN2; GDNF; GHR; GLRA1; GM2A; HEXB; HSD17B4; ITGA2; KFS; LGMD1A; LOX; LTC4S; MAN2A1; MCC; MCCC2; MSH3; MSX2; NR3C1; PCSK1; PDE6A; PFBI; RASAI; SCZDI; SDHA; SGCD; SLC22A5; SLC26A2; SLC6A3; SM1; SMA@; SMN1; SMN2; SPINK5; TCOF1; TELAB1; TGFBI; ALDH5A1; ARG1; AS; ASSP2; BCKDHB; BF; C2; C4A; CDKN1A; COL10A1; COL11A2; CYP21A2; DYX2; EJM1; ELOVL4; EPM2A; ESR1; EYA4; F13A1; FANCE; GCLC; GJA1; GLYS1; GMPR; GSE; HCR; HFE; HLA-A; HLA-DPBI; HLA-DRA; HPFH; ICS1; IDDM1; IFNGR1; IGAD1; IGF2R; ISCW; LAMA2; LAP; LCA5; LPA; MCDR1; MOCS1; MUT; MYB; NEU1; NKS1; NYS2; OA3; ODDD; OFC1; PARK2; PBCA; PBCRA1; PDB1; PEX3; PEX6; PEX7; PKHD1; PLA2G7; PLG; POLH; PPAC; PSORS1; PUJO; RCD1; RDS; RHAG; RP14; RUNX2; RWS; SCA1; SCZD3; SIASD; SOD2; ST8; TAPl; TAP2; TFAP2B; TNDM; TNF; TPBG; TPMT; TULP1; WISP3; AASS; ABCB1; ABCB4; ACHE; AQP1; ASL; ASNS; AUTS1; BPGM; BRAF; C7orf2; CACNA2D1; CCM1; CD36; CFTR; CHORDOMA; CLCN1; CMH6; CMT2D; COL1A2;

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CRS; CYMD; DFNA5; DLD; DYT11; EEC1; ELN; ETV1; FKBP6; GCK; GHRHR; GHS; GLI3; GPDS1; GUSB; HLXB9; HOXA13; HPFH2; HRX; IAB; IMMP2L; KCNH2; LAMB1; LEP; MET; NCF1; NM; OGDH; OPN1SW; PEX1; PGAM2; PMS2; PON1; PPP1R3A; PRSS1; PTC; PTPN12; RP10; RP9; SERPINE1; SGCE; SHFM1; SHH; SLC26A3; SLC26A4; SLOS; SMAD1; TBXAS1; TWIST; ZWS1; ACHM3; ADRB3; ANK1; CA1; CA2; CCAL1; CLN8; CMT4A; CNGB3; COH1; CPP; CRH; CYP11B1; CYP11B2; DECR1; DPYS; DURS1; EBS1; ECA1; EGI; EXT1; EYA1; FGFR1; GNRH1; GSR; GULOP; HR; KCNQ3; KFM; KWE; LGCR; LPL; MCPH1; MOS; MYC; NAT1; NAT2; NBS1; PLAT; PLEC1; PRKDC; PXMP3; RP1; SCZD6; SFIPC; SGM1; SPG5A; STAR; TG; TRPS1; TTPA; VMD1; WRN; ABCA1; ABL1; ABO; ADAMTS13; AK1; ALAD; ALDH1A1; ALDOB; AMBP; AMCD1; ASS; BDMF; BSCL; C5; CDKN2A; CHAC; CLA1; CMD1B; COL5A1; CRAT; DBH; DNAI1; DYS; DYT1; ENG; FANCC; FBP1; FCMD; FRDA; GALT; GLDC; GNE; GSM1; GSN; HSD17B3; HSN1; IBM2; INVS; JBTS1; LALL; LCCS1; LCCS; LGMD2H; LMX1B; MLLT3; MROS; MSSE; NOTCH1; ORM1; PAPPA; PIP5K1B; PTCH; PTGS1; RLN1; RLN2; RMRP; ROR2; RPD1; SARDH; SPTLC1; STOM; TDFA; TEK; TMC1; TRIM32; TSC1; TYRP1; XPA; CACNB2; COL17Al; CUBN; CXCL12; CYP17; CYP2C19; CYP2C9; EGR2; EMX2; ERCC6; FGFR2; HK1; HPS1; IL2RA; LGI1; LIPA; MAT1A; MBL2; MKI67; MXI1; NODAL; OAT; OATL3; PAX2; PCBD; PEO1; PHYH; PNLIP; PSAP; PTEN; RBP4; RDPA; RET; SFTPA1; SFTPD; SHFM3; SIAL; THC2; TLX1; TNFRSF6; UFS; UROS; AA; ABCC8; ACAT1; ALX4; AMPD3; ANC; APOA1; APOA4; APOC3; ATM; BSCL2; BWS; CALCA; CAT; CCND1; CD3E; CD3G; CD59; CDKN1C; CLN2; CNTF; CPT1A; CTSC; DDB1; DDB2; DHCR7; DLAT; DRD4; ECB2; ED4; EVR1; EXT2; F2; FSHB; FTH1; G6PT1; G6PT2; GIF; HBB; HBBP1; HBD; HBE1; HBG1; HBG2; HMBS; HND; HOMG2; HRAS; HVBS1; IDDM2; IGER; INS; JBS; KCNJ11; KCNJ1; KCNQ1; LDHA; LRP5; MEN1; MLL; MYBPC3; MYO7A; NNO1; OPPG; OPTB1; PAX6; PC; PDX1; PGL2; PGR; PORC; PTH; PTS; PVRL1; PYGM; RAG1; RAG2; ROM1; RRAS2; SAA1; SCA5; SCZD2; SDHD; SERPING1; SMPD1; TCIRG1; TCL2; TECTA; TH; TREH; TSG101; TYR; USH1C; VMD2; VRNI; WT1; WT2; ZNFl45; A2M; AAAS; ACADS; ACLS; ACVRL1; ALDH2; AMHR2; AOM; AQP2; ATD; ATP2A2; BDC; C1R; CD4; CDK4; CNA1; COL2A1; CYP27B1; DRPLA; ENUR2; FEOM1; FGF23; FPF; GNB3; GNS; HAL; HBP1; HMGA2; HMN2; HPD; IGF1; KCNA1; KERA; KRAS2; KRT1; KRT2A; KRT3;

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KRT4; KRT5; KRT6A; KRT6B; KRTHB6; LDHB; LYZ; MGCT; MPE; MVK; MYL2; OAP; PAH; PPKB; PRB3; PTPN11; PXR1; RLS; RSN; SAS; SAX1; SCA2; SCNN1A; SMAL; SPPM; SPSMA; TBX3; TBX5; TCF1; TPI1; TSC3; ULR; VDR; VWF; ATP7B; BRCA2; BRCD1; CLN5; CPB2; ED2; EDNRB; ENUR1; ERCC5; F10; F7; GJB2; GJB6; IPF1; MBS1; MCOR; NYS4; PCCA; RB1; RHOK; SCZD7; SGCG; SLC10A2; SLC25A15; STARP1; ZNF198; ACHM1; ARVD1; BCH; CTAA1; DAD1; DFNB5; EML1; GALC; GCH1; IBGC1; IGH@; grupo IGHC; IGHG1; IGHM; IGHR; IV; LTBP2; MCOP; MJD; MNG1; MPD1; MPS3C; MYH6; MYH7; NP; NPC2; PABPN1; PSEN1; PYGL; RPGRIP1; SERPINA1; SERPINA3; SERPINA6; SLC7A7; SPG3A; SPTB; TCL1A; TGMI; TITF1; TMIP; TRA@; TSHR; USH1A; VP; ACCPN; AHO2; ANCR; B2M; BBS4; BLM; CAPN3; CDAN1; CDAN3; CLN6; CMH3; CYP19; CYP1A1; CYP1A2; DYX1; EPB42; ETFA; EYCL3; FAH; FBN1; FES; HCVS; HEXA; IVD; LCS1; LIPC; MY05A; OCA2; OTSC1; PWCR; RLBP1; SLC12A1; SPG6; TPM1; UBE3A; WMS; ABCC6; ALDOA; APRT; ATP2A1; BBS2; CARD15; CATM; CDH1; CETP; CHST6; CLN3; CREBBP; CTH; CTM; CYBA; CYLD; DHS; DNASE1; DPEP1; ERCC4; FANCA; GALNS; GAN; HAGH; HBA1; HBA2; HBHR; HBQ1; HBZ; HBZP; HP; HSD11B2; IL4R; LIPB; MC1R; MEFV; MHC2TA; MLYCD; MMVP1; PHKB; PHKG2; PKD1; PKDTS; PMM2; PXE; SALL1; SCA4; SCNN1B; SCNN1G; SLC12A3; TAT; TSC2; VDI; WT3; ABR; ACACA; ACADVL; ACE; ALDH3A2; APOH; ASPA; AXIN2; BCL5; BHD; BLMH; BRCA1; CACD; CCA1; CCZS; CHRNB1; CHRNE; CMT1A; COL1A1; CORD5; CTNS; EPX; ERBB2; G6PC; GAA; GALK1; GCGR; GFAP; GH1; GH2; GP1BA; GPSC; GUCY2D; ITGA2B; ITGB3; ITGB4; KRT10; KRT12; KRT13; KRT14; KRT14L1; KRT14L2; KRT14L3; KRT16; KRT16L1; KRT16L2; KRT17; KRT9; MAPT; MDB; MDCR; MGI; MHS2; MKS1; MPO; MYO15A; NAGLU; NAPB; NF1; NME1; P4HB; PAFAH1B1; PECAM1; PEX12; PHB; PMP22; PRKAR1A; PRKCA; PRKWNK4; PRP8; PRPF8; PTLAH; RARA; RCV1; RMSA1; RP17; RSS; SCN4A; SERPINF2; SGCA; SGSH; SHBG; SLC2A4; SLC4A1; SLC6A4; SMCR; SOST; SOX9; SSTR2; SYM1; SYNSI; TCF2; THRA; TIMP2; TOC; TOP2A; TP53; TRIM37; VBCH; ATP8B1; BCL2; CNSN; CORD1I; CYB5; DCC; F5F8D; FECH; FEO; LAMA3; LCFS2; MADH4; MAFD1; MC2R; MCL; MYP2; NPC1; SPPK; TGFBRE; TGIF; TTR; AD2; AMH; APOC2; APOE; ATHS; BAX; BCKDHA; BCL3; BFIC; C3; CACNA1A; CCO; CEACAM5; COMP; CRX; DBA; DDU; DFNA4; DLL3; DM1; DMWD; E11S; ELA2;

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EPOR; ERCC2; ETFB; EXT3; EYCLI; FTL; FUT1; FUT2; FUT6; GAMT; GCDH; GPI; GUSM; HB1; HCL1; HHC2; HHC3; ICAM3; INSR; JAK3; KLK3; LDLR; LHB; LIG1; LOH19CR1; LYL1; MAN2B1; MCOLN1; MDRV; MLLT1; NOTCH3; NPHS1; OFC3; OPA3; PEPD; PRPF31; PRTN3; PRX; PSG1; PVR; RYR1; SLC5A5; SLC7A9; STK11; TBXA2R; TGFB1; TNNI3; TYROBP; ADA; AHCY; AVP; CDAN2; CDPD1; CHED1; CHED2; CHRNA4; CST3; EDN3; EEGV1; FTLL1; GDF5; GNAS; GSS; HNF4A; JAG1; KCNQ2; MKKS; NBIA1; PCK1; PI3; PPCD; PPGB; PRNP; THBD; TOP1; AIRE; APP; CBS; COL6Al; COL6A2; CSTB; DCR; DSCR1; FPDMM; HLCS; HPE1; ITGB2; KCNE1; KNO; PRSS7; RUNX1; SOD1; TAM; ADSL; ARSA; BCR; CECR; CHEK2; COMT; CRYBB2; CSF2RB; CTHM; CYP2D6;CYP2D7P1; DGCR; DIA1; EWSR1; GGT1; MGCR; MN1; NAGA; NE2; OGS2; PDGFB; PPARA; PRODH; SCO2; SCZD4; SERPIND1; SLC5AI; SOXI0; TCN2; TIMP3; TST; VCF; ABCD1; ACTL1; ADFN; AGMX2; AHDS; AIC; AIED; AIH3; ALAS2; AMCD; AMELX; ANOP1; AR; ARAF1; ARSC2; ARSE; ARTS; ARX; ASAT; ASSP5; ATP7A; ATRX; AVPR2; BFLS; BGN; BTK; BZX; C1HR; CACNA1F; CALB3; CBBM; CCT; CDR1; CFNS; CGF1; CHM; CHR39C; CIDX; CLA2; CLCN5; CLS; CMTX2; CMTX3; CND; COD1; COD2; COL4A5; COL4A6; CPX; CVD1; CYBB; DCX; DFN2; DFN4; DFN6; DHOF; DIAPH2; DKC1; DMD; DSS; DYT3; EBM; EBP; ED1; ELK1; EMD; EVR2; F8; F9; FCP1; FDPSL5; FGD1; FGS1; FMR1; FMR2; G6PD; GABRA3; GATA1; GDI1; GDXY; GJB1; GK; GLA; GPC3; GRPR; GTD; GUST; HMS1; HPRT1; HPT; HTC2; HTR2C; HYR; IDS; IHG1; IL2RG; INDX; IP1; IP2; JMS; KAL1; KFSD; LICAM; LAMP2; MAA; MAFD2; MAOA; MAOB; MCF2; MCS; MEAX; MECP2; MF4; MGCI; MIC5; MID1; MLLT7; MLS; MRSD; MRX14; MRX1; MRX20; MRX2; MRX3; MRX40; MRXA; MSD; MTMI; MYCL2; MYPI; NDP; NHS; NPHLI; NROBI; NSX; NYSI; NYX; OAI; OASD; OCRL; ODTI; OFD1; OPA2; OPD1; OPEM; OPN1LW; OPN1MW; OTC; P3; PDHA1; PDR; PFC; PFKFB1; PGK1; PGK1P1; PGS; PHEX; PHKA1; PHKA2; PHP; PIGA; PLP1; POF1; POLA; POU3F4; PPMX; PRD; PRPSI; PRPS2; PRS; RCCP2; RENBP; RENS1; RP2; RP6; RPGR; RPS4X; RPS6KA3; RS1; S11; SDYS; SEDL; SERPINA7; SH2D1A; SHFM2; SLC25A5; SMAX2; SRPX; SRS; STS; SYN1; SYP; TAF1; TAZ; TBX22; TDD; TFE3; THAS; THC; TIMM8A; TIMP1; TKCR; TNFSF5; UBE1; UBE2A; WAS; WSN; WTS; WWS; XIC; XIST; XK; XM; XS; ZFX; ZIC3; ZNF261 ; ZNF41; ZNF6; AMELY; ASSP6; AZFI; AZF2; DAZ; GCY; RPS4Y; SMCY;

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SRY; ZFY; ABAT; AEZ; AFA; AFD1; ASAH1; ASD1; ASMT; CCAT; CECR9; CEPA; CLA3; CLN4; CSF2RA; CTSI; DF; DIH1; DWS; DYT2; DYT4; EBR3; ECT; EEF1A1L14; EYCL2; FANCB; GCSH; GCSL; GIP; GTS; HHG; HMI; HOAC; HOKPP2; HRPT1; HSD3B3; HTC1; HV1S; ICHQ; ICR1; ICR5; IL3RA; KAL2; KMS; KRT18; KSS; LCAT; LHON; LIMM; MANBB; MCPH2; MEB; MELAS; MIC2; MPFD; MS; MSS; MTATP6; MTCOI; MTCO3; MTCYB; MTND1; MTND2; MTND4; MTND5; MTND6; MTRNR1; MTRNR2; MTTE; MTTG; MTTI; MTTK; MTTL1; MTTL2; MTTN; MTTP; MTTS1; NAMSD; OCD1; OPD2; PCK2; PCLD; PCOS1; PFKM; PKD3; PRCA1; PRO1; PROP1; RBS; RFXAP; RP; SHOX; SLC25A6; SPG5B; STO; SUOX; THM; ou TTD. Cada proteína recombinante representa uma modalidade separada desta presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para o tratamento de anemia em um sujeito, compreendendo o contato de uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando para eritropoietina, tratando assim a anemia em um sujeito. Em outra modalidade, a molécula de RNA sintetizada in vitro compreende ainda uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em outra modalidade, a célula é uma célula de tecido subcutâneo. Em outra modalidade, a célula é uma célula de pulmão. Em outra modalidade, a célula é um fibroblasto. Em outra modalidade, a célula é um linfócito. Em outra modalidade, a célula é uma célula de músculo liso. Em outra modalidade, a célula é qualquer outro tipo de célula conhecido na técnica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um vasoespasmo em um sujeito, compreendendo o contato de uma célula do sujeito com molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando para óxido nítrico-sintase induzivel (iNOS), assim tratando um vasoespasmo em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para melhorar a taxa de sobrevivência de uma célula em um sujeito, compreendendo o contato da célula com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando uma proteína de choque térmico, melhorando assim uma taxa de sobrevivência de uma célula em um sujeito.

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Em outra modalidade, a célula, cuja taxa de sobrevivência é melhorada é uma célula isquêmica. Em outra modalidade a célula não é isquêmica Em outra modalidade, a célula foi exposta a um ambiente isquêmico. Em outra modalidade, a célula foi exposta a um stress ambiental. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para diminuir a incidência de restenose de um vaso sanguíneo seguindo um procedimento que aumenta o vaso sanguíneo, compreendendo o contato de uma célula do vaso sanguíneo com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando para uma molécula de proteína de choque térmico, diminuindo assim uma incidência de uma restenose em um sujeito.

Em outra modalidade, o procedimento é uma angioplastia. Em outra modalidade, o procedimento é qualquer outro procedimento conhecido na técnica que aumenta o vaso sanguíneo. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o crescimento de cabelo a partir de um folículo piloso é um couro cabeludo de um sujeito, compreendendo o contato de uma célula do couro cabeludo com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, uma molécula de RNA sintetizada in vitro codificando uma proteína telomerase ou um imunossupressor, aumentando assim o crescimento de cabelo a partir de um folículo piloso.

Em outra modalidade a proteína imunossupressora é o hormônio estimulante de melanócito alfa (α -MSH). Em outra modalidade a proteína imunossupressora está transformando o fator de crescimento β-1 (TGF-β 1). Em outra modalidade, a proteína imunossupressora é fator de crescimento insulina-símile (IGF- I). Em outra modalidade, a proteína imunossupressora é qualquer outra proteína imunossupressora conhecida na técnica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade a presente invenção fornece um método para induzir a expressão de uma enzima com atividade antioxidante em uma célula, compreendendo o contato da célula com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando a enzima, desse modo induzindo a expressão de uma enzima com atividade antioxidante em uma célula.

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Em uma modalidade, a enzima é catalase. Em outra modalidade, a enzima é a glutationa peroxidase. Em outra modalidade, a enzima é fosfolipídeo hidroperóxido glutationa peroxidase. Em outra modalidade, a enzima é a superóxido dismutase-1. Em outra modalidade, a enzima é superóxido dismutase-2. Em outra modalidade, a enzima é qualquer outra enzima com atividade antioxidante que é conhecida na técnica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para o tratamento da fibrose cística num sujeito, compreendendo o contato de uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando a enzima, codificando o regulador da condutância transmembrana em fibrose cística (CFTR), assim, tratando fibrose cística em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para o tratamento de uma agamaglobulinemia ligada ao X em um sujeito, compreendendo o contato de uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando a tirosina quinase de Bruton, assim, tratando uma agamaglobulinemia ligada ao X.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para o tratamento de uma Imunodeficiência Combinada Grave por deficiência de adenosina desaminase (ADA SCID) em um sujeito, compreendendo o contato de uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando a adenosina desaminase (ADA) assim, tratando uma Imunodeficiência Combinada Grave por deficiência de adenosina desaminase (ADA SCID).

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para reduzir a capacidade de resposta imunológica da pele e melhorar a patologia da pele, compreendendo o contato de uma célula do sujeito com uma molécula de RNA sintetizada in vitro, a molécula de RNA sintetizada in vitro codificando o um ecto-nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase', reduzindo assim a capacidade de resposta imune da pele e melhorar a patologia da pele.

Em outra modalidade, uma molécula de RNA ou molécula ribonucleotídicq da presente invenção é encapsulada em nanopartículas. Métodos para empacotar as nanopartículas são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em Bose S, et al Bose S, et al (Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Vírus Type 3 Infection of Human Lung Epithelial Cells.

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J. Virol. 78:8146. 2004); Dong Y et al. Poli(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials 26:6068. 2005); Lobenberg R. et al (Improved body distribution of 14C-labelled AZT bound to nanoparticles in rats determined by radioluminography. J Drug Target 5:171. 1998);); Sakuma SR et al (Mucoadhesion of polistyrene nanoparticles having surface hydrophilic polimeric chains in the gastrointestinal tract. Int J Pharm 177:161. 1999); Virovic L et al. Novel delivery methods for treatment of viral hepatitis: an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005); e Zimmermann E et al., Electrolyte-and pH-stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle (SLN) dispersions in artificial gastrointestinal media. Eur J Pharm Biopharm 52:203.2001). Cada método representa uma modalidade separada da presente invenção.

Várias modalidades de gamas de dosagem dos compostos da presente invenção podem ser usadas nos métodos da presente invenção. Em uma modalidade, a dosagem está na gama de 1-10 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 2-10 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 3-10 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 5-10 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 2-20 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 3-20 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 5-20 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 10-20 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 3-40 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 5-40 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 10-40 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 20-40 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 5-50 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 10-50 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 20-50 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 1-100 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 2-100 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 3-100 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é 5-100 pg/dia. Em outra modalidade, a dose é 10-100 pg/dia. Em outra modalidade, a dose é 20-100 pg/dia. Em outra modalidade, a dose é 40-100 pg/dia. Em outra modalidade a dosagem é de 60-100 pg/dia.

Em outra modalidade, a dosagem é de 0,1 ug/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 0,2 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 0,3 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 0,5 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 1 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 2 mg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 3 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 5 pg/dia. Em outra modalidade a dosagem é de 10 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 15 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 20

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75/141 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 30 pg/ dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 40 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 60 pg/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 80 ug/dia. Em outra modalidade, a dosagem é de 100 pg/dia.

Em outra modalidade, a dosagem é de 10 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 20 pg /dose.Em outra modalidade, a dosagem é de/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 30 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 40 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 60 pg/dose. Em outra modalidade a dosagem é de 80 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 100 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 150 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 200 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 300 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 400 pg/dose Em outra modalidade, a dosagem é de 600 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 800 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 1000 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 1,5 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 2 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 3 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 5 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 10 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 15 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 20 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 30 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 50 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 80 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 100 mg/dose.

Em outra modalidade, a dosagem é de 10-20 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 20-30 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 20-40 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 30 - 60 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 40-80 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 50-100 pg/dose. Em outradmodalidade, a dosagem é 50-150 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 100-200 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 200-300 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 300-400 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 400-600 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 500-800 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 800-1000 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 1000-1500 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 1500-2000 pg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 2-3 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 2-5 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 2-10 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 2-20 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 2-30 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 2-50 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 2-80

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76/141 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 2-100 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 3-10 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 3-20 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 3-30 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 3-50 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 3-80 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 3-100 mg/dose. Numa outra concretização, a dosagem é de 5 -10 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 5-20 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 5-30 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 5-50 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 5-80 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 5-100 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 1020 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 10-30 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é 10-50 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 10-80 mg/dose. Em outra modalidade, a dosagem é de 10-100 mg/dose.

