JP2020534278A - 抗葉酸受容体α抗体コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

抗葉酸受容体α抗体コンジュゲート及びその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】葉酸受容体の特異的結合及び標的化には新しい抗体が必要である。【解決手段】本開示は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）並びにそのイソ型及びホモログに対する結合特異性を有する抗体コンジュゲートと、医薬組成物を含む、抗体コンジュゲートを含む組成物とに関する。可変軽鎖は、トラスツズマブのものである。抗体コンジュゲート及び組成物を製造する方法並びに治療及び診断方法などで抗体コンジュゲート及び組成物を使用する方法も提供される。抗体コンジュゲートは、Kabat、Chothia又はＥＵ番号付けスキームによるHC-F404、HC-K121、HC-Y180、HC-F241、HC-221、LC-T22、LC-S7、LC-N152、LC-K42、LC-E161、LC-D170、HC-S136、HC-S25、HC-A40、HC-S119、HC-S190、HC-K222、HC-R19、HC-Y52又はHC-S70からなる群から選択される部位に非天然アミノ酸を含む。【選択図】図１４Ｂ

Description

発明の分野
[0001] 葉酸受容体α（ＦｏｌＲα又はＦＯＬＲ１）に対する結合特異性を有する抗体コンジュゲートと、医薬組成物を含む、抗体コンジュゲートを含む組成物と、コンジュゲートを製造する方法と、コンジュゲート及び組成物を治療に使用する方法とが本明細書で提供される。コンジュゲート及び組成物は、細胞増殖及びがんの治療及び予防方法、細胞増殖及びがんの検出方法並びに細胞増殖及びがんの診断方法において有用である。コンジュゲート及び組成物は、自己免疫疾患、感染性疾患及び炎症状態の治療、予防、検出及び診断方法でも有用である。
背景
[0002] 葉酸受容体又は葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）は、生体内で葉酸及び他の化合物に結合して更新に寄与する単鎖糖タンパク質を含む。Elwood, 1989, J. Biol. Chem. 264:14893-14901。特定の葉酸受容体は、葉酸及びメトトレキサートなどの他の化合物に対して高親和性の結合部位を有する単鎖糖タンパク質である。Elwood, p. 14893。ヒトＦＯＬＲ１遺伝子は、３つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位を有する、約２５７個のアミノ酸を有する３０ｋＤａのポリペプチドである成人葉酸受容体をコードする。Elwood, p. 14893; Lacey et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:715-720。相同遺伝子及びポリペプチドは、数十の生物種で同定されている。
[0003] 成熟した葉酸受容体糖タンパク質のサイズは、約４２ｋＤａであり、葉酸及び抗葉酸の細胞内移行に関与することが観察されている。Elwood et al., 1997, Biochemistry 36:1467-1478。発現は、ヒトがん細胞株の他にヒト小脳及び腎臓細胞で観察されている。Elwood et al., 1997, p. 1467。葉酸の内部移行に加えて、葉酸受容体は、特にマールブルグ及びエボラウイルスなどのウイルスの細胞侵入の重要な補因子であることが示されている。Chan et al., 2001, Cell 106:117-126。これらの内部移行特性のために、葉酸受容体は、診断薬及び治療薬の標的として提案されてきた。例えば、葉酸受容体を発現する細胞への内部移行のために診断薬及び治療薬が葉酸と連結されている。例えば、Leamon, 2008, Curr. Opin. Investig. Drugs 9:1277-1286; Paulos et al., 2004, Adv. Drug Del. Rev. 56:1205-1217を参照されたい。
[0004] 葉酸受容体α（ＦｏｌＲα又はＦＯＬＲ１）は、葉酸に対して高親和性を有するグリコシルホスファチジルイノシトール連結細胞表面糖タンパク質である。腎臓及び肺における低レベルを除いて、ほとんどの正常組織は、ＦＯＬＲ１を発現しないが、漿液性及び類内膜上皮性卵巣がん、子宮内膜腺がん、腺がんサブタイプの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及びトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）では、高レベルのＦＯＬＲ１が発見されている。ＦＯＬＲ１発現は、卵巣がん患者の転移巣及び再発がんにおいて維持され、上皮性卵巣がん及び子宮内膜がんの化学療法後、ＦＯＬＲ１発現が観察されている。正常組織上のＦＯＬＲ１の非常に限られた発現と相俟って、これらの特性は、ＦＯＬＲ１をがん治療の非常に有望な標的にする。したがって、葉酸受容体は、がん及び炎症状態の診断及び治療のための潜在的標的を提供する。これらの葉酸受容体の特異的結合及び標的化には新しい抗体が必要である。
[0005] 葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の免疫調節と、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）によって活性化される下流シグナル伝達プロセスとを調整する改善された方法に対する必要性がある。さらに、がん形質転換細胞及びがん腫形質転換細胞における葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の特異的発現並びに非がん組織におけるより低い発現を考慮すると、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）を過剰発現する細胞及び組織を特異的に標的化し得る改善された治療薬に対する必要性がある。このような疾患の治療又は診断のために、ＦＯＬＲ１への抗体コンジュゲートを使用して、葉酸受容体αを発現する標的細胞に治療又は診断ペイロード部分が送達され得る。
概要
[0006] 葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）に選択的に結合する抗体コンジュゲートが本明細書で提供される。抗体コンジュゲートは、１つ又は複数のペイロード部分に連結された葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）に結合する抗体を含む。抗体は、共有結合によって直接的に又はリンカーを介して間接的にペイロードに連結され得る。葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体について、本明細書で詳細に説明され、有用なペイロード部分及び有用なリンカーについても同様である。
[0007] 別の態様では、抗体コンジュゲートを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。任意の適切な医薬組成物が使用され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与のための組成物である。さらなる態様では、抗体コンジュゲート又は医薬組成物を含むキットが本明細書で提供される。
[0008] 別の態様では、抗ＦＯＬＲ１抗体コンジュゲートを使用する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、葉酸受容体αを発現する標的細胞又は組織に１つ又は複数のペイロード部分を送達する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、治療方法である。いくつかの実施形態では、方法は、診断方法である。いくつかの実施形態では、方法は、分析方法である。いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートを使用して疾患又は病状が治療される。いくつかの態様では、疾患又は病状は、がん、自己免疫疾患及び感染症から選択される。
[0009] いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートは、ヒト葉酸受容体αに結合する。いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートは、ヒト葉酸受容体αのホモログにも結合する。いくつかの態様では、抗体コンジュゲートは、カニクイザル及び／又はマウス葉酸受容体αのホモログにも結合する。
図面の簡単な説明
[0010]ＣＤＲ−Ｈ１のKabat及びChothia番号付けシステム比較を提供する。Martin A.C.R. (2010). Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In R. Kontermann & S. Duebel (Eds.), Antibody Engineering vol. 2 (pp. 33-51). Springer-Verlag, Berlin Heidelbergから転用。 [0011]本明細書で提供される変異抗体からのＶＨ配列（配列番号３０８〜３６６）のアラインメントを提供する。ChothiaによるＣＤＲが強調表示され、KabatによるＣＤＲがボックスで囲まれる。 [0011]本明細書で提供される変異抗体からのＶＨ配列（配列番号３０８〜３６６）のアラインメントを提供する。ChothiaによるＣＤＲが強調表示され、KabatによるＣＤＲがボックスで囲まれる。 [0011]本明細書で提供される変異抗体からのＶＨ配列（配列番号３０８〜３６６）のアラインメントを提供する。ChothiaによるＣＤＲが強調表示され、KabatによるＣＤＲがボックスで囲まれる。 [0012]トラスツズマブ及び本明細書で提供される変異抗体からのＶＬ配列（配列番号３６７〜３６９）のアラインメントを提供する。ChothiaによるＣＤＲが強調表示され、KabatによるＣＤＲが下線で強調される。 [0013]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、ＫＢ子宮頸がん細胞を移植されたマウスの体重変化を図解するグラフである。 [0014]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、ＫＢ子宮頸がん細胞を移植されたマウスにおける、２５日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズを図解するグラフである。 [0014]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、ＫＢ子宮頸がん細胞を移植されたマウスにおける、２５日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズを図解するグラフである。 [0015]本明細書で開示される２種の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートでの単回用量治療後、ＫＢ子宮頸がん細胞を移植されたマウスにおける、３１日目の最終腫瘍サイズを示す散布図である。 [0016]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、ＫＢ子宮頸がん細胞を移植されたマウスの体重変化を図解するグラフである。 [0017]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、ＫＢ子宮頸がん細胞を移植されたマウスにおける、２１日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズを図解するグラフである。 [0017]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、ＫＢ子宮頸がん細胞を移植されたマウスにおける、２１日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズを図解するグラフである。 [0018]本明細書で開示される３種の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートでの単回用量治療後、ＫＢ子宮頸がん細胞を移植されたマウスにおける、３６日目の最終腫瘍サイズを示す散布図である。 [0019]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスの体重変化を図解するグラフである。 [0020]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける、２４日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズを図解するグラフである。 [0020]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける、２４日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズを図解するグラフである。 [0021]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの単回用量を投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスの腫瘍増殖曲線を図解するグラフである。 [0022] 本明細書で開示される異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートによる単回用量治療後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける、２１日目の腫瘍サイズを図解する散布図である。 [0023]異なる葉酸受容体イソ型（ｈＦＯＬＲ１、ｈＦＯＬＲ２）を安定に発現する２９３Ｔ形質転換細胞に対する、異なるＦＯＬＲ１抗体の結合を図解するプロットを含む。 [0024]異なる葉酸受容体イソ型（ｈＦＯＬＲ１、ｈＦＯＬＲ２）を安定に発現する２９３Ｔ形質転換細胞に対する、異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの細胞毒性活性を図解するプロットを含む。 [0025]本明細書で開示される様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスの体重変化を図解するグラフである。 [0026]本明細書で開示される様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける、２１日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズの散布図を含む。 [0026]本明細書で開示される様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける、２１日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズの散布図を含む。 [0026]本明細書で開示される様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける、２１日目の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズの散布図を含む。 [0027]本明細書で開示されるような様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける腫瘍サイズを図解するグラフを含む。 [0027]本明細書で開示されるような様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける腫瘍サイズを図解するグラフを含む。 [0027]本明細書で開示されるような様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける腫瘍サイズを図解するグラフを含む。 [0027]本明細書で開示されるような様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける腫瘍サイズを図解するグラフを含む。 [0028]本明細書で開示されるような様々な用量の異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された後、Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞を移植されたマウスにおける腫瘍増殖の遅延を図解するチャートである。 [0029]カルボプラチンあり又はなしの例示的ＦＯＬＲ−１抗体薬物コンジュゲートの単回用量で処置された、確立されたＩｇｒｏｖ１腫瘍を保有する動物における、腫瘍増殖チャート、２９日目の腫瘍サイズを図解する散布図及び２９日目の腫瘍増殖阻害を図解するチャートを含む。 [0029]カルボプラチンあり又はなしの例示的ＦＯＬＲ−１抗体薬物コンジュゲートの単回用量で処置された、確立されたＩｇｒｏｖ１腫瘍を保有する動物における、腫瘍増殖チャート、２９日目の腫瘍サイズを図解する散布図及び２９日目の腫瘍増殖阻害を図解するチャートを含む。 [0029]カルボプラチンあり又はなしの例示的ＦＯＬＲ−１抗体薬物コンジュゲートの単回用量で処置された、確立されたＩｇｒｏｖ１腫瘍を保有する動物における、腫瘍増殖チャート、２９日目の腫瘍サイズを図解する散布図及び２９日目の腫瘍増殖阻害を図解するチャートを含む。 [0030]確立されたＯＶＣＡＲ３腫瘍を有する動物における、腫瘍増殖チャート及び３１日目の腫瘍サイズを図解する散布図を含む。 [0030]確立されたＯＶＣＡＲ３腫瘍を有する動物における、腫瘍増殖チャート及び３１日目の腫瘍サイズを図解する散布図を含む。 [0031]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された様々な子宮内膜患者由来の異種移植モデルの腫瘍増殖曲線を含む。 [0031]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された様々な子宮内膜患者由来の異種移植モデルの腫瘍増殖曲線を含む。 [0031]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された様々な子宮内膜患者由来の異種移植モデルの腫瘍増殖曲線を含む。 [0031]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された様々な子宮内膜患者由来の異種移植モデルの腫瘍増殖曲線を含む。 [0031]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された様々な子宮内膜患者由来の異種移植モデルの腫瘍増殖曲線を含む。 [0031]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された様々な子宮内膜患者由来の異種移植モデルの腫瘍増殖曲線を含む。 [0031]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートを投与された様々な子宮内膜患者由来の異種移植モデルの腫瘍増殖曲線を含む。 [0032]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート、アベルマブ又は両方の組み合わせによる治療に応答した、ＭＣ３８−ｈＦＯＬＲ１腫瘍を有する動物の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズ散布図を含む。 [0032]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート、アベルマブ又は両方の組み合わせによる治療に応答した、ＭＣ３８−ｈＦＯＬＲ１腫瘍を有する動物の腫瘍増殖曲線及び腫瘍サイズ散布図を含む。 [0033]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート、アベルマブ又は両方の組み合わせによる治療に応答した、ＭＣ３８−ｈＦＯＬＲ１腫瘍を有する動物の腫瘍増殖曲線及びカプラン−マイヤー生存プロットを含む。 [0033]例示的ＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート、アベルマブ又は両方の組み合わせによる治療に応答した、ＭＣ３８−ｈＦＯＬＲ１腫瘍を有する動物の腫瘍増殖曲線及びカプラン−マイヤー生存プロットを含む。 [0034]ＳＣＩＤベージュマウスにおける、異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの薬物動態血漿プロファイルを図解するグラフである。 [0035]ビヒクル又はＡＤＣ分子１又は１７で処置されたマウスの血漿中で検出された、小分子のＬＣ／ＭＳトレースである。 [0036]ＳＣＩＤベージュマウスに投与された代表的なＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの血漿安定性（薬物抗体比又はＤＡＲによって測定される）を図解するグラフを含む。 [0037]ＰＢＳ、カニクイザル血漿又はヒト血漿中で試験された、様々なＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの血漿安定性（薬物抗体比又はＤＡＲによって測定される）を図解するグラフを含む。 [0038]競合相手としてのそれぞれの裸の抗体の存在下における、様々な細胞に対するＡＤＣ分子４及びＡＤＣ分子２１の細胞毒性活性を図解するグラフを含む。 [0039]本明細書で開示されるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの異化産物の様々な用量を投与されたラットにおける、体重変化を図解するグラフである。 [0040]カニクイザル血漿、ヒト血漿及びＰＢＳ中で試験された比較物質ＡＤＣと比較した、代表的なＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の安定性を図解するグラフである。 [0041]様々なレベルのＰｇＰを有する細胞で且つ特定のＰｇＰ阻害剤の存在下において、比較物質ＡＤＣのそれと比較した、本明細書で開示される代表的なＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の異化産物の細胞毒性活性を図解するグラフを含む。 [0042]確立されたＩｇｒｏｖ１腫瘍を有するマウスにおいて測定された比較物質ＡＤＣと比較した、本明細書で開示される代表的なＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の異化産物の腫瘍及び血漿レベルを図解するチャートである。 [0043]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）について、腫瘍増殖曲線及び２１日目の腫瘍サイズを図解する散布図を含む。 [0043]本明細書で開示されるような異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）について、腫瘍増殖曲線及び２１日目の腫瘍サイズを図解する散布図を含む。 [0044]ＳＣＩＤベージュマウスにおける、異なるＦＯＬＲ１抗体薬物コンジュゲートの薬物動態血漿プロファイルを図解するグラフである。
実施形態の詳細な説明
１．定義
[0045] 別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記法及び他の科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。場合により、明瞭化及び／又は容易な参照のために、一般に理解される意味を有する用語が本明細書で定義されるが、本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも当該技術分野で一般に理解されるものとの相違を表すと解釈されるべきではない。本明細書に記載されるか又は参照される技術及び手順は、当業者によって一般によく理解されており、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載される、幅広く利用される分子クローニング方法論などの従来の方法論を使用して一般に用いられる。適切な場合、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は、特に明記されない限り、製造業者が規定するプロトコル及び条件に従って実行される。
[0046] 本明細書で使用されるように、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」は、文脈上明白に別段の記載がない限り、複数の指示対象を含む。
[0047] 「約」という用語は、示された値及びその値の上下の範囲を示して包含する。特定の実施形態では、「約」という用語は、指定された値±１０％、±５％又は±１％を示す。特定の実施形態では、「約」という用語は、指定された値±その値の１標準偏差を示す。
[0048] 「それらの組み合わせ」という用語は、その用語が言及する要素のあらゆる可能な組み合わせを含む。例えば、「α２がＡであれば、α３はＤでない；α５はＳでない；若しくはα６はＳでない；又はそれらの組み合わせ」と述べる文は、α２がＡである場合、次の組み合わせを含む：（１）α３はＤでない；（２）α５はＳでない；（３）α６はＳでない；（４）α３はＤでなく；α５はＳでなく；且つα６はＳでない；（５）α３はＤでなく、且つα５はＳでない；（６）α３はＤでなく、且つα６はＳでない；及び（７）α５はＳでなく、且つα６はＳでない。
[0049] 「葉酸受容体α」及び「葉酸受容体１」という用語は、本明細書で同義的に使用される。葉酸受容体αは、特に、ＦＯＬＲ１、ＦｏｌＲα、葉酸結合タンパク質、ＦＢＰ、成体葉酸結合タンパク質、Ｆｏｌｂｐ１、ＦＲ−α、ＦＲα、ＫＢ細胞ＦＢＰ及び卵巣腫瘍関連抗原ＭＯｖ１８をはじめとする同義語によっても知られている。特に明記されない限り、用語は、細胞によって天然に発現されるか、又は葉酸受容体α又はＦＯＬＲ１遺伝子で形質移入された細胞によって発現されるヒト葉酸受容体αのあらゆる変異型、イソ型及び種ホモログを含む。葉酸受容体αタンパク質としては、例えば、ヒト葉酸受容体α（配列番号１）が挙げられる。いくつかの実施形態では、葉酸受容体αタンパク質は、カニクイザル葉酸受容体α（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態では、葉酸受容体αタンパク質は、マウス葉酸受容体α（配列番号３）を含む。
[0050] 「免疫グロブリン」という用語は、２対のポリペプチド鎖、すなわち軽（Ｌ）鎖の対及び重（Ｈ）鎖の対を一般に含む、構造的に関連するタンパク質のクラスを指す。「無傷の免疫グロブリン」中では、これらの４本の鎖の全てがジスルフィド結合によって相互接連結する。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている。例えば、Paul, Fundamental Immunology 7th ed., Ch. 5 (2013) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PAを参照されたい。簡潔に述べると、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、典型的には、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と略記される３つのドメインを含む。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的には、ＣＬと略記される１つのドメインを含む。
[0051] 「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のタイプを表し、本明細書ではその最も広い意味で使用される。抗体としては、特に、無傷の抗体（例えば、無傷の免疫グロブリン）及び抗体断片が挙げられる。抗体は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインの一例は、ＶＨ−ＶＬ二量体によって形成される抗原結合ドメインである。「葉酸受容体α抗体」、「抗葉酸受容体α抗体」、「葉酸受容体αＡｂ」、「葉酸受容体α特異的抗体」、「抗葉酸受容体αＡｂ」、「ＦＯＬＲ１抗体」、「ＦｏｌＲα抗体」、「抗ＦＯＬＲ１抗体」、「抗ＦｏｌＲα抗体」、「ＦＯＬＲ１ Ａｂ」、「ＦｏｌＲα Ａｂ」、「ＦＯＬＲ１特異的抗体」、「ＦｏｌＲα特異的抗体」、「抗ＦｏｌＲαＡｂ」又は「抗ＦＯＬＲ１ Ａｂ」は、本明細書に記載される、葉酸受容体α又はＦＯＬＲ１に特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の細胞外ドメインに結合する。
[0052] ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存されている領域がその中に散在する超可変性領域（「超可変領域（ＨＶＲｓ）」；「相補的決定領域」（ＣＤＲ）とも称される）にさらに細分化され得る。より保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。各ＶＨ及びＶＬは、一般に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序（Ｎ末端からＣ末端方向）で配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。ＣＤＲは、抗原結合に関与し、抗体の抗原特異性及び結合親和性に影響を及ぼす。その全体が参照により援用される、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDを参照されたい。
[0053] あらゆる脊椎動物種の軽鎖は、定常ドメインの配列に基づいて、κ及びλと称される２つのタイプの１つに割り当てられ得る。
[0054] 脊椎動物種の重鎖は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの異なるクラス（又はイソタイプ）の１つに割り当てられ得る。これらのクラスは、それぞれα、δ、ε、γ及びμとも称される。ＩｇＧ及びＩｇＡクラスは、配列及び機能の違いに基づいてサブクラスにさらに分類される。ヒトは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスを発現する。
[0055] ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、それぞれその内容全体が参照により援用される、Kabat et al., supra (“Kabat”numbering scheme); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948 (“Chothia”numbering scheme); MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 (“Contact”numbering scheme); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 (“IMGT”numbering scheme);及びHonegge and Plueckthun, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70 (“AHo”numbering scheme)によって記載されるものをはじめとする、いくつかの既知の番号付けスキームのいずれかを使用して、当業者によって判定され得る。
[0056] 表１は、Kabat及びChothiaスキームによって同定されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３の位置を提供する。ＣＤＲ−Ｈ１では、Kabat及びChothiaの両方の番号付けスキームを使用して、残基の番号付けが提供される。
[0057] 特に明記されない限り、本明細書で特定のＣＤＲの同定に使用される番号付けスキームは、Kabat／Chothia番号付けスキームである。これらの２つの番号付けスキームに包含される残基が異なる場合（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１及び／又はＣＤＲ−Ｈ２）、番号付けスキームは、Kabat又はChothiaとして規定される。便宜上、本明細書では、ＣＤＲ−Ｈ３は、ときにKabat又はChothiaのいずれかで称される。しかし、これは、それらが存在しない場合の配列の違いを暗示することを意図するものではなく、当業者は、配列を調べることにより、配列が同じであるか又は異なるかを容易に確認し得る。
[0058] ＣＤＲは、例えば、www.bioinf.org.uk/abs/abnum/で利用でき、その全体が参照により援用される、Abhinandan and Martin, Immunology, 2008, 45:3832-3839に記載される、Abnumなどの抗体番号付けソフトウェアを使用して割り当てられ得る。
[0059] 「ＥＵ番号付けスキーム」は、抗体重鎖定常領域（例えば、前出のKabat et al.で報告される）の残基を指すときに一般的に使用される。特に明記されない限り、ＥＵ番号付けスキームを使用して、本明細書に記載される抗体重鎖定常領域の残基に言及する。
[0060] 「抗体断片」は、無傷抗体の抗原結合領域又は可変領域などの無傷抗体の部分を含む。抗体断片としては、例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）断片及びｓｃＦｖ−Ｆｃ断片が挙げられる。
[0061] 「Ｆｖ」断片は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの非共有結合で連結された二量体を含む。
[0062] 「Ｆａｂ」断片は、重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、例えば、組換え法又は完全長抗体のパパイン消化によって作製され得る。
[0063] 「Ｆ（ａｂ’）２」断片は、ジスルフィド結合によってヒンジ領域の付近で結合した２つのＦａｂ’断片を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えば、組換え法又は無傷抗体のペプシン消化によって作製され得る。Ｆ（ａｂ’）断片は、例えば、β−メルカプトエタノールによる処理によって解離され得る。
[0064] 「単鎖Ｆｖ」、又は「ｓＦｖ」、又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、単一ポリペプチド鎖中にＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ＶＨ及びＶＬは、一般に、ペプチドリンカーによって連結される。Plueckthun A. (1994)を参照されたい。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３７７である。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３７８である。その全体が参照により援用される、Antibodies from Escherichia coli. In Rosenberg M. & Moore G.P. (Eds.), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, New York。
[0065] 「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」断片は、Ｆｃドメインに付着したｓｃＦｖを含む。例えば、Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖのＣ末端に付着され得る。Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖの可変ドメインの方向（すなわちＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ）次第で、ＶＨ又はＶＬの後に続き得る。当該技術分野で公知の又は本明細書に記載される任意の適切なＦｃドメインが使用され得る。場合により、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、配列番号３７０又はその部分を含む。配列番号３７０は、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の配列を提供する。
[0066] 「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団からの抗体を指す。実質的に均一な抗体の集団は、モノクローナル抗体の産生中に通常生じ得る変異型以外、実質的に類似して同一エピトープに結合する抗体を含む。このような変異型は、一般に微量のみ存在する。モノクローナル抗体は、典型的には、複数の抗体から単一の抗体を選択することを含むプロセスによって得られる。例えば、選択過程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、酵母クローン、細菌クローン又は他の組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからのユニークなクローンの選択であり得る。選択された抗体は、例えば、標的に対する親和性を改善し（「親和性成熟」）、抗体をヒト化し、細胞培養におけるその産生を改善し、及び／又は対象におけるその免疫原性を低下させるためにさらに改変され得る。
[0067] 「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来する一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
[0068] 非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、一般に、１つ又は複数のＣＤＲからの残基が非ヒト抗体（供与者抗体）の１つ又は複数のＣＤＲからの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。供与者抗体は、所望の特異性、親和性又は生物学的効果を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又は非ヒト霊長類抗体などの任意の適切な非ヒト抗体であり得る。場合により、受容者抗体の選択されたフレームワーク領域残基は、供与者抗体からの対応するフレームワーク領域残基によって置換される。ヒト化抗体は、受容者抗体又は供与者抗体のいずれにも見られない残基も含み得る。このような修飾は、抗体機能をさらに洗練するためになされ得る。より詳細には、それぞれその内容全体が参照により援用される、Jones et al., Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323-329;及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596を参照されたい。
[0069] 「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するか、又はヒト抗体レパートリー又はヒト抗体コード配列（例えば、ヒト供給源から入手されか又は新規に設計される）を利用する非ヒト供給源に由来するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体は、ヒト化抗体を明確に除外する。
[0070] 「単離された抗体」は、その自然環境の構成要素から分離及び／又は回収されたものである。自然環境の構成要素は、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性物質を含み得る。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、例えば、スピニングカップ配列決定装置の使用により、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製される。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、クマシーブルー又は銀染色による検出を伴う還元又は非還元条件下でのゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、均質になるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないことから、単離された抗体は、組換え細胞内の原位置抗体を含む。いくつかの態様では、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
[0071] いくつかの実施形態では、単離された抗体は、少なくとも８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％又は９９重量％まで精製される。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、少なくとも８０容積％、８５容積％、９０容積％、９５容積％又は９９容積％まで精製される。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、少なくとも８５重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％〜１００重量％を含む溶液として提供される。いくつかの態様では、単離された抗体は、少なくとも８５容積％、９０容積％、９５容積％、９８容積％、９９容積％〜１００容積％を含む溶液として提供される。
[0072] 「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に明記されない限り、本明細書の用法では、「結合親和性」は、結合対メンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有結合親和力を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（ＫＤ）で表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものをはじめとする、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。親和性は、例えば、ビアコア（登録商標）機器などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して判定され得る。いくつかの実施形態では、親和性は、２５℃で判定される。
[0073] 標的分子への抗体の結合に関して、特定の抗原（例えば、ポリペプチド標的）又は特定の抗原上のエピトープに「特異的結合」、「特異的に結合する」、「特異的な」、「選択的に結合する」及び「選択的」という用語は、非特異的又は非選択的相互作用と測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して、分子の結合を判定することによって測定され得る。特異的結合は、標的上の抗体結合部位を模倣する対照分子との競合によっても判定され得る。その場合、標的への抗体の結合が対照分子によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示唆される。
[0074] 「ｋｄ」（秒−１）という用語は、本明細書の用法では、特定の抗体抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値は、ｋｏｆｆ値とも称される。
[0075] 「ｋａ」（Ｍ−１×秒−１）という用語は、本明細書の用法では、特定の抗体抗原相互作用の結合速度定数を指す。この値は、ｋｏｎ値とも称される。
[0076] 「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、本明細書の用法では、特定の抗体抗原の相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。
[0077] 「ＫＡ」（Ｍ−１）という用語は、本明細書の用法では、特定の抗体抗原相互作用の結合平衡定数を指す。ＫＡ＝ｋａ／ｋｄ。
[0078] 「親和性成熟」抗体は、改変のない親抗体と比較して、その抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、１つ又は複数のＣＤＲ又はＦＲの１つ又は複数の改変を有するものである。一実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対するナノモル濃度又はピコモル濃度親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して製造され得る。例えば、Marks et al.（その全体が参照により援用されるBio/Technology, 1992, 10:779-783）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載する。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基ランダム変異誘発は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91:3809-3813); Schier et al., Gene, 1995, 169:147-155; Yelton et al., J. Immunol., 1995, 155:1994-2004; Jackson et al., J. Immunol., 1995, 154:3310-33199;及びHawkins et al, J. Mol. Biol., 1992, 226:889-896によって記載される。
[0079] 本明細書で２つ以上の抗体に関連して使用される場合、「競合する」又は「交差競合する」という用語は、２つ以上の抗体が抗原（例えば、葉酸受容体α又はＦＯＬＲ１）への結合について競合することを示す。１つの例示的なアッセイでは、ＦＯＬＲ１がプレート上に被覆されて第１の抗体に結合され、その後、第２の標識された抗体が添加される。一次抗体の存在が二次抗体の結合を減少させる場合、抗体は、競合する。別の例示的アッセイでは、第１の抗体がプレートに被覆されて抗原に結合され、次に第２の抗体が添加される。「競合する」という用語は、１つの抗体が別の抗体の結合を減少させるが、抗体を逆の順序で添加した場合に競合が観察されない抗体の組み合わせも含む。しかし、いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体は、それらが添加される順序に関係なく、相互に結合を阻害する。いくつかの実施形態では、１つの抗体は、別の抗体のその抗原への結合を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少させる。
