JP2018503600A5 - - Google Patents

Description

一部の具現例において、本発明の抗体は抗体‐薬物接合体を含む。一部の抗体‐薬物接合体は治療剤を含む。一部の抗体‐薬物接合体は細胞傷害剤を含む。一部の場合、細胞傷害剤は抗体に直接接合される。一部の場合、細胞傷害剤はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して抗体に接合される。このようなリンカーは切断可能なリンカー、または切断‐不可能なリンカーを含んでもよい。一部の場合、細胞傷害剤はＤＮＡ損傷剤である。一部の場合、細胞傷害剤は細胞骨格阻害剤である。

結合された：本願において用いられたように、用語「結合された」、「接合された」、「連結された」、「付着された」及び「束ねられた」は、２つ以上の部分構造に対して使用される場合、部分構造が直接的にまたはリンカーとして作用する１つ以上の追加の部分構造を介して互いに物理的に結合または連結され、構造体が使用される条件、例えば生理学的な条件下部分構造が物理的に結合されたままで維持されるように十分に安定した構造を形成することを意味する。「結合」は直接的な共有化学結合を介した厳格なものである必要はない。これは、また「結合された」実体が物理的に結合された状態を維持するように十分に安定したイオン結合または水素結合または混成化ベース連結を示唆する。

細胞傷害性の：本願において用いられたように、用語「細胞傷害性の」は細胞（例えば、哺乳類の細胞（例えば、ヒト細胞））、バクテリア、ウィルス、菌類、原生動物、寄生虫、プリオンまたはこれらの組み合わせを死滅させるか、またはこれに有害、毒性、または致命的な影響を及ぼす製剤を称する。

高親和性抗体をコードするＤＮＡ配列は、親和性成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）として公知された追加の選別段階で突然変異される。本願において用いられたように、用語「親和性成熟」は、抗体が、抗体‐または抗体断片‐コードｃＤＮＡ配列の突然変異及び選別の連続的な段階を介して与えられた抗原に対する親和性を増加させることで、生産される方法を称する。一部の場合、このような方法は試験管内で行われる。これを達成するために、ＣＤＲコード配列の増幅は、非制限的に点突然変異、局地的突然変異、挿入突然変異及び欠失突変異を含む、突然変異を含有する数百万個のコピーを生成するために、エラーが発生しやすいＰＣＲを使用して行われる。本願において用いられたように、用語「点突然変異」は、ヌクレオチド配列内の１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチドに変化された核酸突然変異を称する。本願において用いられたように、用語「局地的突然変異」は、２つ以上の連続的なヌクレオチドが異なるヌクレオチドに変化された核酸突然変異を称する。本願において用いられたように、用語「挿入突然変異」は、１つ以上のヌクレオチドがヌクレオチド配列内に挿入された核酸突然変異を称する。本願において使用されたように、用語「欠失突然変異」は１つ以上のヌクレオチドが核酸配列から取り除かれた核酸突然変異を称する。挿入または欠失突然変異は開始コドンの１つまたは２つのヌクレオチドを変更させることで全体コドンの完全な置換、または１つのコドンを他のコドンに変化させることを含む。

１５ｍｌの２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）を０．９ｍｌの１６．６Ｍエタノールアミン及び２８４．１ｍｌの精製水と組み合わせて３００ｍｌのエポキシブロッキング緩衝液を調製する。前記溶液をＨＣｌを用いて最終ｐＨが９．０になるようにする。前記溶液を０．２μＭのニトロセルロース膜を用いて濾過する。エポキシ緩衝溶液及び１Ｌの精製水を５０℃に事前に加温する。ガラススライドをスライドホルダーに配列して事前に加温したエポキシブロッキング緩衝液がある染色槽に迅速に浸漬させる。スライドをエポキシブロッキング緩衝液とともに５０℃で１時間周期的に振盪しながらインキュベーションしてエポキシの結合部位を不活性化させる。次に、スライドをすすぎ、１％のＯＶＡが含まれたＰＢＳで２５℃で１時間ブロッキングさせる。ポリクローナル抗体（１：１０００）または精製されたモノクローナル抗体（１ｕｇ／ｍＬ）が含まれた血清試料を１％ＯＶＡが含まれたＰＢＳで希釈して２５℃で１時間グリカンアレイに添加する。広範囲に洗浄した後に、Ｃｙ３接合された抗マウスＩｇＧとともにグリカンマイクロアレイスライドで１時間インキュベーションして抗体結合を検出する（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州ウェストグローブ所在）。次にスライドを広範囲に洗浄して乾燥させ、Ｇｅｎｅｐｉｘ ４０００Ｂスキャナー（１００％レーザー、３５０で獲得、１０μｍピクセル）でスキャンする。スキャンイメージからのローデータをＧｅｎｅｐｉｘソフトウェアを使用して抽出してローデータ分析を行う。抗体は、これらがＡｃＳＴｎ及びＧｃＳＴｎの両分子に結合するが、Ｔｎまたはアレイ上の他のグリカンに結合しない場合ＡｃＳＴｎ及びＧｃＳＴｎに対して非常に特異的であるとみなされる。