Em outra modalidade, a dosagem é uma dose diária. Em outra modalidade, a dosagem é uma dose semanal. Em outra modalidade, a dosagem é uma dose mensal. Em outra modalidade, a dosagem é uma dose anual. Em outra modalidade, a dose é uma de uma série de um número definido de doses. Em outra modalidade, a dose é de uma dose única. Como descrito abaixo, em outra modalidade, uma vantagem do RNA, oligoribonucleotídeo, ou moléculas poliribonucleotidicas da presente invenção é a sua maior potência, permitindo o uso de doses menores.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma proteína recombinante, compreendendo o contato de um aparato de tradução in vitro com um oligoribonucleotídeo sintetizado in vitro, o oligoribonucleotídeo sintetizado in vitro compreendendo um pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, produzindo assim uma proteína recombinante.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma proteína recombinante, compreendendo o contato de um aparato de tradução in vitro com uma molécula de RNA transcrita in vitro da presente invenção, a molécula de RNA transcrita in vitro compreendendo um pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, produzindo assim uma proteína recombinante.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um aparato de transcrição in vitro, compreendendo: um nucleotídeo não modificado, um nucleotídeo contendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, e uma polimerase. Em outra modalidade, a

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77/141 presente invenção fornece um kit de transcrição in vitro, compreendendo: um nucleotídeo não modificado, um nucleotídeo contendo uma pseudouridina ou um nucleosídeo modificado, e uma polimerase. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, o aparelho de tradução in vitro compreende um lisado de reticulócitos. Em outra modalidade, o lisado de reticulócitos é um lisado de reticulócitos de coelho.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de redução de imunogenicidade de uma molécula de oligoribonucleotídeo ou molécula de RNA, o método compreendendo o passo de substituição de um nucleotídeo da molécula oligorubonucleotídeo ou molécula de RNA com um nucleotídeo modificado que contém um nucleosídeo modificado ou uma pseudouridina, reduzindo assim a imunogenicidade de uma molécula de oligoribonucleotídeo ou molécula de RNA.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de redução de uma imunogenicidade de um vetor de terapia gênica que compreende uma molécula de poliribonucleotídeo ou molécula de RNA, o método compreendendo o passo de substituição de um nucleotídeo da molécula polirubonucleotídeo ou molécula de RNA com um nucleotídeo modificado que contém um nucleosídeo modificado ou uma pseudouridina, reduzindo assim uma imunogenicidade de um vetor de terapia gênica.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de aumentar a tradução in vitro a partir de uma molécula de oligoribonucleotídeo ou molécula de RNA, o método compreendendo o passo de substituição de um nucleotídeo da molécula oligoribonucleotídeo ou molécula de RNA com um nucleotídeo modificado que contém um nucleósido modificado ou um pseudouridina, reforçando assim a tradução in vitro a partir de uma molécula de oligoribonucleotídeo ou molécula de RNA.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de aumentar a tradução in vivo a partir de um vetor de terapia gênica que compreende uma molécula de poliribonucleotídeo ou molécula de RNA, o método compreendendo o passo de substituição de um nucleotídeo da molécula polirubonucleotídeo ou molécula de RNA com um nucleotídeo modificado que contém um nucleosídeo modificado ou uma pseudouridina, aumentando assim a tradução in vivo a partir de um vetor de terapia gênica.

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Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de aumentar a eficiência da entrega de uma proteína recombinante por um vetor de terapia gênica compreendendo uma molécula de poliribonucleotídeo ou molécula de RNA, o método compreendendo o passo de substituição de um nucleotídeo da molécula polirubonucleotídeo ou molécula de RNA com um nucleotídeo modificado que contém um nucleosídeo modificado ou uma pseudouridina, aumentando assim a eficiência da entrega de uma proteína recombinante por um vetor de terapia gênica.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de aumentar a estabilidade in vivo do vetor de terapia gênica que compreende uma molécula de poliribonucleotídeo ou molécula de RNA, o método compreendendo o passo de substituição de um nucleotídeo da molécula polirubonucleotídeo ou molécula de RNA com um nucleotídeo modificado que contém um nucleosídeo modificado ou uma pseudouridina, aumentando assim a estabilidade in vivo do vetor de terapia gênica.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de sintetizar uma molécula de RNA transcrita in vitro compreendendo um nucleosídeo pseudouridina, compreendendo o contato de uma polimerase isolada com uma mistura de nucleotídeos não modificados e o nucleotídeos modificado (Exemplos 5 e 10).

Em outra modalidade, os métodos de transcrição in vitro da presente invenção utilizam um extrato de uma célula animal. Em outra modalidade o extrato é de reticulócitos ou de uma célula com eficiência semelhante de transcrição in vitro. Em outra modalidade, o extrato é a partir de qualquer outro tipo de célula conhecida na técnica. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Quaisquer das moléculas de RNA ou moléculas oligorribonucleotídeo s da presente invenção podem ser utilizadas, em outra modalidade, em qualquer um dos métodos da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de aumentar uma resposta imune a um antígeno, compreendendo a administração do antígeno, em combinação com (mt) RNA mitocondrial (Exemplos 4 e 8).

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a capacidade de uma molécula de RNA de estimular uma célula dendrítica (DC), compreendendo a

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79/141 modificação de um nucleosídeo da molécula de RNA por um método da presente invenção (por exemplo, ver EXEMPLOS).

Em outra modalidade, a DC é uma célula DC1. Em outra modalidade, a DC é uma célula DC2. Em outra modalidade, o DC é um subtipo de uma célula DC1 ou DC2. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a capacidade de uma molécula de RNA para estimular a sinalização por TLR3, compreendendo a modificação de um nucleosídeo da molécula de RNA por um método da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a capacidade de uma molécula de RNA para estimular a sinalização por TLR7, compreendendo a modificação de um nucleosídeo da molécula de RNA por um método da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a capacidade de uma molécula de RNA para estimular a sinalização por TLR8, compreendendo a modificação de um nucleosídeo da molécula de RNA por um método da presente invenção. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, todas as ligações internucleosídicas ou internucleotídicas no RNA, oligoribonucleotídeo, ou molécula polirubonucleotídeo são fosfodiéster. Em outra modalidade, as ligações inter-nucleotídicas são predominantemente fosfodiéster. Em outra modalidade, a maioria das ligações internucleotídicas são fosforotioato. Em outra modalidade, a maioria das ligações inter-nucleotídicas são fosfodiéster. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a percentagem das ligações inter-nucleotídeos no RNA, oligoribonucleotídeo, ou molécula polirubonucleotídeo que são fosfodiéster é superior a 50%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 10%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 15%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 20%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 25%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 30%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 35%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 40%. Em outra modalidade a percentagem é superior a 45%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 55%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 60%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 65%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 70%. Em outra modalidade, a percentagem é above75%. Em outra

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80/141 modalidade, a percentagem é superior a 80%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 85%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 90%. Em outra modalidade, a percentagem é superior a 95%.

Em outra modalidade, um método da presente invenção compreende o aumento do número, percentagem, ou da frequência de nucleosídeos modificados na molécula de RNA para diminuir a imunogenicidade ou aumentar a eficiência da tradução. Como aqui fornecido (por exemplo, ver EXEMPLOS), o número de resíduos modificados em um RNA, oligoribonucleotídeo, ou molécula polirubonucleotídeo determina, em uma outra modalidade, a magnitude dos efeitos observados na presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a introdução de uma proteína recombinante em uma célula de um sujeito, compreendendo o contato do sujeito com uma molécula de RNA transcrita in vitro que codifica a proteína recombinante, a molécula de RNA transcrita in vitro que compreende ainda uma pseudouridina ou outro nucleosídeo modificado, introduzindo assim uma proteína recombinante em uma célula de um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para diminuir a produção de TNF-α em resposta a um vetor de terapia gênica em um sujeito, compreendendo o passo de engenharia do vector para incluir uma pseudouridina ou uma base nucleosídica modificada, diminuindo assim a produção de TNF-α em resposta a um vetor de terapia gênica em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para diminuir a produção de IL-12 em resposta a um vetor de terapia gênica em um sujeito, compreendendo o passo de engenharia do vetor para incluir uma pseudouridina ou uma base nucleosídica modificada, diminuindo assim a produção de IL-12 em resposta a um vetor de terapia gênica em um sujeito.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de redução de uma imunogenicidade de um vetor de terapia gênica, compreendendo a introdução de um nucleosídeo modificado em referido vetor de terapia gênica, reduzindo assim uma imunogenicidade de um vetor de terapia gênica

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Conforme fornecido neste documento, os resultados da presente invenção mostram que o DC primário tem uma entidade adicional sinalizadora de RNA que reconhece RNA m5C e m6A modificados e cuja sinalização é inibida pela modificação de resíduos de U.

Em outra modalidade, uma vantagem de moléculas de RNA, oligoribonucleotídeo, e poliribonucleotídeo da presente invenção é que o RNA não se incorpora ao genoma (em oposição a vetores baseados em DNA). Em outra modalidade, uma vantagem é que a tradução de RNA, e, portanto, o aparecimento do produto codificado, é instantâneo. Em outra modalidade, uma vantagem é que a quantidade de proteína gerada a partir do mRNA pode ser regulada através da apresentação de mais ou menos RNA. Em outra modalidade, uma vantagem é que a entrega repetida de pseudouridina purificada ou outras moléculas de RNA modificados, oligoribnucleotídeos, poliribonucleotídeos não induz uma resposta imune, enquanto que a entrega repetida de RNA não modificado poderia induzir vias de sinalização entre os sensores de RNA.

Em outra modalidade, uma vantagem é a falta de imunogenicidade, permitindo a entrega repetida sem a geração de citocinas inflamatórias. Em outra modalidade, a estabilidade do RNA é aumentada por circularização, diminuindo a degradação por exonucleases.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de um sujeito com uma doença que compreende uma resposta imune contra uma própria molécula auto-RNA, compreendendo a administração ao sujeito de um antagonista de uma molécula de TLR-3, assim tratando o sujeito com uma doença que compreende uma resposta imune contra uma molécula de auto-RNA.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de um sujeito com uma doença que compreende uma resposta imune contra uma molécula de autoRNA, compreendendo a administração ao sujeito de um antagonista de uma molécula TLR- 7, assim tratando o sujeito com uma doença que compreende uma resposta imunitária contra uma molécula de auto-RNA.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de um sujeito com uma doença que compreende uma resposta imune contra uma molécula de autoRNA, compreendendo a administração ao sujeito de um antagonista de uma molécula TLR-8, assim tratando o sujeito com uma doença que compreende uma resposta imuneitária contra uma molécula de auto-RNA.

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Em outra modalidade, a doença que compreende uma resposta imune contra uma molécula de auto-RNA é uma doença autoimune. Em outra modalidade, a doença é lúpus eritematoso sistêmico (LES). Em outra modalidade, a doença é outra doença conhecida na técnica que compreende uma resposta imune contra uma molécula de auto-RNA. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um kit compreendendo um reagente utilizado na realização de um método da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um kit compreendendo uma composição, ferramenta ou instrumento da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um kit para medir ou estudar sinalização por um receptor de TLR-3, TLR-7 e TLR-8, como exemplificado no Exemplo 7.

Em outra modalidade, um protocolo de tratamento da presente invenção é terapêutico. Em outra modalidade, o protocolo é profilático. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Em uma modalidade, a frase contatar uma célula ou contatar uma população refere-se a um método de exposição, o que pode ser direto ou indireto. Em um método tal contato compreende injeção direta da célula através de quaisquer meios bem conhecidos na técnica, como microinjeção. Em outra modalidade, a alimentação da célula é indireta, como através de disposição de um meio de cultura que envolve a célula, ou a administração a um sujeito, ou através de qualquer via conhecida na técnica. Numa outra modalidade, o termo contatando significa que a molécula da presente invenção é introduzida em um sujeito em tratamento, e a molécula entra em contato com a célula in vivo. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

Métodos para a quantificação da frequência de reticulócitos e para medir a atividade biológica da EPO são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em Ramos, AS et al (Biological evaluation of recombinant human erythropoietin in pharmaceutical products. Braz J Med Biol Res 36:1561). Cada método representa uma modalidade separada da presente invenção.

As composições da presente invenção podem ser, em outra modalidade, administradas a um sujeito por qualquer método conhecido para um perito na técnica, como via parenteral, paracanceral, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intra-dérmica,

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83/141 subcutânea, intraperitoneal, intra ventricular, intra-cranialmente, intra-vaginal ou intratumoral.

Em outra forma modalidade dos métodos e composições da presente invenção, as composições são administradas oralmente, e são assim formuladas em uma forma adequada para administração oral, isto é, como um sólido ou uma preparação líquida. Formulações sólidas orais adequadas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, pastilhas e semelhantes. Formulações líquidas orais adequadas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e semelhantes. Em outra modalidade da presente invenção, o ingrediente ativo é formulado em uma cápsula. De acordo com esta modalidade, as composições da presente invenção compreendem, em adição ao composto ativo e o transportador ou diluente inerte, uma cápsula de gelatina dura.

Em outras modalidades, a composição farmacêutica é administrada via intravenosa, intra-arterial, ou injeção intramuscular de uma preparação líquida. As formulações líquidas adequadas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e semelhantes. Em outra modalidade, as composições farmacêuticas são administradas via intravenosa e são formuladas de uma forma adequada para administração intravenosa. Em outra modalidade, as composições farmacêuticas são administradas intraarterialmente e são formuladas de uma forma adequada para administração intra-arterial. Em outra modalidade, as composições farmacêuticas são administradas intramuscularmente e são formulados de forma adequada para administração via intramuscular.

Em outra modalidade, as composições farmacêuticas são administradas topicamente nas superfícies do corpo e são formuladas de uma forma adequada para administração tópica. As formulações adequadas incluem géis, pomadas tópicas, cremes, loções, gotas e semelhantes. Para administração tópica, as composições ou seus derivados fisiologicamente tolerados são preparados e aplicados como soluções, suspensões, ou emulsões em diluente fisiologicamente aceitável com ou sem um veículo farmacêutico.

Em outra modalidade, a composição é administrada como um supositório, por exemplo, um supositório retal ou um supositório uretral. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é administrada por implantação subcutânea de um pélete. Em outra modalidade, o pellet fornece liberação controlada do agente durante um período de tempo.

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Em outra modalidade, o composto ativo é distribuído numa vesícula, por exemplo, um lipossoma (ver Langer, Science 249:. 1527-1533 (1990) Tratar et ai, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver geralmente ibid).

Conforme usado aqui carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes são bem conhecidos dos especialistas na técnica. O transportador ou diluente pode ser, em várias modalidades, um transportador sólido ou diluente para formulações sólidas, transportador líquido ou diluente para formulações líquidas para, ou misturas dos mesmos.

Em outra modalidade, carreadores sólidos/diluentes incluem, entre outros, uma goma, um amido (por exemplo, amido com, o amido pré-geletinizado) um açúcar (por exemplo, lactose, manitol, sacarose, dextrose), um material celulósico (por exemplo, celulose microcristalina), um acrilato (por exemplo, polimetilacrilato), carbonato de cálcio, óxido de magnésio, talco, ou misturas dos mesmos.

Em outras modalidades, os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para formulações líquidas podem ser soluções aquosas ou não aquosas, suspensões, emulsões ou óleos. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etil. Carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, e Incluindo salinas e meios tamponados . Exemplos de óleos são aqueles de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de oliva, óleo de girassol, e de fígado de peixe.

Veículos parenterais (para injeção subcutânea, intravenosa, intra-arterial, ou intramuscular) incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato e óleos fixos. Veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólitos como os baseados em dextrose de Ringer, e semelhantes. Exemplos são líquidos estéreis como água e óleos tais, com ou sem a adição de um tensoativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em geral, água, solução salina, dextrose aquosa e soluções relacionadas de açúcares, e glicóis como propileno glicol ou polietileno glicol são os carreadores líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis. Exemplos de óleos são Exemplos de óleos são aqueles de petróleo, animal, vegetal ou de

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85/141 origem sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de oliva, óleo de girassol, e de fígado de peixe.

Em outra modalidade, as composições compreendem ligantes (por exemplo, acácia, amido de milho, gelatina, carbômero, etil-celulose, goma guar, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, povidona), agentes desintegrantes (por exemplo, amido de milho, amido de batata, ácido algínico, dióxido de silício, croscarmelose de sódio, crospovidona, goma guar, amido glicolato de sódio), tampões (por exemplo, Tris-HCI., acetato, fosfato) de vários pH e forças iônicas, aditivos como a albumina ou gelatina, para prevenir a absorção de superfícies, detergentes (por exemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácidos biliares), inibidores de protease, agentes tensoativos (por exemplo, lauril sulfato de sódio), promotores de permeação, agentes de solubilização (por exemplo, glicerol ,polietileno) glicerol, antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sódio, hidroxianisol butilado), estabilizantes (por exemplo, hidroxipropil celulose, hidroxipropilmetil celulose), agentes para aumento da viscosidade (por exemplo, carbomero, dióxido de silício coloidal, etil celulose, goma guar), adoçantes (por exemplo, aspartame, ácido cítrico), conservantes (por exemplo, Timerosal, álcool benzílico, parabenos), lubrificantes (por exemplo ácido esteárico, estearato de magnésio, polietileno glicol, lauril sulfato de sódio), ajudantes de fluxos (dióxido de silício coloidal, por exemplo), plastificantes (por exemplo, dietil ftalato, citrato de trietil), emulsionantes.

Em outra modalidade, as composições farmacêuticas aqui proporcionadas são composições de liberação controlada, ou seja, composições em que o composto é liberado durante um período de tempo após a administração 15. Composições de liberação controlada ou sustentada incluem formulação em depósitos lipofílicos (por exemplo, ácidos graxos, ceras, óleos). Em outra modalidade a composição é uma composição de liberação imediata, isto é, uma composição em que o composto inteiro é liberado imediatamente após a administração.

Em outra modalidade, as moléculas da presente invenção são modificadas pela ligação covalente de polímeros solúveis em água como polietileno glicol, copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona ou poliprolina. Os compostos modificados são conhecidos por apresentar substancialmente meia-vidas mais longas no sangue após injeção intravenosa do que os correspondentes compostos não modificados (Abuchowski et ai, 1981;. Newmark et al, 1982;..

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E Katre et al, 1987). Tais modificações também aumentam, em outra modalidade, a solubilidade do composto em solução aquosa, eliminam a agregação, melhoram a estabilidade física e química do composto, e reduzem grandemente a imunogenicidade e reatividade do composto. Como resultado, a desejada atividade biológica in vivo pode ser conseguida pela administração de tal polímero composto sequestra menos frequentemente ou em doses mais baixas do que com o composto não modificado.

Um componente ativo é, em outra modalidade, formulado na composição como formas de sal neutralizadas farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (por exemplo, formados com os grupos amino livres de uma molécula de polipeptídeo ou anticorpo), que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e afins. Os sais formados a partir dos grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio, ou hidróxidos de ferro, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e semelhantes.

Cada um dos aditivos acima, excipientes, formulações e métodos de administração representa uma modalidade separada da presente invenção.

EXEMPLOS

Os seguintes protocolos experimentais foram empregados nos exemplos fornecidos abaixo, a menos que indicado o contrário.

MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 1-3

Cultura de célula Células de fibroblasto 1079 de prepúcio de recém-nascidos humanos (Cat# CRL-2097, ATCC, Manassas, VA) e células de IMR90 humanas (Cat# CCL-186, ATCC) foram cultivadas em Meio MEM Avançado (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS, Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2mM Glutamax (Invitrogen), 0,1mM β-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), e Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen). Todas as células cresceram em 37°C e 5% CO2. Em alguns experimentos, células iPSs humanas que foram induzidas usando métodos descritos aqui foram mantidas em fibroblastos embrionários de camundongos irradiados (MEFs) (R&D Systems, Minneapolis, MN) em placas de 10 cm pré-revestidas com 0,1%

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87/141 gelatina (Millipore, Phillipsburg, NJ) em meio DMEM/F12 complementado com 20% KnockOut substituto de soro, 0,1mM L-glutamina (todas da Invitrogen), 0,1mM βmercaptoetanol (Sigma) e 100ng/ml fator de crescimento básico de fibroblasto (Invitrogen). Em alguns experimentos, células iPS humanas que foram induzidas usando os métodos descritos aqui foram mantidas em meio condicionado MEF que foi coletado conforme anteriormente descrito (Xu et al. 2001).

Construção de Vetores. Os cDNAs para as regiões de leitura abertas (ORFs) de KLF4, LIN28, NANOG, e OCT4 foram amplificadas em PCR a partir de clones de cDNA (Open Biosystems, Huntsville, AL), clonados em um vetor de plasmídeo downstream de um promotor de T7 RNA polimerase (Mackie 1988, Studier and Moffatt 1986) (por exemplo, vários vetores pBluescript™, Agilent, La Jolla, CA or pGEM™, Promega, Madison, WI,) e sequenciados. As ORF de SOX2 foram amplificadas por PCR a partir de um clone de cDNA (Invitrogen) e o ORF de c-MYC foi isolado por RT-PCR de RNA total de célula HeLa. Ambos SOX2 e c-MYC ORF foram ainda clonados em um vetor de plasmídeo a jusante de um promotor T7 RNA polimerase e sequenciados.

Os vetores de plasmídeos alternativos contendo regiões de leitura abertas humanas de (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4 e SOX2) foram clonados em pBluescriptII. Estes vetores pBluescriptII foram construídos através de ligação das regiões de leitura abertas acima em sítios EcoRV (cMyc) ou EcoRV/SpeI (KLF4, LIN28, NANOG, OCT4, e SOX2) entre regiões 5' e 3' de Xenopus laevis beta-globina não traduzidas descritas (Krieg and Melton 1984).

Produção de mRNA Os constructos de plasmídeos contendo promotor T7 RNA polimerase (pT7-KLF4, pT7-LIN28, pT7-c-MYC, pT7-OCT4, pT7-SOX2, ou pT7-XBgKLF4, pT7-XBg-LIN28, pT7-XBg-c-MYC, pT7-XBg-OCT4, e pT7-XBg-SOX2) foram linearizados com BamHI e pT7-NANOG e pT7-XBg-NANOG foram linearizados com Xba I. O sistema de produção de mRNA mSCRIPT™ (EPICENTRE ou CellScript, Madison, WI, USA) foi usado para produzir mRNA com uma estrutura 5' Cap1 e uma cauda 3' Poli (A) (por exemplo, com aproximadamente 150 resíduos de A), exceto que a pseudouridina-5'-trifosfato (TRILINK, San Diego, CA) foi usada no lugar de uridina-5'-trifosfato nas reações de transcrição de T7 RNA polimerase in vitro.

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Purificação e análise de mRNA. Em algumas modalidades experimentais, o mRNA foi purificado por HPLC, frações da coluna foram coletadas, e as frações de mRNA foram analisadas para pureza e imunogenicidade conforme descrito em “Materiais e Métodos para os Exemplos 35-38” e/ou conforme descrito e mostrado para as as Figuras 22-24. Em algumas modalidades experimentais, as preparações de RNA purificado compreendendo ou consistindo de mRNAs que codificam um ou mais fatores de reprogramação que apresentaram pouca ou nenhuma imunogenicidade foram usados para os experimentos para reprogramar células somáticas humanas a células iPS.

Reprogramação de Células Somáticas Humanas em MEFs. Fibroblastos 1079 foram plaqueados em 1 x 10⁵ células/poço de uma placa de 6 poços pré-revestida com 0,1% gelatina (Millipore) e crescidos durante a noite. Os fibroblastos 1079 foram transfectados com quantidades iguais de cada fator de reprogramação mRNA (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2) usando TransIT mRNA reagente de transfecção (MirusBio, Madison, WI). Um total de três transfecçãos foi realizado, com uma transfecção sendo realizada em dias alternados, com alterações médias no dia após a primeira e segunda transfecções. O dia após a terceira transfecção, as células foram tripsinizadas em 3,3 x 10⁵ células foram plaqueadas em meio 1079 em 0,1% gelatina placa de 10 cm pré-revestida com 7,5 x 10⁵ MEFs no dia anterior. O dia após o plaqueamento os 1079 fibroblastos transfectados em MEFs, o meio foi alterado para meio de célula iPS. O meio de célula iPS foi alterado todos os dias. Oito dias após o plaqueamento as células transfectadas em MEFs, meio condicionado MEF foi usado. Meio condicionado MEF foi coletado conforme anteriormente descrito (Xu et al. 2001). As placas foram triadas todos os dias para a presença de colônias com uma morfologia iPS usando um microscópio invertido.