[0080] 「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合ができる抗原の一部を意味する。エピトープは、表面にアクセス可能なアミノ酸残基及び／又は糖側鎖からなることが多く、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。立体構造的及び非立体構造的エピトープは、変性溶媒の存在下において、前者への結合が失われるが、後者への結合が失われないことによって区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。抗体がそれに結合するエピトープは、例えば、異なる点変異を有する葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の変異型への抗体結合の試験などのエピトープ判定のための既知の技術を使用して判定され得る。
[0081] ポリペプチド配列と参照配列との間の「同一性」百分率は、配列を整列させ必要に応じてギャップを導入し、最大配列同一性百分率を達成した後、参照配列中のアミノ酸残基と同一である、ポリペプチド配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を判定するためのアライメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN（DNASTAR）、CLUSTALW、CLUSTAL OMEGA又はMUSCLEソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当該技術範囲内の様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムをはじめとする、配列を整列させるための適切なパラメーターを判定し得る。
[0082] 「保存的置換」又は「保存的アミノ酸置換」は、化学的又は機能的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を指す。類似アミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野で周知である。このような置換を有するポリペプチド配列は、「保存的に修飾された変異型」として知られている。このような保存的に修飾された変異型は、多型変異型、種間ホモログ及び対立遺伝子に加えられ、それらを除外しない。例として、表２〜４に提供されるアミノ酸の群は、いくつかの実施形態では、互いの保存的置換と見なされる。
[0083] 追加的な保存的置換は、例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties 2nd ed. (1993) W. H. Freeman & Co., New York, NYにある。親抗体のアミノ酸残基の１つ又は複数の保存的置換を作り出すことによって作製される抗体は、「保存的に修飾された変異型」と呼ばれる。
[0084] 「アミノ酸」という用語は、２０種の一般的な天然アミノ酸を指す。天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が挙げられる。
[0085] 天然にコードされるアミノ酸は、当業者に知られているタンパク質構成アミノ酸である。それらとしては、２０種の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）並びにあまり一般的でないピロリシン及びセレノシステインが挙げられる。天然にコードされたアミノ酸としては、プレニル化アミノ酸、イソプレニル化アミノ酸、ミリソイル化アミノ酸、パルミトイル化アミノ酸、Ｎ結合グリコシル化アミノ酸、Ｏ結合グリコシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸及びアシル化アミノ酸などの２２種の天然アミノ酸の翻訳後変異型が挙げられる。
[0086] 「非天然アミノ酸」という用語は、タンパク質構成アミノ酸ではないアミノ酸又はその翻訳後修飾変異型を指す。特に、この用語は、２０種の一般的なアミノ酸の１つではないアミノ酸又はピロリジン若しくはセレノシステイン或いはそれらの翻訳後修飾変異型を指す。
[0087] 「コンジュゲート」又は「抗体コンジュゲート」という用語は、１つ又は複数のペイロード部分に連結された抗体を指す。抗体は、本明細書に記載される任意の抗体であり得る。ペイロードは、本明細書に記載される任意のペイロードであり得る。抗体は、共有結合を介してペイロードに直接連結され得るか、又は抗体は、リンカーを介して間接的にペイロードに連結され得る。典型的には、リンカーは、抗体に共有結合され、ペイロードにも共有結合される。「抗体薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」という用語は、少なくとも１つのペイロードが薬物などの治療的部分であるコンジュゲートを指す。
[0088] 「ペイロード」という用語は、抗体に共役され得る分子部分を指す。特定の実施形態では、ペイロードは、治療的部分及び標識部分からなる群から選択される。
[0089] 「リンカー」という用語は、少なくとも２つの共有結合を形成できる分子部分を指す。典型的には、リンカーは、抗体に対する少なくとも１つの共有結合と、ペイロードに対する少なくとも別の共有結合とを形成できる。特定の実施形態では、リンカーは、抗体に対して２つ以上の共有結合を形成し得る。特定の実施形態では、リンカーは、ペイロードに対する２つ以上の共有結合を形成し得るか、又は２つ以上のペイロードに対する共有結合を形成し得る。リンカーが抗体若しくはペイロード又は両方への結合を形成した後、残りの構造、すなわち１つ又は複数の共有結合が形成された後のリンカーの残基は、本明細書では依然として「リンカー」と称されることがある。「リンカー前駆体」という用語は、抗体若しくはペイロード又は両方との共有結合を形成できる、１つ又は複数の反応基を有するリンカーを指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。例えば、切断可能なリンカーは、操作されてもされなくてもよい生体不安定官能基によって放出されるリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断不能なリンカーである。例えば、切断不能なリンカーは、抗体の分解に際して放出されるリンカーであり得る。
[0090] 任意の疾患又は障害を「治療する」又は「治療」は、特定の実施形態では、対象に存在する疾患又は障害を改善することを指す。別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、対象が識別できなくてもよい少なくとも１つの物理的パラメーターを改善することを含む。さらに別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、身体的（例えば、識別可能な症状の安定化）又は生理学的（例えば、身体的パラメータの安定化）のいずれか又はその両方で疾患又は障害を調節することを含む。さらに別の実施形態では、「治療する」又は「治療」は、疾患又は障害の発症を遅延させるか又は予防することを含む。
[0091] 本明細書の用法では、「治療有効量」又は「有効量」という用語は、対象に投与したとき、疾患又は障害を治療するのに有効な抗体又は組成物の量を指す。いくつかの実施形態では、治療的有効量又は有効量は、対象に投与したとき、疾患又は疾患の進行を予防若しくは改善するか又は症状の改善をもたらすのに有効な抗体又は組成物の量を指す。
[0092] 本明細書の用法では、「増殖を阻害する」（例えば、腫瘍細胞などの細胞を指して）という用語は、ＦＯＬＲ１抗体と接触していない同一細胞の増殖と比較した、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体に接触したときの細胞増殖（例えば、腫瘍細胞増殖）のあらゆる測定可能な減少を含むことを意図する。いくつかの実施形態では、増殖は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％又は１００％阻害され得る。細胞増殖の減少は、抗体内部移行、アポトーシス、壊死及び／又はエフェクター機能媒介活性をはじめとするが、これに限定されるものではない様々な機序によって生じ得る。
[0093] 本明細書の用法では、「対象」という用語は、哺乳類対象を意味する。例示的な対象としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、鳥類、ヤギ及びヒツジが含まれるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書で提供される抗体で治療又は診断され得る疾患を有する。いくつかの実施形態では、疾患は、胃がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮内膜がん、前立腺がん及び／又は上皮起源のがんである。
[0094] 本明細書で示されるいくつかの化学構造では、特定の置換基、化学基及び原子は、１つ又は複数の結合と交差する曲線／波線（例えば、
）で描写され、これは、それを介して置換基、化学基及び原子が結合する原子を示す。例えば、
などであるが、これに限定されるものではないいくつかの構造では、この曲線／波線は、図示される化学物質が結合するコンジュゲート又はリンカー−ペイロード構造の主鎖内の原子を示す。
などであるが、これに限定されるものではないいくつかの構造では、この曲線／波線は、抗体又は抗体断片中の原子並びに図示される化学物質が結合するコンジュゲート又はリンカー−ペイロード構造の主鎖中の原子を示す。
[0095] 「部位特異的」という用語は、ポリペプチドの所定の配列位置におけるポリペプチドの修飾を指す。修飾は、多様性がわずか又は皆無であるポリペプチドの単一の予測可能な残基にある。特定の実施形態では、修飾アミノ酸は、例えば、組換え的に又は合成的に配列位置に導入される。同様に、部分は、ポリペプチド中の特定の配列位置において残基に「部位特異的に」連結され得る。特定の実施形態では、ポリペプチドは、２つ以上の部位特異的修飾を含み得る。
２．コンジュゲート
[0096] 葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１又はＦｏｌＲα）への抗体のコンジュゲートが本明細書で提供される。コンジュゲートは、リンカーを介して直接的又は間接的にペイロードに共有結合された、ＦＯＬＲ１に対する抗体を含む。特定の実施形態では、抗体は、１つのペイロードに連結される。さらなる実施形態では、抗体は、２つ以上のペイロードに連結される。特定の実施形態では、抗体は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又はそれを超えるペイロードに連結される。
[0097] ペイロードは、専門家によって有用と見なされる任意のペイロードであり得る。特定の実施形態では、ペイロードは、治療的部分である。特定の実施形態では、ペイロードは、例えば、標識などの診断的部分である。有用なペイロードについては、以下のセクション及び実施例で説明される。
[0098] リンカーは、抗体への少なくとも１つの結合及びペイロードへの少なくとも１つの結合を形成できる任意のリンカーであり得る。有用なリンカーについては、以下のセクション及び実施例で説明される。
[0099] 本明細書で提供されるコンジュゲート中において、抗体は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１又はＦｏｌＲα）に対して結合特異性を有する、任意の抗体であり得る。ＦＯＬＲ１は、任意の種に由来し得る。特定の実施形態では、ＦＯＬＲ１は、脊椎動物ＦＯＬＲ１である。特定の実施形態では、ＦＯＬＲ１は、哺乳類ＦＯＬＲ１である。特定の実施形態では、ＦＯＬＲ１は、ヒトＦＯＬＲ１である。特定の実施形態では、ＦＯＬＲ１は、マウスＦＯＬＲ１である。特定の実施形態では、ＦＯＬＲ１は、カニクイザルＦＯＬＲ１である。
[00100] 特定の実施形態では、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１又はＦｏｌＲα）に対する抗体は、結合について、本明細書に記載される抗体と競合する。特定の実施形態では、ＦＯＬＲ１に対する抗体は、本明細書に記載される抗体と同じエピトープに結合する。
[00101] 抗体は、典型的には、複数のポリペプチド鎖を含むタンパク質である。特定の実施形態では、抗体は、２本の同一軽（Ｌ）鎖と２本の同一重（Ｈ）鎖とを含むヘテロ四量体である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され得る。各重鎖は、１つ又は複数の共有ジスルフィド結合によって他の重鎖に連結され得る。各重鎖及び各軽鎖は、１つ又は複数の鎖内ジスルフィド結合も有し得る。当業者に知られているように、各重鎖は、典型的には、可変ドメイン（ＶＨ）を含み、いくつかの定常ドメインンがそれに続く。各軽鎖は、典型的には、一端に可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメインを含む。当業者に知られているように、抗体は、典型的には、それらの標的分子、すなわち抗原に対する選択的親和性を有する。
[00102] 本明細書で提供される抗体は、当業者に知られている任意の抗体形態を有し得る。それらは、完全長又は断片であり得る。例示的な完全長抗体としては、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭなどが挙げられる。例示的な断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆｃ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃなどが挙げられる。
[00103] 特定の実施形態では、コンジュゲートの抗体は、本明細書に記載されるＣＤＲ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを含む。特定の実施形態では、コンジュゲートの抗体は、本明細書に記載される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートの抗体は、本明細書に記載される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートの抗体は、本明細書に記載される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び本明細書に記載される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施形態では、コンジュゲートの抗体は、本明細書に記載される重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対（ＶＨ−ＶＬ対）とを含む。
[00104] 特定の実施形態では、抗体コンジュゲートは、１つ又は複数の反応基を含む抗体から形成され得る。特定の実施形態では、抗体コンジュゲートは、全ての天然にコードされたアミノ酸を含む抗体から形成され得る。当業者は、いくつかの天然にコードされたアミノ酸が、ペイロード又はリンカーに共役できる反応基を含むことを認識するであろう。これらの反応基としては、システイン側鎖、リジン側鎖及びアミノ末端基が挙げられる。これらの実施形態では、抗体コンジュゲートは、抗体反応基の残基に連結されたペイロード又はリンカーを含み得る。これらの実施形態では、ペイロード前駆体又はリンカー前駆体は、抗体反応基との結合を形成できる反応基を含む。典型的な反応基としては、マレイミド基、活性化炭酸塩（ｐ−ニトロフェニルエステルをはじめとするが、これに限定されるものではない）、活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステル及びアルデヒドをはじめとするが、これに限定されるものではない）が挙げられる。特に有用な反応基としては、例えば、システイン及びリジン側鎖への結合を形成するためのＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのマレイミド及びスクシンイミドが挙げられる。さらなる反応基については、以下のセクション及び実施例で説明される。
[00105] さらなる実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるように、反応基を有する１つ又は複数の修飾アミノ酸を含む。典型的には、修飾アミノ酸は、天然にコードされたアミノ酸でない。これらの修飾アミノ酸は、リンカー前駆体又はペイロード前駆体への共有結合を形成するのに有用な反応基を含み得る。当業者は、反応基を使用して、修飾アミノ酸への共有結合を形成できる任意の分子実体にポリペプチドを連結させ得る。したがって、リンカーを介して直接的に又は間接的にペイロードに連結された、修飾アミノ酸残基を含む抗体を含むコンジュゲートが本明細書で提供される。例示的な修飾アミノ酸については、以下のセクションで説明される。一般に、修飾されたアミノ酸は、相補的反応基を有するリンカー又はペイロードへの結合を形成できる反応基を有する。
[00106] 非天然アミノ酸は、抗体のポリペプチド鎖の選択された位置に配置される。これらの場所は、非天然アミノ酸による置換の最適部位を提供するものとして同定される。各部位は、抗体を産生するための最適構造、機能及び／又は方法を備えた非天然アミノ酸を保有し得る。
[00107] 特定の実施形態では、置換のための部位特異的位置は、安定な抗体を提供する。安定性は、当業者に明らかな任意の技術によって測定され得る。
[00108] 特定の実施形態では、置換のための部位特異的位置は、最適機能的特性を有する抗体を提供する。例えば、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して、その標的抗原に対する結合親和性のわずか又は皆無の損失を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して結合の強化を示し得る。
[00109] 特定の実施形態では、置換のための部位特異的位置は、有利に生成され得る抗体を提供する。例えば、特定の実施形態では、抗体は、以下で考察されるその合成方法において有利な特性を示す。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して生産における収量のわずか又は皆無の損失を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して生産における収量の強化を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較してｔＲＮＡ抑制のわずか又は皆無の損失を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して生産におけるｔＲＮＡ抑制の強化を示し得る。
[00110] 特定の実施形態では、置換のための部位特異的位置は、有利な溶解度を有する抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して溶解度のわずか又は皆無の損失を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して溶解度の強化を示し得る。
[00111] 特定の実施形態では、置換のための部位特異的位置は、有利な発現を有する抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して発現のわずか又は皆無の損失を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して発現の強化を示し得る。
[00112] 特定の実施形態では、置換のための部位特異的位置は、有利な折り畳みを有する抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して適切な折り畳みのわずか又は皆無の損失を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、部位特異的非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して折り畳みの強化を示し得る。
[00113] 特定の実施形態では、置換のための部位特異的位置は、有利な共役が可能な抗体を提供する。下述するように、いくつかの非天然アミノ酸は、直接的に又はリンカーを介してのいずれかで第２の薬剤への抗体の共役を容易にする、側鎖又は官能基を有する。特定の実施形態では、抗体は、他の位置に同一又は他の非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して増強された共役効率を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、他の位置に同一又は他の非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して増強された共役収率を示し得る。特定の実施形態では、抗体は、他の位置に同一又は他の非天然アミノ酸を含まない抗体と比較して増強された共役特異性を示し得る。
[00114] １つ又は複数の非天然アミノ酸は、抗体の少なくとも１つのポリペプチド鎖中の選択された部位特異的位置に配置される。ポリペプチド鎖は、限定なしに軽鎖又は重鎖のいずれかを含む、抗体の任意のポリペプチド鎖であり得る。部位特異的位置は、任意の可変ドメイン及び任意の定常ドメインを含む、抗体の任意のドメインであり得る。
[00115] 特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、部位特異的位置に１つの非天然アミノ酸を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、部位特異的位置に２つの非天然アミノ酸を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、部位特異的位置に３つの非天然アミノ酸を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、部位特異的位置に３つを超える非天然アミノ酸を含む。
[00116] 特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、Kabat又はChothia又はＥＵの番号付けスキームによる重鎖又は軽鎖残基ＨＣ−Ｆ４０４、ＨＣ−Ｋ１２１、ＨＣ−Ｙ１８０、ＨＣ−Ｆ２４１、ＨＣ−２２１、ＬＣ−Ｔ２２、ＬＣ−Ｓ７、ＬＣ−Ｎ１５２、ＬＣ−Ｋ４２、ＬＣ−Ｅ１６１、ＬＣ−Ｄ１７０、ＨＣ−Ｓ１３６、ＨＣ−Ｓ２５、ＨＣ−Ａ４０、ＨＣ−Ｓ１１９、ＨＣ−Ｓ１９０、ＨＣ−Ｋ２２２、ＨＣ−Ｒ１９、ＨＣ−Ｙ５２又はＨＣ−Ｓ７０からなる群から選択される位置にそれぞれ１つ若しくは複数の非天然アミノ酸又はその翻訳後修飾変異型を含む。これらの命名では、ＨＣは、重鎖残基を示し、ＬＣは、軽鎖残基を示す。
[00117] 特定の実施形態では、式（Ｃ１）又は（Ｃ２）：
によるコンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩、溶媒和化合物、立体異性体、位置異性体又は互変異性体が本明細書で提供され、式中、
ＣＯＭＰは、抗ＦＯＬＲ１抗体の残基であり；
ＰＡＹは、ペイロード部分であり；
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４及びＷ５は、それぞれ独立して、単結合、不在又は二価の結合基であり；
ＥＧは、不在又はエリミネーター基であり；
各ＲＴは、式（Ｃ１）又は（Ｃ２）の主鎖中の放出トリガー基であるか又はＥＧに結合し、各ＲＴは、任意選択的であり；
ＨＰは、単結合、不在又は二価親水基であり；
ＳＧは、単結合、不在又は二価スペーサー基であり；
Ｒは、水素、末端共役基又は末端共役基の二価残基である。
[00118] いくつかの実施形態では、式（Ｃ１）又は（Ｃ２）によるコンジュゲートは、ｎ個のＰＡＹ部分を含み、式中、ｎは、１〜８の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。いくつかの実施形態では、ｎは、５である。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。いくつかの実施形態では、ｎは、７である。いくつかの実施形態では、ｎは、８である。
結合基
[00119] 結合基は、エリミネーター基、放出トリガー基、疎水性基、スペーサー基及び／又は共役基の化合物への組み込みを容易にする。有用な結合基は、当業者に知られており、当業者に明白である。有用な結合基の例は、本明細書で提供される。特定の実施形態では、結合基は、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４又はＷ５と称される。特定の実施形態では、結合基は、二価ケトン、二価エステル、二価エーテル、二価アミド、二価アミン、アルキレン、アリーレン、スルフィド、ジスルフィド、カルボニレン又はそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、結合基は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨ−アルキル−、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−若しくはその逆転（例えば、−ＮＨＣ（Ｏ）−）又はそれらの組み合わせを含み得る。
エリミネーター基
[00120] エリミネーター基は、生体内及び／又は生体外で、本明細書に記載される化合物又はコンジュゲートの生物学的活性部分の、化合物又はコンジュゲートの残部からの分離を容易にする。エリミネーター基は、放出トリガー基と連動して、本明細書に記載される化合物又はコンジュゲートの生物学的活性部分の分離も容易にし得る。例えば、エリミネーター基及び放出トリガー基は、放出反応において反応し、生体内及び／又は生体外で、本明細書に記載される化合物又はコンジュゲートの生物学的活性部分を化合物又はコンジュゲートから放出し得る。放出トリガーによる放出反応の開始に際して、エリミネーター基は、生物学的活性部分又は生物学的活性部分のプロドラッグ形態を切断し、生物学的活性部分の活性にさらなる影響を及ぼさない安定した無毒の実体を形成する。
[00121] 特定の実施形態では、エリミネーター基は、本明細書でＥＧと称される。有用なエリミネーター基としては、本明細書に記載されるものが挙げられる。特定の実施形態では、エリミネーター基は、
であり；式中、ＲＥＧは、水素、アルキル、ビフェニル、−ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＣＮ、フルオロ、ブロモ、クロロ、アルコキシル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルキルアミノ−Ｃ（Ｏ）−及びジアルキルアミノＣ（Ｏ）−からなる群から選択される。各構造において、フェニル環は、１つ、２つ、３つ、場合により４つのＲＥＧ基に結合し得る。第２及び第３の構造では、当業者は、ＥＧが、上記の式（Ｃ１）の説明に示されるように、式（Ｃ１）の骨格内にないＲＴに結合することを認識するであろう。いくつかの実施形態では、ＲＥＧは、水素、アルキル、ビフェニル、−ＣＦ３、アルコキシル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルキルアミノ−Ｃ（Ｏ）−及びジアルキルアミノＣ（Ｏ）−からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＲＥＧは、水素、−ＮＯ２、−ＣＮ、フルオロ、ブロモ及びクロロからなる群から選択される。特定の実施形態では、エリミネーター基は、
である。特定の実施形態では、エリミネーター基は、
である。特定の実施形態では、エリミネーター基は、
である。
[00122] いくつかの実施形態では、エリミネーター基は、
であり、式中、Ｚは、ＣＨ又はＮであり得、ＲＥＧは、水素、アルキル、ビフェニル、−ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＣＮ、フルオロ、ブロモ、クロロ、アルコキシル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルキルアミノ−Ｃ（Ｏ）−及びジアルキルアミノＣ（Ｏ）−からなる群から選択される。各構造において、フェニル環は、１つ、２つ、３つ、場合により４つのＲＥＧ基に結合し得る。第１及び第２の構造では、当業者は、ＥＧが、上記の式（Ｃ１）の説明に示されるように、式（Ｃ１）の骨格内にないＲＴに結合することを認識するであろう。いくつかの実施形態では、ＲＥＧは、水素、アルキル、ビフェニル、−ＣＦ３、アルコキシル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルキルアミノ−Ｃ（Ｏ）−及びジアルキルアミノＣ（Ｏ）−からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＲＥＧは、水素、−ＮＯ２、−ＣＮ、フルオロ、ブロモ及びクロロからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＥＧ中の各ＲＥＧは、水素である。特定の実施形態では、エリミネーター基は、
である。特定の実施形態では、エリミネーター基は、
である。特定の実施形態では、エリミネーター基は、
である。
放出トリガー基
[00123] 放出トリガー基は、生体内及び／又は生体外で、本明細書に記載される化合物又はコンジュゲートの生物学的活性部分の、化合物又はコンジュゲートの残部からの分離を容易にする。放出トリガー基は、エリミネーター基と連動して、本明細書に記載される化合物又はコンジュゲートの生物学的活性部分の分離も容易にし得る。例えば、エリミネーター基及び放出トリガー基は、放出反応において反応し、生体内及び／又は生体外で、本明細書に記載される化合物又はコンジュゲートの生物学的活性部分を化合物又はコンジュゲートから放出し得る。特定の実施形態では、放出トリガーは、腫瘍環境で過剰発現される酵素のタンパク質分解作用など、高い腫瘍：非腫瘍特異性がある、生物学的に駆動される反応を通じて作用し得る。
[00124] 特定の実施形態では、放出トリガー基は、本明細書でＲＴと称される。特定の実施形態では、ＲＴは、二価であり、式（Ｃ１）の主鎖内で結合される。他の実施形態では、ＲＴは、一価であり、上記のようにＥＧに結合する。有用な放出トリガー基としては、本明細書に記載されるものが挙げられる。特定の実施形態では、放出トリガー基は、天然又は非天然アミノ酸の残基又は糖環の残基を含む。特定の実施形態では、放出トリガー基は、
である。当業者は、第１の構造が二価であり、式（Ｃ１）の主鎖内に又は式（Ｃ２）で描写されるように結合され得、第２の構造が一価であり、上記の式（Ｃ１）で描写されるようにＥＧに結合され得ることを認識するであろう。特定の実施形態では、放出トリガー基は、
である。特定の実施形態では、放出トリガー基は、
である。
[00125] いくつかの実施形態では、放出トリガー基は、
の構造を有するプロテアーゼ切断可能Ｒ１−Ｖａｌ−Ｘペプチドであり、式中、Ｒ１は、Ｈ又は
であり、Ｒ２は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ又は（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２；
の構造を有するレグマイン切断可能Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ又はＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐペプチドであり、式中、Ｚは、ＯＨ又はＮＨ２；又は
の構造を有するβ−グルクロニダーゼ切断可能β−グルクロニドである。当業者は、
が二価構造であり、式（Ｃ１）の主鎖内に又は式（Ｃ２）で描写されるように結合され得ることを認識するであろう。構造：
は、一価であり、上の式（Ｃ１）で描写されるように、ＥＧに結合され得る。
親水性基
[00126] 親水性基は、本明細書に記載の化合物の親水性を高めることを容易にする。親水性を高めることで、生物学的系に見られる水溶液などの水溶液への溶解性を高めることができると考えられる。親水性基は、本明細書でさらに詳細に記載されているスペーサー基としても機能できる。
[00127] 特定の実施形態では、親水性基は、本明細書でＨＰと称される。有用な親水性基としては、本明細書に記載されるものが挙げられる。特定の実施形態では、親水性基は、二価ポリ（エチレングリコール）である。特定の実施形態では、親水性基は、式：
による二価ポリ（エチレングリコール）であり；式中、ｍは、１〜１３、任意選択的に１〜４、任意選択的に２〜４又は任意選択的に４〜８の整数である。
[00128] いくつかの実施形態では、親水性基は、以下の式：
を有する二価ポリ（エチレングリコール）である。
[00129] 他のいくつかの実施形態では、親水性基は、以下の式：
を有する二価ポリ（エチレングリコール）である。
[00130] 他の実施形態では、親水性基は、以下の式：
を有する二価ポリ（エチレングリコール）である。
[00131] 他の実施形態では、親水性基は、以下の式：
を有する二価ポリ（エチレングリコール）である。
[00132] いくつかの実施形態では、親水性基は、式：
を有して、鎖が提示するスルホン酸を保有し得る。
スペーサー基
[00133] スペーサー基は、本明細書に記載される化合物の他の基からの共役基の間隔を促進にする。この間隔は、本明細書に記載される化合物の第２の化合物へのより効率的な共役並びに活性異化産物のより効率的な切断をもたらし得る。スペーサー基はまた、共役基を安定化させ、全体的な抗体薬物コンジュゲート特性の改善をもたらし得る。
[00134] 特定の実施形態では、スペーサー基は、本明細書でＳＰと称される。有用なスペーサー基としては、本明細書に記載されるものが挙げられる。特定の実施形態では、スペーサー基は、
である。特定の実施形態では、スペーサー基、Ｗ４及び親水性基が合わさって、式：
による二価ポリ（エチレングリコール）を形成し；式中、ｍは、１〜１３、任意選択的に１〜４、任意選択的に２〜４又は任意選択的に４〜８の整数である。
[00135] いくつかの実施形態では、ＳＰは、
である。
[00136] いくつかの実施形態では、二価ポリ（エチレングリコール）は、以下の式：
を有する。
[00137] 他のいくつかの実施形態では、二価ポリ（エチレングリコール）は、以下の式：
を有する。
[00138] 他の実施形態では、二価ポリ（エチレングリコール）は、以下の式：
を有する。
[00139] 他の実施形態では、二価ポリ（エチレングリコール）は、以下の式：
を有する。
[00140] いくつかの実施形態では、親水性基は、式：
を有して、鎖が提示するスルホン酸を保有し得る。
共役基及びその残基
[00141] 共役基は、本明細書に記載される抗体などの第２の化合物への、本明細書に記載されるペイロードの共役を容易にする。特定の実施形態では、共役基は、本明細書でＲと称される。共役基は、当業者に知られている任意の適切な反応機構を介して反応し得る。特定の実施形態では、共役基は、本明細書で詳細に記載されるように、［３＋２］アルキン−アジ化物付加環化反応、逆電子要求ディールス−アルダー連結反応、チオール求電子反応又はカルボニル−オキシアミン反応を通じて反応する。特定の実施形態では、共役基は、アルキン、ひずみアルキン、テトラジン、チオール、パラアセチルフェニルアラニン残基、オキシアミン、マレイミド又はアジ化物を含む。特定の実施形態では、共役基は、
−Ｎ３又は−ＳＨであり；式中、Ｒ２０１は、低級アルキルである。一実施形態では、Ｒ２０１は、メチル、エチル又はプロピルである。一実施形態では、Ｒ２０１は、メチルである。追加的な共役基については、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３５６３８５号、米国特許出願公開第２０１３／０１８９２８７号、米国特許出願公開第２０１３／０２５１７８３号、米国特許第８，７０３，９３６号、米国特許第９，１４５，３６１号、米国特許第９，２２２，９４０号及び米国特許第８，４３１，５５８号に記載される。
[00142] 共役後、共役基の二価の残基が形成され、第２の化合物の残基に結合される。二価残基の構造は、コンジュゲートを形成するために用いられる共役反応のタイプによって決定される。
[00143] ［３＋２］アルキン−アジ化物付加環化反応を通じてコンジュゲートが形成される特定の実施形態では、共役基の二価の残基は、トリアゾール環を含むか、又はトリアゾール環を含む縮合環式基を含む。ひずみ促進［３＋２］アルキン−アジ化物付加環化（ＳＰＡＡＣ）反応を通じてコンジュゲートが形成される特定の実施形態では、共役基の二価残基は、
である。
[00144] 一実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂ：
のいずれかによるコンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、抗ＦＯＬＲ１抗体の残基を示し、ＰＡＹは、ペイロード部分を示す。
[00145] 前述の実施形態のいずれかでは、コンジュゲートは、ｎ個のＰＡＹ部分を含み、式中、ｎは、１〜８の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。いくつかの実施形態では、ｎは、５である。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。いくつかの実施形態では、ｎは、７である。いくつかの実施形態では、ｎは、８である。
[00146] 特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、以下の式（３０）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置４０４における、以下の式（３０）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置１８０における、以下の式（３０）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置２４１における、以下の式（３０）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置２２２における、以下の式（３０）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、Kabat又はChothia番号付けシステムによる軽鎖位置７における、以下の式（３０）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、Kabat又はChothia番号付けシステムによる軽鎖位置４２における、以下の式（３０）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、ＰＡＹは、メイタンシン、ヘミアステリン、アマニチン、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）及びモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＰＡＹは、メイタンシンである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、ヘミアステリンである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、アマニチンである。特定の実施形態では、ＰＡＹ、はＭＭＡＦである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、ＭＭＡＥである。
[00147] 特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、以下の式（５６）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置４０４における、以下の式（５６）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置１８０における、以下の式（５６）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置２４１における、以下の式（５６）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置２２２における、以下の式（５６）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、Kabat又はChothia番号付けシステムによる軽鎖位置７における、以下の式（５６）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、Kabat又はChothia番号付けシステムによる軽鎖位置４２における、以下の式（５６）による非天然アミノ酸の残基を示す。特定の実施形態では、ＰＡＹは、メイタンシン、ヘミアステリン、アマニチン、ＭＭＡＦ及びＭＭＡＥからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＰＡＹは、メイタンシンである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、ヘミアステリンである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、アマニチンである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、ＭＭＡＦである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、ＭＭＡＥである。
[00148] 特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、パラアジド−Ｌ−フェニルアラニンの非天然アミノ酸残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置４０４における、非天然アミノ酸残基パラアジドフェニルアラニンを示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置１８０における、パラアジド−Ｌ−フェニルアラニンの非天然アミノ酸残基を示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置２４１における、非天然アミノ酸残基パラアジド−Ｌ−フェニルアラニンを示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、ＥＵ番号付けシステムによる重鎖位置２２２における、非天然アミノ酸残基パラアジド−Ｌ−フェニルアラニンを示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、Kabat又はChothia番号付けシステムによる軽鎖位置７における、非天然アミノ酸残基パラアジド−Ｌ−フェニルアラニンを示す。特定の実施形態では、式１０１ａ〜１０４ｂのいずれかによる抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ＣＯＭＰは、Kabat又はChothia番号付けシステムによる軽鎖位置４２における、非天然アミノ酸残基パラアジド−Ｌ−フェニルアラニンを示す。特定の実施形態では、ＰＡＹは、メイタンシン、ヘミアステリン、アマニチン、ＭＭＡＦ及びＭＭＡＥからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＰＡＹは、メイタンシンである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、ヘミアステリンである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、アマニチンである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、ＭＭＡＦである。特定の実施形態では、ＰＡＹは、ＭＭＡＥである。
[00149] いくつかの実施形態では、国際公開第２０１６／１２３５８２号に記載されるような、修飾ヘミアステリンとリンカーとを含む抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供される。例えば、コンジュゲートは、国際公開第２０１６／２０１６／１２３５８２号に記載されるような、式１０００〜１０００ｂ、１００１〜１００１ｂ、１００２〜１００２ｂ及びＩ〜ＸＩＸｂ−２、１０１〜１１１ｂ又は１〜８ｂのいずれかを含む構造を有し得る。修飾ヘミアステリンとリンカーとを含むコンジュゲートの例が以下に提供される。
[00150] いくつかの実施形態では、コンジュゲートＭ：
の構造を有する抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ｎは、１〜６の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１〜４の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートは、
の構造を有する。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートは、
の構造を有する。
[00151] いくつかの実施形態では、コンジュゲートＰ：
の構造を有する抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ｎは、１〜６の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１〜４の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートは、
の構造を有する。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートは、
の構造を有する。
[00152] いくつかの実施形態では、コンジュゲートＱ：
の構造を有する抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが本明細書で提供され、式中、ｎは、１〜６の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１〜４の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートは、