グリカンアレイの特性分析結果を以下の表に示した。グリカンアレイを分析する間に各抗体に対して獲得された一番高い水準の信号が示され、それぞれの抗体が結合されたグリカン及び各グリカンに対して獲得された信号強度に基づく結果の群及び特異性決定が示されている。実施例１の方法によって群を決定した。特異性決定はまたＡｃ対Ｇｃ構造との結合強度を考慮する。

ヒト定常領域を有する完全にヒト化された抗体をコードする発現プラスミドを構築するために、哺乳類発現ベクターの上流サイトメガロウイルス極初期プロモーター／エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）及び免疫グロブリンシグナル配列と下流免疫グロブリン定常領域の遺伝子との間に、それぞれの可変領域のためのＤＮＡ配列を挿入する。哺乳類細胞への形質移入のためのＤＮＡ試料を調製する。

［実施例１７：Ｓ３Ｆ抗体の製造］
３Ｆ１ ＩｇＧ１可変ドメイン（ＳＢＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ネイティック所在）をＩｇＧ２抗体の抗体定常ドメイン領域と結合させてＳ３Ｆ ＩｇＧ２ａ抗体を製造した。３Ｆ１の重鎖及び軽鎖可変ドメインを配列分析して、ＩｇＧ２発現ベクター、抗体重鎖に対するプラスミドＨ１２０６（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、カリフォルニア州ベルモント所在）及び抗体軽鎖に対するプラスミドＬ１２０６（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、カリフォルニア州ベルモント所在）、の上流に３Ｆ１可変ドメインをコードする構造体を製作した。関連の配列を以下の表に示した。

ＣＳＣ下位分画で抗ＳＴｎ抗体Ｓ３Ｆの影響を測定するために使用される後続検定を最適化するために、記述（Ｆｒｉｅｌなど、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ、２００８、７、２４２‐２４９）されたように増殖検定を必ず行う。２つの選択された卵巣癌腫細胞株それぞれからの可能な８つの分類されたＣＳＣ下位分画の組み合わせと２つの母系からの細胞とを２４ウェル培養プレートに３重複で（５×１０^３細胞／ウェルで開始して希釈）シーディングする。１、３、５、７、８、及び９日目、または必要な場合それ以上の日にトリパンブルー色素排除によって決定されるように、ＭＴＴ検定を介して血球計算板及びまたはプレートリーダーを使用して生存細胞を計数する。スチューデントのｔ検定を用いて群を比較しており、０．０５以下のｐ値を有する比較は有意であるとみなす。このような結果に基づいて、細胞傷害検定を行うための副次的なプロトコールを設ける。

細胞傷害検定を行って、Ｓ３ＦｍＡｂのみ、Ｓ３Ｆ＋パクリタキセル＋カルボプラチン、または、これら化学療法剤混合物のみに対する、各細胞株からの８つのＳＴｎ＋及びＳＴｎ‐分類された下位分画、及び母系からの細胞の感受性を評価する。Ｓ３Ｆ（対照群として、無関係のアイソタイプマッチングされた抗体とともに）を０．１μＭから開始していくつかの希釈で試験する。化学療法剤を０．１、１．０、１０、及び１００ｎＭで使用する。適切なビヒクル対照群もまた含み、検定は前述（Ｆｒｉｅｌなど、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ、２００８、７、２４２‐２４９）のように必ず行う。分類されたＣＳＣ下位分画を２４ウェル培養プレートに細胞増殖検定で決定された細胞の数で３重複でシーディングし、５０％のコンフルエンスに到達するようにする。次に、細胞に抑制剤を添加してから２４時間飢餓状態にする。細胞生存能を前述のように２、４及び５日目及び必要な場合はそれ以上の日に測定する。スチューデントのｔ検定を用いて群を比較して、０．０５以下のｐ値を有する比較は有意であるとみなす。

Claims (44)