Protocolos alternativos para reprogramar fibroblastos 1079 e IMR90 em MEFs foram ainda usados. MEFs foram plaqueados em 1,25 x 10⁵ células/poço de uma placa de 6 poços pré-revestida com 0,1% de gelatina e incubada durante a noite em meio de fibroblasto completo. Fibroblastos 1079 ou IMR90 foram plaqueados em 3 x 10⁴ células/poço de uma placa de 6 poços semeada com MEFs no dia anterior e crescidos durante a noite a 37^oC/5%CO2. O kit mScript foi em seguida usado para gerar mRNA Cap1/poli-adenilado a partir dos seguintes vetores (pT7-X3g-KLF4, pT7-X3g-LIN28, pT7-X$g-c-MYC, pT7-X3g

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NANOG, pT7-X3g-OCT4, e pT7-X3g-SOX2) para uso nestas transfecções diárias. Todos os seus mRNAs de reprogramação foram diluídos a 100 ng/pl de cada mRNA. A molaridade igual de cada mRNA foi adicionada junto usando os seguintes fatores de conversão (OCT4 é ajustado em 1 e todos os outros mRNAs são multiplicados por estes fatores de conversão para obter uma molaridade igual em cada mix de mRNA). KLF=1,32, LIN28=0,58, c-MYC=1,26, NANOG=0,85, OCT4=1, e SOX2=0,88. Para obter molaridade igual de cada fator 132 pl de KLF4, 58 pl de LIN28, 126 pl de c-MYC, 85 pl de NANOG, 100 pl de OCT4 e 88 pl de SOX2 mRNA (cada um em 100ng/pl) poderia ser adicionado junto. Um total de 600pg de dose para transfecções poderia significar que 100ng (usando conversões de molaridade acima) de cada um dos seis mRNAs de reprogramação foi usado. O Trans-IT mRNA reagente de transfecção foi usado para transfectar estas doses de mRNA. Para todas as transfecções, pools de mRNA foram adicionados a 250pl de meio DMEM/F12 sem aditivos ou meio MEM Avançado sem aditivos. 5pl de reagente de impulsionamento de mRNA e 5pl de TransIT reagente de transfecção foi adicionado a cada tubo em temperatura ambiente por dois minutos antes de adicionar o mix de transfecção a 2,5ml de meio MEM Avançado com 10% FBS + 100ng/ml de hFGFb ou meio iPS contendo 100ng/ml de hFGFb. As transfecções foram repetidas todos os dias por 10-16 dias. O meio foi trocado a cada 4 horas após cada transfecção. Em alguns experimentos, as células foram tripsinizadas e replaqueadas em novas placas MEF entre 5-8 dias após a transfecção inicial. Células 1079 foram divididas 1/6 ou 1/12 em novas placas MEF enquanto que células IMR90 foram divididas 1/3 ou 1/6 em novas placas MEF.

Reprogramação de Células Somáticas Humanas em Meio MEF Condicionado. Fibroblastos 1079 ou IMR90 foram plaqueados em 3 x 10⁵ celulas por placas de 10 cm prérevestidas com 0,1% gelatina (Millipore) e crescidos durante a noite. Os fibroblastos 1079 ou IMR90 foram transfectados com quantidades iguais de cada fator de reprogramação mRNA (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2) usando TransIT mRNA reagente de transfecção (MirusBio, Madison, WI). Para cada transfecção, 6 pg, 18 pg, ou 36 pg de cada mRNA de reprogramação (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2) foi usado por placa de 10 cm. Um total de três transfecções foi realizado, com uma transfecção sendo realizada a cada outro dia com o meio sendo alterado no dia após cada uma das primeira e

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90/141 segunda transfecções. Todas as transfecções foram realizadas em meio MEF condicionado. O dia após a terceira transfecção, as células foram tripsinizadas e 3 x 10⁵ células foram plaqueados em novas placas de 10 cm pré-revestidas com 0,1% gelatina (Millipore). As células cresceram em meio MEF condicionado pela duração do experimento.

Semelhantes transfecções diárias de mRNA foram ainda realizadas conforme descrito na seção anterior com a única diferencai de que MEFs não foram usados como camadas alimentadoras, somente meio MEF condicionado foi usado.

Imunofluorescência. As células 1079 ou placas de células iPS derivadas de 1079 foram lavadas e fixadas em 4% paraformaldeído em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. As células iPS foram então lavadas 3 vezes por 5 minutos cada lavagem com PBS seguido por três lavagens em PBS + 0,1% Triton X-100. As células iPS foram então bloqueadas em tampão de bloqueio (PBS + 0,1% Triton, 2% FBS, e 1% BSA) por 1 hora em temperatura ambiente. As células foram então incubadas por 2 horas em temperatura ambiente com o anticorpo primário (anti- OCT4 humano de camundongo Cat# sc-5279, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), (anti- NANOG humano de coelho Cat #3580, anti- KLF4 humano de coelho Cat # 4038, anti- LIN28 humano de camundongo Cat# 5930, anti- c-MYC humano de coelho Cat# 5605, anti- SOX2 humano de coelho Cat# 3579, e anti-TRA-1-60 de camundongo todos de Cell Signaling Technology, Beverly, MA) em uma diluição 1:500 em tampão de bloqueio. Após lavagem 5 vezes em PBS + 0,1% Triton X-100, as células iPS foram incubadas por 2 horas com o anticorpo anti-Alexa Fluor 488 de coelho (Cat # 4412, Cell Signaling Technology), anti- FITC secundário de camundongo (Cat# F5262, Sigma), ou um anti- Alexa Fluor 555 de camundongo (Cat# 4409, Cell Signaling Technology) em diluições de 1:1000 em tampão de bloquei. As imagens foram tomadas em um microscópio invertido Nikon TS100F (Nikon, Tokyo, Japan) com uma câmera digital mocromática de 2 megapixel (Nikon) usando o software NIS-elements (Nikon).

EXEMPLO 1

Este Exemplo descreve os testes para determinar se as transfecções com mRNA que codificam KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4 e SOX2 resultaram na expressão e localização subcelular apropriada de cada produto de proteína respectivo em fibroblastos 1079 de prepúcio fetal de recém-nascidos. Os mRNAs usados nos experimentos foram preparados com pseudouridina-5’-trifosfato substituindo para uridina-5’-trifosfato (Kariko et al. 2008). Os

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91/141 fibroblastos 1079 foram transfectados com 4 pg de cada mRNA por poço de uma placa de 6 poços e análise de imunofluorescência foi realizada 24 horas após a transfecção. Níveis de proteínas endógenas KLF4, LIN28, NANOG, OCT4 e SOX2 foram não detectáveis por imunofluorescência em células 1079 não transfectadas (Fig.1: B, F, N, R, V). Níveis endógenos de c-MYC foram relativamente altos em células 1079 não transfectadas (Fig. 1J). As transfecções com mRNAs que codificam os fatores de transcrição, KLF4, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2 todos resultaram em localização primariamente nuclear de cada proteína 24 horas após as transfecções de mRNA (Figura 1: D, L, P, T, X). A proteína de ligação ao mRNA citoplasmático, LIN28, foi localizada para o citoplasma (Fig. 1: H).

EXEMPLO 2

Tendo demonstrado transfecção de mRNA eficiente e localização subcelular apropriada das proteínas de reprogramação, este Exemplo descreve o desenvolvimento de um protocolo para a geração de célula iPS a partir de fibroblastos somáticos. Quantidades iguais (em peso) de KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2 mRNAs foram transfectadas em fibroblastos 1079 três vezes (uma vez em dias alternados). O dia após a terceira transfecção, as células foram plaqueadas em células MED alimentadoras irradiadas e crescidas em meio de célula iPS. Seis dias após o plaqueamento os 1079 fibroblastos em MEFs irradiados, duas colônias de célula iPS putativas se tornaram aparentes na placa de 10 cm transfectada com 3 pg de cada fator de reprogramação mRNA (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2). As colônias foram deixadas crescer até 12 dias após a última transfecção antes de serem fixadas para análise de imunofluorescência. O marcador NANOG específico para massa celular interna é geralmente usado para avaliar se as colônias de células iPS são verdadeiramente colônias iPS (Gonzalez et al. 2009, Huangfu et al. 2008). A expressão de NANOG oriunda de mRNAs que foram transfectados 12 dias mais cedo poderia ser desprezível baseado em relatos anteriores sobre a duração da estabilidade e expressão do mRNA (Kariko et al. 2008). A coloração para NANOG mostrou que as duas colônias de células iPS foram positivas para NANOG (Fig. 2 B, D, e não mostrado). Os fibroblastos circundantes que não foram parte da colônia de célula iPS foram negativas para NANOG, sugerindo que não foram reprogramadas em células iPS.

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Em um experimento subsequente usando o mesmo protocolo, ambos os 1079 fibroblastos e fibroblastos IMR90 humanos foram transfectados com os mesmos mRNAs de reprogramção. Várias colônias foram detectadas tão cedo quanto 4 dias após o plaqueamento das células transfectadas em MEFs irradiados. Quando 6 pg de cada mRNA (KLF4, LIN28, cMYC, NANOG, OCT4, e SOX2) foram usados em transfecções em placas de 6 poços, 3 colônicas de células iPS putativas foram depois detectadas em ambas as linhagens celulares após plaqueamento em MEFs em placas de 10 cm (Figura 3). Além de analisar estas colônicas para expressão de NANOG, TRA-1-60, um marcador mais rígido de células iPS completamente reprogramadas (Chan et al. 2009), foi ainda usada para análise de imunofluorescência. As colônias iPS geradas a partir de fibroblastos 1079 (Fig. 3 A-F) e de fibroblastos IMR90 (Fig. 3 G-I) foram positivos para ambos NANOG e TRA-1-60, indicando que estas colônias são colônias de células iPS tipo III completamente reprogramadas. Este protocolo compreendendo três transfecções de mRNAs que codificam todos os seis fatores de reprogramação e em seguida plaqueando em células alimentadoras MEF resultou em uma eficiência de reprogramação semelhante (3-6 colônias iPS por 1 x 106 células entradas) conforme foi anteriormente relatado por protocolos compreendendo liberação dos mesmos fatores de reprogramação por transfecção de um plasmídeo de expressão (Aoi et al. 2008).

EXEMPLO 3

Este Exemplo descreve uma tentativa de melhorar a eficiência de células diferenciadas de reprogramação usando mRNA. Em uma abordagem, um protocolo foi usado que compreendia transfectar fibroblastos 1079 ou IMR90 três vezes (uma vez em dias alternados) com os mRNAs que codificam os seis fatores de reprogramação em meio MEF condicionado ao invés de em meio de fibroblasto e em seguida cresceram os fibroblastos 1079 tratados em meio MEF condicionado ao invés de plaquear os mesmos em uma camada alimentadora de MEF após os tratamentos. Na dose mais alta de transfecção utilizada (36 pg de cada fator de reprogramação por placa de 10 cm), 208 colônias de células iPS foram detectadas três dias após a transfecção final (Figura A-F). De modo interessante, nenhuma colônia de célula iPS foi detectada nas placas com 6 ou 18 pg de cada um dos fatores de reprogramação no ponto de tempo do dia 3, sugerindo que uma dose acima de 18 pg foi importante, sob estas condições, para a formação de colônia de células iPS ocorre dentro de 3 dias em meio MEF

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93/141 condicionado. As células IMR90 mostraram um número ainda maior de colônias de células iPS, com cerca de 200 colônias 8 dias após a última transfecção na placa transfectada com três doses de 6 pg de cada um dos seis fatores de reprogramação de mRNAs e >1000 colônias em células IMR90 transfectadas três vezes com doses de 18 pg ou 36 pg de cada um dos seis mRNAs de reprogramção (Figura 4 G-I). As colônias foram visíveis 3 dias após a transfecção final em células 1079, enquanto que somente colônias se tornaram visíveis 6-7 dias após a transfecção final em células IMR90. Portanto, as colônias mais maduras derivada das células 1079 foram maiores e mais densas e foram mais escuras em imagens de campo brilhante comparadas às colônias IMR90 (Figura 4). Todas as colônias na placa 1079 transfectadas três vezes com 36 pg de cada mRNA de reprogramação foram positivas para ambos NANOG e TRA-1-60 8 dias após a transfecção final de mRNA (Figura 5 A-I). Toas as colônias iPS IMR90 mais imaturas foram ainda positivas para ambos NANOG e TRA-1-60 (Figura 5 J-O), mas apresentaram coloração menos robusta para ambos os marcadores devido à natureza celular menos densa comparado às colônias 1079 mais maduras (Figura 5 A-I). O protocolo presente compreendendo liberação de mRNAs em células 1079 ou IMR90 em meio MEF condicionado teve uma eficiência de reprogramação de 200 a >1000 colônias por 3 x 10⁵células entradas. Este protocolo para indução de células iPS foi mais rápido e quase 2-3 ordens de magnitude mais eficiente do que os protocolos publicados compreendendo transfectar fibroblastos com plasmídeos de DNA que codificam os mesmos seis fatores de reprogramação em meio de fibroblasto (Aoi et al. 2008). Ainda, este protocolo foi mais de 7-40 vezes mais eficiente do que o protocolo publicado compreendendo liberação de fatores de reprogramação com lentivírus, baseado em dados publicados de que a liberação de fatores de reprogramação lentiviral em fibroblastos 1079 de recém-nascidos, que resultou em aproximadamente 57 colônias de células iPS por 6 x 10⁵ células entradas (Aoi et al. 2008). Este protocolo é ainda muito mais rápido do que os métodos publicados.

EXEMPLO 4

MOLÉCULAS DE RNA DE OCORRÊNCIA NATURAL APRESENTAM CAPACIDADES DIFERENCIAIS PARA ATIVAR CÉLULAS DENDRÍTICAS, MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Plasmídeos e Reagentes

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Os plasmídeos pT7T3D-MART-1 e pUNO-hTLR3 foram obtidos de ATCC (Manassas, VA) e InvivoGen (San Diego, CA), respectivamente. pTEVluc foi obtido de Dr Daniel Gallie (UC Riverside), contém pT7-TEV (a sequência lídade do RNA de genoma viral de tobacco etch)-luciferase-A50, e é descrito em Gallie, DR et al, 1995. A cauda líder 5' de vírus tobacco etch e poli(A) são reguladores funcionalmente sinergísticos de tradução. Gene 165:233) pSVren foi gerado a partir de p2luc (Grentzmann G, Ingram JA, et al, A dualluciferase reporter system for studying recoding signals. RNA 1998;4(4): 479-86) pela remoção de sequência codificadorade luciferase de vaga-lume com digestão BamHI e NotI, preenchimento de extremidade, e religação.

siRNA específicos de TLR3 humanos, pTLR3-sh foi construído inserindo ODN sintético que codifica shRNA com 20 nt de homologia de comprimento ao TLR3 humano (nt 703-722, acesso: NM_003265) no plasmídeo pSilencer 4.1-CMV-neo (Ambion, Austin, TX). pCMV-hTLR3 foi obtido por primeira clonagem de produto de PCR específico para hTLR3 (nt 80-2887; Acesso NM_003265) em pCRII-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), em seguida liberado com Nhe I-Hind III cortando e subclonando nos sítios correspondentes de pcDNA3.1 (Invitrogen). LPS (E. coli 055:B5) foi obtido de Sigma Chemical Co, St. Louis, MO. CpG ODN2006 e R-848 foram obtidos de InvivoGen.

Células e cultura de células

Células renas embrionárias humanas 293 (ATCC) foram propagadas em DMEM complementado com glutamina (Invitrogen) e 10% FCS (Hyclone, Ogden, UT) (meio completo). Em todos os casos aqui, células 293 refere-se a células renais humans embrionárias (HEK) 293. A linhagem de célula 293-hTLR3 foi gerada transformando células 293 com pUNO-hTLR3. As linhagens de células 293-hTLR7, 293-hTLR8 e 293-hTLR9 (InvivoGen) cresceram em meio completo complementado com blasticidina (10 pg/ml) (Invivogen). As linhagens de células 293-ELAM-Iuc e TLR7-293 (M. Lamphier, Eisai Research Institute, Andover MA), e células TLR3-293 foram cultivas conforme escrito (Kariko et al, 2004, mRNA é um ligante endógeno para o receptor tipo Toll 3. J Biol Chem 279: 12542-12550). As linhagens de células 293, 293-hTLR7 e 293-hTLR8 foram estavelmente transfectadas com pTLR3-sh e selecionadas com G-418 (400 pg/ml) (Invitrogen). Colônias neo resistentes foram selecionadas e somente aquelas que não expressam TLR3, determinadas como falta de secreção de IL-8 loin resposta a poli(I):(C),

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95/141 foram usados em outros estudos. Amostras de leucoferese foram obtidas de voluntários infectados por HIV através de um protocolo aprovado pelo IRB.

Geração de DC murinas

DCs murinas foram geradas coletando células de medula óssea da tíbia e fêmures de camundongos de 6-8 semanas de vida C57BL/6 e lisando as células vermelhas. As células foram semeadas em placas de 6 poços em 10⁶ células/poço em 2 ml DMEM + 10% FCS e 20 ng/ml muGM-CSF (R & D Systems). No dia 3, 2 ml de meio fresco com muGM-CSF foi adicionado. No dia 6, 2 ml meio/poço foi coletado, e as células foram peletizadas e ressuspendidas em meio fresco com muGM-CSF. No dia 7 da cultura, o muDC foi colhido, lavado.

RNA Natural

A mitocôndria foi isolada e as plaquetas obtidas de University of Pennsylvania Blood Bank usando um procedimento de fracionamento por lise (Mitochondria isolation kit; Pierce, Rockford, IL). O RNA foi isolado da mitocôndria purificada, frações citoplasmáticas e nucleares de células 293, células 293 não fracionadas, fígado de rato, linhagem de células TUBO de camundongos, e cepa DH5alfa de E. coli por Master Blaster® (BioRad, Hercules, CA). tRNA bovino, tRNA de trigo, tRNA de levedura, tRNA de E. coli, poli(A)+ mRNA de coração de camundongo e poli(I):(C) foram adquiridos de Sigma, RNA total de baço humano e E. coli RNA foram adquiridos de Ambion. Oligorribonucleotídeo-5'-rnonofosfatos foram quimicamente sintetizados (Dharmacon, Lafayette, CO).

Alíquotas de amostras de RNA foram incubados na pesenca de Benzonase nuclease (1 U por 5 pl de RNA em 1 micrograma por microlitro (pg/pl) por 1 h) (Novagen, Madison, WI). Alíquotas de RNA-730 foram digeridas com fosfatase alcalina (New England Biolabs). Amostras de RNA foram analisadas por agarose desnaturante ou eletroforese em gel de poliacrilamida para garantia de qualidade. Ensaios para LPS em preparações de RNA usando o ensaio de coagulação de gel Limulus Amebocyte Lysate foram negativos com uma sensibilidade de 3 picogramas por mililitro (pg/ml) (University of Pennsylvania, Core Facility).

Análise de HPLC

Os nucleosídeos monofosfatos foram separados e visualizados via HPLC. Para liberar nucleoside livre de 3'-monofosfatos, alíquotas de 5 pg de RNA foram digeridos com 0,1 U de

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RNase T2 (Invitrogen) em 10 μΐ de 50 mM NaOAc e 2 mM de tampão EDTA (pH 4,5) durante a noite, em seguida as amostras foram injetadas em um Agilent 1100 HPLC usando uma coluna Waters Symmetry C 18 (Waters, Milford, MA). Em uma vazão de 1 mL/min, um gradiente de 100% tampão A (30 mM KH2PO4 e10 mM tetraetilamônio fosfato [reagente PicA, Waters], pH 6.0) a 30% tampão B (acetonitrila) correm em 60 minutos. Os nucleotídeos foram detectados usando um arranjod e fotodiodo em 254 nm. As identidades foram verificadas por tempos de retenção e espectos.

Ensaios de célula dendrítica

Células dendríticas em placas de 96 poços (aproximadamente 1.1 x 10⁵ células/poço) foram tratadas com R-848, Lipofectin®, ou Lipofectin®-RNA por 1 h, do que o meio foi alterado. Ao fim das 8 h (salvo indicado de outra forma), as células foram colhidas por isolamento de RNA ou citometria de fluxo, enquanto o meio de cultura coletado foi submetido a citocina ELISA. Os níveis de IL-12 (p70) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), IFN-α, TNF-α, e IL-8 (Biosource International, Camarillo, CA) foram medidos em sobrenadantes por ELISA sanduíche. As culturas foram realizadas em triplicata ou quadruplicata e medidas em duplicata.

Análise de Northern blot

O RNA foi isolado de MDDCs após uma incubação de 8 h após o tratamento conforme descrito acima. Onde notado, as células foram tratadas com 2,5 μg/ml cicloheximida (Sigma) 30 min antes da estimulação e ao longo da duração total da incubação. As amostras de RNA foram processadas e analisadas em Northern blots conforme descrito (Kariko et al, 2004, ibid) usando sondas de TNF-α e GAPDH humandas derivadas de plasmídeos (pE4 e pHcGAP, respectivamente) obtidos de ATCC.

RESULTADOS

Para determinara o potencial imuno estimulatório de diferentes subtipos de RNA celulares, o RNA foi isolado de compartimentos subcelulares diferentes, ou seja, citoplasma, núcleo e mitocôndria. Estas frações de RNA, bem como RNA total, tRNA e mRNA selecionados de cauda poliA, todos de fontes mamíferas, foram complexados com Lipofectin® e adicionados a MDDC. Enquanto o RNA total de mamíferos, nuclear e citoplasmático todos estimularam MDDC, conforme evidenciado por secreção detectável de TNF-α, os níveis de TNF-α foram muito inferiores do que aqueles induzidos por mRNA sintetizado in vitro

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97/141 (Figura 6).Além disso, tRNA mamífero não induz qualquer nível detectável de TNF-α, enquanto RNA mitocondrial (mt) induziu muito mais TNF-α do que outros tipos de RNA mamíferos. RNA total bacteriano foi ainda um potente ativador de MDDC; em contraste, tRNA bacteriano induziu somente um nível baixo de TNF-α. tRNA de outras fontes (levedura, germen de trigo, bovino) foram não estimulatórios. Resultados semelhantes foram observados quando RNA de outras fontes mamíferas foi testado. Quando amostras de RNA foram digeridas com Benzonase, que cliva ssRNA e dsRNA, a sinalização de RNA foi abolida em MDDC, verificando que a secreção de TNF-α foi devido a RNA nas preparações. Os potenciais de ativação de tipos de RNA testados apesentaram uma correlação inversa com a extensão da modificação do nucleosídeo. Resultados semelhantes foram obtidos nos experimentos descritos neste Exemplo para ambos os tipos de DC gerados por citocina.

Estes achados demonstram que a imunogenicidade de RNA é afetada pela extensão da modificação do nucleosídeo, com um grau maior de modificação tendendo a diminuir a imunogenicidade.

EXEMPLO 5

SÍNTESE IN VITRO DE MOLÉCULAS DE RNA COM NUCLEOSÍDEOS MODIFICADOS MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

RNA transcrito in vitro

Usando ensaio de transcrição in vitro (MessageMachine and MegaScript kits; Ambion,) os seguintes RNAs longos foram gerados por T7 RNA polimerase (RNAP) conforme descrito (Kariko et al, 1998, fosfato-enhanced transfection of cationic lipidcomplexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta 1369, 320-334) (Nota: os nomes de modelos são indicados em parênteses; o número no nome do RNA especifica o comprimento): RNA-1866 (Nde I-linearizado pTEVluc) codifica luciferase de vaga-lume e uma cauda 50 nt de comprimento poliA. RNA-1571 (Ssp I-linearized pSVren) codifica Renilla luciferase. RNA-730 (Hind III-linearizado pT7T3D-MART-l) codifica o antígeno de melanoma humano MART-I. RNA-713 (EcoR I-linearizado pTIT3D-MART-l) corresponde a sequência antissenso de MART-1, RNA497 (Bgl II-linearizado pCMV-hTLR3) codifica um fragmento parcial 5' de hTLR3. As sequências de moléculas de RNA são as seguintes:

RNA-I866:

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98/141 ggaauucucaacacaacauauacaaaacaaacgaaucucaagcaaucaagcauucuacuucuauugcagcaauuu aaaucauuucuuuuaaagcaaaagcaauuuucugaaaauuuucaccauuuacgaacgauagccauggaagacgccaaaaac auaaagaaaggcccggcgccauucuauccucuagaggauggaaccgcuggagagcaacugcauaaggcuaugaagagauac gcccugguuccuggaacaauugcuuuuacagaugcacauaucgaggugaacaucacguacgcggaauacuucgaaauguc cguucgguuggcagaagcuaugaaacgauaugggcugaauacaaaucacagaaucgucguaugcagugaaaacucucuuc aauucuuuaugccgguguugggcgcguuauuuaucggaguugcaguugcgcccgcgaacgacauuuauaaugaacguga auugcucaacaguaugaacauuucgcagccuaccguaguguuuguuuccaaaaagggguugcaaaaaauuuugaacgugc aaaaaaaauuaccaauaauccagaaaauuauuaucauggauucuaaaacggauuaccagggauuucagucgauguacacgu ucgucacaucucaucuaccucccgguuuuaaugaauacgauuuuguaccagaguccuuugaucgugacaaaacaauugca cugauaaugaauuccucuggaucuacuggguuaccuaaggguguggcccuuccgcauagaacugccugcgucagauucuc gcaugccagagauccuauuuuuggcaaucaaaucauuccggauacugcgauuuuaaguguuguuccauuccaucacgguu uuggaauguuuacuacacucggauauuugauauguggauuucgagucgucuuaauguauagauuugaagaagagcuguu uuuacgaucccuucaggauuacaaaauucaaagugcguugcuaguaccaacccuauuuucauucuucgccaaaagcacucu gauugacaaauacgauuuaucuaauuuacacgaaauugcuucugggggcgcaccucuuucgaaagaagucggggaagcgg uugcaaaacgcuuccaucuuccagggauacgacaaggauaugggcucacugagacuacaucagcuauucugauuacacccg agggggaugauaaaccgggcgcggucgguaaaguuguuccauuuuuugaagcgaagguuguggaucuggauaccgggaa aacgcugggcguuaaucagagaggcgaauuaugugucagaggaccuaugauuauguccgguuauguaaacaauccggaag cgaccaacgccuugauugacaaggauggauggcuacauucuggagacauagcuuacugggacgaagacgaacacuucuuc auaguugaccgcuugaagucuuuaauuaaauacaaaggauaucagguggcccccgcugaauuggaaucgauauuguuaca acaccccaacaucuucgacgcgggcguggcaggucuucccgacgaugacgccggugaacuucccgccgccguuguuguuu uggagcacggaaagacgaugacggaaaaagagaucguggauuacguggccagucaaguaacaaccgcgaaaaaguugcgc ggaggaguuguguuuguggacgaaguaccgaaaggucuuaccggaaaacucgacgcaagaaaaaucagagagauccucau aaaggccaagaagggcggaaaguccaaauuguaaaauguaacucuagaggauccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaca (SEQ ID No: 1).