の構造を有する。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートは、
の構造を有する。
[00153] 抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートが、コンジュゲートＭ、コンジュゲートＰ又はコンジュゲートＱによる構造を有する前述の態様のいずれかにおいて、括弧で囲まれた構造は、抗体の１つ又は複数の非天然アミノ酸に共有結合され得、１つ又は複数の非天然アミノ酸は、Kabat又はKabatのＥＵ番号付けスキームによるＨＣ−Ｆ４０４、ＨＣ−Ｙ１８０及びＬＣ−Ｋ４２からなる群から選択される部位に位置する。いくつかの実施形態では、括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＨＣ−Ｆ４０４で１つ又は複数の非天然アミノ酸に共有結合する。いくつかの実施形態では、括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＨＣ−Ｙ１８０で１つ又は複数の非天然アミノ酸に共有結合する。いくつかの実施形態では、括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＬＣ−Ｋ４２で１つ又は複数の非天然アミノ酸に共有結合する。いくつかの実施形態では、括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＨＣ−Ｆ４０４及びＨＣ−Ｙ１８０で１つ又は複数の非天然アミノ酸に共有結合する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＨＣ−Ｆ４０４で非天然アミノ酸に共有結合し、少なくとも１つの括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＨＣ−Ｙ１８０で非天然アミノ酸に共有結合する。いくつかの実施形態では、括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＨＣ−Ｙ１８０及びＬＣ−Ｋ４２で１つ又は複数の非天然アミノ酸に共有結合する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＨＣ−Ｙ１８０で非天然アミノ酸に共有結合し、少なくとも１つの括弧で囲まれた構造は、抗体の部位ＬＣ−Ｋ３２で非天然アミノ酸に共有結合する。
３．ペイロード
[00154] 上記のペイロードに加えて、分子ペイロードは、当業者がポリペプチドにコンジュゲートさせることを望み得る任意の分子実体であり得る。特定の実施形態では、ペイロードは、治療的部分である。このような実施形態では、抗体コンジュゲートを使用して、治療的部分をその分子標的に標的化し得る。特定の実施形態では、ペイロードは、標識部分である。このような実施形態では、抗体コンジュゲートを使用して、ポリペプチドのその標的への結合を検出し得る。特定の実施形態では、ペイロードは、細胞毒性部分である。このような実施形態では、抗体コンジュゲートを使用して、細胞毒性部分を例えばがん細胞などの罹患細胞に標的化し、細胞の破壊又は排除を開始し得る。当業者に明らかな他の分子ペイロードを含むコンジュゲートは、本明細書に記載されるコンジュゲートの範囲内である。
[00155] 特定の実施形態では、抗体コンジュゲートは、標識、染料、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、放射性核種、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチド類似体、抗体又は抗体断片、金属キレート剤、補酵素、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、ペプチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、共有結合的又は非共有結合的に他の分子と相互作用する基、光ケージ化部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込んだ部分、化学的切断可能基、光切断可能基、伸長された側鎖、炭素結合糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小型分子又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるペイロードを有し得る。一実施形態では、ペイロードは、標識、染料、ポリマー、細胞毒性化合物、放射性核種、薬物、親和性標識、樹脂、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド類似体、抗体、抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛍光団又は炭素連結糖である。別の実施形態では、ペイロードは、標識、染料、ポリマー、薬物、抗体、抗体断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドである。
４．リンカー
[00156] 特定の実施形態では、抗体は、抗体アミノ酸及びペイロード群と反応できる１つ又は複数のリンカーによってペイロードに連結され得る。１つ又は複数のリンカーは、当業者に明らかな任意のリンカーであり得る。
[00157] 「リンカー」という用語は、本明細書では、化学反応の結果として通常形成され、通常、共有結合である基又は結合を指すために使用される。
[00158] 有用なリンカーとしては、本明細書に記載されるものが挙げられる。特定の実施形態では、リンカーは、当業者に知られている任意の二価又は多価のリンカーである。有用な二価リンカーとしては、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン及び置換ヘテロアリーレンが挙げられる。特定の実施形態では、リンカーは、Ｃ１〜１０アルキレン又はＣ１〜１０ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｃ１〜１０ヘテロアルキレンは、ＰＥＧである。
[00159] 特定の実施形態では、リンカーは、加水分解的に安定している。加水分解に安定な結合とは、結合が水中で実質的に安定であり、生理的条件下での、おそらく無期限でさえある長期間を含むが、これに限定されることなく、有用なｐＨ値で水と反応しないことを意味する。特定の実施形態では、リンカーは、加水分解的に不安定である。加水分解的に不安定又は分解可能な結合は、結合が水中又は例えば血液をはじめとする水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定又は分解可能な結合とは、結合が１つ又は複数の酵素によって分解され得ることを意味する。
[00160] 当該技術分野で理解されているように、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、ポリマー主鎖中又はポリマー主鎖とポリマー分子の１つ又は複数の末端官能基との間のリンカー基に分解可能な結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸又は活性化ＰＥＧカルボン酸と、生物学的活性薬剤上のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合は、一般に、生理的条件下で加水分解して薬剤を放出する。
[00161] 他の加水分解的に分解可能な結合としては、炭酸塩結合；アミンとアルデヒドとの反応から生じた、イミン結合；アルコールとリン酸基とを反応させることによって形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルトエステル結合；ＰＥＧなどのポリマー末端をはじめとするが、これに限定されるものではないアミン基と、ペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド結合；及びポリマー末端をはじめとするが、これに限定されるものではないホスホラミダイト基と、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド結合が挙げられるが、これに限定されるものではない。
[00162] いくつかの異なる切断可能なリンカーが当業者に知られている。米国特許第４，６１８，４９２号、米国特許第４，５４２，２２５号及び米国特許第４，６２５，０１４号を参照されたい。これらのリンカー基からの薬剤の放出の機序としては、例えば、光解離性結合の照射及び酸触媒加水分解が挙げられる。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号は、患者の補体系のタンパク質分解酵素により、生体内の標的部位で切断されるリンカーを含む免疫複合体の説明を含む。リンカーの長さは、ポリペプチドと、それに連結された分子との間の所望の空間的関係に応じて予め決定又は選択され得る。様々な放射線診断用化合物、放射線治療用化合物、薬物、毒素及び他の薬剤をポリペプチドに結合させるために報告されている多数の方法を考慮して、当業者は、所与の薬剤をポリペプチドに結合させる適切な方法を決定するであろう。
[00163] リンカーは、広範囲の分子量又は分子長を有し得る。より大きい又はより小さい分子量リンカーは、ポリペプチドと連結実体との間に所望の空間関係又は立体配座を提供するために使用され得る。より長い又はより短い分子長を有するリンカーは、ポリペプチドと連結実体との間に所望の空間又は可撓性を提供するためにも使用され得る。同様に、特定の形状又は立体配座を有するリンカーは、ポリペプチドがその標的に到達する前又は後のいずれかで、ポリペプチド又は連結実体に特定の形状又は立体配座を付与するために使用され得る。リンカーの各末端に存在する官能基は、所望の条件下でポリペプチド又はペイロードの放出を調節するように選択され得る。ポリペプチドと連結実体との間の空間関係のこの最適化は、分子に新たな、調節された又は所望の特性を提供し得る。
[00164] いくつかの実施形態では、ａ）ポリマー主鎖の少なくとも第１端上のアジ化物、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン又はカルボニル含有部分；及びｂ）ポリマー主鎖の第２端上の少なくとも第２の官能基をはじめとするダンベル構造を有する水溶性二官能価リンカーが本明細書で提供される。第２の官能基は、第１の官能基と同一であるか又は異なり得る。いくつかの実施形態では、第２の官能基は、第１の官能基と反応しない。いくつかの実施形態では、分岐分子構造の少なくとも１つのアームを含む水溶性化合物が提供される。例えば、分岐分子構造は、樹状構造であり得る。
[00165] いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）又は２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択されるリンカー前駆体に由来する。特定の実施形態では、リンカーは、リンカー前駆体Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）に由来する。
[00166] いくつかの実施形態では、リンカーは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びペンタペプチドからなる群から選択されるリンカー前駆体に由来する。このような実施形態では、リンカーは、プロテアーゼによって切断され得る。例示的なジペプチドとしては、バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）；フェニルアラニン−リジン（ｆｋ又はｐｈｅ−ｌｙｓ）；フェニルアラニン−ホモリジン（ｐｈｅ−ｈｏｍｏｌｙｓ）；及びＮ−メチルバリン−シトルリン（Ｍｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。例示的なトリペプチドとしては、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）、グリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）及びグリシン−メトキシエトキシエチル）セリン−バリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−シトアラニンＯＭＥＳｅｒＶａｌＡｌａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
[00167] いくつかの実施形態では、リンカーは、自己犠牲スペーサーを含む。特定の実施形態では、自己犠牲スペーサーは、ｐ−アミノベンジルを含む。いくつかの実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコールは、アミド結合を介してアミノ酸単位に結合され、カルバメート、メチルカルバメート又はカーボネートは、ベンジルアルコールとペイロードとの間で生成される（Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103）。いくつかの実施形態では、リンカーは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）を含む。他の自己犠牲スペーサーの例としては、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体などのＰＡＢ基と電子的に類似した芳香族化合物（米国特許第７，３７５，０７８号；Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237）及びオルトアミノベンジルアセタール又はパラアミノベンジルアセタールが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、置換及び非置換４−アミノ酪酸アミド（Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815）及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867）などのアミド結合加水分解に際して環化を受けるスペーサーが使用され得る。グリシン残基のα炭素への薬物の結合は、コンジュゲートで有用であり得る自己犠牲スペーサーの別の例である（Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447）。
[00168] 特定の実施形態では、リンカー前駆体を組み合わせて、より大きいリンカーが形成され得る。例えば、特定の実施形態では、リンカーは、ジペプチドバリン−シトルリン及びｐ−アミノベンジルオキシカルボニルを含む。これらは、ｃｉｔＶａｌＣｉｔ−−ＰＡＢリンカーとしても参照される。
[00169] 特定の実施形態では、ペイロードは、抗体アミノ酸基と反応できる１つ又は複数のリンカー基により、本明細書でリンカーペイロードと称されるリンカーに連結され得る。１つ又は複数のリンカーは、当業者に明らかな任意のリンカー又は本明細書に記載されるものであり得る。
[00170] 例えば、下記のリンカー前駆体（Ａ）〜（Ｌ）などの追加的なリンカーが本明細書で開示される。
５．抗体特異性
[00171] コンジュゲートは、ヒト葉酸受容体αに選択的に結合する抗体を含む。いくつかの態様では、抗体は、ヒト葉酸受容体α（ヒトＦＯＬＲ１）の細胞外ドメインに選択的に結合する。
[00172] いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＦＯＬＲ１のホモログに結合する。いくつかの態様では、抗体は、サル、マウス、イヌ、ネコ、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ及びヒツジから選択される種に由来する、ヒトＦＯＬＲ１のホモログに結合する。いくつかの態様では、ホモログは、カニクイザルホモログである。いくつかの態様では、ホモログは、マウス又はマウスの類似体である。
[00173] いくつかの実施形態では、抗体は、本開示で提供されるコンセンサス配列によって定義される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、本開示で提供される例示的なＣＤＲ、ＶＨ若しくはＶＬ配列又はその変異型を含む。いくつかの態様では、変異型は、保存的アミノ酸置換を有する変異型である。
[00174] いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸残基の数の観点から、特定の長さを有する１つ又は複数のＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、抗体のChothia ＣＤＲ−Ｈ１は、６、７又は８残基長である。いくつかの実施形態では、抗体のKabat ＣＤＲ−Ｈ１は、４、５又は６残基長である。いくつかの実施形態では、抗体のChothia ＣＤＲ−Ｈ２は、５、６又は７残基長である。いくつかの実施形態では、抗体のKabat ＣＤＲ−Ｈ２は、１６、１７又は１８残基長である。いくつかの実施形態では、抗体のKabat／Chothia ＣＤＲ−Ｈ３は、１３、１４、１５、１６又は１７残基長である。
[00175] いくつかの態様では、抗体のKabat／Chothia ＣＤＲ−Ｌ１は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８残基長である。いくつかの態様では、抗体のKabat／Chothia ＣＤＲ−Ｌ２は、６、７又は８残基長である。いくつかの態様では、抗体のKabat／Chothia ＣＤＲ−Ｌ３は、８、９又は１０残基長である。
[00176] いくつかの実施形態では、抗体は、軽鎖を含む。いくつかの態様では、軽鎖は、κ軽鎖である。いくつかの態様では、軽鎖は、λ軽鎖である。
[00177] いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖を含む。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＡである。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＤである。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＥである。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＧである。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＭである。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＧ１である。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＧ２である。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＧ３である。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＧ４である。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＡ１である。いくつかの態様では、重鎖は、ＩｇＡ２である。
[00178] いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。いくつかの態様では、抗体断片は、Ｆｖ断片である。いくつかの態様では、抗体断片は、Ｆａｂ断片である。いくつかの態様では、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片である。いくつかの態様では、抗体断片は、Ｆａｂ’断片である。いくつかの態様では、抗体断片は、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）断片である。いくつかの態様では、抗体断片は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片である。
[00179] いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。
[00180] いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
[00181] いくつかの実施形態では、抗体は、親和性成熟抗体である。いくつかの態様では、抗体は、本開示で提供される例示的な配列に由来する親和性成熟抗体である。
[00182] 本明細書で提供される抗体は、がんをはじめとする様々な疾患及び病状の治療に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、固形腫瘍のがんの治療に有用であり得る。例えば、本明細書で提供される抗体は、結腸直腸がんの治療に有用であり得る。
５．１ ＣＤＲ−Ｈ３配列
[00183] いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ３配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号３０８〜３６６で提供されるＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ３配列である。
[00184] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２５５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２９４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列を含む。
５．２ 例示的なＣＤＲを含むＶＨ配列
[00185] いくつかの実施形態では、抗体は、本開示で提供される１つ又は複数の例示的なＣＤＲ−Ｈ配列及びその変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる１つ又は複数のＣＤＲ−Ｈ配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ配列は、配列番号３０８〜３６６から選択されるＶＨ配列で提供される１つ又は複数のＣＤＲ−Ｈ配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
５．２．１．例示的なKabat ＣＤＲを含むＶＨ配列
[00186] いくつかの実施形態では、抗体は、本開示で提供される１つ又は複数の例示的なKabat ＣＤＲ−Ｈ配列及びその変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる１つ又は複数のKabat ＣＤＲ−Ｈ配列を含むＶＨ配列を含む。
５．２．１．１．Kabat ＣＤＲ−Ｈ３
[00187] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨ配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＨ配列のKabat ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号３０８〜３６６で提供されるＶＨ配列のKabat ＣＤＲ−Ｈ３配列である。
[00188] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、Kabat ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２５５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２９４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨ配列を含む。
５．２．１．２．Kabat ＣＤＲ−Ｈ２
[00189] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むＶＨ配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＨ配列のKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号３０８〜３６６で提供されるＶＨ配列のKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列である。
[00190] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８１〜２３９から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、Kabat ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１９６を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２３５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むＶＨ配列を含む。
５．２．１．３．Kabat ＣＤＲ−Ｈ１
[00191] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むＶＨ配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＨ配列のKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号３０８〜３６６で提供されるＶＨ配列のKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列である。
[00192] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６３〜１２１から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、Kabat ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号７８を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１１７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むＶＨ配列を含む。
５．２．１．４．Kabat ＣＤＲ−Ｈ３＋Kabat ＣＤＲ−Ｈ２
[00193] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ３配列と、配列番号１８１〜２３９から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列とを含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ３配列及びKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ３及びKabat ＣＤＲ−Ｈ２の両方は、配列番号３０８〜３６６から選択される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。
５．２．１．５．Kabat ＣＤＲ−Ｈ３＋Kabat ＣＤＲ−Ｈ１
[00194] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ３配列と、配列番号６３〜１２１から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列とを含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ３配列及びKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ３及びKabat ＣＤＲ−Ｈ１の両方は、配列番号３０８〜３６６から選択される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。
５．２．１．６．Kabat ＣＤＲ−Ｈ１＋Kabat ＣＤＲ−Ｈ２
[00195] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６３〜１２１から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列と、配列番号１８１〜２３９から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列とを含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ１配列及びKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ１及びKabat ＣＤＲ−Ｈ２の両方は、配列番号３０８〜３６６から選択される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。
５．２．１．７．Kabat ＣＤＲ−Ｈ１＋Kabat ＣＤＲ−Ｈ２＋Kabat ＣＤＲ−Ｈ３
[00196] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６３〜１２１から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列と、配列番号１８１〜２３９から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列と、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ３配列とを含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ１配列、Kabat ＣＤＲ−Ｈ２配列及びKabat ＣＤＲ−Ｈ３配列の全ては、本開示で提供される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、Kabat ＣＤＲ−Ｈ１、Kabat ＣＤＲ−Ｈ２及びKabat ＣＤＲ−Ｈ３の全ては、配列番号３０８〜３６６から選択される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。
５．２．２．例示的なChothia ＣＤＲを含むＶＨ配列
[00197] いくつかの実施形態では、抗体は、本開示で提供される１つ又は複数の例示的なChothia ＣＤＲ−Ｈ配列及びその変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる１つ又は複数のChothia ＣＤＲ−Ｈ配列を含むＶＨ配列を含む。
５．２．２．１．Chothia ＣＤＲ−Ｈ３
[00198] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨ配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＨ配列のChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号３０８〜３６６で提供されるＶＨ配列のChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列である。
[00199] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２５５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２９４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＶＨ配列を含む。
５．２．２．２．Chothia ＣＤＲ−Ｈ２
[00200] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むＶＨ配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＨ配列のChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号３０８〜３６６で提供されるＶＨ配列のChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列である。
[00201] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２２〜１８０から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、Chothia ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１３７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１７６を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列を含むＶＨ配列を含む。
５．２．２．３．Chothia ＣＤＲ−Ｈ１
[00202] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むＶＨ配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＨ配列のChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号３０８〜３６６で提供されるＶＨ配列のChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列である。
[00203] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４〜６２から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１９を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号５８を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列を含むＶＨ配列を含む。
５．２．２．４．Chothia ＣＤＲ−Ｈ３＋Chothia ＣＤＲ−Ｈ２
[00204] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列と、配列番号１２２〜１８０から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列とを含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ３配列及びChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ３及びChothia ＣＤＲ−Ｈ２の両方は、配列番号３０８〜３６６から選択される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。
５．２．２．５．Chothia ＣＤＲ−Ｈ３＋Chothia ＣＤＲ−Ｈ１
[00205] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列と、配列番号４〜６２から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列とを含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ３配列及びChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ３及びChothia ＣＤＲ−Ｈ１の両方は、配列番号３０８〜３６６から選択される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。
５．２．２．６．Chothia ＣＤＲ−Ｈ１＋Chothia ＣＤＲ−Ｈ２
[00206] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４〜６２から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列と、配列番号１２２〜１８０から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列とを含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ１配列及びChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ１及びChothia ＣＤＲ−Ｈ２の両方は、配列番号３０８〜３６６から選択される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。
５．２．２．７．Chothia ＣＤＲ−Ｈ１＋Chothia ＣＤＲ−Ｈ２＋Chothia ＣＤＲ−Ｈ３
[00207] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４〜６２から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列と、配列番号１２２〜１８０から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列と、配列番号２４０〜２９８から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列とを含むＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ１配列、Chothia ＣＤＲ−Ｈ２配列及びChothia ＣＤＲ−Ｈ３配列の全ては、本開示で提供される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、Chothia ＣＤＲ−Ｈ１、Chothia ＣＤＲ−Ｈ２及びChothia ＣＤＲ−Ｈ３の全ては、配列番号３０８〜３６６から選択される単一の例示的なＶＨ配列に由来する。
５．３．ＶＨ配列
[00208] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０８〜３６６で提供されるＶＨ配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00209] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０８〜３６６から選択される配列を含むＶＨ配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３２３を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＶＨ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３６２を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＶＨ配列を含む。
５．３．１．ＶＨ配列の変異型
[00210] いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＶＨ配列は、本開示で提供される例示的なＶＨ配列の変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00211] いくつかの態様では、ＶＨ配列は、本開示で提供される例示的なＶＨ配列の変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、ＶＨ配列は、本開示で提供される例示的なＶＨ配列のいずれかと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00212] いくつかの実施形態では、ＶＨ配列は、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下のアミノ酸置換を有する、本開示で提供される例示的なＶＨ配列のいずれかを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
５．４．ＣＤＲ−Ｌ３配列
[00213] いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ３配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３６７〜３６９で提供されるＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ３配列である。
[00214] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０５〜３０７から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０６を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。
５．５．例示的なＣＤＲを含むＶＬ配列
[00215] いくつかの実施形態では、抗体は、本開示で提供される１つ又は複数の例示的なＣＤＲ−Ｌ配列及びその変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる１つ又は複数のＣＤＲ−Ｌ配列を含むＶＬ配列を含む。
５．５．１．ＣＤＲ−Ｌ３
[00216] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ３配列を含むＶＬ配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ３配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３６７〜３６９で提供されるＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ３配列である。
[00217] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０５〜３０７から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０６を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列を含むＶＬ配列を含む。
５．５．２．ＣＤＲ−Ｌ２
[00218] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ２配列を含むＶＬ配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ２配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３６７〜３６９で提供されるＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ２配列である。
[00219] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０２〜３０４から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０２を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０３を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列を含むＶＬ配列を含む。
５．５．３．ＣＤＲ−Ｌ１
[00220] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１配列を含むＶＬ配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ１配列は、本明細書で提供される例示的な抗体又はＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号３６７〜３６９で提供されるＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１配列である。
[00221] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９９〜３０１から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２９９を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３００を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列を含むＶＬ配列を含む。
５．５．４．ＣＤＲ−Ｌ３＋ＣＤＲ−Ｌ２
[00222] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０５〜３０７から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列と、配列番号３０２〜３０４から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列とを含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ３配列及びＣＤＲ−Ｌ２配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＬ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ３及びＣＤＲ−Ｌ２の両方は、配列番号３６７〜３６９から選択される単一の例示的なＶＬ配列に由来する。
５．５．５．ＣＤＲ−Ｌ３＋ＣＤＲ−Ｌ１
[00223] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０５〜３０７から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列と、配列番号２９９〜３０１から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列とを含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ３配列及びＣＤＲ−Ｌ１配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＬ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ３及びＣＤＲ−Ｌ１の両方は、配列番号３６７〜３６９から選択される単一の例示的なＶＬ配列に由来する。
５．５．６．ＣＤＲ−Ｌ１＋ＣＤＲ−Ｌ２