1. （ａ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｌ１と、
   （ｂ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｌ２と、
   （ｃ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｌ３と、
   （ｄ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｈ１と、
   （ｅ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｈ２と、
   （ｆ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｈ３と、を含む抗体またはその抗体断片であって、
   前記抗体またはその抗体断片が、シアリル化されたＴｎ抗原（ＳＴｎ）に結合する、抗体またはその抗体断片。
2. 配列番号３７のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
   配列番号３８のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗体断片。
3. 配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
   配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗体断片。
4. モノクローナル抗体またはその抗体断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片。
5. ＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ２アイソタイプである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片。
6. 前記抗体またはその抗体断片はＮ‐アセチルノイラミンシアリルＴｎ抗原（ＡｃＳＴｎ）及びＮ‐グリコリルノイラミンシアリルＴｎ抗原（ＧｃＳＴｎ）の少なくとも一方に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片。
7. 前記抗原は９‐Ｏ‐アセチル基を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗体断片。
8. 前記抗体またはその抗体断片は二重特異的抗体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片と、治療剤または細胞傷害剤とを含む、抗体薬物接合体。
10. 前記細胞傷害剤は前記抗体またはその抗体断片に直接接合されている、請求項９に記載の抗体薬物接合体。
11. 前記細胞傷害剤はリンカーを介して前記抗体またはその抗体断片に接合されている、請求項９に記載の抗体薬物接合体。
12. 前記リンカーは切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーである、請求項１１に記載の抗体薬物接合体。
13. 前記抗体薬物接合体は細胞傷害剤を含んでおり、前記細胞傷害剤はＤＮＡ損傷剤または細胞骨格阻害剤である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の抗体薬物接合体。
14. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗体断片、または、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の抗体薬物接合体を含む薬学組成物。
15. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗体断片、または、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の抗体薬物接合体、及びこれの使用指針を含むキット。
16. 腫瘍細胞を死滅させるための薬学組成物であって、
    前記組成物の前記抗体が前記腫瘍細胞に接触させられる、請求項１４に記載の薬学組成物。
17. 治療が必要な対象において癌を治療するための薬学組成物であって、
    前記組成物が前記対象に投与される、請求項１４に記載の薬学組成物。
18. 前記癌は上皮癌を含む、請求項１７に記載の薬学組成物。
19. 前記癌は乳癌、大腸癌、肺癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌及び肝癌の少なくとも１つである、請求項１７に記載の薬学組成物。
20. 対象で腫瘍容積を減少させるための薬学組成物であって、
    前記組成物が前記対象に投与される、請求項１４に記載の薬学組成物。
21. 抗腫瘍細胞免疫活性を増加させるための薬学組成物であって、
    前記組成物の前記抗体が１つ以上の免疫耐性腫瘍細胞に接触させられる、請求項１４に記載の薬学組成物。
22. 前記抗腫瘍細胞免疫活性は先天的免疫活性を含む、請求項２１に記載の薬学組成物。
23. 前記先天的免疫活性はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の抗腫瘍細胞活性を含む、請求項２２に記載の薬学組成物。
24. 前記抗腫瘍細胞免疫活性は後天的免疫活性を含む、請求項２１に記載の薬学組成物。
25. 前記後天的免疫活性はＢ細胞の抗腫瘍細胞活性を含む、請求項２４に記載の薬学組成物。
26. 前記後天的免疫活性は樹状細胞（ＤＣ）の抗腫瘍細胞活性を含む、請求項２４に記載の薬学組成物。
27. 前記組成物はＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ‐１２、及びＴＮＦ‐αからなる群から選ばれた１つ以上の因子のＤＣ発現を増加させる、請求項２６に記載の薬学組成物。
28. 治療が必要な対象で免疫耐性腫瘍を治療するための薬学組成物であって、
    前記組成物が前記対象に投与される、請求項１４に記載の薬学組成物。
29. 対象から癌幹細胞（ＣＳＣ）を減少または取り除くための薬学組成物であって、前記組成物が前記対象に投与される、請求項１４に記載の薬学組成物。
30. 前記ＣＳＣは乳房組織、卵巣組織、膵臓組織、膀胱組織、子宮頸組織、大腸組織、及び肺組織の少なくとも１つに存在する、請求項２９に記載の薬学組成物。
31. 前記ＣＳＣはＣＤ１３３及びＣＤ４４バイオマーカーの少なくとも一方を含む、請求項２９または３０に記載の薬学組成物。
32. 前記対象に１つ以上の化学療法剤がさらに投与される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の薬学組成物。
33. 前記１つ以上の化学療法剤はパクリタキセル及びカルボプラチンからなる群から選ばれる、請求項３２に記載の薬学組成物。
34. （ａ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｌ１と、
    （ｂ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｌ２と、
    （ｃ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｌ３と、
    （ｄ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｈ１と、
    （ｅ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｈ２と、
    （ｆ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ‐Ｈ３と、を含む、可変ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    前記可変ドメインが、シアリル化されたＴｎ抗原（ＳＴｎ）に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
35. 前記可変ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項３４に記載のＣＡＲ。
36. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片をコードする構造体。
37. 請求項３４または３５に記載のＣＡＲをコードする構造体。
38. 請求項３６または３７に記載の構造体を含む単離細胞。
39. 請求項３６または３７に記載の構造体を含むウィルス。
40. ＳＴｎを発現する細胞及び組織の少なくとも一方を同定する方法であって、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片を、前記細胞及び組織の少なくとも一方に接触させることを含む、方法。
41. 組織または器官における癌性細胞を同定する試験管内方法であって、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片を、前記組織または器官の試料に接触させることを含む、方法。
42. 前記組織または器官は乳房、卵巣または膵臓である、請求項４１に記載の方法。
43. 組織または器官における癌性細胞を同定するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗体断片を含む、薬学組成物。
44. 前記組織または器官は乳房、卵巣または膵臓である、請求項４３に記載の薬学組成物。