RNA-1571: ggcuagccaccaugacuucgaaaguuuaugauccagaacaaaggaaacggaugauaacugguccgcaguggugggccaga uguaaacaaaugaauguucuugauucauuuauuaauuauuaugauucagaaaaacaugcagaaaaugcuguuauuuuuuu acaugguaacgcggccucuucuuauuuauggcgacauguugugccacauauugagccaguagcgcgguguauuauaccag accuuauugguaugggcaaaucaggcaaaucugguaaugguucuuauagguuacuugaucauuacaaauaucuuacugca ugguuugaacuucuuaauuuaccaaagaagaucauuuuugucggccaugauuggggugcuuguuuggcauuucauuaua gcuaugagcaucaagauaagaucaaagcaauaguucacgcugaaaguguaguagaugugauugaaucaugggaugaaugg

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99/141 ccugauauugaagaagauauugcguugaucaaaucugaagaaggagaaaaaaugguuuuggagaauaacuucuucgugga aaccauguugccaucaaaaaucaugagaaaguuagaaccagaagaauuugcagcauaucuugaaccauucaaagagaaagg ugaaguucgucguccaacauuaucauggccucgugaaaucccguuaguaaaaggugguaaaccugacguuguacaaauug uuaggaauuauaaugcuuaucuacgugcaagugaugauuuaccaaaaauguuuauugaaucggacccaggauucuuuucc aaugcuauuguugaaggugccaagaaguuuccuaauacugaauuugucaaaguaaaaggucuucauuuuucgcaagaaga ugcaccugaugaaaugggaaaauauaucaaaucguucguugagcgaguucucaaaaaugaacaaaugucgacgggggccc cuaggaauuuuuuagggaagaucuggccuuccuacaagggaaggccagggaauuuucuucagagcagaccagagccaaca gccccaccagaagagagcuucaggucugggguagagacaacaacucccccucagaagcaggagccgauagacaaggaacug uauccuuuaacuucccucagaucacucuuuggcaacgaccccucgucacaauaaagauaggggggcaacuaaagggaucgg ccgcuucgagcagacaugauaagauacauugaugaguuuggacaaaccacaacuagaaugcagugaaaaaaaugcuuuauu ugugaaauuugugaugcuauugcuuuauuuguaaccauuauaagcugcaauaaacaaguuaacaacaacaauugcauuca uuuuauguuucagguucagggggaggugugggagguuuuuuaaagcaaguaaaaccucuacaaaugugguaaaaucgau aaguuuaaacagauccagguggcacuuuucggggaaaugugcgcggaaccccuauuuguuuauuuuucuaaauacauuca aauauguauccgcucaugagacaauaacccugauaaaugcuucaauaau (SEQ ID No: 2).

RNA-730: gggaauuuggcccucgaggccaagaauucggcacgaggcacgcggccagccagcagacagaggacucucauuaaggaagg uguccugugcccugacccuacaagaugccaagagaagaugcucacuucaucuaugguuaccccaagaaggggcacggccac ucuuacaccacggcugaagaggccgcugggaucggcauccugacagugauccugggagucuuacugcucaucggcuguug guauuguagaagacgaaauggauacagagccuugauggauaaaagucuucauguuggcacucaaugugccuuaacaagaa gaugcccacaagaaggguuugaucaucgggacagcaaagugucucuucaagagaaaaacugugaaccugugguucccaau gcuccaccugcuuaugagaaacucucugcagaacagucaccaccaccuuauucaccuuaagagccagcgagacaccugaga caugcugaaauuauuucucucacacuuuugcuugaauuuaauacagacaucuaauguucuccuuuggaaugguguaggaa aaaugcaagccaucucuaauaauaagucaguguuaaaauuuuaguagguccgcuagcaguacuaaucaugugaggaaaug augagaaauauuaaauugggaaaacuccaucaauaaauguugcaaugcaugauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacugcggcc gca (SEQ ID No: 3).

RNA-713 gggaauaagcuugcggccgcaguuuuuuuuuuuuuuuuuuuuaucaugcauugcaacauuuauugauggaguuuuccca auuuaauauuucucaucauuuccucacaugauuaguacugcuagcggaccuacuaaaauuuuaacacugacuuauuauua gagauggcuugcauuuuuccuacaccauuccaaaggagaacauuagaugucuguauaaauucaagcaaaagugugagaga aauaauuucagcaugucucaggugucucgcuggcucuuaaggugaauaaggugguggugacuguucugcagagaguuuc ucauaagcagguggagcauugggaaccacagguucacaguuuuucucuugaagagacacuuugcugucccgaugaucaaa

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100/141 cccuucuugugggcaucuucuuguuaaggcacauugagugccaacaugaagacuuuuauccaucaaggcucuguauccau uucgucuucuacaauaccaacagccgaugagcaguaagacucccaggaucacugucaggaugccgaucccagcggccucuu cagccgugguguaagaguggccgugccccuucuugggguaaccauagaugaagugagcaucuucucuuggcaucuugua gggucagggcacaggacaccuuccuuaaugagaguccucugucugcuggcuggccgcgugccucgugccgaauu (SEQ ID No: 4).

RNA-497:

gggagacccaagcuggcuagcagucauccaacagaaucaugagacagacuuugccuuguaucuacuuuuggggg ggccuuuugcccuuugggaugcugugugcauccuccaccaccaagugcacuguuagccaugaaguugcugacugcagcca ccugaaguugacucagguacccgaugaucuacccacaaacauaacaguguugaaccuuacccauaaucaacucagaagauu accagccgccaacuucacaagguauagccagcuaacuagcuuggauguaggauuuaacaccaucucaaaacuggagccaga auugugccagaaacuucccauguuaaaaguuuugaaccuccagcacaaugagcuaucucaacuuucugauaaaaccuuugc cuucugcacgaauuugacugaacuccaucucauguccaacucaauccagaaaauuaaaaauaaucccuuugucaagcagaa gaauuuaaucacauua (SEQ ID No: 5).

Para obter RNA modificado, a reação de transcrição foi montada com a substituição de um (ou dois) dos NTPs básicos com os derivados correspondentes trifosfato dos nucleotídeos modificados nucleotídeo 5-metilcistidina, 5-metiluridina, 2-tiouridina, N6-metiladenosina ou pseudouridina (TriLink, San Diego, CA). Em cada reação de transcrição, todos os 4 nucleotídeos ou seus derivados estavam presentes em concentração de 7,5 milimolar (mM). Em experimentos selecionados, conforme indicado, 6 mM de análogo de capa m7GpppG (New England BioLabs, Beverly, MA) foi ainda incluído para onter RNA capeado. ORN5 e ORN6 foram gerados usado moldes de DNA oligodeoxinucleotídeo e T7 RNAP (Silencer® siRNA construction kit, Ambion).

RESULTADOS

Para ainda testar o efeito de modificações de nucleosídeo em imunogenicidade, um sistema in vitro foi desenvolvido para a produção de moléculas de RNA com pseudouridina ou nucleosídeos modificados. As reações de transcrição in vitro foram realizadas em que 1 ou 2 dos 4 nucleotídeos trifosfatos (NTP) foram substituídos com um NTP de nucleosídeo modificado correspondente. Vários conjuntos de RNA com diferentes sequências primárias variando no comprimento entre 0,7-1.9 kb, e contendo ou nenhum, 1 ou 2 tipos de nucleosídeos modificados foram transcritos. Os RNAs modificados foram não distinguíveis de suas contrapartes não modificadas em sua mobilidade em eletroforese de gel desnaturante,

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101/141 mostrando que eles estavam intactos e de outra forma não modificados (Figura 7A). Este procedimento trabalhou de forma eficiente com qualquer um de polimerases de fago T7, SP6, e T3, e portanto é generalizável para uma ampla variedade de RNA polimerases.

Estes achados fornecem um novo sistema in vitro para a produção de Moléculas de RNA com nucleosídeos modificados.

EXEMPLO 6

RNA TRANSCRITO IN VITRO ESTIMULA TLR3 HUMANO E MODIFICAÇÕES DE NUCLEOSÍDEO REDUZEM A IMUNOGENICIDADE DE RNA MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Células parental-293; 293-hTLR7 e 293-hTLR8, todas expressando siRNA específico de TLR3, e 293hTLR9, TLR3-293 foram semeadas em placas de 96 poços (5 x 10⁴células/poço) e cultivadas sem antibióticos. No dia subsequente, as células foram expostas a R-848 ou RNA complexado com Lipofectin® (Invitrogen) conforme descrito (Kariko et al, 1998, ibid). RNA foi removido após uma hora (h), e as células foram ainda incubadas em meio incompleto por 7 h. Os sobrenadantes foram coletados para medição de IL-8.

RESULTADOS

Para determinar se a modificação de nucleosídeos influencia a ativação mediada por RNA de TLRs, células renais embrionárias humanas 293 foram estavelmente transformados para expressar TLR3 humana. As linhagens células foram tratadas com RNA complexado com Lipofectin ® e ativação de TLR foi monitorada conforme indicado 10 pela liberação de interleucina (IL) -8. Varias diferentes moléculas de RNA foram testadas. RNA transcrito sem modificações, in vitro gerou um elevado nível de secreção de IL-8. RNA contendo modificações de nucleosídeo m6A ou s2U, em contraste, não induziu a secreção detectável de IL-8 (Figura 7B). As outras modificações de nucleosídeo testadas (ou seja, m5C, m5U, Ψ e mSC/Ψ) tinham um menor efeito supressivo sobre estimulação de TLR3 (Figura 7B). Ψ refere-se a pseudouridina.

Assim, modificações de nucleosídeos como m⁶A S²U, m⁵C, m⁵U, Ψ, reduzem a imunogenicidade de RNA conforme mediado por sinalização de TLR3.

EXEMPLO 7

RNA TRANSCRITA IN VITRO ESTIMULA TLR7 E TLR8 HUMANOS, E MODIFICAÇÕES DE NUCLEOSÍDEO REDUZEM A IMUNOGENICIDADE DE RNA

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Para testar a possibilidade que 293 expressa TLR3 endógeno que interfere com a avaliação dos efeitos do RNA em receptores específicos de TLR, a expressão de TLR3 endógeno foi eliminada da linhagem de células 293-TLR8 por estavelmente transfectando conforme as células com um plasmídeo expressando RNA tipo hairpin curto (sh)RNA específico para TLR3 (também conhecido como siRNA). Esta linhagem de células foi usada para um estudo mais aprofundado, uma vez que ele não respondeu a poli(I):(C), LPS, e oligodeoxinucleotídeos contendo CpG (ODNs), indicando a ausência de TLR3, TLR4 e TLR9, mas não responde a R-848, o ligante cognato de TLR8 humano (Figura 7B). Quando as células 293-hTLR8 que expressam shRNA marcado para TLR3 (células 293-hTLR8 shRNATLR3) foram transfectados com RNA transcrito in vitro, secretaram grandes quantidades de IL-8. Por contraste, o RNA contendo a maior parte das modificações de nucleosídeo (m⁵C, m⁵U, Ψ, e m⁵C/T, S²U) eliminou a estimulação (não mais a produção de IL-8 do que o controle negativo, ou seja, vetor vazio). A modificação m6A teve um efeito variável, em alguns casos eliminando e em outros casos reduzindo a liberação de IL-8 (Figura 7B).

Os resultados deste Exemplo e o Exemplo anterior mostram que (a) RNA com ligações naturais fosfodiéster inter-nucleotídeos (por exemplo RNA transcrito in vitro) estimula TLR3, TLR7 e TLR8 humanos; e (b) modificações de nucleosídeos como m6A, m5C, m5U, s2U e Ψ, isolados ou em combinação, reduzem a imunogenicidade de RNA conforme mediado por sinalização de TLR3, TLR7 e TLR8. Além disso, estes resultados fornecer um novo sistema para estudar a sinalização por receptores de TLR específicos.

EXEMPLO 8

MODIFICAÇÕES DE NUCLEOSÍDEOS REDUZEM A IMUNOGENICIDADE DE RNA CONFORME MEDIADO POR SINALIZAÇÃO DE TLR7 E TLR8

O próximo conjunto de experimentos testou a capacidade do RNA isolado de fontes naturais em estimular TLR3, TLR7 e TLR8. RNA a partir de diferentes espécies de mamíferos foram transfectados em linhagens de células 293 que expressam TLR3, TLR7 e TLR8 conforme descrito no exemplo anterior. Nenhuma das amostras de RNA de mamíferos induziu a secreção de IL-8 acima do nível do controle negativo. Por outro lado, RNA bacteriano total obtido a partir de duas fontes diferentes de E. coli induziu robusta secreção de IL-8 em células transfectadas com TLR3, TLR7 e TLR8, mas não TLR9 (Figura 7C). Nenm DNA LPS nem não metilado (CpG ODN) (os contaminantes potenciais em isolados de RNA bacteriano)

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103/141 ativou os testados TLR3, TLR7 ou TLR8. RNA mitocondrial isolado de plaquetas humanas estimulou TLR8, mas não TLR3 ou TLR7.

Estes resultados demonstram que RNA bacteriano e transcrito in vitro não modificado são ativadores de TLR3, TLR7 e TLR8, e RNA mitocondrial estimula TLR8. Além disso, esses resultados confirmam a constatação que modificação de nucleosídeo do RNA diminui sua capacidade de estimular TLR3, TLR7 e TLR8.

EXEMPLO 9

MODIFICAÇÕES DE NUCLEOSÍDEOS REDUZE A CAPACIDADE DO RNA EM INDUZIR A SECREÇÃO DE CITOCINA E ATIVAÇÃO DE MARCADOR DE EXPRESSÃO POR DC

MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Ensaios de estimulação de DC

Após 20 h de incubação com RNA, DCs foram corados com CD83-ficoeritrina mAb (Research Diagnostics Inc, Flanders, NJ), HLA-DR-Cy5PE, e CD80 ou CD86-isotiocianato de fluoresceína mAb e analisados em um citometro de fluxos FACScalibur® usando CellQuest® software (BD Biosciences). Sobrenadantes de cultura de células foram colhidos no final de uma incubação de 20h e submetidos a citocina ELISA. Os níveis de IL-12 (p70) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), IFN-α, e TNF-α (Biosource International, Camarillo, CA) foram medidos em sobrenadantes por ELISA. As culturas foram realizadas em triplicata ou quadruplicata e cada amostra foi medida em duplicata.

RESULTADOS

Os experimentos seguintes testaram a capacidade do RNA contendo nucloesídeos modificados ou não modificados de estimular MDDC gerado por citocina. Modificações de nucleosídeos de forma reprodutíveis diminuem a capacidade de 5 RNA para induzir a secreção de TNF-α e IL-12 por MDDC gerado em GM-CSF/IL-4 e MDCC gerado por (GMCSF)/ IFNα, na maioria dos casos para níveis não mais que o controle negativo (Figuras 8A e B). Os resultados foram semelhantes quando outros conjuntos de RNA com as mesmas modificações de base mas diferentes sequências primárias e comprimentos foram testados, ou quando o RNA foi ainda modificado por adição de estrutura 5' capa e/ou cauda poliA na extremidade 3' ou removendo a fração 5' trifosfato. RNAs de comprimentos e sequência diferentes induziram

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104/141 quantidades variadas de TNF-α a partir de DC, tipicamente menos do que uma diferença de duas vezes (Figura 8C).

Em seguida o ensaio foi realizado em DC1 e DC2 primário. O monocitoide primário (DCI, BDCA1⁺) e plasmacitoide (DC2, BDCA4⁺) DC foram purificados a partir de sangue periférico. Ambos os tipos de células produziram TNF-α quando expostos a R-848, mas somente DC1 respondeu a poli(I):(C), em um nível muito baixo, indicando a ausência de atividade TLR3 em DC2. A transfecção de transcritos in vitro induziu secreção de TNF-α em ambos DC1 e DC2, enquanto m5U, Ψ ou s2U-transcritos modificados não foram estimulatórios (Figura 8D). Em contraste ao DC gerado por citocina, modificações m5C e m6A de RNA não diminuíram sua capacidade estimulatória em DC1 e DC2 primários. Os transcritos com dupla modificação ιη6Λ/Ψ foram não estimulatórios, enquanto uma mistura de moléculas de RNA com tipo único de modificação (móA+Ψ) foi um potenteo indutor de citocina. Assim, modificação de uridina exerceu um efeito supressivo dominante em uma molécula de RNA in cis em DC primário. Estes resultados foram consistentes entre todos os doadores testados.

Estes achados mostram que o RNA transcrito in vitro estimula a produção de citocina por DC. Além disso, uma vez que DC2 não expressa TLR3 ou TLR8, e a modificação m5C e m6A de RNA reduziu sua capacidade estimulatória de TLR7, estes achados mostram que DC primário tem uma entidade de sinalização de RNA adicional que reconhece a modificação de RNA m5C- e m6A- e cuja sinalização é inibida por modificação de resíduos de U.

Conforme indicadores adicionais de imunogenicidade, a expressão de superfície celular de moléculas de CD80, CD83, CD86 e MHC classe II, e a secreção de TNF-α foram medidos por análise FACS de MDDC tratado com RNA-1571 e suas versões modificadas. A modificação de RNA com pseudouridina e nucleosídeos modificados (m5C, m6A, s2U e mOA/'!') reduziu estes marcadores (Figura 9), confirmando os achados anteriores.

Em resumo, a capacidade de RNA em induzir DCs a amadurecer e secretar citocinas depende do subtipo de DC bem como das características da modificação de nucleosídeo presente no RNA. Uma quantidade crescente de modificação diminui a imunogenicidade do RNA.

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EXEMPLO 10

SUPRESSÃO DE ESTIMULAÇÃO IMUNE MEDIADA POR RNA É PROPORCIONAL AO NÚMERO DE NUCLEOSÍDEOS MODIFICADOS PRESENTE NO RNA

MATERIAIS EMÉTODOS EXPERIMENTAIS

DC humano

Para citocina gerada por DC, monócitos foram purificados a partir de PBMC por centrifugação de gradiente Percoll descontínuo. A fração de baixa densidade (enriquecida em monócito) foi depletada de células B, T, e NK usando pérolas magnéticas (Dynal, Lake Success, NY) específicas para CD2, CD16, CD19, e CD56, rendendo monócitos altamente purificados conforme determinado por citometria de fluxo usando mAb anti-CD14 (>95%) ou antiCD11c (>98%).

Para gerar DC imaturos, monócitos purificados foram cultivados em meio AIM V isento de soro (Life Technologies), complementado com GM-CSF (50 ng/ml) + IL-4 (100 ng/ml) (R & D Systems, Minneapolis, MN) em meio AIM V (Invitrogen) para a geração de monócito derivado de DC (MDDC) conforme descrito (Weissman, D et al, 2000. J Immunol 165: 4710-4717). DC foram ainda gerados pelo tratamento com GM-CSF (50 ng/ml) + IFN-α (1,000 V/ml) (R & D Systems) para obter IFN-α MDDC (Santini et al., 2000. Type I interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity in vitro and in Hu-PBL-SCID mice. J Exp Med 191: 1777-178).

Mieloide primário e plasmacitoide DCs (DC1 e DC2) foram obtidos de sangue periférico usando kits de isolamento de células BDCA-l e BDCA-4 (Miltenyi Biotec Auburn, CA), respectivamente.

RESULTADOS

A maior parte do RNA com nucleosídeo modificado utilizado continha, assim, um tipo de modificação que ocorre em aproximadamente 25% dos nucleotídeos nucleoside no RNA (por exemplo todas as bases uridina). Para definir a frequência mínima de modificações de nucleosídeos particulares que é suficiente para reduzir a imunogenicidade nas condições utilizadas aqui, as moléculas de RNA com números limitados de nucleosídeos modificados foram geradas. No primeiro conjunto de experimentos, o RNA foi transcrito in vitro na presença de proporções variadas de m6A, Ψ (pseudouridina) ou m5C aos seus NTPs

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106/141 correspondentes não modificados. A quantidade de incorporação de nucleosídeos modificados fosfatos em RNA foi esperada como sendo proporcionao à proporção contida na reação de transcrição, uma vez que os rendimentos de RNA obtidos com T7 RNAP mostraram que a enzima utiliza NTPs de m6A, Ψ ou m5C quase tao eficientemente como os NTPs básicos. Para confirmar esta expectativa, o RNA transcrito na presença de UTP^ em uma proporção 50:50 foi digerido e demonstrou conter UMP e Ψ em uma proporção quase 50:50 (Figura 10A).

As moléculas de RNA com teores crescentes de nucleosídeos modificados foram transfectados em MDDC, e a secreção de TNF-α foi avaliada. Cada modificação (m6A, Ψ e m5C) inibiu a secreção de TNF-α proporcionalmente à fração das bases modificadas. Mesmo as menores quantidades de bases modificadas testadas (0,2-0,4%, correspondente a 3-6 nucleosídeos modificados por molécula 1571 nt), foi suficiente para de forma mensurável inibir a secreção de citocina (Figura 10B). RNA com 1,7-3,2% de níveis de nucleosídeo modificados (14-29 modificações por molécula) apresentou uma redução de 50% na indução de expressão de TNF-α. Nas células 293 que expressam TLR, um percentual maior (2,5%) de teor de nucleosídeo modificado foi requerido para inibir eventos de sinalização medidos por RNA.

Assim, pseudouridina e nucleosídeos modificados reduzem a imunogenicidade de moléculas de RNA, mesmo quando presenets como uma fração pequena de resíduos.

Em experimentos adicionais, 21-mer oligorribonucleotídeos (ORN) com ligações fosfodiéster inter-nucleotídeos foram sintetizados em que os nucleosídeos modificados (m5C, Ψ ou 2'-O-metil-U [Um]) foram substituídos em uma posição particular (Figura 11A). Enquanto o ORN não modificado induziu a secreção de TNF-α, ete efeito foi abolido na presença de uma única modificação de nucleosídeo (Figura 11B). Resultados semelhantes foram obtidos com TLR-7 e TLR-8 células 293 transformadas que expressam siRNA marcado para TLR3.

Os resultados acima foram confirmados medindo os níveis de TNF-α mRNA em MDDC por ensaio de Northern blot, usando ambos transcritos sintetizados in vitro 21-mer ORN (ORN1) e 31-mer acima (ORN5 e ORN6). Para amplificar o sinal, cicloheximida, que bloqueia a degradação de mRNAs selecionados, foi adicionado a algumas amostras, conforme indicado na Figura. O ODN não modificado aumentou os níveis de TNF-α mRNA, enquanto

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ORNs contendo um único nucleosídeo modificado foram significativamente menos estimulatórios; ORN2-Um apresentam a maior diminuição de produção de TNF-α (Figura 11C). Resultados semelhantes foram observados em células RAW tipo macrófago de camundongos e em DC humanas.

Em resumo, cada uma das modificações testadas (m6A, m5C, m5U, s2U, Ψ e 2'-Ometil) suprimiram estimulação imune mediada por RNA, mesmo quando presente em uma fração pequena de resíduos. Outra supressão foi observada quando a proprocao de nucleosídeos modificados foi aumentada.