[00224] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９９〜３０１から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列と、配列番号３０２〜３０４から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列とを含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ１配列及びＣＤＲ−Ｌ２配列の両方は、本開示で提供される単一の例示的なＶＬ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ２の両方は、配列番号３６７〜３６９から選択される単一の例示的なＶＬ配列に由来する。
５．５．７．ＣＤＲ−Ｌ１＋ＣＤＲ−Ｌ２＋ＣＤＲ−Ｌ３
[00225] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９９〜３０１から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列と、配列番号３０２〜３０４から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列と、配列番号３０５〜３０７から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列とを含むＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ１配列、ＣＤＲ−Ｌ２配列及びＣＤＲ−Ｌ３配列の全ては、本開示で提供される単一の例示的なＶＬ配列に由来する。例えば、いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３の全ては、配列番号３６７〜３６９から選択される単一の例示的なＶＬ配列に由来する。
５．６．ＶＬ配列
[00226] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３６７〜３６９で提供されるＶＬ配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00227] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３６７〜３６９から選択される配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３６７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３６８を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＶＬ配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３６９を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＶＬ配列を含む。
５．６．１．ＶＬ配列の変異型
[00228] いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＶＬ配列は、本開示で提供される例示的なＶＬ配列の変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00229] いくつかの態様では、ＶＬ配列は、本開示で提供される例示的なＶＬ配列の変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、ＶＬ配列は、本開示で提供される例示的なＶＬ配列のいずれかと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00230] いくつかの実施形態では、ＶＬ配列は、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下のアミノ酸置換を有する、本開示で提供される例示的なＶＬ配列のいずれかを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
５．７．対
５．７．１．ＣＤＲ−Ｈ３とＣＤＲ−Ｌ３との対
[00231] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ３配列及びＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ３配列は、ＶＨの一部であり、ＣＤＲ−Ｌ３配列は、ＶＬの一部である。
[00232] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号２４０〜２９８を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列であり、ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３０５〜３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列である。
[00233] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ３とＣＤＲ−Ｌ３との対は、配列番号３０５及び配列番号２５５；並びに配列番号３０５及び配列番号２９４から選択される。
[00234] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ３とＣＤＲ−Ｌ３との対は、配列番号３０６及び配列番号２５５；並びに配列番号３０６及び配列番号２９４から選択される。
[00235] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ３とＣＤＲ−Ｌ３との対は、配列番号３０７及び配列番号２５５；並びに配列番号３０７及び配列番号２９４から選択される。
５．７．２．ＣＤＲ−Ｈ１とＣＤＲ−Ｌ１との対
[00236] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１配列及びＣＤＲ−Ｌ１配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、ＶＨの一部であり、ＣＤＲ−Ｌ１配列は、ＶＬの一部である。
[00237] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号４〜６２を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列であり、ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号２９９〜３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列である。
[00238] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号６３〜１２１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列であり、ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号２９９〜３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列である。
５．７．３．ＣＤＲ−Ｈ２とＣＤＲ−Ｌ２との対
[00239] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２配列及びＣＤＲ−Ｌ２配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ２配列は、ＶＨの一部であり、ＣＤＲ−Ｌ２配列は、ＶＬの一部である。
[00240] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号１２２〜１８０を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列であり、ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３０２〜３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列である。
[00241] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号１８１〜２３９を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列であり、ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３０２〜３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列である。
５．７．４．ＶＨとＶＬとの対
[00242] いくつかの実施形態では、抗体は、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。
[00243] いくつかの態様では、ＶＨ配列は、配列番号３０８〜３６６を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＶＨ配列であり、ＶＬ配列は、配列番号３６７〜３６９を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＶＬ配列である。
[00244] いくつかの態様では、ＶＨとＶＬとの対は、配列番号３６７及び配列番号３２３；並びに配列番号３６７及び配列番号３６２から選択される。
[00245] いくつかの態様では、ＶＨとＶＬとの対は、配列番号３６８及び配列番号３２３；並びに配列番号３６８及び配列番号３６２から選択される。
[00246] いくつかの態様では、ＶＨとＶＬとの対は、配列番号３６９及び配列番号３２３；並びに配列番号３６９及び配列番号３６２から選択される。
５．７．４．１．ＶＨとＶＬとの対の変異型
[00247] いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＶＨとＶＬとの対は、本開示で提供される例示的なＶＨ及び／又はＶＬ配列の変異型を含む。
[00248] いくつかの態様では、ＶＨ配列は、本開示で提供される例示的なＶＨ配列の変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、ＶＨ配列は、本開示で提供される例示的なＶＨ配列のいずれかと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．１％の同一性を有する配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00249] いくつかの実施形態では、ＶＨ配列は、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下のアミノ酸置換を有する、本開示で提供される例示的なＶＨ配列のいずれかを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
[00250] いくつかの態様では、ＶＬ配列は、本開示で提供される例示的なＶＬ配列の変異型を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、ＶＬ配列は、本開示で提供される例示的なＶＬ配列のいずれかと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％の同一性を有する配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
[00251] いくつかの実施形態では、ＶＬ配列は、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下のアミノ酸置換を有する、本開示で提供される例示的なＶＬ配列のいずれかを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
５．８．６つのＣＤＲの全てを含む抗体
[00252] いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１配列、ＣＤＲ−Ｈ２配列、ＣＤＲ−Ｈ３配列、ＣＤＲ−Ｌ１配列及びＣＤＲ−Ｌ３配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ配列は、ＶＨ（ＣＤＲ−Ｈの場合）又はＶＬ（ＣＤＲ−Ｌの場合）の一部である。
[00253] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号４〜６２を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列であり；ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号１２２〜１８０を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列であり；ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号２４０〜２９８を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列であり；ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号２９９〜３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列であり；ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３０２〜３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列であり；ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３０５〜３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列である。
[00254] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号１９を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列であり；ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号１３７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列であり；ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号２５５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列であり；ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号２９９〜３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列であり；ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３０２〜３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列であり；ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３０５〜３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列である。
[00255] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号５８を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ１配列であり；ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号１７６を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるChothia ＣＤＲ−Ｈ２配列であり；ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号２９４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列であり；ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号２９９〜３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列であり；ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３０２〜３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列であり；ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３０５〜３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列である。
[00256] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号６３〜１２１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列であり；ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号１８１〜２３９を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列であり；ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号２４０〜２９８を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列であり；ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号２９９〜３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列であり；ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３０２〜３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列であり；ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３０５〜３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列である。
[00257] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号７８を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列であり；ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号１９６を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列であり；ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号２５５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列であり；ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号２９９〜３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列であり；ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３０２〜３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列であり；ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３０５〜３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列である。
[00258] いくつかの態様では、ＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号１１７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ１配列であり；ＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号２３５を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるKabat ＣＤＲ−Ｈ２配列であり；ＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号２９４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｈ３配列であり；ＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号２９９〜３０１を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ１配列であり；ＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号３０２〜３０４を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ２配列であり；ＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号３０５〜３０７を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＣＤＲ−Ｌ３配列である。
６．生殖系列
[00259] いくつかの実施形態では、葉酸受容体αに特異的に結合する抗体は、特定の生殖系列遺伝子又はその変異型によってコードされる可変領域を含む抗体である。本明細書で提供される例示的な抗体は、重鎖可変領域生殖系列遺伝子ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３３、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０及びＶＨ４−３０−４又はその変異型；及び軽鎖可変領域生殖系列遺伝子Ｖκ１−５、Ｖκ３−１１、Ｖκ２−２０、Ｖκ１−３３及びＶκ１−１６又はその変異型によってコードされる可変領域を含む。
[00260] 当業者は、本明細書で提供されるＣＤＲ配列が、他の可変領域生殖系列遺伝子又はその変異型によってコードされる可変領域と組み合わされた場合にも有用であり得ることを認識するであろう。特に、本明細書で提供されるＣＤＲ配列は、上記の可変領域生殖系列遺伝子と構造的に類似した可変領域生殖系列遺伝子又はその変異型によってコードされる可変領域と組み合わされた場合に有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤＲ−Ｈ配列は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３若しくはＶＨ４ファミリー又はその変異型から選択される可変領域生殖系列遺伝子によってコードされる可変領域と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤＲ−Ｌ配列は、Ｖκ１、Ｖκ２若しくはＶκ３又はその変異型から選択される可変領域生殖系列遺伝子によってコードされる可変領域と組み合わされ得る。
７．親和性
[00261] いくつかの実施形態では、ＫＤによって示される葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、約１０−５Ｍ未満、約１０−６Ｍ未満、約１０−７Ｍ未満、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満、約１０−１０Ｍ未満、約１０−１１Ｍ未満又は約１０−１２Ｍ未満である。いくつかの実施形態では、抗体の親和性は、約１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体の親和性は、約１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体の親和性は、約１０−７Ｍ〜１０−９Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体の親和性は、約１０−７Ｍ〜１０−８Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体の親和性は、約１０−８Ｍ〜１０−１１Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体の親和性は、約１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体の親和性は、約１０−９Ｍ〜１０−１１Ｍである。いくつかの実施形態では、抗体の親和性は、約１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍである。
[00262] いくつかの実施形態では、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定され、ＫＤによって示される、ヒト葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、約０．３６×１０−９Ｍ〜約２．２１×１０−９Ｍである。いくつかの実施形態では、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定され、ＫＤによって示される、ヒト葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、約８．５５×１０−１０Ｍ〜約１．７０×１０−８Ｍである。いくつかの実施形態では、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定され、ＫＤによって示される、ヒト葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、約５．７１×１０−１０Ｍ〜約２．５８×１０−８Ｍである。いくつかの実施形態では、ヒト葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、以下の実施例においてヒト葉酸受容体αについて報告されたＫＤ値のほぼいずれかである。
[00263] いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも約１０４Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも約１０５Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも約１０６Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも約１０７Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも約１０８Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも約１０９Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０４Ｍ−１×秒−１〜約１０１０Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０５Ｍ−１×秒−１〜約１０１０Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０６Ｍ−１×秒−１〜約１０１０Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０７Ｍ−１×秒−１〜約１０１０Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。
[00264] いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト葉酸受容体αと結合したとき、２５℃での表面プラズモン共鳴による測定で約４．４４×１０５Ｍ−１×秒−１〜約１．６１×１０５Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト葉酸受容体αと結合したとき、２５℃での表面プラズモン共鳴による測定で約２．９０×１０５Ｍ−１×秒−１〜約９．６４×１０９Ｍ−１×秒−１のｋａを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト葉酸受容体αと結合したとき、以下の実施例でヒト葉酸受容体αについて報告されたｋａ値のほぼいずれかのｋａを有する。
[00265] いくつかの実施形態では、抗体は、約１０−５秒−１以下のｋｄを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０−４秒−１以下のｋｄを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０−３秒−１以下のｋｄを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０−２秒−１〜約１０−５秒−１のｋｄを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０−２秒−１〜約１０−４秒−１のｋｄを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０−３秒−１〜約１０−５秒−１のｋｄを有する。
[00266] いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト葉酸受容体αから分離したとき、２５℃での表面プラズモン共鳴による測定で約８．６６×１０−４秒−１〜約１．０８×１０−２秒−１のｋｄを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト葉酸受容体αから分離したとき、２５℃での表面プラズモン共鳴による測定で約２．２８×１０−４秒−１〜約４．８２×１０１秒−１のｋｄを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト葉酸受容体αから分離したとき、以下の実施例でヒト葉酸受容体αについて報告されたｋｄ値のほぼいずれかのｋｄを有する。
[00267] いくつかの実施形態では、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定され、ＫＤによって示される、カニクイザル葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、約０．１９×１０−９Ｍ〜約２．８４×１０−９Ｍである。いくつかの実施形態では、カニクイザル葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、以下の実施例においてカニクイザル葉酸受容体αについて報告されたＫＤ値のほぼいずれかである。
[00268] いくつかの実施形態では、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定され、ＫＤによって示される、マウス葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、約０．５×１０−９Ｍ〜約９．０７×１０−８Ｍである。いくつかの実施形態では、マウス葉酸受容体αに対する抗体の親和性は、以下の実施例においてマウス葉酸受容体αについて報告されたＫＤ値のほぼいずれかである。
[00269] いくつかの態様では、ＫＤ、ｋａ及びｋｄは、２５℃で測定される。いくつかの実施形態では、ＫＤ、ｋａ及びｋｄは、表面プラズモン共鳴によって測定される。いくつかの実施形態では、ＫＤ、ｋａ及びｋｄは、本明細書で提供される実施例に記載される方法によって測定される。
８．エピトープ結合
[00270] いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０８〜３６６のいずれかを包含する抗体と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、上記ＶＨ−ＶＬ対のいずれかを含む抗体と同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３０８〜３６６のいずれかを包含する抗体とエピトープ結合について競合する。いくつかの実施形態では、抗体は、上記ＶＨ−ＶＬ対のいずれかを含む抗体とエピトープ結合について競合する。
９．グリコシル化変異型
[00271] 特定の実施形態では、抗体は、改変されて、それがグリコシル化される程度が増加、減少又は排除され得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、「Ｎ結合」又は「Ｏ結合」のいずれかである。
[00272] 「Ｎ結合」グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。
[00273] 「Ｏ結合」グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つが最も一般的にはセリン又はスレオニンであるヒドロキシアミノ酸に結合することを指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
[00274] Ｎ結合グリコシル化部位の抗体付加又は欠失は、アミノ酸配列を改変して、上記のトリペプチド配列の１つ又は複数が生成し又は除去されるようにすることで達成され得る。Ｏ結合グリコシル化部位の付加又は欠失は、抗体の配列内の又は（場合により）抗体配列への、１つ又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、欠失又は置換によって達成され得る。
１０．Ｆｃ変異型
[00275] 特定の実施形態では、アミノ酸修正物が本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入されて、Ｆｃ領域変異型が生成され得る。特定の実施形態では、Ｆｃ領域変異型は、全てではないが、一部のエフェクター機能を保有する。このような抗体は、例えば、生体内での抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能は、不必要又は有害である用途において有用であり得る。エフェクター機能の例としては、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）及び抗体指向補体媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）が挙げられる。エフェクター機能が改変される多数の置換若しくは置換群又は欠失が当該技術分野で知られている。
[00276] いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＣＨ３配列の少なくとも１つに、１つ又は複数の修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＣＨ２配列の少なくとも１つに、１つ又は複数の修飾を含む。例えば、Ｆｃは、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６２Ｄ、Ｖ２６２Ｋ、Ｖ２６２Ｒ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ３０３Ｒ及びＶ３０５Ｒからなる群から選択される１つ又は修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、単一のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、例えば、２つのポリペプチドなどの多ペプチドである。Ｆｃ領域の例示的な修正は、例えば、２０１７年６月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０３７５４５号に記載される。
[00277] ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の変化は、生体外及び／又は生体内アッセイを使用して確認され得る。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、ＦｃγＲ結合が測定され得る。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現については、その全体が参照により援用される、Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 1991, 9:457-492で要約される。
[00278] 目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するための生体外アッセイの非限定的例は、それぞれその内容全体が参照により援用される、米国特許第５，５００，３６２号及び米国特許第５，８２１，３３７号；Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83:7059-7063; Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82:1499-1502;及びBruggemann et al., J. Exp. Med., 1987, 166:1351-1361で提供される。このようなアッセイで有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代わりに又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、その全体が参照により援用される、Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:652-656で開示されたものなどの動物モデルを使用して生体内で評価され得る。
[00279] 抗体がＣ１ｑに結合できず、そのため、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するためにＣ１ｑ結合アッセイが実行され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイの例としては、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号に記載されるものが挙げられる。
[00280] 補体活性化アッセイとしては、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 1996, 202:163-171; Cragg et al., Blood, 2003, 101:1045-1052; 及びCragg and Glennie, Blood, 2004, 103:2738-2743に記載されるものが挙げられる。
[00281] 例えば、その全体が参照により援用される、Petkova et al., Intl. Immunol., 2006, 18:1759-1769に記載される方法を使用して、ＦｃＲｎ結合及び生体内クリアランス（半減期判定）も測定され得る。
１１．修飾アミノ酸
[00282] 抗体コンジュゲートが修飾アミノ酸を含む場合、修飾アミノ酸は、実務家によって適切であると見なされる任意の修飾アミノ酸であり得る。特定の実施形態では、修飾アミノ酸は、リンカー前駆体又はペイロード前駆体への共有結合を形成するのに有用な反応基を含む。特定の実施形態では、修飾アミノ酸は、非天然アミノ酸である。特定の実施形態では、反応基は、アミノ、カルボキシ、アセチル、ヒドラジノ、ヒドラジド、セミカルバジド、スルファニル、アジド及びアルキニルからなる群から選択される。修飾アミノ酸は、例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３／１８５１１５号及び国際公開第２０１５／００６５５５号にも記載される。
[00283] 特定の実施形態では、アミノ酸残基は、以下の式：
のいずれかに従う。当業者は、抗体が一般にＬ−アミノ酸からなることを認識するであろう。しかし、非天然アミノ酸について、本方法及び組成物は、部位特異的位置でＬ−、Ｄ−又はラセミ非天然アミノ酸を使用する能力を実務家に提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載される非天然アミノ酸は、天然アミノ酸のＤバージョン及び天然アミノ酸のラセミバージョンを含む。
[00284] 上記の式において、波線は、抗体のポリペプチド鎖の残りの部分に接続する結合を示す。これらの非天然アミノ酸は、同じポリペプチド鎖に組み込まれた天然アミノ酸と全く同じように、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る。特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、式に示されるように、アミド結合を介してポリペプチド鎖に組み込まれる。
[00285] 上記の式において、Ｒは、アミノ酸残基が天然アミノ酸残基と同一でない限り、限定なしに任意の官能基を指す。特定の実施形態では、Ｒは、疎水性基、親水性基、極性基、酸性基、塩基性基、キレート基、反応基、治療的部分又は標識部分であり得る。特定の実施形態では、Ｒは、Ｒ１ＮＲ２Ｒ３、Ｒ１Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、Ｒ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２、Ｒ１Ｎ３、Ｒ１Ｃ（≡ＣＨ）からなる群から選択される。これらの実施形態において、Ｒ１は、結合、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレンからなる群から選択される。Ｒ２及びＲ３は、それぞれ水素、アルキル及びヘテロアルキルからなる群から独立して選択される。
[00286] いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸としては、２０種の一般的アミノ酸には見られない官能基（アジド、ケトン、アルデヒド及びアミノオキシ基をはじめとするが、これに限定されるものではない）と効率的且つ選択的に反応し、安定なコンジュゲートを形成する側鎖官能基が挙げられる。例えば、アジド官能基を含む非天然にコードされたアミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドは、ポリマー（ポリ（エチレングリコール）をはじめとするが、これに限定されるものではない）又は代わりにアルキン部分を含む第２のポリペプチドと反応して、安定なコンジュゲートが形成され、アジ化物とアルキン官能基との選択的反応の結果としてヒュスゲン［３＋２］付加環化生成物が形成される。
[00287] 本発明で使用するのに適し得、水溶性ポリマーとの反応に有用である例示的な非天然にコードされたアミノ酸としては、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジ化物及びアルキン反応基を有するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、糖部分を含む。このようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、アミノ酸と糖類との間の天然に存在するＮ結合又はＯ結合が、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、天然には通常見られない共有結合によって置換されている例も挙げられる。このようなアミノ酸の例は、天然に存在するタンパク質には通常見られない２−デオキシグルコース、２−デオキシガラクトースなどの糖類も含む。
[00288] 本明細書で提供される非天然にコードされたアミノ酸の多くは、例えば、Sigma-Aldrich（St. Louis, Mo., USA）、Novabiochem（EMD Biosciences, Darmstadt, Germanyの一部門）又はPeptech （Burlington, Mass., USA）から市販される。市販されていないものは、本明細書で提供されるように又は当業者に知られている標準法を使用して、任意選択的に合成される。有機合成技術については、例えば、Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York);及びAdvanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)を参照されたい。参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号及び米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号も参照されたい。
[00289] 多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸ベースであり、本発明での使用に適する。チロシン類似体としては、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン及びメタ置換チロシンが挙げられるが、これに限定されるものではなく、置換チロシンとしては、ケト基（アセチル基をはじめとするが、これに限定されるものではない）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６〜Ｃ２０直鎖又は分枝炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基などが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、多重置換されたアリール環も考察される。本発明で使用するのに適し得るグルタミン類似体としては、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環式誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で使用するのに適し得るフェニルアラニン類似体の例としては、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されるものではなく、置換基としては、水酸基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（アセチル基をはじめとするが、これに限定されるものではない）、ベンゾイル、アルキニル基などが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で使用するのに適し得る非天然アミノ酸の特定の例としては、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、L-Dopa、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で使用するのに適し得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「In vivo incorporation of unnatural amino acids」という名称の国際公開第２００２／０８５９２３号で提供される。追加的なメチオニン類似体については、Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24も参照されたい。