EXEMPLO 11

MODIFICAÇÃO DE PSEUDOURIDINA DE RNA REDUZ SUA IMUNOGENICIDADE IN VIVO

Para determinar o efeito de modificação de pseudouridina em imunogenicidade de RNA in vivo, 0,25 iig RNA) foi complexado a Lipofectin® e injetado por via intratraqueal em camundongos, camundongos foram sangrados 24 h após, e os níveis circulantes de TNF-α e IFN-α foram avaliados a partir de amostras de soro. mRNA capeada modificada em pseudouridina induziu significativamente menos TNF-α. e IFN-α mRNA do que foi estimulado por mRNA não modificado (Figura 12A-B).

Estes resultados fornecem evidência de que mRNA modificado em pseudouridina é significativamente menos imunogênico in vivo do RNA não modificado.

EXEMPLO 12

RNA CONTENDO PSEUDOURIDINA APRESENTA CAPACIDADE

REDUZIDA EM ATIVAR PRK

MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Ensaios de fosforilação de PKR

Alíquotas de PKR agarose ativa (Upstate) foram incubadas na presença de coquetel de magnésio /ATP (Upstate), tampão quinase e mix ATP [gama³²p] e moléculas de RNA por 30 min a 30°C. RNA não modificado e RNA com modificação de nucleosídeo (m5C, pseudouridina, m6A, m5U) e dsRNA foram testados. eIF2a humano recombinante (BioSource) foi adicionado, e amostras foram ainda incubadas por 5 min, 30°C. As reações foram interrompidas adicionando NuPage LDS tampão de amostra com reagente redutor (Invitrogen), desnaturado por 10 min, 70° C, e analisado em 10% PAGE. Os géis foram secos

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108/141 e expostos ao filme. Heparina (l U/μΙ), um ativador de PKR, foi usado como um controle positivo.

RESULTADOS

Para determinar se o mRnA contendo pseudouridina ativa proteína quinase dependente de dsRNA (PKR), ensaios de fosforilação in vitro foram realizados usando PKR humana recombinante e seu substrato, eIF2a (fator 2 alfa de iniciação eucariótica) na presença de mRNA capeado que codifica renilla (0,5 e 0,05 ng/μ^. mRNA contendo pseudouridina (Ψ) não ativou PKR, conforme detectado pela falta de ambos auto-fosforilação de PKR e fosforilação de efF2u, enquanto o RNA sem modificação de nucleosídeo e mRNA com modificação m⁵C ativou PKR (Figura 13). Assim, modificação de pseudouridina diminreduz imunogenicidade de RNA.

EXEMPLO 13

TRADUÇÃO AUMENTADA DE PROTEÍNAS A PARTIR DE RNA CONTENDO PSEUDOURIDINA E m⁵C IN VITRO

MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Tradução in vitro de mRNA em lisado de reticulócito de coelho

A tradução in vitro foi realizada em lisado de reticulócito de coelho (Promega, Madison WI). Uma alíquota de 9 μl do lisado foi complementada com 1 μl (1 μg) mRNA e incubada por 60 min a 30°C. Uma alíquota de um μl foi removida para análise usando sistemas de ensaio de firefly e renilla (Promega, Madison WI), e um luminômetro LUMAT LB 950 (Berthold/EG&G Wallac, Gaithersburg, MD) com um tempo de medição de 10 segundos.

RESULTADOS

Para determinar o efeito da modificação de pseudouridina em eficiência de tradução de RNA in vitro, (0,1 μg/μl) mRNA não capeado modificado com pseudouridina que codifica luciferase de vaga-lume foi incubado no lisado de reticulócito de coelho por 1 h a 30°C, e a atividade de luciferase foi determinada. mRNA contendo pseudouridina foi traduzida mais do que 2 vezes mais eficientemente do que RNA sem pseudouridina no lisado de reticulócito de coelhos, mas não em extrato de trigo ou lisado de E. coli (Figura 14), mostrando que a modificação de pseudouridina aumento a eficiência de tradução de RNA. Resultados semelhantes foram obtidos com m⁵C-modificado RNA. Quando uma cauda poliA foi

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109/141 adicionada a mRNA contendo pseudouridina, outras 10 vezes de aumento na eficiência de tradução foi observada. (Exemplo 10).

Assim, modificação de pseudouridina e m⁵C aumenta a eficiência de tradução de RNA, e a adição de uma cauda poliA ao mRNA contendo pseudouridina ainda aumenta a eficiência de tradução.

EXEMPLO 14

TRADUÇÃO MELHORADA DE PROTEÍNAS A PARTIR DE RNA CONTENDO PSEUDOURIDINA NAS CÉLULAS CULTIVADAS

MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Ensaios de tradução em células

As placas com 96 poços foram semeadas com 5 x 10⁴ células por poço 1 dia antes da transfecção. Complexos Lipofectin®-mRNA foram montados e adicionados diretamente às monocamadas de células após remocao do meio de cultura (0,2 pg mRNA-0,8 pg lipofectina em 50 pl por poço). As células foram incubadas com a mistura de transfecção por 1 h a 37°C, 5% CO2 incubador, em seguida a mistura foi substituída com meio fresco préaquecido contendo 10% FCS, em seguida as células foram analisadas conforme descrito no Exemplo anterior.

RESULTADOS

Para determinar o efeito da modificação de pseudouridina em tradução de RNA em células cultivadas, as células 293 foram transfectadas com mRNA transcrito in vitro capeado com nucleosídeo modificado que codifica a proteína repórter renilla. As células foram lisadas 3 h após o início da transfecção, e os níveis de renilla foram removidos por ensaios enzimáticos. Nas células 293, DNA modificado por pseudouridina e m5C foram traduzidos quase 10 vezes e 4 vezes mais eficientemente, respectivamente, do que mRNA não modificado (Figura l5A).

Em seguida, o experimento foi realizado com DC de camundongo derivado de medula óssea primária, neste caso lisando as células 3 h e 8 h após transfecção. RNA contendo a modificação de pseudouridina foi traduzido 15-30 vezes mais eficientemente do que RNA não modificado (Figura 15B).

Resultados de expressão semelhantes foram obtidos usando DC humano e outras células primárias e linhagens de células estabelecidas, incluindo CHO e células RAW tipo

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110/141 macrófago de camundongo. Em todos os tipos de células, modificação de pseudouridina produziu o melhor aprimoramento das modificações testadas.

Assim, modificação de pseudouridina aumentaram a eficiência de tradução de RNA em todos os tipos de células testadas, incluindo diferentes tipos de ambas as células apresentadores de antígenos profissionais e células apresentadoras de antígenos não profissionais, fornecendo outra evidência de que a modificação de pseudouridina aumenta a eficiência de tradução de RNA.

EXEMPLO 15

ELEMENTOS 5' E 3' AINDA MELHORAM A TRADUÇÃO DE TmRNA EM CÉLULAS MAMÍFERAS

Para testar o efeito de elementos estruturas adicionais de RNA na melhora da tradução por modificação de pseudouridina, um conjunto de ymRNAs que codifica luciferase foi sintetizado que continha combinações das seguintes modificações: 1) uma única sequência 5' não traduzida (TEV, um potencializado de tradução independente de capa), 2) capa e 3) cauda poliA. A capacidade destas modificações em melhorar a tradução de ymRNA ou mRNA convencional foi avaliada (Figura 16A). Estes elementos estruturais aditivamente melhoraram a eficiência de tradução de ambos convencionais ymRNA, com ymRNA apresentando melhor produção de proteína de todos os constructos.

A capacidade de expressão da proteína a partir do constructo ymRNA eficiente de luciferase de vaga-lume, capTEVlucA50 (contendo TEV, capa, e uma cauda estendida poli(A)) foi em seguida avaliada por 24 horas nas células 293 (Figura 16B). ymRNA produziu mais proteína em cada ponto de tempo testado e conferiu expressão mais persistente de luciferase do que constructos equivalentes de mRNA convencional, mostrando que as ψmodificações estabilizam mRNA.

Para testar se a ψ-modificação de mRNA melhorou a eficiência de tradução em células de mamíferos in situ, constructos caplacZ^mRNA com ou sem caudas estendidas de poliA (An) e que codificam β-galactosidase (lacZ) foram gerados e usados para transfectar células 293 . 24 h após liberação de mRNA, aumento significativo em níveis de β-galactosidase foram detectados por visualização X-gal, em ambas caplacZ e caplacZ-An, comparado ao controle correspondente (convencional) de transcritos (Figura 16C). Esta tendência foi observada

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111/141 quando o número de células que expressa níveis detectáveis de β-galactosidase ou a magnitude de sinal em células individuais foi analisado.

EXEMPLO 13

TRADUÇÃO MELHORADA DE PROTEÍNAS A PARTIR DE RNA CONTENDO PSEUDOURIDINA IN VIVO MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Injeções intracerebrais de RNA

Todos os procedimentos animais estavam de acordo com NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals e aprovados por Institutional Animal Care e Use Committee. Ratos machos Wistar (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (60 mg/kg peso corporal). As cabeças foram colocadas em uma moldura estereotáxicas, e oito orifícios uniformemente espaçados de 1,5 mm de diâmetro foram feitos bilateralmente (coordenatos em relação ao bregma: anterior/posterior +3,0, -3, -6 mm; lateral ±2,5 mm) deixando a dura intacta. Injeções intracerebrais foram feitas usando uma seringa 25 pl (Hamilton, Reno, NV) com 30 gauge, agulha estéril de 1 polegada (Beckton 25 Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) que foi fixada a um suporte de sonda grande e braço estereotáxico. Para evitar espaço de ar na seringa, o cubo da agulha foi preenchido com 55 pl de complexo antes de a agulha ser acoplada, e o restante da amostra foi retirada através da agulha. A profundidade da injeção (2 mm) foi determinada em relação à superfície da dura, e 4 pl de complexo (32 ng mRNA) foram administrados em uma infusão única rápida em bolus. 3 horas (h) depois, os ratos foram sacrificados halotano, e os cérebros foram removidos em salina fosfato tamponada resfriada.

Injeção de RNA na veia da cauda do camundongo

As veias da cauda de camundongos fêmeas BALB/c (Charles River Laboratories) foram injetados (bolus) com 60 pl RNA complexado com Lipofectin® (0,26 pg). Os órgãos foram removidos e homogeneizados em tampão de lise de luciferase ou Renilla em tubos de microcentrífuga usando um pilão. Os homogenados foram centrifugados e os sobrenadantes foram analisados para a atividade.

Liberação de RNA para o pulmão

Camundongos fêmeas BALB/c foram anestesiados usando cetamina (l00 mg/kg) e xilasina (20 mg/kg). Pequenas incisões foram feitas na pele adjacente a traqueia. Quando a

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112/141 traqueia foi exposta, 501-11 de RNA complexado com Lipofectin® (0,2 pg) foram instilados na traqueia na direção do pulmão. As incisões foram fechadas e os animais foram deixados para recuperar. 3 horas após a liberação do RNA, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e os pulmões foram removidos, homogeneizados em tampão de lise de luciferase ou Renilla (250 μ1), e avalidos para atividade. Em um conjunto diferente de animais, amostras de sangue (100 μl/animal) foram coletadas a partir de veias da cauda, coaguladas e centrifugadas. As frações do soro foram usadas para determinar os níveis de TNF e IFNa por ELISA conforme descrito nos Exemplos acima, usando anticorpos específicos de camundongos.

RESULTADOS

Para determinar o efeito de modificação de pseudouridina na tradução de RNA in vivo, cada hemisfério dos cortexes do cérebro do rato foi injetado com RNA capeado modificado por pseudouridina que codifica renilla ou RNA não modificado, e a tradução do RNA foi medida. RNA modificado por pseudouridina foi traduzido significativamente mais eficientemente do que RNA não modificado (Figura 17A). Em seguida estudos de expressão foram realizados em camundongos. mRNAs codificam luciferase de vaga-lume porque nenhuma enzima mamífera endógena interfere com sua detecção. Os transcritos (não modificado e ymRNA) foram construídos capa, TEV (capTEVA50) e caudas estendidas de (200 nt) poli(A). 0,25 μg de RNA Lipofectin®-complexada foi injetado em camundongos (intravenosa (i.v.) na veia da cauda). Uma gama de órgãos foi pesquisada para atividade de luciferase para determinar o sítio ótimo de medição. A administração de 0,3 μg capTEVlucAn ymRNA induziu alta expressão de luciferase em baço e expressão moderada em medula óssea, mas pouca expressão em pulmão, fígado, coração, rim ou cérebro (Figura 17B). Em estudos subsequentes, os baços foram estudados.

As eficiências de tradução de mRNA convencional e ψ (0,015 mg/kg; 0,3 pg/animal administrados por via intravenosa) foram sem seguida comparados em experimentos de curso de tempo. A atividade de luciferase foi prontamente detectável em 1 h, com pico em 4 h e declinou em 24 h após administrada do mRNA convencional ou ψ, mas todas as vezes foi substancialmente maior em animais que receberam ψmRNA (Figura 17C, quadro à esquerda). Em 24 h, somente animais injetados com ψmRNA demonstraram atividade de luciferase esplênica (4 vezes acima do background). Um padrão relativo semelhante de expressão (entre

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113/141 mRNA modificado e não modificado) foi obtido quando mRNAs que codificam Renilla luciferase (capRen com ou sem modificações ψ) foram injetados nos animais ao invés de luciferase de vaga-lume, ou quando esplenócitos isolados de camundongos foram expostos ao mRNA em cultura.

No experimento seguinte, 0,25 pg de mRNA-Lipofectin® foi liberado aos pulmões do camundongo por injeção intratraqueal. RNA capeado pseudouridina-modificado foi traduzido de modo mais eficientemente do que RNA capeado sem modificação de pseudouridina (Figura 17D).

Assim, modificação de pseudouridina aumenta a eficiência de tradução de RNA in vitro, em células cultivadas, e modelos de vários animais in vivo e por diversas vias de administração, mostrando sua ampla aplicação como um meiod e aumentar a eficiência de tradução de RNA.

EXEMPLO 17

MODIFICAÇÃO DE PSEUDOURIDINA MELHORA A ESTABILIDADE DE RNA IN VIVO

Análise de Northern de RNA esplênico em 1 e 4 h após a injeção nos animais do Exemplo anterior revelou que os mRNAs adminsitrados, em suas formas intactas e parcialmente degradados, foram prontamente detectáveis (Figura 17C, quadro à direita). Em contraste, em 24 h, mRNA capTEVlucAn não modificado foi abaixo do nível de detecção, enquanto que capTEVlucAn ψmRNA, embora parcialmente degradado, ainda estava claramente detectável. Assim, ψmRNA é mais estavelmente preservado in vivo do que o mRNA controle.

Para testar se a produção de proteína in vivo é quantitativamente dependente da concentração de mRNA liberado por via intravenosa, mRNAs foram administrados aos camundongos em 0,015-0.150 mg/kg (0,3-3.0 pg capTEVlucAn por animal) e os baços foram analisados 6 horas após conforme descrito acima. A expressão de luciferase se correlacionou quantitativamente com a quantidade de RNA injetado (Figura 18) e em cada concentração.

Estes achados confirmam os resultados do Exemplo 15, que demonstram que ψmRNA é mais estável do que RNA não modificado. Ainda a imunogenicidade de ψ-mRNA foi menor do que RNA não modificado, conforme descrito aqui acima (Figura 12 e Figura 17C, quadro à direita).

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Para resumir os Exemplos 16-17, as 3 vantagens de ψ-mRNA comparado com mRNA convencional (tradução melhorada, estabilidade aumentada e imunogenicidade reduzida) observadas in vitro são ainda observadas in vivo.

EXEMPLO 18

TmRNA LIBERADO ATRAVÉS DO TRATO RESPIRATÓRIO SE COMPORTA DE MODO SEMELHANTE AO mRNA ADMINISTRADO POR VIA INTRAVENOSA

Para testar a capacidade de ψmRNA em ser liberado por inalação, mRNAs Lipofectin®-ou PEI-complexados que codificam luciferase de vaga-lume foram liberados aos camundongos por via intratraqueal, emq eu uma agulha foi colocada na traqueia e a solução de mRNA dispersa nos pulmões. Semelhante à liberação intravenosa, a expressão significativamente maior de luciferase foi observada com ψmRNA comparado a mRNA não modificado (Figura 19), embora significativamente menores proteína foi produzida com a intratraqueal conforme comparado às vias intravenosas. mRNA não modificado administrado por via intratraqueal foi associado com concentrações significativamente maiores de citocinas inflamatórias (IFN-α e TNF-α) comparado com controle de veículo, enquanto ψmRNA não foi (Figura 19).

Assim, ψmRNA pode ser liberado por inalação sem ativar a resposta imune inata.

EXEMPLO 19

LIBERAÇÃO DE EPO-TmRNA ÀS CÉLULAS 293 ψmRNA foi gerado a partir do plasmídeo contendo o cDNA de EPO humana. Quando 0,25 pg de EPO^mRNA foi transfectada em 10⁶ células 293 cultivadas, mais do que 600 mU/ml de proteína EPO foi produzida. Assim, moléculas modificadas de RNA da presente invenção são eficazes em liberar proteínas recombinantes às células.

EXEMPLO 20

PREPARAÇÃO DE CONSTRUCTOS DE TmRNA QUE CODIFICAM EPO MELHORADA

MATERIAIS EMÉTODOS EXPERIMENTAIS

Esta sequência de codificação de EPO é clonada usando as técnicas de enzimas de restrição para gerar 2 novos plasmídeos, pTEV-EPO e pT7TS-EPO, que são uados como moldes para produção de EPO^mRNA. EPO^mRNAs são produzidos a partir destes moldes

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115/141 por transcrição in vitro (MessageMachine® and MegaScript® kits; Ambion,) usando T7 RNA polimerase (RNAP), incorporando nucleosídeo em concentrações equimolares (7,5mM). Para incorporar as modificações de nucleosídeo, ψ trifosfato (TriLink, San Diego, CA) substitui UTP na reação de transcrição. Para garantir o capeamento do ψmRNA, um análogo de capa não reversível, 6 mM 3'-O-Me-m7GpppG (New England BioLabs, Beverly, MA) é ainda incluído. Os ψmRNAs são poli(A)-caudais em uma reação de ~1,5 pg/pl RNA,5 mM ATP, e 60 U/p1 poli(A) polimerase de levedura (USB, Cleveland, OH) misturados a 30°C por 3 a 24 h. A qualidade de ψmRNAs é avaliada pela desnaturação em eletroforese de gel agarose. Os ensaios para LPS em preparações de mRNA usando o ensaio Limulus Amebocyte Lysate gel clot com uma sensibilidade de 3 pg/ml são ainda realizados.

RESULTADOS

A região proximal 3' não traduzida (3'UTR) de EPO^mRNA preserva um elemento estabilizante de comprimento ~90 nt rico em pirimidina do mRNA nascente de EPO, que estabiliza EPO mRNA por associação específica com uma proteína ubíqua, proteína de ligação de eritropoetina mRNA (ERBP). Para maximizar a estabilidade de EPO^mRNA, 2 alterações são incorporadas em plasmídeo EPO para melhorar a estabilidade e eficiência de tradução do mRNA transcrito: 1) Uma sequência 5'UTR de vírus tobacco etch (TEV) é incorporada upstream da sequência de codificação de EPO para gerar pTEV-EPO. 2) Um plasmídeo, pT7TS-EPO, é gerado, em que a EPO cDNA é flanqueado por sequências correspondendo a 5' e 3' UTRs de Xenopus beta-globina mRNA.

Além disso, o comprimento de cauda poli(A) durante a produção de ψmRNA a partir destes moldes de plasmídeo é estedido, aumentando o período de incubação da reação de poli(A) polimerase. A cauda poli(A) maior diminui a taxa em que ψmRNA se degrada durante a tradução.

Estas melhoras resultam em eficiência de tradução aumentada in vivo, assim minimizando a dose terapêutica do produto final.

EXEMPLO 21

ANÁLISES IN VITRO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA A PARTIR DE CONSTRUCTOS DE mRNA EPO

MATERIAIS EMÉTODOS EXPERIMENTAIS

Preparação de células mamíferas.

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Células renas embrionárias humanas 293 (ATCC) foram propagadas em DMEM complementado com glutamina (Invitrogen) e 10% FCS (Hyclone, Ogden, UT) (meio completo). Amostras de leucoferese são obtidas de voluntários infectados por HIV através de um protocolo aprovado pelo IRB. DCs são produzidos conforme descrito acima e cultivados com GM-CSF (50 ng/ml) + IL-4 (100 ng/ml) (R & D Systems) em um meio AIM V ® (Invitrogen).

Células de fígados de murinho e DC são obtidas por procedimentos publicados. Resumidamente, os baços de camundongos BALB/c são assepticamente removidos e picados com fórceps em meio completo. Fragmentos de tecido são sedimentados por gravidade e a suspensão de células únicas lavada e lisada com tampão de lise AKC (Sigma). DCs murinos são derivados de células de medula óssea coletadas de fêmures e tíbia de camundongos BALB/c de 6-9-semanas de idade. As células são cultivadas em DMEM contendo 10% FCS (Invitrogen) e 50 ng/ml muGM-CSF (R&D) e usados no dia 7.

Transfecção de células e detecção de EPO e citocinas pró-inflamatórias

As transfecções são realizadas Lipofectina na presença de tampão fosfato, um método de liberação efetivo para expressão de célula esplênica e in vitro. EPO-ymRNA (0,25 pg/poço; 100.000 células) é adicionado a cada tipo de célula em triplicata por 1 hora e o sobrenadante substituído com meio fresco. 24 horas depois, o sobrenadante é coletado para medição por ELISA de EPO, IFN-α ou β e TNF-α.

RESULTADOS

Para avaliar o impacto de UTRs únicos na melhora de eficiência de tradução de ymRNA, EPO-ymRNA contendo, ou não contendo, cada melhora (elemento 5' TEV, (βglobina 5' e 3' UTRs) com caudas longas de poli(A) são testadas para produção de proteína in vitro e ativação imune in vitro usando EPO mRNA contendo nucleosídeos convencionais conforme os controles. A eficiência de produção de proteína a partir de cada mRNA é avaliada em linhagens de células mamíferas, (HEK293, CHO), DCs humanos e murinos primárias, e células de baço para cada mRNA. A medida de EPO total produzido em todos os tipos celulares e a imunogenicidade (citocinas pró-inflamatórias associadas ao sobreanadante) em células primárias é avaliada. O constructo de mRNA que demonstra a combinação ideal de alta produção de EPO (em 1 ou mais tipos celulares) e baixa estimulação de citocina é usado em estudos subsequentes. Melhorias em 5' e 3'UTRs de EPO-wmRNA e caudas maiores de

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117/141 poli(A) resulta em uma melhora estimada de 2-10 vezes na eficiência de tradução, com nenhum aumento na imunogenicidade.

EXEMPLO 22

CARACTERIZAÇÃO DE PRODUÇÃO DE EPO E RESPOSTA BIOLÓGICA PARA EPO-ψ mRNA IN VIVO

MATERIAIS EMÉTODOS EXPERIMENTAIS

Administração de EPO-ymRNA aos camundongos.

Todos os estudos animais descritos são realizados de acordo com NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals e aprovados por Institutional Animal Care e Use Committee da University of Pennsylvania. Camundongos fêmeas BALB/c (n=5 por condição experimental; 6 semanas, 18-23 g; Charles River Laboratories) são anestesiados usando 3,5% halotano em uma mistura de N2O e O2 (70:30), em seguida halotano reduziu a 1% e anestesia foi mantida usando uma máscara nasal. Temperaturas do corpo do animal são mantidas ao longo de todo o procedimento usando uma almofada aquecedora aquecida a 37°C. Complexos EPO-ymRNA-lipofectina (construídos por mistura de quantidades variantes de ácido nucleico com 1 pl de lipofectina em um volume final de 60 pl são injetados em uma veia lateral da cauda. As amostras de sangue são coletadas 3 vezes por dia por 3 dias após a injeção de mRNA durante o tempo de curso do estudo, em um ponto de tempo ideal em estudos de dose resposta, e diariamente a partir dos dias 2-6 nos estudos para reticulocitose.

Determinação de reticulócitos por citometria de fluxo.

Amostras de sangue total são coradas usando reagente Retic-COUNT (BD Diagnostics) e os dados dos eventos adquiridos em um citometro de fluxo FACScan. As hemácias (RBCs) são selecionadas por propriedades de dispersão direta e lateral e analisadas pra absorção de Laranja de Tiazol. As células coradas com reagente Retic-COUNT são detectadas por fluorescência e os reticulócitos expressos como o percentual de RBC total. Pelo menos 50.000 eventos são contados por amostra.

RESULTADOS

Para otimizar a produção de proteína EPO humana biologicamente funcional (hEPO) em resposta a mRNA que codifica EPO, os seguintes estudos são realizados:

Curso de tempo de produção de EPO após injeção única de EPO-wmRNA. Após administração intravenosa de 1 pg de EPO-ymRNA, hEPO é medida serialmente a partir de 1Petição 870180166239, de 21/12/2018, pág. 136/167

118/141 h após administração de EPO-ymRNA por ELISA, para determinar a meia-vida de proteína EPO no soro. Esta meia-vida é um resultado de ambas meia-vida de proteína EPO e a meiavida funcional de EPO-ymRNA. O ponto de tempo ideal resultante para medir a proteína EPO após administração de EPO-ymRNA é utilizado nos estudos subsequentes.

Dose-resposta de produção de EPO após injeção única de EPO-wmRNA. Para determinar a correlação entre a quantidade de proteína EPO produzida e a quantidade de EPOymRNA administrado, concentrações crescentes de EPO-ymRNA (0,01 a 1 pg/animal) são administradas e EPO é medida no ponto de tempo ideal.

Relação entre produção de hEPO e reticulócito. Para medir o efeito de EPO-ymRNA em um correlato biológico de atividade de EPO, a citometria de fluxo é usada para determinar a frequência de reticulócito no sangue). Citometria de fluxo tem um coeficiente de variação de < 3%. Camundongos recebem uma dose única de EPO-ymRNA, e o sangue é coletado de camundongos diariamente a partir dos dias 2-6. A relação entre a dose de EPO-ymRNA e frequência de reticulócito é então avaliada no ponto de tempo de reticulócito máximo. A dose de EPO-ymRNA que leva a pelo menos um aumento de 5% em contagem de reticulócito é usado nos estudos subsequentes. As concentrações séricas de hEPO em camundongos estimadas de 50 mU/ml e/ou um aumento na frequência de reticulócito de 5% estimados são obtidas.

EXEMPLO 23

MEDIÇÃO DE RESPOSTAS IMUNES A EPO^mRNA IN VIVO

MATERIAS EMÉTODOS EXPERIMENTAIS

Detecção de citocinas no plasma.

As amostras de soro obtidas do sangue coletado em diferentes vezes durante e após 7 administrações diárias de mRNA complexados com lipofectina são analisados para IFN-α, TNF-α, e IL-12 de camundongos usando kits ELISA.

Análise de Northern blot

Alíquotas (2,0 pg) de amostras de RNA isoladas de baço e separadas por 1,4% de eletroforese em gel de agarose desnaturante, transferidos para membranas carregadas (Schleicher and Schuell) e hibridizadas em MiracleHyb® (Stratagene). As membranas são sondadas para TNF-α, moléculas de sinalização down-stream de IFN (por exemplo IRF7, IL12 p35 e p40, e GAPDH) e outros marcadores de ativação imune. A especificidade de todas as

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119/141 sondas é confirmada por sequenciamento. Para sondar as membranas, 50 ng de DNA é marcado usando Redivue [alfa-³²P] dCTP® (Amersham) com um kit de marcadao de prime aleatório (Roche). As membranas hibridizadas são expostas a filme Kodak BioMax MS usando um MS intensificador screen a -70°C.

Histopatologia.

Os baços de camundongos tratados com EPO-ymRNAe tratados com controle positivo e negativo são colhidos, fixados, seccionados, corados com hematoxilina e eosina e avaliados por um patologista veterinário para sinais de ativação imune.

RESULTADOS

Para confirmar a imunogenicidade reduzida de moléculas de RNA da presente invenção, camundongos (n = 5) recebem diariamente doses de EPO-ymRNA por 7 dias, em seguida são avaliados para eventos adversos medidaos por imune, conforme indicado por concentrações séricas de citocina, a expressão esplênica de mRNAs que codifica proteínas inflamatórias, e avaliação patológica. As doses máximas administradas são 3 pg ou 5 x a dose única efetiva conforme determinados acima. mRNA não modificado e Lipofectin® sozinha são usadas como controles positivo e negativo, respectivamente.

Estes estudos confirmam que a imunogenicidade reduzida de moléculas de RNA da presente invenção.

EXEMPLO 24

OUTRA MELHORIA DE MÉTODOS DE LIBERAÇÃO DE EPO-quiRNA

Complexação de Nanopartícula.

Soluções de Polímero e ymRNA são misturadas para formar complexos. Várias condições de formulações são testadas e otimizadas: (1) sub-22 nm polietilenimina (PEI)/mRNA complexos são preparados pela adição de 25 volumes de mRNA a 1 volume de PEI em água sem mistura por 15 minutos. (2) o poli-L-lisina -polietileno glicol tipo haste (PLL-PEG) com dimensões médias de 12x150 nm é sintetizado por adição lenta de 9 volumes de mRNA a 1 volume de CK30-PEGl0k em tampão contraion de acetato enquanto vortexando. (3) para a síntese de polímero carreador de gene biodegradável, anidrido poliaspártico coetileno glicol (PAE) é sintetizado por abertura de anel de policondensação de N(Benziloxycarbonyl)L-aspártico anidrido e etileno glicol. Em seguida, a amina pendente de ácido aspártico é desprotegida e protonada por acidificação com cloreto de hidrogênio e

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120/141 condensado com mRNA. (4) Para a última geração de nanopartículas, estoque alíquota de CK30PEGi0k como acetato de amônio (1,25mL; 6,4mg/mL) é adicionado aos tupos de Eppendorf siliconizados. Em seguida mRNA é adicionado lentamente a CK30PEGl0k (2,5mg em 11,25mL RNase livre de H2O) por 1-2 mins. Após 15 mins, este é diluído 1:2 em RNaselivre de H2O.

Liberação Intratraqueal.

Os camundongos são anestesiados com 3% halotano (70% N2O + 30% O2) em uma câmara anestésica e mantido com 1% halotano (70% N2O + 30% O2) durante a operação com um cone nasal. A traqueia é exposta, e 50 pl de complexo mRNA é infundido com 150 pl de ar no pulmão através da traqueia usando 250 pl de seringa Hamilton (Hamilton, Reno, NV) com uma agulha 27 G 1/2.

RESULTADOS

Para melhorar a eficiência de liberação e expressão de ymRNA administrado via intratraqueal (i.t.), ymRNA é encapsulado em nanopartículas. O empacotamento em nanopartícula envolve condensação e encapsulamento de DNA (por exemplo) em partículas que são menores do que o poro da membrana nuclear, usando substâncias químicas incluindo poli-L-lisina e polietileno glicol. RNA é empacotado em 4 diferentes formulações de nanopartícula (PEI, PLL,PAE, e CK30PEGl0k), e eficiência de liberação de ymRNA é comparado para ymRNA que codifica luciferase comparado a (Luc-ymRNA). A cinética de liberação e dose-resposta são então caracterizados usando EPO-ymRNA.

EXEMPLO 25

PREVENÇÃO DE RESTENOSE POR LIBERAÇÃO À ARTÉRIA CARÓTIDA DE mRNA MODIFICADO QUE CODIFICA PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO RECOMBINANTE

MATERIAS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Desenho Experimental

RNA é administrado à artéria carótida de ratos por injeção intra-arterial próximo ao tempo de angioplastia por balão, após o que o fluxo sanguíneo é reintegrado. Os ratos são sacrificados 3 h após a injeção, seções da artéria carótida são excisadas, células do endotélio vascular são colhidas e homogeneizadas, e a atividade de luciferase é determinada conforme descrito nos Exemplos acima.

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RESULTADOS

RNA modificado por pseudouridina que codifica Luciferase é administrado às artérias da carótica de rato. 3 horas depois, RNA luciferase pode ser detectado em um local de liberação mas não nos sítios adjacentes.

Em seguida, este procolo é usado para impedir a restenose de um vaso sanguíneo após angioplastia em balão em um modelo de restenose animal, por liberação de RNA modificado que codifica uma proteína do choque térmico, por exemplo HSP70; um fator de crescimento (por exemplo fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento endotelial vascular (V-EGF), ou fator de crescimento tipo insulina (IGF); ou uma proteína que regula para baixo ou antagoniza a sinalização do fator de crescimento. A administração de RNA modificado reduz a incidência de restenose.

EXEMPLO 26

TRATAMENTO DE FIBROSE CÍSTICA POR LIBERAÇÃO DE MOLÉCULAS DE mRNA QUE CODIFICAM CFTRPARA EPITÉLIO RESPIRATÓRIO

RNA modificado em nucleosídeo ou pseudouridin que codifica CFTR é liberado, conforme descrito no Exemplo 16, aos pulmões de um modelo de fibrose cística animal, e seu efeito na doença é avaliado conforme descrito em Scholte BJ, et al (Animal models of cystic fibrosis. J Cyst Fibros 2004; 3 Suppl2: 183-90) ou Copreni E, et al, Lentivírus-mediated gene transfer to the respiratory epithelium: a promising approach to gene therapy of cystic fibrosis. GeneTher 2004; 11 Suppl 1: S67-75). A administração de RNA ameniza a fibrose cística.

Em experimentos adicionais, as moléculas de mRNA modificadas da presente invenção são usadas para liberar os pulmões, outras proteínas recombinantes de valor terapêutico, por exemplo através de um inalador que libera RNA.

EXEMPLO 27

TRATAMENTO DE XLA POR LIBERAÇÃO DE MOLÉCULAS DE mRNA MODIFICADAS QUE CODIFICA, ADA ÀS CÉLULAS HEMATOPOIETICAS

RNA modificado em nucleosídeo ou pseudouridina que codifica ADA é liberado nas células hematopoiéticas de uma agamaglobulinemia ligada ao X em modelo animal, e seu efeito na doença é avaliado conforme descrito em Tanaka M, Gunawan F, et al, Inhibition of heart transplant injury and graft coronary artery disease after prolonged organ ischemia by selective protein kinase C regulators. J Thorac Cardiovasc Surg 2005;129(5): 1160-7) ou

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Zonta S, Lovisetto F, et al, Uretero-neocystostomy in a swine model of kidney transplantation: a new technique. J Surg Res. 2005 Apr;124(2):250-5). A administração de RNA demonstra aumentar XLA.

EXEMPLO 28

PREVENÇÃO DE REJEIÇÃO DE ÓRGÃO POR LIBERAÇÃO MOLÉCULAS DE mRNA MODIFICADAS QUE CODIFICAM PROTEÍNA IMUNOMODULATÓRIA EM UM LOCAL DE TRANSPLANTE

RNA modificado nucleosídeo ou pseudouridina que codifica uma citocina, uma quimiocina, ou um interferon IS (por exemplo IL-4, IL-13, IL-I0, ou TGF-β) é liberado em um local do transplante de um modelo de transplante de órgão, e seu efeito na incidência de rejeição é avaliado conforme descrito em Yu PW, Tabuchi R S et al, Sustained correction of B-cell development and function in a murine model of X-linked agammaglobulinemia (XLA) using retroviral-mediated gene transfer. Blood. 2004 104(5): 1281-90) ou Satoh M, Mizutani A et al, X-linked immunodeficient mice spontaneously produce lupus-related anti20 RNA helicase A autoantibodies, but are resistant to pristane-induced lupus. Int Immunol 2003, 15(9): 1117-24). A administração de RNA reduz a incidência de rejeição de transplante.

EXEMPLO 29

O TRATAMENTO DE DOENÇA NIEMANN-PICK DISEASE, MUCOPOLISACARIDOSE, E OUTROS ERROS METABÓLICOS INATOS POR LIBERAÇÃO DE mRNA MODIFICADO PARA OS TECIDOS CORPORAIS

RNA nucleosídeo modificado ou pseudouridina que codifica esfingomielinase é liberado ao pulmão, cérebro, ou outro tecido de doença de Niemann-Pick Tipo A e B em modelos animais, e seu efeito na doença é avaliado conforme descrito em Passini MA, Macauley SL, et al, AAV vector-mediated correction of brain pathology in a mouse model of Niemann-Pick A disease. Mol Ther 2005;11(5): 754-62) ou Buccoliero R, Ginzburg L, et al, Elevation of lung surfactant phosphatidylcholine in mouse models of Sandhoff and of Niemann-Pick A disease. J Inherit Metab Dis 2004;27(5): 641-8). A administração de RNA demonstra melhorar a doença.

RNA de nucleosídeo modificado ou pseudouridina que codifica alfa-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, ou uma enzima relacionada é liberada aos tecidos corporais de um modelo animal de mucopolisacaridose, e seu efeito na doença é avaliado conforme descrito em

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Simonaro CM, D'Angelo M, et al, Joint and bone disease in mucopolisaccharidosis VI e VII: identification of new therapeutic targets and biomarkers using animal models. Pediatr Res 2005;57(5 Pt 1): 701-7) ou McGlynn R, Dobrenis K, et al, Differential subcellular localization of cholesterol, gangliosides, and glycosaminoglycans in murine models of mucopolisaccharide storage disorders. J Comp Neurol 2004 20;480(4): 415-26). A administração de RNA melhora a doença.

Em experimentos adicionais, as moléculas de mRNA da presente invenção são usados para fornecer fatores de coagulação (por exemplo para hemofílicos). Em experimentos adicionais, moléculas de mRNA modificadas da presente invenção são usadas para fornecer ácido-b-glucosidase para tratar doença de Gaucher. Em experimentos adicionais, moléculas de mRNA modificadas da presente invenção são usadas para fornecer alfa-galactosidase A para tratar a doença de Fabry. Em experimentos adicionais, moléculas de mRNA modificadas da presente invenção são usadas para fornecer citocinas para o tratamento de doenças infecciosas.

Em experimentos adicionais, moléculas de mRNA modificadas da presente invenção são usadas para corrigir outros erros inatos do metabolismo, por administrcao de moléculas de mRNA que codificam, por exemplo ABCA4; ABCD3; ACADM; AGL; AGT; ALDH4Al; ALPL; AMPD1; APOA2; AVSD1; BRCD2; C1QA; C1QB; C1QG; C8A; C8B; CACNA1S; CCV; CD3Z; CDC2L1; CHML; CHS1; CIAS1; CLCNKB; CMD1A; CMH2; CMM; COL11AI; COL8A2; COL9A2; CPT2; CRB1; CSE; CSF3R; CTPA; CTSK; DBT; DIO1; DISC1; DPYD; EKV; ENO1; ENO1P; EPB41; EPHX1; F13B; F5; FCGR2A; FCGR2B; FCGR3A; FCHL; FH; FMO3; FMO4; FUCA1; FY; GALE; GBA; GFND; GJA8; GJB3; GLC3B; HF1; HMGCL; HPC1; HRD; HRPT2; HSD3B2; HSPG2; KCNQ4; KCS; KIF1B; LAMB3; LAMC2; LGMD1B; LMNA; LOR; MCKD1; MCL1; MPZ; MTHFR; MTR; MUTYH; MYOC; NB; NCF2; NEM1; NPHS2; NPPA; NRAS; NTRK1; OPTA2; PBX1; PCHC; PGD; PHA2A; PHGDH; PKLR; PKP1; PLA2G2A; PLOD; PPOX; PPT1; PRCC; PRG4; PSEN2; PTOS1; REN; RFX5; RHD; RMD1; RPE65; SCCD; SERPINC1; SJS1; SLC19A2; SLC2A1; SPG23; SPTA1; TAL1; TNFSF6; TNNT2; TPM3; TSHB; UMPK; UOX; UROD; USH2A; VMGLOM; VWS; WS2B; ABCB11; ABCG5; ABCG8; ACADL; ACP1; AGXT; AHHR; ALMS1; ALPP; ALS2; APOB; BDE; BDMR; BJS; BMPR2; CHRNA1; CMCWTD; CNGA3; COL3A1; COL4A3; COL4A4; COL6A3; CPS1; CRYGA; CRYGEP1; CYP1B1; CYP27A1; DBI; DES; DYSF; EDAR; EFEMP1; EIF2AK3; ERCC3;

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FSHR; GINGF; GLC1B; GPD2; GYPC; HADHA; HADHB; HOXD13; HPE2; IGKC; IHH; IRS1; ITGA6; KHK; KYNU; LCT; LHCGR; LSFC; MSH2; MSH6; NEB; NMTC; NPHP1; PAFAH1P1; PAX3; PAX8; PMS1; PNKD; PPH1; PROC; REGIA; SAG; SFTPB; SLC11A1; SLC3Al; SOS1; SPG4; SRD5A2; TCL4; TGFA; TMD; TPO; UGT1A@; UV24; WSS; XDH; ZAP70; ZFHX1B; ACAA1; AGS1; AGTR1; AHSG; AMT; ARMET; BBS3; BCHE; BCPM; BTD; CASR; CCR2; CCR5; CDL1; CMT2B; COL7A1; CP; CPO; CRY; CTNNB1; DEM; ETM1; FANCD2; F1H; FOXL2; GBE1; GLB1; GLC1C; GNAI2; GNAT1; GP9; GPX1; HGD; HRG; ITIH1; KNG; LPP; LRS1; MCCC1; MDS1; MHS4; MITF; MLH1; MYL3; MYMY; OPA1; P2RY12; PBXPI; PCCB; POU1FI; PPARG; PROS1; PTHR1; RCA1; RHO; SCA7; SCLC1; SCN5A; SI; SLC25A20; SLC2A2; TF; TGFBR2; THPO; THRB; TKT; TM4SF1; TRH; UMPS; UQCRC1; USH3A; VHL; WS2A; XPC; ZNF35; ADH1B; ADH1C; AFP; AGA; AIH2; ALB; ASMD; BFHD; CNGA1; CRBM; DCK; DSPP; DTDP2; ELONG; ENAM; ETFDH; EVC; F11; FABP2; FGA;FGB; FGFR3; FGG; FSHMD1A; GC; GNPTA; GNRHR; GYPA; HCA; HCL2; HD; HTN3; HVBS6; IDUA; IF; JPD; KIT; KLKB1; LQT4; MANBA; MLLT2; MSX1; MTP; NR3C2; PBT; PDE6B; PEE1; PITX2; PKD2; QDPR; SGCB; SLC25A4; SNCA; SOD3; STATH; TAPVR1; TYS; WBS2; WFS1; WHCR; ADAMTS2; ADRB2; AMCN; AP3BI; APC; ARSB; B4GALT7; BHR1; C6; C7; CCAL2; CKN1; CMDJ; CRHBP; CSF1R; DHFR; DIAPH1; DTR; EOS; EPD; ERVR; F12; FBN2; GDNF; GHR; GLRA1; GM2A; HEXB; HSD17B4; ITGA2; KFS; LGMD1A; LOX; LTC4S; MAN2A1; MCC; MCCC2; MSH3; MSX2; NR3C1; PCSK1; PDE6A; PFBI; RASA1; SCZD1; SDHA; SGCD; SLC22A5; SLC26A2; SLC6A3; SM1; SMA@; SMN1; SMN2; SPINK5; TCOF1; TELAB1; TGFBI; ALDH5Al; ARG1; AS; ASSP2; BCKDHB; BF; C2; C4A; CDKN1A; COL10A1; COL11A2; CYP21A2; DYX2; EJM1; ELOVL4; EPM2A; ESR1; EYA4; F13A1; FANCE; GCLC; GJA1; GLYS1; GMPR; GSE; HCR; HFE; HLA-A; HLA-DPB1; HLA-DRA; HPFH; ICS1; IDDM1; IFNGR1; IGAD1; IGF2R; ISCW; LAMA2; LAP; LCA5; LPA; MCDR1; MOCS1; MUT; MYB; NEU1; NKS1; NYS2; OA3; OODD; OFC1; PARK2; PBCA; PBCRA1; PDB1; PEX3; PEX6; PEX7; PKHD1; PLA2G7; PLG; POLH; PPAC; PSORS1; PUJO; RCD1; RDS; RHAG; RP14; RUNX2; RWS; SCA1; SCZD3; SIASD; SOD2; ST8; TAP1; TAP2; TFAP2B; TNDM; TNF; TPBG; TPMT; TULP1; WISP3; AASS; ABCB1; ABCB4; ACHE; AQP1; ASL; ASNS; AUTS1; BPGM; BRAF; C7orf2; CACNA2D1; CCM1; CD36; CFTR; CHORDOMA; CLCN1; CMH6; CMT2D; COL1A2;

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CRS; CYMD; DFNA5; DLD; DYT11; EEC1; ELN; ETV1; FKBP6; GCK; GHRHR; GHS; GLI3; GPDS1; GUSB; HLXB9; HOXA13; HPFH2; HRX; IAB; IMMP2L; KCNH2; LAMB1; LEP; MET; NCF1;NM; OGDH; OPN1SW; PEX1; PGAM2; PMS2; PON1; PPP1R3A; PRSS1; PTC; PTPN12; RP10; RP9; SERPINE1; SGCE; SHFM1; SHH; SLC26A3; SLC26A4; SLOS; SMAD1; TBXAS1; TWIST; ZWS1; ACHM3; ADRB3; ANKI; CA1; CA2; CCAL1; CLN8; CMT4A; CNGB3; COH1; CPP; CRH; CYP11B1; CYP11B2; DECR1; DPYS; DURS1; EBS1; ECA1; EGI; EXT1; EYA1; FGFR1; GNRH1; GSR; GULOP; HR; KCNQ3; KFM; KWE; LGCR; LPL; MCPH1; MOS; MYC; NAT1; NAT2; NBS1; PLAT; PLEC1; PRKDC; PXMP3; RP1; SCZD6; SFTPC; SGM1; SPG5A; STAR; TG; TRPS1; TTPA; VMD1; WRN; ABCA1; ABL1; ABO; ADAMTS13; AK1; ALAD; ALDH1A1; ALDOB; AMBP; AMCD1; ASS; BDMF; BSCL; C5; CDKN2A; CHAC; CLA1; CMD1B; COL5A1; CRAT; DBH; DNAI1; DYS; DYT1; ENG; FANCC; FBP1; FCMD; FRDA; GALT; GLDC; GNE; GSM1; GSN; HSD17B3; HSN1; IBM2; INVS; JBTS1; LALL; LCCS1; LCCS; LGMD2H; LMX1B; MLLT3; MROS; MSSE; NOTCH1; ORM1; PAPPA; PIP5K1B; PTCH; PTGS1; RLN1; RLN2; RMRP; ROR2; RPD1; SARDH; SPTLC1; STOM; TDFA; TEK; TMC1; TRIM32; TSC1; TYRP1; XPA; CACNB2; COLl7A1; CUBN; CXCL12; CYP17; CYP2C19; CYP2C9; EGR2; EMX2; ERCC6; FGFR2; HK1; HPSI; IL2RA; LGI1; LIPA; MAT1A; MBL2; MKI67; MXI1; NODAL; OAT; OATL3; PAX2; PCBD; PEO1; PHYH; PNL1P; PSAP;PTEN; RBP4; RDPA; RET; SFTPA1; SFTPD; SHFM3; SIAL; THC2; TLX1; TNFRSF6; UFS; UROS; AA; ABCC8; ACAT1; ALX4; AMPD3; ANC; APOA1; APOA4; APOC3; ATM; BSCL2; BWS; CALCA; CAT; CCND1; CD3E; CD3G; CD59; CDKN1C; CLN2; CNTF; CPT1A; CTSC; DDB1; DDB2; DHCR7; DLAT; DRD4; ECB2; ED4; EVR1; EXT2; F2; FSHB; FTH1; G6PT1; G6PT2; GIF; HBB; HBBP1; HBD; HBE1; HBG1; HBG2; HMBS; HND; HOMG2; HRAS; HVBS1; IDDM2; IGER; INS; JBS; KCNJ11; KCNJ1; KCNQ1; LDHA; LRP5; MEN1; MLL; MYBPC3; MYO7A; NNO1; OPPG; OPTB1; PAX6; PC; PDX1; PGL2; PGR; PORC; PTH; PTS; PVRL1; PYGM; RAG1; RAG2; ROM1; RRAS2; SAA1; SCA5; SCZD2; SDHD; SERPING1; SMPD1; TCIRG1; TCL2; TECTA; TH; TREH; TSG101; TYR; USH1C; VMD2; VRN1; WT1; WT2; ZNF145; A2M; AAAS; ACADS; ACLS; ACVRL1; ALDH2; AMHR2; AOM; AQP2; ATD; ATP2A2; BDC; C1R; CD4; CDK4; CNA1; COL2A1; CYP27B1; DRPLA; ENUR2; FEOM1; FGF23; FPF; GNB3; GNS; HAL; HBP1; HMGA2; HMN2; HPD; IGF1; KCNA1; KERA; KRAS2; KRT1; KRT2A;