[00290] 本発明で使用するのに適した非天然アミノ酸の多くは、例えば、Sigma（USA）又はAldrich（Milwaukee, Wis., USA）から市販される。市販されていないものは、本明細書で提供されるように、又は様々な刊行物で提供されるように、又は当業者に知られている標準法を使用して、任意選択的に合成される。有機合成技術については、例えば、Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York);及びAdvanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)を参照されたい。非天然アミノ酸の合成を記載する追加的な刊行物としては、例えば、「In vivo incorporation of unnatural amino acids」という名称の国際公開第２００２／０８５９２３号；Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F. E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl] amino] quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989:1859-1866; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-4308;及びSubasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7が挙げられる。「Protein Arrays」という名称の２００３年１２月２２日に出願された米国特許出願第１０／７４４，８９９号及び２００２年１２月２２日に出願された米国特許出願第６０／４３５，８２１号も参照されたい。
[00291] 有用な非天然アミノ酸の特定の例としては、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｂ−セリン、L-Dopa、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに有用な例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。
[00292] 特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、ｐ−アセチル−フェニルアラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ−アジド−メチル−フェニルアラニン及びｐ−アジド−フェニルアラニンから選択される。特に有用な１つの非天然アミノ酸は、ｐ−アジドフェニルアラニンである。このアミノ酸残基は、例えば、アルキニル基を有する化合物とのヒュスゲン［３＋２］付加環化反応（いわゆる「クリック」ケミストリー反応）を促進することが当業者に知られている。この反応は、当業者が非天然アミノ酸の部位特異的位置で容易且つ迅速に抗体に共役させることができるようにする。
[00293] 特定の実施形態では、第１の反応基は、アルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン中をはじめとするが、これに限定されるものではない、プロパルギル基は、ときにアセチレン部分とも称される）であり、第２の反応基は、アジド部分であり、［３＋２］付加環化ケミストリーが用いられ得る。特定の実施形態では、第１の反応基は、アジド部分（非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン中をはじめとするが、これに限定されるものではない）であり、第２の反応基は、アルキニル部分である。
[00294] 上記の式において、各Ｌは、二価リンカーを表す。二価リンカーは、当業者に知られている任意の二価リンカーであり得る。一般に、二価リンカーは、非天然アミノ酸の官能基Ｒ及び同族反応基（例えば、α炭素）との共有結合を形成できる。有用な二価リンカー、結合、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン及び置換ヘテロアリーレンである。特定の実施形態では、リンカーは、Ｃ１〜１０アルキレン又はＣ１〜１０ヘテロアルキレンである。
[00295] 本明細書に記載される方法及び組成物で使用される非天然アミノ酸は、以下の４つの特性の少なくとも１つを有する：（１）非天然アミノ酸の側鎖上の少なくとも１つの官能基は、２０種の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸（すなわちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）の化学反応性に直交するか、又は非天然アミノ酸を含むポリペプチドに存在する天然アミノ酸の化学反応性に少なくとも直交する、少なくとも１つの特性及び／又は活性及び／又は反応性を有する；（２）導入された非天然アミノ酸は、一般的に遺伝的にコードされた２０種のアミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である；（３）非天然アミノ酸は、好ましくは、天然アミノ酸に釣り合った安定性又は典型的な生理学的条件下においてポリペプチドに安定に組み込まれ得、さらに好ましくは、このような組み込みは、生体内システムを介して生じ得る；（４）非天然アミノ酸は、オキシム官能基を含むか、又は好ましくは、非天然アミノ酸をはじめとするポリペプチドの生物学的特性を破壊しない（当然のことながら、このような生物学的特性の破壊が修飾／変換の目的である場合を除く）条件下において、又は変換がｐＨ約４〜約８の水性条件下で生じ得る場合、又は非天然アミノ酸上の反応部位が求電子部位である場合、試薬との反応によってオキシム基に変換され得る官能基を含む。任意の数の非天然アミノ酸がポリペプチドに導入され得る。非天然アミノ酸は、保護若しくは遮蔽されたオキシム又は保護された基の脱保護若しくは遮蔽された基の脱遮蔽後にオキシム基に変換され得る保護又は遮蔽された基も含み得る。非天然アミノ酸は、保護される基の脱保護又は遮蔽された基の脱遮蔽後、カルボニル又はジカルボニル基に変換され得、その結果、ヒドロキシルアミン又はオキシムと反応してオキシム基を形成するのに利用できる、保護又は遮蔽されたカルボニル又はジカルボニル基も含み得る。
[00296] さらなる実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物で使用され得る非天然アミノ酸としては、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的に又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光ケージ化及び／又は光異性化可能アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含むアミノ酸、糖置換セリンなどのグリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、アルデヒド含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又は他のポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学切断可能及び／又は光切断可能アミノ酸、約５個を超える又は約１０個を超える炭素をはじめとするが、これに限定されるものではない、ポリエーテル又は長鎖炭化水素をはじめとするが、これに限定されるものではない、天然アミノ酸と比較して伸長された側鎖を有するアミノ酸、炭素連結糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び１つ又は複数の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
[00297] いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、糖部分を含む。このようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、アミノ酸と糖類との間の天然に存在するＮ結合又はＯ結合が、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、天然には通常見られない共有結合によって置換されている例も挙げられる。このようなアミノ酸の例は、天然に存在するタンパク質には通常見られない２−デオキシグルコース、２−デオキシガラクトースなどの糖類も含む。
[00298] 特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、
又はその塩からなる群から選択される。このような非天然アミノ酸は、塩の形態であり得るか、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖類又はポリヌクレオチドに組み込まれ得、任意選択的に翻訳後修飾され得る。
[00299] 特定の実施形態では、修飾アミノ酸は、式５１〜６２：
又はその塩のいずれかに従う。
[00300] 特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、上記の化合物３０、５３、５６、５９、６０、６１及び６２からなる群から選択される。特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、化合物３０である。特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、化合物５６である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、化合物６１である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、化合物６２である。
１２．抗体コンジュゲートの調製
１２．１．抗原調製
[00301] 抗体の単離に使用されるＦＯＬＲ１タンパク質は、無傷のＦＯＬＲ１又はＦＯＬＲ１の断片であり得る。無傷のＦＯＬＲ１タンパク質又はＦＯＬＲ１の断片は、単離されたタンパク質又は細胞によって発現されたタンパク質の形態であり得る。抗体を生じるのに有用な他の形態のＦＯＬＲ１は、当業者に明らかであろう。
１２．２．モノクローナル抗体
[00302] モノクローナル抗体は、（例えば、その全体が参照により援用される）Kohler et al., Nature, 1975, 256:495-497によって初めて記載されたハイブリドーマ法を使用して及び／又は組換えＤＮＡ法（例えば、その全体が参照により援用される、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって入手され得る。モノクローナル抗体は、例えば、ファージベースの又は酵母ベースのライブラリを使用しても入手され得る。例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、米国特許第８，２５８，０８２号及び米国特許第８，６９１，７３０号を参照されたい。
[00303] ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物が免疫化され、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生できるリンパ球を生じさせる。代わりに、リンパ球は生体外で免疫化され得る。次に、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される。その全体が参照により援用される、Goding J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 3rded. (1986) Academic Press, San Diego, CAを参照されたい。
[00304] ハイブリドーマ細胞は、未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含有する適切な培養培地に播種し増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
[00305] 有用な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生をサポートし、ＨＡＴ培地の有無などの培地条件の影響を受けるものである。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞株は、ＭＯＰ−２１及びＭＣ−１１マウス腫瘍（Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CAから入手可能）及びＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（American Type Culture Collection, Rockville, MDから入手可能）に由来するものなどのマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている。例えば、その全体が参照により援用される、Kozbor, J. Immunol., 1984, 133:3001を参照されたい。
[00306] 所望の特異性、親和性及び／又は生物学的活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定後、選択されたクローンが限界希釈法によってサブクローニングされ、標準的な方法によって増殖され得る。前出のGodingを参照されたい。この目的に適した培養液としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍として生体内培養され得る。
[00307] モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され配列決定され得る。したがって、ハイブリドーマ細胞は、所望の特性を有する抗体をコードするＤＮＡの有用な供給源の役割を果たし得る。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れられ得、次にそれはさもなければ抗体を産生しない、細菌（例えば、大腸菌（E. coli）、酵母（例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）又はピキア属（Pichia）種）、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入されて、モノクローナル抗体が産生される。
１２．３．ヒト化抗体
[00308] ヒト化抗体は、対応するヒト抗体配列により、非ヒトモノクローナル抗体の構造部分のほとんど又は全てを置き換えることによって作製され得る。その結果、抗原特異的可変部分又はＣＤＲのみが非ヒト配列から構成されるハイブリッド分子が作製される。ヒト化抗体を得る方法としては、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、Winter and Milstein, Nature, 1991, 349:293-299; Rader et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:8910-8915; Steinberger et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:36073-36078; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86:10029-10033；及び米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号及び米国特許第６，１８０，３７０号に記載されるものが挙げられる。
１２．４．ヒト抗体
[00309] ヒト抗体は、例えば、遺伝子組換え動物（例えば、ヒト化マウス）を使用することにより、様々な当該技術分野で公知の技術によって作製され得る。例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90:2551; Jakobovits et al., Nature, 1993, 362:255-258; Bruggermann et al., Year in Immuno., 1993, 7:33；及び米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号及び米国特許第５，５４５，８０７号を参照されたい。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリにも由来し得る（例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 1991, 227:381-388; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597；及び米国特許第５，５６５，３３２号及び米国特許第５，５７３，９０５号）を参照されたい。ヒト抗体は、生体外活性化Ｂ細胞によっても産生され得る（例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、米国特許第５，５６７，６１０号及び米国特許第５，２２９，２７５号を参照されたい）。ヒト抗体は、酵母ベースのライブラリにも由来し得る（例えば、その全体が参照により援用される、米国特許第８，６９１，７３０号を参照されたい）。
１２．５．共役
[00310] 抗体コンジュゲートは、標準技術によって調製され得る。特定の実施形態では、抗体は、抗体からペイロードへの結合を形成するのに適した条件でペイロード前駆体と接触されて、抗体とペイロードとのコンジュゲートが形成される。特定の実施形態では、抗体は、抗体からリンカーへの結合を形成するのに適した条件下でリンカー前駆体に接触される。得られた抗体−リンカーは、抗体−リンカーからペイロードへの結合を形成するのに適した条件下でペイロード前駆体と接触されて、抗体−リンカー−ペイロードコンジュゲートが形成される。特定の実施形態では、ペイロード前駆体は、ペイロードからリンカーへの結合を形成するのに適した条件下でリンカー前駆体と接触される。得られたペイロード−リンカーは、ペイロード−リンカーから抗体への結合を形成するのに適した条件下で抗体と接触されて、抗体−リンカー−ペイロード−コンジュゲートが形成される。抗体コンジュゲートを調製するのに適したリンカーは本明細書で開示され、共役のための例示的な条件は、以下の実施例で記載されている。
[00311] いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１コンジュゲートは、本明細書で開示される抗ＦＯＬＲ１抗体と、（Ａ）〜（Ｌ）のいずれかの構造を有するリンカー前駆体とを接触させることによって調製される。
[00312] いくつかの実施形態では、（Ａ）〜（Ｌ）として同定されるリンカー前駆体の立体化学は、下記の式（Ａ１）〜（Ｌ１）及び（Ａ２）〜（Ｌ２）で描写されるように、左から右へ各キラル中心のＲ及びＳ表記で同定される。
１３．ベクター、宿主細胞及び組換え法
[00313] 実施形態は、抗ＦＯＬＲ１抗体をコードする単離された核酸、核酸を含むベクターと宿主細胞及び抗体の生産のための組換え技術の提供にも関する。
[00314] 抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（すなわちＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクターに挿入され得る。いくつかの態様では、核酸は、例えば、その全体が参照により援用される、米国特許第５，２０４，２４４号に記載されるような相同組換えによって生成され得る。
[00315] 多くの異なるベクターが当該技術分野で公知である。ベクター構成要素としては、一般に、例えば、その全体が参照により援用される、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されるような、シグナル配列、複製起点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列の１つ又は複数が挙げられるが、これに限定されるものではない。
[00316] 適切な宿主細胞の説明に役立つ実例を以下に提供する。これらの宿主細胞は、限定を意図するものではない。
[00317] 適切な宿主細胞としては、あらゆる原核生物（例えば、細菌）、下等真核生物（例えば、酵母）又は高等真核生物（例えば、哺乳類）の細胞が挙げられる。適した原核生物としては、例えば、エシェリキア属（Escherichia）（大腸菌（E. coli））、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）（ネズミチフス菌（S. typhimurium））、セラチア属（Serratia）（霊菌（S. marcescens））、シゲラ属（Shigella）、桿菌（Bacilli）（Ｂ．サブチリス（B. subtilis）及びＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis））、シュードモナス属（Pseudomonas）（緑膿菌（P. aeruginosa））及びストレプトミセス属（Streptomyces）などの腸内細菌科のようなグラム陰性又はグラム陽性生物などの真正細菌が挙げられる。有用な大腸菌（E. coli）クローニング宿主は、大腸菌（E. coli）294であるが、大腸菌（E. coli）Ｂ、大腸菌（E. coli）X1776及び大腸菌（E. coli）W3110などの他の株も適切である。
[00318] 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗ＦＯＬＲ１抗体をコードするベクターの適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又は普通のパン用酵母は、一般に使用される下等真核生物の宿主微生物である。しかし、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）（例えば、SF9）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）（Ｋ．ラクチス（K. lactis）、Ｋ．フラジリス（K. fragilis）、Ｋ．ブルガリカス（K. bulgaricus）、Ｋ．ウイッケルハミイ（K. wickerhamii）、Ｋ．ワルティ（K. waltii）、Ｋ．ドロソフィラルム（K. drosophilarum）、Ｋ．サーモトレランス（K. thermotolerans）及びＫ．マルキシアナス（K. marxianus））、ヤロウィア属（Yarrowia）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ属（Candida）（Ｃ．アルビカンス（C. albicans））、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）（Ｓ．オクシデンタリス（S. occidentalis））並びに例えばペニシリウム属（Penicillium）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）及びアスペルギルス属（Aspergillus）（Ａ．ニデュランス（A. nidulans）及びＡ．ニガー（A. niger））などの糸状菌などのいくつかの他の属、種及び株も利用でき、有用である。
[00319] 有用な哺乳類宿主細胞としては、ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３細胞；幼若ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）などが挙げられる。
[00320] 本発明の抗ＦＯＬＲ１抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。例えば、HamのF10、基礎培地（ＭＥＭ）、RPMI-1640及びダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適する。さらに、Ham et al., Meth. Enz., 1979, 58:44；Barnes et al., Anal. Biochem., 1980, 102:255；及び米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号及び米国特許第５，１２２，４６９号又は国際公開第９０／０３４３０号及び国際公開第８７／００１９５号のいずれかに記載される培地が使用され得る。前述の参考文献のそれぞれは、その全体が参照により援用される。
[00321] これらの培地はいずれも、必要に応じてホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質、微量元素（通常、マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に知られているであろう適切な濃度で含まれ得る。
[00322] 温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。
[00323] 組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内、細胞膜周辺腔で産生されるか又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１段階として、宿主細胞又は溶解断片のいずれかである粒子状残骸が例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。例えば、Carter et al.（Bio/Technology, 1992, 10:163-167）は、大腸菌（E. coli）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載する。簡潔に述べると、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍される。細胞残骸は、遠心分離によって除去され得る。
[00324] いくつかの実施形態では、抗体は、無細胞系で生産される。いくつかの態様では、無細胞系は、その全体が参照により援用される、Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225に記載されるような生体外転写及び翻訳系である。いくつかの態様では、無細胞系は、真核細胞又は原核細胞からの無細胞抽出物を利用する。いくつかの態様では、原核細胞は、大腸菌（E. coli）である。抗体の無細胞発現は、例えば、抗体が細胞内で不溶性凝集体として蓄積する場合又はペリプラズム発現からの収量が低い場合に有用であり得る。無細胞系で生産された抗体は、細胞の供給源に応じて脱グリコシル化され得る。
[00325] 抗体が培地に分泌される場合、このような発現系からの上清は、一般に、最初に例えばAmicon（登録商標）又はMillipore（登録商標）Pellcon（登録商標）限外濾過装置などの市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するための前述のステップのいずれかに含まれ得、抗生物質は、偶発性汚染物質の増殖を防ぐために含まれ得る。
[00326] 細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得、アフィニティークロマトグラフィーが特に有用な精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びイソタイプに左右される。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖ベースの抗体が精製され得る（その全体が参照により援用される、Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 1983, 62:1-13）。プロテインＧは、全てのマウスイソタイプ及びヒトγ３に有用である（その全体が参照により援用される、Guss et al., EMBO J., 1986, 5:1567-1575）。
[00327] 親和性リガンドが付着しているマトリックスは、アガロースであることが多いが、他のマトリックスも利用できる。制御孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成され得るよりも速い流速と短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、BakerBond ABX（登録商標）樹脂が精製に有用である。
[00328] イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（登録商標）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も利用でき、当業者によって適用され得る。
[00329] 任意の予備精製ステップに続いて、目的の抗体と汚染物質とを含む混合物は、一般に低い塩濃度（例えば、約０〜約０．２５Ｍの塩）で実施される、ｐＨ約２．５〜約４．５の溶出緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
１４．医薬組成物及び投与方法
[00330] 本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、当該技術分野で利用できる方法及び本明細書で開示されるものを使用して医薬組成物に製剤化され得る。本明細書で提供される抗体コンジュゲートのいずれも適切な医薬組成物中で提供され、適切な投与経路によって投与され得る。
[00331] 本明細書で提供される方法は、本明細書で提供される少なくとも１つの抗体コンジュゲートを含む医薬組成物と、１つ又は複数の適合性で薬学的に許容可能な担体とを投与することを包含する。これに関連して、「薬学的に許容される」という用語は、動物及びより特にヒトで使用するために、連邦政府（the Federal）又は州政府の監督官庁によって承認されるか、又は米国薬局方又は他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、（完全及び不完全）フロイントアジュバント）、賦形剤又はビヒクルを含む。このような薬学的担体は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの鉱油、動物、植物又は合成起源のものをはじめとする、水及び油などの滅菌液体であり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合、水が担体として使用され得る。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に、注射液のための液体担体としても用いられ得る。適切な薬学的担体の例は、Martin, E.W., Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載される。
[00332] 臨床診療では、本明細書で提供される医薬組成物又は抗体コンジュゲートは、当該技術分野で公知の任意の経路によって投与され得る。例示的な投与経路としては、吸入、動脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経鼻、非経口、肺及び皮下経路が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物又は抗体コンジュゲートは、非経口的に投与される。
[00333] 非経口投与のための組成物は、エマルション又は滅菌溶液であり得る。非経口組成物は、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油及び注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）を含み得る。これらの組成物は、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤及び安定剤も含有し得る。滅菌は、例えば、細菌学的フィルターを使用して、放射線又は加熱によってなどのいくつかの方法で実施され得る。非経口組成物は、使用時に滅菌水又は任意の他の注射用滅菌媒体に溶解され得る滅菌固体組成物の形態でも調製され得る。
[00334] いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、医薬組成物又は単一の単位用量剤形である。本明細書で提供される医薬組成物及び単一の単位用量剤形は、１つ又は複数の予防的又は治療的抗体コンジュゲートの予防的又は治療的有効量を含む。
[00335] 医薬組成物は、１つ又は複数の医薬品賦形剤を含み得る。任意の適切な医薬品賦形剤が使用され得、当業者は、適切な医薬品賦形剤を選択できる。適切な賦形剤の非限定的例としては、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、粉末、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。特定の賦形剤が医薬組成物又は剤形への組み込みに適するかどうかは、剤形が対象に投与される様式及び剤形中の特異的抗体をはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で周知の様々な要因に依存する。組成物又は単一の単位用量剤形は、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤を含有し得る。したがって、以下に提供される医薬品賦形剤は、例示的であり、限定的ではないことが意図される。追加的な医薬品賦形剤としては、例えば、その全体が参照により援用される、Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. (Eds.) 6th Ed. (2009)に記載されるものが挙げられる。
[00336] いくつかの実施形態では、医薬組成物は、消泡剤を含む。任意の適切な消泡剤が使用され得る。いくつかの態様では、消泡剤は、アルコール、エーテル、油、ワックス、シリコーン、界面活性剤及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、消泡剤は、鉱油、植物油、エチレンビスステアラミド、パラフィン蝋、エステルワックス、脂肪アルコールワックス、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸石鹸、脂肪酸エステル、シリコングリコール、フルオロシリコーン、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール共重合体、ポリジメチルシロキサン−シリコンジオキシド、エーテル、オクチルアルコール、カプリルアルコール、ソルビタントリオレアート、エチルアルコール、２−エチルヘキサノール、ジメチコン、オレイルアルコール、シメチコン及びそれらの組み合わせから選択される。
[00337] いくつかの実施形態では、医薬組成物は、共溶媒を含む。共溶媒の説明に役立つ実例としては、エタノール、ポリ（エチレン）グリコール、ブチレングリコール、ジメチルアセトアミド、グリセリン及びプロピレングリコールが挙げられる。
[00338] いくつかの実施形態では、医薬組成物は、緩衝液を含む。緩衝剤の説明に役立つ実例としては、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、水酸化物、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、グリシン、メチオニン、グアーガム及びグルタミン酸ナトリウムが挙げられる。
[00339] いくつかの実施形態では、医薬組成物は、担体又は充填剤を含む。担体又は充填剤の説明に役立つ実例としては、乳糖、マルトデキストリン、マンニトール、ソルビトール、キトサン、ステアリン酸、キサンタンガム及びグアーガムが挙げられる。
[00340] いくつかの実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤を含む。界面活性剤の説明に役立つ実例としては、ｄ−αトコフェロール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、ドキュセートナトリウム、ベヘン酸グリセリル、モノオレイン酸グリセリル、ラウリン酸、マクロゴール１５ヒドロキシステアレート、ミリスチルアルコール、リン脂質、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリオキシルグリセリド、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル及びビタミンＥポリエチレン（グリコール）コハク酸塩が挙げられる。
[00341] いくつかの実施形態では、医薬組成物は、固結防止剤を含む。固結防止剤の説明に役立つ実例としては、リン酸カルシウム（三塩基性）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及び酸化マグネシウムが挙げられる。
[00342] 医薬組成物と共に使用され得る他の賦形剤としては、例えば、アルブミン、抗酸化剤、抗菌剤、抗真菌剤、生体吸収性ポリマー、キレート化剤、制御放出剤、希釈剤、分散剤、溶解促進剤、乳化剤、ゲル化剤、軟膏基剤、浸透促進剤、保存料、可溶化剤、溶剤、安定剤及び糖類が挙げられる。これらの各薬剤の特定の例は、例えばその全体が参照により援用される、Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. (Eds.) 6th Ed. (2009), The Pharmaceutical Pressに記載される。
[00343] いくつかの実施形態では、医薬組成物は、溶媒を含む。いくつかの態様では、溶媒は、無菌等張食塩水又はデキストロース溶液などの生理食塩水溶液である。いくつかの態様では、溶媒は、注射用水である。
[00344] いくつかの実施形態では、医薬組成物は、微粒子又はナノ粒子などの粒子形態である。微粒子及びナノ粒子は、ポリマー又は脂質などの任意の適切な物質から形成され得る。いくつかの態様では、微粒子又はナノ粒子は、ミセル、リポソーム又はポリマーソームである。
[00345] 抗体コンジュゲートを含む無水医薬組成物及び剤形が本明細書でさらに提供され、これは、いくつかの実施形態では、水が一部の抗体の分解を促進し得るためである。
[00346] 本明細書で提供される無水医薬組成物及び剤形は、無水又は低水分含有成分と、低水分又は低湿度条件とを使用して調製され得る。乳糖と、一級アミン又は二級アミンを含む少なくとも１つの活性成分とを含む医薬組成物及び剤形は、製造、包装及び／又は貯蔵中における水分及び／又は湿度との実質的な接触が予測される場合、無水であり得る。
[00347] 無水医薬組成物は、その無水性質が維持されるように調製され保存され得る。したがって、無水組成物は、それらが適切な処方キットに含まれ得るように、水への曝露を防止することが知られている材料を使用して包装され得る。適切な包装の例としては、密封ホイル、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパック及びストリップパックが挙げられるが、これに限定されるものではない。
[00348] 本明細書で提供される乳糖非含有組成物は、当該技術分野で周知の、例えば米国薬局方（ＵＳＰ）ＳＰ（ＸＸＩ）／ＮＦ（ＸＶＩ）で列挙される賦形剤を含み得る。一般に、乳糖非含有組成物は、活性成分、結合剤／充填剤及び潤滑剤を薬学的に適合性及び薬学的に許容可能な量で含む。例示的な乳糖非含有剤形は、活性成分、微結晶セルロース、α化デンプン及びステアリン酸マグネシウムを含む。
[00349] 抗体又は抗体コンジュゲートが分解する速度を低下させる１つ又は複数の賦形剤を含む医薬組成物及び剤形も提供される。本明細書で「安定剤」と称されるこのような賦形剤としては、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ｐＨ緩衝剤又は塩緩衝剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。
１４．１．非経口剤形
[00350] 特定の実施形態では、非経口剤形が提供される。非経口剤形は、皮下、静脈内（ボーラス注射を含む）、筋肉内及び動脈内をはじめとするが、これに限定されるものではない、様々な経路によって対象に投与され得る。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する対象の自然防御を回避することから、それらは、典型的には、対象に投与する前に無菌であるか又は滅菌可能である。非経口剤形の例としては、注射可能な溶液、薬学的に許容可能な注射用ビヒクルに溶解又は懸濁可能な乾燥製品、注射可能な懸濁液及びエマルションが挙げられるが、これに限定されるものではない。
[00351] 非経口剤形を提供するために使用され得る適切なビヒクルは、当業者によく知られている。例としては、注射用水ＵＳＰ；塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロース及び塩化ナトリウム注射及び乳酸加リンゲル注射などであるが、これに限定されるものではない水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなどであるが、これに限定されるものではない水混和性ビヒクル；及びコーンオイル、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び安息香酸ベンジルなどであるが、これに限定されるものではない非水性ビヒクルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
[00352] 本明細書で開示される１つ又は複数の抗体の溶解度を増加させる賦形剤も非経口剤形に組み込まれ得る。
１４．２．用量及び単位用量剤形
[00353] ヒトの治療では、予防的又は治癒的治療に応じて且つ治療される対象に固有の年齢、体重、病状及び他の要因に応じて、医師が最も適切と考える薬量学を決定する。
[00354] 特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、医薬組成物又は単一の単位用量剤形である。本明細書で提供される医薬組成物及び単一の単位用量剤形は、１つ又は複数の予防的又は治療的抗体の予防的又は治療的有効量を含む。
[00355] 障害又はその１つ若しくは複数の症状の予防又は治療に有効な抗体コンジュゲート又は組成物の量は、疾患又は病状の性質と重症度並びに抗体が投与される経路によって変動する。頻度及び用量は、投与される特定の治療法（例えば、治療的又は予防的薬剤）、障害、疾患又は病状の重症度、投与経路並びに対象の年齢、体重、応答及び過去の病歴に応じて、各対象に特有の要因によっても変動する。有効用量は、生体外又は動物モデル試験システムから得られた用量反応曲線から外挿され得る。
[00356] 特定の実施形態では、組成物の例示的用量としては、１キログラムの対象又はサンプル重量当たりのミリグラム又はマイクログラム量の抗体が挙げられる（例えば、１キログラム当たり約１０マイクログラム〜１キログラム当たり約５０ミリグラム、１キログラム当たり約１００マイクログラム〜１キログラム当たり約２５ミリグラム又は１キログラム当たり約１００マイクログラム〜１キログラム当たり約１０ミリグラム）。特定の実施形態では、対象における障害又は１つ又は複数のその症状を予防、治療、管理又は改善するために投与される抗体重量に基づく、本明細書で提供される抗体コンジュゲートの用量は、対象の体重当たり０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋ以上である。別の実施形態では、対象における障害又は１つ又は複数のその症状を予防、治療、管理又は改善するために投与される、組成物又は本明細書で提供される組成物の用量は、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜５０ｍｇ、０．１ｍｇ〜２５ｍｇ、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜７．５ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５〜１５ｍｇ、０．２５〜１２ｍｇ、０．２５〜１０ｍｇ、０．２５ｍｇ〜７．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．５〜１５ｍｇ、０．５〜１２ｍｇ、０．５〜１０ｍｇ、０．５ｍｇ〜７．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜７．５ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ又は１ｍｇ〜２．５ｍｇである。
[00357] 用量は、適切なスケジュールに従って、例えば週に１回、２回、３回又は４回投与され得る。当業者に明らかであるように、場合により、本明細書で開示される範囲外の用量の抗体コンジュゲートを使用することが必要であり得る。さらに、臨床医又は治療医は、対象の応答と併せて、いつどのように治療を中断、調節又は終結させるかを知っていることに留意されたい。