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KRT3; KRT4; KRT5; KRT6A; KRT6B; KRTHB6; LDHB; LYZ; MGCT; MPE; MVK; MYL2; OAP; PAH; PPKB; PRB3; PTPN11; PXR1; RLS; RSN; SAS; SAX1; SCA2; SCNN1A; SMAL; SPPM; SPSMA; TBX3; TBX5; TCF1; TPI1; TSC3; ULR; VDR; VWF; ATP7B; BRCA2; BRCD1; CLN5; CPB2; ED2; EDNRB; ENUR1; ERCC5; F10; F7; GJB2; GJB6; IPF1; MBS1; MCOR; NYS4; PCCA; RB1; RHOK; SCZD7; SGCG; SLC10A2; SLC25A15; STARP1; ZNFl98; ACHM1; ARVDI; BCH; CTAA1; DAD1; DFNB5; EML1; GALC; GCH1; IBGC1; IGH@; IGHC group; IGHG1; IGHM; IGHR; IV; LTBP2; MCOP; MJD; MNG1 MPD1; MPS3C; MYH6; MYH7; NP; NPC2; PABN1; PSEN1 PYGL; RPGRIP1; SERPINA1; SERPINA3; SERPINA6; SLC7A7; SPG3A; SPTB; TCL1A; TGMI; TITF1; TMIP; TRA@; TSHR; USH1A; VP; ACCPN; AHO2; ANCR; B2M; BBS4; BLM; CAPN3; CDAN1; CDAN3; CLN6; CMH3; CYP19; CYP1A1; CYP1A2; DYX1; EPB42; ETFA; EYCL3; FAH; FBN1; FES; HCVS; HEXA; IVD; LCS1; LIPC; MYO5A; OCA2; OTSC1; PWCR; RLBP1; SLC12A1; SPG6; TPM1; UBE3A; WMS; ABCC6; ALDOA; APRT; ATP2A1; BBS2; CARD15; CATM; CDH1; CETP; CHST6; CLN3; CREBBP; CTH; CTM; CYBA; CYLD; DHS; DNASE1; DPEP1; ERCC4; FANCA; GALNS; GAN; HAGH; HBA1; HBA2; HBHR; HBQ1; HBZ; HBZP; HP; HSD11B2; IL4R; LIPB; MC2R; MEFV; MHC2TA; MLYCD; MMVP1; PHKB; PHKG2; PKD1; PKDTS; PMM2; PXE; SALL1; SCA4; SCNN1B; SCNN1G; SLC12A3; TAT; TSC2; VDI; WT3; ABR; ACACA; ACADVL; ACE; ALDH3A2; APOH; ASPA; AXIN2; BCL5; BHD; BLMH; BRCA1; CACD; CCA1; CCZS; CHRNB1; CHRNE; CMT1A; COL1A1; CORD5; CTNS; EPX; ERBB2; G6PC; GAA; GALK1; GCGR; GFAP; GH1; GH2; GP1BA; GPSC; GUCY2D; ITGA2B; ITGB3; ITGB4; KRT10; KRT12; KRT13; KRT14; KRT14L1; KRT14L2; KRT14L3; KRT16; KRT16L1; KRT16L2; KRT17; KRT9; MAPT; MDB; MDCR; MGI; MHS2; MKS1; MPO; MYO15A; NAGLU; NAPB; NF1; NME1; P4HB; PAFAH1B1; PECAM1; PEX12; PHB; PMP22; PRKAR1A; PRKCA; PRKWNK4; PRP8; PRPF8; PTLAH; RARA; RCV1; RMSA1; RP17; RSS; SCN4A; SERPINF2; SGCA; SGSH; SHBG; SLC2A4; SLC4A1; SLC6A4; SMCR; SOST; SOX9; SSTR2; SYM1; SYNS1; TCF2; THRA; TIMP2; TOC; TOP2A; TP53; TRIM37; VBCH; ATP8B1; BCL2; CNSN; CORD1; CYB5; DCC; F5F8D; FECH; PEO; LAMA3; LCFS2; MADH4; MAFD1; MC2R; MCL; MYP2; NPC1; SPPK; TGFBRE; TGIF; TTR; AD2; AMH; APOC2; APOE; ATHS; BAX; BCKDHA; BCL3; BFIC; C3; CACNA1A; CCO; CEACAM5; COMP; CRX; DBA; DDU; DFNA4; DLL3; DM1; DMWD; E11S; ELA2;

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127/141

EPOR; ERCC2; ETFB; EXT3; EYCL1; FTL; FUT1; FUT2; FUT6; GAMT; GCDH; GPI; GUSM; HB1; HCL1; HHC2; HHC3; ICAM3; INSR; JAK3; KLK3; LDLR; LHB; LIG1; LOH19CR1; LYL1; MAN2B1; MCOLN1; MDRV; MLLT1; NOTCH3; NPHS1; OFC3; OPA3; PEPD; PRPF31; PRTN3; PRX; PSG1; PVR; RYR1; SLC5A5; SLC7A9; STK11; TBXA2R; TGFB1; TNNI3; TYROBP; ADA; AHCY; AVP; CDAN2; CDPD1; CHED1; CHED2; CHRNA4; CST3; EDN3; EEGV1; FTLL1; GDF5; GNAS; GSS; HNF4A; JAG1; KCNQ2; MKKS; NBIA1; PCK1; PI3; PPCD; PPGB; PRNP; THBD; TOP1; AIRE; APP; CBS; COL6A1; COL6A2; CSTB; DCR; DSCR1; FPDMM; HLCS; HPE1; ITGB2; KCNE1; KNO; PRSS7; RUNX1; SOD1; TAM; ADSL; ARSA; BCR; CECR; CHEK2; COMT; CRYBB2; CSF2RB; CTHM; CYP2D6; CYP2D7P1; DGCR; DIA1; EWSR1; GGT1; MGCR; MN1; NAGA; NF2; OGS2; PDGFB; PPARA; PRODH; SCO2; SCZD4; SERPIND1; SLC5A1; SOX10; TCN2; TIMP3; TST; VCF; ABCD1; ACTL1; ADFN; AGMX2; AHDS; AIC; AIED; AIH3; ALAS2; AMCD; AMELX; ANOP1; AR; ARAF1; ARSC2; ARSE; ARTS; ARX; ASAT; ASSP5; ATP7A; ATRX; AVPR2; BFLS; BGN; BTK; BZX; C1HR; CACNA1F; CALB3; CBBM; CCT; CDR1; CFNS; CGF1; CHM; CHR39C; CIDX; CLA2; CLCN5; CLS; CMTX2; CMTX3; CND; COD1; COD2; COL4A5; COL4A6; CPX; CVD1; CYBB; DCX; DFN2; DFN4; DFN6; DHOF; DIAPH2; DKC1; DMD; DSS; DYT3; EBM; EBP; ED1; ELK1; EMD; EVR2; F8; F9; FCP1; FDPSL5; FGD1; FGS1; FMR1; FMR2; G6PD; GABRA3; GATA1; GDI1; GDXY; GJB1; GK; GLA; GPC3; GRPR; GTD; GUST; HMS1; HPRT1; HPT; HTC2; HTR2C; HYR; IDS; IHG1; IL2RG; INDX; IP1; IP2; JMS; KAL1; KFSD; L1CAM; LAMP2; MAA; MAFD2; MAOA; MAOB; MCF2; MCS; MEAX; MECP2; MF4; MGC1; MIC5; MID1; MLLT7; MLS; MRSD; MRX14; MRX1; MRX20; MRX2; MRX3; MRX40; MRXA; MSD; MTM1; MYCL2; MYP1; NDP; NHS; NPHL1; NR0B1; NSX; NYS1; NYX; OA1; OASD; OCRL; ODT1; OFD1; OPA2; OPD1; OPEM; OPN1LW; OPN1MW; OTC; P3; PDHA1; PDR; PFC; PFKFB1; PGK1; PGK1P1; PGS; PHEX; PHKA1; PHKA2; PHP; PIGA; PLP1; POF1; POLA; POU3F4; PPMX; PRD; PRPS1; PRPS2; PRS; RCCP2; RENBP; RENS1; RP2; RP6; RPGR; RPS4X; RPS6KA3; RS1; S11; SDYS; SEDL; SERPINA7; SH2D1A; SHFM2; SLC25A5; SMAX2; SRPX; SRS; STS; SYN1; SYP; TAF1; TAZ; TBX22; TDD; TFE3; THAS; THC; TIMM8A; TIMP1; TKCR; TNFSF5; UBE1; UBE2A; WAS; WSN; WTS; WWS; XIC; XIST; XK; XM; XS; ZFX; ZIC3; ZNF261; ZNF41; ZNF6; AMELY; ASSP6; AZF1; AZF2; DAZ; GCY; RPS4Y; SMCY; SRY;

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128/141

ZFY; ABAT; AEZ; AFA; AFD1; ASAH1; ASD1; ASMT; CCAT; CECR9; CEPA; CLA3; CLN4; CSF2RA; CTS1; DF; DIH1; DWS; DYT2; DYT4; EBR3; ECT; EEF1A1L14; EYCL2; FANCB; GCSH; GCSL; GIP; GTS; HHG; HMI; HOAC; HOKPP2; HRPT1; HSD3B3; HTC1; HV1S; ICHQ; ICR1; ICR5; IL3RA; KAL2; KMS; KRT18; KSS; LCAT; LHON; LIMM; MANBB; MCPH2; MEB; MELAS; MIC2; MPFD; MS; MSS; MTATP6; MTCO1; MTCO3; MTCYB; MTND1; MTND2; MTND4; MTND5; MTND6; MTRNR1; MTRNR2; MTTE; MTTG; MTTI; MTTK; MTTL1; MTTL2; MTTN; MTTP; MTTS1; NAMSD; OCD1; OPD2; PCK2; PCLD; PCOS1; PFKM; PKD3; PRCA1; PRO1; PROP1; RBS; RFXAP; RP; SHOX; SLC25A6; SPG5B; STO; SUOX; THM; ou TTD.

EXEMPLO 30

TRATAMENTO DE VASOESPASMO POR LIBERAÇÃO DE MOLÉCULAS DE mRNA MODIFICADAS QUE CODIFICAM iNOS AOS TECIDOS CORPORAIS

RNA de nucleosídeo modificado ou pseudouridina que codifica óxido nítrico sintase induzível (iNOS) é liberado ao endotélio vascular de modelos animais de vasoespasmo (por exemplo hemorragia subaracnoide), e seu efeito na doença é avaliado conforme descrito in Pradilla G, Wang PP, et al, Prevention of vasospasm by anti-CD11/CD18 monoclonal antibody therapy following subarachnoid hemorrhage in rabbits. J Neurosurg 2004;101(1): 8892) ou Park S, Yamaguchi M, et al, Neurovascular protection reduces early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Stroke 2004;35(10): 2412-7). A administração de RNA melhora a doença.

EXEMPLO 31

RESTAURAÇÃO DE CRESCIMENTO DE PELO POR LIBERAÇÃO DE mRNA MODIFICADO QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA IMUNOSSUPRESSORA

RNA com nucleosídeo modificado ou pseudouridina que codifica uma telomerase ou uma proteína imunossupressora (por exemplo α-MSH, TGF-β 1, ou IGF-I é liberado aos folículos pilosos de animais usados como modelos de perda de peso ou calvície, e seu efeito em crescimento de pelo é avaliado conforme descrito em Jiang J, Tsuboi R, et al, Topical application of ketoconazole stimulates hair growth in C3H/HeN mice. J Dermatol 2005;32(4): 243-7) ou McElwee KJ, Freyschmidt-Paul P, et al, Transfer of CD8(+) cells induces localized hair loss whereas CD4(+)/CD25(-) cells promote systemic alopecia areata and

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CD4(+)/CD25(+) cells blockade disease onset in the C3H/HeJ mouse model. J Invest Dermatol 2005;124(5): 947-57). A administração de RNA restabelece o crescimento de pelos.

EXEMPLO 32

SÍNTESE DE UMA MOLÉCULA DE RNA TRANSCRITO IN VITRO COM NUCLEOSÍDEOS ALTERADOS CONTENDO UM siRNA

Uma molécula de RNA de dupla fita (dsRNA) compreendendo pseudouridina ou um nucleosídeo modificado e outro compreendendo um pequeno RNA interferente (siRNA) ou RNA hairpin curto (shRNA) é sintetizado pelo seguinte procedimento: Fitas de RNA complementares com a sequência desejada contendo uridina ou 1 ou mais nucleosídeos modificados são sintetizados por transcrição in vitro (por exemplo por T7, SP6, ou T3 RNA polimerase de fago) conforme descrito no Exemplo 5. Moléculas de dsRNA apresentam imunogenicidade reduzida. Em outros experimentos as moléculas de dsRNA são projetadas para serem processadas por uma enzima intracelular para render o siRNA ou shRNA desejado. Devido ao fato de moléculas de dsRNA de várias centenas de nucleotídeos serem facilmente sintetizadas, cada dsRNA pode ainda ser projetado para conter vários siRNA ou Moléculas de shRNA, para facilitar a liberação de vários siRNA ou shRNA em uma única célula alvo.

EXEMPLO 33

USO DE UMA MOLÉCULA DE RNA TRANSCRITO IN VITRO COM NUCLEOSÍDEOS ALTERADOS PARA LIBERAR siRNA

A molécula de dsRNA do Exemplo anterior é complexada com um reagente de transfecção (por exemplo um reagente de transfecção catiônico, um reagente de transfecção a base de lipídeo, um reagente de transfecção baseado em proteína, um reagente de transfecção a base de polietilenoimina, ou fosfato de cálcio) e liberado em uma célula alvo de interesse. As enzimas em ou na superfície da célula alvo degradam o dsRNA nas moléculas desejadas de siRNA ou shRNA. Este método efetivamente silencia a transcrição de 1 ou mais genes celulares que correspondem às sequências de siRNA ou shRNA.

EXEMPLO 34

TESTE DO EFEITO DE MODIFICAÇÕES ADICIONAIS DE NUCLEOSÍDEOS NA IMUNOGENICIDADE DO RNA E EFICIÊNCIA DE TRADUÇÃO

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130/141

Modificações adicionais de nucleosídeos são introduzidos em RNA transcrito in vitro, usando os métodos descritos acima nos Exemplos 5 e 10, e seus efeitos e imunogenicidade e eficiência de tradução são testados conforme descrito nos Exemplos 4-11 e 12-18, respectivamente. Certas modificações adicionais demonstram diminuir a imunogenicidade e melhorar a tradução. Estas modificações são modalidades adicionais de métodos e compsicoes da presente invenção.

Modificações testadas incluem, por exemplo:

γη¹ A' rn²A‘ Αιττ π'ΐ^^'ιΆ' i^A· triéióA' r⁶A* mc^A' tm⁶A'

Hl TA; AAA r\.; rUU; ms 111 TA; A ZY; ms 1UA; Ao ZA; ms AO ZV; g ZV; A ZY; ms L zA; AAA L ZA; AAAA ZA;

mQ²hn⁶ A * A'γΓή'^’ T* γπ¹^ ιύ^Τ^π’ tn³C· Cnr Q²^* qc⁴^* rn⁵^^n íic⁴Cnr 1c²c iyi¹^· γπ²^τ m⁷É~r* ms mi zA; rviip); i; m i; m im; m C; Cm; s C; ac C; a. c; m Cm; ac Cm; κ c; m G; m G; m G;

Gm; m²2G; m²Gm; m²2Gm; Gr(p); yW; o2yW; OHyW; OHyW*; imG; mimG; Q; oQ; galQ; manQ; preQ0; preQ1; G+; D; m⁵Um', m¹T; Tm; S⁴U; -m⁵s²U', S²Um, ' acp³U·, ho⁵u., mo⁵U·; cmo⁵U·; mcmo⁵U; chm⁵U; mchm⁵U·; mcm⁵U; mcm⁵Um; mcm⁵s²U; nm⁵s²U; mnm⁵U; mnm⁵s²U; mnm⁵se²U; ncm⁵U; ncm⁵Um; cmnm⁵U; cmnm⁵Um; cmnm⁵s²U; m⁶2A; im; m⁴C;

('m hni⁵C· τη³TT’ m¹ cm⁵TT’ m⁶ A^n^- iri^Am· m2^,7G· γπ²,²,⁷^τ· τη³ΤΤ^π^- τη⁵^’ τη³Ψ’ m V/AAA; ΑΑΑΑΑ V/; AAA LJ; AAA dC^T; CAAA ; AAA ζΑΑΑΑ; AAA 2A1H; m G; m G; AAA UAAA; AAA J_Z; AAA I ;

f5Cm; m^lGm; m^lAm; im⁵U; rm⁵s²U; imG-14; imG2; e ac⁶A.

MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 35-38

Purificação por HPLC de RNA: mRNA produzido por transcrição de T7 polimerase foi purificado por HPLC usando uma matriz de coluna de microesferas de copolímero alquilado não poroso de poliestireno-divinilbenzeno (PS-DVB) (2,1 pm) (21 mm x 100 mm coluna) e um sistema de tampão de Trietilamônio acetato (TEAA) com um gradiente de acetonitrila. Tampão A contendo 0,1 M TEAA e tampão B contendo 0,1 M TEAA e 25% acetonitrila. As colunas foram equilibradas com 38% tampão B em tampão A, carregados com RNA, e em seguida corridos com um gradiente linear para 55% de tampão B por 30 minutos em 5 ml/minuto. As frações correspondendo ao pico desejado foram coletados. As análises de RNA foram realizadas com a mesma matriz de coluna e sistema de tampão, mas usando uma coluna 7,8 mm x 50 mm em um 1,0 ml/min e uma duração de gradiente de 25 minutos.

Isolamento de RNA das frações da coluna: As frações coletadas foram combinadas e primeiro seus teores de RNA foram concentrados usando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 com membrana 30K (Milipore). O dispositivo de filtro foi enchido com 15 ml de amostra e girado a 4.000x g por 10 min (4°C) em uma centrífuga Thermo Scientific Sorvall ST16R usando rotor de caçamba móvel. Sob estas condições, ~98% do volume do solvente

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131/141 pode ser removido. Quando as frações coletadas tinham um volume de mais de 15 ml, a unidade de filtro foi reusada para encher com frações adicionais da coluna e centrifugando novamente até que todo o RNA estivess em um tubo. Para remover o sal e solvente do RNA concentrado, a nuclease isenta de água foi adicionada (até 15 ml) e o dispositivo de filtro foi girado novamente. O processo de “lavagem” foi repetido até que a concentração de acetonitrila foi <0,001%. A amostra dessalinizada e sem solvente foi removida do dispositivo de filtração e o RNA foi recuperado por precipitação durante a noite em -20 °C em NaOAc (0,3 M, pH 5,5), isopropanol (1 volume) e glicogênio (3 pl). O RNA precipitado foi coletado, lavado duas vezes com etanol 75% resfriado em gelo e reconstituído em água.

dsRNA dot blot: RNA (25-100 ng) foi blotted em uma membrana de nitrocelulose, deixada secar, bloqueada com 5% de leite seco desnatado em tampão TBS complementado com 0,05% Tween-20 (TBS-T), e incubado com mAb específico para dsRNA J2 ou K1 (English & Scientific Consulting) por 60 minutos. As membranas foram lavadas 6 vezes com TBS-T e em seguida reagidas com anticorpo anti-camundongo conjugado com HRP de burro (Jackson Immunology). Após lavagem 6 vees, dsRNA foi detectado com a adição de substrato SuperSignal West Pico Chemiluminescent (Pierce) e captura de imagem por 30 segundos a 2 minutos em um sistema de imagem digital Fujifilm LAS1000.

Geração de célula dendrítica: As amostras de monocitoferese foram obtidas de volutarios normais através de um protocolo aprovado em IRB. DCs humanos foram produzidos por monócitos em tratamento com GM-CSF (50 ng/ml) + IL-4 (100 ng/ml) (R&D Systems) em meio AIM V (Invitrogen) por 7 dias. Nos dias 3 e 6, um volume de 50% de meio novo com citocinas foi adicionado.

DC murina foram geradas por isolamento de células mononucleares de medula óssea a partir de camundongos Balb/c e cultivo em RPMI + 10% de meio FBS complementado GMCSF murino (20 ng/ml, Peprotech). Nos dias 3 e 6, um volume de 50% de meio novo com GM-CSF foi adicionado. Células não aderentes foram usadas após 7 dias de cultura.

Complexação de Lipofectina de RNA: Tampão estoque de fosfato foi adicionado ao DMEM isento de soro para gerar concentrações finais de 20 mM de fosfato de potássio e 100 ng/ml BSA, pH 6,4. Para 3 poços de uma placa de 96 poços, RNA complexado com lipofectina foi preparado nas seguintes proporções: 2,4 pl de lipofectina foi adicionado a 21,3 pl de meio DMEM isento de soro com tampão fosfato e incubado em temperatura ambiente

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132/141 por 10 minutos. Em seguida, 0,75 pg de RNA em 9,9 pl de DMEM isento de soro foi adicionado e a mistura foi incubada por 10 minutos adicionais em temperatura ambiente. Por fim, 116,4 ml de meio DMEM isento de soro foi adicionado para avolumar o volume final a 150 ml. A mistura foi vortexada.

Complexação de TransIT de RNA: Para cada poço de uma placa de 96 poços, 0,25 pg de RNA foi adicionado a 17,3 pl de DMEM isento de soro em gelo. Reagente TransIT mRNA (0,3 ul) foi adicionado com vortexação seguido por 0,2 pl de reagente de impulsão de mRNA e vortexação. RNA complexado foi adicionado dentro de 5 minutos da formação.

Transfecções de célula: Para RNA complexado com lipofectina, 50 pl (0,25 pg RNA/poço) foi adicionado diretamente às células, 5 x 10⁵ por poço. As células transfectadas foram incubadas por 1 h a 37°C em um 5% CO2 incubador. A mistura lipofectina-RNA foi removida e substituída com 200 pl de soro pré-aquecido contendo meio. Para RNA complexado com TransIT, 17 pl de complexo foi adicionado às células, 5 x 10⁵ por poço, em 200 pl de meio contendo soro. As células foram lisadas em meio de lise específico, 3 a 24 hr após transfecção e a atividade de firefly ou renilla luciferase foi medida com substratos específicos emum luminômetro.

Análise de imunogenicidade de RNA: DCs (murinas ou humanas) em placas de 96 poços (5 x 10⁵ células/poço) foram tratadas com meio, ou lipofectina ou RNA complexado com TransIT. O sobrenadante foi colhido após 24 hr e submetido a análise. Os níveis de IFN-α (TransIT liberou RNA) ou TNF-α (Lipofectina liberou RNA) (Biosource International, Camarillo, CA) foram medidos em sobrenadantes por ELISA. As culturas foram realizadas em triplicata a quadruplicata e medidas em duplicata.

EXEMPLO 35

Este exemplo avalia a sequência e dependência de tipo de célula de tradução de Ψ-, m5C, e Ψ/m5C-modificado mRNA em relação ao RNA não modificado (U). mRNA que codifica Luciferase Firefly ou Renilla com as modificações indicadas foram complexados para lipofectina e liberados às células dendríticas murinas (A) e HEK293T (B). DC humanas foram transfectadas com mRNA que codifica firefly ou renilla luciferase com as modificações indicadas complexadas com TransIT (C). Os dados demonstram que dependendo da sequência de RNA e o tipo de célula que traduz isto, a modificação ótima varia. Ainda deve ser demonstrado que a melhora causada pela incorporaca de nucleosídeos modificados é

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133/141 substancialmente maior para as células primárias comparada a linhagens de células transformadas. A atividade de enzima em células lisadas foi medida usando substratos específicos e medida de luz produzida em um luminômetro e expressa como aumento em vezes comparado ao RNA não modificado (U).

EXEMPLO 36

As reações de transcrição de T7 polimerase de fago usadas para a geração do mRNA resulta em quantidades maiores de RNA do tamanho correto, mas ainda contém contaminantes. Isto é visualizado pela aplicação de RNA a uma coluna de HPLC de fase reversa que separa RNA baseado em tamanho sob condições desnaturantes. RNA Ymodificado TEV-luciferase-A51 foi aplicado a coluna de HPLC em 38% Tampão B e submetido a um gradiente linear de tampão B crescente para 55%. O perfil demonstrou ambos menor do que esperado e maior do que esperado de contaminantes. Estes resultados são mostrados na Figura 22.