[00358] 当業者に容易に分かるように、異なる治療有効量が異なる疾患及び病状に応用でき得る。同様に、このような障害を予防、管理、治療又は改善するのに十分な量であるが、本明細書で提供される抗体に関連する有害作用を引き起こすのには不十分な量又は軽減するのに十分な量も本明細書に記載の用量及び投薬頻度スケジュールに包含される。さらに、本明細書に提供される組成物の複数の用量が対象に投与される場合、全ての用量が同じである必要はない。例えば、対象に投与される用量が増加されて、組成物の予防効果又は治療効果が改善され得るか、又は減少されて、特定の対象が経験している１つ又は複数の副作用が低減され得る。
[00359] 特定の実施形態では、治療又は予防は、本明細書で提供される抗体コンジュゲート又は組成物の１つ又は複数の負荷用量で開始し得、その後、１つ又は複数の維持用量がそれに続く。
[00360] 特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲート又は組成物の用量が投与され、対象の血液又は血清中の抗体の定常状態濃度が達成され得る。定常状態の濃度は、当業者が利用可能な技術による測定によって判定され得るか、又は身長、体重及び年齢などの対象の身体的特徴に基づき得る。
[00361] 特定の実施形態では、同じ組成物の投与が繰り返され得、投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３か月又は６か月間、隔てられ得る。他の実施形態では、同じ予防薬又は治療薬の投与が繰り返され得、投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３か月又は６か月間、隔てられ得る。
１４．３．併用療法及び製剤
[00362] 特定の実施形態では、本明細書で開示される１つ又は複数の化学療法剤と組み合わされた、本明細書で提供される抗体コンジュゲートのいずれかを含む組成物及び治療製剤並びにこのような組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法が提供される。化学療法剤の例としては、エルロチニブ（タルセバ（登録商標）、Genentech/OSI Pharm.）、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標）、Millennium Pharm.）、フルベストラント（フェソロデックス（登録商標）、AstraZeneca）、スーテント（SU11248、Pfizer）、レトロゾール（フェマーラ（登録商標）、Novartis）、イマチニブメシレート（GLEEVEC（登録商標）、Novartis）、PTK787/ZK 222584（Novartis）、オキサリプラチン（エロキサチン（登録商標）、Sanofi）、5-FU（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ラパミューン（登録商標）、Wyeth）、ラパチニブ（タイケルブ（登録商標）、GSK572016、Glaxo Smith Kline）、ロナファーニブ（SCH 66336）、ソラフェニブ（BAY43-9006、Bayer Labs）及びゲフィチニブ（イレッサ（登録商標）、AstraZeneca）、AG1478、AG1571（SU 5271；Sugen）、チオテパ及びシトキサン（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミンをはじめとする、エチレンイミン及びメチロールメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にウンシアラマイシン、カリケアマイシンガモール及びカリケアマイシンオメガル（Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（登録商標）（ドキソルビシン）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プラジエノライドＢ、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアムニプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナリン；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖類複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；例えば、タキソール（登録商標）（パクリタキセル；Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、アブラキサン（登録商標）（クレモフォール非含有）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.）及びタキソテール（登録商標）（ドセタキセル）；Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）などのタキソイド；クロラムブシル；ジェムザール（登録商標）（ゲムシタビン）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（登録商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ゼローダ（登録商標））；イバンドロン酸；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；及び上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸及び誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。
[00363] 特定の実施形態では、１つ又は複数のＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤と組み合わせて本明細書で提供される抗体コンジュゲートのいずれかを含む、組成物及び治療製剤並びにこのような組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１経路の小分子遮断薬を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１活性を阻害する抗体を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＣＡ−１７０、ＢＭＳ−８、ＢＭＳ−２０２、ＢＭＳ−９３６５５８、ＣＫ−３０１及びＡＵＮＰ１２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アベルマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、AMP-224（GlaxoSmithKline）、MEDI0680/AMP-514（AstraZeneca）、PDR001（Novartis）、セミプリマブ、TSR-042（Tesaro）、チスレリズマブ／BGB-A317（Beigene）、CK-301（Checkpoint Therapeutics）、BMS-936559（Bristol-Meyers Squibb）、カムレリズマブ、シンチリマブ、トリパリマブ、ゲノリムズマブ及びＡ１６７（Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、MGA012（Incyte/MacroGenics）、PF-06801591（Pfizer/Merck KGaA）、LY3300054（Eli Lilly）、FAZ053（Novartis）、PD-11（Novartis）、CX-072（CytomX）、BGB-A333（Beigene）、BI 754091（Boehringer Ingelheim）、JNJ-63723283（Johnson and Johnson/Jannsen）、AGEN2034（Agenus）、CA-327（Curis）、CX-188（CytomX）、STI -A1110（Servier）、JTX-4014（Jounce）、（LLY）AM0001（Armo Biosciences）、CBT-502（CBT Pharmaceuticals）、FS118（F-Star/Merck KGaA）、XmAb20717（Xencor）、XmAb23104（Xencor）、AB122（Arcus Biosciences）、KY1003（Kymab）、RXI-762（RXi）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、PRS-332（Pieris Pharmaceuticals）、ALPN-202（Alpine Immune Science）、TSR-075（Tesaro/Anaptys Bio）、MCLA-145（Merus）、MGD013（Macrogenics）、MGD019（Macrogenics）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、例えば、国際公開第２０１６／０７７３９７号、国際公開第２０１８／１５６７７７号及び２０１８年５月２３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０３４２１３号に記載される抗ＰＤ１単一特異性又は二重特異性抗体から選択される。
[00364] 本明細書で開示される抗体コンジュゲートと組み合わせて投与される薬剤は、抗体コンジュゲートの投与の直前、同時又は直後に投与され得る。本開示の目的で、このような投与レジメンは、追加的な治療活性成分と「組み合わされた」抗体コンジュゲートの投与と見なされる。実施形態としては、本明細書で開示される抗体コンジュゲートが、本明細書で開示される化学療法剤、ＰＤ−１阻害剤又はＰＤ−Ｌ１阻害剤の１つ又は複数と共配合される、医薬組成物が挙げられる。
１５．治療用途
[00365] 治療用途では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、当該技術分野で公知であるもの及び上で考察されるものなどの薬学的に許容可能な剤形において、一般にヒトである哺乳類に投与され得る。例えば、抗体コンジュゲートは、ボーラスとして静脈内に、又は一定時間にわたる持続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、クモ膜下腔内又は腫瘍内経路により、ヒトに投与され得る。抗体コンジュゲートは、腫瘍周囲、病変内又は病変周囲経路によって適切に投与され、局所的並びに全身的な治療効果を発揮する。腹腔内経路は、例えば、卵巣腫瘍の治療でも特に有用であり得る。
[00366] 本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）が関与する任意の疾患又は病状の治療に有用であり得る。いくつかの実施形態では、疾患又は病状は、葉酸受容体αの過剰発現によって診断され得る疾患又は病状である。いくつかの実施形態では、疾患又は病状は、抗葉酸受容体α抗体による治療から恩恵を受け得る疾患又は病状である。いくつかの実施形態では、疾患又は病状は、がんである。
[00367] あらゆる適切ながんが、本明細書で提供される抗体コンジュゲートで治療され得る。例示的な適切ながんとしては、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞がん、脳腫瘍、胆管がん、膀胱がん、骨がん、乳がん（トリプルネガティブ乳がん又はＴＮＢＣを含む）、気管支腫瘍、原発不明がん、心臓腫瘍、子宮頸がん、脊索腫、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、乳管がん腫、胚芽腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、卵管がん、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼がん、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん（gastric cancer）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭頸部がん、肝細胞がん、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、口唇及び口腔がん、肝臓がん、非浸潤性小葉がん、肺がん、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、ＮＵＴ遺伝子関与正中管がん、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、脳下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂及び尿管がん、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃がん（stomach cancer）、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫腫瘍、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、外陰がん及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
[00368] いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートで治療される疾患は、胃がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、子宮がん、卵管がん、原発性腹膜がん、子宮の体がん腫、子宮内膜がん腫、前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、脳腫瘍、肝臓がん、膵臓がん、中皮腫及び／又は上皮起源のがんである。特定の実施形態では、疾患は、結腸直腸がんである。いくつかの実施形態では、疾患は、卵巣がんである。いくつかの実施形態では、疾患は、乳がんである。いくつかの実施形態では、疾患は、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。いくつかの実施形態では、疾患は、肺がんである。いくつかの実施形態では、疾患は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。いくつかの実施形態では、疾患は、頭頸部がんである。いくつかの実施形態では、疾患は、腎細胞がんである。いくつかの実施形態では、疾患は、脳腫瘍である。いくつかの実施形態では、疾患は、子宮内膜がんである。
１６．診断用途
[00369] いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、診断用途で使用される。例えば、抗ＦＯＬＲ１抗体コンジュゲートは、ＦＯＬＲ１タンパク質のアッセイに有用であり得る。いくつかの態様では、抗体コンジュゲートを使用して、様々な細胞及び組織におけるＦＯＬＲ１の発現が検出され得る。これらのアッセイは、例えば、がんなどの疾患の診断及び／又は予後を決定する際に有用であり得る。
[00370] 一部の診断及び予後の用途では、抗体コンジュゲートが検出可能な部分で標識され得る。適切な検出可能部分としては、放射性同位体、蛍光標識及び酵素基質標識が挙げられるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体コンジュゲートが標識される必要はなく、抗体コンジュゲートの存在は、抗ＦＯＬＲ１抗体コンジュゲートに特異的に結合する標識抗体を使用して検出され得る。
１７．親和性精製試薬
[00371] 本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、親和性精製剤として使用され得る。このプロセスにおいて、抗体コンジュゲートは、当該技術分野で周知の方法を使用して、樹脂又は濾紙などの固相上に固定化され得る。固定化抗体コンジュゲートは、葉酸受容体αタンパク質（又はその断片）を含有するサンプルと接触されて精製され、その後、支持体が適切な溶媒で洗浄され、固定化抗体に結合する葉酸受容体αタンパク質以外の、サンプルの実質的に全ての物質が除去される。最後に、支持体は、例えば、グリシン緩衝液、ｐＨ５．０などの別の適切な溶媒で洗浄され、葉酸受容体αタンパク質が抗体から放出される。
１８．キット
[00372] いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＦＯＬＲ１抗体コンジュゲートは、キット、すなわち手順を実施するための使用説明書及び所定量の試薬の包装された組み合わせの形態で提供される。いくつかの実施形態では、手順は、診断的アッセイである。他の実施形態では、手順は、治療手順である。
[00373] いくつかの実施形態では、キットは、抗ＦＯＬＲ１抗体コンジュゲートの再構成のための溶媒をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体コンジュゲートは、医薬組成物の形態で提供される。
実施例
実施例１
抗ＦＯＬＲ１抗体の作製及び一次スクリーニング
[00374] 相補性決定領域（ＣＤＲ）を標的化する変異原性プライマーによる標準オーバーラップ伸長ＰＣＲプロトコルを使用して、抗体Ｆａｂライブラリを構築した。いずれもそれらの全体が参照により援用される、Heckman and Pease, Nat. Protoc., 2007, 2:924-932；Stafford et al., 2014, Protein Eng. Des. Sel. 27:97-109を参照されたい。新規抗体の選択は、標準的なリボソームディスプレイプロトコルを使用して実施した。その全体が参照により本明細書に援用される、Dreier and Pluckthun, 2011, Methods Mol Biol 687:283-306を参照されたい。
[00375] リボソームディスプレイからの最初の抗体リードは、基本テンプレートとしてトラスツズマブＨＣを使用してＰＣＲをオーバーラップすることによって構築された、ナイーブヒトライブラリから得た。ＣＤＲ Ｈ１及びＨ２は、Integrated DNA Technologiesから購入したオリゴヌクレオチドを使用して、Lee et al., J. Mol. Biol. 2004, 340:1073-1093によって記載されるような同一設計でランダム化した。この設計では、ＣＤＲ Ｈ１及びＨ２は、天然ヒト抗体の観測されたアミノ酸分布と厳密に一致する。ＣＤＲ Ｈ３は、アミノ酸のランダム化のために、三量体ホスホラミダイト混合物（ＴＲＩＭ）を組み込んだオリゴヌクレオチドを使用して多様化した。ＴＲＩＭオリゴをYagodkin A et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2007, 26:473-97によって記載されるように合成した。具体的には、ＴＲＩＭを含有する６つの個別のオリゴヌクレオチドを使用して、６つの個別のＨ３ループ長を作製し（１３〜１８；Zemlin et al.によって定義される通り）、ヒトレパートリーで観察される最も一般的なループ長に一致させた。Zemlin et al., J. Mol. Biol. 2003, 334:733-749によって報告されるように、これらのループの長さを合わせると、ヒトＩｇＧで天然に存在するループ長の変動のおよそ５４．５％を構成する。各アミノ酸の頻度分布は、Zemlin et al.によって報告された、ヒトＩｇＧのＣＤＲ Ｈ３で観測されたアミノ酸の分布と厳密に一致するように設計した。Zhai et al., J Mol Biol. 2011, 412:55-71に記載されるように、全体的に、ライブラリは、抗体の安定性及び抗体の折り畳みを改善することが本技術分野で知られている、天然ヒト抗体の多様性と厳密に一致する。Stafford et al., Protein Eng Des Sel 2014, 27:97-10によって記載されるように、選択過程全体を通じて、重鎖（ＨＣ）ライブラリは、定常未修飾トラスツズマブ軽鎖（ＬＣ）と対形成した。
[00376] 親和性成熟抗体リード（例えば、以下のＳＲＰ １８４８抗体）は、Eurofins MWG Operonから購入した「ソフトランダム化」オリゴヌクレオチドを使用して、オーバーラップＰＣＲによって構築された、２つのリードに偏った集中ライブラリから得た。ソフトランダム化は、その中で、親アミノ酸配列が他のアミノ酸よりも３０％程度より頻繁にコード化されるように、ヌクレオチドの偏った分布が各ソフトランダム化コドンに使用されるプロセスである。他のアミノ酸は各位置でコード化されるが、百分率はより低くなる。各ソフトランダム化位置では、親ヌクレオチドの７０％が他の３つのヌクレオチドの１０％と混合される。ライブラリでは、ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２及びＨ３を同時にソフトランダム化し、標準リボソームディスプレイプロトコルによって選択した。Stafford et al., Protein Eng Des Sel 2014, 27:97-109によって記載されるように、最初のリードの選択と同様に、選択過程全体を通じて、親和性成熟抗体と定常未修飾トラスツズマブＬＣとを対形成させた。
[00377] 新規抗体の選択は、標準的なリボソームディスプレイプロトコルを使用して実施した。その全体が参照により援用される、Dreier and Plueckthun, Methods Mol. Biol., 2003, 687:283-306, Clifton, NJを参照されたい。Ｆａｂリボソームディスプレイの選択は、公開されたプロトコルに従って実施した。いずれもそれらの全体が参照により援用される、Stafford et al., 2014, Protein Eng. Des. Sel. 27:97-109；Hanes and Plueckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94:4937-4942を参照されたい。複数回の選択の後、標準的分子生物学技術を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ出力からのＤＮＡを無細胞発現用に最適化されたベクターにクローニングした。その全体が参照により援用される、Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225を参照されたい。全てのコンストラクトにＨＩＳタグ及びＦＬＡＧタグを付け、スクリーニング中の精製及び試験を合理化した。
[00378] 選択ワークフローによって生成された抗体変異型のライブラリを大腸菌（E. coli）に形質転換し、抗生物質（カナマイシン）と共に寒天プレート上で培養した。個々のコロニーを液体ブロス（ＴＢ＋カナマイシン）中で培養し、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるＤＮＡ増幅のテンプレートとして使用した。次に、Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225に記載されるように、無細胞タンパク質合成反応で変異型を発現させた。
[00379] 簡潔に述べると、無細胞抽出物を５０μＭのヨードアセトアミドで室温（２０℃）で３０分間処理し、無細胞構成要素（その全体が参照により援用される、Cai et al., Biotechnol Prg, 2015, 3:823-831を参照されたい）と、ＨＣ変異型のための１０％（ｖ／ｖ）ＲＣＡ ＤＮＡテンプレート（およそ１０μｇ／ｍＬのＤＮＡ）とを含有するプレミックスに、抗体アセンブリのために存在するが、ライブラリ中では変動しない２．５ｕｇ／ｍＬのトラスツズマブＬＣと共に添加した。９６ウェルプレート内において、６０マイクロリットルの無細胞反応を６５０ｒｐｍの振盪機上で３０℃で１２時間インキュベートした。異なる選択キャンペーンの予測される多様性に応じて、４００〜１５００個のコロニーをスクリーニングした。
[00380] 合成後、各反応液を３％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１：５０に希釈し、発現された変異型は、ＣＨＯ−ｈＦＯＬＲ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞中で組換え的に発現されたヒトＦＯＬＲ１）への細胞ベースのＥＬＩＳＡ結合によって機能活性について試験した。簡潔に述べると、アッセイの前日に、３８４ウェルプレートにＣＨＯ対照細胞又はＣＨＯ−ｈＦＯＬＲ１細胞を播種した。アッセイの当日、細胞を暗所で１５分間２０μＬのＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、次にＰＢＳ中の３０％ＦＢＳで室温で３０分間ブロックした。目的の抗体変異型（１：５０希釈無細胞反応液）を固定ＣＨＯ−ｈＦＯＬＲ１細胞に結合させ、二次抗体（例えば、ＨＲＰ結合抗ヒトＦｃ又は抗ＦＬＡＧ）によって検出し、次に、化学発光基質（Pierce ELISA SuperSignal（商標）基質）によって検出した。化学発光を分子装置SpectraMax（登録商標）M5プレートリーダー上で定量化した。トップヒットを細胞ベースのＥＬＩＳＡシグナル／ノイズ比に基づいて選択し、それらのヌクレオチドを配列決定した。結合活性とシーケンス分析とに基づいて、変異型のサブセットをさらなるスケールアップと特性評価のために選択した。
[00381] ＥＬＩＳＡベースのスクリーニングからのトップリードを培養して、製造業者の使用説明書に従ってQIAprep（登録商標）96 Turboミニプレップキット（Qiagen）を使用し、プラスミドミニプレップを実施した。１０μｇ／ｍＬのミニプレップされたＤＮＡを４ｍＬの無細胞反応液に添加し、６５０ｒｐｍで１２時間、３０℃で一晩インキュベートした。共通のトラスツズマブＬＣを有するＩｇＧ変異型の場合、７．５μｇ／ｍＬのＨＣ変異型ＤＮＡと２．５μｇ／ｍＬの共通のトラスツズマブＬＣとを反応に添加した。
[00382] 清澄化無細胞反応液から発現された変異型は、半自動化されたハイスループットバッチ精製法を使用した固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製によって精製した。簡潔に述べると、精製は、５０μＬ／ウェルのＩＭＡＣ樹脂（Ｎｉセファロース高性能、GE Healthcare）がＩＭＡＣ結合緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）中で平衡化され、１ｍＬの無細胞反応液と共に１５分間インキュベートされ、ＩＭＡＣ結合緩衝剤で２回の洗浄がそれに続く、９６ウェルプレート形式で実施した。次に、Ｈｉｓタグ付き抗体変異型を２００μＬのＩＭＡＣ溶出緩衝剤（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）を使用して溶出し、９６ウェルZebaプレート（7 kD MWCO、Thermo Fisher）を使用して緩衝液をＰＢＳに交換した。製造業者の使用説明書に従い、ハーセプチン標準曲線に対してLabChip GXII（Perkin Elmer）を使用するハイスループットキャピラリー電気泳動によって精製抗体を定量化した。
[00383] 例示的な親和性成熟抗体は、以下の表５に報告される。
実施例２
ＳＣＦＶＳの調製
[00384] リンカー配列がＶＨ及びＶＬドメイン間にある、ＶＨＶＬ又はＶＬＶＨのいずれかの方向で単鎖抗体を生成する。典型的には、ｓｃＦｖリンカーは、それぞれ１５、２０、２５又は３０残基のリンカーの（ＧＧＧＧＳ）ｎリピートから構成される（式中、ｎ＝３、４、５又は６である）。無細胞発現の場合にはＮ末端Ｍｅｔが付加されるが、哺乳類発現の場合にはリーダーペプチドが付加される。ｓｃＦｖのＣ末端には、Ｆｃ配列を付加して生体内半減期が延長されるか、又はｓｃＦｖが直接使用され得る。任意選択的リンカー配列は、ｓｃＦｖとＦｃとの間に組み込まれ得る。例示的ｓｃＦｖ−Ｆｃリンカー配列は、ＡＡＧＳＤＱＥＰＫＳＳ（配列番号３７８）である。Ｃ末端親和性タグを任意選択的に付加して、精製及びアッセイ開発を容易にし得る。例示的親和性タグは、Ｃ末端ＦｌａｇＨｉｓタグＧＳＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧＳＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号３７６）である。停止コドンは、典型的には、配列の末端に挿入される。例示的ｓｃＦｖは、Ｎ末端Ｍｅｔ残基、ＶＨドメイン、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７７）リンカー、ＶＬドメイン、ＡＡＧＳＤＱＥＰＫＳＳ（配列番号３７８）リンカー、Ｆｃドメイン、ＦｌａｇＨｉｓタグ及び停止コドンを含み得る。
実施例３
親和性及び動態結合分析
[00385] 抗Ｆｃポリクローナル抗体は、アミン共役化学反応（アミン共役キットから、GE Life Sciences）を使用して、CM5チップ（GE Life Sciences）に固定化させた。固定化ステップは、１×ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝剤（GE Life Sciences；使用前に希釈された１０倍ストック）で２５μＬ／分の流速において実行した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、０．０５Ｍ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ、０．２Ｍ）との混合物により、センサー表面を７分間にわたり活性化させた。抗Ｆｃポリクローナル抗体は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の２５μｇ／ｍＬの濃度で４つのフローセル全てに７分間かけて注入した。エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を７分間かけて注入し、あらゆる残留活性化基をブロックした。平均で１２，０００個の捕捉抗体の応答単位（ＲＵ）を各フローセル上に固定化した。
[00386] オフレート及び動態結合実験は、１×ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液を使用して２５℃で実施した。フローセル２、３及び４上の１０μＬ／分の流速で１２秒間にわたり、試験抗体及び対照抗体を５〜１０μｇ／ｍＬの濃度で抗Ｆｃ表面に注入し、同一流速での３０秒間にわたる緩衝液洗浄がそれに続いた。抗体サンプルの動態特性評価は、単一濃度の抗原（オフレートランキングの場合）又は抗原の１：２希釈系列（動態特性評価の場合）及び０ｎＭの抗原の１回の注入によって実行した。抗Ｆｃ表面上にリガンド（抗体）を捕捉した後、検体（ヒトＦＯＬＲ１−ＨＩＳ）を５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎＭで１８０秒間結合させ、その後、５０μＬ／分の流速での６００秒間の解離相がそれに続いた。各リガンド捕捉と検体結合サイクルとの間において、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０の３０μＬ／分で３０秒間の２回の注入と、それに続く３０秒間の緩衝液洗浄ステップを使用して再生を実施した。
[00387] データは、１：１ラングミュア結合モデルを使用して、ビアコアＴ２００評価ソフトウェアによって適合させた。ＫＤ（親和性、ｎＭ）は、結合相及び解離相の適合から算出された動態速度定数の比率として判定した。
実施例４
フローサイトメトリーベースの細胞結合アッセイ
[00388] 発現レベル＞２５０ｎＭの変異型を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）細胞結合アッセイで試験した。ＣＨＯ細胞を形質移入し、細胞表面上にヒト（ＣＨＯ−ｈＦＯＬＲ１）、カニクイザル（ＣＨＯ−ｃＦＯＬＲ１）又はマウス（ＣＨＯ−ｍＦＯＬＲ１）標的分子ＦＯＬＲ１を安定して発現させた。親ＣＨＯ細胞は、バックグラウンド結合レベルを判定するための陰性対照として使用した。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Corning, Cellgro-Mediatech）と、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Corning, Cellgro-Mediatech）と、２ｍｍｏｌ／Ｌのglutamax（Life Technology）とを添加したHamのF-12：高グルコースＤＭＥＭ（５０：５０）（Corning, Cellgro-Mediatech）中において、親ＣＨＯ及び安定に形質移入されたＣＨＯ−ｈＦＯＬＲ１、ＣＨＯ−ｃＦＯＬＲ１及びＣＨＯ−ｍＦＯＬＲ１細胞を培養した。
[00389] 蛍光標識された親ＣＨＯ細胞と、未標識のＣＨＯ−ｈＦＯＬＲ１細胞との混合物を以下のように調製した。親ＣＨＯ細胞をＰＢＳ中で２回洗浄して、１ｎＭのCellTrace（商標）Oregon Green488（登録商標）（Life Technologies）を含有するＰＢＳ中で３７℃で３０分間インキュベートした。次に、標識された親ＣＨＯ細胞をHamのF-12培地で２回、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳ）で２回洗浄した。未標識のＣＨＯ−ｈＦＯＬＲ１細胞を同様に洗浄して調製した。標識された親ＣＨＯ細胞と非標識のＣＨＯ−ｈＦＯＬＲ１細胞とを１：１の比率で組み合わせ、９６ウェルポリプロピレンプレートに１ウェル当たり５０μＬ（１ウェル当たり２００，０００個の細胞）で播種した。細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で連続希釈した５０μＬの試験抗体（すなわち抗ＦＯＬＲ１変異型）と混合し、氷上で６０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２．５μｇ／ｍＬのＲ−フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液と共に氷上で６０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、暗所の氷上でＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド（Santa Cruz Biotechnology; Dallas, TX）中で１０分間固定し、BD LSR IIフローサイトメーター（BD Biosciences; San Jose, CA）を使用して分析した。データは FlowJo（登録商標）ソフトウェア（FlowJo, LLC; Ashland, OR）を使用して分析し、平均蛍光強度を判定した。結合定数は、非線形回帰方程式、Ｈｉｌｌ傾斜がある１部位特異的結合を使用する統計ソフトウェアGraphPad Prism（GraphPad Software; La Jolla, CA）を使用して計算した。ＣＨＯ親細胞への非特異的抗体の結合を測定することに加えて、二次抗体のみを対照として使用した。
[00390] この手順を繰り返し、ＣＨＯ−ｃＦＯＬＲ１及びＣＨＯ−ｍＦＯＬＲ１細胞における細胞結合を評価した。
実施例５
細胞殺滅分析
[00391] 抗体の内部移行は、標的陽性細胞に対する二次抗体細胞殺滅アッセイによって評価した。ＦＯＬＲ１陽性ＫＢ細胞は、ＡＴＣＣから入手し、ＦＯＬＲ１陽性Ｉｇｒｏｖ１細胞は、ＮＩＨから入手した。細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清ウシ胎仔血清（Corning, Cellgro-Mediatech, Manassas, Virginia）と、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Corning, Cellgro-Mediatech, Manassas, Virginia）と、２ｍｍｏｌ／Ｌのglutamax（Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts）とを添加した、HamのF-12：高グルコースＤＭＥＭ（５０：５０）（Corning, Cellgro-Mediatech）中で維持した。付着細胞は、カルシウム及びマグネシウム非含有ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、HYQ（登録商標）TASE（商標）（Hyclone; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts）を用いて採取し、Vi-CELL細胞生存率分析装置（Beckman Coulter, Indianapolis, Indiana）によって計数した。３８４ウェル平底白色ポリスチレンプレートの各ウェル内に合計６２５個の細胞を播種した。リード抗体を細胞培養培地中で４倍の出発濃度で調合し、MultiScreenHTS ９６ウェルフィルタープレート（Millipore; Billerica, Massachusetts）を通して濾過した。試験抗体の連続希釈液（２００ｎＭから開始する１：３連続希釈液）を処理ウェルに添加し、切断可能なリンカーを介してヘミアスタリンに共役された抗ヒトＦｃナノボディを各ウェルに２０ｎＭの規定の最終濃度で添加した。アッセイプレートは、ＣＯ２インキュベーター内でアッセイ前に３７℃で１２０時間培養した。細胞生存率測定のために、３０μＬのCell Titer-Glo（登録商標）試薬（Promega Corp. Madison, WI）を各ウェルに添加し、製品の使用説明書に従ってプレートを処理した。ENVISION（登録商標）プレートリーダー（Perkin-Elmer; Waltham, MA）上で相対ルミネセンスを測定した。対照として未処理の細胞を使用し、相対ルミネセンスの読み取り値を生存率に変換した。データは、ｌｏｇ（インヒビター）に対する応答変数傾斜を使用する非線形回帰分析を使用して適合させ、GraphPad Prism（GraphPad v 5.0, Software; San Diego, California）で４パラメーター適合させた。データは、抗体の用量に対する相対細胞生存率（ＡＴＰ含有量）％として表した。
実施例６
ハイブリドーマの作製
[00392] ヒトＦＯＬＲ１を過剰発現するマウスＭＣ３８細胞を用いて、免疫適格性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を免疫化した。ＦＯＬＲ１特異的な抗体が血清中に検出され、脾臓を採取してＰ３Ｘ細胞と融合させ、以前記載されたものと同様のハイブリドーマ（Aragen Biosciences, Morgan Hill, CA）を作製した。それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、Chronopoulou, et al., 2014, Methods Mol Biol 1131:47-70及びKim, et al., 2014, Methods Mol Biol 1131:31-45を参照されたい。QIAGEN RNeasyミニキット（カタログ番号７４１０４）を使用してハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、Clontech SMARTer RACE ｃＤＮＡ増幅キット（カタログ番号６３４９２３）（Lake Pharma, Belmont, CA）を使用してｃＤＮＡに変換した。陽性のクローンをゲル電気泳動によって同定し、Invitrogen TOPOキットを使用してクローン化し、標準サンガー法を使用して配列決定した。ｍ６Ｄ１のＣＤＲを標準的な方法により、ヒト抗体フレームワークＶＨ１−１８、ＶＨ３−３３、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ４−３０−４、Ｖｋ１−５、Ｖｋ３−１１、Ｖｋ２−３０、Ｖｋ１−３３及びＶｋ１−１６上にグラフトし、ヒト化抗体を得た。その全体が参照により本明細書に援用される、Kuramochi, et al., 2014, Methods Mol Biol 1060:123-137を参照されたい。これらのグラフトのうち、ｈ６Ｄ１−ＨＣ３／ＬＣ４（ＶＨ３−３３／Ｖｋ３−１１グラフト）及びｈ６Ｄ１−ＨＣ３／ＬＣ５（ＶＨ３−３３／Ｖｋ１−５グラフト）ＩｇＧは、無細胞で発現させたときに最良の収量を与えて最高の親和性を維持した。その全体が参照により本明細書に援用される、Stafford, et al., 2014, Protein Eng Des Sel 4:97-109に記載されるように、ＨＣ３／ＬＣ４及びＨＣ３／ＬＣ５ヒト化変異型の両方は、ソフトランダム化によって重鎖ＣＤＲを標的化するＦａｂベースのリボソームディスプレイ（上記のとおり）によって親和性成熟に進み、軽鎖は、一定のままであった。
[00393] ヒト化マウス抗体の親和性成熟によって特定の抗体を作製した。例示的な抗体候補は、以下の表６に報告される。
実施例７
例示的な抗ＦＯＬＲ１抗体の特性
[00394] 表７〜９は、本明細書に記載される例示的な抗体を使用して得られた結果を示す。
[00395] 表７は、トラスツズマブ重鎖（ＨＣ）フレームワーク上に構築された、ナイーブＦａｂ ＴＲｉＭリボソームディスプレイライブラリから得られた、最初の抗体リードの親和性成熟から単離された抗体によって得られた結果を示す。
[00396] 表８は、表７に列挙されるのと同じ抗体について得られた動態結合結果を示す。
[00397] 表９は、ヒト化マウスクローン候補から単離された抗体から得られた結果を示す。
実施例８
卵巣、子宮内膜がん、ＮＳＣＬＣ及びＴＮＢＣ細胞株における、ＦＯＬＲ１発現
[00398] 高レベルのＦｏｌＲαが卵巣及び子宮内膜がん、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）で発見されている。候補ＡＤＣ分子の生体外試験のために、報告されたＦｏｌＲα ｍＲＮＡ発現レベルに基づいて、卵巣がん、子宮内膜がん、ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ細胞株のパネルを選択した。細胞表面上で発現されるＦｏｌＲα受容体の数を測定するために、Ａｌｅｘａ６４７結合抗体１８４８−Ｈ０１（Ｙ１８０／Ｆ４０４）をＦＡＣＳ細胞結合アッセイで使用し、定量ビーズ（Bangs LaboratoriesからのSimply Cellular抗ヒトＩｇＧビーズ）によって測定された結合抗体の抗体結合能（ＡＢＣ）に基づいて、ＦｏｌＲαコピー数を判定した。表１０に示されるように、卵巣がん、子宮内膜がん、ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ細胞のＦｏｌＲαコピー数は、１細胞当たり３５，０００〜４，０００，０００個の受容体の範囲であった。
実施例９
卵巣及び子宮内膜がん、ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ組織におけるＦＯＬＲ１発現
[00399] 卵巣及び子宮内膜がん、ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣを代表する患者サンプルにおけるＦｏｌＲα発現の有病率を判定するために、４つの適応症の患者サンプルを含有する市販の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上で免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を実施した。製造業者の推奨プロトコルによって市販のＦｏｌＲα ＩＨＣアッセイキット（Biocare；カタログ番号ＩＰＩ４００６Ｋ Ｇ１０）を使用して、ＴＭＡ（Biomax；Biomax；カタログ番号ＢＣ１１１１５ｂ、ＥＭＣ１０２１、ＢＲ１００１及びＢＣ０４１１１５ｃ）をＦｏｌＲα発現について染色した。スライドを画像化し、染色された腫瘍コアを染色について点数化した。ＦｏｌＲαの陽性染色は、卵巣がんの約８０％、子宮内膜がんのサンプルの約６０％、ＴＮＢＣサンプルの約３０％及びＮＳＣＬＣサンプルの約５０％で観察され；これらが、ＦｏｌＲαを標的化する治療薬の適切な適応症であり得ることが示唆された。卵巣及び子宮内膜サンプルにおけるＦｏｌＲαの相対的発現レベルは、表１１に要約される。
実施例１０
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）評価
[00400] ＦＯＬＲ１（又は「ＦｏｌＲα−ＥＣＤ」）の細胞外ドメインへのビアコア親和性に基づいて、ＨＣ Ｆ４０４部位に組み込まれたパラアジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）によってスケールアップされる９つの抗体を選択した。試験のために選択された９つの抗体は、１８４８−Ａ０１、１８４８−Ｈ０１、１８４８−Ａ０８、１８４８−Ｂ０４、１８４８−Ｄ０２、１８４８−Ａ０７、１８４８−Ｂ１０、１８４８−Ｇ１０及び１８４８−Ｇ０４）である。抗体１８４８−Ｄ０２は、十分に発現せず、その結果、さらなる研究で使用しなかった。残りの８つの抗体は、切断不能メイタンシンに共役して、以下のコンジュゲートＭ：
の構造を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成した。候補抗体薬物コンジュゲートは、ＫＢ、Ｉｇｒｏｖ１、ＨｅＬａ及びＪＥＧ３をはじめとする、ＦｏｌＲα発現細胞の細胞殺滅で試験した。表１２は、ＫＢ及びＪＥＧ３細胞に対する、候補コンジュゲートの生体外細胞毒性活性の概要を提供する。
ＫＢ細胞とＪＥＧ３細胞の細胞殺滅活性において、ＡＤＣ間に有意差はなかった、表１２）。したがって、切断不能メイタンシンにコンジュゲートされ、２の薬物抗体比（ＤＡＲ２）でコンジュゲートＭの構造を形成する４つのリード（１８４８−Ａ０１、１８４８−Ａ０７、１８４８−Ｂ０４、１８４８−Ｇ１０）を、ビアコア親和性（表８）に基づいて配列の多様性を最大化する生体内試験のために選択した。さらに、ＤＡＲ２を有するＡＤＣには、ＪＥＧ３細胞に対する弱い細胞毒性活性があった。
[00401] 抗ＦｏｌＲαリードの細胞殺滅活性に対する、薬物抗体比（ＤＡＲ）の影響を研究するために、ＤＡＲ２を有するＡＤＣを切断不能メイタンシンに結合する二次ＤＡＲ２抗ヒトＩｇＧナノボディにも組み合わせ、細胞殺滅アッセイにおけるＤＡＲ ４ ＡＤＣを近似した。このアッセイでは、１８４８−Ｂ１０ ＡＤＣは、ＪＥＧ３及びＩｇｒｏｖ１細胞上の二次ナノボディと組み合わせると、最良の細胞殺滅活性を示した（データ未掲載）。この結果に基づいて、ＤＡＲ２の１８４８−Ｂ１０ ＡＤＣを生体内試験に加えて、他の４つのリード（１８４８−Ａ０１、１８４８−Ａ０７、１８４８−Ｂ０４、１８４８−Ｇ１０）に加えてＡＤＣ候補を評価した。生体内効力試験の結果から、ＤＡＲ２の１８４８−Ｂ１０ ＡＤＣのみがＫＢモデルで弱い腫瘍抑制を示したことが明らかになった（データ未掲載）。
[00402] その結果、さらなるＡＤＣ研究のための主要な抗体の１つとして１８４８−Ｂ１０を選択した。
実施例１１
トップＦＯＬＲ１抗体リードの有効性スクリーニング
[00403] ＤＡＲ２にコンジュゲートＭを含有するＡＤＣは、高レベルのＦｏｌＲαを発現するＫＢ細胞に対して強力な生体外活性を有した。しかし、ＡＤＣは、より中等度のレベルのＦｏｌＲαを発現してＫＢモデルにおける生体内活性が低い、ＪＥＧ３及びＩｇｒｏｖ１細胞において、生体外活性が芳しくなかった。ＪＥＧ３及びＩｇｒｏｖ１細胞におけるＦｏｌＲα発現のパターン及びレベルは、患者の腫瘍における発現をよりよく代表する一方、ＫＢ細胞におけるＡＤＣリードの評価は、異なるリードの特性を識別するように見えない。ＦｏｌＲαは、リソソームに到達することなく、迅速な内部移行及び再利用を被り；したがって、ＦｏｌＲαを標的化するＡＤＣの活性を改善するために、エンドソーム区画で薬物を放出し得るリンカーを有することが有用であろう。さらに、原発性卵巣腫瘍及びＩｇｒｏｖ１異種移植片におけるＦｏｌＲα発現は不均一であり（Ab et al. 2015. Molecular Cancer Therapeutics 14(7):1605-1613）、バイスタンダー活動を伴うＡＤＣは、これらの腫瘍においてより高い活動を潜在的に有することが示唆される。標的の生物学並びに卵巣がんの発現レベル及びパターンに合わせて、ＦｏｌＲα標的化ＡＤＣの設計を調節するために、いくつかの変更調節をスクリーニング戦略に実装した。ＫＢモデルを一次スクリーニングのために使用し、リードの活動を生体外及び生体内のＩｇｒｏｖ１細胞上で試験して、異なるリードを評価し比較した。
[00404] ＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型の初期スクリーニングは、高レベルのＦｏｌＲαを発現するＫＢ腫瘍で実施した。この試験では、同じリンカー弾頭（以下のコンジュゲートＰ）及び結合部位（Ｙ１８０／Ｆ４０４）に共役された４つの異なる抗ＦｏｌＲα抗体の抗腫瘍効果の評価を試みた。ＫＢ子宮頸がん細胞を胸腺欠損ヌードマウスに皮下移植し、表１３に列挙される２．５ｍｇ／ｋｇのＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型の単回用量で処置した。腫瘍が約１５０ｍｍ３に達したときにＡＤＣ変異型を投与した。
[00405] 動物の体重の＞２０％減少として定義される有意な体重減少の不在によって証明されるように、いかなる試験物による毒性も観察されなかった（図６）。図７（Ａ、Ｂ）は、ビヒクル対照群が試験エンドポイント（＞１０００ｍｍ３）に達した２５日目における、ＫＢ腫瘍増殖及び腫瘍サイズに対する処置の効果を描写する。結果は、ＡＤＣ分子１（１８４８−Ｂ１０ ＦｏｌＲα抗体、Ｙ１８０／Ｆ４０４、コンジュゲートＰ）及びＡＤＣ分子４（１８４８−Ｈ０１ ＦｏｌＲα抗体、Ｙ１８０／Ｆ４０４、コンジュゲートＰ）が、対照と比較してＫＢ腫瘍増殖を有意に抑制したが、他の２つのＡＤＣ変異型は、いかなる抗腫瘍活性も示さなかったことを示す。３１日目の試験の終わりまでに、ＡＤＣ分子１及び４間に有意差はなかった（図８）。したがって、さらなる特性評価及び試験のために、１８４８−Ｂ１０及び１８４８−Ｈ０１抗ＦｏｌＲα抗体を含有するＡＤＣを研究した。
実施例１２
抗体薬物コンジュゲートの薬物抗体比
[00406] ＤＡＲ（２〜６つ）が増加しており、切断可能なリンカーが存在するＡＤＣを評価し、これらの特徴を変化させることで分子の活性が改善するかどうかを判定した。ＦｏｌＲα標的化ＡＤＣの生体内効力を高めるために、各抗体上に組み込まれた２つ、４つ又は６つのパラアジドメチルフェニルアラニン（ｐＡＭＦ）残基を有する１８４８−Ｂ１０抗体を発現させ、切断不能メイタンシン（コンジュゲートＭ、実施例１０）及び切断可能ヘミアステリン（コンジュゲートＰ、実施例１１）に共役させて、２つ、４つ又は６つのＤＡＲを有するＡＤＣを作製した。
[00407] ＦｏｌＲα陽性細胞（ＫＢ、Ｉｇｒｏｖ１及びＪＥＧ３）の生体外細胞殺滅は、中程度のレベルのＦｏｌＲα発現を有するＩｇｒｏｖ１細胞に対して、コンジュゲートＰの抗体１８４８−Ｂ１０コンジュゲートがコンジュゲートＭの１８４８−Ｂ１０コンジュゲートよりも強力であることを示した（表１４）。さらに、ＤＡＲを４つに増やすことで、ＤＡＲ２バージョンと比較して効力が大幅に改善されたＡＤＣがもたらされた一方、ＤＡＲ６ ＡＤＣは、ＤＡＲ４よりもわずかにのみ細胞殺滅活性をさらに改善した。これらのデータに基づいて、ＤＡＲ４での切断可能ヘミアスタリンコンジュゲート（コンジュゲートＰ）がＦｏｌＲα ＡＤＣの最適なコンジュゲート形式であると判定した。
実施例１３
ＡＤＣの異なる部位の対の活性を比較するための試験
[00408] この研究では、同じＦｏｌＲα抗体（１８４８−Ｂ１０）及びリンカー弾頭（コンジュゲートＰ）を使用して、３つの異なる結合部位対（Ｙ１８０／Ｆ４０４、Ｙ１８０／Ｋ４２及びＦ４０４／Ｋ４２）の抗腫瘍効果の比較を試みた。３つのＡＤＣの生体外細胞殺滅活性は、ＫＢ細胞及びＩｇｒｏｖ１細胞に対して、非常によく似ていた（表１５）。
[00409] 生体内効力試験では、ＫＢ子宮頸がん細胞を胸腺欠損ヌードマウスに皮下移植し、表１５に列挙される、２．５ｍｇ／ｋｇのＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型の単回用量で処置した。腫瘍が約１５０ｍｍ３に達したときにＡＤＣを投与した。動物の体重の＞２０％減少として定義される有意な体重減少の不在によって証明されるように、いかなる試験物による毒性も観察されなかった（図９）。図１０（Ａ、Ｂ）は、ビヒクル処置腫瘍が試験エンドポイントに達し（＞１０００ｍｍ３）、その後、試験が停止された２１日目における、ＫＢ腫瘍増殖及び腫瘍サイズに対する処置の効果を描写する。結果は、異なる結合部位を有する３つ全てのＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型（ＡＤＣ分子１、１２及び９）は、ビヒクル対照と比較して、最初に腫瘍退縮を誘発し有意に腫瘍増殖を遅延させた一方、対照抗ＧＦＰ ＡＤＣ（ＡＤＣ分子１１）は、ビヒクルと同様に挙動したことを示す（図１０Ａ及び１０Ｂ）。３６日目の研究の終わりまでに、ＡＤＣ分子１２は最良の奏効持続期間を示し、この群のほとんどの腫瘍では、増殖が抑制されたままであった一方、ＡＤＣ分子１及び９では、腫瘍の再増殖が観察された（図１０Ａ）。統計分析は、ＡＤＣ分子１２が、ＡＤＣ分子９（ｐ＝０．０２９７）及びＡＤＣ分子１（ｐ＝０．０４７０）と比較して、有意により有効であることを示した（図１１）。結論として、Ｙ１８０／Ｋ４２結合部位は、ＫＢ腫瘍で最良の効力及び奏効持続期間をもたらした。
実施例１４
ＡＤＣ設計のためのリード抗ＦＯＬＲ１抗体の選択に関する試験
[00410] 抗ＦｏｌＲα ＡＤＣの潜在的なリード抗体を評価するために、共役されてＤＡＲ４とコンジュゲートＰを形成する、選択されたＦｏｌＲαトップリードを生体外でスクリーニングした。トップ抗体リードの生体外細胞殺滅活性は、ＫＢ細胞とＩｇｒｏｖ１細胞とで非常によく似ており、結果は、表１６に要約される。
[00411] ４つのトップリード抗体について、ＤＡＲ４を有する同じコンジュゲートＰをＫＢモデルの生体内有効性試験でスクリーニングした（図７、８）。これらの研究の結果に基づいて、さらなる特性評価のために、１８４８−Ｂ１０及び１８４８−Ｈ０１をトップ抗体リードとして選択した。１８４８−Ｂ１０及び１８４８−Ｈ０１の配列並びに対応するＣＤＲは、表３２に示される。トップ抗体リードの追加的な特性は、表１７に要約される。
実施例１５
切断可能ヘミアスタリンのための最適リンカーの選択
[00412] 異なる切断特性を有する複数のリンカーを有するヘミアステリンを作製した。抗体１８４８−Ｂ１０をいくつかの候補リンカー変異型に共役させ、得られたＡＤＣを生体外細胞毒性アッセイで試験した（表１８）。候補リンカー変異型のうち、ＶａｌＣｉｔの代わりにＶａｌＡｌａのタンパク質分解配列を持つコンジュゲートＰの代替物は、優れた細胞殺滅活性を示し（以下のコンジュゲートＱ）、拡張性及び合成効率において潜在的な利点をもたらした。
複数のロットの候補ＡＤＣ変異型の生体外細胞毒性活性は、表１９に要約される。ＡＤＣ分子４は、０．０３〜０．６６ｎＭの範囲のＥＣ５０で一貫した細胞殺滅を示し、スパンは異なる実験にわたり６９〜９６％であった。
[00413] さらに、別の試験では、抗体１８４８−Ｂ１０ Ｙ１８０／Ｆ４０４及びコンジュゲートＲ：
を使用して、抗体薬物コンジュゲートを合成した。コンジュゲートＲは、ヘミアスタリン弾頭に連結されたＤＢＣＯアジポイルＶａｌＧｌｕを含む。コンジュゲートＲを有する１８４８−Ｈ０１ ＨＣ−Ｙ１８０／Ｆ４０４を含むＡＤＣ（ＡＤＣ分子２２）は、ＡＤＣ分子４（データ未掲載）と同等の生体外細胞殺滅活性と、Ｉｇｒｏｖ１モデルと同等の生体内活性とを示した（図１４Ａ、１４Ｂ）。したがって、これらの結果は、抗体１８４８−Ｂ１０ ＨＣ−Ｙ１８０／Ｆ４０４が、ＦｏｌＲαを標的化するＡＤＣの代替リンカー弾頭と共に使用され得ることを示す。
実施例１６
最適なＡＤＣリードの選択
[00414] この試験では、抗体、結合部位、リンカー弾頭を含む、ＦｏｌＲα ＡＤＣ分子の異なる態様の評価を試みた。Ｉｇｒｏｖ１卵巣がん細胞をＳＣＩＤベージュマウスに皮下移植し、表２０に列挙される２．５ｍｇ／ｋｇのＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型の単回投与で処置した。腫瘍が約１５０ｍｍ３に達したときにＡＤＣを投与した。
[00415] 動物の体重の＞２０％減少として定義される有意な体重減少の不在によって証明されるように、いかなる試験物による毒性も観察されなかった（図１２）。図１３（Ａ、Ｂ）は、ビヒクル対照で処置された腫瘍が試験エンドポイント（約１０００ｍｍ３）に達した処置後２４日目における、Ｉｇｒｏｖ１腫瘍増殖及び最終腫瘍サイズに対する処置の効果を図示する。試験された７つのＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型のうち、ＡＤＣ分子４は、ビヒクル対照と比較して腫瘍増殖を有意に阻害した（図１３Ａ、１３Ｂ）。この結果は、Ｉｇｒｏｖ−１腫瘍における抗ＦｏｌＲα抗体、結合部位及びリンカー弾頭の最適な組み合わせとして、それぞれ１８４８−Ｈ０１、Ｙ１８０／Ｆ４０４及びＳＣ２３９を同定する。
実施例１７
ＦＯＬＲイソ型に対するＡＤＣ変異型の交差反応性
[00416] 葉酸受容体は、ヒトにおいて、ｈＦｏｌＲα、ｈＦｏｌＲβ及びｈＦｏｌＲγ（またそれぞれＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２及びＦＯＬＲ３）と称される、３つのイソ型を有する。ｈＦｏｌＲα及びｈＦｏｌＲβがＧＰＩアンカーを介して原形質膜で発現される一方、ＦｏｌＲγは分泌される。正常組織では、ＦｏｌＲαは、一般に、分極した上皮細胞の頂端表面で発現されるが、ｈＦｏｌＲβは、正常な骨髄発生の後期に且つ胎盤、脾臓及び胸腺で発現される。骨髄単球系統の正常な発達では、ｈＦｏｌＲβは、単球では比較的低レベルでＣＤ１４と共発現されるが、ＣＤ３４＋正常造血前駆細胞では発現しない、識別マーカーと見なされる。ｈＦｏｌＲγは、脾臓、胸腺及び骨髄のリンパ系細胞から、低レベルで分泌される。３つのＦＲイソ型は、ＦｏｌＲαとの高度な相同性を有し、ＦｏｌＲβ及びＦｏｌＲγと、それぞれ７２％及び７１％の配列同一性を共有する。したがって、ＦｏｌＲαに対するリード抗体１８４８−Ｂ１０及び１８４８−Ｈ０１の特異性並びにＦｏｌＲβ及びＦｏｌＲγを発現する細胞との交差反応性の程度を決定することは有用である。
[00417] ３つの葉酸受容体イソ型（ｈＦｏｌＲα、ｈＦｏｌＲβ及びｈＦｏｌＲγ）を安定して発現する２９３Ｔ細胞を作製し、ＦＡＣＳアッセイで抗体１８４８−Ｂ１０及び１８４８−Ｈ０１への結合を試験した。このアッセイでは、１８４８−Ｂ１０ではなく１８４８−Ｈ０１がＦｏｌＲβ（図１５）への非常に弱い結合を示したが、ＦｏｌＲγへの結合を示さなかった（未掲載）。ＦｏｌＲβ発現細胞への１８４８−Ｈ０１結合は、１５６ｎＭの親和性を有し、Ｂｍａｘは、ＦｏｌＲαのＢｍａｘと比較してわずか２０％であった。ＦｏｌＲα及びＦｏｌＲβイソ型を発現する２９３Ｔ細胞に対する、対応するＡＤＣ分子４及び１の細胞毒性活性の評価は、ＡＤＣ分子４が、ＦｏｌＲα発現細胞に対する＜１０ｎＭのＥＣ５０と比較して、約１００ｎＭのＥＣ５０で、１０ｎＭを超える濃度でＦｏｌＲβを発現する細胞に対し、弱いが特異的な細胞毒性効果を有したことを示した（図１６）。
実施例１８
造血細胞におけるＡＤＣ変異型の結合及び細胞毒性活性
[00418] ＡＤＣ分子１及び４が造血細胞の生存度に対する効果を有するかどうかを判定するために、単離されたＰＢＭＣ（ｎ＝４ドナー）のＴ細胞、Ｂ細胞及び単球においてＦｏｌＲ発現を判定し、免疫細胞上のＦｏｌＲβへの抗体１８４８−Ｈ０１及び１８４８−Ｂ１０の結合の程度を評価した。単球において不均一な（ドナー変数）ＦｏｌＲα発現が検出されたが、この発現は、一過性であり、培養１日後に消失した（データ未掲載）一方、ＦｏｌＲβは、単球の亜集団において一貫して発現された（データ未掲載）。抗体１８４８−Ｂ１０又は１８４８−Ｈ０１のいずれも単球への結合は観察されなかったが、これらの細胞上でＦｏｌＲβの発現が検出可能であった（データ未掲載）。さらに、ＡＤＣ分子１及び４による処置後の生存度についてＣＤ１４単球をアッセイし、潜在的な細胞毒性に対処した。負の細胞結合と相関して、ＡＤＣ変異型は単球／マクロファージの生存度に影響を及ぼさず、ヒトのＰＢ単球に対する臨床的影響がないことが示唆された（データ未掲載）。
[00419] ＦｏｌＲβは、Ｍ１マクロファージ上では弱く発現され、Ｍ２マクロファージ及びそれらのサブセット上では高度に発現される。したがって、単離されたマクロファージに結合する能力について、抗体１８４８−Ｈ０１及び１８４８−Ｂ１０を評価した。しかし、これらの細胞ではＦｏｌＲβの発現が確認されたものの、いずれの抗体もＭ１又はＭ２マクロファージへの結合を示さなかった。この相互作用の欠如を確認するために、分極マクロファージ（１０，０００個の細胞、インキュベーション期間＝３日）に対する細胞殺滅活性について、対応するＡＤＣ分子（１、４）を評価した。結合の欠如と一致して、いずれのＡＤＣ変異型も複数のドナーからのマクロファージに対して、細胞毒性活性を示さなかった（データ未掲載）。
[00420] したがって、ＡＤＣ変異型は、ヒトドナーから単離された単球及びマクロファージに対する結合及び細胞毒性の影響が最小限であることが実証された。
実施例１９
抗体薬物コンジュゲートの追加的な特性決定
[00421] 抗ＦｏｌＲα抗体を含むリード抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を評価し、特性決定した。測定され分析された特性には、リードＡＤＣの発現及び精製プロファイル、共役効率及び臨床的に関連するモデルにおけるＡＤＣの生体外及び生体内活性が含まれた。抗ＦｏｌＲαリードＡＤＣの特性は、表２１に要約される。
実施例２０
用量範囲の有効性試験
[00422] ＡＤＣ分子４及び２０の用量反応関係をＩｇｒｏｖ−１腫瘍において評価した。この試験では、（１）ヘミアスタリンベースのリンカー弾頭に共役されたＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型（コンジュゲートＰ、Ｑ）のいずれが優れていたかの評価；（２）これらのＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型の抗腫瘍活性と比較物質分子（ＡＤＣ分子２１）との比較、及び（３）同定されたより有効なＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型の最小及び最大有効用量の判定を試みた。全ての試験物は、表２２に記載される。
[00423] ２．５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲の４つの用量のＡＤＣ分子４又は２０を用いて、確立されたＩｇｒｏｖ１卵巣腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスを１回処置した。比較のために、ベンチマーク群を５ｍｇ／ｋｇの比較物質ＡＤＣ分子（ＡＤＣ分子２１）で１回処置した。（動物の体重の＞２０％減少として定義される）有意な体重減少の不在によって証明されるように、試験物による毒性も観察されなかった（図１７）。図１８（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、ビヒクル対照で処置された腫瘍が試験エンドポイント（＞１０００ｍｍ３）に達した処置後２１日目までの、Ｉｇｒｏｖ１腫瘍増殖及び個々の腫瘍サイズに対する処置の効果を図示する。２１日目の腫瘍サイズの比較（ビヒクル対照との比較）は、ＡＤＣ分子４の５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ用量が、より低いｐ値に基づいて、ＡＤＣ分子２０又は比較物質ＡＤＣ分子２１の同等用量よりも有効であることを示唆する（図１８Ｃ）。最高用量（１５ｍｇ／ｋｇ）では、ＡＤＣ分子４及び２０の両方は、強力な抗腫瘍活性を示し、ビヒクル対照と比較して同様のｐ値を示した（図１８Ｃ）。用量によってソートされた腫瘍増殖曲線を並べて比較すると、低用量でのＡＤＣ分子４の優れた活性に基づいて、ＡＤＣ分子４は、ＡＤＣ分子２０よりも強力であることが明らかになった（図１９、Ａ〜Ｄ）。１０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子２０と対比して、５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４での処置後２６日目まで、腫瘍静止が観察された（図１９Ｂ、１９Ｃ）。腫瘍の退縮は、１０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４対１５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子２０で開始して誘導された（図１９Ｃ、１９Ｄ）。さらに、５、１０及び１５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子２０並びに５ｍｇ／ｋｇの比較物質ＡＤＣ分子２１と比較して、ＡＤＣ分子４は、３００ｍｍ３に達するまでの腫瘍増殖を大幅に遅延させた（図２０）。
[00424] 累積的に、これらの結果は、ＡＤＣ分子４がＩｇｒｏｖ１腫瘍においてＡＤＣ分子２０及びＡＤＣ分子２１よりもはるかにより有効であることを実証する。ＡＤＣ分子４の最小有効用量が５ｍｇ／ｋｇで観察された一方、１５ｍｇ／ｋｇは、奏効持続期間が最も長い最大有効用量であった。
実施例２１
カルボプラチンとの併用処置におけるＡＤＣ変異型の有効性
[00425] 卵巣がんの標準的な化学療法剤であるカルボプラチンと組み合わされたＡＤＣ分子４の有効性をＩｇｒｏｖ１腫瘍で評価した。確立されたＩｇｒｏｖ１腫瘍（平均腫瘍サイズ１５０ｍｍ３）を有する動物は、６０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンあり又はなしで、２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４の単回用量において７日毎に２回処置した（ｑ７ｄ×２）。図２１Ａは、ビヒクル対照で処置された腫瘍の平均が、試験エンドポイント（約１２００ｍｍ３）に達した処置後２９日目までのＩｇｒｏｖ１腫瘍増殖に対する治療の効果を図示する。２９日目の最終腫瘍サイズ及び腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の分析は、５０％〜７０％の範囲のＴＧＩを有するビヒクル対照と比較して、単剤ＡＤＣ分子４及びカルボプラチンが、それぞれ中程度の活性を提示したことを示した（図２１Ｂ及び２１Ｃ）。ＡＤＣ分子４とカルボプラチンとの組み合わせは、カルボプラチン単独と比較して有効性を有意に改善したが、この組み合わせは、単剤ＡＤＣ分子４と比較して有意差がなかった（図２１Ａ）。併用処置動物の最終的な平均腫瘍サイズは、単剤カルボプラチン処置動物と比較して有意に小さかった（４１４ｍｍ３対８４２ｍｍ３、ｐ＝０．００１１）（図２１Ｂ）。さらに、併用処置群のＴＧＩは、単剤カルボプラチン群の４７％に対して７９％でより高かった（ｐ＝０．０００８）（図２１Ｃ）。
[00426] 結論として、ＡＤＣ分子４をカルボプラチンと組み合わせると、単剤カルボプラチンと比較して、有意な付加利益が観察された。この観察は、ＡＤＣ分子４及びカルボプラチンの同様の用量を投与した同一モデルを使用した２つの追加的な独立した研究で一貫して再現された（データ未掲載）。
実施例２２
卵巣腫瘍モデルにおけるＡＤＣ変異型の有効性
[00427] ＡＤＣ分子４の有効性をヒト卵巣細胞株ＯＶＣＡＲ３腫瘍モデルで評価した。１００〜２００ｍｍ３の範囲の確立されたＯＶＣＡＲ３腫瘍を有する動物は、２．５又は５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４の単回投与で処置した。図２２（Ａ、Ｂ）は、ビヒクル対照で処置された腫瘍の平均が＞１５００ｍｍ３に達した処置後３１日目における、ＯＶＣＡＲ３腫瘍増殖及び最終腫瘍サイズに対する処置の効果を図示する。２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４による処置が処置後約１２日目まで腫瘍静止をもたらした一方、５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４は、腫瘍退縮を誘導して処置後約２０日目に再増殖が観察された（図２２Ａ）。３１日目の最終腫瘍サイズの分析は、２．５及び５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４による処置が、ビヒクル対照と比較していずれも有意に有効であり、それぞれ６０％及び８９％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を提示することを示した（図２２Ｂ）。
実施例２３
子宮内膜患者由来の異種移植モデルにおけるＡＤＣ変異型の有効性
[00428] ＦｏｌＲαに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体を使用した異種移植片組織の免疫組織化学分析により、子宮内膜がん患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルをＦｏｌＲα発現レベルについて評価した。ＡＤＣ分子４の有効性をこれらのＰＤＸモデルのサブセットで評価し、陰性、低（＋）、中（＋＋）及び高（＋＋＋）ＦｏｌＲα発現があるモデルが含まれていた。確立されたＰＤＸ腫瘍（約１００〜２００ｍｍ３）を有する動物に毎週１０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４を静脈内（ＩＶ）注射で投与し（ｎ＝３）又は群平均が＞１，０００ｍｍ３になるまで若しくは処置後４５日目まで処置しなかった（対照、ｎ＝２〜３）。腫瘍が、処置後１４日目に１，０００ｍｍ３に達した場合、エンドポイントを２，０００ｍｍ３に延長した。
[00429] 試験されたＦｏｌＲα陽性モデルの約５０％で統計的に有意な有効性が観察され、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、約５０％〜１００％を超える範囲であった（処置開始時の腫瘍サイズを下回る退縮を示す）。一方、ＦｏｌＲα発現が陰性である全てのＰＤＸモデルでは、有意な活性は観察されなかった。ＡＤＣ分子４の抗腫瘍活性の程度は、ＦｏｌＲα発現レベルと正の相関があるようであった（例えば、より高レベルのＦｏｌＲαを有するＰＤＸ腫瘍は、ＡＤＣ分子４による処置に応答して、より高いＴＧＩを示した）。示されるデータ（図２３）は、有効性を示したいくつかのモデルの代表である：（Ａ）ＦｏｌＲα陰性の発現を有するＰＤＸモデル；（Ｂ）ＦｏｌＲα＋発現を有するＰＤＸモデル；（Ｃ、Ｄ）ＦｏｌＲα＋＋発現を有するＰＤＸモデル；（Ｅ、Ｆ）ＦｏｌＲα＋＋＋発現を有するＰＤＸモデル。パーセントＴＧＩ（最終日に対照腫瘍上で判定された）及び対応するｐ値がグラフに示される。ＴＧＩの統計分析は、不対ｔ検定を使用して実施した。５％未満の確率（ｐ＜０．０５）を有意であると見なした。全てのグラフは、平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例２４
アベルマブとの併用処置におけるＡＤＣ変異型の有効性
[00430] 確立されたＭＣ３８−ＦｏｌＲα腫瘍を有する動物において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤アベルマブ（臨床的グレード）と組み合わされたＡＤＣ分子４の有効性を評価した。結果は、図２４及び２５に示される。図２４Ａ及び２５Ａは、示された用量のＡＤＣ分子４、アベルマブ又は両方の組み合わせに応答したＭＣ３８−ｈＦｏｌＲα腫瘍増殖曲線を描写する。ＩＡＣＵＣプロトコルに基づく腫瘍サイズの制限に達したため、単剤処置群の動物の＞５０％が安楽死されるまでの増殖曲線が表示される。図２４Ｂは、対照腫瘍の平均が＞１，２００ｍｍ３であった、１２日目の個々の腫瘍サイズの散布図である。ビヒクル対照と比較するための統計分析は、ダネットの多重比較検定で一方向ＡＮＯＶＡを使用して実施した。５％未満の確率（ｐ＜０．０５）を有意であると見なした。図２５Ｂは、示された用量のＡＤＣ分子４、アベルマブ又は両方方の組み合わせでの処置に応答して生存した動物の割合を示す、カプラン−マイヤー曲線である。全てのグラフは、平均値又は個々の値±ＳＥＭとして提示される。
[00431] 図２４に示されるように、いずれかの用量（１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射による１回投与）の単剤ＡＤＣ分子４又はアベルマブ（ｑ３ｄ×３の腹腔内投与）が最初におよそ７日目までの腫瘍静止をもたらした一方、併用処置は、腫瘍退縮を誘発した（図２４Ａ）。１２日目の腫瘍サイズの分析は、ビヒクル対照と比較して、全ての処置群における腫瘍増殖の有意な阻害を示した（図２４Ｂ）。継続的なモニタリングにより、１５匹中１４匹の動物における完全な退縮（例えば、触診可能腫瘍なし）によって証明されるように、アベルマブと組み合わされたＡＤＣ分子４は、いずれかの単剤のみと比較して、抗腫瘍活性を顕著に増強したことが明らかになった（図２４Ｂ）。
[00432] 図２５に示されるように、１０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ分子４＋アベルマブ群の１匹の動物で腫瘍の再増殖が観察され、最大腫瘍サイズに達したため５９日目に安楽死させた（図２５Ａ）。さらに、併用処置は、正常な体重増加を有して単剤よりも生存期間中央値が３〜４倍長い、処置後最大１１２日で腫瘍の再増殖がない、健常動物の有意に延長された生存期間に基づいて治癒的効果又は完全寛解を示す（図２５Ｂ）。
実施例２５
ＳＣＩＤベージュマウスにおけるＡＤＣ変異型の薬物動態特性
[00433] 非腫瘍性ＳＣＩＤベージュマウスにおいて、ＫＢ及びＩｇｒｏｖ１腫瘍モデルで良好な効果を示した候補ＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型の非コンパートメント薬物動態パラメーターを評価した。５ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶボーラスを投与して試料採取し、異なるマウスからプールして、薬物動態（ＰＫ）パラメーターのタイムポイントを得た。ＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型は、マウスＦｏｌＲαに結合しないため、抗原媒介ＰＫ効果は、期待できない。試験された物質の一覧及び結果の概要は、表２３に示される。
[00434] 排出半減期（Ｔ１／２）は、濃度時間曲線の対数線形プロットの回帰分析から判定した。具体的には、ＡＤＣ分子４のＴ１／２、ＣＬ及びＶｓｓは、それぞれ６．３６、９．５７及び７９．７であった。さらに、ＡＤＣ分子４のＣｍａｘは、１１８±５μｇ／ｍＬと判定された。
[00435] 一般に、試験された全てのＦｏｌＲα ＡＤＣ変異型の薬物動態特性は、同等であり、同様のＰＫプロファイル値を示した（図２６）。さらに、全ての試験物質のマウス薬物動態プロファイルは、他のＦＤＡ承認モノクローナルＩｇＧ抗体と同様のＰＫプロファイルを示した。
実施例２６
カニクイザルにおけるＡＤＣリード抗体の薬物動態特性
[00436] Ｋ４２／Ｙ１８０結合部位を有する抗体１８４８−Ｂ１０及び１８４８−Ｈ０１の非コンパートメント薬物動態（ＰＫ）パラメーターは、カニクイザル（各抗体用量についてｎ＝３）における反復投与試験で評価した。１日目及び１５日目に２回の１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量を投与し、サンプルを分析して、ＰＫパラメーター及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を判定した。２つの抗体は、ヒト標的と同等の親和性でｃｙｎｏ ＦｏｌＲαに結合し、したがって抗原媒介ＰＫ効果が予期される。表２４に要約されているように、両方の抗体のＰＫプロファイルは、類似している。
[00437] 抗体１８４８−Ｈ０１（Ｋ４２／Ｙ１８０）の平均薬物動態パラメーターは、用量１及び２の後に同様であった。用量１及び２の後の平均血漿クリアランスは、それぞれ７．８３及び６．６０ｍＬ／日／ｋｇで、分布容量は、それぞれ６７及び７１ｍＬ／ｋｇであった。用量１及び２の平均終末半減期は、それぞれ６．５及び８．０日であった。１８４８−Ｂ１０（Ｋ４２／Ｙ１８０）の平均薬物動態パラメーターは、用量１及び用量２の後に同等であった。用量１及び２の後の血漿クリアランスは、それぞれ６．０２及び４．７４ｍＬ／日／ｋｇであった。用量１及び２の平均終末半減期値は、それぞれ９．７及び１３日であった。分布容積は、およそ８０ｍＬ／ｋｇであった。
[00438] 処置動物からの血清サンプルは、抗薬物抗体の発生についても分析した（データ未掲載）。ＡＤＡ分析では、両方の抗体について１５日目（初回投与後）には有意な応答は示されなかったが、２８日目と４３日目（１５日目の２回目投与後）には数匹の動物でＡＤＡが検出された。
実施例２７
カニクイザルにおけるＡＤＣ候補の薬物動態評価
[00439] メスのカニクイザルに、１及び２２日目に緩慢なボーラス用量のビヒクル対照又は１、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤＣ分子４をＩＶ投与し（ｎ＝３／群）、４３日目まで観察した。毒物動態プロファイル評価（総抗体、ＡＤＣ及び遊離薬物（Ｉ）異化産物）のために、全ての群から血清及び血漿をいくつかの時点で採取した。毒物動態分析は、ＡＤＣ、総抗体及び遊離薬物（Ｉ）の循環レベルを評価することによって推定された全ての用量でのＡＤＣ分子４の曝露を確認した。ＡＤＣ、総抗体及び遊離薬物（Ｉ）の平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣ値は、ＡＤＣ分子４の用量レベルの増加に伴ってほぼ用量比例的に増加し、１日目と２２日目とは、ほぼ同様であった。ＡＤＣの半減期（Ｔ１／２）は、１．７〜２日を超える範囲であり、Ｃｍａｘは、投与量に応じて２９〜５６０μｇ／ｍＬの範囲であった。
実施例２８
ＡＤＣ候補から放出された異化代謝産物の同定
[00440] 本明細書に記載される抗ＦｏｌＲα ＡＤＣは、エンドソーム又はリソソーム内でプロセスされ、周囲の細胞に浸透し得、バイスタンダー活性を引き起こし得る代謝産物、遊離薬物（Ｉ）の放出をもたらす。コンジュゲートＰ及びＱから放出された遊離薬物は、以下に示される構造（Ｉ）：
の化合物であると予測される。
[00441] ＡＤＣ分子１及びＡＤＣ分子１７で処置された培養細胞（未掲載）及びＩｇｒｏｖ１腫瘍において遊離薬物（Ｉ）の生成を確認し、投与後の異なる時点で腫瘍を採取した。腫瘍を均質化してアセトニトリルで抽出し、溶媒抽出画分をＬＣ／ＭＳで分析した。ＡＤＣ分子１及びＡＤＣ分子１７で処置された動物では、異化代謝産物Ｃ１が腫瘍サンプル中に見られたが、処置されたマウスの血漿では見られなかった（図２７）。Ｃ１のＬＣ／ＭＳプロファイルは、予測された異化代謝産物遊離薬物（Ｉ）のプロファイルと一致し、構造は、質量分光分析によって確認された（未掲載）。遊離薬物（Ｉ）は、試験された細胞株に応じて０．５〜２０ｎＭの範囲のＥＣ５０で生体外で細胞毒性活性を有することが示された（表２６、全ての細胞株についてのデータは未掲載）。
実施例２９
ＡＤＣ候補の生体内安定性
[00442] ＡＤＣ分子４の生体内安定性は、５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの単回投与に続き、ヌードマウス系で測定した。血漿を様々な時点で採取し、ＥＬＩＳＡによって総ＩｇＧを分析した。循環ＡＤＣのＤＡＲ分析は、アフィニティ捕捉とそれに続くＬＣ−ＭＳによって測定した。データは、ＤＡＲ値が試験の過程にわたり変化しないことを示す、図２８。観察された分解ピークも試験中に変化せず、元の貯蔵液と同様の量で存在する。
実施例３０
血漿中のＡＤＣ候補の安定性
[00443] カニクイザル及びヒト血漿中でＡＤＣ分子４及び２０の安定性を試験し、２つのリンカー薬物であるコンジュゲートＰ及びＱの安定性を比較した。ＡＤＣは、５０μｇ／ｍＬで、ＰＢＳ、ヒト及びカニクイザル血漿中で二連でインキュベートした。サンプルは、６０分、１日、３日、７日、１４日及び２１日の時点でインキュベートした。ＥＬＩＳＡによる総ＩｇＧ並びにアフィニティ捕捉及びＣ−ＭＳによるＡＤＣのＤＡＲ分析を使用して、分子の安定性を評価した。図２９に示されるデータは、ＡＤＣ分子４及び２０の生体外安定性がヒト及びｃｙｎｏ血漿の両方で同等であり、ＤＡＲ４が２１日目まで保持されることを示す。いずれの分子も、おそらく抗体のＣ末端でクリッピングの発生を示したが、これは、インキュベーション後１日目から観察された。このクリッピングは、重鎖のＣ末端にある２つのリジン残基の切断である可能性が高く、分子の安定性又は活性に影響を与える可能性が低い。同様のクリッピングは、ＣＨＯのＩｇＧ分子産生中に一般的に観察される。
実施例３１
ＡＤＣ候補と比較物質ＡＤＣとの比較
[00444] 本明細書に記載されるＡＤＣ候補の比較物質は、ＩＭＧＮ８５３である。ＩＭＧＮ８５３（ミルベツキシマブソラブタンシン）は、切断可能（スルホＳＰＤＢ）リンカーを介してチューブリンを破壊するメイタンシノイドＤＭ４に連結された、ＦｏｌＲα結合抗体を含有する抗体薬物コンジュゲートである。抗体及びリンカー構成要素の選択をはじめとするＩＭＧＮ８５３の設計は、卵巣及び非小細胞肺がんの患者の腫瘍サンプル中のＦｏｌＲα発現のレベルを代表する、前臨床モデルにおける抗腫瘍活性の最適化に基づいた。ＩＭＧＮ８５３は、臨床では有望視されているが、その化学的性質に基づいて、分子の安定性、安全性及び活性に影響を及ぼすいくつかの潜在的な不利益を有することもある。したがって、ＩＭＧＮ８５３サロゲート（ＡＤＣ分子２１）及びＡＤＣ分子４の特性及び前臨床効果を評価するためのアッセイを以下に記載する。
[00445] ＡＤＣ分子４の特異性をＩＭＧＮ８５３の特異性と比較して評価するために、ＡＤＣ分子４の細胞毒性活性をＩＭＧＮ８５３の近似サロゲートと比較した。サロゲートをＣＨＯ細胞で一過性に発現させ、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４に共役させて、ＡＤＣ分子２１を生成した。ＦｏｌＲα発現が陽性の細胞（Ｉｇｒｏｖ１及びＯＶＣＡＲ３）上及びＦｏｌＲα発現が陰性の細胞（Ａ５４９）上において、競合相手としての過剰な非共役「裸」抗体の存在下で２つのＡＤＣ分子の細胞毒性活性を比較した。ＡＤＣ分子４の場合、非共役抗体の存在下では、Ｉｇｒｏｖ１細胞の細胞殺滅活性が約８００分の１に（０．０５３ｎＭのＥＣ５０から３３ｎＭを超えるＥＣ５０へ）減少し、ＡＤＣ分子４の細胞殺滅活性は、細胞表面上のＦｏｌＲα抗原の存在に特異的であることが示唆され、これは、裸の抗体がＦｏｌＲα抗原への結合についてＡＤＣと競合するためである。裸の抗体の添加のみがＩｇｒｏｖ１細胞上でＥＣ５０を約３倍シフトさせることから、ＡＤＣ分子２１の細胞殺滅活性は、細胞表面上のＦｏｌＲα抗原の存在に完全には依存しない。同様の結果は、ＯＶＣＡＲ３細胞上でも観察された（図３０Ａ、３０Ｂ）。ＦｏｌＲα陰性Ａ５４９細胞上では、ＡＤＣ分子２１で強力な非特異的細胞殺滅が観察されたが、ＡＤＣ分子４では非特異的細胞殺滅が観察されなかった（図３０Ｃ）。これらのデータに基づいて、ＡＤＣ分子４は、ＦｏｌＲα陽性細胞に対してのみ強力で特異的な細胞殺滅を示す一方、ＡＤＣ分子２１は、ＦｏｌＲα抗原へのＡＤＣの結合に関連しない非特異的な細胞殺滅を示すと結論付け得る。結果は、表２５に要約される。
[00446] ＡＤＣ分子４は、ＦｏｌＲα陽性Ｉｇｒｏｖ１細胞に対して特異的な細胞殺滅活性を有したが、Ａ５４９ ＦｏｌＲα陰性細胞に対してはいかなる活性もなかった。対照的に、ＡＤＣ分子２１は、陰性及び陽性ＦｏｌＲα細胞株の両方に対して細胞毒性活性を有し、培養中及び生体内の還元条件下におけるスルホＳＰＤＢリンカーの潜在的な不安定性に帰するとされ得るか、又はＡＤＣの細胞内への飲作用に起因する特異性の欠如が示唆された。ＡＤＣ分子４及びＡＤＣ分子２１から放出される遊離薬物は、それぞれ構造（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物であり、以下：
で図示される。生体外細胞毒性試験では、放出された遊離薬物（Ｉ）及び（ＩＩ）は、同等の細胞毒性活性を有した（表２６）。この試験における１つの重要な観察は、ＡＤＣ分子４が、それが共役している理論上の４つの遊離薬物部分（Ｉ）よりも１０倍強力なことであり、コンジュゲートが遊離薬物（Ｉ）よりも、標的細胞に対する高レベルの特異的殺滅を与えることが示唆されることである。
[00447] 遊離薬物（Ｉ）の薬物動態プロファイルを評価するために、留置頸静脈カテーテルを介したＩＶボーラス投与により、メスのSprague-Dawleyラット（平均体重２５０ｇ）に０．４ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量を与えた（Ｎ＝１用量レベル当たり３匹）。血液サンプルは、投薬後０、０．８３、１、２、８、２４、３２、４８及び７２時間で採取した。遊離薬物（Ｉ）及び（ＩＩ）のレベルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定し、Phoenix WinNonlin Version 6.4（Pharsight Corporation）を使用して、非コンパートメント薬物動態分析を実施した。表２７は、この試験から収集されたＰＫデータを提供する。（Ｉ）の濃度が２時間から８時間に増加し、その後、検出不能であったという事実のために、遊離薬物（Ｉ）のＰＫは、推定され得なかった。（Ｉ）は、投与後２４時間で検出されないため、この試験の結果は、遊離薬物（Ｉ）のクリアランスが遊離薬物（ＩＩ）のクリアランスより迅速であることを示唆する（データ未掲載）。さらに、２用量の遊離薬物（Ｉ）の投与が動物の体重に影響を及ぼさなかった一方、０．４ｍｇ／ｋｇの遊離薬物（ＩＩ）による処置では、進行性の体重減少が観察された（図３１）。
[00448] 表２８は、ＡＤＣ分子４及びその代謝産物である遊離薬物（Ｉ）の特性の概要である。
実施例３２
ＡＤＣ候補と比較物質ＡＤＣとの薬物結合の安定性の比較
[00449] ＡＤＣ分子４及び比較物質ＡＤＣ分子２１の安定性をカニクイザル及びヒト血漿及びＰＢＳ中で評価し、それぞれ放出された異化産物である遊離薬物（Ｉ）及び（ＩＩ）の定量がそれに続いた（実施例２９を参照されたい）。図３２に要約されるデータに基づいて、ＡＤＣ分子４の薬物結合は、ＡＤＣ分子２１の薬物結合よりも安定しているように見える。ＡＤＣ分子２１は、血漿への添加後１５〜３０分以内に遊離薬物（ＩＩ）が検出されるように、ヒト及びｃｙｎｏ血漿で急速に切断されるように見える。次に、遊離薬物（ＩＩ）は、時間経過と共にさらなる代謝を被るように見える。対照的に、遊離分子（Ｉ）は、ＡＤＣ分子４の血漿への添加から１５〜３０分以内には検出されない。遊離薬物（Ｉ）のレベルは、血漿中での４日間のインキュベーションで若干増加するが、ＰＢＳでは増加せず；血漿中でのより安定した薬物結合が示唆される。
実施例３３
排出ポンプに関するＡＤＣ異化産物の比較
[00450] 透過性糖タンパク質１（ＰｇＰ；多剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）としても知られる）は、異物を細胞外に汲み出して様々な細胞毒性薬物の細胞内濃度を低下させる、細胞膜タンパク質である。ＰｇＰ活性は、生体外及び生体内で化学療法誘発性細胞毒性の鈍化をもたらす。ＰｇＰの上方制御のために、がん細胞は、多くの場合に薬剤耐性になり、場合により、この上方制御は、薬剤自体によって媒介される。遊離薬物（Ｉ）及び（ＩＩ）（実施例２９）のＰｇＰ感度を比較するアッセイをシスプラチン耐性細胞株モデルで実施した。
[00451] 遊離薬物（Ｉ）が、いくつかの卵巣がん細胞株におけるシスプラチン耐性の原因となるＰ糖タンパク質（ＰｇＰ）の基質であるかどうかを評価するために（Stordal et al. 2012. PLoS One 7(7)）、ＰｇＰを過剰発現するＭＥＳ−ＳＡ／ＭＸ２細胞株及び親ＭＥＳ−ＳＡ細胞に対する遊離薬物細胞殺滅活性を調査した。ＰｇＰ過剰発現ＭＥＳ−ＳＡ／ＭＸ２細胞に対する遊離薬物（Ｉ）、遊離薬物（ＩＩ）及び対照遊離薬物（ＭＭＡＥ、「ＩＩＩ」と称される）の細胞殺滅活性は、親ＭＥＳ−ＳＡ細胞に対するそれらの活性と比較して異なるレベルで減少した。ＭＥＳ−ＳＡ／ＭＸ２細胞は、ＰｇＰ阻害剤ＧＦ１２０９１８（５μＭ）でも処理し、観察された細胞殺滅の減少が細胞表面上のＰｇＰの存在によるものかどうかをさらに調査した。ＰｇＰ阻害剤の存在下では、遊離薬物の細胞殺滅活性は、親ＭＥＳ−ＳＡ細胞株と同一レベルに戻り、ＭＥＳ−ＳＡ／ＭＸ２細胞におけるＰｇＰ過剰発現が遊離薬物耐性の主な理由であることが示唆された。
[00452] ＭＥＡ−ＳＡ／ＭＸ２細胞に対する陽性対照の遊離薬物（ＩＩＩ）の細胞殺滅ＥＣ５０は、ＰｇＰ阻害剤ＧＦ１２０９１８の存在下及び不在下で１１１倍の変化を示し、遊離薬物（ＩＩＩ）がＰｇＰの非常に良好な基質であることが示唆された。遊離薬物（Ｉ）は、ＭＥＡ−ＳＡ／ＭＸ２細胞に対するＰｇＰ阻害剤の存在下及び不在下で細胞殺滅ＥＣ５０の８倍の変化のみが観察されたという事実に基づいて、ＰｇＰの芳しくない基質である。遊離薬物（ＩＩ）もＰｇＰの基質として比較的芳しくないが、細胞殺滅ＥＣ５０に１７倍の変化が観察されたため、遊離薬物（Ｉ）に比べて排出ポンプによる輸送の影響を受け易い（表２９、図３３）。
[00453] データは、遊離薬物（ＩＩ）と比較して、遊離薬物（Ｉ）が、排出ポンプによって膜を越える能動輸送のより弱い基質であることを示唆する。その結果、遊離薬物（Ｉ）が、がん細胞から汲み出される可能性がより低くなり、毒素のよりよい細胞内滞留につながり、したがって比較物質ＡＤＣ分子２１と比較してＡＤＣ分子４の細胞毒性が改善される。ＰｇＰが媒介する薬物排出は、ＡＤＣに対する一般的な耐性機序であり、診療所では、白金剤及びＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性の主要な機序の１つである。したがって、ＰｇＰに対する遊離薬物（Ｉ）の芳しくない基質能力のために、それは、白金耐性及び潜在的なＰＡＲＰ耐性のがんを標的化するための有望な弾頭になる。
実施例３４
腫瘍及び血漿中の異化産物の蓄積
[00454] ＡＤＣ分子４の薬物結合は、比較物質ＡＤＣ分子２１のそれよりも安定しているように見えるが、腫瘍細胞内のＡＤＣ分子４からの遊離薬物（Ｉ）の効率的な放出は、その細胞毒性にとって重要である。ＡＤＣ分子４及び２１からの弾頭の放出を評価するために、２種のＡＤＣ分子で処置されたＩｇｒｏｖ１腫瘍を有するマウスにおいて、遊離薬物（Ｉ）及び（ＩＩ）の腫瘍及び血漿レベルを測定した。図３４に示されるように、ＡＤＣ分子４からの遊離薬物（Ｉ）の放出及び腫瘍蓄積は、ＡＤＣ分子２１からの遊離薬物（ＩＩ）のそれと同等であるか又はそれより若干優れていた。このデータは、２種の弾頭の同等の細胞毒性と合わせて、ＡＤＣ分子４の細胞毒性活性が比較物質ＡＤＣ分子２１の細胞毒性活性と少なくとも同等であることを示唆する。
[00455] 要約すると、実施例２９〜３２に記載されているデータは、拡張された治療指数（ＴＩ）が、放出された弾頭（遊離薬物（Ｉ）対遊離薬物（ＩＩ））及び全体としてのＡＤＣ分子４の構造の両方の属性によって生じ得ることを示唆する。遊離薬物（Ｉ）及び（ＩＩ）は、遊離薬物として投与された場合の生体外細胞毒性活性が同等であり、且つＡＤＣとして投与された場合の腫瘍への蓄積においても同等である。遊離薬物（ＩＩ）と対比して、遊離薬物（Ｉ）のＰｇＰ基質能力は、はるかに弱いため、腫瘍が排出に基づいて耐性を発達させるのにつれて、ＡＤＣ分子４は、元の活性のほとんどを保持することが予測される。ＡＤＣ分子４のプロテアーゼ切断可能放出機序は、比較物質ＡＤＣ分子２１のジスルフィド放出機序よりも高い安定性及び腫瘍特異性を有する。これは、ＦｏｌＲαを発現する細胞に同時により高い特異性を付与する。ＡＤＣ分子４のより高い安定性は、異化産物（Ｉ）のより迅速なクリアランス及びより高い耐容性と共にＡＤＣ分子４の安全性プロファイルも改善する。これは、全てサロゲートＡＤＣ分子２１上で測定するとＡＤＣ分子４が比較物質ＡＤＣ ＩＭＧＮ８５３よりも高いＴＩを有し得ることを示す。
実施例３５
候補抗体への変異の導入
[00456] Ｖ２６２Ｅ変異を抗体変異型１８４８−Ｈ０１（Ｙ１８０／Ｆ４０４）に導入し、この変異が変異型の収量を増加させるかどうかを調査した。Ｖ２６２Ｅ変異の導入は、ＰｒｏＡ精製後の収量に約７０％の増加をもたらし（親力価の１７０ｍｇ／Ｌと比較して３５０ｍｇ／Ｌ）、精製タンパク質の品質は変化しなかった（データ未掲載）。コンジュゲートＰ（実施例１１）及びコンジュゲートＱ（実施例１５）に共役されたＶ２６２Ｅ変異タンパク質の特性は、ＡＤＣの共役効率及び生体外活性について、親コンジュゲートＡＤＣ分子４と比較した。表３０に見られるように、Ｖ２６２Ｅ変異の導入は、ＰコンジュゲートのＩｇｒｏｖ１細胞に対する生体外細胞毒性活性をわずかに減少させ、Ｑコンジュゲートではより大幅に減少させたが、共役効率及びＤＡＲは同等であった。
[00457] ＡＤＣ分子４に対するＰコンジュゲートの薬物動態特性及び生体内安定性及び生体内効力の比較は、ＡＤＣのＰＫが２つのバージョン間で同等であった（表３１、図３６）一方、変異Ｐコンジュゲート（ＡＤＣ分子２３）の生体内活性は、ＡＤＣ分子４のそれよりもわずかに低かったことを示した（図３５Ａ）。２１日目の腫瘍サイズの統計分析は、ＡＤＣ分子４による治療のみがビヒクルと比較して有意により小さい腫瘍をもたらしたことを示したが、ＡＤＣ分子４及びＡＤＣ分子２３群の腫瘍サイズは、互いに統計的に異ならなかった（図３５Ｂ）。これに基づいて、ＡＤＣ分子２３は、ＦｏｌＲαの標的化のための開発及びさらなる研究のための代替的なＡＤＣとして適切である。
実施例３６
配列
[00458] 表３２は、本明細書で言及される配列を提供する。
均等物