EXEMPLO 37

A purificação de HPLC aumenta a tradução de todos os tipos de RNA modificado ou não modificado, mas mRNA Ψ-modificado é melhor traduzido. Os resultados são mostrados na Figura 23. (A) mRNA que codifica EPO com as modificações indicadas e com ou sem purificação de HPLC foram liberados para níveis de DCs e EPO murinos nos sobrenadantes foram medidos 24 horas após. Enquanto mRNA m5C/Y modificado teve o nível mais alto de tradução antes de purificação por HPLC, mRNA Ψ-modificado teve a maior tradução após purificação em HPLC. (B) DCs humanos foram transfectados com mRNA que codifica renilla com as modificações indicadas com ou sem purificação HPLC. Semelhante aos mRNA de DCs e EPO murinos, após purificação de HPLC, mRNA de Y-modificado teve o nível mais alto de tradução.

EXEMPLO 38 mRNA modificado Ψ, m5C, e Ψ/mSC tem níveis baixos de imunogenicidade que é reduzido para controlar os níveis com purificação de HPLC. Os resultados são mostrados na Figura 24. (B) DCs humanos foram transfectados com RNA complexado com TransIT com as modificações indicadas com ou sem purificação HPLC. Níveis de IFN-α foram medidos após 24 horas. A purificação por HPLC aumentou a imunogenicidade de RNA não modificado, que

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134/141 é dependente da sequência, conforme outro RNA não modificado teve níveis semelhantes de níveis de IFN-a ou níveis reduzidos. RNA Ψ-modificado teve níveis não mensuráveis de IFNa, semelhante aos DCs tratados com controle. (B) RNA Ψ-modificado antes (-) e após purificação por HPLC (P1 e P2) foi analisado para dsRNA usando dot blotting com um anticorpo monoclonal específico para dsRNA (J2). A purificação de RNA removeu a contaminação de dsRNA. (C) RNA Ψ-modificado que codifica fatores iPS são imunogênicos, que é removido por purificação por HPLC do RNA.

MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 39-41

Cultura de célula Células de queratinócitos epidérmico humanos neonatais (HEKn) (Invitrogen) foram cultivados em meio EpiLife complementado com suplemento de crescimento de queratinócitos Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen). Todas as células cresceram em 37°C e 5% CO2. As células iPS humanas que foram induzidas usando os métodos descritos aqui foram transferidas para matriza matrigel qualificada hESC (BD Biosciences) em placas de 6 poços revestidas após transfecção.

Construção de Vetores. Geralmente o mesmo que os Exemplos 1-3.

Produção de mRNA. Geralmente o mesmo que os Exemplos 1-3.

Reprogramação de Queratinócitos Primários. Células HEKn foram plaqueadas em 1 x 10⁵ células/poço de uma placa de 6 poços em meio EpiLife e crescidos durante a noite. As células foram transfectadas com quantidades iguais de cada fator de reprogramação mRNA (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2) ou um subconjunto de fatores usando TransIT™ mRNA reagente de transfecção (MirusBio, Madison, WI). Três transfecções foram realizadas, em dias alternados, com alterações de meio cada dia. O dia após a terceira

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135/141 transfecção, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em meio mTeSR1 (StemCell Technologies) sobre placas revestidas com matrigel de 6 poços. O meio de célula mTeSR foi alterado diariamente. As células foram mantidas a 37^oC com 5% CO2. As placas foram triadas para alterações de morfologia usando um microscópio invertido.

As células HEKn foram ainda reprogramadas por uma única transfecção por eletroporação com quantidades iguais de cada fator de reprogramação mRNA. As células foram plaqueadas diretamente sobre as placas revestidas em matrigel em uma densidade de 1 x 10⁵ celulas por placa de 6 poços ou 7,5 x 10⁵ células por placas de 10 cm em um meio mTeSR1 que foi alterado diariamente.

Imunofluorescência. Geralmente o mesmo que os Exemplos 1-3.

RT-PCR Quantitativo (qPCR) RNA celular foi transcrito reverso usando métodos padrões e um primer oligo d(T)21 de quantidades equivalentes de RNA celular. Três mensagens foram amplificadas usandoprimers específicos dos genes e PCR em tempo real usando detecção de SYBR green e normalização GAPDH. Os níveis de expressão foram determinados em relação ao nível de expressão na linhagem original de célula HEKn, e descrito como changes em nível de limiar do ciclo (Ct).

EXEMPLO 39

Este exemplo descreve o desenvolvimento de um protocolo para a geração de célula iPS a partir de queratinócitos somáticos. Quantidades iguais (em peso) de KLF4, c-MYC, OCT4, e SOX2 mRNAs foram transfectados em células HEKn três vezes (uma vez em dias alternados) com Reagente TransIT™ mRNA. O meio foi trocado diariamente. O dia após a terceira transfecção, as células foram plaqueadas em placas revestidas com matrigel e crescidas em meio de célula mTeSR1. Por 11 dias após a primeira transfecção a morfologia da célula reprogramada começou a aparecer (Fig. 28).

EXEMPLO 40

Este exemplo descreve a caracterização de células que resultam da transfecção de queratinócitos primários com quantidades iguais de KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4, e SOX2 mRNAs. Um milhão de células HEKn foram eletroporadas uma vez com 5 microgramas de cada mRNA e plaqueadas em placas de 10 cm revestidas com matrigel em meio de célula mTeSR1. 15 dias após a transfecção as células foram fixadas para análise de

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136/141 imunofluorescência. As colônias resultantes foram positivas para seus marcadores de iPS KLF4, LIN28, SSEA4, TRA-1-60, e NANOG (Fig. 29).

EXEMPLO 41

Este exemplo descreve as diferenças de expressão entre queratinócitos primáriso e queratinócitos reprogramados com quantidades iguais de KLF4, c-MYC, OCT4, e SOX2 mRNAs. 7,5 x 10⁵ células HEKn foram eletroporadas uma vez com 3 ou 5 microgramas de cada mRNA e plaqueadas em placas revestidas com matrigel de 10 cm em meio mTeSR1. O meio foi trocado diariamente. 13 dias após transfecção as células foram transferidas para placas de matrigel recém revestidas. 21 dias após transfecção, o RNA célular total foi purificado a partir de células HEKn não transfectadas e dois poços de células reprogramadas. Quantidades iguais de cada RNA celular foram convertidas ao cDNA e analisadas por qPCR. Níveis aumentados de NANOG, CRIPTO e REX1 foram detectados por qPCR usando primers específicos de mensagem (Fig. 30). Estas três mensagens demostraram estar elevadas em células iPS (Aasen T et al. 2008. Nature Biotech 26: 1276). Nenhum destes fatores foi introduzido nas células por transfecção; portanto as alterações na expressão são devido à influência dos fatores de reprogramação que foram introduzidos.

EXEMPLO 42

Células de Transdiferenciação com mRNAs

As células podem ser transdiferenciadas usando as preparações de mRNA purificados descritos aqui, ou o mRNA modificado conforme descrito aqui, ou as preparcoes de mRNA purificadas contendo mRNA modificado conforme descrito aqui. Neste Exemplo, uma preparação de RNA purificado contendo OCT4 mRNA que tem pelo menos uma pseudouridina ou uma 5-metilcitidina é empregada. Ditos mRNAs OCT4 purificados e modificados são substituídos para os vetores de codificação de OCT4 no protocolo descrito em Szabo et al. (Nature 468: 521-528, 2010, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade como se completamente estabelecido aqui) e no protocolo descrito em Racila et al. (Gene Therapy, 1-10, 2010, aqui incorporado como referência em sua totalidade como se completamente estabelecido aqui). Em uma modalidade de cada um destes métodos, a preparação de RNA purificado compreende ou consiste em OCT 4 mRNA, em que todos os nucleosídeos uridina são substituídos por nucleosídeos pseudouridina. Em uma modalidade de cada um destes métodos, a preparação de RNA purificado compreende ou consiste em OCT 4

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137/141 mRNA, em que todos os nucleosídeos citidina são substituídos por nucleosídeos 5metilcistidina. Em uma modalidade de cada um destes métodos, a preparação de RNA purificado compreende ou consiste em OCT 4 mRNA, em que todos os nucleosídeos uridina são substituídos por nucleosídeos pseudouridina e todos os nucleosídeos citidina são substitudos por nucleosídeos 5-metilcistidina. Em modelidades preferenciais, o OCT4 mRNA é purificado para ser livre de RNAs contaminantes. A referência de Racilla et al. descreve um sistema em que queratinócitos humanos foram transdifereciados por serem redirecionados e uma via de diferenciação alternativa. Em particular, a transfecção transitória de queratinócitos de pelo humanos com o fator de transcrição OCT4 foi empregado. Após 2 dias, estas células transfectadas apresentaram expressão de genes embrionários endógenos e mostrou metilação genômica reduzida. Foi demonstrado que ditas células poderiam ser convertidas em tipos celulares neuronais e mesenquimais contrácteis.

A referência de Szabo et al. demonstrou a capacidade de gerar progenitores e células maduras do destino hematopoiético diretamente de fibroblastos dermais humanos sem estabelecer pluripotência. Em particular, a expressão ectópica de OCT4 ativou os fatores de transcrição hematopoiéticos, junto com o tratamento com a citocina específica, permitiu a geração de células que expressam o marcador CD45 de pan-leucócito. Estas únicas células derivadas de fibroblasto originaram as linagens granulocíticas, monocíticas, megacariocíticas e eritroides e demonstraram capacidade de enxerto in vivo.

Além do uso de OCT4, ambos estes protocolos ainda empregaram citocinas ou fatores de crescimento, como faor de crescimento e transformação (TGF), PDGF-BB, fator de célulatronco (SCF), e ligante tirosina quinase tipo FMS 3 (Flt3L). Outros fatores de crescimento e citocinas poderiam ser usados como fator estimulador de colônia de granulócito (G-CSF), IL3, IL-6, eritropoetina, fator de crescimento básico de fibroblastoo (bFGF), fator de crescimento tipo insulina 2 (IGFII), e proteína morfogenética de osso 4 (BMP-4). Como tal, em certas modalidades, os protocolos de Racilla et al. ou Szabo et al. são repetidos com a substituição de OCT4 mRNA modificado (por exemplo, psuedouridina-modificado e/ou 5metilcitidina-modificado), junto com o uso de fatores de crescimento ou citocinas mencionadas acima. Em algumas modalidades, as células são contatadas com as proteínas de citocina e/ou factor de crescimento que são usados. Em algumas outras modalidades, as células são contatadas com mRNAs modificados (por exemplo, mRNAs modificados

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138/141 conforme descrito no presente pedido, por exemplo, por exemplo, psuedouridina-modificado e/ou 5-metilcitidina-modificado) que codifica um ou mais de citocinas e/ou fatores de crescimento que são usados no protocolo de transdiferenciação. Ficará claro a partir desta descrição, que a presente invenção inclui contatar uma célula human ou animal com uma preparação de RNA purificado compreendendo ou consistindo de mRNA que codifica um fator de reprogramação para transdiferenciar uma célula contendo um primeiro estado de diferenciação ou fenótipo para uma célula contendo um segundo estado de de diferenciação ou fenótipo.

Referências

Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S.

2008. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 321: 699-702.

Banerjee AK. 1980. 5'-terminal cap structure in eucaryotic messenger ribonucleic acids. Microbiol Rev 44: 175-205.

Chan EM, et al. 2009. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol 27: 1033-1037.

Ebert AD, Yu J, Rose FF, Jr., Mattis VB, Lorson CL, Thomson JA, Svendsen CN.

2009. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature 457: 277280.

Edmonds M. 1990. Polyadenylate polymerases. Methods Enzymol 181: 161-170.

Feng, R et al. 2008. PU.1 and C/EBPa/b convert fibroblasts into macrophage-like cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105: 6057-6062.

Gershon PD. 2000. (A)-tail of two polymerase structures. Nat Struct Biol 7: 819-821.

Gonzalez F, Barragan Monasterio M, Tiscornia G, Montserrat Pulido N, Vassena R, Batlle Morera L, Rodriguez Piza I, Izpisua Belmonte JC. 2009. Generation of mouse-induced pluripotent stem cells by transient expression of a single nonviral polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 8918-8922.

Graf T, Enver T. 2009. Forcing cells to change lineages. Nature 462: 587-594.

Grudzien E, Stepinski J, Jankowska-Anyszka M, Stolarski R, Darzynkiewicz E, Rhoads RE. 2004. Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translational efficiency. RNA 10: 1479-1487.

Petição 870180166239, de 21/12/2018, pág. 157/167

139/141

Grudzien-Nogalska E, Jemielty J, Kowalska J, Darzynkiewicz E, Rhoads R. 2007. Phosphorothioate cap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency in mammalian cells. RNA 13: 1745-1755.

Higman MA, Bourgeois N, Niles EG. 1992. The vaccinia virus mRNA (guanine-N7-)methyltransferase requires both subunits of the mRNA capping enzyme for activity. J Biol Chem 267: 16430-16437.

Higman MA, Christen LA, Niles EG. 1994. The mRNA (guanine-7-)methyltransferase domain of the vaccinia virus mRNA capping enzyme. Expression in Escherichia coli and structural and kinetic comparison to the intact capping enzyme. J Biol Chem 269: 1497414981.

Huangfu D, Osafune K, Maehr R, Guo W, Eijkelenboom A, Chen S, Muhlestein W, Melton DA. 2008. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol 26: 1269-1275.

Ieda, M et al. 2010. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell 142: 375-386.

Jemielity J, Fowler T, Zuberek J, Stepinski J, Lewdorowicz M, Niedzwiecka A, Stolarski R, Darzynkiewicz E, Rhoads RE. 2003. Novel anti-reverse cap analogs with superior translational properties. RNA 9: 1108-1122.

Kariko K, Muramatsu H, Welsh FA, Ludwig J, Kato H, Akira S, Weissman D. 2008. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther 16: 1833-1840.

Krieg PA, Melton DA. 1984. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Res 12: 7057-7070.

Lee G, et al. 2009. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature 461: 402-406.

Mackie GA. 1988. Vectors for the synthesis of specific RNAs in vitro. Biotechnology 10: 253-267.

Maehr R, Chen S, Snitow M, Ludwig T, Yagasaki L, Goland R, Leibel RL, Melton DA. 2009. Generation of pluripotent stem cells from patients with type 1 diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 15768-15773.

Petição 870180166239, de 21/12/2018, pág. 158/167

140/141

Martin SA, Paoletti E, Moss B. 1975. Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine-7-) methyltransferase from vaccinia virions. J Biol Chem 250: 9322-9329.

Myette JR, Niles EG. 1996. Domain structure of the vaccinia virus mRNA capping enzyme. Expression in Escherichia coli of a subdomain possessing the RNA 5'-triphosphatase and guanylyltransferase activities and a kinetic comparison to the full-size enzyme. J Biol Chem 271: 11936-11944.

Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. 2008. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol 26: 101-106.

Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S. 2008. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 322: 949-953.

Ozawa T, Kishi H, Muraguchi A. 2006. Amplification and analysis of cDNA generated from a single cell by 5'-RACE: application to isolation of antibody heavy and light chain variable gene sequences from single B cells. Biotechniques 40: 469-470, 472, 474 passim.

Peng ZH, Sharma V, Singleton SF, Gershon PD. 2002. Synthesis and application of a chain-terminating dinucleotide mRNA cap analog. Org Lett 4: 161-164.

Racila D et al. 2010. Transient expression of OCT 4 IS sufficient to allow human keratinocytes to change their differentiation pathway. Gene Therapy advance online publication, (October 28, 2010; doi:10.1038/gt.2010.148).

Shuman S. 1995. Capping enzyme in eukaryotic mRNA synthesis. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 50: 101-129.

Shuman. 2001. Structure, mechanism, and evolution of the mRNA capping apparatus. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 66: 1-40.

Shuman S, Surks M, Furneaux H, Hurwitz J. 1980. Purification and characterization of a GTP-pyrophosphate exchange activity from vaccinia virions. Association of the GTPpyrophosphate exchange activity with vaccinia mRNA guanylyltransferase. RNA (guanine-7)methyltransferase complex (capping enzyme). J Biol Chem 255: 11588-11598.

Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K. 2008. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 322: 945-949.

Petição 870180166239, de 21/12/2018, pág. 159/167

141/141

Stepinski J, Waddell C, Stolarski R, Darzynkiewicz E, Rhoads RE. 2001. Synthesis and properties of mRNAs containing the novel anti-reverse cap analogs 7-methyl(3'-Omethyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy)GpppG. RNA 7: 1486-1495.

Studier FW, Moffatt BA. 1986. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189: 113-130.

Szabo E, Rampalli S, Risueno RM, Schnerch A, Mitchell R, Fiebig-Comyn A, Levadoux-Martin M, Bhatia M. 2010. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468: 521-526.

Takahashi K, Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676.

Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-872.

Vierbuchen T et al. 2010. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463: 1035-1041.

Wang SP, Deng L, Ho CK, Shuman S. 1997. Phylogeny of mRNA capping enzymes. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 9573-9578.

Wilusz J, Shenk T. 1988. A 64 kd nuclear protein binds to RNA segments that include the AAUAAA polyadenylation motif. Cell 52: 221-228.

Woltjen K, et al. 2009. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 458: 766-770.

Xu C, Inokuma MS, Denham J, Golds K, Kundu P, Gold JD, Carpenter MK. 2001. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 19: 971974.

Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. 2009. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324: 797-801.

Yu J, et al. 2007. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318: 1917-1920.

Zhou H, et al. 2009. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell 4: 381-384.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método in vitro para reprogramar células somáticas humanas ou de outros mamíferos, que exibem um primeiro estado diferenciado ou fenótipo, para uma célula tronco pluripotente induzida (células iPS ou iPSCs), caracterizado pelo fato de que compreende:

a) introduzir nas referidas células que exibem um primeiro estado ou fenótipo diferenciado uma preparação de RNA purificada compreendendo moléculas de mRNA modificadas e sintetizadas in vitro que

- codificam uma pluralidade de 4 ou mais, 5 ou mais, ou 6 fatores de indução de iPSC selecionados do grupo que consiste em OCT4, SOX2, KLF4, MYC, NANOG e LIN28,

- compreendem um nucleosídeo modificado selecionado do grupo consistindo em pseudouridina (Ψ), 5-metiluridina (m⁵U) e 2-tiouridina (S²U) no lugar do nucleosídeo de uridina não modificado e 5-metilcitidina (m⁵C) no lugar do nucleosídeo de citidina não modificado correspondente, e

- exibem uma 5'-cap e uma cauda 3' poli(A);

em que as referidas moléculas de mRNA modificadas compõem a referida preparação de RNA purificada que são purificadas por um processo de purificação que compreende:

purificação das referidas moléculas de mRNA modificadas usando uma purificação por HPLC ou em coluna de fluxo por gravidade; e/ou tratar as referidas moléculas de mRNA modificadas com uma enzima ribonuclease III (RNase III) de tal modo que os produtos de digestão de RNase III pequenos são gerados, e purificar os referidos produtos de digestão de RNase III pequenos longe das referidas moléculas de mRNA modificadas, em que este processo remove: moléculas contaminantes de RNA que são imunogênicas e tóxicas para a célula por induzir uma resposta imune inata, como detectável por medição da secreção diminuída de citocina IFN-α ou TNF-α de células dendríticas transfectadas com as referidas moléculas de mRNA purificadas modificadas comparadas com a secreção da referida citocina de células dendríticas transfectadas com as moléculas mRNA modificadas não purificadas;

tal que a referida preparação de RNA purificada é livre de moléculas de RNA contaminantes que, se presentes, ativariam uma resposta imune nas referidas células

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2/4 suficiente para impedir a sobrevivência das referidas células e a geração das células reprogramadas; e

b) repetir a referida introdução da referida preparação de RNA purificado em vários dias e cultivar a célula, em que a célula é reprogramada para uma iPSC.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de mRNA modificadas, sintetizadas in vitro, exibem uma cauda poli-A 3' compreendendo 50 a 200 ou mais do que 150 nucleotídeos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as referidas moléculas contaminantes de RNA são selecionadas do grupo que consiste em moléculas de dsRNA e moléculas de mRNA sem cap.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida preparação de RNA purificada compreende moléculas de mRNA sintetizadas modificadas in vitro, em que:

(i) mais do que 98% das referidas moléculas de mRNA são capeadas;

(ii) as referidas moléculas de mRNA exibem um cap com uma estrutura cap1, em que o 2’hidroxil da ribose no penúltimo nucleotídeo com relação ao nucleotídeo cap é metilado;

(iii) a referida cauda poli-A compreende 50 a 200 ou mais que 150 nucleotídeos;

(iv) as referidas moléculas de mRNA modificadas exibem uma sequência particular selecionada do grupo consistindo em: uma sequência 5' UTR, uma sequência Kozak, uma sequência IRES, e uma sequência 3' UTR, em que a referida sequência particular resulta em uma maior tradução das moléculas de mRNA modificadas se comparadas com as mesmas moléculas de mRNA que não exibem a referida sequência particular, incluindo em que a referida sequência 5' UTR ou sequência 3' UTR é de um mRNA de alfa globina ou beta globina de Xenopus ou humano, ou em que a referida sequência 5' UTR é uma sequência de RNA de um vírus de tabaco etch (TEV).

(v) o nucleosídeo modificado com pseudouridina (Ψ) está presente no lugar de todos os nucleosídeos de uridina correspondentes não modificados;

(vi) as referidas moléculas de mRNA modificadas e sintetizadas in vitro compreendem ainda o nucleosídeo modificado com 5-metilcitidina (m⁵C) no lugar de uma porção dos nucleosídeos de citidina não modificados correspondentes; e/ou

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3/4 (vii) as referidas moléculas de mRNA modificadas codificam a referida pluralidade de 5 ou 6 fatores de indução de iPSC e/ou o referido MYC é selecionado de c-MYC, 1MYC e N-MYC.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as referidas moléculas de mRNA modificadas e sintetizadas in vitro compreendem nucleosídeo modificado com 5-metilcitidina (m⁵C) no lugar de todos os nucleosídeos de citidina correspondentes não modificados.
6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que cada referido nuclesídeo modificado é 5-metiluridina (m⁵U) ou pseudouridina que não é adicionalmente modificada (Ψ) e está presente no lugar de todos os referidos nucleosídeos de uridina correspondentes não modificados e/ou em que o referido nucleosídeo modificado é 5-metilcitidina (m⁵C) e está presente no lugar de todos os referidos nucleosídeos de citidina correspondentes não modificados.
7. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido nucleosídeo modificado é 2-tiouridina (s²U) e está presente no lugar de apenas uma porção do nucleosídeo de uridina não modificado correspondente e/ou é 5metilcitidina (m⁵C) e está presente no lugar de apenas uma porção do nucleosídeo de citidina não modificado correspondente.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que:

(a) a fração percentual dos resíduos de uridina no referido mRNA sintetizado in vitro, que são modificados pela presença do referido nucleosídeo 2-tiouridina (s2U) modificado, é selecionada do grupo que consiste em menos de 20% dos referidos resíduos de uridina, menos de 30% dos referidos resíduos de uridina, menos de 40% dos referidos resíduos de uridina, menos de 50% dos referidos resíduos de uridina, menos de 60% dos referidos resíduos de uridina e menos de 70% dos referidos resíduos de uridina, particularmente em que a referida fração percentual dos resíduos de uridina no referido mRNA sintetizado in vitro, que são modificados pela presença do referido nucleosídeo 2tiouridina (s2U) modificado, é selecionada do grupo que consiste em 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% e 60% dos referidos resíduos de uridina; e/ou (b) a fração percentual dos resíduos de citidina no referido mRNA sintetizado in vitro, que são modificados pela presença de m⁵C (5-metilcitidina) no lugar de citidina, é selecionada do grupo que consiste em menos de 20% dos referidos resíduos de citidina, menos de 30% dos referidos resíduos de citidina, menos de 40% dos referidos resíduos de

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4/4 citidina, menos de 50% dos referidos resíduos de citidina, menos de 60% dos referidos resíduos de citidina e menos de 70% dos referidos resíduos de citidina, particularmente em que a referida fração percentual dos resíduos de citidina, no referido mRNA sintetizado in vitro, que são modificados pela presença do referido nucleosídeo 5-metilcitidina modificado, é selecionada do grupo que consiste em 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% e 60% dos referidos resíduos de citidina.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por compreender ainda, após a referida introdução, o contato da referida célula com um fator de crescimento e/ou citocina.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por compreender introduzir na referida célula o mRNA modificado que codifica uma citocina ou fator de crescimento.
11. Composição caracterizada por compreender uma célula de mamífero contendo a preparação de RNA purificada ou as moléculas de mRNA modificadas e sintetizadas in vitro que compõem a referida preparação purificada de RNA, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.