[00459] 上に記載された本開示は、独立した効用を有する複数の異なる発明を包含し得る。これらの発明をそれぞれその好ましい形態で開示したが、本明細書で開示され、図示されるその特定の実施形態に対する多くの変形形態が可能であることから、限定的な意味で考察されるべきではない。本発明の主題は、本明細書で開示される様々な要素、特徴、機能及び／又は特性の全ての新規且つ非自明な組み合わせ及び下位組み合わせを含む。以下の特許請求の範囲は、新規且つ非自明と見なされる特定の組み合わせ及び下位組み合わせを特に指摘する。特徴、機能、要素及び／又は特性の他の組み合わせ及び下位組み合わせにおいて具現化された発明は、本出願、本出願からの優先権を主張する出願又は関連出願において特許請求され得る。このような請求項も、異なる発明又は同じ発明に関するかどうか、及び元の特許請求と比較して範囲がより広いか、より狭いか、等しいか又は異なるかにかかわらず、本開示の発明の主題に包含されると見なされる。
[00460] 本明細書又は図面に記載される任意の実施形態からの１つ又は複数の特性は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書又は図面に記載される任意の他の実施形態の１つ又は複数の特性と組み合わされ得る。
[00461] 本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物又は特許出願が参照により援用されることが具体的且つ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。前述の本発明の理解を明瞭化する目的で、例証及び実施例としてある程度詳細に説明したが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、それに対する特定の変更形態及び修正形態がなされ得ることは、当業者に容易に明らかであろう。

Claims (54)

  1. 少なくとも１つのペイロード部分に部位特異的に連結された葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）に特異的に結合する抗体を含む抗体コンジュゲートであって、前記抗体は、Kabat、Chothia又はＥＵ番号付けスキームによるＨＣ−Ｆ４０４、ＨＣ−Ｋ１２１、ＨＣ−Ｙ１８０、ＨＣ−Ｆ２４１、ＨＣ−２２１、ＬＣ−Ｔ２２、ＬＣ−Ｓ７、ＬＣ−Ｎ１５２、ＬＣ−Ｋ４２、ＬＣ−Ｅ１６１、ＬＣ−Ｄ１７０、ＨＣ−Ｓ１３６、ＨＣ−Ｓ２５、ＨＣ−Ａ４０、ＨＣ−Ｓ１１９、ＨＣ−Ｓ１９０、ＨＣ−Ｋ２２２、ＨＣ−Ｒ１９、ＨＣ−Ｙ５２又はＨＣ−Ｓ７０からなる群から選択される部位に１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む、抗体コンジュゲート。
  2. 前記１つ又は複数の非天然アミノ酸が、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、L-Dopa、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、化合物５６、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体コンジュゲート。
  3. 前記１つ又は複数の非天然アミノ酸の残基が、加水分解的に安定しているリンカーを介して前記ペイロード部分に連結される、請求項２に記載の抗体コンジュゲート。
  4. 前記１つ又は複数の非天然アミノ酸の残基が、切断可能なリンカーを介して前記ペイロード部分に連結される、請求項２に記載の抗体コンジュゲート。
  5. 前記非天然アミノ酸残基が、化合物（３０）又は化合物（５６）の残基である、請求項２から４のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  6. 前記ペイロード部分が、メイタンシン、ヘミアステリン、アマニチン及びオーリスタチンからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  7. 前記ペイロード部分が、ＤＭ１、ヘミアステリン、アマニチン、ＭＭＡＦ及びＭＭＡＥからなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  8. 前記抗体が、
    （ｉ）配列番号５８及び１１７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７６及び２３５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９４を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｉｉ）配列番号１９及び７８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３７及び１９６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５５を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｉｉｉ）配列番号４及び６３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１２２及び１８１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４０を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｉｖ）配列番号５及び６４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１２３及び１８２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４１を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｖ）配列番号６及び６５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１２４及び１８３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４２を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｖｉ）配列番号７及び６６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１２５及び１８４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４３を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｖｉｉ）配列番号８及び６７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１２６及び１８５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４４を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｖｉｉｉ）配列番号９及び６８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１２７及び１８６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４５を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｉｘ）配列番号１０及び６９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１２８及び１８７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４６を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘ）配列番号１１及び７０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１２９及び１８８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｉ）配列番号１２及び７１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３０及び１８９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４８を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｉｉ）配列番号１３及び７２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３１及び１９０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２４９を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｉｉｉ）配列番号１４及び７３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３２及び１９１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５０を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｉｖ）配列番号１５及び７４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３３及び１９２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５１を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｖ）配列番号１６及び７５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３４及び１９３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５２を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｖｉ）配列番号１７及び７６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３５及び１９４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５３を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｖｉｉ）配列番号１８及び７７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３６及び１９５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５４を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｖｉｉｉ）配列番号２０及び７９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３８及び１９７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５６を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｉｘ）配列番号２１及び８０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１３９及び１９８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘ）配列番号２２及び８１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４０及び１９９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５８を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｉ）配列番号２３及び８２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４１及び２００の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２５９を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｉｉ）配列番号２４及び８３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４２及び２０１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６０を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｉｉｉ）配列番号２５及び８４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４３及び２０２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６１を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｉｖ）配列番号２６及び８５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４４及び２０３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６２を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｖ）配列番号２７及び８６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４５及び２０４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６３を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｖｉ）配列番号２８及び８７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４６及び２０５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６４を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｖｉｉ）配列番号２９及び８８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４７及び２０６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６５を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｖｉｉｉ）配列番号３０及び８９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４８及び２０７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６６を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｉｘ）配列番号３１及び９０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１４９及び２０８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘ）配列番号３２及び９１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５０及び２０９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６８を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｉ）配列番号３３及び９２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５１及び２１０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２６９を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｉｉ）配列番号３４及び９３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５２及び２１１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７０を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３５及び９４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５３及び２１２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７１を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｉｖ）配列番号３６及び９５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５４及び２１３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７２を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｖ）配列番号３７及び９６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５５及び２１４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７３を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｖｉ）配列番号３８及び９７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５６及び２１５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７４を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｖｉｉ）配列番号３９及び９８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５７及び２１６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７５を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号４０及び９９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５８及び２１７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７６を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｘｘｉｘ）配列番号４１及び１００の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１５９及び２１８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌ）配列番号４２及び１０１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６０及び２１９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７８を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｉ）配列番号４３及び１０２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６１及び２２０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２７９を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｉｉ）配列番号４４及び１０３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６２及び２２１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８０を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｉｉｉ）配列番号４５及び１０４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６３及び２２２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８１を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｉｖ）配列番号４６及び１０５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６４及び２２３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８２を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｖ）配列番号４７及び１０６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６５及び２２４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８３を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｖｉ）配列番号４８及び１０７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６６及び２２５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８４を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｖｉｉ）配列番号４９及び１０８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６７及び２２６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８５を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｖｉｉｉ）配列番号５０及び１０９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６８及び２２７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８６を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｘｌｉｘ）配列番号５１及び１１０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１６９及び２２８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌ）配列番号５２及び１１１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７０及び２２９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８８を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌｉ）配列番号５３及び１１２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７１及び２３０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２８９を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌｉｉ）配列番号５４及び１１３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７２及び２３１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９０を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌｉｉｉ）配列番号５５及び１１４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７３及び２３２の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９１を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌｉｖ）配列番号５６及び１１５の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７４及び２３３の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９２を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌｖ）配列番号５７及び１１６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７５及び２３４の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９３を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌｖｉ）配列番号５９及び１１８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７７及び２３６の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９５を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌｖｉｉ）配列番号６０及び１１９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７８及び２３７の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９６を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；
    （ｌｖｉｉｉ）配列番号６１及び１２０の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１７９及び２３８の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；又は
    （ｌｉｘ）配列番号６２及び１２１の１つを含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号１８０及び２３９の１つを含むＣＤＲ−Ｈ２；並びに配列番号２９８を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ
    を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  9. 前記抗体が、
    （ａ）配列番号３００を含むＣＤＲ−Ｌ１；配列番号３０３を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列番号３０６を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ；又は
    （ｂ）配列番号３０１を含むＣＤＲ−Ｌ１；配列番号３０４を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列番号３０７を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ
    を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  10. 前記抗体が、
    （ｉ）配列番号３６２であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｉｉ）配列番号３２３であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｉｉｉ）配列番号３０８であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｉｖ）配列番号３０９であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｖ）配列番号３１０であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｖｉ）配列番号３１１であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｖｉｉ）配列番号３１２であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｖｉｉｉ）配列番号３１３であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｉｘ）配列番号３１４であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘ）配列番号３１５であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｉ）配列番号３１６であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｉｉ）配列番号３１７であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｉｉｉ）配列番号３１８であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｉｖ）配列番号３１９であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｖ）配列番号３２０であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｖｉ）配列番号３２１であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｖｉｉ）配列番号３２２であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｖｉｉｉ）配列番号３２４であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｉｘ）配列番号３２５であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘ）配列番号３２６であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；又は
    （ｘｘｉ）配列番号３２７であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｉｉ）配列番号３２８であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｉｉｉ）配列番号３２９であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｉｖ）配列番号３３０であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｖ）配列番号３３１であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｖｉ）配列番号３３２であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｖｉｉ）配列番号３３３であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｖｉｉｉ）配列番号３３４であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｉｘ）配列番号３３５であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘ）配列番号３３６であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｉ）配列番号３３７であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｉｉ）配列番号３３８であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３３９であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｉｖ）配列番号３４０であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｖ）配列番号３４１であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｖｉ）配列番号３４２であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｖｉｉ）配列番号３４３であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号３４４であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｘｘｉｘ）配列番号３４５であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌ）配列番号３４６であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｉ）配列番号３４７であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｉｉ）配列番号３４８であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｉｉｉ）配列番号３４９であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｉｖ）配列番号３５０であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｖ）配列番号３５１であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｖｉ）配列番号３５２であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｖｉｉ）配列番号３５３であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｖｉｉｉ）配列番号３５４であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｘｌｉｘ）配列番号３５５であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌ）配列番号３５６であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌｉ）配列番号３５７であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌｉｉ）配列番号３５８であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌｉｉｉ）配列番号３５９であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌｉｖ）配列番号３６０であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌｖ）配列番号３６１であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６７であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌｖｉ）配列番号３６３であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６８であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌｖｉｉ）配列番号３６４であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６８であるＶＬ領域又はその変異型；
    （ｌｖｉｉｉ）配列番号３６５であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６９であるＶＬ領域又はその変異型；又は
    （ｌｉｘ）配列番号３６６であるＶＨ領域又はその変異型及び配列番号３６９であるＶＬ領域又はその変異型
    を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  11. 前記抗体が、Kabat又はKabatのＥＵ番号付けスキームによるＨＣ−Ｆ４０４、ＨＣ−Ｙ１８０及びＬＣ−Ｋ４２の群から選択される部位に１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む、請求項１０に記載の抗体コンジュゲート。
  12. 前記抗体が、部位ＨＣ−Ｆ４０４に非天然アミノ酸を含む、請求項１１に記載の抗体コンジュゲート。
  13. 前記抗体が、部位ＨＣ−Ｆ４０４及びＨＣ−Ｙ１８０に非天然アミノ酸を含む、請求項１１に記載の抗体コンジュゲート。
  14. 前記抗体が、部位ＨＣ−Ｆ４０４及びＬＣ−Ｋ４２に非天然アミノ酸を含む、請求項１１に記載の抗体コンジュゲート。
  15. 前記抗体が、部位ＨＣ−Ｙ１８０及びＬＣ−Ｋ４２に非天然アミノ酸を含む、請求項１１に記載の抗体コンジュゲート。
  16. １つ又は両方の非天然アミノ酸が、パラ−アジドメチルフェニルアラニン及びｐ−アジド−メチル−Ｌ−フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  17. コンジュゲートＰ：
    （式中、ｎは、１から６の整数である）
    の構造を有する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  18. コンジュゲートＭ：
    （式中、ｎは、１から６の整数である）
    の構造を有する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  19. コンジュゲートＱ：
    （式中、ｎは、１から６の整数である）
    の構造を有する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  20. 前記抗体が、配列番号３６２のＶＨ領域又は７つ以下のアミノ酸置換を有するその変異型と、配列番号３６７のＶＬ領域又は７つ以下のアミノ酸置換を有するその変異型とを含む、請求項１から１９のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  21. 前記抗体が、配列番号３２３のＶＨ領域又は７つ以下のアミノ酸置換を有するその変異型と、配列番号３６７のＶＬ領域又は７つ以下のアミノ酸置換を有するその変異型とを含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  22. 前記アミノ酸置換が、保存的アミノ酸置換である、請求項２０又は２１に記載の抗体。
  23. 少なくとも１つの定常領域ドメインをさらに含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  24. 前記定常領域が、配列番号３７０、３７１及び３７２から選択される配列を含む、請求項２３に記載の抗体コンジュゲート。
  25. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１から２４のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  26. 前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭである、請求項１から２５のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  27. 前記抗体が、ヒト化又はヒトである、請求項１から２６のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  28. 前記抗体が、脱グリコシル化されている、請求項１から２７のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  29. 前記抗体が、抗体断片である、請求項１から２８のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  30. 前記抗体断片が、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）断片及びｓｃＦｖ−Ｆｃ断片から選択される、請求項２９に記載の抗体コンジュゲート。
  31. 前記抗体が、ｓｃＦｖ断片である、請求項３０に記載の抗体コンジュゲート。
  32. 前記ｓｃＦｖ断片が、配列番号３７９から３８０から選択される配列を含む、請求項３１に記載の抗体コンジュゲート。
  33. 前記抗体が、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片である、請求項３０に記載の抗体コンジュゲート。
  34. 前記ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片が、配列番号３８１又は配列番号３８２を含む、請求項３３に記載の抗体コンジュゲート。
  35. 前記抗体が、２５℃の温度でヒト葉酸受容体に結合するとき、約２．９０×１０５Ｍ−１×秒−１から約９．６４×１０９Ｍ−１×秒−１のｋａを有する、請求項１から３４のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  36. 前記抗体が、２５℃の温度でヒト葉酸受容体から分離するとき、約２．２８×１０−４秒−１から約４．８２×１０１秒−１のｋｄを有する、請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  37. 前記抗体が、２５℃の温度でヒト葉酸受容体に結合されるとき、約２．２６×１０−１１Ｍから約７．２０×１０−９ＭのＫＤを有する、請求項１から３６のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  38. 前記抗体が、カニクイザル葉酸受容体に特異的に結合する、請求項１から３７のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  39. 前記抗体が、２５℃の温度でカニクイザル葉酸受容体に結合されるとき、約０．１９×１０−９Ｍから約２．８４×１０−９ＭのＫＤを有する、請求項３８に記載の抗体コンジュゲート。
  40. 前記抗体が、マウス葉酸受容体に特異的に結合する、請求項１から３９のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
  41. 前記抗体が、２５℃の温度でマウス葉酸受容体に結合されるとき、約０．５×１０−９Ｍから約９．０７×１０−８ＭのＫＤを有する、請求項４０に記載の抗体コンジュゲート。
  42. 請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲートと、前記抗体コンジュゲートの使用説明書とを含むキット。
  43. 前記抗体コンジュゲートが、凍結乾燥されている、請求項４２に記載のキット。
  44. 前記凍結乾燥抗体を再構成するための流体をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
  45. 請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲートと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  46. 疾患又は病状の治療又は予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート又は請求項４５に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
  47. 疾患又は病状の診断を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１から４１のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート又は請求項４５に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
  48. 前記疾患又は病状が、がんである、請求項４６又は４７に記載の方法。
  49. 前記疾患又は病状が、乳がんである、請求項４６から４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記疾患又は病状が、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である、請求項４６から４８のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記疾患又は病状が、卵巣がんである、請求項４６から４８のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記疾患又は病状が、肺がんである、請求項４６から４８のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記疾患又は病状が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、請求項４６から４８のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記疾患又は病状が、子宮内膜がんである、請求項４６から４８のいずれか１項に記載の方法。
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